Get Macrolides As Immunomodulatory Agents 1st Edition Bruce K. Rubin Free All Chapters

Full download test bank at ebookmeta.
com
Macrolides as Immunomodulatory Agents 1st Edition

Bruce K. Rubin
For dowload this book click LINK or Button below
https://ebookmeta.com/product/macrolides-as-
immunomodulatory-agents-1st-edition-bruce-k-rubin/
OR CLICK BUTTON
DOWLOAD EBOOK
Download More ebooks from https://ebookmeta.com

More products digital (pdf, epub, mobi) instant
download maybe you interests ...
Natural Products as Anticancer Agents 1st Edition Bimal

Krishna Banik
https://ebookmeta.com/product/natural-products-as-anticancer-
agents-1st-edition-bimal-krishna-banik/
Current Perspectives on Anti Infective Agents 1st

Edition K. Tamreihao
https://ebookmeta.com/product/current-perspectives-on-anti-
infective-agents-1st-edition-k-tamreihao/
Redox Active Molecules as Therapeutic Agents Ana Sofia

Fernandes (Editor)
https://ebookmeta.com/product/redox-active-molecules-as-
therapeutic-agents-ana-sofia-fernandes-editor/
Children as Agents in Their Worlds A Psychological

Relational Perspective 1st Edition Greene
https://ebookmeta.com/product/children-as-agents-in-their-worlds-
a-psychological-relational-perspective-1st-edition-greene/
Flavonoids as Nutraceuticals 1st Edition Rajesh K.
Kesharwani
https://ebookmeta.com/product/flavonoids-as-nutraceuticals-1st-
edition-rajesh-k-kesharwani-2/
Flavonoids as Nutraceuticals. 1st Edition Rajesh K.

Kesharwani
https://ebookmeta.com/product/flavonoids-as-nutraceuticals-1st-
edition-rajesh-k-kesharwani/
Curating in a Time of Ecological Crisis Biennales as

Agents of Change 1st Edition Felicity Fenner
https://ebookmeta.com/product/curating-in-a-time-of-ecological-
crisis-biennales-as-agents-of-change-1st-edition-felicity-fenner/
Meteorite Mineralogy Alan E. Rubin
https://ebookmeta.com/product/meteorite-mineralogy-alan-e-rubin/
Finding the Will of God A Pagan Notion 2nd Edition

Waltke Bruce K
https://ebookmeta.com/product/finding-the-will-of-god-a-pagan-
notion-2nd-edition-waltke-bruce-k/
Progress in Inflammation Research 92
Series Editors: Michael J. Parnham
Thorsten J. Maier · Emanuela Ricciotti
Bruce K. Rubin
Masaharu Shinkai Editors
Macrolides
as Immuno-
modulatory
Agents
Progress in Inflammation Research
Volume 92
Series Editors
Michael J. Parnham, Faculty of Chemistry, Biochemistry and Pharmacy, Goethe
University Frankfurt am Main, Frankfurt am Main, Germany
Thorsten J. Maier, Federal Institute for Vaccines and Biomedicines, Paul Ehrlich
Institute, Langen, Germany
Emanuela Ricciotti, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania,
Philadelphia, PA, USA
This book series addresses all key topical aspects of basic research, therapy and its
clinical implications in the field of inflammatory diseases. It provides a unique
reference source for academic and industrial biomedical researchers, drug develop-
ment personnel, immunologists, rheumatologists, cardiologists, allergologists and
many other relevant clinical disciplines. Each publication supplies regular scientific
updates on newest developments and allow providing access to state-of-the-art
techniques and technologies.
The series gathers knowledge from leading authorities on the multiple facets of
inflammation research, making it a valuable asset for advanced students in biomed-
ical sciences, early career investigators and for professionals in both basic and
translational research and in the clinic. Each volume comprises a carefully selected
collection of high-quality review articles on the respective field of expertise. They
also introduce new investigators to the most pertinent aspects of inflammatory
disease and allow established investigators to understand fundamental ideas, con-
cepts and data on sub-fields that they may not normally follow.
Thus chapters should not comprise extensive data reviews nor provide a means
for authors to present new data that would normally be published in peer-reviewed
journals. Instead, the chapters should provide a concise overview and guide to the
most pertinent and important literature, thus reflecting a conceptual approach rather
than a complete review of the particular field of research. Moreover, each chapter
should be intelligible for less experienced researchers or even newcomers to the
fields of pathology, mechanisms and therapy of inflammatory disease. To this end,
authors should consider introducing PhD students or postdocs who are new to the
laboratory to the major concepts and the most critical literature in their chosen field
of research.
Bruce K. Rubin • Masaharu Shinkai
Editors
Macrolides
as Immunomodulatory
Agents
Editors
Bruce K. Rubin Masaharu Shinkai
School of Medicine Clinical Trial Develop & Research Center
Virginia Commonwealth University Tokyo Shinagawa Hospital
Richmond, VA, USA Tokyo, Japan
ISSN 1422-7746 ISSN 2296-4525 (electronic)

Progress in Inflammation Research
ISBN 978-3-031-42858-6 ISBN 978-3-031-42859-3 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-3-031-42859-3
© The Editor(s) (if applicable) and The Author(s), under exclusive license to Springer Nature Switzerland
AG 2024
This work is subject to copyright. All rights are solely and exclusively licensed by the Publisher, whether
the whole or part of the material is concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of
illustrations, recitation, broadcasting, reproduction on microfilms or in any other physical way, and
transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation, computer software, or by
similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication
does not imply, even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant
protective laws and regulations and therefore free for general use.
The publisher, the authors, and the editors are safe to assume that the advice and information in this
book are believed to be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or
the editors give a warranty, expressed or implied, with respect to the material contained herein or for any
errors or omissions that may have been made. The publisher remains neutral with regard to jurisdictional
claims in published maps and institutional affiliations.
This Springer imprint is published by the registered company Springer Nature Switzerland AG
The registered company address is: Gewerbestrasse 11, 6330 Cham, Switzerland
Paper in this product is recyclable.

Preface: A Brief History of the Macrolide
Antibiotics
Macrolides are a class of bacteriostatic antibiotics containing a large macrocyclic

lactone ring, generally 14- ,15-, or 16-membered in size, with one or more
deoxysugars (e.g., cladinose) attached. They bind to the 50S subunit of the bacterial
ribosome inhibiting bacterial protein synthesis and thus growth and reproduction.
The most commonly used macrolide antibiotics are the 14-membered erythromycin,
clarithromycin, and roxithromycin and the 15-membered azalide, azithromycin.
The first macrolide identified was erythromycin. Dr. Abelardo Aguilar was a
physician and pharmaceutical representative working at Eli Lilly Company in the
Philippine island of Iloilo. In 1952, he was doing independent research to attempt to
identify novel antibiotics and he found that some soil from the Molo cemetery had
reproducible antibacterial activity. He sent some soil samples to Eli Lilly where
erythromycin was isolated from a strain of Streptomyces erythreus, which produced
erythromycin as a metabolic product (1). Commercially, the company launched the
product in 1952 under the brand name Ilosone to honor the discovery of Iloilo.
Although erythromycin and a similar compound, troleandomycin, had excellent
antibacterial activity, their relatively poor bioavailability, unpredictable pharmaco-
kinetics, and low stability in the acidic pH of the stomach, as well as uncomfortable
gastrointestinal side effects prompted early searches for new derivatives with
improved properties. Of note, troleandomycin (no longer sold) is a CYP3A4 inhib-
itor affecting drug metabolism and its use caused hepatic dysfunction. Taking
advantage of erythromycin’s binding to the gastrointestinal motilin receptor, it is
now used as a prokinetic for some patients with delayed gastric emptying.
The antibiotic clarithromycin was invented by scientists at the Japanese drug
company Taisho Pharmaceutical in the 1970s as a result of efforts to overcome the
acid instability of erythromycin (2). Hoechst Marion Roussel in France synthesized
roxithromycin (3), and azithromycin was synthesized by PLIVA in Croatia (4).
Clarithromycin and azithromycin are highly marketed worldwide.
Early studies suggesting the immunomodulatory properties of these antibiotics
reach back to the late 1950s when erythromycin and especially troleandomycin were
observed to be “steroid-sparing” agents when used for patients with asthma who
v
vi Preface: A Brief History of the Macrolide Antibiotics
required regular systemic corticosteroids for disease control (5). However, it was in
the early 1980s when Miazawa and Kudo in Japan first exploited these properties for
the therapy of diffuse panbronchiolitis (6) as detailed in a later chapter by Taniuchi
and Azuma.
Much has happened in the 40 years since this discovery with greater understand-
ing of the potential immunomodulatory mechanisms and effective use, in particular
for neutrophil-dominated inflammation. We bring much of this information together
in this book.
Richmond, USA Bruce K. Rubin
References
[1] https://www.thenewstoday.info/2005/05/03/iloilonews3.htm
[2] Morimoto S, Nagate T, Sugita K, Ono T, Numata K, Miyachi J, Misawa Y,
Yamada K, Omura S. Chemical modification of erythromycins. III. In vitro and
in vivo antibacterial activities of new semisynthetic 6-O-
methylerythromycins A, TE-031 (clarithromycin) and TE-032. J Antibiot
(Tokyo) 1990;43(3):295-305.
[3] Chantot JF, Bryskier A, Gasc JC. Antibacterial activity of roxithromycin: a
laboratory evaluation. J Antibiot (Tokyo). 1986;39(5):660-8
[4] Retsema J, Girard A, Schelkly W, Manousos M, Anderson M, Bright G,
Borovoy R, Brennan L, Mason R. Spectrum and mode of action of azithromycin
(CP-62,993), a new 15-membered-ring macrolide with improved potency
against gram-negative organisms. Antimicrob Agents Chemother 1987;31(12):
1939-47
[5] Kaplan MA and Golden M. The use of triacetyloleandomycin in chronic infec-
tious asthma. Antibiotic Annual 1958-1959. New York, Interscience Publishers.
pp 273-276
[6] Kudoh S. Applying lessons learned in the treatment of diffuse panbronchiolitis to
other chronic inflammatory diseases. Am J Med 2004; 117 (Suppl 9A):12S–19S
Contents
Part I Mechanisms of Action and Novel Macrolides

Macrolides and Diseases Associated with Loss of Epithelial Barrier
Integrity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Clive P. Page, Fridrik R. Gardarsson, Jennifer A. Kricker,
Thorarinn Gudjonsson, Virginia Norris, and Michael J. Parnham
Macrolides and Inflammatory Cells, Signaling, and Mediators . . . . . . . . 25
Mitsuko Kondo
Part II Clinical Use for Airway Disease

Macrolides as Immunomodulatory Agents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Namiko Taniuchi and Arata Azuma
Macrolides and Cystic Fibrosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Rishi Pabary, Adam Jaffe, and Andrew Bush
Non-CF Bronchiectasis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Dustin Mills, Anne B. Chang, and Julie M. Marchant
Macrolide Use in Chronic Obstructive Pulmonary Disease . . . . . . . . . . . 115
Iwein Gyselinck and Wim Janssens
Macrolides and Asthma Therapy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149
Krishna Undela, Adil Adatia, Brian H. Rowe, and Giovanni Ferrara
Macrolides and Interstitial Lung Diseases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
Yu Hara and Takeshi Kaneko
Macrolides in Acute Respiratory Distress Syndrome
and Acute Lung Injury . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177
Kodai Kawamura
vii
viii Contents
Azithromycin for Other Lung Diseases: Lung Transplantation

and Sarcoidosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
Geert M. Verleden and Stijn E. Verleden
Macrolides for Rhinosinusitis and Nasal Polyps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207
Isao Suzaki
Part III Clinical Use for Other Diseases

Macrolides for Cancer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223
Masahiro Shinoda
Macrolides in Chronic Skin Disorders . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255
Yozo Ishiuji
Macrolide Use in Preschool-Aged Children with Acute or
Recurrent Respiratory Tract Illnesses with Wheezing . . . . . . . . . . . . . . 271
Lauren D. Benton and Fernando D. Martinez
Macrolides and Immunomodulation: Today and the Future . . . . . . . . . . 283
Masaharu Shinkai
Part I
Mechanisms of Action and Novel
Macrolides
Macrolides and Diseases Associated
with Loss of Epithelial Barrier Integrity
Clive P. Page , Fridrik R. Gardarsson, Jennifer A. Kricker ,

Thorarinn Gudjonsson , Virginia Norris, and Michael J. Parnham
Abstract In addition to the antiinflammatory/immunoregulatory actions of

macrolide antibiotics, more recent investigations indicate the potential barrier-
protective effects of these drugs on the epithelium. This chapter builds on and
expands the chapters on the cytoprotective effects of macrolides, on airway epithelial
cells, and on mucoregulatory effects of this drug class on the respiratory mucosa,
which were published in 2005 in a previous PIR volume on Antibiotics as
antiinflammatory and immunoregulatory agents. Birkhäuser Basel, Basel,
2005 (75); Takeyama K, in: Antibiotics as antiinflammatory and immunomodulatory
agents [Internet]. Birkhäuser Basel, Basel, 2005; 96). We consider here the accu-
mulated clinical literature on the subject, including more recent publications since
the last PIR review, which particularly concern azithromycin and its efficacy in the
treatment of patients with asthma and chronic obstructive pulmonary disease
(COPD). We also mention possible effects of barrier-protective macrolides on the
dermal and gut epithelium, suggesting their potential for efficacy in the treatment of
skin and gut diseases associated with epithelial barrier injury.
Keywords Epithelial integrity · Barrier function · Epithelial cells · Barrier failure ·

Nonantibiotic macrolides · Azithromycin
C. P. Page
Sackler Institute of Pulmonary Pharmacology, King’s College London, London, UK
F. R. Gardarsson · J. A. Kricker · V. Norris
EpiEndo Pharmaceuticals, Reykjavik, Iceland
T. Gudjonsson
University of Iceland, Faculty of Medicine and Landspitali, University Hospital, Reykjavik,
Iceland
M. J. Parnham (✉)
EpiEndo Pharmaceuticals, Reykjavik, Iceland
Faculty of Chemistry, Biochemistry and Pharmacy, Goethe University Frankfurt am Main,
Frankfurt am Main, Germany
e-mail: mjp@epiendo.com
© The Author(s), under exclusive license to Springer Nature Switzerland AG 2024 3

B. K. Rubin, M. Shinkai (eds.), Macrolides as Immunomodulatory Agents, Progress
in Inflammation Research 92, https://doi.org/10.1007/978-3-031-42859-3_1
4 C. P. Page et al.
1 Introduction
Since 2000, azithromycin has become the main macrolide investigated for pharma-
cological effects beyond antibiosis. Its demonstrated efficacy now covers the treat-
ment of patients with asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) [1–
4], patients exposed to various airborne viral infections [5–7], and other diseases
associated with loss of epithelial barrier integrity.
This current review will consider the characteristics of the epithelial barrier and
the in vivo and in vitro evidence for the effects of macrolides on epithelium that may
contribute to their clinical efficacy in a range of diseases known to be associated with
epithelial dysfunction, including those in the skin, as well as data suggesting their
potential for efficacy in the gut. A novel class of modified macrolides or so-called
“Barriolides” exemplified by EP395, an azithromycin-related macrolide with
reduced antimicrobial resistance potential, that recently entered early clinical devel-
opment targeting chronic airway disease (CAD), will also be discussed [6].
2 Epithelial Barrier Failure, a Common Pathophysiological

