Cromatografía

Sistema de cromatografía de gases, para registrar concentraciones de acrilonitrilo en el

aire.

La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas

complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia y la física. Es un
conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es
separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar
las cantidades de dichos componentes.

Las técnicas cromatográficas1 son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil
que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a
través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido.
Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria.
De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y
se van separando. Después de que los componentes hayan pasado por la fase
estacionaria, separándose, pasan por un detector que genera una señal que puede
depender de la concentración y del tipo de compuesto.

Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos da como resultado

una retención diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separación efectiva
en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente.:

 Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan
ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
 Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En
este caso, las cantidades de material empleadas son pequeñas.

Contenido
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 1 Clasificación[2]
 2 Historia
 3 Términos empleados en cromatografía[5]
  4 Véase también
 5 Enlaces externos
 6 Referencias

Tipos Fase móvil Fase estacionaria

Líquido ( moléculas de agua contenidas en la
Cromatografía en papel Líquido
celulosa del papel )
Cromatografía en capa
Líquido Sólido
fina
Cromatografía de gases Gas Sólido o líquido
Cromatografía líquida Líquido Sólido o líquido
en fase inversa (polar) (menos polar)
Líquido
Cromatografía líquida Sólido o líquido
(menos
en fase normal (polar)
polar)
Cromatografía líquida Líquido
Sólido
de intercambio iónico (polar)
Cromatografía líquida
Líquido Sólido
de exclusión
Cromatografía líquida
Líquido Sólido
de adsorción
Cromatografía de
Líquido Sólido
fluidos supercríticos

Clasificación2 [editar]

Las distintas técnicas cromatográficas3 se pueden dividir según cómo esté dispuesta la
fase estacionaria:

 Cromatografía plana. La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre
un papel. Las principales técnicas son:
o Cromatografía en papel
o Cromatografía en capa fina
 Cromatografía en columna. La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna.
Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen:
o Cromatografía de líquidos
o Cromatografía de gases
o Cromatografía de fluidos supercríticos

La cromatografía de gases es útil para gases o para compuestos relativamente volátiles,

lo que incluye a numerosos compuestos orgánicos. En el caso de compuestos no
volátiles se recurre a procesos denominados de "derivatización", a fin de convertirlos en
otros compuestos que se volatilizen en las condiciones de análisis.

Dentro de la cromatografía líquida destaca la cromatografía líquida de alta resolución

(HPLC, del inglés High Performance Liquid Chromatography), que es la técnica
cromatográfica más empleada en la actualidad, normalmente en su modalidad de fase
reversa, en la que la fase estacionaria tiene carácter no polar, y la fase móvil posee
carácter polar (generalmente agua o mezclas con elevada proporción de la misma, o de
otros disolvente polares, como por ejemplo metanol). El nombre de "reversa" viene
dado porque tradicionalmente la fase estacionaria estaba compuesta de sílice o alúmina,
de carácter polar, y por tanto la fase móvil era un disolvente orgánico poco polar.

Una serie eluotrópica, es un rango de sustancias de diferentes polaridades que actúan

como fase móvil y que permiten observar un mejor desplazamiento sobre una fase
estacionaria.

Historia [editar]
El botánico ruso Mijaíl Tswett4 (Mikhail Semenovich Tswett, 1872-1919) empleó por
primera vez en 1906 el término "cromatografía" (que proviene del griego χρομα y
γραφω que significan respectivamente chroma "color" y graphos "escribir").

separación de clorofilas mediante cromatografía en papel

A comienzos del año 1903, Mijail Tsvet usó columnas de adsorción de líquidos para
separar pigmentos vegetales (por ejemplo, clorofilas). Las disoluciones se hacían pasar
a través de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio, que finamente
dividido de un material poroso que interacciona de forma diferente con los componentes
de la mezcla, de forma que éstos se separaban en distintas bandas coloreadas a lo largo
de la columna.
Los primeros equipos de cromatografía de gases aparecieron en el mercado a mediados
del siglo XX. A su vez, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) comenzó a
desarrollarse en los años 1960, aumentando su importancia en las décadas siguientes,
hasta convertirse en la técnica cromatográfica más empleada. Sin embargo esto se irá
modificando con el paso de los años.

Términos empleados en cromatografía5 [editar]

 Analito es la substancia que se va a separar durante la cromatografía.
 Cromatografía analítica se emplea para determinar la existencia y
posiblemente también la concentración de un analito en una muestra.
 Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las
partículas de soporte o a las paredes internas de la columa.

 Cromatograma es el resultado gráfico de la cromatografía. En el caso de

separación óptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se
corresponden a los componentes de la mezcla separada.

En el eje X se representa el tiempo de retención, y en el eje Y una señal

(obtenida, por ejemplo, a partir de un espectrofotómetro, un espectrómetro de
masas o cualquier otro de los diversos detectores) correspondiente a la respuesta
creada por los diferentes analitos existentes en la muestra. En el caso de un
sistema óptimo, la señal es proporcional a la concentración del analito específico
separado.

 Cromatógrafo es el equipo que permite una separación sofisticada. Por

ejemplo, un cromatógrafo de gases o un cromatógrafo de líquidos.
 Cromatografía es el método físico de separación en el cual los componentes
que se van a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es
 estacionaria (fase estacionaria) mientras la otra (la fase móvil) se mueve en una
dirección definida.
 Efluente es la fase móvil que atraviesa la columna.
 Serie eluotrópica es una lista de disolventes clasificados según su poder de
dilución.
 Fase inmovilizada es una fase estacionaria que está inmovilizada sobre
partículas de soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna.

Cromatograma correspondiente a una cromatografía liquida en fase reversa para

compuestos fenólicos

 Fase móvil es la fase que se mueve en una dirección definida. Puede ser un
líquido (cromatografía de líquidos o CEC). un gas (cromatografía de gases) o un
fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos). La fase móvil
consiste en la muestra que está siendo separada/analizada y el disolvente, que se
mueven por el interior de la columna. En el caso de la cromatografía líquida de
alta resolución, HPLC, la fase móvil es un disolvente no-polar como el hexano
(fase normal) o bien algún disolvente polar (cromatografía de fase reversa) y la
muestra que va a ser separada.. La fase móvil se mueve a través de la columna
de cromatografía (fase estacionaria) de forma que la muestra interacciona con la
fase estacionaria y se separa.
 Cromatografía preparativa se usa para purificar suficiente cantidad de
sustancia para un uso posterior, más que para análisis.
 Tiempo de retención es el tiempo característico que tarda un analito particular
en pasar a través del sistema (desde la columna de entrada hasta el detector) bajo
las condiciones fijadas. Véase también: Índice de retención de Kovats
 Muestra es la materia que va a as er analizada en la cromatografía. Puede
consistir en un simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla es
tratada en el curso del análisis, la fase o fases que contienen los analitos de
interés es llamada igualmente muestra mientras el resto de sustancias cuya
separación no resulta de interés es llamada residuo.
 Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado.
 Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra,y especialmente la fase
líquidamóvil en cromatografía de líquidos.
  Fase estacionaria es la sustancia que está fija en una posición en el
procedimiento de la cromatografía. Un ejemplo es la capa de silica en la
romatografía en capa fina.

