Evaluación de Microorganismos Nativos Por Biodegradación de Aceite y Grasa Procedente de Los Efluentes de La Refinería Aceite de Palma

Evaluacin de microorganismos nativos por biodegradacin de aceite y grasa procedente
de los efluentes de la refinera aceite de palma
Introduccion
El aceite de palma se ha convertido en un gran producto agrcola global que es usado para
aplicaciones alimenticias y no alimenticios, la manufactura de productos de valor aadidos
y ms recientemente una prometedora materia prima para la produccin de biocombustible.
Actualmente hay cerca de cinco millones de hectreas de palma plantada en el mundo,
representando 16 millones de toneladas de produccin anual. Colombia es el mayor
productor en America y cuarto mas grande en el mundo seguido Malasia, Indonesia y
Nigeria. Este producto es mayormente obtenido del aceite de palma de Africa (Elais
guineensis Jacq.) e hibridos con otras tantas especies tambin.
Aparte de la importancia econmica del aceite de palma tambin a ha contribuido con la
contaminacin ambiental como consecuencia de la produccin de grandes cantidades de
subproductos de la extraccin de aceite. En particular el efluente del molino del aceite de
palma (EMAP) es un agua residual espesa y oscura generada de las actividades de la
molienda del aceite de oliva, la cual produce grandes cantidades de gas metano de su
proceso anaerbico. Este gas es conocido por ejercer casi 20 veces sobre otros gases el
Potencial del Calentamiento Global (PCG). Mas aun EMAP frecuentemente tiene grandes
cantidades de aceite y grasa (A&G), solidos suspendidos totales (SST), oxigeno quimico
(OQ), demanda de oxigeno bioqumico (DOQ), los cuales producen la mayor cantidad de
efectos contaminantes en sus efluentes debido a sus propiedades altamente nocivas y su
naturaleza acida. La descarga de estos elfuentes en cuerpos acuferos pueden producir
efectos importantes como la alteracin del pH o el incremento del OQ y DOQ.
Adicionalmente esta agua contaminada podra limitar el paso de luz y oxigeno afectando
negativamente el proceso de fotosntesis, generar eutrofizacin y componentes toxicos. Por
lo tanto el tratamiento a EMAP es esencial para evitar la contaminacin de los cuerpos
acuferos.
Una opcin interesante ppara el manejo de la EMAP y otros residuos liquidos recae en un
tratamiento biolgico, que permite la degradacin del contaminante organico presente en
los efluentes generando lodo organico que puede ser usado despus para la produccin de
compost. Se ha demostrado que la bioaumentacion o la introduccin de una bacteria
exgena ser un mtodo eficiente para la reduccin de contaminantes organicos en la
EMAP. Mejorando asi el rendimiento total degradativo aadiendo microorganismos
con gran habilidad de degradacin de especficos contaminantes. Estudios previos han
demostrado que la bioaumentacion facilita la degradacin de grandes cantidades de grasa
y otros contaminantes organicos presentes en los efluentes por la adicion a EMAP de
microorganismos aislados demostrando actividad lipolitica tales como la bacteria aerobica
Pseudomonas spp. Y Bacillus spp. O levadoras como Candida spp. Y Yarowia spp.
Mientras que varias bacterias con el poder de regeneracin de EMAP han sido identificadas
hay pocos estudios de los consorcios microbianos ambientales de su habilidad de degradar
estas aaguas residuales ya sea por uso de mejoradores aerobicos microbianos nativos o
consorcios microbianos aislados provenientes de desperdicios altamente contaminados. En
este estudio nos concentramos en el uso de consorcsio microbianos mixtos compuestos
por levaduras y bacterias. El uso de este tipo poco comn de cultivos seria beneficial puesto
que EMAP esta compuesto de matrices heterogneos que contiene comnbinacioones
complejas de compuestos organicos, los cuales pueden ser metablicamente degradados
por una comunidad de organismos aerobicos pertenecientes a diferentes rangos de
dominios y taxa. Mas aun el uso de estos microorganismos nativos pueden mejorar su
habilidad de adaptarse y sobrevivir y degradar mayores cantidades de efluentes con
grandes cantidades de solidos organicos suspendidos. Por lo tanto este estudio fue dirigido
para aislar microorganismos nativos con la habilidad de metabolizar A&G y evaluar su
potencial ya sea como organismos nicos o inoculos mixtos para el tratamiento de EMAP
proveniente de la refinacin del aceite de palma.
Materiales y Metodos
Muestras de contenidos residuales de A&G

