Cromatografía PDF
Cromatografía PDF
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FACULTAD DE
CIENCIAS FORESTALES
Ing. Néstor René Ledesma
Mayo 2019
Técnicas de Análisis en Química Orgánica - CROMATOGRAFÍA
Corzo, Adriana
Técnicas de análisis en Química Orgánica : cromatografía : Cátedra de Química
orgánica y Biológica / Adriana Corzo. - 1a ed . - Santiago del Estero : Universidad
Nacional de Santiago del Estero - UNSE. Facultad de Ciencias Forestales, 2019.
Libro digital, PDF
LA CIENCIA EN LA
FILATELIA
El Royal Institute of Chemical es una organización científica británica fundada
en 1877. La Chemical Society, junto con el Royal Institute of Chemistry, Faraday
Society y la Society of Analytical Chemistryse se empiezan a fusionar en 1972,
convirtiéndose en la Royal Society of Chemistry en 1980. En 1977 fueron
emitidos los siguientes 4 sellos, en conmemoración del centenario de dicha
organización (1877 – 1977).
PRÓLOGO
Una vez que se identificaron y cuantificaron los procesos químicos que ocurrían
en Westernport, fueron creadas normas para la descarga desde la presa de
manera que su agua ácida no excediera la capacidad neutralizante de la fábrica
de papel.
Es así que, el importante desarrollo de la Química Analítica y su implicancia en
casi cualquier rama de la ciencia exige realizar permanentes esfuerzos en su
enseñanza. Esta preocupación por mejorar el proceso de enseñanza-aprendizaje
requiere del apoyo de material didáctico apropiado, de manera de facilitar al
estudiante su participación activa durante el mencionado proceso.
El objetivo del presente material de estudio no es desarrollar en profundidad ni en
toda su amplitud el tema que se aborda en el mismo, si no proveer a los alumnos
de las carreras de Ingeniería Forestal, Ingeniería en Industrias Forestales y
Licenciatura en Ecología y Conservación del Ambiente de la Facultad de Ciencias
Forestales una guía de estudio que les permita asomarse de una manera un poco
Índice
LA CIENCIA EN LA FILATELIA ...........................................................................2
PRÓLOGO .................................................................................................................3
CAPÍTULO I: Introducción a la Cromatografía .............................................................. 7
PRESENTACIÓN ......................................................................................................8
DEFINICIÓN Y PRINCIPIO DE FUNCIONAMIENTO .......................................10
TÉRMINOS COMUNMENTE USADOS EN CROMATOGRAFÍA ..................... 12
CLASIFICACIÓN ....................................................................................................17
Según el tipo de soporte físico sobre el cual se desarrolla ..................................17
Según el estado físico de la fase móvil ................................................................ 17
Según el estado físico de ambas fases y el mecanismo que rige la separación ...18
C-1) Cromatografía Líquido-Sólido................................................................ 18
C-1-1. Cromatografía de adsorción ............................................................ 19
C-1-2. Cromatografía de intercambio iónico .............................................20
C-1-3. Cromatografía de exclusión ............................................................ 20
C-2) Cromatografía Líquido- Líquido. ........................................................... 21
C-2-1. Cromatografía de reparto ................................................................ 21
C-2-2. Cromatografía de afinidad .............................................................. 22
C-3) Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia. .............................................22
C-4) Cromatografía de gases. .........................................................................25
CAPÍTULO II: Cromatografía planar en papel ............................................................. 30
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................31
Coeficiente Rf (Relación de Frentes) ..................................................................31
ETAPAS DE LA TÉCNICA .................................................................................... 33
Siembra ................................................................................................................33
Desarrollo o Corrida ............................................................................................ 34
Revelado ..............................................................................................................40
Evaluación de los resultados ................................................................................42
EFECTOS DE LA TEMPERATURA ....................................................................44
CAPÍTULO III: Cromatografía planar en capa fina ...................................................... 45
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................46
ETAPAS DE LA TÉCNICA .................................................................................... 48
Elección del Adsorbente ...................................................................................... 48
Elección de la Fase Móvil.................................................................................... 49
Preparación de las Placas ..................................................................................... 49
Activación de las placas ....................................................................................... 50
Siembra de las muestras en las placas .................................................................51
Formas de desarrollo............................................................................................ 51
Revelado de las placas ......................................................................................... 51
BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................53
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN A LA
PRESENTACIÓN
(a) (b)
Figura 1: (a) Mikhael Tswett (1872 – 1919); (b) separación de pigmentos vegetales por
cromatografía en papel.
