Biology">
Amplificação in Vitro de DNA
Amplificação in Vitro de DNA
Amplificação in Vitro de DNA
Amplificação
in vitro de DNA
Prof.ª Camila Freze Baez
Descrição Técnicas de amplificação e detecção de ácidos nucleicos in vitro e introdução de suas aplicações
em rotina laboratorial.
Propósito Compreender a teoria por trás da amplificação de ácidos nucleicos in vitro em suas diferentes
formas e entender quais são suas vantagens, desvantagens e aplicações em contextos diversos é
importante para o profissional de laboratório, pois lhe fornecerá poderosa ferramenta de trabalho.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Objetivos
meeting_room Introdução
Os ácidos nucleicos são as estruturas fundamentais que carregam informações
genéticas. Você já parou para pensar como certas características físicas passam
dos pais para os filhos? Traços físicos como formato do rosto, altura, cor da pele
e dos olhos são traduções de informações transmitidas às gerações futuras dos
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Cada uma dessas moléculas – DNA e RNA – tem funções diferentes dentro da
menor unidade viva conhecida — a célula. O DNA possui fita dupla, sendo mais
estável e resistente que o RNA. Por isso, a célula utiliza o DNA para armazenar as
informações genéticas em longo prazo. Já o RNA, normalmente, em fita simples e
mais instável, tem como principal função intermediar a informação entre o DNA e
as unidades efetoras da maioria das funções celulares, as proteínas.
Formato do rosto e altura, por exemplo, são decorrentes da estrutura óssea que,
em grande parte, é feita de proteínas. O papel das proteínas não se limita apenas
em traços físicos, mas também em funcionais.
Em uma célula viva e saudável, as enzimas fazem toda a amplificação do DNA por
conta própria em um ambiente extremamente complexo e controlado – do pH e
nível de oxigênio disponível, ao momento que a célula está em seu ciclo de vida.
São dezenas de enzimas envolvidas na síntese de novas moléculas de DNA,
tantas que os cientistas ainda não compreendem completamente todas as etapas
envolvidas nesse processo. Apesar de toda a complexidade da duplicação do
DNA in vivo, já somos capazes de sintetizar pequenos trechos do DNA em um
tubo de ensaio.
Incrível, não? Vamos ver com detalhes como isso é possível neste material.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Dogma central da Biologia Molecular: DNA replica-se em DNA e é transcrito em RNA, que é traduzido em
proteína.
Ao final deste módulo, você será capaz de reconhecer elementos fundamentais à amplificação de ácidos
nucleicos in vitro.
O segundo componente são as bases nitrogenadas. Para o DNA, existem quatro tipos
diferentes de bases nitrogenadas:
Desoxirribonucleico
Prefixo “des” significa a ausência (como em desinteresse), portanto, “desoxi” representa o oxigênio que está
ausente.
Adenina (A)
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
check_circle_outline
Imagine escrever um texto codificado, tão complexo quanto um ser humano, usando
apenas uma das letras do teclado do computador. Como seria possível entender a
informação que você quis codificar? Agora, se você escrever um texto com pelo
menos duas letras (ou números) do teclado, usará um código binário. Isso também
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
acontece com a informação genética: a célula utiliza essas cinco bases nitrogenadas
para codificar, em sequência, uma informação preciosa.
Código binário
Formado por sequências de 0 e 1 que, em trechos longos, podem codificar informação, como computadores.
Esquema da estrutura básica dos desoxirribonucleotideos, compostos por fosfato, desoxirribose e base nitrogenada.
Pirimidinas Purinas
(C, T, U) - Possuem um anel. (A, G) - Possuem dois anéis.
As bases interagem entre si, mas entre grupos opostos: ou seja, pirimidinas pareiam
com purinas, de acordo com as cargas livres de cada base. Desse modo, A interage
com T, pois ambas têm duas cargas livres para interação, e C interage com G através
de três cargas. Essas interações são chamadas de pontes de hidrogênio e são
consideradas fracas por serem facilmente quebradas por agentes físicos, como a
temperatura, e químicos, como o pH.
Semiconservada
Uma fita original (fita parental) é mantida na duplicação, como molde para a síntese da fita nova (fita filha).