Métodos cromatográficos.

Métodos variados de separación de mezclas se conocen como cromatografía. Según la

definición dada por Keulemans la cromatografía es un método de separación en el que los
componentes a desglosar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye un
lecho estacionario de amplio desarrollo superficial y la otra es un fluido que pasa a través o a
lo largo del lecho estacionario.

La cromatografía se introduce en los métodos de separación en 1903 y su posterior

desarrolló y evolución se produce hacia 1930. La primera persona que definió la
cromatografía fue el botánico ruso Miguel Tswett (1872-1913) en 1906 y eligió el término
cromatografía procedente de las palabras griegas khromatos (color) y graphos (escrito) ya
que utilizó el término cromatografía para describir la separación de pigmentos vegetales en
distintas zonas coloreadas. Aunque la mayor parte de las separaciones que se realizan
actualmente son de compuestos incoloros, el término inicial cromatografía se ha mantenido.

Definición de cromatografía

En 1906 Tswett definió la cromatografía como:

Método en el cual los componentes de una mezcla son separados en una columna adsorbente
dentro de un sistema fluyente.

Recientemente la I.U.P.A.C define la cromatografía de forma más amplia como:

Método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el

cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria,
mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido
soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en
una columna, extendida en una capa, distribuida como una película, etc...

Se utiliza el término general de lecho para definir las distintas formas en que puede
encontrarse la fase estacionaria. Las separaciones cromatográficas se consiguen mediante la
distribución de los componentes de una mezcla entre la fase fija y la fase móvil. La
separación entre dos sustancias empieza cuando una es retenida más fuertemente por la
fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse más rápidamente en la fase móvil. las
retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción que se
dan entre las dos fases y que pueden ser :
1.-La adsorción, que es la retención de una especie química por parte de los puntos activos
de la superficie de un sólido quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las
fases o superficie interfacial.

2.- La absorción, que es la retención de una especie química por parte de una masa, y
debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la primera, absorción pura, o a
reaccionar químicamente con la misma, absorción con reacción química, considerando ambas
como un fenómeno másico y no superficial.

Aspectos históricos de la cromatografía

Aunque procesos parecidos ocurren en la naturaleza cuando disoluciones pasan a través de

arcilla, rocas, etc... la cromatografía como tal adquiere importancia cuando en 1850 el
químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubrió que los cationes orgánicos se
separaban por migración cuando se depositaba una disolución que los contenía sobre un
material poroso, como papel.

En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía en columna para separar extractos
vegetales coloreados, y a este proceso le dió el nombre de cromatografía. Pero el mayor
desarrollo se produce en 1930 con Lederer cuando consigue separar los colorantes de la
yema de huevo. Posteriormente los químicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la
cromatografía en el campo de la química orgánica e inorgánica, y obtienen el premio Nobel
por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente.

A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión mundial de forma que en
1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en cromatografía por análisis frontal,
desarrollo por elución y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nobel por sus
trabajos en 1948.

Al mismo tiempo la cromatografía se aplicaba en el campo de la bioquímica, y así Martin

consigue separar algunos aminoácidos acetilados.

Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía.

Cromatografía en papel

Fue desarrolla por Martin. Tiene como soporte un papel de celulosa. Adquirió una gran
extensión por su sencillez y presenta la ventaja de poder utilizar miligramos y microgramos,
además presenta la opción de utilizar tanto la técnica descendente ( en columna, etc...)
como la técnica ascendente.
Cromatografía en capa fina

Fue originada por los trabajos de los investigadores rusos Izmailov y Schraiberen en 1938 al
separar mezclas de tinturas farmacéuticas. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria
se extiende sobre un soporte inerte, la dificultad que presentaba el método era el crear una
capa homogénea, sin ningún tipo de rugosidad. La cromatografía en capa fina tuvo valor
limitado hasta que Stahl estandarizó el método para elaborar capas finas por métodos
mecánicos.

Cromatografía de intercambio iónico

Esta técnica apareció durante la II Guerra Mundial y en principio tenía la finalidad de separar
las tierras raras y los elementos de transición. En 1938 Taylor y Urey utilizan este método
para separar isótopos de Litio y Potasio utilizando resinas de zeolita. En 1939 Samuel logra
sintetizar resinas de intercambio iónico.

Cromatografía de gel-filtración

Fodin y Porath en 1958 descubren que usando como fase estacionaria geles se consigue
separar polímeros sintéticos de alto peso molecular.

Cromatografía de afinidad.

Ideada por Porath en 1967, usando como fuente un péptido o proteína unida covalentemente
a un ligando y se utiliza para la separación de moléculas proteicas.

Cromatografía de gas.

Es una de las técnicas más utilizadas e importantes, de forma que ha revolucionado el campo
de la química analítica.

INTRODUCCION

En esta practica se pretenden identificar los componentes de una disolución. Esta puede estar formada
por tres compuestos, naftaleno, veratrol o acetanilida, siendo las cantidades de cada compuesto
desconocidas para nosotros siendo la mezcla completamente aleatoria. Para ello el método a utilizar será
la cromatografía. Con este método experimental podremos separar los componentes de una disolución
desconocida para luego compararlos con diferentes disoluciones patrón. La técnica a utilizar no se
corresponde de manera especifica con su nombre, puesto que no apreciaremos ninguna diferencia de
color entre los diferentes componentes. El nombre de la técnica deriva de los primeros ensayos en los
que se separaron pigmentos de plantas como la clorofila, los cuales tienen colores definidos. Estos
primeros pasos los dio el botánico ruso de origen italiano Mijail Tswett cuando separo diversos pigmentos
de las plantas.
La técnica se basa en la velocidad de desplazamiento diferencial de los solutos al ser arrastrados por una
fase móvil sobre una estacionaria que puede ser sólida o liquida. Esta diferencia será la que nos permita
tanto identificar cuantos componentes tiene una disolución como separarlos.

FUNDAMENTO TEORICO

La cromatografía es la técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de

desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (liquida o
gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser sólida o
líquida.

Hay que indicar que el nombre de la técnica es incorrecto, ya que no consiste en escribir con colores.
Este nombre proviene de la primera experiencia cromatográfica realizada, la cual se utilizo para separar
pigmentos coloreados de plantas. La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso de origen italiano
Mijail Tswett en 1903. Tswett separo los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas
verde en éter de petróleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una
probeta. No obstante, no existen datos sobre la utilización de esta técnica hasta 1930 cuando khun y
Lederer separaron también pigmentos de las plantas usando como adsorbentes alúmina y carbonato de
calcio. Fue a partir de ahí cuando se inicio el verdadero desarrollo de la cromatografia .

Para explicar el fenómeno cromatorgafico es necesario establecer dos tipos de fundamento, uno remoto y
otro próximo

Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades físicas o físico
químicas de los analitos: solubilidad, adsorción (tendencia a ser retenidos en sólidos finamente divididos),
volatilidad, tamaño, carga, reactividad química o bioquímica, etc. La mezcla de sustancias a separar se
coloca en una situación experimental dinámica donde exhiben dos de estas propiedades, o bien una de
ellas pero por duplicado tal como la solubilidad en dos líquidos diferentes como ocurre en cromatografía
liquido - liquido. Deben cumplirse las condiciones siguientes:

- Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo contacto entre si.