Feature of Various Chronic Inflammatory Diseases
Epithelial integrity and barrier failure are emerging as fundamental determining

factors for health and disease in a range of organs [8]. While the major focus in
diseases involving injury to the epithelium has been placed on the involvement of
inflammatory cells and the vascular endothelium in the past, more recently, the
concept of epithelial barrier dysfunction as the basis for disease progression has been
proposed, particularly by Akdis and his colleagues in their recent treatise on the
epithelial barrier hypothesis [9]. Others, such as Georas and colleagues in the USA,
have conducted research in patients with asthma to address a “barrier failure”
hypothesis [10, 11]. Loss of epithelial integrity or barrier failure is now recognized
as a feature of a number of chronic inflammatory diseases including COPD, asthma,
cystic fibrosis (CF), dermatitis, inflammatory bowel disease (IBD), and diseases
associated with lung injury such as acute respiratory distress syndrome (ARDS) and
sepsis, and is postulated as the underlying defect responsible for infective exacer-
bations, poor resolution and fibrosis [9].
The increasing interest in the epithelial integrity paradigm both in academia and
the pharmaceutical industry is indicated by the growing number of patents and
publications appearing in this field over the last five decades (Fig. 1). Furthermore,
several pharma and biotech companies are now developing drug classes targeting the
epithelium for the treatment of a range of disorders [12].
This relatively recent introduction of agents developed based on epithelial phar-
macology and the use of endpoints investigating barrier integrity in inflammation
research programs has been aided by recent advances in our understanding of
epithelial biology (discussed below). The stem cell revolution of the nineties with
Macrolides and Diseases Associated with Loss of Epithelial Barrier Integrity 5
Fig. 1 Evident increase in epithelial terms by decade in publications cited in PubMed
its transformative effects on tissue culture technology and organoid development

coupled with the equally transformative effects that genomics, as well as other
omics, have had in recent years on analytical capabilities on all fronts of biology
research has also impacted investigations of epithelial cell biology. In the last
20 years, modern epithelial cell culture systems have created ways that did not
exist before to detect and analyze the epithelial pharmacology of test compounds
independently of immune cell pharmacology, antibiotic potency, or any other
nonepithelial effects in laboratory settings.
2.1 Epithelial Homeostasis, Remodeling, and Barrier Failure
All epithelial tissues share unifying structural and functional features like hexagonal
orientation and ongoing cellular renewal, as well as their undisrupted continuity,
which provides separation between the external environment and the body’s interior
tissues, acting as a contiguous surface for all organs and a lining for other tissues.
The epithelium is generally capable of remodeling itself and is often the first line
of defense against the external environment. It is widely distributed and is the key
surface lining in organs such as the airways, skin, and the gastrointestinal tract,
whereby its varying architecture reflects its different functions. Apical to basolateral
polarity, as in the upper airways and in the gastrointestinal tract, and the stratified
squamous epithelium of the skin are pivotal to the barrier function of the epithelium
and its organ-specific functions.
6 C. P. Page et al.
2.1.1 Airway Epithelium
In the respiratory tract, the epithelium changes from being pseudostratified in the
upper airways to cuboidal in the lower bronchioles and simple squamous epithelium
in the alveoli (Fig. 2). The pseudostratified epithelium is responsible for the
mucociliary clearing of particles and infectious agents. Goblet cells produce
mucus which entraps infectious/hazardous agents and ciliated cells produce a thin
periciliary fluid, which with the help of the beating cilia, move the mucus up the
respiratory tract to be expelled through the mouth or nose. Macrolide antibiotics such
as azithromycin are well known to inhibit the secretion of mucus by the airway
epithelium [13, 14]. Basal cells are responsible for the renewal of both ciliated and
goblet cells in the trachea and large bronchi [15]. In the lower bronchi, the epithe-
lium has a simple cuboidal structure, with club cells replacing the basal cells as the
stem or progenitor cells [16]. The bronchioles open into the air-filled alveoli that are
composed of a thin layer of alveolar type 1 cells with cuboidal type 2 cells distributed
in between. Whereas the type 1 alveolar cells are responsible for the gas exchange,
type 2 cells produce surfactants to prevent the alveoli collapsing. They are also the
progenitor cells for new type 1 cells [17]. The epithelial barrier is generated by the
ability of epithelial cells to form tight contact to each other via various adhesion
proteins, most notably the tight junction complexes. Tight junctions formed by
epithelial cells regulate the paracellular flux and infiltration of leukocytes, and are
also important in generating apical-basal polarity by controlling the distribution of
phospholipids and transmembrane proteins within the semi-fluid cell membrane
[18]. The tight junctions are formed by a variety of adhesion molecules, including
transmembrane proteins, claudins, occludins, and junctional adhesion molecules
(JAM), which are linked to the actin cytoskeleton through scaffold proteins, most
notably, zonula occludens (ZO-1 to -3), cingulin, and afadin [19]. These, in turn,
are regulated by cytokines, which cause junction modifications during inflammation.
Together with numerous other proteins involved in cell signaling, they form the
intracellular tight junction plaques [20]. As discussed below in sect. 2.2,
azithromycin has been shown to modify airway epithelial tight junction molecule
expression.
Loss of epithelial integrity/barrier failure also increases during aging. Indeed,
aging results in reduced lung function which makes the elderly more vulnerable to
chronic lung diseases. Aging reduces the mucociliary clearance, thus weakening the
epithelial barrier, which makes older people more prone to infections such as
pneumonia [21]. Recently, Angelidis et al. used single cell transcriptomic and
mass-spectrometry proteomics to quantify changes in 30 lung cell types in young
and old mice. They demonstrated significant changes in gene regulation and cellular
remodeling that may affect the epithelial barrier [22]. Several respiratory diseases
affect the epithelial barrier including COPD, CF, and asthma with cigarette smoking
and other types of oxidant pollution being the main causes of COPD. Cigarette
smoking facilitates goblet cell hyperplasia and disrupts tight junctions resulting in
Fig. 2 The epithelial barrier in airway, skin, and gut. (a) The airway epithelium varies from the
pseudostratified layer in the bronchi to the single squamous layer in the alveoli. It extends from the
trachea and large bronchi to the smaller bronchioles and alveoli. The epithelium thus, forms a
continuous layer that protects the underlying interstitial connective tissue from pathogens and
pollutant-rich external air. In the trachea and large bronchi, the pseudostratified layers are composed
8 C. P. Page et al.
suboptimal epithelial barrier integrity, mainly as a result of direct oxidant damage

and inflammation with loss of tight junction integrity [23–25].
In bronchial asthma, repeated injury to the airway mucosal barrier enhances
mucosal permeability to pathogens and injurious chemicals. This epithelial barrier
damage results from the activation of airway epithelial cells, dendritic cells, and
innate group 2 innate lymphoid cells (ILC2), leading to the release of epithelial
cytokines, such as thymic stromal lymphopoietin (TSLP), as well as interleukins
IL-25, and IL-33 and to a Th2-biased inflammatory response. The associated
infiltration and activation of inflammatory cells from the circulation, also reduced
by azithromycin (see sect. 2.4), leads to the characteristic hallmarks of asthma [26]
(Fig. 3).
Upon epithelial damage in the respiratory tract, basal, club, and type 2 alveolar
cells are activated collectively to induce a recovery phase and healing of the barrier
by generating new differentiated and functionally active cells. This recovery phase is
activated very rapidly as epithelial barrier failure allows infectious agents and other
materials from the external environment such as allergens or pollutant particles to
enter the subepithelial stroma, triggering an inflammatory response and/or infection
of submucosal tissues that may exacerbate further tissue damage. Thus, finding
drugs that enhance the integrity of the epithelial barrier in the airways of people
with underlying airway diseases such as COPD may reduce the risk of exacerba-
tions, reduce symptoms and improve the quality of life.
Fig. 2 (continued) of mucociliary epithelium and basal cells which represent progenitor cells. In the
bronchioles, club cells replace the basal cells as the progenitor cells. The distal part of the airway
epithelium terminates in the alveoli where gas exchange takes place. The type II alveolar cells are
responsible for surfactant production and also for the generation of new type I alveolar cells that are
responsible for gas exchange. In vitro and in vivo work indicates that azithromycin may enhance the
epithelial barrier via tight junction remodeling, enhancing epithelial cell growth, and differentiation,
reducing epithelial-derived proinflammatory cytokines, and reducing mucus (see sect. 4) (b) The
epidermis forms stratified squamous epithelium. The epidermis is composed of four layers of
epithelial cells (keratinocytes). Stratum basale sits on top of the basement membrane, which
separates the epidermis from the underlying dermis. Keratinocyte stem cells (basal cells) are located
in the stratum basale. These stem cells give rise to keratinocytes which move up to the stratum
spinosum. In the stratum spinosum, interconnections between cells are apparent, presumably
through desmosomes. Keratinocytes differentiate further and move up to the stratum granulosum.
This layer forms the water barrier. Keratinocytes are filled with lipids packed in lamellar bodies that
make this layer highly hydrophobic and which may possibly be enhanced by barrier-protective
macrolides (cf sect. 5.3). At the interface of the stratum granulosum and stratum corneum,
keratinocytes undergo keratinization which is a specific form of apoptosis, losing their nuclei and
other cellular organelles and accumulate to form the keratin- and lipid-rich stratum corneum. (c) The
colon epithelium forms a columnar single-layer barrier. The colon epithelium is mainly composed
of absorptive enterocytes, mucin-producing goblet cells, and stem cells located at the bottom of the
crypt. The stem cells give rise to new enterocytes and goblet cells. Microfold (M) cells and
enteroendocrine cells are also found within the colon epithelium (not shown in this figure), where
they contribute to the immune and hormonal systems, respectively. Potential sites of action of
barrier-protective macrolides in the gut have yet to be determined. Figures generated by BioRender.
com
Macrolides and Diseases Associated with Loss of Epithelial Barrier Integrity
9
Fig. 3 Macrolides, especially azithromycin (AZM), interfere with a number of cellular organelles and signaling pathways to elicit their effects in epithelial and
other cells. Binding to membrane phospholipids, probably by charge interactions, activates a series of signaling cascades resulting in altered gene regulation. As
a result of intracellular macrolide accumulation, particularly in lysosomes, lipid accumulation occurs with lamellar body formation and alterations in
10 C. P. Page et al.
2.1.2 Epidermis
The cellular turnover in the stratified squamous epithelium, the epidermis, is fast and
requires active stem or progenitor cells to generate new keratinocytes [27]. The
keratinocyte stem cells sit on the basement membrane in the stratum basale [28] and
give rise to keratinocytes which reach maximal differentiation in the stratum
granulosum, forming the water barrier. The water barrier between the stratum
granulosum and stratum corneum is composed of accumulated lipids (e.g., phos-
pholipids, glucosylceramide, sphingomyelin, and cholesterol) that together with
proteins form lamellar bodies (LBs) [28–31]. These stratified layers are of major
importance for the barrier function of the skin and help prevent transepidermal water
loss (TEWL).
Epidermal barrier failure and the accompanying inflammatory response are
considered a primary component of skin diseases such as atopic dermatitis (AD),
rosacea, and ichthyoses [32–35]. AD, a chronic, relapsing skin disease characterized
by dry erythematous lesions and severe itching (pruritis), has a very high prevalence,
affecting up to 3% of the worldwide population. Furthermore, the frequency of AD
and other atopic diseases has increased by two- to threefold during the past decades
in industrialized countries [36, 37]. Histological features of AD include intercellular
edema (spongiosis) of the keratinocytes within the stratum spinosum, resulting from
a lack of cell-cell binding [38]. Although the cause of AD is unknown, barrier failure
and inflammatory responses are both key features of the disease [39]. A hallmark of
AD is elevated serum concentrations of allergen-specific IgE antibodies against
various inhaled, food, and environmental allergens, probably resulting from the
epithelial barrier failure, leading to passage of allergens into the underlying connec-
tive tissues which initiate an inflammatory response triggered by cross-linking of
allergens with IgE on mast cells [40].
Loss-of-function (LOF) studies on the gene FLG, which encodes for the precur-
sor of the filament-associated protein filaggrin, have shown a strong association with
AD [41]. LOF FLG mutations are also responsible for the onset of ichthyosis
vulgaris, the most common skin disorder within ichthyoses (IC). IC are a heteroge-
neous group of skin diseases sharing the feature of barrier failure leading to water
loss and compensatory hyperproliferation of keratinocytes [42]. Common pheno-
types include dry skin (xerosis) and scaling, and IC patients are at increased risk for
AD, asthma, and other allergic disorders, probably due to the disrupted skin barrier,
subsequently allowing easier epidermal penetration of allergens and other external
inflammatory stimuli [41]. As in IC and AD, rosacea is also characterized by
Fig. 3 (continued) mitochondrial oxygen consumption. As a consequence of these membrane and

intracellular changes, release of cytokines and enzymes is modified. In airway epithelial cells,
mucus secretion is decreased, and tight junction proteins are remodeled, resulting in an increase in
transepithelial electrical resistance (TEER) with reduced paracellular flux. With time, epithelial
growth and differentiation are enhanced, further facilitating the barrier function of the cells. Since
junction proteins are crucial to skin and gut epithelium, it is likely that nonantibiotic macrolides will
beneficially affect these molecules as well as other epithelial processes
increased TEWL with compromised tight junction proteins, while filaggrin remains
unchanged [43, 44]. The pathophysiology of rosacea is still not understood but
increased epithelial cell expression of cathelicidin (LL-37) and IL-33 play a key
role, together with increased expression of vascular endothelial growth factor
(VEGF) [45]. The epithelium of the skin, although multilayered compared to airway
and gut, is susceptible to breaches of the barrier resulting in imbalance and subse-
quent inflammation.
2.1.3 Intestinal and Colon Epithelium
The intestine and colon epithelium are composed of multiple cell types. In the
intestine, large folding of the epithelium generates villi and crypts. Cellular
remodeling is undertaken in the crypts where stem cells deep in the crypts generate
daughter cells that differentiate either downwards to become Paneth cells (intestine)
or upwards to generate enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells [46]. The
epithelial barrier in the gut is of great importance for maintaining homeostasis of the
gastrointestinal tract, and barrier failure contributes to a variety of conditions such as
leaky gut [47, 48], and inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn’s disease
[49], ulcerative colitis [50] and celiac disease [51]. A common denominator of
barrier failure in the gut is the aberrant regulation of tight junctions [51]. Recently,
Parikh et al. used single-cell profiling to demonstrate the intestinal and colonic
epithelial diversity in normal gut and epithelial cells derived from patients with
IBD [52]. At the top of the crypts, they found a previously unknown absorptive cell,
expressing the proton channel otopetrin 2 (OTOP2) and the satiety peptide
uroguanylin, that senses pH and is dysregulated in inflammation. In IBD, they
observed a positional remodeling of goblet cells that coincides with the
downregulation of WFDC2-an antiprotease molecule that they found to be expressed
by goblet cells and that preserves the integrity of tight junctions and prevents the
invasion of bacteria and inflammation [52]. The expression patterns of various
claudins, expressed both by gut epithelial and other mesodermal cells, have been
investigated in both humans and in murine models of IBD and shown to reflect the
interactions between the different cells involved in the disease [53].
It is apparent, therefore, that tight junctions play an important role in maintaining
gut epithelial integrity. Others have shown that increased expression of claudin
2 increases paracellular flux [54], whilst the reduced function of occludin has been
linked to increased barrier failure. IL-13 has been shown to increase claudin
2 expression resulting in increased paracellular flux, and TNF-alpha has been
shown to induce the activity of myosin light chain kinase (MLCK) that further
induces caveoli endocytosis of occludin resulting in increased leakiness of the gut
[55]. Based on the importance of the epithelial barrier for healthy organs, drugs that
maintain and/or increase the strength of the epithelial integrity may therefore be of
great importance in a range of diseases of the airways, skin, and gastrointestinal tract
and potentially open to therapy with barrier-protecting macrolides.
3 In Vitro Models to Study Epithelial Integrity

and the Mechanism of Action of Macrolides
Advanced cell culture models are useful tools for studying epithelial biology both in
health and disease. Since many epithelial tissues are exposed to hazardous environ-
ments, cell culture models have been useful in analyzing the effects of various
toxicants and infectious agents on epithelial cells. Furthermore, these cell culture
models now provide convenient assays for analyzing the efficacy of drugs as they
can provide simple readout assays allowing for the reasonably rapid screening of
large numbers of compounds. Testing cell viability in conventional monolayer
culture is simple and fast. However, monolayer cultures have limitations, such as a
lack of an in vivo-like environment, cellular phenotype plasticity, and association
with the micro-environment [56]. For analysis of epithelial barrier integrity, cultur-
ing cells on transwell filters can provide a good option, either as liquid–liquid (LL) or
air–liquid interface (ALI) cell culture. ALI cultures are suitable for analysis of the
barrier integrity of the airway, gastrointestinal, and skin epithelium. ALI cultures are
generated by initiating cell culture in liquid-liquid conditions on coated porous filters
representing a basement membrane, and after a few days in culture, media is
removed from the apical compartment, which allows for further differentiation into
organotypic structures.
Regarding airway epithelium, culture of basal cells in ALI conditions results in
pseudostratified-like histology. This is demonstrated by formation of apical-
basolateral polarity, and formation of goblet and ciliated cells [57, 58]. Tight junc-
tions are responsible for the apical to basolateral polarity of the cells and fencing,
meaning they form the tight barrier between epithelial cells, which controls the
paracellular flux between cells. A simple readout for barrier integrity in ALI cultures
is to measure transepithelial electrical resistance (TEER) and paracellular flux
(p-flux). Thus, increased TEER and reduced p-flux are good indicators of a func-
tionally active barrier maintained by tight junctions and other adhesion molecules
[59]. Additional readout assays include RNA sequencing, proteomic, ELISA, and
metabolomic analysis. Mimicking the appropriate in vivo-like phenotype in vitro as
closely as possible is of great importance as this allows for a better understanding of
the communication between cells and histological appearance and allows investiga-
tion of the effect of external stimuli and drugs on the function of the epithelial
barrier.
Reflecting in vivo pathological conditions in cell models using challenging assays
can be a useful tool to either investigate the clinical condition in question or to study
drugs or methods to ameliorate the clinical condition. It can be said that there are
broadly three categories of challenging assays, biological, chemical, and mechani-
cal. Biological assays include challenging the cell culture model with inflammatory
cytokines and fibrosis-inducing agents such as TGFβ [60]. Chemical challenging can
be performed using, for instance, EDTA, to bind calcium and subsequently impair
cell-to-cell adhesion properties [61]. Mechanical challenging includes insults such as
stretching cell models or increasing pressure in a way that deforms the cells,
mimicking, for instance, what happens in ventilator-induced lung injury [62]. The
challenge, however, needs to be adapted carefully to the cell type used, as bacterial
lipopolysaccharide (LPS), for instance, does not exert the same response in different
cell lines [63].
Using ALI cultures, it has been shown how azithromycin enhances the epithelial
barrier by increasing TEER, an indicator of a strong barrier [64, 65], and in lung
epithelial cells, it was shown that this drug also induces epidermal differentiation and
the formation of lamellar bodies [66], which may be useful pharmacological prop-
erties to explain the effectiveness of macrolides in a number of diseases discussed
below.
4 Macrolides and the Epithelial Barrier
Macrolide antibiotics as a class of drugs are known to have numerous additional

non-antibacterial effects, such as immunomodulatory/antiinflammatory activity,
targeted mainly at neutrophils and macrophages, together with the ability to enhance
epithelial barrier function [6]. They inhibit adhesion, diapedesis, and activation of
leukocytes, reducing inflammation, as well as reducing the epithelial-to-mesenchy-
mal transition which occurs in fibrosis. In addition, they promote the formation of
M2 macrophages – involved in active resolution of inflammation – and enhance the
differentiation of epithelial cells, while regulating airway mucus hypersecretion
[6]. Azithromycin, particularly, has been shown in bronchial epithelial cells to
enhance processing of the tight junction proteins, claudin-1 and claudin-4, occludin,
and junctional adhesion molecule-A, enhance intracellular lipid generation and to
promote cell differentiation, all of which facilitate epithelial barrier function as
observed by increased transepithelial resistance and decreased permeability
[64, 66]. The actions of macrolides in modulating the production by airway epithelial
cells of the neutrophil chemotactic and activating cytokine, interleukin-8 (IL-8) and
inhibiting the secretion of mucus from airway secretory cells, in part by inhibition of
MUC5AC, further contribute to protection of the epithelium from injury, including
that to cigarette smoke [6, 67, 68]. Azithromycin has also been reported to inhibit, in
human airway epithelial cells, the stimulation by the viral product polyinosinic-
polycytidylic (poly (I:C)) acid of the T2-biasing cytokine TSLP, a response of
potential therapeutic benefit in asthma [69]. Moreover, in a rat ovalbumin-induced
asthma model, azithromycin promoted epithelial thickening and inhibited epithelial
apoptosis [70].
It is of interest therefore, that recently, EpiEndo Pharmaceuticals has developed
EP395, a macrolide with greatly reduced antimicrobial activity which has entered
clinical development. This is the first macrolide analogue to have entered clinical
trials for the treatment of nonbacterial airway diseases since solithromycin was
tested for non-antibacterial efficacy in patients with COPD and terminated due to
tolerability issues [71]. While solithromycin is a 14-membered fluoroketolide with
good antibiotic potency, but a poor long-term safety profile, EP395 is an
azithromycin-related, nitrogen-containing, 15-membered macrolactone that has