Atenção!
Se olharmos para essa fita dupla em um sentido único, da esquerda para a direita, por exemplo, veremos que
uma das fitas se encontra com o carbono 5 da desoxirribose livre na extremidade à esquerda, enquanto a
outra fita tem o carbono 3 da desoxirribose livre à esquerda. Isso acontece porque, para interagirem, as duas
fitas precisam estar em sentidos opostos – por isso, nós as chamamos de fitas antiparalelas. Esse sentido
de interação por complementariedade traz à tona outra característica do DNA: sua replicação deve ser feita
de forma semidescontínua (In vivo, apenas a fita no sentido antiparalelo (3’→5’) é lida de forma contínua, e a
fita de DNA molde no sentido paralelo (5’→3’) é lida de forma descontínua. Isso acontece por causa do
sentido de abertura da forquilha de replicação).
Em uma célula viva, as enzimas polimerases têm ao seu dispor todos os itens
necessários para duplicar o DNA, de nucleotídeos a todas as enzimas.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Primeira característica do DNA importante na sua replicação in vitro: as bases nitrogenadas de uma
fita interagem especificamente com as bases correspondentes da outra fita (A-T, C-G) por meio de
interações frágeis que podem ser desfeitas pelo calor. Ao aquecermos a solução acima de 90ºC,
podemos desfazer essas interações e abrir a fita dupla em duas fitas simples. Isso deixa as bases
nitrogenadas expostas para interagirem e, ao abaixarmos a temperatura, conseguimos fazer com
que a fita dupla se refaça e a informação seja mantida. Vamos ver como esse processo funciona
passo a passo mais à frente.
Segunda característica importante para a replicação do DNA in vitro. Essa enzima lê cada base
nitrogenada da fita simples como se fosse um molde, e adiciona a base nitrogenada complementar
na fita que está sendo sintetizada através da ligação fosfodiéster. In vivo, a polimerase não inicia a
duplicação do DNA sozinha, pois ela não consegue abrir a fita dupla em fitas simples, identificar o
local certo de início de replicação ou adicionar os primeiros nucleotídeos. A célula utiliza enzimas
para abrir a fita dupla, as helicases, e adição dos primeiros nucleotídeos é feita por outra enzima,
chamada primase.
Normalmente, são usados dois oligonucleotídeos por reação: um chamado senso, que
se liga ao DNA molde fita simples no sentido 3’→5’; e um antissenso, que se liga à fita
no sentido 5’→3’.
Já compreendemos que a fita dupla de DNA se abre em duas fitas simples quando
aquecida próximo a 100ºC, e sabemos que a reação de síntese de novas fitas de DNA
é feita por meio de uma enzima termorresistente chamada de Taq polimerase.
Também descobrimos que a enzima precisa de oligonucleotídeos iniciadores que se
ligam por complementariedade ao DNA-alvo desnaturado em uma fita simples. Agora,
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
podemos entender como essa última se desenvolve. Assim como em qualquer receita
de bolo, uma PCR precisa de seus ingredientes básicos – ou reagentes mínimos –
para a síntese de DNA acontecer. Desse modo, adicionamos esses ingredientes a um
microtubo. Os reagentes mínimos necessários para a amplificação são:
Desnaturação expand_more
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Anelamento expand_more
Uma vez que os oligonucleotídeos tenham se anelado à fita de DNA molde, a Taq
polimerase reconhecerá esse local e fará a extensão da fita dupla. Como a Taq
polimerase é termorresistente, a elevação da temperatura a 95ºC não a destrói – na
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Atenção!
Após o término da extensão, a reação é aquecida novamente a > 95ºC, para que as
fitas duplas recém-sintetizadas sejam separadas, e o ciclo desnaturação-anelamento-
extensão se repita de 30 a 40 vezes. No final, é recomendável ter um ciclo final de
extensão maior para garantir que a síntese de todas as fitas seja concluída. Após o
término, a reação deve ser mantida refrigerada para preservar o material amplificado.
mesma sequência! Um número tão grande de uma mesma sequência vai ser muito
mais facilmente identificado posteriormente.
Dica
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Para separar o DNA de acordo com seu tamanho, usamos uma espécie de malha gelatinosa chamada de
matriz ou gel de agarose.
