Cromatografia de Intercambio Ionico

PRACTICA No.
“CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO: SEPARACION DE LOS COMPONENTES DE UNA

MUESTRA PROTEICA DE HONGOS.”
I. RELACION DE CONOCIEMIENTOS
Conocimientos requeridos Conocimientos por adquirir
Equilibrio de fases Modelos de isotermas de adsorción
Concepto de internase Liberalización de una isoterma
Transferencia de masa Parámetros de la isoterma de Freundich
Concepto de adsorción
II. OBJETIVOS.
Que el alumno aprenda los fundamentos y la técnica de separación de la cromatografía de intercambio iónico,
efectuando la elusión de una muestra proteica de hongos.
III. INTRODUCCIÓN.
La cromatografía de intercambio iónica es conocida desde hace 30 años. Se basa en el equilibrio de

intercambio entre una fase sólida que contiene grupos sulfónicos o dicarboxílicos (para la separación de
cationes) o grupos amino cuaternarios, ternarios o secundarios (para la separación de aniones). Estos
recubrimientos se depositan sobre pequeñas esferas de sílice, vidrio o de algún polímero que son capaces de
soportar las altas presiones comúnmente usadas en la cromatografía líquida de alta resolución. Una vez
eluida la muestra, la atracción de cargas opuestas entre los componentes y la fase estacionaria, permitirá que
estos se retengan con un mayor o menor grado según sea su carga. Por lo que componentes con mayor
carga opuesta, serán retenidos más. Para obligarlos a separarse se necesitara de una molécula de mayor
carga, para que al aumentar su concentración en el eluyente (fase móvil), desplazará a los componentes
gradualmente, es decir se intercambiarán.
IV. REACTIVOS Y MATERIALES.
REACTIVOS.
No. Material Cantidad
1 Agua destilada El necesario
2 Etanol El necesario
3 Hidróxido de Sodio El necesario
4 Tris-HCl (Tris Hidrocloruro) El necesario
5 NaCl El necesario
MATERIAL DE LABORATORIO
No. Material Cantidad
1 Cromatogro de líquidos de Baja presión 1
2 Columna Q-Sepharosa 1
3 .unidad de filtración 1
4 Filtros de celulosa (45μm de porosidad) 3
5 Bomba de vacio 1
6 Matraz aforado 1L 1
7 Matraz aforado de 250 mL 1
8 Piceta con agua 1
9 Vaso de precipitados de 500 mL 1
10 Agitador magnético 1
11 Matraz Kitazato de 500 mL 1
12 Manguera de látex 1
13 Parrilla erétrica 1
V. PROCEDIMIENTO,
Tratamiento de soluciones (previo a la práctica) Una vez preparada las soluciones (mencionadas
anteriormente), filtrar utilizando un filtro de 45 m de porosidad, acoplado a la unidad de filtración. Colocar cada
una de las soluciones filtradas en un matraz Kitazato de 500 mL limpio, adicionar un agitador magnético y
tapar la boca del matraz con una tapa de plástico. Conectar este matraz a una bomba de vació durante 15
minutos con agitación constante. Etiquetar las soluciones. Cada solución que ingrese al cromatógrafo deberá
pasar por este tratamiento. Tratamiento de la muestra (previo a la práctica) Macerar en un mortero un
fragmento de 1 g de hongo seta en 5 mL de solución de Tris-HCl 50 mM pH 7.3, y colocar este macerado en
un tubo de centrifuga de 25 mL y efectuar el proceso a 10,000 rpm durante 15 minutos. Posteriormente, el
sobrenadante es aforado a 10 mL con solución de Tris-HCl 50 mM pH 7.3. Acondicionamiento del Equipo
(previo a la práctica) El equipo consta de dos mangueras de ingreso de líquidos, la entrada A y la B y dos
mangueras de salida. Las condiciones a las que trabajará siempre la bomba peristaltica es un flujo de 5
mL/min. La limpieza de las mangueras del equipo deberá efectuarse con las soluciones anteriormente
tratadas. Este proceso comienza por limpiar las mangueras y la columna (HiPrep, fase estacionaria:
Qsepharosa), transportando un volumen total de 100 mL agua des ionizada a un flujo volumétrico de 5
mL/min. Posteriormente pasar por las mangueras 80 mL de 2M de NaCl, seguido de 50 mL de agua
desionizada. Posteriormente 80 mL de NaOH y después 50 mL de agua desionizada. Por último 80 mL de