been structurally and functionally optimized away from the antimicrobial class
effects of macrolides, to minimize induction of host flora resistance [72, 73]. The
compound has effects on epithelial barrier function, enhancing epithelial integrity, as
well as possessing antiinflammatory actions that are shared by other 14- and
15-membered macrolides that have proven efficacy in patients with diffuse
panbronchiolitis (DPB). Importantly, EP395 exhibits augmented barrier-modulating
pharmacology in vitro compared to azithromycin, but similar effects have not been
observed for erythromycin in the same assay [64, 73]. Moreover, inhibitory actions
of EP395 on murine lung injury induced in vivo by cigarette smoke or SO2 are
commensurate with its epithelial barrier-protecting effect [72].
5 Macrolide-Sensitive Inflammatory Diseases
5.1 Distinctions between Macrolide Antibiotics
There has been an ongoing interest in clarifying the disease modifying pharmacol-
ogy of macrolides ever since the late sixties and seventies when the dramatic
antiinflammatory and even curative effect of erythromycin on DPB was recognized
in Japan [74]. As DPB has an essentially unknown etiology and the exact patho-
physiology is still not completely understood, it has remained unclear which of the
multiple pharmacological properties of azithromycin, erythromycin, and other
macrolides are responsible for this clinical benefit of a relatively rapid remission
of inflammation and suppression of further disease progression [75–77].
However, it seems likely that the disease-modifying efficacy of macrolides on
inflammatory responses lies within the 14-membered and 15-membered analogues,
since the 16-membered compounds are not disease modifying in DPB or other
macrolide-sensitive indications [78]. The potential efficacy of solithromycin, a
14-membered fluoroketolide, was investigated against non-bacterial airway diseases,
but this drug was not well tolerated on long-term use and the trial was terminated due
to safety issues when tested in patients with COPD [71].
In this regard, it is of interest therefore, that a patient with DPB who did not
respond to erythromycin therapy did respond to clarithromycin [79], while in
contrast the 16-membered josamycin, despite having prominent 14-membered like
PMNC inhibitory effects, has been found to be clinically ineffective in treating DPB
[78]. It is worth mentioning, in this context, that clarithromycin, in addition to its
well-established antiinflammatory/immunomodulatory actions, also exerts benefi-
cial effects on epithelial cell function [67]. Thus, it seems likely that both the
14-membered and 15-membered macrolide antibiotics share features essential for
treating most cases with DPB, while those experimental antiinflammatory features
shared by them with josamycin appear less important for therapeutic benefit in DPB
[75, 78].
Nevertheless, beyond shared properties, each structure has distinct pharmacolog-

ical characteristics differing from those of the others, depending on the assays and
models of inflammation used. It is also unclear what specific pharmaceutical prop-
erties of macrolides are more relevant than others in macrolide-sensitive disease
indications. Moreover, no statistically significant head-to-head studies exist to help
in discerning whether one of the 14-membered or the 15-membered azalide struc-
tures is generally more effective than the others in any of the sensitive indications.
Nevertheless, it is relevant in this context that clarithromycin is inactive in progres-
sive CF lung disease, a condition repeatedly shown to be sensitive to
azithromycin [80].
In view of the supportive data and despite the absence of direct head-to-head trial
designs for any of the macrolide-sensitive indications, azithromycin seems to have
become the go-to macrolide for off-label use, at least for some airway conditions, for
example, GOLD (COPD) and GINA (asthma), [81, 82]. This is noteworthy as
azithromycin was not introduced onto the market until 1988 and by then already
much of the evidence for the 14-membered macrolides in DPB and CF had been
established.
Consequently, the structural basis for most early documented attempts to develop
non-antibiotic macrolides was the 14-membered ring. These compounds emulated
the erythromycin-like effects on macrophages and neutrophils, their activation,
chemotaxis, and reactive functions, while the 15-membered azithromycin-like struc-
ture has dominated more recent novel structural approaches. A summary of past
attempts to develop non-antibiotic macrolides was given recently by Kricker
et al. [6].
5.2 Macrolide Antibiotics in COPD and Asthma
Arising from the initial studies on DPB, there has been interest in the clinical utility
of macrolides in the treatment of several respiratory diseases, including COPD,
asthma, chronic allergic rhinosinusitis, non-CF bronchiectasis, CF, and cryptogenic
organizing pneumonia (COP), previously termed bronchiolitis obliterans organizing
pneumonia (BOOP) [83]. More detailed discussions of the use of macrolides in
specific disorders are given in other chapters in this present volume. We focus here
on the key clinical studies in patients with asthma and COPD, which are clearly
associated with epithelial injury, and these are summarized below.
In asthma, small clinical trials have looked at the effects of macrolides on markers
of inflammation. For example, it has been shown that 8 weeks of treatment with
clarithromycin reduced IL-8 and neutrophilic inflammation in the sputum of patients
with refractory asthma. The effect was most marked in those with refractory
non-eosinophilic asthma [84]. In children on maintenance inhaled fluticasone pro-
pionate, 4 weeks treatment with clarithromycin reduced eosinophilic inflammation
as assessed by blood levels of eosinophils and ECP [85]. In the AMAZES trial,
48 weeks of azithromycin reduced the number of combined moderate and severe
exacerbations compared to placebo (1.07 versus 1.86 events/patient/year; incidence

rate ratio 0.59 (95% CI 0.47–0.74) in patients with symptomatic asthma despite
ICS/LABA therapy [2]. Subgroup analysis of the AMAZES trial indicated that
azithromycin is effective at reducing exacerbations in both eosinophilic and
non-eosinophilic asthma [86]. ERS/ATS guidelines suggest consideration of a trial
macrolide treatment to reduce asthma exacerbations in adult asthma subjects on step
5 therapy that remain persistently symptomatic or uncontrolled. The potential benefit
should be carefully considered against the risk of the emergence of antimicrobial
resistance at both the individual patient and wider community levels. In the GINA
treatment guidelines, in patients with no evidence of type 2 inflammation, a trial of
low dose macrolide is a treatment option for consideration [82]. In this respect, it is
worth noting the results of a study in mice sensitized to house dust mite (HDM), then
exposed to poly(I:C), as a model of asthma complicated with viral infection. Four
days oral treatment with 25 mg/kg of the non-antibiotic, 14-membered macrolide
EM900 resulted in significant reduction of bronchial airway lavage fluid (BALF) of
all cell counts, including the predominant eosinophils, and concentrations of the type
2 inflammatory cytokines IL-13, IL-5, RANTES, IL-17A, and MIP-2 [87]. These
data indicate that the use of non-antibiotic macrolides is also likely to be of benefit in
allergic airway inflammation.
In a small study (n = 30) in patients with COPD and neutrophilic bronchitis,
patients were randomized to azithromycin 250 mg a day or placebo for 12 weeks.
Azithromycin treatment resulted in a non-significant reduction in sputum neutrophils
and IL-8 levels [88]. In a randomized, double-blind, placebo-controlled study in
109 COPD patients, 250 mg of erythromycin twice daily for 12 months reduced
moderate to severe exacerbations compared to placebo [89]. Two studies have also
been conducted looking at azithromycin on exacerbations in COPD patients. In the
first such study performed, 1142 patients at risk of exacerbation were randomized to
receive either 250 mg once a day or placebo for 1 year, in addition to their usual care.
The median time to the first exacerbation was 266 days (95% confidence interval
[CI], 227 to 313), among participants receiving azithromycin, as compared with
174 days (95% CI, 143 to 215) among participants receiving placebo (P < 0.001).
The frequency of exacerbations was 1.48 exacerbations per patient-year in the
azithromycin group, as compared with 1.83 per patient-year in the placebo group
(P = 0.01) [1]. In a second study, COPD patients with 3 or more exacerbations in the
previous year were randomized to azithromycin 500 mg three times a week (n = 47)
or placebo (n = 45) for 12 months. Eighty-four exacerbations were recorded in the
azithromycin group compared with 129 in the placebo group. Azithromycin resulted
in a significant reduction in the exacerbation rate versus placebo (058, 95% CI
042–079; p = 0001) [4]. Interestingly, a sub-analysis of this study suggests that
COPD patients with higher blood eosinophils (≥2%) derive greater benefit in terms
of lower number of exacerbations and hospitalizations compared to those with blood
eosinophils <2% [90]. Treatment recommendations suggest consideration of
azithromycin in patients who continue to exacerbate despite LABA/LAMA treat-
ment if blood eosinophil counts are <100 cells/μl (i.e., those who are unlikely to
derive benefit from ICS) or those who continue to exacerbate despite LABA/LAMA/
ICS, particularly if ex-smokers [81].
TSLP is a key epithelial cytokine released in response to multiple triggers, and
blocking TSLP with tezepelumab is effective at reducing exacerbations in asthma
[91]. The inhibition of TSLP generation from airway epithelium by azithromycin
may contribute to its therapeutic benefit in asthma [69], in addition to the other
beneficial effects of this drug on airway epithelium described previously.
Given the broad patient populations who derive clinical benefit from
azithromycin in terms of exacerbation reduction, taken together with the data from
HBEC and poly I:C stimulation, effects on the epithelium could at least in part
explain the efficacy of macrolides in reducing exacerbations in asthma and COPD.
5.3 Macrolides in Other Inflammatory Disorders
Based on the foregoing discussion, it is likely that macrolide protective effects on the
epithelial barrier may also contribute to the therapeutic benefit observed in the
topical treatment of rosacea or atopic dermatitis with macrolide dermal formulations,
or the oral macrolide therapy of psoriasis [92–94]. While these dermal disorders are
also associated with barrier disruption, the effects of macrolides, up till now, have
been associated with inhibition of inflammatory cell and mediator reduction and
attributed exclusively to either antibacterial or antiinflammatory actions [92]. We
have also recently suggested that oral macrolides without antibacterial activity and
thus, without adverse effects on the gut microbiome, may also be of benefit in the
treatment of epithelial damage in IBD [6]. A recent article connects gut and skin
health, showing that fiber-derived short-chain fatty acids formed in the gut promote
keratinocyte metabolism and differentiation in keratinocytes from the skin [95]. In
this respect, it is worth noting that the beneficial effects of azithromycin on airway
epithelial growth and differentiation are associated both with increased expression of
a set of 51 genes also associated with epidermal differentiation and with increased
deposition of intracellular fatty acids [66], suggesting a potential common mecha-
nism in airway and skin and even intestinal epithelial protection.
In a recent review article from 2019 entitled “Azithromycin is the answer in
pediatric respiratory medicine, but what was the question?” the author, Andrew
Bush, is critical of the evolution of inappropriate over-prescription and widespread
use of macrolides in chronic inflammatory diseases both in children and adults, as
such “off-label” therapy leads to extensive resistance formation [76]. Furthermore,
he urges the medical and scientific community to focus on better understanding the
endotype of inflammatory conditions where the non-antibiotic effects of macrolides
have proven to be beneficial beyond DPB and to develop new non-antibiotic
macrolides to target strategically these identified endotypes of inflammation [76].
6 Concluding Remarks
The efficacy of macrolides in treating inflammatory disorders, particularly those of

the respiratory tract, arose from the serendipitous observation of the dramatic benefit
of erythromycin, given as an antibiotic to patients with DPB. In the succeeding
years, this therapeutic benefit has been attributed to the antiinflammatory/immuno-
modulatory actions of erythromycin and of the next generation macrolides, partic-
ularly clarithromycin and azithromycin, subsequently developed as antibiotics. As a
result, azithromycin has been used widely off-label in the treatment of COPD and
asthma, this use supported by several randomized, double-blind, placebo-controlled
clinical trials. Evidence, albeit associative, has suggested that such actions may play
a role in the effects of macrolides in inflammatory skin disorders.
These findings on immunomodulatory actions of macrolide antibiotics have now
been complemented by studies on the role of epithelial cell directed actions. In view
of the increasing data on the importance of epithelial cell injury in the pathogenesis
of inflammatory respiratory, intestinal and skin disorders, the recent data on the
enhancing effects of azithromycin on epithelial barrier protection suggest that this
may represent a therapeutically rewarding avenue for novel macrolide development.
However, the almost inevitable occurrence of bacterial resistance in response to
long-term macrolide antibiotic administration is a constant limitation to this
approach. It is likely that the clinical testing of non-antibiotic macrolides, such as
EP395, will facilitate the pursual of this possibility.
Conflict of Interest Statement FRG, JAK, MJP, and VN are all employees of
EpiEndo Pharmaceuticals. CPP holds equity in Verona Pharma and MJP in
Phialogics AG.
Ethical Compliance Statement All published studies reported here that were
performed in the authors’ laboratories complied with international guidelines.
References
1. Albert RK, Connett J, Bailey WC, Casaburi R, Cooper JA Jr, Criner GJ, et al. Azithromycin for
prevention of exacerbations of COPD. N Engl J Med. 2011;365(8):689–98.
2. Gibson PG, Yang IA, Upham JW, Reynolds PN, Hodge S, James AL, et al. Effect of
azithromycin on asthma exacerbations and quality of life in adults with persistent uncontrolled
asthma (AMAZES): a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 2017;390
(10095):659–68.
3. Pomares X, Monton C, Espasa M, Casabon J, Monso E, Gallego M. Long-term azithromycin
therapy in patients with severe COPD and repeated exacerbations. Int J Chron Obstruct Pulmon
Dis. 2011;6:449–56.
4. Uzun S, Djamin RS, Kluytmans JA, Mulder PG, van’t Veer NE, Ermens AA, et al.
Azithromycin maintenance treatment in patients with frequent exacerbations of chronic obstruc-
tive pulmonary disease (COLUMBUS): a randomised, double-blind, placebo-controlled trial.
Lancet. Respir Med. 2014;2(5):361–8.
5. Khoshnood S, Shirani M, Dalir A, Moradi M, Haddadi MH, Sadeghifard N, et al. Antiviral