DEFINICIÓN Y PRINCIPIO
DE FUNCIONAMIENTO
La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de
mezclas complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia. Es
un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo
objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo
identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Puede cumplir dos
funciones básicas que no se excluyen mutuamente:
• Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que
puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
• Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica).
En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeñas.
La separación se debe a la influencia de dos efectos contrapuestos:
a) Retención: Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase
estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido.
b) Desplazamiento: efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una
fase móvil, que puede ser un líquido, un gas o un fluido supercrítico.
El fenómeno de migración de los componentes de una muestra impulsados por la
fase móvil, a lo largo de la fase estacionaria, se denomina elución. La mezcla a
separar se deposita sobre la fase estacionaria, mientras que la móvil atraviesa el
sistema arrastrando los componentes de la misma, los cuales se desplazan a
distintas velocidades dependiendo de la magnitud de las interacciones relativas
de dichos componentes con ambas fases.
La fase móvil y la estacionaria se eligen de manera que los componentes de la
muestra se distribuyan de manera diferente entre ambas. Aquellos componentes
que son retenidos fuertemente por la fase estacionaria, se mueven lentamente
con el flujo de la fase móvil. Por el contrario, los componentes que se unen
débilmente a la fase estacionaria se mueven con rapidez junto con la fase móvil.
Como consecuencia de esta movilidad diferente los componentes se separan en
bandas o manchas que pueden analizarse cualitativamente y/o cuantitativamente.
Los fenómenos físicos que influyen directamente sobre las constantes de
equilibrio de distribución de los compuestos entre fase estacionaria y fase móvil
TÉRMINOS COMUNMENTE
USADOS EN
CROMATOGRAFÍA
♣ SOPORTE: papel u otro elemento físico sobre el cual queda retenida la fase
estacionaria, con la cual debe ser totalmente inerte.
♣ FASE ESTACIONARIA: sustancia sólida, o líquida sostenida por un soporte
inerte, con la cual interactúan de diversas maneras los componentes de la
muestra a analizar.
♣ FASE MÓVIL: es un líquido (o mezcla de líquidos), un gas o un fluido
supercrítico que fluyen a través del sistema cromatografico (papel, columna o
placa) arrastrando los solutos.
♣ SIEMBRA: Procedimiento mediante el cual se deposita la muestra a analizar
sobre una línea (línea de siembra), en el caso de la cromatografía que se
desarrollará en papel o en capa fina. Para ello se utilizan micropipetas (pipetas
Pasteur) de manera de asegurar que el volumen sembrado sea pequeño.
En los equipos automáticos más modernos la muestra se “inyecta” en el
dispositivo destinado para recibirla mediante el uso de jeringas, provistas junto
con el equipo para tal fin.
♣ CORRIDA CROMATOGRÁFICA O DESARROLLO: Término que se refiere a la
acción por la cual los componentes de la muestra son arrastrados por la fase
móvil.
♣ TIEMPO DE CORRIDA: Tiempo que dura una corrida. En la cromatografía
planar, se da por concluida la corrida una vez que se observa que el “frente del
solvente” ya no avanza más. En el caso de la cromatografía en columna, la cual
procede con flujo continuo de fase móvil, normalmente consiste en el tiempo que
toman todos los componentes de la muestra en salir de la columna, ser
detectados por el detector y su presencia ser indicada gráficamente.