Fueron usadas muestras de residuos liquidos y solidos de una tramp ade grasa del proceso
de refinacin del aceite de palma de la planta C.I Sacietes S.A.S (Santander Colombia).
Muetsas compuestas de desechos de ya sea 2 litros o 2 kilogramos fueron obtenidos
usando 250 ml de un frasco ambar Winkler en diferentes lugares y profundidades a travs
de la trampa de aceite. Las muestras fueron almacenadas a 4 grados C hasta su uso. Una
caracterizacin fisicoqumica fueron realizadas para todas las muetras de EMAP
consistiendo en la medida del pH, SST, OQ, DOQ y A&G contenido de cauerdo a los
mtodos indicados en EPA 150.0 410.4 340.2 y por mtodo de Soxhlet ASTM D5369
respectivamente.
Seleccin y aislamiento de microorganismo nativos
La separacin de microbios de desperdicios liquidos y solidos aceitosos se realizo en

diferentes pasos. Primero un preenriquecimiento no selectivo fue hecho aadiendo 10 gr o
10 ml (dependiendo de la muestra) a 70 ml de un medio salino basal
0.1 g/L de extracto de levadura. Los frascos fueron

Incubados con agitacin constante a 150 rpm a 30C hasta turbiedad en el medio
observado, subsecuentemente un paso selectivo fue realizado diluyendo 10 ml de cultivo
preenriquecido en 90 ml de BMS modificado usando 0.05% de aceite de palma como fuente
de carbono usando las mismas condiciones descritas anteriormente. Para la aislacin 1 ml
de cultivo enriquecido fue impregnado en BSM solido modificado e incubado a 30C por 96
horas. Colonias individuales fueron seleccionadas y transferidas a nuevas placas de BSM
que contenan aceite de palma como fuente de carbono y el proceso se repiti.
Caractersticas morfolgicas macroscpicas y microscpicas en las colobias fueron
verficadas proveendo una base para el establecimiento de cultivos puros. Cada cultivo puro
(de una sola colonia) fue considerado un microorganismo aislado.
Deteccion de microorganismos con potencial degradador en A&G
El potencial de degradacin del aceite de microorganismoa fue asesorado mediante la

observacin de diferencias en su crecimiento usando aceite de palma como su nica fuente
de carbono en cultivos liquidos. Cada uno fue usado y se inocularon 2 ml de BSM liquido
que contiene 0.05% (p/v) de aceite de palma, e incubado a 30C a 150rpm por 48 horas.
Los cambios en los cultivos como incremento de turbidad, variacin del color y desaparicin
del aceite fueron evaluados cualitativamente. Algunos que presentaban presumiblemente
actividad lipolitica fueron identificados usando sistemas API 20E API20NE y APUI20C AUX
y por medio de amploficacion PCR y secuenciacin de las regiones de los procariotas
16rRna y eucariotas ITS1 ITS2 y 5.8 rRna. De acuerdo a sus reportes anteriores. Tubos
BSM sin aceite de palma fueron inoculados con cada microorganismo aislado asi como los
tunos BSM no inoculados conteniendo 0.05% de aceite que fueron usados como controles.
Evaluacion del antagonismo microbiano
Para determinar si ocurrio interaccion interespecie negativa entre los aislados la evaluacin
in vitro de bacteria a bacteria, levadura a bacteria y levadura a levadura antogonicos de los
aislados muetra la mayor habilidad de eliminacin en A&G. fue hecha en una placa de
ensayo de acuerdo al mtodo de placas descrito por BAUER et al. Los asilados crecieron
en 50 ml de medio BSM liquido (conteniendo 20g/L de glucosa) a 30C con agitacin
constante a 200 rpm hasta que el cultivo llegue a una densidad ptica de 0.14 a 600 nm
(comparable con Mac Farland stantand No 0.5). Subsecuqntemente 100 uL de cada cultivo
(aprox 1.5x107 c.f.u) fueron esparcidos sobre la superfcie de los cultivos DE BSM 2 con
1.5% de agar y 5mm de dimetro de discos de nitrocelulosa impregnada con 50 uL de
cultivo de 24-h sobrenadante de losotros aislados que fueron puestos en la superficie. Las
placas fueron incubadas a 30C y los halos de inhbicion fueron medidos cada 24 h por 2
dias. Discos sin cultivo sobrenadante fueron usados como controles. Los ensayos fueron
realizados por triplicado.
Determinacion de Oxigeno Quimico OQ

La degradacin de A&G fue medida indirectamente por medio de remocin de OQ asi como
permite la cuantificacopn de materia organica en muestras liquidas inclutendo A&G. valores
OQ fueron determinados en triplicado de acuerdo al mtodo HACH 800. Los controles
consistidos en los frascos BSM no inoculados bajo las mismas condiciones descritas para
los inoculados. La medida indirecta de la degradacin fue calculadas segn la ecuacin
Donde OQ fue la concentracin inicial de OQ Y OQ FINAL. La concentracin final de OQ