- El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas completo posible.

Fundamento próximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies presenten
cuantitativamente el mismo par de propiedades físicas o físico - químicas frente a un sistema
cromatográfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser muy pequeñas, se basa la
separación cromatográfica.

Si se transforma la idea del equilibrio estático establecido entra las dos fases en un equilibrio dinámico, se
tiene la realidad del fenómeno cromatográfico. Como se ha indicado anteriormente, una de las fases,
denominada fase móvil, fluye a través de la otra, a la que se denomina fase estacionaria, que permanece
inmóvil, y que, al menos en una extensión esta en equilibrio con la fase móvil.

Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan so “movilidad” entre si y con respecto a
la fase móvil. Se eligen las condiciones experimentales y las fases cromatográficas para que los
componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad. La base de la separación cromatográfica será,
por tanto, la diferencia en la velocidad de migración de los mismos.

La cromatografía es probablemente la más versátil de las técnicas de separación: es aplicable a cualquier

mezcla soluble o volátil. De hecho las técnicas de separación suelen dividirse en dos grandes grupos:
cromatograficas y no cromatograficas. La elección de una técnica cromatográfica concreta dependerá de
la naturaleza y cantidad de la muestra, del objetivo de la separación y de las limitaciones del tiempo y
equipo asequible

Puede hacerse una primera distinción entra las técnicas cromatográficas atendiendo a la integración
continua o no del sistema de detección. Así, la cromatografia no conlleva a un sistema de detección,
mientras que cualquier cromatógrafo de líquidos o gases lleva incorporado dicho sistema siendo, por
tanto, auténticos instrumentos.

Clasificaciones:
Para clasificar globalmente los procesos cromatográficos es necesario atender a dos criterios básicos:

 Fundamento del proceso cromatográfico, lo que conduce a los tipos de cromatografias

 Forma de realizar el proceso cromatográfico, es decir, lo que constituye las distintas técnicas
cromatográficas

Tipos de cromatografias:

Si es un sólido, cabe distinguir entre:

Cromatografía de adsorción: El sólido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase móvil
(liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals)

Cromatografia de cambio iónico: el sólido es un cambiador de iones (fuerzas electrostáticas)

Cromatografia de exclusión (o de geles), el sólido es un gel formado por polímeros no iónicos porosos que
retienen a las moléculas de soluto según su tamaño.

Cromatografia de afinidad: es un tipo especial de cromatografia de adsorcion, utilizadaespecialmente en

bioquímica, en la que un sólido tiene enlazado un llamado ligando de afinidad que puede ser por ejemplo,
un indicador enzimático o un anticuerpo

Si es un liquido que se encuentra soportado en un sólido inerte, se trata de la Cromatografia de partición.

El soluto se reparte entra la fase móvil (liquido o gas) y la fase estacionaria.

Según la naturaleza de la fase móvil, la técnica cromatográfica correspondiente recibe el nombre de dicha
fase móvil:

Si es un líquido, cromatografía liquida, cabe distinguir:

 Cromatografía liquido-liquido (CLL) en la que ambas fases son liquidas y, por tanto, se trata de
una cromatografía de partición.

 Cromatografía liquido-sólido (CLS) en la que la fase estacionaria es sólida (adsorción, cambio

iónica, exclusión, afinidad).

Si es un gas, cromatografía de gases, puede ser:

 Cromatografía gas-liquido (CGL), que es una cromatografía de partición.

 Cromatografía gas-sólido (CGS), que es una cromatografía de adsorción.

Si es un fluido supercrítico, (fluido calentado a una temperatura superior a la temperatura critica, pero
simultáneamente comprimido a una presión mayor que su presión critica), se trata de la cromatografía de
fluidos supercríticos (CFS), que puede ser de partición o de adsorción.

Técnicas cromatográficas:

Según la forma de llevar a cabo la separación cromatográfica, es decir, según el dispositivo utilizado para
conseguir entre la fase móvil y la estacionaria, cabe distinguir dos tipos de técnicas cromatogrÁficas: en
columna y plana.

Cromatografía en columna: Se utiliza un tubo cilíndrico, en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a
su través se hace pasar la fase móvil. El flujo de la fase móvil (liquido o gas) a través de la estacionaria se
consigue: 1)por presión, 2)por capilaridad, 3) por gravedad.
Es de destacar que en la actualidad, aunque incorrectamente, el término de cromatografia en columna
suele aplicarse a la cromatografia liquida para distinguirla de la cromatografia plana ya que, obviamente la
cromatografia de gases solo puede realizarse en columna.

Cromatografia plana: La fase estacionaria esta colocada en una superficie plana que en realidad es
tridimensional, aunque una de sus dimensiones es muy reducida, por lo que puede considerarse
bidimendional. Se divide en dos tipos generales:

 Cromatografia en papel: en la que el papel actúa como soporte de la fase estacionaria

(cromatografia de partición).

 Cromatografia en capa fina: en la que un sólido actúa como fase estacionaria (cromatografia de
partición), se extiende en una capa delgada sobre una placa, generalmente de vidrio.

El flujo de la fase móvil puede conseguirse de dos formas: 1) por capilaridad (cromatografia horizontal y
ascendente) y 2) por capilaridad y gravedad (cromatografia descendente). En la cromatografia plana
queda excluido el uso de un gas como fase móvil, por lo que ésta siempre es líquida.

Cromatografia plana:

La cromatografia plana es un tipo de cromatografia liquida en la que la fase estacionaria esta extendida
sobre la superficie de un plano y la fase móvil fluye a través de ella. La fase móvil siempre es un liquido,
mientras que la fase estacionaria puede ser un liquidosoportedo en un sólido (cromatografia de particion)
o un sólido sorbente (cromatografia de adsorción, cambio ionico o exclusión). El flujo de la fase móvil se
produce:

 Por capilaridad (cromatografia horizontal y ascendente)

 Por capilaridad y gravedad (cromatografia descendente)

Esta clase de cromatografia es considerada la más simple de todas las técnicas cromatograficas. La
diferencia principal con la cromatografia en columna es de tipo técnico, es decir, difieren en la forma de
soportar la fase estacionaria. En lo que se refiere al fenómeno en que se fundamenta la separación, es el
mismo para ambas técnicas

En la cromatografía plana, la disolución de la muestra a separar se sitúa sobre el plano que contiene la
fase estacionaria en forma de mancha, o a veces de banda, a corta distancia de uno de los extremos de
dicho plano. Una vez seca la mancha o banda, el extremo del plano próximo a la misma se pone en
contacto con la fase móvil, manteniendo todo el sistema cromatográfico en una cámara cerrada. La
separación se produce por migración diferencial de los componentes de la muestra en la dirección en que
se mueve la fase móvil.

