Morphogenetic ability in vitro of the genus Centaurea Kleop species of Ukrainian flora

УДК 582.521.42: 582.394 МОРФОГЕНЕТИЧНА ЗДАТНІСТЬ IN VITRO ВИДІВ РОДУ CENTAUREA KLEOP (ВОЛОШКА) ФЛОРИ УКРАЇНИ А. В. ГОЛУБЕНКО, В. І. ДІДЕНКО, А. В. ЗІНЧЕНКО, О. В. ВОЙЦЕХІВСЬКА, Н. Ю. ТАРАН 3 Навчально-науковий центр «Інститут біології та медицини» Київський національний університет імені Тараса Шевченка Україна, 03022, м. Київ, проспект Академіка Глушкова, 2 e-mail: holubenko@yahoo.com Мета. Метою роботи було введення в асептичну культуру двох ендемічних і одного поширеного видів роду Centaurea (C. breviceps, C. steveniana і C. stoebе) та виявлення їхньої здатності до різних типів морфогенезу. Методи. У роботі застосовано методи культури рослинних тканин і клітин in vitro. Первинним культиваційним матеріалом було насіння й частини отриманих із нього проростків. Живильне середовище Мурасіге-Скуга було використане як базове. Насіння пророщували за методиками М. Г. Ніколаєвої та власними їх модифікаціями. Результати. Отримали проростки C. breviceps, C. steveniana і C. stoebе. Рослини C. breviceps виявили здатність до вегетативного розмноження in vitro шляхом живцювання та до формування неморфогенного калюсу. Експланти C. steveniana утворювали морфогенний калюс і вегетативні та генеративні пагони-регенеранти з нього, а також були здатні до прямої регенерації пагонів (мікроклонування) на сегментах стебла. C. stoebе не утворювала адвентивних бруньок на стеблових експлантах, проте виявила здатності до масової регенерації на листкових і черешкових експлантах. Висновки. Морфогенез різних видів Centaurea in vitro має як видову, так і тканинну специфіку, та залежить від експланта. Досліджувані види здатні до таких типів морфогенезу: калюсогенез, пряма й непряма регенерація адвентивних бруньок і пагонів з них, утворення генеративних пагонів. Ключові слова. Centaurea, рідкісні ендемічні рослини, морфогенез in vitro. В ступ. Глобальні зміни клімату і зростання антропогенного тиску (руйнування природних ареалів, забруднення навколишнього середовища, масове винищення рослин тощо) є основними причинами збіднення фіторізноманіття [1, 2]. Дедалі більше видів рослин потрапляють під загрозу знищення та набувають статусу рідкісних і зникаючих. Особливо вразливими є рослини-ендеміки, які обмежені вузьким природним ареалом і є досить вразливими до змін у природному середовищі. Створення природоохоронних резерватів для збереження рідкісних рослин in situ не завжди ефективне для ендемічних рослин. Згідно з основними положеннями Конвенції про збереження біорізноманіття, прийнятною альтернативою консервативним способам збереження фіторізноманіття є вирощування їх ex situ, за умов інтродукції у ботанічні сади та культивування в культурі in vitro [1, 3]. Для успішного інтродукційного процесу, зазвичай, як вихідний батьківський садивний матеріал, використовують насіння або живці. Проте, якщо кількість і життєздатність рослинного матеріалу обмежена, а вилучати з природи рідкісні рослини заборонено, інтродукція значно ускладнюється. Також, за таких умов, стає практично неможливим вивчення фізіологічних, біохімічних та генетичних особливостей цих рослин. У цьому випадку має значні переваги введення рослин в культуру in vitro, яка дає можливість навіть з невеликої кількості батьківського матеріалу отримати велику кількість генетично ідентичних рослин за короткий проміжок часу. Крім того, розмножені й вирощені в асептичній культурі рослини можуть стати об’єктом різноманітних досліджень з метою з’ясування їхніх біологічних властивостей та використання як корисних (наприклад, лікарських, декоративних, кормових тощо) рослин [4, 5, 6]. © А. В. ГОЛУБЕНКО, В. І. ДІДЕНКО, А. В. ЗІНЧЕНКО, О. В. ВОЙЦЕХІВСЬКА, Н. Ю. ТАРАН, 2017 20 ISSN 2415-3680 (Online), ISSN 1810-7834 (Print). Вісн. Укр. тов-ва генетиків і селекціонерів. 