♣ FRENTE DEL SOLVENTE: Distancia máxima recorrida por la fase móvil.
♣ REVELADO: Si la técnica cromatográfica se realizó en papel o en capa fina,
una vez concluida, interesa localizar la posición de las sustancias separadas. Si
las sustancias no son coloreadas, como para poder localizarlas a simple vista, se
recurre a diferentes métodos para poder hacerlo. Los métodos físicos como
Figura 3: Cromatograma
Concentración
encontrada de Cafeína
(obtenida en base al
cálculo del área
debajo de su pico)
CAFÉ DE FILTRO
CAFÉ INSTANTÁNEO
Coca - Cola TÉ
CLASIFICACIÓN
Son diversos los criterios usados para la clasificación, siendo los más comunes
los relacionados con:
➢ A) El tipo de técnica empleada (o soporte físico sobre el cual se lleva a
cabo).
➢ B) El tipo de fase móvil utilizada.
➢ C) Según el estado físico de ambas fases.
➢ D) El mecanismo que rige la separación.
CROMATOGRAFÍA
EN
PLANAR COLUMNA
EN CAPA
EN PAPEL
FINA
Sustancia no
adsorbida
(A) (B)
(C)
Figura 11: (A): Esquema general básico de un equipo para HPLC; (B): Columnas
para HPLC; (C): Modelo de equipo para HPLC.
Figura 12: Cromatograma obtenido por HPLC del agua de perfume JꞋ Adore,
como ejemplo de análisis de una muestra compleja
Figura 13: Cromatograma HPLC de café. (A) Cafeína; (B) cafeína y sus
productos después de 4 minutos de ozonización a pH 7
(a) (b)
La Figura 15 muestra un modelo de los equipos usados para llevar a cabo una
cromatografía de gases.
CAPÍTULO II
INTRODUCCIÓN
ETAPAS DE LA TÉCNICA
SIEMBRA
Recordemos que, por “siembra”, se entiende el procedimiento mediante el cual se
deposita la muestra a analizar sobre una línea (línea de siembra), en el caso de la
cromatografía que se desarrollará en papel.
Para ello se utilizan micropipetas Pasteur (o, en su defecto, pequeños tubos
capilares) de manera de asegurar que el volumen sembrado sea pequeño. Una
buena resolución en la separación de los componentes de la muestra depende de
la concentración y del diámetro de la mancha aplicada.
La muestra a analizarse aplica en el papel a no menos de 1,5 cm del borde
inferior de una tira rectangular de papel, y a no menos de 1,5 cm de los bordes
laterales. Se toca el papel con la punta de la pipeta cargada con muestra,
evaporando el solvente entre cada toque, a fin de concentrar el punto de siembra
y tratando de que la mancha producida no supere un diámetro de 3 mm. La
siembra es puntual para fines analíticos, y en banda para fines preparativos. La
Figura 19 muestra lo expuesto.
Cuando el objetivo de la cromatografía en papel, además de separar los
componentes de la muestra en estudio, es IDENTIFICARLOS se requiere de
patrones puros de identidad conocida los cuales se siembran junto con la muestra
manteniendo, entre cada punto de siembra, una distancia no menor de 1 cm. Al
finalizar la corrida cromatográfica, la identidad de los componentes de la muestra
problema se determina por comparación de la distancia recorrida por cada uno de
ellos con la distancia recorrida por cada uno de los patrones.
b) Se dibujan los
a) Se dibuja la línea puntos sobre los
de siembra a 1.5 cuales se depositaran
cm. del borde los patrones y la
muestra a analizar
inferior del papel.
con, al menos, 1 cm
de distancia entre c/u
DESARROLLO O CORRIDA
Es el movimiento diferencial de los componentes de una muestra, al ser
arrastrados por la fase móvil. El desarrollo de esta técnica se lleva a cabo en
cubas o cámaras cromatográficas, como las mostradas en la Figura 20. Las
mismas consisten en recipientes rectangulares de vidrio con tapa hermética, con
lo cual se evita el escape de la fase móvil.