Generalmente, a diferencia de la cromatografía en columna, en cromatografía plana el analito no

abandona el lecho cromatográfico, de forma que el proceso se detiene cuando la fase movil ha alcanzado
una determinada zona del plano.

Cabe distinguir dos tipos de cromatografia plana: En papel (CP) y en capa fina (CCF).

La cromatografía en papel tuvo su máximo desarrollo en, os años cincuenta per en la actualidad se
encuentra practicamante eclipsada debido a la mayor rapidez, eficacia y versatilidad de la cromatografía
en capa fina. Aproximadamente solo el 4% de las publicaciones sobre las distintas técnicas
cromatográficas se dedican a la cromatografía en papel. En esta técnica, la celulosa actúa como soporte
de la fase estacionaria que suele ser agua (cromatografia de partición). No obstante, también existen en
el comercio papeles impregnados (v.i. como gel de sílice o alúmina, con silicona para separaciones en
fase invertida, con cambiadores ionicos) o tratadas químicamente (v.i. grupos cambiadores incorporados
al esqueleto polimérico de la celulosa), que amplían la aplicabilidad de esta técnica.

En cromatografía en capa fina, un sólido, sorbente o soporte de la fase estacionaria, se extiende en forma
de capa sobre el plano de una superficie rígida, normalmente una capa de vidrio o polietileno, de forma
que la fase móvil fluye a través del mismo. Dependiendo de las características del sólido utilizado, la
cromatografía será de partición, adsorción, cambio ionico o exclusión.
Hasta hace relativamente poco tiempo, la (CCF) era considerada una técnica cualitativa simple y rápida,
para separar mezclas no demasiado complejas, pero su aplicabilidad cuantitativa resultaba una pobre
alternativa frente a otras técnicas cromatográficas como la CLAR. Sin embargo, actualmente, debido a los
cambios introducidos en esta técnica, en lo que se refiere a la calidad de los sorbentes, equipos para
aplicar y la muestra y sistemas de detección, el interés por la CCF ha vuelto a renacer, siendo
considerada una técnica útil para separar y determinar cualitativa y cuantitativamente mezclas complejas
a nivel de trazas. Estos cambios han llevado a modificar el nombre de la técnica, denominada
cromatografia en capa fina de alta resolución (CCFAR o HPTLC en la bibliografía inglesa), al igual que
ocurrió cuando se mejoro la capacidad de resolución de la cromatografia liquida en columna, pasando a
denominarla cromatografia liquida de alta resolución (CLAR o HPLC)

Diferencias entre cromatografia plana y en columna:

Aunque con algunas modificaciones, los principios teóricos de la cromatografia en columna pueden ser
aplicados, en general, a la cromatografía plana. Las diferencias entre estas técnicas hay buscarlas en la
distinta configuración de ambos sistemas cromatográficos ya que la cromatografia plana se realiza en un
sistema de lecho abierto, mientras que la cromatografia en columna es un sistema de lecho cerrado.
Sobre esta base pueden indicarse las diferencias siguientes

 En la cromatografía plana la separación se realiza por distancias mientras que en columna se hace por
tiempos ( o volúmenes ).

 En cromatografia plana la velocidad de la fase móvil solo puede controlarse indirectamente ya que esta
gobernada por fuerzas capilares que son las que permiten el paso de dicha fase a través del lecho
cromatográfico. Por el contrario, en cromatografía en columna la velocidad de la fase móvil puede
controlarse fácilmente, dependiendo del gradiente de presión mantenido a través de la columna.

 El tiempo que dura la separación esta determinado por el tiempo necesario para que el frente del
disolvente llegue a una zona determinada del lecho cromatográfico y es independiente del camino
recorrido por los componentes de la muestra. En cromatografía en columna, cada soluto debe atravesar
completamente la longitud de la columna, por lo que el tiempo que dura la separación esta determinado
por el tiempo que tarda el componente mas lento en llegar al detector.

 En lo que se refiere a la forma de llevar a cabo el proceso de separación, en cromatográfia en columna

la separación de varias muestras, se realiza de forma secuencial, es decir, cada una de ellas debe
someterse individualmente al mismo proceso de introducción en la columna, separación y detección,
además de proceder a reequilibrar la columna antes de introducir la siguiente muestra. En cromatografía
plan por el contrario, la separación de varias muestras se realiza de forma simultanea, siendo todas ellas
sometidas al mismo tiempo al proceso separativo. Esto supone un ahorro de tiempo considerable ya que
en cromatigrafía en columna la duración de separación de varias muestras será la suma de los tiempos
parciales necesarios para cada separación individual.

 La elección de la fase móvil en cromatografía plana se realiza dé forma que de la separación requerida,
no importando que algunos componentes de la muestra queden en el origen, ya que las placas se
desechan después de cada separación. En cromatografia en columna, la fase móvil debe elegirse de
forma que eluya todos los componentes de la muestra para que no se produzca el “envenenamiento” de
la columna. Este envenenamiento puede suponer una perdida de tiempo considerable hasta que se logra
eluir completamente aquellos componentes que hayan podido quedar acumulados al comienzo de la
columna. Si es irreversible, el aspecto económico puede ser de gran importancia.

 Otra diferencia básica entre ambas técnicas se encuentra en la forma de llevar a cabo la detección.
Mientras que en cromatografía en columna este es un proceso dinámico, pasando cada soluto eluido por
el detector, en cromatografía plana es un proceso estatico. Esta diferencia da lugar a que la detección en
la cromatografia plana sea mas difícil de automatizar que en columna, pero también, que sea un proceso
más flexible y variable. Así, en lo que se refiere a los disolventes utilizados como fase móvil, la pureza o
propiedades (Absorbentes, ácido base, etc.) de los mismos no son tan críticos como en columna, ya que
estos se evaporan completamente entre el desarrollo y la medida. Por ejemplo, si en columna se utiliza un
detector U.V., la fase móvil no debe contener disolventes o impurezas que absorban en esta zona del
espectro, mientras que esto no supone un problema en cromatografía plana. Por otra parte, en esta
técnica, es posible aumentar la sensibilidad del proceso de detección mediante una selección adecuada
de las reacciones utilizadas para mejorar la señal medida. El sistema de detección estático permite, por
ejemplo, registrar espectros de cada soluto por separado y seleccionar la longitud de onda de máxima
respuesta de cada uno de ellos.
 En general, los solutos mas retenidos en cromatografía plana forman manchas compactas, por lo que
se detectan con mayor sensibilidad. Por el contrario, los solutos mas retenidos en la columna son los que
dan picos más anchos menos resueltos y sensibles

Aunque normalmente se considera que la cromatografía plana es una técnica más simple que la de
columna, no es posible en la actualidad proceder a un desarrollo profundo de este proceso separativo al
igual que el realizado en cromatografía en columna. El motivo de ello es que en cromatografía plana tanto
la fase móvil como la estacionaria no están bien definidas y se encuentran en un estado dinámico con la
fase de vapor que rodea el sistema cromatográfico. Las condiciones experimentales optimas para realizar
la separación son, por tanto, difíciles de controlar experimentalmente. Se producen los cambios siguientes

 La fase estacionaria puede modificar sus propiedades antes y durante el proceso cromatográfico
adsorbiendo la fase de vapor antes de ser mojada por la fase móvil, o evaporándose si dicha fase
estacionaria es liquida.

