Taq 중합효소

Taq polymerase
DNA중합효소I, 내열성
PDB 1ktq EBI.jpg
Taq polA의 큰(Klenow) 조각. polA와 잔존 도메인을 포함합니다.
식별자
유기체테르머스 아쿠아쿠아티쿠스
기호.폴라
유니프로트P19821

Taq 중합효소는 [1]1976년 Chien 등에 의해 처음 분리된 호열성 유균 미생물 Thermus aquaticus의 이름을 딴 내열성 DNA 중합효소이다.그것의 이름은 종종 Taq 또는 Taq pol로 축약된다.그것은 DNA의 짧은 세그먼트의 양을 크게 증폭시키는 방법인 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 자주 사용된다.

T. 아쿠아티쿠스는 온천 및 열수 분출구에 서식하는 박테리아로 Taq 중합효소는 [2]PCR 중 단백질 변성 조건(고온)에 견딜 수 있는[1] 효소로 확인되었다.따라서 원래 PCR에 [3]사용되었던 대장균의 DNA 중합효소를 대체하였다.

효소 특성

Taq의 활성에 대한 최적 온도는 75–80°C이며, 92.5°C에서 2시간 이상 반감기, 95°C에서 40분, 97.5°C에서 9분 이상이며 72°[4]C에서 1000개의 염기쌍 DNA를 10초 이내에 복제할 수 있다.Taq는 75~80°C에서 효소 분자당 초당 약 150뉴클레오티드의 최적 중합 속도에 도달하며, 최적의 온도 범위로부터의 편차는 효소의 신장 속도를 저해한다.단일 Taq는 70°C에서 초당 약 60개의 뉴클레오티드, 55°C에서 24개의 뉴클레오티드/초, 37°C에서 1.5 뉴클레오티드/초, 22°C에서 0.25 뉴클레오티드/초를 합성한다.90°C 이상의 온도에서 Taq는 활성이 거의 없거나 전혀 나타나지 않지만 효소 자체는 변성되지 않고 [5]그대로 유지됩니다.반응 혈관에 특정 이온의 존재는 효소의 특정 활성에도 영향을 미칩니다.소량의 염화칼륨(KCl)과 마그네슘 이온(Mg2+)은 Taq의 효소 활성을 촉진합니다.Taq 중합효소는 50mM KCl에서 최대 활성화되며 뉴클레오시드 트리인산염(dNTPs) 농도에 의해 결정되는 적정 농도의2+ Mg에서 최대 활성화된다.고농도의 KCl과2+ Mg는 Taq의 [6]활성을 억제한다.흥미롭게도, 일반적인 금속 이온 킬레이트인 EDTA는 이러한 [7]금속 이온이 없을 때 Taq에 직접 결합합니다.

Taq의 단점 중 하나는 3~5' 핵산가수분해효소 교정 활동이[4] 부족하여 복제 충실도가 상대적으로 낮다는 것입니다.원래 그것의 오류율은 약 9,000개의 뉴클레오티드 [8]중 1개로 측정되었다.일부 내열성 DNA 중합효소는 Pfu DNA 중합효소와 같은 다른 호열성 박테리아 및 고세균으로부터 격리되어 교정 활성을 가지고 있으며, 고충실성 [9]증폭을 위해 Taq 대신(또는 그와 함께) 사용되고 있다.충실도는 Taq에 따라 크게 다를 수 있으며,[10] 이는 애플리케이션 다운스트림 시퀀싱에 큰 영향을 미칩니다.

Taq는 3' 끝에 A(아데닌)가 돌출된 DNA 제품을 만듭니다.이것은 T(티민) 3' 오버행이 있는 복제 벡터(플라스미드 등)를 사용하는 TA 클로닝에서 유용할 수 있으며, 이는 PCR 제품의 A 오버행을 보완하여 PCR 제품을 플라스미드 벡터에 결합할 수 있다.

PCR의 경우

1980년대 초, 캐리 멀리스는 Cetus Corporation에서 합성 DNA를 생명공학에 적용하는 일을 하고 있었다.그는 표적 DNA 가닥에 결합하기 위한 탐침으로 DNA 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것과 DNA 염기서열 분석 및 cDNA 합성을 위한 프라이머로 사용하는 것에 익숙했다.1983년, 그는 두 개의 프라이머를 사용하기 시작했는데, 하나는 표적 DNA의 각 가닥에 교배하기 위한 것이고, DNA 중합효소를 반응에 첨가하기 위한 것이다.이것은 기하급수적인 DNA [11]복제로 이어졌고,[3] 프라이머 사이의 분리된 DNA 세그먼트를 크게 증폭시켰다.