Você deve estar familiarizado com a gelatina que fazemos na cozinha, certo? A
agarose funciona de maneira semelhante: é um polissacarídeo que se dissolve em
líquido aquoso quando aquecido e, quando resfriado, se solidifica, ou polimeriza. Ao
polimerizar, a agarose forma uma malha com pequenos orifícios que permitirão a
passagem do DNA, de modo que moléculas menores de DNA passarão com maior
facilidade e mais rapidamente, enquanto moléculas maiores de DNA terão maior
dificuldade de passar e, por isso, demorarão mais tempo para viajarem pela malha.
Assim, podemos separar as moléculas de DNA de acordo com tamanho. Dependendo
do tamanho do nosso DNA amplificado, poderemos usar uma malha mais fechada ou
mais aberta simplesmente variando a concentração da agarose que usamos para
fazer o gel.
Montagem de gel de agarose com uso de pentes para formação de poços e aplicação do produto de PCR.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Uma vez que o gel de agarose esteja pronto e que o DNA tenha sido pipetado nos
poços do gel com o corante azul, podemos começar a eletroforese. Para a
eletroforese, precisaremos ainda de uma cuba, ou recipiente que contenha entradas
para corrente elétrica, uma fonte elétrica e um tampão ionizável. A eletroforese parte
do princípio de que um tampão, quando submetido a uma corrente elétrica, tem suas
moléculas ionizadas migrando em direção a um dos polos: as moléculas negativas
migram para o polo oposto, o cátodo, e as moléculas positivas migram para o polo
negativo, o ânodo.
No caso do DNA, seu grupamento fosfato lhe dá carga negativa, fazendo que o DNA
migre para o polo positivo (cátodo) quando em solução submetida à corrente elétrica.
Como o DNA está no fundo do gel de agarose graças ao corante mais pesado que o
tampão eletroforético, ele passa por dentro da agarose e, assim, será separado de
acordo com seu tamanho pela trama do gel. Por sua vez, o corante azul, também de
carga negativa e de tamanho muito inferior à complexa molécula de DNA, migrará pelo
gel mais rapidamente, servindo apenas como marcador da velocidade de migração, e
não da posição do DNA.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Representação esquemática de uma eletroforese em gel de agarose.
Imagem de um gel de agarose e sua revelação por fluorescência do brometo de etídio em luz ultravioleta.
Além de mais tóxica que a agarose, a montagem do gel e sua corrida eletroforética
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
também são mais trabalhosas. Desse modo, o gel de agarose corado por brometo de
etídio é a técnica de revelação de PCR mais utilizada.
Questão 1
Vimos que a PCR é uma ferramenta molecular para amplificação do DNA in vitro.
Sobre a PCR, é correto afirmar que
Questão 2
A PCR convencional contém diversas etapas, desde pipetagem da reação até sua
leitura. Considerando as etapas, leia as afirmativas a seguir e assinale a alternativa
correta:
Existem situações em que a PCR qualitativa e convencional pode não ser a técnica
ideal para o nosso objetivo. Podemos nos deparar com casos em que a concentração
do DNA total da amostra é muito baixa, o que pode limitar o uso do produto
amplificado em outras aplicações, como o sequenciamento. Em determinadas
ocasiões, queremos saber o quanto de determinada sequência temos em nossas
amostras. Em outras situações, podemos estar interessados no produto da expressão
de um determinado gene, e precisamos olhar para o RNA mensageiro ao invés do
DNA, já que os níveis de DNA de uma célula são mantidos constantes, salvo raras
exceções.
Dica
Como você pode ver, existem diversos outros interesses, e uma PCR convencional dará apenas a base para
que variações mais complexas, específicas e úteis sejam desenvolvidas, validadas e usadas.
Como já sabemos, a DNA polimerase é capaz de sintetizar uma nova fita de DNA a
partir de uma fita de DNA molde. Afinal, ela é uma DNA polimerase DNA-dependente.
Mas, em muitas ocasiões, é necessário investigar a expressão de um gene, ou até
mesmo diagnosticar doenças causadas por vírus que não têm material genético feito
por DNA. Nesses casos, a molécula a ser detectada e quantificada indiretamente é o
RNA. A Taq polimerase, no entanto, não é capaz de reconhecer ou de adicionar
nucleotídeos a riboses; ela só trabalha com desoxirriboses.