 Si la fases móvil y de vapor no están equilibradas, la evaporación puede producir una alteración en la
composición de la fase móvil.

 La porosidad de la fase estacionaria no es uniforme, por lo que la velocidad de la fase móvil no es

constante. Así, las fuerzas capilares son mas fuertes en las zonas interparticulares mas estrechas,
produciéndose en las mismas un flujo mas rápido de la fase móvil

PARTE EXPERIMENTAL

Los reactivos y materiales a utilizar son estos:

MATERIALES REACTIVOS

Capilares Naranja de metilo

Cubeta Azul de metileno

Placas de silicagel Etanol

Lamparas ultravioleta Naftaleno

Acetanilida

Veratrol

Hexano

Diclorometano

Material:

Placas de silicagel: La función de este material es el soporte de agua puesto que puede almacenar hasta
un 50%de humedad cuando esta seco. Esta propiedad la utilizaremos para que la fase móvil avance por
la placa.

Cubeta: Pieza de vidrio en la cual colocaremos tanto la fase móvil como la estacionaria. Después de que
estas estén dentro se coloca una tapa para que la fase móvil no se evapore

Capilares: Las usaremos para depositar una mínima cantidad de compuestos sobre la fase estacionaria

Lamparas ultravioleta: Como los compuestos a identificar son incoloros la luz U.V. mostrara una mancha
en el lugar en el que se encuentre el compuesto

Reactivos:
Naranja de metilo: Indicador

Azul de metileno: Indicador

Etanol: Alcohol utilizado mayormente en medicina como desinfectante para las heridas. También
aparecen en bebidas que si se consumen en exceso pueden producir graves problemas de salud

Naftaleno: Se utiliza como fuerza motriz en sustitución de aceites pesados del petróleo y aun de la
gasolina. Se emplea como expectorante en enfermedades bronco pulmonares y como desinfectante en
las intestinales de origen infectivo. De uso tópico para afecciones de la piel como la Psoriasis

Acetanilida: Se emplea en medicina con el nombre de antifibrina para combatir la fiebre. La acetanilida
cristaliza en forma de laminillas o tablas rómbicas brillante, incoloras, inodoras de sabor cáustico. Funden
a 113 o 114 grado. Se disuelve fácilmente en alcohol, éter

Veratrol: Eter dimetilico de la pirocatequina. Se forma calentando ácido veratrico con barita cáustica, así
como por la acción del yoduro de metilo sobre el guyacol potasico . Es un líquido oleoso, aromático, que
hierve a 205 C. Es inmiscible en alcohol, éter y aceites, insoluble en agua y glicerina. Se emplea en
medicina como expectorante.

Hexano: Usado como disolvente orgánico. Funde a -93,5 C y hierve a 69 C

Diclorometano: Hierve a 41 C y es utilizado como disolvente orgánico.

Procedimiento:

En esta práctica utilizaremos una placa de aluminio cubierta, por una de sus caras con silicagel. En dicha
placa trazaremos dos líneas a 0,5 mm de distancia tanto de la parte superior como de la inferior. La franja
inferior será nuestra zona de aplicación. En esta colocaremos nuestros patrones primarios y la muestra a
analizar. Esto lo haremos con la ayuda de un capilar, aplicando en forma de mancha una pequeña
cantidad en dicha franja. Los compuestos a analizar serán azul de metileno, naranja de metileno y una
mezcla de las dos.

Una vez aplicados se insertara la placa dentro de la cubeta, la cual contiene etanol 96%. La cantidad de
etanol no puede ser cualquiera, el volumen de este no puede sobrepasar la franja de aplicación. Desde el
momento en que la fase estacionaria es introducida en la cubeta podemos observar como la fase móvil
asciende por la estacionaria debido a la capilaridad de la segunda. Una vez el frente de la fase móvil ha
llegado a la franja superior impuesta por nosotros procederemos a la extracción de la fase estacionaria y
la dejaremos secar. Cuando la placa este seca observaremos los diferentes compuestos. En el caso de
que sean incoloros lo haremos mediante luz ultravioleta. Se marcara la zona exacta en la que ha quedado
cada compuesto y se medirá la distancia recorrida.

El cociente de la distancia recorrida por los compuestos y la distancia recorrida por la fase móvil desde el
punto de aplicación hasta el limite superior establecido por nosotros nos dará el valor Rf

Rf = Distancia recorrida por el soluto / Distancia recorrida por la fase móvil

El etanol será nuestra fase móvil que ira ascendiendo por la placa de silicagel e ira arrastrando los
compuestos que hemos aplicado. Cuando el frente haya ascendido hasta la franja superior pararemos el
experimento y observaremos los resultados.

Comprobamos que el azul de metileno ha ascendido pero que el naranja de metilo a ascendido 3,5 cm.
Paralelamente en la muestra problema vemos que la mezcla se ha separado, logrando unos punto a la
misma distancia.

Azul de metileno X= 0 cm. Rf = 0

Naranja de metilo X= 3,5 cm. Rf = 0,875

Mezcla X= 3,5 cm. Rf = 0,875

A continuación, después de haber hecho el primer análisis, se procederá a analizar la muestra problema.
Para esto repetiremos el apartado anterior, a diferencia de en el anterior en esta pondremos acetanilida,
naftaleno y veratrol. Repetimos la prueba y los resultados son estos:

Rf en C6H14 Rf en CH2Cl2

Naftaleno 3 cm. Rf =0,666 4,2 cm. Rf = 0,913

Veratrol 0.1 cm. Rf = 0,02 3,27 cm. Rf = 0,71

Acetanilida 0 cm. Rf = 0 0,25 cm. Rf = 0,054

Una vez terminado este proceso, se analizara la muestra problema. Aplicaremos otra vez los patrones
primarios y al lado de estos aplicaremos una pequeña cantidad de muestra problema. Repetimos el
experimento y obtenemos estos valores:

R en C6H14 y =4,5 cm. R en CH2Cl2 y = 4,5 cm.

Naftaleno X = 3 cm. R = 0,6 X = 4,2 cm. R = 0,913

Veratrol X = 0,1 cm. R = 0,02 X = 3,27 cm R =0,71

Acetanilida X = 0 cm. R = 0 X = 0,25 cm. R = 0,054

Muestra problema Valores idénticos Valores idénticos

Al proyectar luz ultravioleta sobre las placas, se abserva que de forma paralela a los patrones primarios,
han aparecido otras manchas en las dos pruebas, tanto en hexano como en diclorometano

1 Naftaleno

2 Veratrol

3 Acetanilida

4 Muestra problema
Utilizando hexano como eluyente no llegamos a precisar la composición exacta de la muestra, pero
podemos asegurar que contiene naftaleno. Después de repetir la prueba con diclorometano apreciamos
claramente tres puntos, cada uno a la misma altura que uno de los patrones.