그러나 각 복제 라운드 후 혼합물을 90°C 이상으로 가열하여 새로 형성된 DNA를 변성시켜야 하며, 이 경우 가닥이 분리되어 다음 증폭 단계에서 템플릿 역할을 할 수 있습니다.이 가열 단계는 또한 Taq 중합효소 발견 전에 사용되었던 DNA 중합효소(대장균에서 추출된)를 비활성화합니다.Taq 중합효소는 변성 없이 DNA 가닥 분리에 필요한 95°C의 온도를 견딜 수 있기 때문에 이 용도에 적합합니다.

내열성 Taq를 사용하면 PCR을 고온(~60°C 이상)에서 실행할 수 있으므로 프라이머의 높은 특이성을 촉진하고 프라이머 다이머와 같은 비특이성 제품의 생산을 줄일 수 있습니다.또한 내열성 중합효소를 사용함으로써 각 열순환에 새로운 효소를 첨가할 필요가 없어진다.비교적 단순한 기계에서 하나의 닫힌 튜브를 사용하여 전체 공정을 수행할 수 있습니다.따라서, Taq 중합효소의 사용은 DNA [2]분석과 관련된 다양한 분자생물학 문제에 PCR을 적용할 수 있게 만든 핵심 아이디어였다.

특허 문제

Hoffmann-La Roche는 결국 Cetus로부터 PCR과 Taq 특허를 3억 3천만 달러에 사들였으며,[12] 이 특허로부터 최대 20억 달러의 로열티를 받았을 가능성이 있다.1989년 사이언스지는 Taq 중합효소를 첫 "올해의 분자"로 선정했습니다.캐리 멀리스는 1993년 생명공학 회사에서 수행한 연구로 유일하게 노벨 화학상을 받았다.1990년대 초까지 Taq 중합효소를 이용한 PCR 기술은 기초 분자생물학 연구, 임상시험, 법의학 등 많은 분야에서 사용되었다.그것은 [13]또한 에이즈에서 HIV를 직접 발견하는 데 있어서 긴급한 응용 프로그램을 찾기 시작했다.

1999년 12월 미국 지방법원 판사인 본 워커 판사는 Taq 중합효소와 관련된 1990년 특허가 부분적으로 Cetus Corporation의 과학자들에 의해 오해의 소지가 있는 정보와 잘못된 주장에 의해 발표되었다고 판결했다.이 판결은 1991년 Taq 특허를 사들인 호프만 라 로슈에 대한 프로메가의 도전을 뒷받침했다.워커 판사는 이번 [14]판결의 근거로 신시내티대 생물과학과의 존 트렐라 교수 연구실 등 다른 연구소의 연구 결과를 들었다.

도메인 구조

Taq 중합효소, 엑소핵산가수분해효소
Taq.png
DNA 옥타머에 결합된 완전 Taq DNA 중합효소
식별자
기호.탁엑소누크
팜PF09281
인터프로IPR015361
SCOP21qtm/SCOPe/SUPFAM

Taq PolA는 대장균 PolA와 유사한 전체적인 구조를 가지고 있다.교정을 담당하는 중간 3'-5' 핵산가수분해효소 도메인은 극적으로 변경되어 [15]기능하지 않습니다.아미노 말단에 기능성 5'-3' 엑소핵산가수분해효소 도메인을 가지며, 아래와 같다.나머지 두 도메인은 결합된 도메인 모션을 [16]통해 조정하여 작동합니다.

엑소핵산가수분해효소 도메인

Taq 중합효소 엑소뉴클레아제는 Taq DNA 중합효소 I의 아미노 말단에서 발견되는 도메인이다.리보핵산가수분해효소 H 유사 모티브를 가정한다.도메인은 중합효소에 [17]5'-3' 엑소핵산가수분해효소 활성을 부여한다.

프라이머를 분해하고 PCR [9]사용을 위해 소화에 의해 제거되어야 하는 대장균의 동일한 도메인과는 달리,[18] 이 도메인은 프라이머를 분해하지 않는다.이 활동은 TaqMan 프로브에 사용됩니다. 도터 가닥이 형성되면 템플릿에 상보적인 프로브가 중합효소와 접촉하여 형광 [19]조각으로 분해됩니다.