effects of azithromycin: a narrative review. Biomed Pharmacother. 2022;147:112682.
6. Kricker JA, Page CP, Gardarsson FR, Baldursson O, Gudjonsson T, Parnham
MJ. Nonantimicrobial actions of macrolides: overview and perspectives for future development.
Pharmacol Rev. 2021;73(4):233–62.
7. Oliver ME, Hinks TSC. Azithromycin in viral infections. Rev Med Virol. 2020;31:e2163.
8. Parrish AR. The impact of aging on epithelial barriers. Tissue Barriers. 2017;5(4):e1343172.
9. Akdis CA. Does the epithelial barrier hypothesis explain the increase in allergy, autoimmunity
and other chronic conditions? Nat Rev Immunol. 2021;21(11):739–51.
10. Georas SN, Rezaee F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and
allergic airway inflammation. J Allergy Clin Immunol. 2014;134(3):509–20.
11. Rezaee F, Georas SN. Breaking barriers. New insights into airway epithelial barrier function in
health and disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 2014;50(5):857–69.
12. Graham WV, He W, Marchiando AM, Zha J, Singh G, Li HS, et al. Intracellular MLCK1
diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nat Med. 2019;25(4):690–700.
13. Mann TS, Larcombe AN, Wang KCW, Shamsuddin D, Landwehr KR, Noble PB, et al.
Azithromycin inhibits mucin secretion, mucous metaplasia, airway inflammation, and airways
hyperresponsiveness in mice exposed to house dust mite extract. Am J Physiol Lung Cell Mol
Physiol. 2022;322(5):L683–L98.
14. Shimizu T, Shimizu S. Azithromycin inhibits mucus hypersecretion from airway epithelial
cells. Mediat Inflamm. 2012;2012:265714.
15. Parekh KR, Nawroth J, Pai A, Busch SM, Senger CN, Ryan AL. Stem cells and lung
regeneration. Am J Physiol Cell Physiol. 2020;319(4):C675–C93.
16. Zuo WL, Shenoy SA, Li S, O'Beirne SL, Strulovici-Barel Y, Leopold PL, et al. Ontogeny and
biology of human small airway epithelial Club cells. Am J Respir Crit Care Med. 2018;198(11):
1375–88.
17. Guillot L, Nathan N, Tabary O, Thouvenin G, Le Rouzic P, Corvol H, et al. Alveolar epithelial
cells: master regulators of lung homeostasis. Int J Biochem Cell Biol. 2013;45(11):2568–73.
18. Cereijido M, Valdes J, Shoshani L, Contreras RG. Role of tight junctions in establishing and
maintaining cell polarity. Annu Rev Physiol. 1998;60:161–77.
19. Kojima T, Go M, Takano K, Kurose M, Ohkuni T, Koizumi J, et al. Regulation of tight
junctions in upper airway epithelium. Biomed Res Int. 2013;2013:947072.
20. Paradis T, Begue H, Basmaciyan L, Dalle F, Bon F. Tight junctions as a key for pathogens
invasion in intestinal epithelial cells. Int J Mol Sci. 2021;22(5)
21. Bailey KL, Bonasera SJ, Wilderdyke M, Hanisch BW, Pavlik JA, DeVasure J, et al. Aging
causes a slowing in ciliary beat frequency, mediated by PKCepsilon. Am J Physiol Lung Cell
Mol Physiol. 2014;306(6):L584–9.
22. Angelidis I, Simon LM, Fernandez IE, Strunz M, Mayr CH, Greiffo FR, et al. An atlas of the
aging lung mapped by single cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nat Commun.
2019;10(1):963.
23. Schamberger AC, Mise N, Jia J, Genoyer E, Yildirim AO, Meiners S, et al. Cigarette smoke-
induced disruption of bronchial epithelial tight junctions is prevented by transforming growth
factor-beta. Am J Respir Cell Mol Biol. 2014;50(6):1040–52.
24. Heijink IH, Brandenburg SM, Postma DS, van Oosterhout AJ. Cigarette smoke impairs airway
epithelial barrier function and cell-cell contact recovery. Eur Respir J. 2012;39(2):419–28.
25. Strzelak A, Ratajczak A, Adamiec A, Feleszko W. Tobacco smoke induces and alters immune
responses in the lung triggering inflammation, allergy, asthma and other lung diseases: a
mechanistic review. Int J Environ Res Public Health. 2018;15(5)
26. Gon Y, Hashimoto S. Role of airway epithelial barrier dysfunction in pathogenesis of asthma.
Allergol Int. 2018;67(1):12–7.
27. Fuchs E. Skin stem cells: rising to the surface. J Cell Biol. 2008;180(2):273–84.
28. Feingold KR. Lamellar bodies: the key to cutaneous barrier function. J Invest Dermatol.
2012;132(8):1951–3.
29. Braff MH, Di Nardo A, Gallo RL. Keratinocytes store the antimicrobial peptide cathelicidin in
lamellar bodies. J Invest Dermatol. 2005;124(2):394–400.
30. Lundwall A, Brattsand M. Kallikrein-related peptidases. Cell Mol Life Sci. 2008;65(13):
2019–38.
31. Oren A, Ganz T, Liu L, Meerloo T. In human epidermis, beta-defensin 2 is packaged in lamellar
bodies. Exp Mol Pathol. 2003;74(2):180–2.
32. Kezic S, Novak N, Jakasa I, Jungersted JM, Simon M, Brandner JM, et al. Skin barrier in atopic
dermatitis. Front Biosci (Landmark Ed). 2014;19(3):542–56.
33. Natsuga K. Epidermal barriers. Cold Spring Harb Perspect Med. 2014;4(4):a018218.
34. Smith FJ, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, Sandilands A, Campbell LE, Zhao Y, et al. Loss-
of-function mutations in the gene encoding filaggrin cause ichthyosis vulgaris. Nat Genet.
2006;38(3):337–42.
35. Woo YR, Lim JH, Cho DH, Park HJ. Rosacea: molecular mechanisms and Management of a
Chronic Cutaneous Inflammatory Condition. Int J Mol Sci. 2016;17(9)
36. Nutten S. Atopic dermatitis: global epidemiology and risk factors. Ann Nutr Metab. 2015;66
(Suppl 1):8–16.
37. Asher MI, Montefort S, Bjorksten B, Lai CK, Strachan DP, Weiland SK, et al. Worldwide time
trends in the prevalence of symptoms of asthma, allergic rhinoconjunctivitis, and eczema in
childhood: ISAAC phases one and three repeat multicountry cross-sectional surveys. Lancet.
2006;368(9537):733–43.
38. Weidinger S, Novak N. Atopic dermatitis. Lancet. 2016;387(10023):1109–22.
39. Kim J, Kim BE, Leung DYM. Pathophysiology of atopic dermatitis: clinical implications.
Allergy Asthma Proc. 2019;40(2):84–92.
40. Suto H, Matsuda H, Mitsuishi K, Hira K, Uchida T, Unno T, et al. NC/Nga mice: a mouse
model for atopic dermatitis. Int Arch Allergy Immunol. 1999;120(Suppl 1):70–5.
41. Weidinger S, Illig T, Baurecht H, Irvine AD, Rodriguez E, Diaz-Lacava A, et al. Loss-of-
function variations within the filaggrin gene predispose for atopic dermatitis with allergic
sensitizations. J Allergy Clin Immunol. 2006;118(1):214–9.
42. Irvine AD, McLean WH, Leung DY. Filaggrin mutations associated with skin and allergic
diseases. N Engl J Med. 2011;365(14):1315–27.
43. Deng Z, Chen M, Xie H, Jian D, Xu S, Peng Q, et al. Claudin reduction may relate to an
impaired skin barrier in rosacea. J Dermatol. 2019;46(4):314–21.
44. Dirschka T, Tronnier H, Folster-Holst R. Epithelial barrier function and atopic diathesis in
rosacea and perioral dermatitis. Br J Dermatol. 2004;150(6):1136–41.
45. Suhng E, Kim BH, Choi YW, Choi HY, Cho H, Byun JY. Increased expression of IL-33 in
rosacea skin and UVB-irradiated and LL-37-treated HaCaT cells. Exp Dermatol. 2018;27(9):
1023–9.
46. Umar S. Intestinal stem cells. Curr Gastroenterol Rep. 2010;12(5):340–8.
47. Ahmad R, Sorrell MF, Batra SK, Dhawan P, Singh AB. Gut permeability and mucosal
inflammation: bad, good or context dependent. Mucosal Immunol. 2017;10(2):307–17.
48. Camilleri M. Leaky gut: mechanisms, measurement and clinical implications in humans. Gut.
2019;68(8):1516–26.
49. DeMeo MT, Mutlu EA, Keshavarzian A, Tobin MC. Intestinal permeation and gastrointestinal
disease. J Clin Gastroenterol. 2002;34(4):385–96.
50. Martini E, Krug SM, Siegmund B, Neurath MF, Becker C. Mend your fences: the epithelial
barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cell Mol
Gastroenterol Hepatol. 2017;4(1):33–46.
51. Odenwald MA, Turner JR. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target? Nat Rev
Gastroenterol Hepatol. 2017;14(1):9–21.
52. Parikh K, Antanaviciute A, Fawkner-Corbett D, Jagielowicz M, Aulicino A, Lagerholm C, et al.
Colonic epithelial cell diversity in health and inflammatory bowel disease. Nature. 2019;567
(7746):49–55.
53. Cuzic S, Antolic M, Ognjenovic A, Stupin-Polancec D, Petrinic Grba A, Hrvacic B, et al.

Claudins: beyond tight junctions in human IBD and murine models. Front Pharmacol. 2021;12:
682614.
54. Obermuller B, Frisina N, Meischel M, Singer G, Stanzl-Tschegg S, Lichtenegger H, et al.
Examination of intestinal ultrastructure, bowel wall apoptosis and tight junctions in the early
phase of sepsis. Sci Rep. 2020;10(1):11507.
55. Heller F, Florian P, Bojarski C, Richter J, Christ M, Hillenbrand B, et al. Interleukin-13 is the
key effector Th2 cytokine in ulcerative colitis that affects epithelial tight junctions, apoptosis,
and cell restitution. Gastroenterology. 2005;129(2):550–64.
56. Edmondson R, Broglie JJ, Adcock AF, Yang L. Three-dimensional cell culture systems and
their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol.
2014;12(4):207–18.
57. Arason AJ, Jonsdottir HR, Halldorsson S, Benediktsdottir BE, Bergthorsson JT, Ingthorsson S,
et al. deltaNp63 has a role in maintaining epithelial integrity in airway epithelium. PLoS One.
2014;9(2):e88683.
58. Jiang D, Schaefer N, Chu HW. Air-liquid Interface culture of human and mouse airway
epithelial cells. Methods Mol Biol. 2018;1809:91–109.
59. Srinivasan B, Kolli AR, Esch MB, Abaci HE, Shuler ML, Hickman JJ. TEER measurement
techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 2015;20(2):107–26.
60. Andrews C, McLean MH, Durum SK. Cytokine tuning of intestinal epithelial function. Front
Immunol. 2018;9:1270.
61. Deli MA. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and
improve drug delivery. Biochim Biophys Acta. 2009;1788(4):892–910.
62. Cavanaugh KJ, Cohen TS, Margulies SS. Stretch increases alveolar epithelial permeability to
uncharged micromolecules. Am J Physiol Cell Physiol. 2006;290(4):C1179–88.
63. Bisig C, Voss C, Petri-Fink A, Rothen-Rutishauser B. The crux of positive controls–pro-
inflammatory responses in lung cell models. Toxicol In Vitro. 2019;54:189–93.
64. Asgrimsson V, Gudjonsson T, Gudmundsson GH, Baldursson O. Novel effects of azithromycin
on tight junction proteins in human airway epithelia. Antimicrob Agents Chemother. 2006;50
(5):1805–12.
65. Slater M, Torr E, Harrison T, Forrester D, Knox A, Shaw D, et al. The differential effects of
azithromycin on the airway epithelium in vitro and in vivo. Physiol Rep. 2016;4(18):e12960.
66. Arason AJ, Joelsson JP, Valdimarsdottir B, Sigurdsson S, Gudjonsson A, Halldorsson S, et al.
Azithromycin induces epidermal differentiation and multivesicular bodies in airway epithelia.
Respir Res. 2019;20(1):129.
67. Kanoh S, Rubin BK. Mechanisms of action and clinical application of macrolides as immuno-
modulatory medications. Clin Microbiol Rev. 2010;23(3):590–615.
68. Chen M, Yang T, Meng X, Sun T. Azithromycin attenuates cigarette smoke extract-induced
oxidative stress injury in human alveolar epithelial cells. Mol Med Rep. 2015;11(5):3414–22.
69. Zhu C, Lei W, Huang J. Azithromycin inhibits double-stranded RNA-induced thymic stromal
lymphopoietin release from human airway epithelial cells. Pharmazie. 2013;68(11):899–903.
70. Liu Y, Pu Y, Li D, Zhou L, Wan L. Azithromycin ameliorates airway remodeling via inhibiting
airway epithelium apoptosis. Life Sci. 2017;170:1–8.
71. London IC, Melinta TI. A study to evaluate the anti-inflammatory effects of solithromycin in
chronic obstructive pulmonary disease. https://ClinicalTrials.gov/show/NCT02628769; 2015.
72. Kricker JA, Ingthorsson S, Valdimarsdottir B, Joelsson JP, Sigurdsson S, Gardarsson FR, et al.
Targeting the lung epithelial barrier to inhibit neutrophilic inflammation. 15th world congress
on inflammation; 5–8 June 2022; Rome, Italy: Pharmadvances, SIF; 2022.
73. Kricker JA, Valdimarsdottir B, Joelsson JP, Ingthorsson S, Parnham MJ, Sigurdsson S, et al.
Barriolides: non-antibacterial compounds with epithelial barrier enhancing properties and anti-
inflammatory effects in vitro. 15th world congress on inflammation; 5–8 June 2022; Rome,
Italy: Pharmadvances, SIF; 2022.
74. Azuma A, Kudoh S. Diffuse panbronchiolitis in East Asia. Respirology. 2006;11(3):249–61.
75. Feldman C, Anderson R. The cytoprotective interactions of antibiotics with human ciliated
airway epithelium. 2005. In: Antibiotics as anti-inflammatory and immunomodulatory agents
[internet]. Basel: Birkhäuser Basel; 2005. p. 1. Progress in Inflammation Research; [49-63].
76. Bush A. Azithromycin is the answer in paediatric respiratory medicine, but what was the
question? Paediatr Respir Rev. 2020;34:67–74.
77. Reijnders TDY, Saris A, Schultz MJ, van der Poll T. Immunomodulation by macrolides:
therapeutic potential for critical care. Lancet Respir Med. 2020;8(6):619–30.
78. Rubin BK. Immunomodulatory properties of macrolides: overview and historical perspective.
Am J Med. 2004;117(Suppl 9A):2S–4S.
79. Mikasa K, Sawaki M, Kita E, Konishi M, Maeda K, Hamada K, et al. Long-term chemotherapy
using erythromycin (EM) for chronic lower airway infection: effectiveness of clarithromycin in
EM ineffective cases–the fourth report. Kansenshogaku Zasshi. 1992;66(8):1097–104.
80. Robinson P, Schechter MS, Sly PD, Winfield K, Smith J, Brennan S, et al. Clarithromycin
therapy for patients with cystic fibrosis: a randomized controlled trial. Pediatr Pulmonol.
2012;47(6):551–7.
81. GOLD. Global strategy for prevention, diagnosis and management of COPD: 2022 report.
www.goldcopd.org: Global initiative for chronic obstructive lung disease, Inc.; 2022.
82. GINA. Global Strategy for Asthma Management and Prevention. https://ginasthma.org/; 2022.
83. Crosbie PA, Woodhead MA. Long-term macrolide therapy in chronic inflammatory airway
diseases. Eur Respir J. 2009;33(1):171–81.
84. Simpson JL, Powell H, Boyle MJ, Scott RJ, Gibson PG. Clarithromycin targets neutrophilic
airway inflammation in refractory asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2008;177(2):148–55.
85. Wan KS, Liu YC, Huang CS, Su YM. Effects of low-dose clarithromycin added to fluticasone
on inflammatory markers and pulmonary function among children with asthma: a randomized
clinical trial. Allergy Rhinol (Providence). 2016;7(3):131–4.
86. Gibson PG, Yang IA, Upham JW, Reynolds PN, Hodge S, James AL, et al. Efficacy of
azithromycin in severe asthma from the AMAZES randomised trial. ERJ Open Res. 2019;5
(4):00056.
87. Sadamatsu H, Takahashi K, Tashiro H, Kato G, Noguchi Y, Kurata K, et al. The non-antibiotic
macrolide EM900 attenuates HDM and poly(I:C)-induced airway inflammation with inhibition
of macrophages in a mouse model. Inflamm Res. 2020;69(1):139–51.
88. Simpson JL, Powell H, Baines KJ, Milne D, Coxson HO, Hansbro PM, et al. The effect of
azithromycin in adults with stable neutrophilic COPD: a double blind randomised, placebo
controlled trial. PLoS One. 2014;9(8):e105609.
89. Seemungal TA, Wilkinson TM, Hurst JR, Perera WR, Sapsford RJ, Wedzicha JA. Long-term
erythromycin therapy is associated with decreased chronic obstructive pulmonary disease
exacerbations. Am J Respir Crit Care Med. 2008;178(11):1139–47.
90. Djamin RS, Bafadhel M, Uzun S, Russell REK, Ermens AAM, Kerstens R, et al. Blood
eosinophil count and GOLD stage predict response to maintenance azithromycin treatment in
COPD patients with frequent exacerbations. Respir Med. 2019;154:27–33.
91. Corren J, Pham TH, Garcia Gil E, Salapa K, Ren P, Parnes JR, et al. Baseline type 2 biomarker
levels and response to tezepelumab in severe asthma. Allergy. 2022;77(6):1786–96.
92. Alzolibani AA, Zedan K. Macrolides in chronic inflammatory skin disorders. Mediat Inflamm.
2012;2012:159354.
93. Bakar O, Demircay Z, Yuksel M, Haklar G, Sanisoglu Y. The effect of azithromycin on reactive
oxygen species in rosacea. Clin Exp Dermatol. 2007;32(2):197–200.
94. Huang SW, Chen YJ, Wang ST, Ho LW, Kao JK, Narita M, et al. Azithromycin impairs TLR7
signaling in dendritic cells and improves the severity of imiquimod-induced psoriasis-like skin
inflammation in mice. J Dermatol Sci. 2016;84(1):59–70.
95. Trompette A, Pernot J, Perdijk O, Alqahtani RAA, Domingo JS, Camacho-Munoz D, et al.
Gut-derived short-chain fatty acids modulate skin barrier integrity by promoting keratinocyte
metabolism and differentiation. Mucosal Immunol. 2022;15(5):908–26.
96. Takeyama K. Macrolides and mucus production. 2005. In: Antibiotics as anti-inflammatory and
immunomodulatory agents [internet]. Basel: Birkhäuser Basel; 2005. p. 1. Progress in Inflam-
mation Research; [123-32].
Macrolides and Inflammatory Cells,
Signaling, and Mediators
Mitsuko Kondo
Abstract Low-dose long-term macrolide therapy had a remarkable effect on the

prognosis of diffuse panbronchiolitis and suppression of airway secretion and
neutrophilic inflammation in this disease. Macrolides inhibit airway water secretion,
mucin secretion, and mucus production. Macrolides also suppress neutrophilic
infiltration through suppression of proinflammatory cytokines, chemokines, and
adhesion molecules. However, macrolides do not appear to be immunosuppressive
but rather immunomodulatory, to reset and normalize inflammation. In order to
elucidate the mechanism of action of macrolides, the intracellular signal transduction
mechanism has been investigated using animal models and cell lines, and in these
models, it is important to inhibit mitogen-activated protein kinases and transcription
factors such as NFκB. However, the effects of macrolides are widespread and
diverse, as are their target proteins and receptors. Since macrolides affect lysosome,
autophagy, and apoptosis, their affinity with the membranes that constitute the cell
membrane and intracellular organelles attracts attention. This can explain many of
the actions of macrolides, intracellular accumulation, and temporal transition of
actions.
Keywords Airway secretion · Mucin · Neutrophil · Proinflammatory cytokine ·

Mitogen-activated protein kinase · NFκB · Apoptosis · Cell membrane
1 Introduction
Low-dose long-term therapy with erythromycin (EM) brought about a breakthrough

improvement in the prognosis of diffuse panbronchiolitis (DPB) [1]. The principal
mechanisms of action for macrolide therapy are thought to be suppressing airway
hypersecretion and neutrophil inflammation. Macrolides improve mucociliary clear-
ance by directly suppressing excessive water and mucin secretion [2–4]. Macrolides
M. Kondo (✉)
Department of Respiratory Medicine, Tokyo Women’s Medical University School of Medicine,
Tokyo, Japan
e-mail: kondo.mitsuko@twmu.ac.jp
© The Author(s), under exclusive license to Springer Nature Switzerland AG 2024 25