Os retrovírus possuem uma enzima capaz de sintetizar DNA a partir de RNA, cujo
nome oficial é DNA polimerase RNA-dependente. Corriqueiramente, ela é chamada de
transcriptase reversa, ou TR, pois faz o reverso da transcrição: sintetiza DNA a partir
do RNA. Uma vez que os pesquisadores conseguiram isolar a TR, ela passou a ser
usada para reações in vitro. Na maioria dos casos, é usada uma TR purificada a partir
de vírus aviários, de forma que as TR não representam nenhum risco de infecção ao
manipulador e são seguras para diagnóstico e pesquisa.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Assim como uma reação pela polimerase, a reação de transcrição reversa (RT - usada
daqui em diante para designar a reação em si) precisa de alguns fatores elementares.
O primeiro fator necessário é o RNA de polaridade positiva (RNA+) de qualidade, o que
requer muito cuidado na manipulação e extração do material. Esse RNA é assim
chamado por possuir o mesmo sentido de transcrição e tradução que um RNA
mensageiro (mRNA), mas expande o entendimento para vírus que nem sempre tem
seu RNA+ diretamente traduzido na célula, como os próprios retrovírus. Além do
RNA+, a RT também precisará da enzima transcriptase reversa para fazer a síntese de
cDNA a partir do RNA+.
Esses oligonucleotídeos têm, em média, apenas 6 bases e, por isso, são chamados de
hexâmeros. Eles podem ser específicos para determinada sequência de RNA, ou
podem ser uma sequência curta rica em timinas (poli-T), que se anelará à cauda poli-A
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
do mRNA, ou podem ser aleatorizados, sendo este último o mais usado por permitir a
síntese e o armazenamento do cDNA derivado de diversas sequências diferentes.
Ao contrário da PCR, que contém ciclos que se repetem várias vezes para a
amplificação de determinada sequência, a RT é linear: cada etapa acontece apenas
uma vez, o que não permite amplificação de sinal. Primeiro, a reação começa com o
anelamento dos hexâmeros ao RNA+ por poucos minutos. Na maioria dos casos, não
há necessidade de temperaturas altas de desnaturação, pois o RNA+ já é uma fita
simples. Contudo, podem ocorrer estruturas secundárias no RNA que precisam de
temperaturas moderadas para desnaturação.
Em seguida, o tubo será aquecido ou resfriado até a temperatura de extensão pela TR.
Diferentemente da PCR convencional, a RT possui diversas TR de origens diferentes
que podem ser usadas. Assim, os protocolos variam entre diferentes marcas de
enzimas. Em alguns casos, a RT pode ter apenas essas duas temperaturas, de
anelamento e extensão, de 25 e 37ºC, respectivamente. O cDNA produzido pode ser
armazenado por meses a anos em geladeira (4ºC) ou freezer (-20ºC), ou usado
imediatamente como molde em uma PCR – a chamada RT-PCR.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Resumo esquemático dos reagentes necessários, das etapas e da amplificação do cDNA em uma RT-PCR.
Nested-PCR
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
A PCR convencional é muito útil, mas, às vezes, não consegue amplificar determinada
sequência que esteja presente em pouquíssima quantidade. Quando há dificuldade em
se amplificar o DNA alvo na PCR convencional, o gel de agarose pode não ter
capacidade suficiente para evidenciar o amplicon. Nós chamamos essa capacidade de
o resultado representar a realidade de sensibilidade.
A solução para PCR com baixa sensibilidade é relativamente simples: usar uma fração
da primeira reação como molde para uma segunda PCR, em uma técnica conhecida
como nested-PCR (ou PCR aninhada). Para isso, utilizamos dois pares de iniciadores,
sendo o par de primers para a primeira reação, chamado de iniciadores externos, e os
primers usados na segunda PCR, conhecidos como internos.