esta en mg/L.
Esto fue corroborado a travs de una curva estndar en la cual las solucions con diferentes
contenidos de aceite de palma dieron un factor de correcion de 1.25 (1.25 mg/L de aceite
de palma correspondientes a 1 mg/L OQ)
Evaluacion de los aislados y los consorcios de microorganismo para la eliminacin
de A&G en cultivis liquidos
La habilidad de aislados selectos en degradar el aceite de palma fueron evaluadas en tubos
BSM que contenan 2000 mg/L de aceite de palma. Para esto 20 ml de 10 cfu/mL cultivos
en fase de latencia da cada aislados fueron inoculados en los frascos de vidrio que
contenan 200 mL de BSM mas aceite de palma que fue incubada a 27 +- 3C con constante
oxigenacin. La habilidad degradativa de los aislados fue determinada por el decenso de
A&G en su contenido medido como OQ durante 48 y 72 h respecto a los controles.
Subsecuentemente para evaluar los posibles efectos sinrgicos entre aislados asociados
fueron usados combinaciones de levaduras y bacterias.
Eliminacion de A&G del EMAP por medio de inoculacin mixta en un reactor batch
Para determinar la capacidad del consorcio construido de bacterias para degradar el A&G
en un reactor batch, una inoculacin mixta demostr actividad lipolitica fue generada
usando bacterias y levadiras aisladas degradadoras de aceite de palma que exhiban
interaccions no negativas como descritas arriba.
La evaluacin de la degradacin del A&G fue hecha en un-L bioreactor usando 3 L de
EMAP del proceso de refinacin. Aislados microbiales fueron cultivados separadamenre en
0.05% (v/v) de aceite de palma y se uso para inocular en el bioreactor a una concentracin
final de 10-9 cfu cada uno (1:1) y el volumen fue ajustado para 4 litros con EMAP. El proceso
fue realizado en 48 h a 27 +- 3C con constante oxigenacin.
La actividad de remocin de A&G fue determinada por medio del descenso de OQ y A&G
al final del proceso.
Las determinacin de A&G fueron hechas de acuerdo al mtodo soxhket astm d5369. Los
ensayos fueron realizados en triplicado.
Diseo experimental y anlisis estadstico
El experimento consista en un diseo aleatorio factorial de 2x2. La informacin de las
mediciones de OQ fueron analizadas por anlisis de varianza (ANOVA) seguidos por un
test de comparacin multiple BONFERRONI con el software de estadstica SPSS versin
14 IBM considerado las diferencias significativas estadsticamente las de p<0.05.
Resultados y discusin
La aislacin de microorganismos nativos con potencial de degradacin de restos aceitosos
es un paso clave para proveer mtodos mas seguros y rapidos para la remediacin de
efluentes provenientes de la refinacin del aceite de aplma asi como una reserva de
microorganismos con el poyencial de degradar el A&G y otros contaminantes con
sobrecargas, mientras se los evalua para el tratamiento del EMAP.
Caracteristicas fisicoqumicas de desperdicios aceitosos
Como se muestra en la tabla 1. Muetras de EMAP usadas para aislacin microbial muestran
valores de pH ligeramente acidos (5.43+-0.51) mientras que las muestras solidas fueron
mas cercanas a la neutralidad (6.20+-0.36). Niveles de SST, OQ y A&G fueron variables
con valores como 2943+-0.76, 11247 +- 1.85 y 4907+- 0.67 mg/L respectivamente. Estos
descubrimientos estn de acuerdo con los estudioos previos mostrando valores bajos de
pH de 3.8 a 4.7 y valores altos para solidos 18000 mg/L, OQ 50000 mg/L y grasas 7000
mg/L in aguas residuales y EMAPs del proceso de refinacin.
Estos niveles altos se piensan que son consecuencia de los acidos grasos libres producidos
durante el tratamiento del aceite. Los cuales pueden variar de acuerdo al tipo de fruta
procesada, su edad y el mtodo empleado para la extraccin del aceite y gomas, biomasas
proteicas y microbiales presentes durante el proceso.
En la practica estas tambin incrementan la probabilidad de aislar microorganismos
capaces de degradar elevadas concentraciones de estos compuestos.
Como se reporto anteriormente, una primera exposicin a altas concentraciones de acidos
grasos libres determinan fuertemente el tipo y numero de organismos degradadores de
A&G encontrados en EMAPs los cuales a su vez son influencian la habilidad degradativa
de los microorganismos nativos.
Aislamiento y proyeccin de los microorganismos degradadores de A&G

Un total de 31 microbios aislados, son correspondientes a 17 levaduras y 14 bacterias.
Fueron obtenidos de muestras liquidas y solidas basadas en su habilidad de usar el aceite
de palma como nica fuente de carbono en medio slido. Solo 11 de los 31 microbios
aislados mostraron visibles

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Muestras de contenidos residuales de A&G

Seleccin y aislamiento de microorganismo nativos

La separacin de microbios de desperdicios liquidos y solidos aceitosos se realizo en

0.1 g/L de extracto de levadura. Los frascos fueron

Deteccion de microorganismos con potencial degradador en A&G

El potencial de degradacin del aceite de microorganismoa fue asesorado mediante la

Evaluacion del antagonismo microbiano

Determinacion de Oxigeno Quimico OQ

Donde OQ fue la concentracin inicial de OQ Y OQ FINAL. La concentracin final de OQ

Aislamiento y proyeccin de los microorganismos degradadores de A&G

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