DNA에 의한 결합

Taq 중합효소는 그 중합효소 활성부위 균열에서 이중 DNA의 둔단과 결합한다.Taq 중합효소는 결합 DNA와 접촉하기 때문에 그 곁사슬이 DNA의 푸린 및 피리미딘과 수소 결합을 형성한다.DNA에 결합된 Taq 중합효소의 동일한 영역 또한 엑소뉴클레아제와 결합한다.Taq 중합효소에 결합된 이러한 구조는 서로 다른 상호작용을 한다.

돌연변이

퇴적 3'-5' 핵산가수분해효소 활성을 2배 향상시키는 사이트 지향 돌연변이 유발 실험이 보고되었지만, 그렇게 함으로써 오류율이 [20]감소하는지는 보고되지 않았다.비슷한 생각을 따라, 키메라 단백질은 대장균, Taq, 그리고 T. neapolitana 중합효소 I의 체리 채취 도메인에 의해 만들어졌다.대장균의 잔존 도메인과 기능적인 도메인을 교환하면 교정 능력은 있지만 최적의 온도와 낮은 내열성을 [21]가진 단백질이 생성되었다.

5'-3' 핵산가수분해효소 도메인이 없는 중합효소 버전이 생성되었으며, 그 중 Klentaq 또는 Stoffel 단편이 가장 잘 알려져 있다.엑소핵산가수분해효소 활성의 완전한 결여는 이러한 변이체들을 2차 구조를 보이는 프라이머와 원형 [9]분자를 복사하는 데 적합하게 만든다.다른 변화처럼 T7DNA중합 효소, 기질을 인정하는 고성능 중합 효소, Thermosequenase과 Klentaq 사용이 포함되, 억제제에게 높은 공차, 또는 촉매 현장 주변을 더 엄격하게 불리한 조건에도 불구하고 DNA를 개최할 여분의helix-hairpin-helix의 모티프가 있"domain-tagged"버전으로 돌연변이들이다.[22]

Taq 중합효소

질병 검출의 중요성

PCR DNA 복제에 제공되는 Taq 중합효소의 개선으로 인해, 보다 높은 특이성, 적은 비특이성 생성물, 보다 단순한 프로세스와 장비로, 질병을 발견하는 데 있어 중요한 역할을 해왔다."감염병 진단에 중합효소 연쇄반응(PCR)을 사용하면 까다로운 병원균으로 인한 질병을 조기에 진단하고 적절히 치료하고 느리게 성장하는 유기체의 항균 감수성을 판단하고 [23]감염의 양자를 확인할 수 있는 능력을 얻을 수 있었습니다."Taq 중합효소의 실행은 수많은 생명을 구했다.그것은 결핵, 연쇄상구균 인두염, 비정형 폐렴, 에이즈, 홍역, 간염, 궤양성 요로겐 감염을 포함한 많은 세계 최악의 질병을 발견하는데 필수적인 역할을 해왔다.특정 DNA 샘플의 복제를 재현하는 데 사용되는 방법인 PCR은 환자의 샘플에서 표적 병원체의 특정 DNA 배열을 목표로 하고 지시 배열의 미량을 최대 수십억 번 복제하여 증폭시킴으로써 질병 검출을 가능하게 한다.이것은 질병 검출의 가장 정확한 방법이지만, 특히 HIV의 경우,[24] 상대적으로 높은 비용, 노동력, 그리고 시간이 필요하기 때문에 대체적이고 열등한 검사만큼 자주 수행되지는 않습니다.

PCR 복제 과정의 촉매로서 Taq 중합효소에 대한 의존성은 2020년 COVID-19 대유행 동안 강조되었다.필요한 효소의 부족으로 인해 전세계 국가들이 바이러스 검사 키트를 생산하는 능력이 저하되었다.Taq 중합효소가 없으면 질병 검출 과정이 훨씬 느리고 [25]지루하다.

PCR 질병 검출에 Taq 중합효소를 사용하는 장점에도 불구하고, 효소는 단점이 없는 것은 아니다.레트로바이러스 질환(HIV, HTLV-1, HTLV-II)은 종종 게놈에 구아닌에서 아데닌으로의 돌연변이를 포함한다.이러한 돌연변이는 PCR 검사에서 질병을 검출할 수 있게 하지만 Taq 중합효소의 충실도가 상대적으로 낮기 때문에 동일한 G-to-A 돌연변이가 발생하고 잘못된 양성반응이 [26]나타날 수 있다.

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레퍼런스

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