Dessa maneira, a segunda PCR sempre gera um produto menor que a primeira reação,
e conseguimos aumentar o número de ciclos de amplificação de, no máximo, 40 (na
PCR convencional) para entre 60 e 80 ciclos no total de ciclos combinados nas duas
reações subsequentes. Consequentemente, aumentamos a quantidade de DNA
amplificado obtido ao final da segunda PCR. Caso seja utilizada corretamente, a
adição de etapa nested pode melhorar muito a sensibilidade e a especificidade da
PCR.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Para isso, são necessários alguns cuidados especiais. O primeiro deles está no
desenho da reação, que deve ser pensada como um conjunto. A primeira PCR deve
possuir oligonucleotídeos que, ao se anelarem a determinada região, permitam que a
polimerase produza um amplicon longo e específico o suficiente para ser usado como
DNA-molde na segunda reação.
Saiba mais
Caso desejemos amplificar sequências altamente repetitivas, precisaremos levar em consideração uma
primeira PCR cujo amplicon contenha regiões específicas ao redor das repetições, para que haja uma boa
reação secundária. Isso porque, essa última precisa de iniciadores que se anelem especificamente à região
que foi amplificada anteriormente.
Exemplo
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Quando queremos determinar se um tratamento está surtindo efeito na redução de um marcador genético
específico. Nesse caso, a PCR convencional e suas variações vistas até agora não informam o suficiente
para tomada de decisões. Precisamos, assim, de técnicas que revelem a quantidade de certa sequência
específica de DNA com o máximo de precisão possível. Entra em cena a PCR quantitativa - também
conhecida como PCR em tempo real - (qPCR).
Existem duas técnicas de qPCR largamente usadas: SYBR Green e TaqMan. Elas
diferem especialmente na forma como a fluorescência é emitida e na especificidade
do sinal fluorescente. As formas de quantificação são, por outro lado, semelhantes.
Vamos explorar as duas em mais detalhes? Vejamos!
SYBR Green
É importante considerarmos que essa interação entre o SYBR e a fita dupla de DNA
não é controlada:
O SYBR irá se intercalar com qualquer fita dupla de DNA. Isso faz
com que a emissão de fluorescência seja menos específica: como
em uma reação convencional, apenas os oligonucleotídeos
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Por isso, reações de SYBR tem amplicons com tamanho limitado em cerca de 100
nucleotídeos em média. Em uma curva de dissociação boa e específica, todas as
moléculas amplificadas irão se dissociar na mesma temperatura e, assim, só um pico
é observado no gráfico. Em uma qPCR por SYBR sem especificidade, mais de um pico
será visto na curva de dissociação, e a reação precisará ser ajustada. Esse é um
importante nível de controle de qualidade da reação que não deverá ser ignorado.
Exemplo de resultado de uma curva de dissociação dos produtos de uma qPCR por
SYBR Green.
Confira mais detalhes sobre PCR em tempo real pela metodologia SYBR para fazer
uma curva de quantificação absoluta.
TaqMan
Outra forma bastante comum de qPCR, cujo nome vem da referência ao jogo de
videogame dos anos 1980, PacMan. Assim como na técnica SYBR, a quantificação em
tempo real na TaqMan ocorre através da emissão e detecção de fluorescência a cada
ciclo de amplificação. Entretanto, a TaqMan difere do SYBR na forma como a emissão
da fluorescência acontece: Além de todos os reagentes que uma PCR convencional
possui, temos a presença de uma sequência extra, complementar à região interna dos
iniciadores. Essa sequência extra é conhecida como sonda e é curta, com tamanho
aproximadamente igual ao dos oligonucleotídeos iniciadores, e possui temperatura de
anelamento pouco superior à deles. A sonda contém uma molécula fluorescente na
extremidade 5’, e outra molécula na extremidade 3’, que bloqueia a emissão de
fluorescência.
A existência de uma sonda que se anela à região alvo a ser amplificada não representa
muito, se a molécula fluorescente não for liberada de seu bloqueador. Para isso, a
enzima Taq polimerase usada na TaqMan é diferente das outras Taq polimerases. Ela
adiciona nucleotídeos (polimerização), como as demais polimerases, e remove
nucleotídeos (função exonuclease).
Repare na ilustração que a sonda anelada entre os dois iniciadores é clivada pela
TaqMan polimerase durante a extensão do DNA, permitindo a emissão de
fluorescência.