2017, том 15, № 1 Морфогенетична здатність in vitro видів роду Centaurea Kleop (волошка) флори України Флора України налічує вісімнадцять рідкісних і зникаючих видів роду Centaurea Kleop (Волошка), занесених до Червоної Книги України, серед яких є і ендемічні види, природні місця зростання яких часто знаходяться під загрозою зникнення [7]. Поряд із виявленням наявності цих ендемів на територіях описаних ареалів є також необхідність встановлення філогенетичних зв’язків між ними, дослідження їхнього походження на цих територіях та динаміки їхнього поширення чи, навпаки, зникнення. Експедиційне вивчення ареалів рідкісних видів волошок показало, що самовідтворення видів відбувається повільно, матеріалу для молекулярних, цитогенетичних, і фізіологічних досліджень недостатньо, а отримане насіння із гербарних зборів попередніх років має надзвичайно низьку схожість. Отримання рослин для збереження в умовах інтродукції виявилось неможливим, проте наявність невеликої кількості насіння деяких видів волошок (рідкісних — Centaurea breviceps Iljin (C. margaritacea Ten. subsp. breviceps (Iljin) Dostál) — Волошка короткоголова, C. steveniana Klokov (C. ovina Pall. ex Willd. subsp. steveniana) — Волошка Стевена, а також широко поширеної C. stoebе L.) дала змогу використати його як первинний матеріал для введення в культуру in vitro з метою подальших молекулярно-генетичних досліджень, які необхідні для остаточного з’ясування таксономічного статусу (статусу окремого виду чи підвиду) ендемічних волошок з точки зору їхньої філогенії [8]. Поряд із введенням у асептичну культуру двох видів рідкісних ендемічних видів волошок доцільним було також вивчення морфогенезу in vitro рослин більш поширеного виду C. stoebе, який став інвазійним у Північній Америці та активно досліджувався при розробці алелопатичної теорії інвазійності рослин [9], для можливого використання його як модельного об’єкта для відпрацювання методики культивування представників роду Centaurea в асептичній культурі. Отже, метою нашої роботи було ввести рослини трьох видів роду Centaurea в стерильну культуру та ініціювати у них всі можливі типи морфогенезу in vitro для визначення їхньої морфогенетичної здатності. Для досягнення мети було поставлено такі завдання: 1) отримати первинний культиваційний матеріал — асептичні проростки; 2) підібрати живильні середовища для ініціації різних типів морфогенезу in vitro (калюсогенез, регенерація вегетативних бруньок і пагонів з них, коренів, генеративних органів). Матеріали і методи Для введення волошок у стерильну культуру використовували насіння C. breviceps, C. steveniana і C. stoebе, надане співробітниками кафедри Ботаніки ННЦ «Інститут біології» КНУ імені Тараса Шевченка, яке було зібране впродовж експедиційних поїздок. Рослинний матеріал для досліджень було вилучено з гербарію і надано у вигляді висушених суцвіть, після препарування яких було відібрано виповнені насінини. Повноцінного насіння було мало, оскільки гербарій було зібрано ще до закінчення цвітіння. Насіння пророщували in vitro за загальноприйнятою методикою [10] з власною модифікацією. Поверхневу стерилізацію насіння виконували за такою схемою: насіння експонували у 70 % етанолі впродовж 60 с, потім — у 0,1 % розчині HgCl2 впродовж 12 хв. Після стерилізації насіння тричі промивали стерильною дистильованою водою. Отримані з насіння асептичні проростки використовували як первинний культиваційний матеріал для дослідження морфогенезу in vitro. У експериментах з ініціації різних типів морфогенезу використовували живильне середовище Мурасіге-Скуга (МС) [11] з половинним вмістом макро- і мікроелементів (МС/2), з додаванням вітамінів (В1, В6, РР — 0,5 мг/л, 0,5 мг/л, 1 мг/л, відповідно), 100 мг/л мезоінозиту, 20 % сахарози, регуляторів росту з ауксиновою (ІОК — індолилоцтова кислота, α-НОК — нафтилоцтова кислота) та цитокініновою (БАП — 6-бензиламінопурин) активністю у різних концентраціях. Результати та обговорення Дослідження показало здатність C. breviceps до нормального росту на безгормональному живильному середовищі та вегетативного розмноження шляхом живцювання. При тривалому культивуванні (протягом 4–6 місяців, за які було проведено 2–3 пасажі на свіже середовище того ж складу) невкорінені живці C. breviceps утворювали жовтуватий неморфогенний калюс на базальній частині живця, а деякі з них сформували вегетативні і генеративні пагони з суцвіттями з пелюстками білого кольору (рис. 1). ISSN 2415-3680 (Online), ISSN 1810-7834 (Print). Вісн. Укр. тов-ва генетиків і селекціонерів. 