B. K. Rubin, M. Shinkai (eds.), Macrolides as Immunomodulatory Agents, Progress
in Inflammation Research 92, https://doi.org/10.1007/978-3-031-42859-3_2
26 M. Kondo
also suppress neutrophil activation and accumulation in the airway, which acts
indirectly on airway epithelial cells to suppress hypersecretion [5]. The characteristic
features of macrolide therapy are as follows. (1) Macrolides are effective at low-dose
and long-term administration, (2) Macrolides are effective even in Pseudomonas
aeruginosa-infected pathologies that are resistant to macrolides, (3) 14-membered
macrolides [EM, clarithromycin (CAM), roxithromycin (RXM)] and 15-membered
macrolide/azilide azithromycin (AZM) are more effective than 16-membered
macrolides [2]. Macrolide concentrations are at least tenfold higher in the epithelial
lung fluid than serum [2]. Currently, macrolides are widely used for chronic airway
inflammatory diseases with neutrophil inflammation such as chronic sinusitis, bron-
chiectasis, cystic fibrosis (CF), and COPD. In addition, the usefulness of macrolides
has been established in some cases of intractable and noneosinophilic asthma and is
being studied for the therapy of pulmonary fibrosis. In this chapter, we introduce the
effects of macrolides on airway secretion and inflammatory cells/cytokines and
describe the broad effects of macrolides on intracellular signaling mechanisms.
2 Regulation of Airway Secretion and Inflammatory

Cells/Cytokines and Chemokines by Macrolides
1. Regulation of water secretion

Over 90% of airway surface fluid is water, and water secretion is regulated by active
Cl ion transport in airway epithelial cells. EM suppresses Cl ion transport in airway
epithelial cells, when the short-circuit current, an indicator of active ion transport, is
measured by Ussing chamber [3]. Using the patch clamp technique with nasal gland
cells, RXM suppresses activation of Cl ion channels induced by acetylcholine
[6]. That is, 14-membered macrolides cause a decrease in water secretion associated
with inhibition of Cl ion channels. The main Cl ion channels in the airway are
cAMP-dependent CFTR and Ca-activated Cl ion channels (CaCC). CaCC is a
transmembrane protein 16A (TMEM16A) [7]. We found that TMEM16A-
dependent Cl ion transport in IL-13-treated airway epithelial cells was suppressed
by pretreatment with CAM [8]. EM also suppresses intracellular Ca2+ elevation
induced by ATP stimulation through Ca2+ influx from extracellular spaces and Ca2+
oscillations [9]. Cl ion transport suppression by macrolides may also be due to
inhibiting the increase in intracellular Ca2+. However, macrolides appear to have no
effect on Cl ion transport in CFTR-knockout mouse and patients with CF [10].
CAM, amoxicillin, and cefaclor were administered for 1 week to patients with
chronic bronchitis and bronchiectasis, and changes in the sputum volume were
measured, and a decrease in sputum volume of 30% or more was observed in the
CAM group. In the sputum, the proportion of solid components increased, and the Cl
ion concentration decreased [11], suggesting that the decrease in sputum content was
due to a decrease in water content, perhaps due to inhibiting Cl ion transport. When
CAM was administered to patients with COPD for 8 weeks, the volume of sputum
Macrolides and Inflammatory Cells, Signaling, and Mediators 27
was reduced by half, and an increase in sputum elasticity was measured while
viscosity was unchanged [4].
2. Suppression of mucin secretion
Mucin accounts for more than 30% of the solid components of airway mucus.
Mucin is a large glycoprotein, and its core protein is composed of repeating serine
and threonine peptides decorated with sugar chains linked by O-glycosidic bonds.
There are secretory and membrane-bound mucins in the respiratory tract, the former
being gel-forming and a component of mucus. Secretory mucin-producing cells in
the airway are goblet cells, mucous cells, and serous cells in the submucosal glands.
MUC5AC and MUC5B are produced from goblet cells, and MUC5B is abundantly
produced from mucous cells of the submucosal gland [12]. When secretory stimu-
lants are administered to goblet cells, degranulation from the secretory granules
occurs rapidly. Airway mucus hypersecretion results from degranulation from secre-
tory cells and from increased mucin production. Stimulation of the autonomic
nervous system and mediators such as elastase and histamine causes degranulation.
In animal experiments, administration of CAM and EM once a day for 1 week
suppresses degranulation caused by lipopolysaccharide (LPS) stimulation, but not
with ampicillin or cefaclor [13].
3. Suppression of mucin production
The epithelial growth factor receptor (EGFR) plays an important role in mucin
production [14]. There are many EGFR ligands such as epidermal growth factor
(EGF), TGFα, HB-EGF, amphiregulin and tobaccos smoke, and when EGFR is
stimulated by these ligands, its phosphorylation occurs and the ERK1/2 pathway is
activated via Ras, Raf, and MEK [14, 15]. Transcription factors such as NFκB then
enter the nucleus to promote gene expression and mucin. Macrolides suppress
TGFα- and LPS-stimulated mucin production in NCI-H292 cells, perhaps at the
transcriptional level of NFκB [16]. EGFR can be phosphorylated when stimulated
with TNFα or H2O2 is added to NCI-H292 cells [17]. Because the antioxidant,
N-acetyl cysteine, suppresses this reaction, it is thought that this is due to reactive
oxygen species (ROS) derived from neutrophils phosphorylating EGFR [17]. The
addition of neutrophil elastase to NCI-H292 cells also causes phosphorylation of
EGFR and enhances mucin production [18]. Macrolides suppress the infiltration and
activation of neutrophils, resulting in suppression of ROS and elastase production,
suppression of EGFR activation, and reduction in mucin production. The culture
supernatant of Pseudomonas aeruginosa stimulates EGFR and enhances mucin
production [19]; therefore, macrolides can decrease mucin gene expression by
decreasing EGFR activation.
4. Regulation of inflammatory cells/cytokines
Neutrophils release chemokines including IL-8/CXCL8, leukotrienes, proteases,
and ROS. Low-dose long-term macrolide therapy decreases neutrophil numbers,
IL-8/CXCL8, and IL-1β in bronchoalveolar lavage fluid of subjects with DPB or
bronchiolitis [20]. Administration of LPS to rats enhances airway neutrophil
28 M. Kondo
accumulation, IL-8/CXCL8, TNFα, and MUC5AC production, and these can be

decreased by macrolides [21]. The expression of neutrophil adhesion molecules
Mac1 (CD11b/CD18) and L-selection is also suppressed by macrolides
[22, 23]. EM administered to cultured human airway epithelial cells decreases the
production of IL-6 and IL-8/CXCL8 and the expression of ICAM-1. Macrolides also
reduce VCAM-1 expression and leukocyte migration in a murine bleomycin-
induced lung fibrosis model [24]. EM inhibits leukocyte recruitment in the lung
through downregulation of adhesion molecules in vivo study using LPS stimulation
[25]. That is, macrolides can suppress neutrophil infiltration through suppression of
proinflammatory cytokines, chemokines, and adhesion molecules.
Macrolides have also been shown to be effective against eosinophil inflammation.
EM suppresses the secretion of the eosinophil chemotactic chemokine, RANTES,
and eotaxin from IL-1β and TNFα-stimulated fibroblasts [26]. Roxithromycin
decreases the production of IL-5 from T cells [27]. In a murine asthma model
induced by human dust mite antigen, AZM decreased the number of eosinophils
and neutrophils in BAL, with a decrease in IL-4, 5, 6, 10, 12, 13, RANTES, and
goblet cells. AZM also decreased goblet cell metaplasia and mucus secretion [28].
5. Application of macrolides to hypersecretion in COPD and asthma
Long-term macrolide therapy with EM or azithromycin (AZM) has been shown
to decrease COPD exacerbations [29, 30]. Macrolides can suppress the expression of
the adhesion molecule, ICAM-1, needed for the invasion of viruses and decrease
inflammatory cytokines released from airway epithelial cells [31]. As airway
defenses are impaired by smoking or oxidants, persistent infection can occur, leading
to chronic neutrophil accumulation and hypersecretion. Macrolides suppress chronic
airway inflammation in COPD by inhibiting virus infection, biofilm formation,
infiltration of inflammatory cells, and hypersecretion [32].
IL-8/CXCL8 and neutrophils are involved in non-T2 asthma, and in these
patients, macrolide therapy inhibits neutrophilic inflammation and improves quality
of life [33]. Airway obstruction due to mucus leads to decreased respiratory function
and contributes to fatal asthma [12]. MUC5AC is abundant in the sputum of persons
with asthma, and MUC5AC, but not MUC5B, is tethered to the cell surface after
being secreted from goblet cells, increasing sputum viscosity and tenacity. IL-13, a
T2 cytokine is abundant in the asthma airway; IL-13 causes goblet cell metaplasia
and increased MUC5AC in airway epithelial cells in vivo and in vitro. IL-13-
induced goblet cell metaplasia is decreased by macrolides but not by corticosteroids
[34, 35]. CAM inhibits the IL-13 receptor-JAK-STAT6 pathway and EGFR-MAP
kinase pathway and inactivates NFκB transcriptional activity [35]. IL-13 induces
secretion of CLCA1 from airway epithelial cells, and this is associated with goblet
cell metaplasia. CAM also decreases CLCA1 expression [36]. CLCA1 is also a
regulator of TMEM16A and is involved in the stabilization of TMEM16A in the cell
membrane [37]. Expression of TMEM16A is also strongly associated with goblet
cell metaplasia, and CAM suppresses IL-13-induced TMEM16A expression [8]
(Fig. 1). Macrolides also enhance the barrier function of the airway epithelium by
differentiation of epithelial cells into ciliated cells and enhancing epithelial repair
Differentiation Mucus Production Secretion
IL-13 N-CLCA1
C-CLCA1
CLCA1
Mucin
Cleavage Cl-
N-CLCA1
ML
IL-4Ra IL-13Ra1 EGFR ML
ATP
TMEM16A UTP P2Y2R
TMEM16A ML Cl-
ERK1/2
ML NFkB ML Ca2+
JAK1
ML STAT6 MUC
5AC
MAPK13
CLCA1
TMEM16A MUC5AC
CLCA1
ML
Epithelial
Precursor Goblet cells
Cells
Ciliated cells
Fig. 1 The hypothesis from goblet cell metaplasia to the secretion of airway epithelial cells induced
by IL-13 and the reported points of action of macrolides Stimulation of IL-13 induces TMEM16A
via JAK1 and STAT6, after which TMEM16A migrates to the cell membrane. Similarly, CLCA1 is
also produced and secreted extracellularly by stimulation with IL-13. CLCA1 is autolyzed, and
N-CLCA1 acts on TMEM16A, contributing to the stabilization of TMEM16A on the cell mem-
brane. In addition, TMEM16A interacts with EGFR, MUC5AC is induced via activation of ERK1/
2, NFκB, and MAPK13-dependent pathway, mucin granules are formed, and goblet cell formation
is completed. IL-13 stimulation suppresses FOXA2 through activation of SPDEF and suppresses
differentiation into ciliated cells. In goblet cells, secretory stimuli such as ATP and UTP increase
intracellular Ca2+ via P2Y2 receptors and induce extracellular Ca2+ influx. As a result, TMEM16A
shows CaCC activity and causes Cl ion transport and mucin granule secretory reaction. In this
hypothesis, the blocking marks are reported as the points of action of macrolides (ML). Created
with reference to References 8, 9, 34–36
[2, 8]. Macrolide therapy is expected to be effective for neutrophil-dominant asthma,

which is steroid-resistant, and severe asthma with mucus hypersecretion. It is
reported that AZM therapy for refractory asthma can decrease exacerbations and
improve quality of life [38].
6. Time course of macrolide action on inflammatory cells
After the first administration of macrolides, the effects of macrolides on neutro-
phil inflammation are known to be biphasic, nonlinear, and time-dependent
[2, 39]. In a very acute phase, neutrophil degranulation, phagocytosis, and the
formation of neutrophil extracellular traps (NETS) are enhanced [40, 41], and the
30 M. Kondo
Phagocytosis
ROS
Elastase
Cl ion
Mucin
LTB4
Biofilm
Quorum sensing
Airway Barrier
epithelium -Defensin
H2O ICAM-1 Macrophage
Proinflammatory cytokine
Apoptosis Chemotaxis Efferocytosis IL-10
Endothelial cell VCAM-1

ICAM-1
Vessels Mac-1
Neutrophil
Fig. 2 Effect of macrolides on chronic inflammatory airways. In the chronic inflammatory airway,
barrier dysfunction of the airway epithelium, infiltration of inflammatory cells, goblet cell meta-
plasia, hypersecretion, impairment of mucociliary clearance, and recurrent airway infection are
observed. Macrolides have antiinflammatory effects such as suppression of proinflammatory
cytokine productions, adhesion molecules, chemical mediators release, reactive oxygen species
(ROS) production, and induction of apoptosis of neutrophils. For airway epithelium, macrolides
suppress secretory responses, enhance barrier function, and suppress proinflammatory cytokines
and adhesion molecules. For bacteria, macrolides suppress biofilm and quorum-sensing function.
Downward-facing arrows, inhibition by macrolides; upward-facing arrows, enhancement by
macrolides
antibacterial effect and host defense are stimulated. However, after 24 h, macrolides
decrease IL-8, proteases, and ROS and promote resolution from inflammation.
Apoptosis of neutrophils is also involved in this process such that neutrophil necrosis
decreases and the release of inflammatory mediators mitigates. Macrolides also
suppress the release of proinflammatory cytokines and inducible nitric oxide
synthase (iNOS) from monocytes and alveolar macrophages and convert M1 to
M2 macrophages after 2–3 days. M2 macrophages release the antiinflammatory
cytokine, IL-10 [42]. Macrophages enhance phagocytosis and efferocytosis of
apoptotic neutrophils in the presence of macrolides [43]. The effect of macrolides
on the resolution of inflammation lasts for weeks to months [44]. Macrolides also
reduce the expression of Toll-like receptors and the expression of IL-12 in dendritic
cells [45]. This causes macrolides to suppress differentiation into Th1 cells and, as a
result, to reduce IFNγ released from Th1 cells. Macrolides induce immune-tolerant
dendritic cells and suppress the expression of co-stimulatory molecules [45–47].
In summary, the effects of macrolides on the airway are shown in Fig. 2 and
Table 1.
Table 1 Antiinflammatory and immunomodulatory effects of macrolides on airway epithelial cells, inflammatory cells, and other cells
Airway epithelial cells Neutrophils Macrophages/Monocytes Lymphocytes Fibroblasts Endothelial cells
Inhibition of cytokine etc.
IL-8 TNFα IL-1β IL-4, IL-5, IL-13 VEGF VCAM-1
TNFα LTB4 TNFα TNFα RANTES VEGF
GM-CSF IL-1β IL-6 IL-2 Eotaxin
Eotaxin Mac1 IL-8 IL-17 IL-8
IL-6 (G)M-CSF IFNγ MMP
ICAM-1 IL-12 IL-10
IFNγ
Inhibition of function
Cl ion transport Elastase Inducible NO production T cell skewing Th1 Proliferation Angiogenesis
Mucin secretion Myeloperoxidase Phagosomal acidification Perforin Migration
MUC5AC Production ROS Co-stimularoty molecules CD69
Goblet cell metaplasia NETS TLR2,4,6,9 Granzyme B
Macrolides and Inflammatory Cells, Signaling, and Mediators
Chemotaxis MHC class II CD8

M1 macrophage
Stimulation of function
Mucociliary clearance Apoptosis Efferocytosis IgA
Tight junction Phagocytosis Apoptosis
β-Defensin Differentiation to M2 Treg
It is classified into inhibition of cytokine etc., inhibition or stimulation of function by macrolides. ROS reactive oxygen species; NETS neutrophil extracellular
traps
31
32 M. Kondo
3 Intracellular Signaling Mechanisms
Macrolides are concentrated in tissues and cells, and their concentration is reported
to reach 10–100 times that of serum [48], suggesting a role of macrolides in
intracellular signaling. However, the target proteins and receptors are still unknown.
Intracellular signaling pathways affected by macrolides are shown in Fig. 3.
1. Intracellular calcium
Intracellular Ca2+ plays an important role in intracellular signal transduction. In
airway epithelial cells and A549 cells, EM suppresses intracellular Ca2+ level and
Ca2+ influx from the extracellular space caused by purinergic receptor stimulation
[49]. EM and AZM can decrease mucus secretion from the submucosal glands of the
airways, in part, by inhibiting calcium influx [50]. In mast cells, roxithromycin also
decreases the activation by β-defensin 2 via the Ca2+ signaling pathway [51]. In
neutrophils, EM suppresses FMLP-stimulated superoxide production and Ca2+
influx [52]. In addition, since intracellular Ca2+ is also involved in the activation
of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and NFκB, it is speculated that
macrolides may affect a wide range of cell functions through the regulation of
intracellular Ca2+ [2].
2. Mitogen-activated protein kinases (MAPKs)
MAPKs form a network responding to both internal and external stimuli for
signal transduction and play an important role in controlling inflammatory gene
expression, cell proliferation, cell differentiation, and apoptosis [53]. There are three
main classes of MAPKs: extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-Jun N-ter-
minal kinase (JNK), and p38 MAPK. MAPKs induce IL-8/CXCL8 expression by
both an NFκB-dependent and independent pathway. Shinkai et al. investigated the
effect of macrolides on MAPK and IL-8/CXCL8 expression using airway epithelial
cells. CAM suppressed ERK phosphorylation in the initial 30–90 min, the level was
increased at 2 h to 3 days, and it normalized to the unstimulated level by 5 days. As a
result, IL-8/CXCL8 was maximal at 24 h, and then gradually decreased [54]. The
action of macrolides is not to suppress inflammation in one direction but to reset and
normalize it and thus is immunomodulatory with long-term therapy. Macrolides also
protect cells by moving the cell cycle to G1/G0, and they decrease the phosphoryla-
tion of ERK in airway epithelial cells [55]. Furthermore, the inhibitory effect of
CAM and AZM on MUC5AC production from airway epithelial cells and neutrophil
infiltration during Pseudomonas aeruginosa infection is also mediated by the inhi-
bition of the ERK activity [56–58]. It has been reported that EM restored steroid
sensitivity by suppressing the activation of the JNK/c-JUN pathway induced by
tobacco smoke [59].
3. Transcription factors; NFκB and AP-1
Macrolides decrease cytokine production by suppressing the transcription factors
NFκB and AP-1 in airway epithelial cells and monocytes [60–62]. NFκB is inactive
External stimuli
(Growth factor, LPS, Pathogen, Inflammatory mediator)
GPCR
RTK TLR Ca2+ channel
PI3K PLCg G
MEKK MyD88 TRIF
PLCb
DAG DAG ER
IP3 TRAF IP3
ML Ca2+
[Ca2+] i stores
TAK1 IP3R
Akt
MEK IKK [Ca2+]i ML IL-18