Quantificação
filter_1 Deve-se ajustar o programa do aparelho para que ele saiba qual laser e quais
filtros usar para a excitação de cada fluoróforo e em qual espectro da
emissão ele deverá buscar o sinal para detecção. Isto é, você é o responsável
em dizer ao aparelho o que ele deve fazer.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
filter_2 Deve-se ajustar o aparelho para que ele determine, nos ciclos iniciais de
amplificação, qual é o nível em que o sinal obtido é superior ao sinal de ruído.
Como a qPCR utiliza fluoróforos para a quantificação, por vezes existe um
“vazamento” de fluorescência no início da reação que não está relacionada
com a amplificação da sequência-alvo em si.
filter_3 Esse sinal inespecífico, geralmente, obtido nos primeiros ciclos, chamamos
de sinal de ruído (background). O ruído vai ser utilizado para determinar o
limiar de detecção (threshold).
Gráfico de amplificação.
Existem duas formas de se quantificar o produto amplificado: pela curva padrão e por
quantificação relativa, ou método de delta-delta-CT (ou ΔΔCt).
Diluição seriada usando a escala em mililitro (mL) como exemplo, porém para a nossa metodologia
é utilizada a escala em microlitro (µL).
Repare na imagem a seguir que existem 5 quantidades diferentes da curva padrão (em
vermelho), obtidas pela diluição seriada, e três amostras desconhecidas (em azul) cuja
quantidade de DNA foi calculada a partir de seus Cts e com base na linearidade da
curva padrão.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Nesse caso, o ideal é fazer uma normalização pela quantidade de cDNA total e, para
isso, usamos um cDNA de referência, que, geralmente, é um gene constitutivo
expresso em níveis estáveis nas células. O segundo delta, ou a segunda subtração, é
feita entre a diferença da primeira subtração na amostra-teste e uma amostra controle,
usada como calibradora. A amostra calibradora também precisará ter passado pela
primeira subtração; ou seja, também terá sido normalizada. Dessa forma, temos:
Δ Ct = Ct gene alvo − Ct gene de refer éncia Seguidopor Δ Δ Ct = (Ct gene alvo − Ct gene de referencia ) calibrador − (Ct gene alvo − Ct gene de re
Essas subtrações são possíveis apenas quando as curvas de quantificação dos dois
DNAs-alvo têm eficiência entre 90-110%, e não devem diferir em mais de 10% entre si.
Por isso, curvas-padrão iniciais para cada gene devem ser construídas para se verificar
as eficiências da reação, antes de procedermos para a técnica de quantificação
relativa.
calibrador, usamos um método especial. Você consegue identificar qual? A pista mais
importante é: você está investigando a expressão gênica, e não a existência do gene
em si. Portanto, você não está olhando diretamente o genoma, mas um produto dele.
Qual produto do DNA podemos detectar via PCR?
Resposta
Se você respondeu RNA, acertou! Nesse caso, o nome correto e completo da técnica utilizada é RT-qPCR:
uma reação de transcrição reversa acoplada a uma reação em cadeia da polimerase quantitativa.
PCR em multiplex
Até agora, falamos sobre detectar apenas um DNA-alvo por reação, seja de PCR
convencional, nested-PCR, RT-PCR ou qPCR. Contudo, podemos detectar mais de um
alvo por reação. Precisaremos ajustar as reações separadamente, utilizando pares de
oligonucleotídeos iniciadores específicos para cada produto desejado, e depois fundir
as duas PCRs em uma. Esse tipo de PCR em que mais de um produto alvo é
identificado chamamos de multiplex – múltiplos produtos são detectados, e até
quantificados.
Você poderá usar um fluoróforo que seja excitado no comprimento de onda azul e
emita fluorescência no espectro verde, e outro fluoróforo que seja excitado e floresça
no comprimento vermelho, e assim por diante.
Por outro lado, reações multiplex quantitativas usando o sistema SYBR são mais
difíceis. Isso porque a emissão de fluorescência pelo SYBR é inespecífica e ocorre
sempre que o fluoróforo intercala com fitas duplas do DNA. Assim, a reação multiplex
fica limitada e, muitas vezes, não é possível distinguirmos entre os sinais dos
diferentes produtos.