2017, том 15, № 1 21 А. В. Голубенко, В. І. Діденко, А. В. Зінченко, О. В. Войцехівська, Н. Ю. Таран а б в Рисунок 1. Морфогенез in vitro C. breviceps: а) регенерація пагонів; б) утворені вегетативний і генеративний пагін; в) квітка, сформована за умов асептичної культури Додавання до живильного середовища ауксинактивних регуляторів росту у невисоких концентраціях (0,05–0,1 мг/л) ініціювало слабкий ризогенез. Вищі концентрації ауксинів викликали проліферацію калюсу, проте калюс був неморфогенним і нежиттєздатним. Отриманий результат показав здатність C. breviceps до щонайменше трьох типів морфогенезу, що може бути основою для розробки модифікованої технології клонального мікророзмноження C. breviceps. Рослини C. steveniana виявили здатність до нормальної вегетації на живильному середовищі МС/2 без додавання регуляторів росту. Спроба вегетативного розмноження шляхом звичайного мікроживцювання і укорінення мікроживців на середовищі МС/2 з додаванням 0,2 мг/л ІОК та 0,02 мг/л НОК була невдалою: очікуваної регенерації коренів не спостерігалося, натомість відбувалось формування морфогенного калюсу з подальшою спонтанною регенерацією адвентивних бруньок та мікропагонів з них, проте, отримані адвентивні пагони мали ознаки вітрифікації. Екс- а планти C. steveniana показали високу чутливість до впливу ауксинактивних регуляторів росту навіть за наявності низьких концентрацій їх у складі середовища. Це може свідчити про активний синтез ендогенних ауксинів, на що варто звертати увагу під час експериментів з оптимізації живильних середовищ для ризогенезу, калюсогенезу та непрямої регенерації. Додавання бензиламінопурину до живильного середовища (МС/2, доповнене 1 мг/л БАП, 0,2 мг/л ІОК та 0,1 мг/л НОК) ініціювало пряму регенерацію пагонів (мікроклонів) C. steveniana на сегментах стебла — спостерігалося формування мікрокущів із 3–7 повноцінних мікроклонів, які було відокремлено від материнської розетки й висаджено на середовище МС/2, доповнене 0,1 мг/л НОК, для укорінення (рис. 2). Проте, як і у мікроживців, так і у мікроклонів, ризогенезу ініціювати не вдалося. Лише після тривалого культивування на безгормональному живильному середовищі з’явилися ознаки формування коренів. б Рисунок 2. Морфогенез in vitro C. steveniana: а) мікрокущ; б) відокремлені мікроклони 22 ISSN 2415-3680 (Online), ISSN 1810-7834 (Print). Вісн. Укр. тов-ва генетиків і селекціонерів. 2017, том 15, № 1 Морфогенетична здатність in vitro видів роду Centaurea Kleop (волошка) флори України живильному середовищі МС/2, доповненому 5 мг/л БАП + 0,25 мг/л ІОК, на базальних кінцях черешків та на базальному й дистальному кінцях листків утворився морфогенний калюс, з якого регенерували адвентивні бруньки та пагони з них, при чому інтенсивність регенерації мікроклонів на черешкових експлантах, у порівнянні з листковими, була значно вищою (рис. 3). Вегетативне розмноження живцюванням C. stoebе виявилося неможливим, оскільки проростки формували дуже коротке стебло із надто щільною розеткою листків. Тому, експлантами для дослідження морфогенезу цього виду були листки та черешки. Низькі концентрації регуляторів росту у живильному середовищі не викликали морфогенної реакції, але за культивування на а б в Рисунок 3. Морфогенез in vitro C. stoebе: а) мікрокущ; б) регенерація на черешкових експлантах; в) регенерація на листковому експланті Висновки Встановлено, що всі досліджувані види Centaurea здатні до спонтанного морфогенезу in vitro на живильному середовищі без додавання регуляторів росту та виявляють видоспецифічну реакцію на вміст регуляторів росту в ньому. За умови обмеженої кількості експлантів Centaurea, нами було отримано три типи морфогенезу: калюсогенез, пряма й непряма регенерація адвентивних бруньок і пагонів з них, утворення генеративних пагонів. Виявлено, що морфогенетична здатність рослин C. steveniana вища, ніж C. breviceps та C. stoebе. Отриманий культиваційний матеріал використано для подальших цитогенетичних і молекулярно-генетичних досліджень. Перелік літератури 1. Конвенція про біологічне різноманіття: громадська обізнаність і участь. — К. : Інтерекоцентр. — 1997. — 153 с. 2. Капустян В. В. Збереження інтродукційного та аборигенного рослинного різноманіття в умовах культури // Вісн. КНУ імені Тараса Шевченка. Сер.: Інтродукція та збереження рослинного різноманіття. — 2000. — Вип. 3. — С. 5–7. 