PKC
mTOR Caspase-1
ML I B-
Nrf2 NF B PKC
ERK Ca2+-mediated
ML CaMK
p38 cellular response
JNK ML
NLRP3
ML
inflammasome
AP1 NF B
NLRP3
ProIL-1
ProIL-18
Pro-inflammatory gene expression
Fig. 3 Intracellular signaling transduction pathways and the related sites of macrolide
immunomodulation. Receptor tyrosine kinases (RTKs) are receptors for many growth factors and
cytokines. For example, epithelial growth factor receptor (EGFR) activates MEKK, MEK, and
ERK1/2. Toll-like receptors (TLRs) activated by pathogens and LPS stimulate the IκB kinase (IKK)
complex and the MAPK pathway. IKK complex activates NFκB through the digestion of IκB, and
then NFκB is translocated. The MAPK pathway leads to AP-1 induction. Macrolides inhibit these
pathways and then inhibit proinflammatory gene expression. NLRP3, ProIL-1β, and ProIL-18 gene
expression form NLRP3 inflammasome, leading to IL-β and IL-18 release decomposed by
Caspase-1. G-protein-coupled receptor (GPCR) or RTK-mediated activation of phospholipase C
(PLC) produces inositol triphosphate (IP3) and diacylglycerol (DAG). IP3 increases intracellular Ca
from endoplasmic reticulum Ca stores, and DAG activates protein kinase C (PKC). RTK- or GPCR-
stimulation also induces activation of PI3K/Akt pathway. Macrolides inhibit these pathways and as
a result, modulate various cell functions. Blue arrows are major pathways influenced by macrolides.
Dashed arrows are cross-talk pathways. Red lines indicate the sites of macrolide’s inhibition.
Modified from Reference 2. Abbreviations: Akt AKT8 virus oncogene cellular homolog; AP-1
activator protein 1; CaMK calmodulin kinase; ER endoplasmic reticulum; ERK extracellular signal-
regulated kinase; GFR cytokine receptor/growth factor receptor; IKK IκB kinase; IP3R inositol
triphosphate receptor; JNK c-Jun N-terminal kinase; MEK MAPK/ERK kinase; MEKK MAPK/
ERK kinase kinase; mTOR serine/threonine kinase mammalian target of rapamycin; MyD88
myeloid differentiation factor 88; PI3K phosphoinositide 3-kinase; PKC protein kinase C; TAK1
transforming growth factor-activated protein kinase 1; TRAF TNF receptor-associated factor; TRIF
TIR-domain-containing adaptor-inducing interferon-β; TLR Toll-like receptor; Nrf2 Nuclear factor-
erythroid 2-related factor 2
Another random document with
no related content on Scribd:
Mutta alusta alkaen oli hänen läheisyytensä painostanut Gilliania
— tyttö tunsi aina hänen läsnäolonsa. Luostarikasvatus oli tehnyt
Gillianista kovin herkän, ja vaistomaisesti hän tiesi, milloin Craven
tuli huoneeseen tai poistui sieltä. Miehet olivat hänelle tuntemattomia
suuruuksia; niitä harvoja, jotka hän oli kohdannut —
koulutovereittensa veljiä tai serkkuja — hän oli tarkkaillut kokonaan
toiselta näkökannalta. Ranskalaisen luostarin jäykät säännöt olivat
estäneet kaikkia tuttavuussuhteita kehittymästä ystävyydeksi — hän
oli ollut vain koulutyttö muiden tyttöjen joukossa, ja vain loitolta
hipaissut nuorimpia miespuolisia jäseniä niissä taloissa, joissa hän
oli vieraillut. Hän oli ollut valmistumaton joutuessaan jokapäiväiseen
kosketukseen Barry Cravenin kaltaisen miehen kanssa. Hän tarvitsi
aikaa sopeutuakseen siihen, perehtyäkseen jatkuvaan miesseuraan.
Veljenpoikansa huojennukseksi oli neiti Craven ottanut ujon,

kalpeakasvoisen tytön omituisen sydämensä lemmikiksi niin äkkiä ja
intomielisesti, että se oli kummastuttanut häntä itseäänkin.
Ja Gillianin umpimielisyys ja ylpeys eivät olleet jaksaneet

vastustaa tuulispään tavoin pyörähtelevää, pientä naisihmistä. Neiti
Cravenin persoonallisuus teki häneen väkevän vaikutuksen; hän
rakasti hänessä naista, ihaili taiteilijaa ja oppi hyvin pian pitämään
arvossa hiomattoman käytöksen ja oudolta kuulostavien puheiden
takana piileviä todellisia tunteita ja syvää hyväsydämisyyttä.
Hänellä oli hyvä arvostelukyky. Nyt hän silmäili ympärilleen

avarassa huoneessa. Kaikkialla oli merkkejä tuhlaavasta autiudesta,
jota hänelle vastalauseista välittämättä osoitettiin. Gillianin silmiin
kihosivat vähitellen kyyneleet. Tämä kaikki oli kuin satua, melkein
liian ihmeellistä ollakseen totta. Miksi hänelle oltiin niin hyviä —
miten hän koskaan kykenisi maksamaan hänelle tuhlattua
suopeutta? Hänen ajatuksensa katkaisi viimeinen lahja, joka nousi
kopastaan, haukotteli unisesti, venyttelihe rehevästi, tuli sitten hänen
luokseen, laski päänsä hänen polvilleen ja katseli häntä surullisilla,
ruskeilla silmillään. Hän oli aina pitänyt eläimistä, halunnut palavasti
koiraa, ja nyt hän huoahtaen syleili isoa, mustaa villakoiraa.
»Mouston, sinä hemmoteltu olento, oletko milloinkaan ollut

yksinäinen? Osaatko kuvitella, miltä tuntuu, kun taaskin kuuluu
jollekulle?» Hän hieroi poskeaan koiran silkinpehmoiseen päähän, ja
eläin värähteli hänen kosketuksestaan, sen jäsenet hytkähtelivät, ja
se päästeli kimeitä, puolittain tukahdutettuja vinkaisuja.
Ensimmäisen kerran hän nyt tunsi olevansa omistaja,
vastuunalainen elävästä olennosta, joka oli riippuvainen hänestä. Ja
todennäköisesti se vastuunalaisuus osoittautuisi vaivaloiseksi.
Otuksen uskollisuus oli vilpitön ja kiivas; neiti Cravenia se sieti
välinpitämättömänä, Cravenia se avoimesti epäili. Se seurasi
Gilliania varjon lailla, jörötteli hänen poissa ollessaan ja alistuvasti
totteli Joshiota, jonka hoidossa se aina silloin oli, mutta ei ketään
muuta talon ihmistä. Moustonin välityksellä olivat Gillian ja Joshio
tutustuneet toisiinsa.
Tänä iltana olivat Moustonin kiintymyksenilmaukset ylen kiihkeitä

ja vaarallisia helposti repeytyvälle silkki- ja pitsivaatteukselle. Gillian
suuteli sen päälakea, torjui juhlallisena itsepäisesti häntä tavoittavan
käpälän ja työnsi koiran syrjään. Sitten hän meni pukeutumispöydän
ääreen ja tarkasti arvostelevasti itseään laajasta kuvastimesta. Hän
katsoi vakavan huvitettuna. Oliko tuo Gillian Locke? Näyttiköhän
perhonen itsestään noin oudolta luotuaan kotelonsa? Hän oli
vuosikausia käyttänyt luostarikoulun oppilaan synkkää asua, muutos
oli vielä kyllin tuore ilahduttaakseen häntä, ja viehättävä, kaunis puku
tehosi hänessä piilevään luonnolliseen naiseen. Tumma
luostarivaatteus oli käynyt hänestä vastenmieliseksi; hän oli
kaivannut värejä melkein yhtä kiihkeästi kuin nälkiintynyt ihminen
ruokaa.
Pitkästä peilistä heijastuvan kuvan yleisvaikutus oli tyydyttävä,

mutta sen yksityiskohtainen tarkastus nostatti hänen mielessään
vakavia epäilyksiä. Hän ei ollut koskaan pannut merkille hennon
vartalonsa viehkeyttä, kalpeiden, soikeiden kasvojensa harvinaista
kauneutta — muut tyypit olivat tehonneet häneen enemmän,
toisenlainen ihonväritys miellyttänyt häntä. Usein hän oli arvostellut
kasvojaan moittivasti. Kerran tai pari hän oli mallin puutteessa
koettanut piirtää omia kasvojaan. Se oli tyyten epäonnistunut.
Muiden muotokuvat hän pystyi piirtämään tarkan osuvasti, mutta nyt
siitä ei tullut mitään. Hän ei pystynyt omaan kuvaansa saamaan sitä
miltei hämmästyttävää, luonnetta kuvaavaa ilmeikkyyttä, joka
tavallisesti näkyi hänen töissään. Hän itse oli ollut oman kykynsä
rajana. Tämä epäonnistuminen oli pannut hänet ymmälle, herättänyt
hänen mielessään tutkivia, sielullisia kysymyksiä. Hän ei itse tiennyt,
miten hänen lahjansa pukeutui muotoihin, työ valmistui hänen
käsissään ikäänkuin itsestään. Hän ei tuntenut saavansa
minkäänlaisia varmoja vaikutelmia, ei milloinkaan ollut yrittänyt
eritellä mallinsa sielua. Hämärästi hän otaksui mallin luonteen
jollakin hienolla, salaperäisellä tavalla vaikuttavan häneen. Usein
olikin hänen työnsä ollut parasta silloin, kun hän oli omistanut siihen
vähimmän huolta. Osoittiko se, ettei hän pystynyt maalaamaan
kankaalle eloisaa kuvaa omista kasvoistaan, sitä, ettei hänellä ollut
luonnetta — että hänen epäonnistumisensa johtui siitä, ettei ollut
mitään ilmituotavaa? Vai oliko syynä se, että hän koetti nähdä jotakin
epätodellista — saada esille vain synnynnäisen pyrkimyksen? Sitä
kysymystä hän ei ollut ratkaissut.
Nyt hän silmäili kuvaansa tyytymättömästi kuten tavallisesti; suuret
ruskeat silmät katsoivat peilistä äreinä häneen; sitten hän liikautti
kättään, ikäänkuin pyyhkäisten jotakin pois, ja ravisti päätään.
Koskaan ennen hän ei ollut välittänyt ulkonäöstään, mutta nyt hän
niin hartaasti halusi miellyttää — olla hänelle osoitetun huomion
arvoinen, korvata hänen tähtensä kulutetut rahat ja ajan. Hänen
silmiinsä tuli kaihoisa ilme, kun hän kumartui lähemmäksi kuvaansa
nähdäkseen, oliko kasvoilla kieleviä kyynelten jälkiä; sitten hän äkkiä
alkoi tanssia ihastuksesta, otti ihojauhehuiskun ja taputti sillä
kasvojaan kokeeksi.
»Voi, Gillian Locke, mitähän luostarinjohtajatar sanoisi!» mutisi

hän nauraen.
Ikävystyneenä syrjässäoloon villakoira hypähti häneen vieressään

olevalle tuolille, laski käpälänsä pöydän lasilevylle, niin että harjat ja
pullot hajaantuivat. Yhä nauraen Gillian hieroi jauhetta sen
innokkaasti nuuhkivaan, kosteaan nenään, kunnes se aivastaen pani
moittivan vastalauseensa.
Tyttö hyväili sitä sovittavasti, jätti sen sotkemaan

pukeutumispöytää yhä pahemmin ja palasi ikkunalle. Hänen
alapuolellaan ulottui nurmikko laajalle pengermälle, jota reunustavan
kivisen rintanojan keskikohdalta veivät pitkät portaat säännöllisesti
järjestettyyn ruusutarhaan. Tarhaa suojasi korkea kuusiaita, ja sen
taustalla kasvoi pensaikko, jonka toisella puolen näkyivät
iltavalaistuksessa rajattomiin leviävän puiston paksut rungot.
Häntä kiehtoi avaruuden tuntu. Hän oli aina kaivannut esteettömiä

näköaloja, maaseudun hiljaisuutta. Lyhyeksi leikatulla nurmikolla
kohosi korkeita puita ikäänkuin talon ympärille sijoitettuina vahteina;
mielikuvituksessaan hän ajatteli niitä valppaiksi, eläviksi olennoiksi,
jotka olivat valvoneet paikallaan yhtä mittaa vuosisatoja — ja hymyili
lapsellisille kuvitteluilleen.
Näköala miellytti häntä yhä enemmän. Towersin kauneus oli jo

vallannut hänet, hän oli pitänyt siitä ensi hetkestä alkaen. Pitkällä
rautatiematkalla ja ajettaessa kahdeksan kilometrin päässä olevalta
asemalta tänne hän oli koko ajan kuvitellut sitä, ja todellisuus oli
voittanut hänen kuvitelmansa. Puiston kauneus ja laitumella olevat
kaurislaumat olivat riemastuttaneet häntä; nähdessään vanhan,
harmaan talon hän oli jäänyt seisomaan kuin lumottuna. Hän ei ollut
luullut sitä puoliksikaan niin viehättäväksi, niin vaikuttavan vankaksi.
Hän ei ollut nähnyt mitään, mikä olisi vetänyt vertoja sen hienoille
mittasuhteille, sen rakenteen upeudelle.
Se oli kokonaan toisenlainen kuin ne Ranskan linnat, joissa hän oli

käynyt; siellä pisti työ silmään, viinitarhat ja aaltoilevat viljapellot oli
siellä ahdettu ulottumaan ihan tilanomistajan asunnon muurien
juurelle, varakkuuden lähdettä näyteltiin peittelemättä; täällä oli
kaikki sentapainen karkoitettu loitolle; huolekkaasti hoidetut
lehtokujat, tasaisiksi leikatut nurmikot ja moitteettomat kukkapenkit
olivat todistuksina työstä, jonka tulokset hivelivät silmää, mutta olivat
aineellisesti hyödyttömät.
Ympäristön muodollinen uhkeus tehosi häneen. Hän ei ollut ihan

ventovieras, mietti hän, hymyillen omituisesti — myöhemmästä
rappiotilastaan huolimatta John Locke oli saanut alkunsa
samanlaisesta juuresta kuin tämän ihastuttavan talon omistaja.
Äkkiä hän säikähtäen tajusi myöhästyvänsä ja poistui ikkunalta,

kutsuen koiraa mukaansa. Hänen huoneistostaan päästiin pyöreälle
parvekkeelle, johon makuuhuoneiden ovet avautuivat ja joka kiersi
talon keskiosan ympäri. Sieltä näkyi avaraan, neliskulmaiseen saliin,
johon valoa tuli korkeasta, lasisesta kupukatosta. Itäänpäin ja
länteenpäin levisivät pitkät, laajat, epäsäännölliset kylkirakennukset
kerrosta korkeampina kuin talon ydinosa. Niiden katoilla oli
harjatornit, joista koko talo oli saanut nimensä.
Alhaalta kuului hiljaista miesäänten sorinaa. Gillian kumartui

kaiteen ylitse ja näki Cravenin ja hänen tilanhoitajansa
keskustelevan tyhjän takan edessä. Hänet valtasi äkillinen ujostelu;
hänen holhoojansa tuntui yhäti hänestä peloittavalta, ja Petersin hän
oli ensi kerran nähnyt muutamia tunteja sitten, kun mies oli ollut heitä
vastassa asemalla; hän oli lyhyt, leveäharteinen ja lihavahko, hänen
tukkansa oli tuuhea ja harmaa, suippoparta lyhyeksi leikattu. Hänen
oli kovin vaikea omasta aloitteestaan mennä alakertaan heidän
luokseen. Mutta hänen tuskaisesti empiessään joudutti Mouston
välttämätöntä ratkaisua syöksymällä portaita alas ja sitten suoraa
päätä karhuntaljaiselle uunimatolle, työntäen sitten kuononsa sen
sakeaan turkkiin ja nuuhkien rajusti. Vastuuntunne voitti arkailun, ja
Gillian riensi perässä, mutta Peters ennätti ennen häntä ja otti
vastustelevan koiran pään lujasti käsiensä väliin.
»Mitä ihmettä se on saanut kuonoonsa, neiti Locke?» tiedusti hän

kummastellen, mutta tuuheiden, harmaiden kulmakarvojen alitse
tyttöön suunnatut, terävät, siniset silmät tuikkivat hilpeästi, eikä
Gillianin ujous jaksanut vastustaa hänen ystävällisyyttään.
Tyttö polvistui ja pyyhki koiran kiusattua kuonoa pitsi- ja

harsopuseronsa liepeellä.
»Ihojauhetta», ilmoitti hän totisena.
»Te ette voi aavistaa», lisäsi hän, katsahtaen äkkiä heihin päin,
»kuinka hauskaa on panna ihojauhetta nenälleen, kun on kasvatettu
luostarissa. Nunnat pitivät sitä turmeluksen huippuna.» Hän
purskahti nauramaan; se oli tyttömäinen, kiirivä hilpeyden puuska,
jollaista Craven ei vielä ollut kuullut, ja hän katsahti tyttöön, joka oli
polvillaan matolla, tyynnytellen koiran loukattuja tunteita ja hymyillen
Petersille, joka tarjosi omaa, tehtävään paremmin sopivaa
nenäliinaansa. Se nauru paljasti Cravenille erään seikan —
itsehillinnästään ja umpimielisyydestään huolimatta Gillian oli
sittenkin vain tyttö, mutta hänen hiljaisen vakavuutensa tähden
Craven oli sen unohtanut.
Hänen nyt tarkkaillessaan tyttöä, nousi hänen kasvoilleen keveä