Conclusión: La muestra problema, en nuestro caso la 26 esta compuesta de:

Naftaleno

Veratrol

Acetanilida

CUESTIONES

1 Si se analiza por cromatografía una mezcla constituida por cuatro sustancias, ¿Cuántos valores de Rf
se obtendrán?

Se obtendrán cuatro valores

 Explicar por que el Rf de las sustancias estudiadas es mayor en diclorometano que en hexano.

La polaridad del diclorometano será lo que genere un resultado mayor. Al ser las sustancias menos
polares, creara una repulsión mayor, avanzando más que en hexano.

Indice
1. Métodos de separación. Introducción
2. Los métodos cromatográficos
3. Electroforesis Convencional
4. Electroforesis Capilar (CE)
5. Bibliografía
1. Métodos de separación. Introducción
Desde el siglo pasado las separaciones analíticas se llevaban a cabo por métodos clásicos
como son la precipitación, destilación y extracción. Los crecientes esfuerzos por conocer
más sobre la composición y función de las proteínas han obligado a los científicos a buscar
técnicas, cada vez, más precisas.
Para elegir una técnica de separarción, además de tener en cuenta los criterios económicos
y de accesibilidad, hay que atender a dos tipos de consideraciones: unas tienen que ver con
las propiedades físicas y estructurales de las moléculas que se pretende separar, o de las
características de la matriz en que se encuentran; otras se derivan de los objetivos del
análisis (sensibilidad, resolución, tiempo de análisis, necesidad de una detección
específica).
El método de selección incluye los pasos necesarios para la obtención, preparación y posible
fraccionamiento de la muestra, la aplicación de la técnica analítica adecuada y el
tratamiento de los datos obtenidos.
Las técnicas analíticas más empleadas en la actualidad pueden englobarse en dos grandes
grupos: técnicas de separación y técnicas espectroscópicas. Las técnicas espectroscópicas
proporcionan, para cada compuesto analizado, una información compleja, relacionada con
sus características estructurales específicas, por otro lado las técnicas de separación se
utilizan para resolver los componentes de una mezcla y la señal obtenida puede utilizarse
con fines analíticos cuantitativos o cualitativos.
Es precisamente en las técnicas de separación en las que basaremos la revisión bibilográfica
del presente trabajo, debido a su amplio uso en el campo de la Biotecnología, Biología
Molecular y Bioquímica entre otras ramas de la investigación.
Actualmente las separaciones analíticas se realizan fundamentalmente por cromatografía y
electroforesis.
La cromatografía comprende un conjunto importante y diverso de métodos que permite a
los científicos separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas, lo
que en muchas ocasiones resulta imposible por otros medios. Se pueden separar moléculas
en función de sus cargas, tamaños y masas moleculares. También a través de la polaridad
de sus enlaces, sus potenciales redox, etc.
La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una mezcla, sino
también su identificación y cuantificación. El análisis cualitativo está basado en la medida
de parámetros cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención) mientras que el análisis
cuantitativo está basado en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se
relacionan con la concentración. La columna cromatográfica y la forma con la que se
diseña, constituye el corazón de la separación. El detector, situado al final de la columna es
el que garantiza la respuesta de los componentes que se separan.
En todas las separaciones cromatográficas la muestra se desplaza con una fase móvil, que
puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico. La fase móvil puede pasarse a través
de una fase estacionaria, con la que es inmiscible y que se fija a una columna o a una
superficie sólida. Las dos fases se eligen de forma, que los componentes de la muestra se
distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos
componentes que son fuertemente retenidos, por la fase estacionaria se mueven lentamente
con el flujo de la fase móvil; por el contrario los componentes que se unen débilmente a la
fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los
componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse
cualitativa y/o cuantitativamente. Estos resultados se recogen en forma de gráficos
llamados cromatogramas.
Los métodos cromatográficos se pueden clasificar según la forma en que la fase móvil y la
fase estacionaria se pongan en contacto. Así en la cromatografía de columna, un tubo
estrecho contiene la fase estacionaria a través de la cual se hace pasar la fase móvil por
presión. En la cromatografía en plano, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a
los intersticios de un papel; en este caso la fase móvil se desplaza a través de la fase
estacionaria por capilaridad o por gravedad.
Las tres clases de cromatografía desde un ángulo más general son cromatografía de
líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos. Como su nombre
lo indica, la fase móvil en las tres técnicas son líquido, gas y fluido supercrítico
respectivamente.
Solo la cromatografía de líquidos es la que puede llevarse acabo en columna o sobre
superficies planas, por otra parte tanto la de gas como la de fluidos supercríticos están
restringidas a los procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la columna
contienen la fase móvil.
La técnica más usada es la cromatografía líquida de alta resolución, HPLC por su
sensibilidad, fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para
la separación de especies no volátiles o termolábiles y su aplicación a sustancias de
primordial interés en la industria, como son los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos, entre otros. Se ofrece a continuación un esquema relativo a
este método de separación:
2. Los métodos cromatográficos
La cromatografía líquida la podemos diferenciar en cuatro grupos:
 C. de reparto: separa los solutos basándose en la solubilidad
 C. de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción
 C. de exclusión: separa solutos según el peso molecular
 C. de intercambio iónico: separa solutos según la carga iónica