etanol al 70% y 50 mL de agua. Equilibrio Químico de la columna Para efectuar este proceso se colocan los
amortiguadores que servirán como fase móvil del experimento, de manera que se colocaran en forma
permanentemente en las mangueras de entrada A y B. Se hacen pasar 100 mL de amortiguador de Tris-HCl
50 mM pH 7.3, por la manguera de entrada A. Posteriormente 100 mL de amortiguador Tris-HCl 50 mM pH
7.3 con NaCl 0.5 M por la manguera B y por último 100 mL del primer amortiguador por A. Rutina programada
del Equipo, Inyección y Elusión de la Muestra El equipo deberá programarse por intervalos de tiempo, de la
siguiente forma antes de que se inyecte la muestra: De 0 a 16 minutos pasará solamente la solución de Tris
por la entrada A. De 16 a 80 minutos el equipo mezclara en forma gradual de 0 a 100%, la solución de la
entrada A, con la de Tris-NaCl por la entrada B. Un último paso, de 80 a 90 minutos solamente pasará por B,
100% de solución Tris-NaCl. El aparato cuenta con un dispositivo colector de fracciones, en donde se
colocan previamente 80 tubos limpios y cuando inicie la rutina, se depositarán 5 mL de las soluciones eluidas
por cada tubo en cada minuto. El proceso cromatográfico comienza al iniciar la rutina programada. Cuando se
cumpla un minuto pausar esta rutina , sacar la manguera A de la solución y colocarla en el matraz con la
muestra, que será absorbida en su totalidad, posteriormente regresar la manguera A a la solución respectiva,
reiniciar la rutina Se puede monitorear la elusión, ya que existe un detector de conductividad eléctrica, que
medirá la concentración relativa de los iones en la fase móvil y un detector de absorción UV-Visible que
medirá la concentración de las proteínas en solución, a una longitud de onda de 280nm. Estos dos detectores
están acoplados a las mangueras y a una computadora. Esperar a que se cumpla la rutina en su totalidad.
INFORME
 Reportar en una gráfica el comportamiento de las señales registradas por los dos detectores.
 Efectué los comentarios pertinentes sobre las señales registradas y relacione con los componentes
de la muestra.
 Comente que otros métodos se pueden aplicar, para conocer el contenido de cada tubo en las
fracciones colectadas durante el experimento.
 Investigue que características tiene la columna utilizada.
 Describa las características de los dos detectores utilizados.
VI. CONCLUSIONES.
VII. CUESTIONARIO.
1. ¿Si deseo mayor separación entre cada señal (picos) registrada que condiciones podría mover en el
experimento? Justifique su respuesta.
2. ¿Cómo afecta la concentración del eluyente en los tiempos de retención de los analitos?
3. ¿Cómo afecta el pH de la fase móvil sobre el poder de elusión de un analito?
4. Efectué una tabla de 5 soportes cationicos y 5 anionicos utilizados, colocando la carga del grupo
funcional importante
5. Efectué una tabla de 10 amortiguadores que se pueden utilizar para cada fase móvil indicando el pH
de trabajo en la cromatografía de intercambio ionico.
6. Una vez utilizadas, ¿Qué condiciones de almacenamiento se debe tener en las columnas
preempacadas?
7. Que cuidados se debe tener en el manejo de soluciones, equipo y de las muestras que se están
separando.
Vll. BIBLIOGRAFIA.
 Handbook “Ión Exchange Chromatography, Principles and Methods”, Amersham
Pharmacia 2000
 J. Weiss (1995). Ion Chromatography, 2nd Edition VCH.
 Harris, D. C. (2001). Análisis Químico Cuantitativo. Ed. Reverté S. A., España. Ed. Mac Graw
Hill Interamericana.
 Luna-Rangel, R. 1981. Fundamentos de Química Analítica. Vol. I. Ed. Limusa México
 Zweig, G. and Sherma, J. (eds). 1978. Handbook series in chromatography. CRC Handbook
Series in Chromatography. Section A: General data and principles. Vol II. CRC Press, USA.
 Willard, H. H., Merritt, Jr. L. L. And Dean , J. A. 1981. Métodos Instrumentales de Análisis.
C.E.C.S.A, México

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