pilvi. Peters näkyi muutamissa tunneissa päässeen sen rajamuurin
sisälle, jonka ulkopuolella hän oli vielä kuukausien jälkeen. Hänen
seurassaan Gillian aina oli ujon äänetön. Niinä muutamina harvoina
kertoina, jolloin hän Pariisissa ja Lontoossa oli joutunut olemaan
kahden kesken tytön kanssa, oli tämä vetäytynyt kuoreensa eikä
ollut puhutellut häntä. Ja ärtyneenä hän oli aprikoinut, kuinka
suureksi osaksi se johtui luontaisesta kainostelusta ja kuinka
suureksi osaksi luostarikasvatuksesta. Mutta hän ei ollut
koettanutkaan ymmärtää tyttöä sen läheisemmin, sillä entisyys
väikkyi aina hänen silmäinsä edessä, valliten hänen taipumuksiaan
ja tunteitaan — yhtenään muistuttaen, ikäänkuin nykien hänen
kyynärpäätään. Joinakuina päivinä saattoi hän saada huojennusta
ainoastaan ruumiillisesta väsymyksestä ja katosi tuntikausiksi
kamppaillakseen pahojen henkiensä kanssa yksinäisyydessä.
Eikähän häntä missään nimessä kaivattu; hänen oli joka suhteessa
paras pysytellä syrjässä. Hänellä ei ollut mitään tekemistä — John
Locken harkitsemattoman välinpitämättömyyden johdosta ei
holhoustehtävään liittynyt raha-asiain hoitoa. Neiti Craven oli ottanut
Gillianin kokonaan haltuunsa, ja Craven eristäytyi yrittämättäkään
päästä läheisiin suhteihin holhottinsa kanssa. Mutta nyt — kuinka
ristiriitaista — häntä harmitti se, että Gillian niin helposti taipui
Petersiin. Hän tunsi olevansa hupsu — eihän se merkinnyt hänelle
rahtuakaan — Peters veti ihmisiä puoleensa, sehän oli sananparsi
— mutta järkeilystä huolimatta hänen kasvonsa pysyivät synkkinä.
Ikäänkuin tuntien hänen tarkastavan itseään Gillian kääntyi ja

kohtasi hänen tutkivan katseensa. Tytön poskille lehahti puna, hän
työnsi koiran luotaan ja nousi hätäisesti pystyyn. Taaskin sai ujous
vallan, ja hän oli hyvillään, kun neiti Craven saapui hengästyneenä ja
anteeksi pyydellen.
»Myöhästynyt kuten tavallisesti! Minä myöhästyn silloinkin, kun

tuomiopäivän pasuuna törähtää. Mutta tällä kertaa se ei tosiaankaan
ollut oma syyni. Rouva Appleyard tuli luokseni — vanha
taloudenhoitajattaremme — ja hänen kielensä lauloi runsaan tunnin.
Nyt olen perillä kaikesta, mitä Towersissa on tapahtunut sen jälkeen,
kun viimeksi olin täällä — kuumentaako korviasi, Peter? —
kuvaannollisesti hän kiskoi minua perässään ylisiltä kellareihin ja
sitten takaisin ylisille. Hän on liikuttavan mielissään siitä, että talo on
taaskin asuttuna.»
Puhellessaan hän asteli toisten edellä ruokasaliin. Se oli

tavattoman tilava huone; sen seinät olivat laudoitetut kuten talon
useimpien huoneiden; pöytä muistutti keidasta aavikkomaisella
persialaisella matolla, iso takka oli silmäänpistävä, ja seinillä oli
muutamia perheen arvokkaimpia muotokuvia. Saliin astuessaan neiti
Craven vaistomaisesti etsi katseellaan veljensä kuvaa, joka hänen
kuolemansa jälkeen — suvussa noudatetun tavan mukaisesti — oli
riippunut kohokuvin koristetun uunin reunuksen kohdalla. Mutta se
oli siirretty pois, ja sen sijalle oli pantu Barryn äidin kaunis maalaus.
Hän katkaisi äkkiä lauseensa kesken. »Uudistusko?» jupisi hän
veljenpojalleen älykkäät silmät suunnattuina Cravenin kasvoihin.
»Korjaus», vastasi Craven lyhyesti, mennen tuolinsa luokse. Ja

hänen sävynsä teki kaikki lisähuomautukset mahdottomiksi. Täti
istuutui mietteissään ja alkoi äänettömänä syödä keittoa
epämääräisesti levottomana siitä, että oli poikettu miespolvia
noudatetusta tavasta. Vaikka hän ei välittänytkään sovinnaisuuksista
ja oli perin uudenaikainen, piti hän kuitenkin kiinni suvun
perinnäistavoista, ja ikimuistoisista ajoista saakka oli Cravenien
viimeisen suvunpäämiehen muotokuva riippunut avaran ruokasalin
takan kohdalla siihen asti, kunnes se siirtyi seuraajansa tieltä. Se
kaikki tuntui liittyvän siihen peloittavaan muutokseen, joka Barryssä
oli näkynyt hänen palattuaan Jaappanista. Muutoksen oli täti yhä
varmemmin asettanut sen miehen yhteyteen, jonka kuva oli
ikäänkuin arvottomana poistettu kunniasi Jaltaan. Arvottomana
totisesti — mutta mistä saattoi Barry sen tietää? Mitä hän oli kuullut
siinä maassa, joka niin turmiokkaasti oli vetänyt hänen isäänsä
puoleensa? Vanha, häpeällinen tarina, jonka hän oli uskonut olevan
iäksi haudatun, näytti nousevan kammottavana aaveena
haudastaan, jossa se oli niin kauan virunut kätkettynä.
Häntä puistatti hieman, ja päättävästi hän karkoitti luotaan

mieleensä tunkeutuvat, tuskalliset ajatukset, antautuen vilkkaasti
keskustelemaan Petersin kanssa.
Tyytyväisenä siihen, ettei häntä huomattu, Gillian silmäili

ympärilleen arkailevan tarkkaavasti; tilava huone himmeine, varsin
muodollisine kalustoineen ja hienoine tauluineen miellytti häntä.
Kaikki oli järjestetty hyvin sopusointuisesti; räikeätä ja
silmäänpistävää oli vältetty; sähkövaloa oli huolekkaasti kartettu, ja
vain vahakynttelit paloivat paksuissa hopeajaloissaan pöydällä.
Iso talo muuttui joka hetki yhä kiehtovammaksi, pitäen häntä

ikäänkuin lumoissaan. Hän antautui siihen, sen herättämään,
omituiseen onnentunteeseen. Se tuntui hänestä kummallisen tutulta.
Hänet valtasi outo tunne — ikäänkuin hän olisi ollut matkoilla
lapsuudestaan saakka ja tullut nyt kotiin. Se oli järjetön ajatus, mutta
se ihastutti häntä.
Hänellä ei ollut koskaan ollut kotia, mutta kahden lähimmän

vuoden aikana hän saattaisi olla olevinaan ikäänkuin hänellä olisi
koti. Se olisi helppoa. Koko ikänsä hän oli elänyt unelmien
maailmassa, jossa asui hänen oman mielikuvituksensa luomia
haaveolentoja, nukkeja, jotka nöyrästi noudattaen hänen tahtoaan
kulkivat oletetuilla eksyttävillä poluilla — henkimaailmassa, jossa hän
liikkui hänen vapauttaan rajoittavien, ahtaiden muurien estämättä.
Hänen oli ollut helppo uneksimalla unohtaa todellisuus luostarissa —
kuinka paljoa helpommin se kävisikään täällä, missä unelmien linna
oli vankkaa todellisuutta ja hänen mielikuvituksensa kannustimena
oli ihmisten rakkaus, jota hänen sydämensä oli halannut. Se
rakkaus, joka siihen saakka oli tullut hänen osakseen, oli ollut
epätyydyttävää, liian persoonatonta, liian rajoitettua, liiaksi
kietoutunut mystilliseen hartauteen. Neiti Cravenin kiintymys oli
lujempaa, käytännöllisempää laatua. Ajattelemattoman
suorasukaisena ja vilpittömänä hän ei koettanutkaan salata
tunteitaan. Gillian oli häntä miellyttänyt, saavuttanut hänen
hyväksymisensä, ja vihdoin hän puolestaan oli ottanut tytön perheen
lisäjäseneksi. Ja lisäksi hän suuresti luotti omaan arvostelukykyynsä.
Ja osoittaakseen sen luottamuksen paikkansapitäväksi Gillian olisi
ollut valmis menemään vaikka tuleen.
Hän katsahti kiitollisena pöydän alapäässä istuvaan pieneen,
tanakkaan olentoon, ja hilpeä välke karkoitti vakavuuden hänen
silmistään. Neiti Craven oli syventynyt kiivaasti väittelemään Petersin
kanssa, piirtäen selvitykseksi suolalusikalla taidokkaita kuvioita
sileään ruokaliinaan. Gillianin tarkatessa hän täydensi piirroksensa
komealla vetäisyllä ja nojautui voitonriemuisena taaksepäin
tuolissaan, pörröttäen tukkansa eriskummaisen näköiseksi. Mutta
perään antamatta ahdisti tilanhoitaja häntä, ja hetkisen kuluttua hän
oli uudelleen kallistunut eteenpäin, vakuutellen voimaperäisesti ja
naputtaen maltittomasti sormillaan pöytää naurusuin muuttaessaan
kuviotaan. He olivat mitä parhaita ystävyksiä ja kinastelivat
yhtenään. Gillianista se kaikki oli niin raikkaan uutta.
Sitten hänen huomionsa kääntyi toisaalle. Koko aterian ajan oli

Craven istunut äänettömänä. Kerran alettuaan sanasodan kiistelivät
täti ja Peters kaikessa ystävyydessä, kunnes asia perinpohjin oli
reposteltu, lainkaan muistamatta ympäristöään. Craven ei ollut
sekaantunut väittelyyn. Kuten aina oli Gillian nytkin liian kaino
puhutellakseen häntä omasta aloitteestaan, mutta tunsi voimakkaasti
hänen läsnäolonsa.
Tyttö moitti omaa käytöstään, mutta vaitiolo oli parempi kuin

jokapäiväiset kuluneet lauseet, ja muuta hän ei olisi osannut sanoa.
Hänen näköpiirinsä oli niin suppea, kun taas Cravenin, joka oli
matkustellut kaikkialla maailmassa, täytyi olla hyvin laaja. Yhtä alaa
lukuunottamatta olivat Gillianin tiedot mitättömät. Mutta Cravenkin oli
taiteilija — oli toivotonta yrittää ottaa sitä puheeksi, hän päätteli,
halveksien vähäisiä tietojaan; olisi julkeata mennä tyrkyttämään
luostarissa kasvaneen amatöörin mielipiteitä sellaiselle henkilölle,
joka oli opiskellut Pariisin kuuluisissa ateliereissä ja tutustunut
useiden maiden taiteeseen.
Mutta kuitenkin hän oli varma, että hänen oli joskus murrettava
oman ujoutensa kohottama muuri; maalaistalon tuttavallisessa
elämässä olisi sellaisen olotilan jatkuminen sekä mahdoton että
naurettava. Harmissaan itselleen hän tunnusti, että heidän väliensä
kireys oli suureksi osaksi hänen syytänsä, ettei hän harjoituksen
puutteessa osannut menetellä toisin. Mutta hän ei voinut
loppumattomasti vedota sellaiseen pätemättömään puolustukseen.
Jos hänestä kerran oli mihinkään, täytyi hänen vapautua niistä
sovinnaistavoista, joihin hänet oli kasvatettu; hän oli irtautunut
ahtaasta entisyydestä; nyt hänen oli ajateltava laajanäköisesti,
luontevasti kaikista asioista — niinkin mitättömästä seikasta kuin
seurustelusta.
Pelastava huumorintajunta nostatti hänen kaulaansa naurun, joka

oli vähällä purskahtaa ilmoille. Sehän oli niin pieni asia, mutta hän oli
suurentanut sitä niin tavattomasti. Mitä se itse asiassa saattoi olla —
sellaisen koulutytön kömpelyyttä, jota hänen huoltajansa varsin
luonnollisesti ei ollut huomaavinaan, sillä eihän hänen seuransa
voinut olla muuta kuin ikävystyttävä. Tant pis! Hän saattoi ainakin
koettaa olla kohtelias.
Hän kääntyi, sankarillisesti aikoen murtaa jään ja aloittaa

keskustelun vaikkapa kuinkakin turhanpäiväisistä asioista. Mutta
hänen katseensa ei ennättänyt Cravenin kasvoihin, vaan juuttui
hänen käsiinsä, jotka lepäsivät valkealla pöytäliinalla pitkien,
voimakkaiden sormien pyöritellessä ja kieputellessa tyhjää viinilasia.
Käsillä oli Gillianiin tenhoisa vaikutus. Niistä ilmeni luonne, niistä näki
ihmisen henkilöllisiä ominaisuuksia. Hän oli herkkä tajuamaan niiden
merkkejä. Hän oli harrastanut käsitutkimuksia hänelle tarjona olleen
rajoitetun aineiston avulla — tarkkaillut nunnien käsiä, pappien käsiä,
eri henkilöiden käsiä niissä taloissa, joissa hän oli vieraillut, ja sen
miehen kättä, joka oli häntä opettanut. Siltä mieheltä hän oli oppinut
enemmän kuin taiteensa pelkät alkeet, hänen johdollaan oli
alkeellinen harrastus kehittynyt määrätietoiseksi opiskeluksi, ja kun
hän nyt silmäili Barry Cravenin käsiä, johtui hänen mieleensä muuan
lause opettajansa luennoista: »Joissakuissa käsissä, etenkin
miesten käsissä, on luonteenomaisia piirteitä, jotka ilmaisevat
intohimoja ja ominaisuuksia ja pistävät silmään yhtä selvästi kuin
kasvonilmeet.»
Syventyen tarkkailuunsa hän unohti alkuperäisen tarkoituksensa,

pannen merkille uuden tyypin silmäänpistäviä tunnuksia ja luetellen
yksityiskohtia, jotka yhdessä muodostivat kokonaisuuden. Voimakas
käsi, joka voimassaan saattoi olla armoton — saattoiko se
voimassaan olla myöskin säälivä? Tämä kummallinen ajatus heräsi
odottamatta hänen mieleensä hänen tarkkaillessaan ensin vinhasti,
sitten hitaammin pyörivän viinilasin ohutta kantaa, joka hiljaa
kilahtaen äkkiä katkesi, kun käsi puristui nyrkkiin, niin että päivettynyt
iho rystysten kohdalta vaaleni. Gillian vetäisi nopeasti henkeään.
Oliko vahinko hänen syytään — oliko hän tuijottanut
huomiotaherättävästi, niin että Craven oli suuttunut hänen
nenäkkyyteensä? Hänen kasvojaan poltti, ja surkean ujona hän
pakottautui katsomaan Cravenia kasvoihin. Hänen pahoittelunsa oli
aiheeton. Hänestä välittämättä Craven silmäili sormiensa vieressä
olevaa särkynyttä lasia kasvoillaan lievän kummastuksen ilme,
ikäänkuin olisi vahinko saanut hänen harhailevat ajatuksensa vain
puolittain palaamaan nykyisyyteen. Hetkisen hän tuijotti lasin
kappaleihin, pannen ne sitten välinpitämättömästi syrjään.
Gillian hillitsi hysteeristä naurunhaluaan. Craven välitti hänestä

niin äärettömän vähän, ettei edes tämä pikku tapaus ollut herättänyt
häntä huomaamaan toisen tarkastelua. Ajatuksiinsa vaipuneena hän
ihan ilmeisesti oli penikulmien päässä Craven Towersista ja
vaivaloisesta holhokista. Ja äkkiä se tuntui loukkaavalta. Hän oli
Cravenille ainoastaan kaino, kömpelö tyttö, jonka pelkkä
olemassaolo oli rasitus. Hänen niin uljaasti tekemänsä päätös särkyi
toisen kylmään eristymiseen. Puheleminen oli mahdottomampaa
kuin milloinkaan ennen.
Hän kohautti vähän olkapäitään huulet hieman lerpallaan. Ja

uskoen Cravenin olevan omissa aatoksissaan hän jatkoi
tarkasteluaan. Oliko kotiintulo tehnyt Cravenin silmien ilmeen
entistäkin murheellisemmaksi ja syventänyt juovia hänen suunsa
ympärillä — tekikö palvotun äidin muisto hänen kasvoillaan
väikkyvän kärsimyksen ilmeen vieläkin terävämmäksi? Vai liioitteliko
Gillianin ylenmäärin kiihtynyt mielikuvitus hänen näkemäänsä,
uskotellen pelkkää ikävystymistä syväksi suruksi? Hän mietti sitä ja
oli melkein johtunut sellaiseen päätelmään, että viimemainittu selitys
oli järkevämpi, kun hän — tarkkaillessaan — näki miehen kasvoilla
äkillisen, niin tuskaisen värähdyksen, että hän rajusti puraisi
huultaan tukahduttaakseen huudahduksen. Silmänräpäykseksi
välähtänyt ilme oli paljastanut hänelle kärsivän sielun. Hätäisesti hän
loi katseensa toisaalle, syvästi pahoitellen väärää arveluaan. Hän oli
löytänyt salaisen haavan. Hänen istuessaan jäykkänä valtasi hänet
pelko, että toisetkin mahdollisesti olivat sen nähneet. Vaivihkaa hän
vilkaisi heihin. Mutta väittely oli vielä ratkaisematta, heidän välillään
oli pöytäliina raavittu täyteen sekavia kuvioita. Hän huoahti
huojennuksesta. Vain hän oli sen huomannut, eikä hänestä ollut
väliä. Muutamia minuutteja hänen ajatuksensa risteilivät hurjasti,
kunnes hän seisautti ne, rypistäen otsaansa. Se ei ollut hänen
asiansa — hänellä ei ollut oikeutta edes mietiskellä Cravenin asioita.
Äkäisenä itselleen hän haihduttaakseen ajatuksiaan kääntyi
katselemaan seinillä riippuvia kuvia — ne ainakaan eivät herättäisi
häiritseviä kysymyksiä. Mutta hänen päätöksensä pitää ajatuksensa
loitolla holhoojastaan kohtasi esteen jo heti alussa, sillä hän huomasi
tuijottavansa Barry Craveniin, mutta sellaisessa asussa, jollaisen
hän oli kuvitellut hänen ylleen silloin, kun he ensi kerran kohtasivat
toisensa — teräspukimissa.
Kuva esitti nuorta miestä, joka oli puettu kuningatar Elisabetin

aikaisen kuosin mukaisesti, yllään keveä, siro rautapaita,
huolettomasti nojaamassa kiviseen rintanojaan, ranteellaan haukka,
jonka pää oli verhottu. Kuvattu nuorukainen muistutti Craven
Towersin omistajaa tavattoman läheisesti — ruumiinrakenne oli
sama, pään ylväs asento sama, piirteet ja ihonväri samat.
Ainoastaan suu oli maalatulla urholla toisenlainen, sillä huulet eivät
olleet jurosti yhteenpuristetut, vaan kaartuneet erittäin miellyttävään
hymyyn. Muotokuva oli äsken puhdistettu, ja värit olivat raikkaan
kirkkaat. Miehen ryhti oli omituisen sulava senaikaiseksi, sen ajan
sovinnaisesta maalausta vasta huolimatta huokui siitä tarmoa — jota
huoleton asento vain huonosti salasi — ikäänkuin taiteilija olisi
totellut traditsionia voimakkaampaa vaikutusta. Koko olento tuntui
uhkuvan elämää. Gillian katseli kuvaa lumottuna; vaistomaisesti
hänen katseensa suuntautui muotokuvan käsiin. Toinen, haukkaa
pitelevä, oli kirjaillun nahkahansikkaan peittämä, mutta toinen, jossa
oli haukan jalkahihnoja, oli paljas. Ja myöskin kädet olivat
samanlaiset, niiden piirteet tunnontarkasti kuvatut.
Petersin ääni sai Gillianin hätkähtämään. »Katselette ensimmäistä