Antes de colocar el papel sembrado con la muestra y los patrones se debe saturar
la cuba con el objeto de asegurar una distribución uniforme de la fase vapor de la
fase móvil en el interior de la misma, hasta alcanzar un equilibrio. Para ello se
Con la técnica ascendente la fase móvil solo puede llegar hasta el extremo
superior del papel, cesando en este momento su movimiento a través del
mismo. Esto, considerando que la atmósfera en la cubeta está saturada
con los vapores de la fase móvil. Así, todos los compuestos separados
permanecen en el papel, y la distancia recorrida por la fase móvil es fija. El
método ascendente da también mejores resultados con disolventes muy
volátiles. Una desventaja de esta técnica es que los compuestos con R F
muy bajos muy a menudo se separan de manera incompleta.
En la técnica descendente se le permite a la fase móvil correr en el papel
debido a la fuerza de la gravedad, con lo cual es posible aumentar
considerablemente la longitud del recorrido y, de esta manera, conseguir
mejores separaciones.
(A) (B)
Figura 24: (A). Esquema del dispositivo para obtener un cromatograma circular
usando vidrio de reloj como contenedor del disolvente: A) líquido eluyente; B)
papel de filtro; C) mancha; D) cromatograma obtenido. (B) Cromatograma circular
de una mancha de tinta, usando un vaso como contenedor del disolvente.
(1) (2)
Figura 25: Cromatogramas circulares: (1). A) frente del solvente; 1,2 y3 especies
separadas. (2). Cromatogramas circulares de suelos
REVELADO
.
Figura 26: Cromatografía en papel de muestras de orina y sangre. Carriles 1, 4,
8, 10, 11. Controles normales de orina. Carril 2.Muestra de orina con aumento de
metionina. Carril 3. Muestra de orina de paciente en seguimiento por sospecha de
cistinuria, banda de cistina característica Rf = 0,08 (primera flecha negra de abajo
hacia arriba). La separación de aminoácidos muestra un patrón de excreción
anormal donde comigran arginina, lisina y ornitina (segunda flecha negra de abajo
hacia arriba) característica de estos pacientes, comparado con controles
normales. Carriles 5, 6 y 9. Control normal de plasma. Carril 7. Patrón o estándar
total de aminoácidos ubicado en la parte central del cromatograma, el cual
muestra patrón característico de cistina Rf = 0,08
1 2
Muestra: Extracto alcohólico de
3 pétalos de corrihuela.
Eluyente: alcohol-agua-HCl.
2 – Luz visible.
3 – Luz UV
EFECTOS DE LA TEMPERATURA
CAPÍTULO III
INTRODUCCIÓN
ETAPAS DE LA TÉCNICA
Interacción puente
de hidrógeno
Alúmina
Gel de sílice
Hexano < tetraclorometano < cloroformo < diclorometano < acetato de etilo < acetona < 2‐propanol
< metanol < agua
Figura 31: Placas de vidrio y de aluminio, con gel de sílice como adsorbente, para
cromatografía en capa fina
6 - FORMAS DE DESARROOLLO
Son esencialmente las mismas que las descriptas para la cromatografía en papel.
Se colocan las placas en cubas de vidrio y se procede a su desarrollo (o corrida).
El desarrollo ascendente es el más utilizado y puede ser considerada como la
técnica básica. En caso de no obtenerse una buena separación por esta técnica,
se recurre a un desarrollo bidimensional, como el explicado para la cromatografía
en papel.
BIBLIOGRAFÍA
Páginas web
https://www.google.com.ar/?gfe_rd=cr&ei=htI6U7PSC4aF8QfRrYGQBQ#
www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivos/.../Tema6.pdf
www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivos/.../Tema6.pdf
rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8246/7/T2cromagraf.pdf
www.uprm.edu/biology/profs/velez/fina.htm