Cromatografía de reparto
La cromatografía de reparto está formada por la cromatografía Líquido-Líquido y la
cromatografía unida químicamente. Estas técnicas se diferencian en la forma en que se
retiene la fase estacionaria sobre las partículas del soporte relleno. En el segundo caso,
como su nombre lo indica, la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del
soporte. Esta técnica actualmente es más usada debido a que la cromatografía líquido-
líquido necesita de un recubrimiento periódico de las partículas del soporte debido a la
pérdida de la fase estacionaria por disolución en la fase móvil.
En general los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se
preparan con sílice rígida o composiciones donde la sílice es el elemento básico. Estos
sólidos están formados por partículas mecánicamente resistentes, porosas y uniformes.
Los rellenos de columna en la cromatografía de fase unida químicamente se clasifican como
de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carácter no polar, y de fase normal
cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares.
Esta técnica puede utilizarse en la separación de mezclas edulcorantes artificiales,
antioxidantes, aflatoxinas, bebidas refrescantes entre otras.
Cromatografía De Adsorción
La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es la forma clásica de la cromatografía de
líquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un método
importante de la HPLC.
Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina,
siendo la primera la preferida.
Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores
a 5 000. Los métodos de la cromatografía de adsorción y reparto tienden a ser
complementarios, aunque en algunos casos se superponen.
En general la cromatografía Líquido-Sólido es más adecuada para muestras que son
solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones
acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de reparto en fase inversa. En este tipo
de cromatografía también se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales.
Una característica particular de este método es su capacidad para diferenciar compuestos
isómeros en mezclas.
Cromatografía De Exclusión
La cromatografía de exclusión, también llamada de filtración en gel o cromatografía de
permeación en gel, se basa en la diferencia de penetración de las moléculas en los poros de
la fase estacionaria debido a que la separación obtenida depende del tamaño de la molécula.
El tiempo de elución es proporcional al peso molecular de los mismos, por lo que no es muy
usada con los compuestos de alto peso molecular. Este tipo de separación por tamaño
difiere de las demás técnicas de cromatografía en que no existen interacciones físicas o
químicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una técnica reproducible, escalable y
rápida.
La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red
uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño tamaño. Las
moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras
que las de pequeño tamaño tienen acceso a todo el volúmen poroso y son las últimas que se
eluyen; de esto se deduce que el volúmen disponible para las moléculas pequeñas es mayor
que para las grandes. Por lo tanto las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente. En
resumen los factores que determinan la separación de las moléculas son el tamaño del poro,
el tamaño de la partícula y el flujo de elución.
Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables, mecánica y químicamente,
tener bajo contenido en grupos iónicos, uniformidad de poro y tamaño. Los compuestos
pueden ser derivados de dextranos (Sephadex), derivados de agarosa (Sepharosa),
derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Hay diferentes tamaños de partícula
para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna.
Este técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos, determinación de
glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.
Cromatografía De Intercambio Iónico
La cromatografía de intercambio iónico está basada en la atracción entre iones del soluto y
puntos cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de intercambiadores
aniónicos, grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto.
Los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados negativamente que atraen
cationes del soluto.
Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos, fuertes o débiles. Las resinas
ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas, en cambio las resinas
ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio
catiónico. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen siendo catiónicos a
cualquier valor de pH. Los básicos débiles de amonio terciario se desprotonan en
disoluciones moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad.
Las resinas de intercambio iónico tienen aplicación en estudios donde intervienen
moléculas pequeñas (PM=500) que pueden penetrar en los poros pequeños de la resina.
Los intercambiadores iónicos de poliestireno son tan grandes que las macromoléculas muy
cargadas, como las proteínas, se pueden enlazar irreversiblemente a ellos. Los de celulosa y
dextranos sirven para intercambio iónico de macromoléculas. Los geles de intercambio
iónico se usan en el caso de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos). Cuando las
separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos
inorgánicos.
En resumen la gran variabilidad de los métodos cromatográficos se debe a las diferentes
condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de una sustancia.
Todas estas técnicas tienen en común la existencia de una fase estacionaria a través de la
cual fluye una fase móvil, así como la presencia de un mecanismo de inyección de la
muestra y un mecanismo de detección de los diferentes componentes separados.
La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el químico sueco Arne Tiselius,
merecedor del Premio Nobel en 1948 por sus trabajos realizados en esta esfera.
La electroforesis es una técnica analítica de separación de fundamento cinético basada en el
movimiento o migración de las macromoléculas disueltas en un determinado medio
(solución tampón de electroforesis), a través de una matriz o soporte reticulado como
resultado de la acción de un campo eléctrico. El comportamiento de la molécula viene dado
por su movilidad electroforética y ésta por la carga, tamaño y forma de la misma. Cuanto
mayor es la relación carga/tamaño más rápido migra un ión en el seno del campo eléctrico.
Esta técnica tiene como ventaja su capacidad de separar macromoléculas de interés en la
industria biotecnológica y química. Ha sido un método muy útil para la separación de
proteínas (enzimas, hormonas) y ácidos nucleicos (DNA y RNA) con gran resolución.
En un sistema electroforético pueden originarse distintos fenómenos que afectan la
separación de las sustancias:
 Difusión
Este fenómeno es provocado por la existencia de gradientes de concentación que favorecen
el transporte hacia las zonas de menor concentaración de cada especie. Afecta tanto a
partículas cargadas como no cargadas. Las moléculas tienden a moverse de una forma
aleatoria debido a que poseen energía cinética propia. Esto es lo que se denomina difusión.
Con un aumento de la temperatura aumentará la difusión por un incremento de la energía
cinética.
 Migración

Es el movimiento producido por una fuerza externa que es impuesta al medio, en este caso,
el campo eléctrico y su intensidad.
 Flujo térmico

Al pasar una corriente eléctrica a través de un sistema que origina una resistencia dada, se
produce calor. Por tanto el sistema electroforético no es isotérmico. En general la fase
líquida se mueve hacia las zonas de menor temperatura, lo que origina un transporte de las
partículas de interés no debido a la migración.
 Fricción

La fricción con el solvente dificultará el movimiento (es decir, al moverse los solutos
chocarán con las moléculas del solvente que están en su camino), lo que genera una fuerza
que se opone al movimiento.
La suma de todos estos factores provoca que las moléculas no migren de una manera
uniforme, de modo que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de la solución, los
iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el tiempo.
Para reducir esta anchura podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un
medio que oponga más resistencia a dicho movimiento.
Esta situación nos permite diferenciar dos métodos electroforéticos:
 Electroforesis convencional
 Electroforesis capilar.