Barry Cravenia, neiti Locke. Se on ihastuttava maalaus.
Yhdennäköisyys on tavaton, eikö totta?»
Gillian kääntyi katsomaan pöydän toisella puolen istuvaa,
herttaisesti hymyilevää tilanhoitajaa.
»Se on — tavaton», virkkoi hän hitaasti. »Se saattaisi olla

entisaikojen asuun puetun herra Cravenin muotokuva, jollei taulun
maalaustapa niin suuresti poikkeaisi nykyisestä.»
Peters naurahti.
»Ammattimiehen silmä, neiti Locke. Mutta olen hyvilläni siitä, että

myönnätte sen olevan herra Cravenin näköisen. Olisin riidellyt
kanssanne hirveästi, jollette olisi sitä nähnyt. Kuvan esittämä nuori
mies», jatkoi hän, lämmeten puhumaan huomatessaan tytön
mielenkiinnon, »oli aikansa romanttisimpia henkilöitä. Hän eli
Elisabetin hallitusaikana ja oli runoilija, kuvanveistäjä ja säveltäjä —
kirjastossa on kaksi nidettä hänen runojaan, ja salissa oleva
marmorinen Hermes on hänen työtään. Seitsentoistavuotiaana hän
lähti Towersista mennäkseen hoviin. Meidän aikoihimme saakka
säilyneistä monista kirjeistä päättäen hänestä nähtävästi pidettiin
yleisesti. Hän oli sir Philip Sidneyn läheinen ystävä, kuului Spenserin
lukuisain suosijoiden joukkoon ja oli Elisabetin erikoinen suosikki —
kuningattaren suosio näyttääkin aiheuttaneen hänelle jonkun verran
harmia, kuten näkyy hänen päiväkirjansa merkinnöistä. Kuningatar
teki hänestä ritarin ilman minkäänlaista aihetta, mikäli on selvinnyt, ja
näyttääpä se hämmästyttäneen häntä itseäänkin, sillä hän mainitsee
siitä päiväkirjassaan:
— 'Tänä päivänä löi Gloriana minut ritariksi. Jumala tietää, mistä

ansiosta se tapahtui, mutta minä en.'
— Hän oli idealisti ja haaveilija, ja hänellä oli kyky pukea

ajatuksensa sanoiksi — hänen rakkausrunonsa ovat kauneimpia,
mitä olen milloinkaan lukenut, mutta ne ovat ihan persoonattomia.
Mikään ei osoita hänen koskaan antaneen rakkauttaan ainoallekaan
'kauniille naiselle'. Ainoankaan naisen nimeä ei milloinkaan mainittu
hänen nimensä yhteydessä, ja kun hän pysytti hellät tunteet loitolla
itsestään, sai hän haavemielisessä hovissa hyväilynimen L'amant
d'Amour.
— Oltuaan kymmenen vuotta kuningattaren hovissa hän ihan

äkkiä varusti retkikunnan Amerikkaan. Syytä hän ei ilmaissut.
Hovissa vallitsevan teennäisyyden herättämä vastenmielisyys, suru
hänen ystävänsä Sidneyn kuoleman johdosta — tai lukuisten
kauppiasseikkailijain kertomien tarinain lietsoma vaellushalu ovat
saattaneet aiheuttaa tämän yllättävän askeleen. Hänen päätöksensä
teki hänen ystävänsä alakuloisiksi, ja Elisabet puhkesi vimmaiseen
sanatulvaan, komentaen häntä jäämään luokseen. Mutta
kuningattaren vannotteluista ja hartaista pyynnöistä huolimatta —
edellisiä oli runsaammin kuin jälkimäisiä — hän purjehti Virginiaan
lähteäkseen sieltä maaretkelle. Seuraavien lähivuosien aikana
saapui häneltä kaksi kirjettä, mutta sitten — ei kuulunut mitään.
Hänen kohtalonsa on tuntematon. Hän oli ensimmäinen Craven, joka
katosi unholaan etsiessään uusia maita.
Petersin miellyttävän äänen sointu muuttui empiväksi,

hiljaisemmaksi, vakavammaksi. Ja Gillian joutui ymmälle
huomatessaan tilanhoitajan hymyilevistä silmistä äkkiä kuvastuvan
huolestumisen. Hän oli kuunnellut kiihkeän tarkkaavasti. Se oli
historiaa, likeistä ja eloisaa, koska se oli niin läheisesti tämän talon
yhteydessä. Unelmien linna oli vieläkin ihmeellisempi kuin hän oli
kuvitellut. Hän hymyili kiitokseksi Petersille ja hengähti syvään.
»Minä pidän siitä», sanoi hän. »Rakkauden rakastaja!» kertasi hän
sitten, katsoen uudelleen kuvaa. »Se on hyvin kaunis ajatus.»
»Perin harmillinen jokaiselle naisparalle, joka on ehkä ollut kyllin

hupakko menettääkseen sydämensä hänelle.» Neiti Cravenin sävy
oli pureva. »Usein olen aprikoinut, onkohan joku neito 'riutunut,
kaihoisasti haaveillessaan' hänestä», lisäsi hän, nousten pöydästä.
»Jos hän olisi siitä tiennyt, olisi hänellä ollut kylliksi syytä lähteä
Virginiaan», virkkoi Craven, naurahtaen kalseasti. »Sukumme
traditsionit eivät ole koskaan hellineet heikomman sukupuolen
liiallista palvomista.»
»Barry, sinä olet kamala!»
»Kenties, rakas täti, mutta sanani ovat osuvat», vastasi Craven

kylmästi, mennen lattian poikki avaamaan ovea. »Myöskin Petersin,
joka tuntee sukumme historian kuin viisi sormeaan, täytyy myöntää
se.»
Hänen äänensä oli uhittelevan vetoava, mutta Peters ei

sekaantunut asiaan lausuen vain lempeän pistävästi: »Kiitos sanasta
'myöskin', Barry!»
Veljenpojan sanat olisivat aikaisemmin nostattaneet neiti Cravenin

harmistuneena panemaan jyrkän vastalauseensa, sillä ne osuivat
hänen hellään kohtaansa. Mutta nyt varoitti vaistomainen, sisäinen
näkemys häntä pysymään vaiti. Hän pisti kätensä Gillianin kainaloon
ja poistui huoneesta yrittämättäkään aloittaa kinaa.
Seurusteluhuoneessa hän istuutui pasianssipöytään, viritti

savukkeen, pörrötti tukkaansa ja levitti kortit pöydälle otsa rypyssä.
Nyt hän oli entistä varmempi siitä, että niiden kahden vuoden aikana,
jotka Barry oli ollut poissa kotoa, oli tapahtunut joku tuhoisa
onnettomuus. Miehen koko luonne tuntui muuttuneen. Hän oli ihan
toisenlainen kuin ennen. Entinen Barry ei ollut ollut kova eikä
kyynillinen, mutta tämä uusi Barry oli. Muutamien viime viikkojen
aikana oli tädillä ollut runsaasti tilaisuutta arvostella. Hän oivalsi, että
Barryä vaivasi joku pimeä varjo, synkistäen hänen kotiintuloaan —
hän oli kuvitellut sen niin toisenlaiseksi ja huokasi ajatellessaan,
kuinka pettäviä toiveet olivat. Veljenpojan onni oli hänestä niin kallis,
että häntä raivostutti, kun hän ei kyennyt auttamaan. Ennenkuin
Barry puhuisi, ei hän voisi tehdä mitään. Ja hän tiesi, ettei Barry
puhuisi koskaan. Iltainen puuha menetti tavallisen viehätyksensä,
joten hän hajamielisesti pyyhkäisi kortit kokoon ja aloitti uudelleen.
Gillian istui uunimatolla Moustonin pää sylissään. Hän nojasi neiti

Cravenin tuoliin, haaveksien kuten oli haaveillut vanhassa
luostarissa, kunnes koira nostamalla äkkiä päätään kiinnitti hänen
huomiotaan siihen, että Peters seisoi hänen vierellään. Tilanhoitaja
katseli jonkun aikaa ääneti kortteja, osoitti nikotiinin tahraamalla
sormellaan neiti Cravenilta huomaamatta jäänyttä siirtoa, meni sitten
huoneen toiseen päähän ja istahti pianon ääreen. Hetkisen hänen
kätensä hiljaa hipuivat koskettimia; sitten hän alkoi soittaa, ja hän
soitti erinomaisesti. Gillian kuunteli ihmeissään. Peters ja musiikki
olivat tuntuneet olevan hyvin etäällä toisistaan. Mies oli näyttänyt niin
läpikotoiselta urheilijalta; siitä kirjallisuuden tutkimisesta huolimatta,
johon hänen myötätuntoinen esityksensä Elisabetin aikaisesta Barry
Cravenista oli viitannut, oli Gillian kuvitellut hänen harrastuksiansa
karkeamman ruumiillisiksi. Hän oli silminnähtävästi ulko-ilmassa
liikkuva mies, pyssy näytti luonnollisemmalta välineeltä hänen
käsilleen kuin pianon herkät koskettimet; hänen paksujen,
jokseenkin kömpelönnäköisten sormiensa ei olisi mitenkään uskonut
taipuvan siihen vienoon näppäilyyn, joka nyt täytti huoneen ihanilla,
sopusointuisilla sävelillä. Se oli kolaus Gillianin mieliteorialle, minkä
hän vastahakoisesti tunnusti. Mutta hänen ihastuneena
kuunnellessaan häneltä unohtui teoretisoiminen.
»Miksi hän ei ole antautunut musiikkialalle», kuiskasi hän

jymisevien sävelien suojassa. Hymyillen neiti Craven katsahti hänen
intoa uhkuviin kasvoihinsa.
»Voitko kuvitella Petersiä sukoilemassa konserttien ohjaajille tai

ilmehtimässä kuulijakunnalle?» huomautti hän, pelastaen kuninkaan
hylättyjen korttien läjästä.
Hymyillen vastaukseksi Gillian vaipui entiseen asentoonsa.

Musiikki vaikutti häneen syvästi, ja Petersin soitto tehosi hänen
herkkään taiteilijatemperementtiinsa. Kappale oli venäläinen
kansanlaulu, valittava ja koruton, ja siinä oli omituinen, lyhyehkö,
kertautuva loppusävel, joka muistutti tuskaisen sydämen huokausta
— siinä oli villin suruista harmoniaa, johon sisältyvä tuska ahdisti
kurkkua. Gillianin mieleen tulvahti murhetta huokuvan soiton
nostattama pahojen enteiden aalto, outo, epämääräinen pelko, jolla
ei ollut muotoa, mutta joka painoi häntä kuin rusentava taakka.
Viimeisten viikkojen onnellisuus tuntui äkkiä hukkuvan maailmassa
rehoittavaan surkeuteen. Jos sydämen sisimmät sopukat tutkittaisiin,
niin kuka oli tosionnellinen? Sitten hänen ajatuksensa suuntautuivat
lähemmäksi häntä itseänsä, lensivät hänen oman tyttöikänsä
lohduttomiin päiviin ja hänen isänsä kovaosaiseen elämään.
Senjälkeen ne hypähtivät eteenpäin, siirtyen nykyisyyteen, ja hän
ajatteli surua, jonka hän oli nähnyt kuvastuvan Cravenin kasvoista
lyhyen hetkisen aikana päivällispöydässä. Oliko maailmassa
ainoastaan murhetta? Haaveksivat ruskeat silmät sumentuivat.

Get Macrolides As Immunomodulatory Agents 1st Edition Bruce K. Rubin Free All Chapters

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Get Macrolides As Immunomodulatory Agents 1st Edition Bruce K. Rubin Free All Chapters

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Get Macrolides As Immunomodulatory Agents 1st Edition Bruce K. Rubin Free All Chapters

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Full download test bank at ebookmeta.

Macrolides as Immunomodulatory Agents 1st Edition

For dowload this book click LINK or Button below

Download More ebooks from https://ebookmeta.com

Natural Products as Anticancer Agents 1st Edition Bimal

Current Perspectives on Anti Infective Agents 1st

Redox Active Molecules as Therapeutic Agents Ana Sofia

Children as Agents in Their Worlds A Psychological

Flavonoids as Nutraceuticals. 1st Edition Rajesh K.

Curating in a Time of Ecological Crisis Biennales as

Meteorite Mineralogy Alan E. Rubin

Finding the Will of God A Pagan Notion 2nd Edition

ISSN 1422-7746 ISSN 2296-4525 (electronic)

Paper in this product is recyclable.

Macrolides are a class of bacteriostatic antibiotics containing a large macrocyclic

Richmond, USA Bruce K. Rubin

Part I Mechanisms of Action and Novel Macrolides

Part II Clinical Use for Airway Disease

Azithromycin for Other Lung Diseases: Lung Transplantation

Part III Clinical Use for Other Diseases

Clive P. Page , Fridrik R. Gardarsson, Jennifer A. Kricker ,

Abstract In addition to the antiinﬂammatory/immunoregulatory actions of

Keywords Epithelial integrity · Barrier function · Epithelial cells · Barrier failure ·

© The Author(s), under exclusive license to Springer Nature Switzerland AG 2024 3

2 Epithelial Barrier Failure, a Common Pathophysiological

Epithelial integrity and barrier failure are emerging as fundamental determining

Fig. 1 Evident increase in epithelial terms by decade in publications cited in PubMed

its transformative effects on tissue culture technology and organoid development

2.1 Epithelial Homeostasis, Remodeling, and Barrier Failure

2.1.1 Airway Epithelium

suboptimal epithelial barrier integrity, mainly as a result of direct oxidant damage

Fig. 3 (continued) mitochondrial oxygen consumption. As a consequence of these membrane and

2.1.3 Intestinal and Colon Epithelium

3 In Vitro Models to Study Epithelial Integrity

4 Macrolides and the Epithelial Barrier

Macrolide antibiotics as a class of drugs are known to have numerous additional

azithromycin-related, nitrogen-containing, 15-membered macrolactone that has

5 Macrolide-Sensitive Inﬂammatory Diseases

5.1 Distinctions between Macrolide Antibiotics

Nevertheless, beyond shared properties, each structure has distinct pharmacolog-

5.2 Macrolide Antibiotics in COPD and Asthma

exacerbations compared to placebo (1.07 versus 1.86 events/patient/year; incidence

5.3 Macrolides in Other Inﬂammatory Disorders

The efﬁcacy of macrolides in treating inﬂammatory disorders, particularly those of

5. Khoshnood S, Shirani M, Dalir A, Moradi M, Haddadi MH, Sadeghifard N, et al. Antiviral

53. Cuzic S, Antolic M, Ognjenovic A, Stupin-Polancec D, Petrinic Grba A, Hrvacic B, et al.

Abstract Low-dose long-term macrolide therapy had a remarkable effect on the

Keywords Airway secretion · Mucin · Neutrophil · Proinﬂammatory cytokine ·

Low-dose long-term therapy with erythromycin (EM) brought about a breakthrough

© The Author(s), under exclusive license to Springer Nature Switzerland AG 2024 25

2 Regulation of Airway Secretion and Inﬂammatory

1. Regulation of water secretion

accumulation, IL-8/CXCL8, TNFα, and MUC5AC production, and these can be

Differentiation Mucus Production Secretion

[2, 8]. Macrolide therapy is expected to be effective for neutrophil-dominant asthma,

H2O ICAM-1 Macrophage

Endothelial cell VCAM-1

Chemotaxis MHC class II CD8

3 Intracellular Signaling Mechanisms