3. Малишева Н. Р., Олещенко В. І., Кузнєцова С. В. та ін. Правові засади впровадження в Україні Конвенції про біорізноманіття. — К. : Хімджест. — 2003. — 176 с. 4. Кунах В. А. Біотехнологія лікарських рослин. Генетичні та фізіолого-біохімічні основи. — К. : Логос, 2005. — 730 с. 5. In vitro manipulation and propagation of Gentiana L. species from the Ukrainian Flora / N. M. Drobyk, L. R. Hrytsak, V. M. Melnyk, N. V. Kravets, I. I. Konvalyuk, M. O. Twardovska, V. A. Kunakh // The Gentianaceae. — Vol. 2: Biotechnology and applications by the edit. J. J. Rybczynski, M. R. Davey, A. Mikula. — Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2015. — P. 45–79. 6. Parnikoza I. et all. Comparative analysis of Deschampsia antarctica Desv. population adaptability in the natural environment of the Admiralty Bay region (King George Island, maritime Antarctic) // I. Parnikoza, N. Miryuta, I. Ozheredova, I. Kozeretska, J. Smykla, V. Kunakh, P. Convey / Polar Biology. — 2015. 38 (9): 1401–1411. 7. Червона книга України. Рослинний світ / За ред. Я. П. Дідуха. — К. : Глобалконсалтінг. — 2009. — С. 298–315. 8. Moysiyenko І. І., Tarieiev A. S., Didenko V. I., Karpenko N. I., Kostikov I. Yu. Centaurea breviceps Iljin (Asteraceae, Magnoliophyta): neotype and its annotation according to ITS1 and ITS2 secondary structures // Chornomors’k. bot. z., 2014. — 10 (3): P. 276–286. doi:10.14255/2308-9628/14.103/1 9. Мосякін А. С. Огляд основних гіпотез інвазійності рослин // Укр. ботан. журн., 2009. — Т. 66, № 4. — С. 466–476. 10. Николаева М. Г. Справочник по проращиванию покоящихся семян / М. Г. Николаева, М. В. Разумова, В. Н. Гладкова — Л. : Наука. — 1985. — 347 с. 11. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid grows bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. — 1962. — № 57. — P. 473–497. Представлено О. О. Пороннік Надійшла 15.05.2017 ISSN 2415-3680 (Online), ISSN 1810-7834 (Print). Вісн. Укр. тов-ва генетиків і селекціонерів. 2017, том 15, № 1 23 А. В. Голубенко, В. І. Діденко, А. В. Зінченко, О. В. Войцехівська, Н. Ю. Таран MORPHOGENETIC ABILITY IN VITRO OF THE GENUS CENTAUREA KLEOP SPECIES OF UKRAINIAN FLORA A. V. Golubenko, V. I. Didenko, A. V. Zinchenko, O. V. Voytsekhivska, N. Yu. Taran Educational and Scientific Centre «Institute of Biology and Medicine» Taras Shevchenko National University of Kyiv Ukraine, 03022, Kyiv, Akademika Glushkova Avenue, 2 e-mail: holubenko@yahoo.com Aim. The purpose of the work was to introduce into the aseptic culture two endemic and one common species of the Centaurea genus (C. breviceps, C. steveniana and C. stoebe) and to identify their ability to different types of morphogenesis. Methods. The methods of plant tissue and cell culture in vitro are used in this work. Seeds and parts of the seedlings derived from seeds were primary cultivating material. The nutritional medium of MurashigeSkoog was used as a base. The seeds were sprouted 24 according to Nikolaeva’s methods and their own modifications. Results. Seedlings C. breviceps, C. steveniana and C. stoebe were obtained. Ability to vegetative reproduction in vitro by cutting and forming non-morphogenic callus of C. breviceps plants have been shown. C. steveniana explants formed morphogenic callus and vegetative and generative shoots-regenerants from it, as well as they were able to the shoot direct regeneration (microcloning) from the segments of the stem. C. stoebe did not form the adventitious buds on stem explants, but revealed the ability to mass regeneration from leafy and petiolate explants. Conclusions. Morphogenesis in vitro of the various speces of Centaurea genus have both type and tissue specificity, and depends on explants. The investigated species are able to the following types of morphogenesis: forming of callus, direct and indirect regeneration of adventitious buds and shoots from them, forming of generative shoots. Keywords: Centaurea, rare endemic plants, in vitro morphogenesis. ISSN 2415-3680 (Online), ISSN 1810-7834 (Print). Вісн. Укр. тов-ва генетиків і селекціонерів. 2017, том 15, № 1