3. Electroforesis Convencional
La electroforesis convencional ha sido utilizada durante muchos años para separar especies
complejas de elevado peso molecular de interés biológico y bioquímico. Las separaciones se
llevan a cabo sobre una capa delgada y plana o placa de un gel semisólido y poroso que
contiene un tampón acuoso en el interior de sus poros. Esta será la sustancia encargada de
ofrecer resistencia al movimiento de las moléculas, controlando así su migración uniforme.
Mediante esta técnica se pueden separar varias muestras simultáneamente. Dichas
muestras se depositan sobre el gel, se aplica un potencial de corriente continua a través del
mismo durante un tiempo fijo. Cuando las separaciones se han completado se interrumpe el
paso de corriente y las especies separadas se tiñen para visualizarse.
La electroforesis en gel es muy utilizada en la detección, control de pureza, caracterización,
cuantificación (por comparación con controles) así como preparación y purificación (por
extracción de bandas desde el gel) de moléculas y fragmentos de DNA y RNA.
Los geles que se emplean son geles tridimensionales de polímeros ramificados que tienen
los espacios entre ramificación rellenos de líquido. Las redes de polímeros no solo reprimen
la convección sino que también actúan como cribas que pueden retardar y hasta bloquear la
migración de los analitos poliméricos más grandes. En cambio los iones pequeños pueden
moverse libremente a través de la estructura porosa del gel. De este modo la electroforesis
en gel tiene dos mecanismos de separación: electroforesis, que separa por la relación
carga/tamaño y tamizado, que separa mayormente por tamaño. Los geles más comunes son
agarosa y poliacrilamida.
La agarosa es un polímero derivado de un polisacárido neutro, que gracias a su poder de
gelificación y propiedades físico-químicas, lo han convertido en el soporte más común para
electroforesis en el área de Biología Molecular. La poiliacrilamida es un polímero formado a
partir de acrilamida y N,N´ metilenbisacrilamida. La concentración de ambos reactivos
define el grado de reticulación del gel.
Ambos geles tienen en común que adquieren la misma forma y están prácticamente libres
de cargas iónicas. Esto es importante para evitar que la disolución tampón se desplace por
el gel cuando se active el campo eléctrico.
A continuación se ofrece un esquema con los aditamentos necesarios para realizar esta
técnica de separación:
Este tipo de electroforesis es ampliamente utilizado en la esfera biotecnológica, aspecto este
que se ha podido comprobar a partir de los numerosos resultados que se encuentran en la
literatura más actual.
Existen otros tipos de electroforesis en gel como son la electroforesis en geles
desnaturalizantes de agarosa, electroforesis en campo pulsado y la electroforesis
preparativa. Estas técnicas no son de aplicación tan general pero no por ello dejan de ser
importantes.
4. Electroforesis Capilar (CE)
La electroforesis capilar es una técnica alternativa de la electroforesis convencional y surge
debido a que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida
que aumenta el campo eléctrico aplicado. Esta afirmación no nos permite aumentar el
potencial, aun sabiendo que existe una dependencia directa de éste con el campo eléctrico.
Esto se debe a que el calentamiento de Joule aumenta hasta afectar la calidad de la
separación. Para solucionar esta dificultad es que se realiza la electroforesis en un tubo
capilar con un diámetro interno inferior a 0,1 mm y una longitud de 50 cm a 1 m. Esta
técnica está representada en el siguiente esquema:
El mecanismo de separación está basado en las relaciones carga/masa de los analitos. Su
utilidad está en la separación de proteínas y péptidos entre otras sustancias.
Entre las ventajas que ofrece la electroforesis capilar se puede apuntar que da lugar a
separaciones con volúmenes de muestra extraordinariamente pequeños (de 0,1 a 10 nL), en
contraste con la electroforesis convencional en la cual se emplean volúmenes de muestra en
el orden de los µL, con una elevada resolución y rapidez. Ofrece además mayor facilidad y
velocidad que la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Esta técnica elimina el problema de los solventes de la HPLC, la toxicidad de los mismos y
su costo, pues emplea soluciones acuosas en su gran mayoría con muy baja concentración
iónica, incorpora los principios de la automatización a través de un hardware creado
especialmente con un software altamente optimizado, aunque la reproducibilidad en el
análisis cuantitativo es peor.
Como las especies separadas eluyen de uno de los extremos del capilar, se pueden utilizar
detectores cuantitativos como los empleados en HPLC. Como resultado se obtiene un
electroferograma con picos característicos de cada compuesto separado. En realidad ambas
técnicas son complementarias al basarse en mecanismos de separación diferentes.
Podemos diferenciar varios tipos de electroforesis capilar:
La electroforesis capilar en gel combina la técnica de electroforesis con la cromatografía de
reparto. Permite la separación en función de la migración electroforética y también en
función del peso molecular de las muestras. Se lleva a cabo en una matriz polimérica con
estructura de gel poroso, cuyos poros contienen una mezcla tampón donde ocurre la
separación. Estos geles están contenidos en un tubo capilar. Los geles utilizados son
también de agarosa y poliacrilamida.
Electroforesis capilar de zona: es una de las técnicas más importantes y más utilizada
debido, probablemente a su simplicidad y elevado poder de separación. Está basada en la
separación de los analitos según la relación carga/tamaño.
En esta técnica la composición del tampón es constante en toda la zona de separación. El
potencial aplicado hace que los diferentes componentes iónicos de la mezcla migren cada
uno según su propia movilidad y se separen en zonas que puedan estar completamente
resueltas o parcialmente solapadas. Entre las zonas completamente resueltas hay huecos
ocupados por el tampón. Su principal inconveniente es que no permite separar los
compuestos neutros.
Enfoque isoeléctrico: la diferencia de los puntos isoeléctricos de las proteínas se aprovecha
para separarlas por el método de isoelectroenfoque. Este método se basa en establecer un
gradiente de pH estable en una disolución o gel. Este gradiente se establece por un conjunto
de tampones especiales llamados anfolitos que migran por sí mismos hasta que alcanzan
sus puntos isoeléctricos. Cuando al gradiente de pH se le introduce una proteína, cada zona
intercambia protones con la muestra proteica, generando una separación isoeléctrica
conocida como electroenfocado.
La isotacoforesis significa electroforesis a velocidad uniforme. Esto significa que el tiempo
de recorrido en el capilar bajo condiciones isotacoforéticas es independiente de la
velocidad. Es una técnica de separación por desplazamiento.
Antes de iniciar la corrida, el capilar se debe llenar con un electrolito líder o guía en un
extremo. Este debe tener una gran movilidad y debe ser mayor que la de los componentes a
separar. Luego se introduce la muestra seguida del electrolito terminal o cola, cuya
movilidad debe ser menor que cualquiera de los componentes de la muestra. La selección
de los electrolitos guías y terminales depende del conocimiento de los valores de las
movilidades y del pKa para todos los componentes de la muestra.
En la isotacoforesis las bandas siempre están en contacto con la zona adyacente. Esta
característica es necesaria para mantener la continuidad eléctrica a lo largo del sistema,
dado que no hay un electrolito de soporte.
Esta técnica puede ser utilizada para determinar cationes y aniones. Se requiere usualmente
corridas separadas para determinar cada forma iónica.
La electrocromatografía capilar es un híbrido entre la HPLC y la CE donde se reúnen
algunas de las mejores características de cada técnica por separado, por lo que tiene
ventajas sobre ellas. De esta manera la electrocromatografía capilar puede usarse para la
separación de especies no cargadas. Proporciona una elevada eficacia en las separaciones de
microvolúmenes de disolución de muestra, sin necesidad de aplicar un bombeo de alta
presión.
En la electrocromatografía capilar la fase móvil se transporta a través de la fase estacionaria
por el bombeo ejercido por el flujo electroosmótico y no por un bombeo mecánico, lo que
simplifica significativamente el equipo.
Se diferencian dos tipos de electrocromatografía capilar:
 Electrocromatografía rellena, en la cual un disolvente polar se conduce por el flujo
electroosmótico a través de un capilar que contiene un relleno típico de HPLC en fase
inversa. Las separaciones dependen de la distribución de los analitos entre la fase móvil
y la fase estacionaria líquida retenida por el relleno.
 Cromatografía capilar electrocinética micelar. Esta técnica requiere la utilización de un
tensoactivo en un nivel de concentración en el cual se formen micelas. Estas micelas son
capaces de alojar compuestos no polares en su interior. La interacción de las micelas y
los solutos es la que produce la separación.
En resumen la cromatografía y la electroforesis son en la actualidad técnicas ampliamente
utilizadas en la resolución de macromoléculas de interés en la industria biotecnológica,
biológica y bioquímica. Muestra de ello es el numeroso grupo de estudios realizados que se
encuentra en la literatura especializada.
Se destaca en las últimas décadas un mayor uso de la electroforesis capilar. Esta versión
instrumental de la electroforesis convencional resulta más ventajosa debido a los
pequeñísimos volúmenes que se necesitan para el estudio en cuestión y los resultados se
obtienen en un tiempo mínimo. Estos aspectos la hacen preferida entre las técnicas de
separación.
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Palabras clave: métodos de separación, cromatografía, electroforesis

Autor:

Teresa Fernández Aldama

teresa.fernandez[arroba]umcc.cu, teresa1925[arroba]hotmail.com
Marcelo Marcet Sánchez
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Carlos Martin Medina
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Eugenio Carrillo Prieto
eugenio.carrillo[arroba]umcc.cu, eugeniocarrillo2001[arroba]hotmail.com