Questão 1
Questão 2
A PCR convencional pode ser utilizada para clonar um gene através de um vetor,
como plasmídeo. Na qPCR-TaqMan, as sondas auxiliam na quantificação de
mutações de alelos diferentes. O tamanho e conteúdo das STRs oferecem grande
precisão na identificação de indivíduos. As técnicas moleculares, como a PCR e as
suas variações, têm ganhado muito espaço na rotina clínica. Há situações em que o
diagnóstico por amplificação de ácidos nucleicos é o padrão-ouro e, às vezes, é a
única opção. Suas aplicações vão de diagnóstico de doenças genéticas e
infecciosas ao acompanhamento da evolução e tratamento de cânceres e infecções
crônicas, assim como determinação de riscos genéticos e aconselhamentos.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Aplicações da PCR
Até agora, vimos os reagentes necessários à amplificação exponencial de uma
sequência específica de DNA até termos milhões e bilhões de cópias da mesma exata
sequência, ou amplicon, que pode ser visualizada a partir de técnicas especiais.
Também vimos algumas variações da PCR que a tornam ainda mais relevante e útil
em diversos contextos.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Mas, afinal, para que precisamos de tantas sequências idênticas? Quais são as
aplicações disso? Para ilustrar melhor o quão útil a PCR é, veremos alguns exemplos a
seguir.
A primeira, e talvez uma das mais famosas para o grande público, é a aplicação
forense. Você já deve ter entrado em contato com a identificação de um criminoso a
partir do seu DNA deixado na cena do crime, seja por ter assistido a alguma série
policial, seja por ter lido alguma reportagem da vida real. Isso só é possível porque
cada ser humano possui um genoma completamente único, exceto de gêmeos
idênticos.
Em nosso genoma, temos regiões especiais nas quais um cientista forense pode olhar
para confirmar a origem do DNA. Denominadas marcadores moleculares, elas são
conhecidas pela alta frequência de polimorfismos genéticos – regiões com grande
variação na sequência de DNA entre indivíduos sem causar nenhum tipo de
interferência funcional, pois são mais frequentes em regiões não codificantes.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
As regiões de interesse são amplificadas por PCR e, em seguida, o perfil genético pode
ser visualizado por separação das bandas em gel de agarose e coloração por brometo
de etídio.
Existem casos em que é necessário aumentar o material genético a ser usado para,
assim, aumentarmos o sinal durante a revelação. Nesse caso, o perito pode optar pelo
uso de uma nested-PCR, lembrando que os primers externos e interno precisam de
regiões não repetidas para se anelarem. Um cientista forense, além de fazer a
extração do DNA e sua amplificação por PCR, fará a identificação de indivíduos
através do seu perfil genético.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Atenção!
Lembre-se de que, para regiões repetitivas, é necessário usar iniciadores que se anelem próximo a STRs, mas
não nas STRs em si, pois isso geraria inespecificidade e muitas bandas em um gel de agarose.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Outro exemplo diagnóstico que você já pode ter ouvido falar é o uso da PCR para
diagnóstico de doenças infecciosas. Ao utilizar a técnica para amplificar o DNA (ou
RNA) de algum agente infeccioso, podemos diagnosticar uma infecção, já que o
material genético de tal agente não deveria estar presente naquela amostra biológica.
Sua simples presença pode indicar o agente etiológico e, assim, descobrir a causa da
doença.
Nos dois casos, a redução (ou não) das sequências alvo na RT-qPCR ao longo do
tempo podem ser cruciais no tratamento e evolução do paciente. A PCR convencional
multiplex também pode ser utilizada no diagnóstico diferencial entre dois patógenos
que possam causar os mesmos sintomas, mas que exigem abordagens clínicas
diferentes.
Exemplo
Um paciente transplantado renal pode apresentar alteração em exames bioquímicos que levem o
nefrologista a pensar em duas possibilidades: na primeira, uma infecção por um vírus sem gravidade pode
estar acontecendo no órgão, e nenhum tratamento seria necessário; na segunda, pode estar acontecendo
uma infecção viral grave no rim transplantado que poderia rapidamente levar à perda do órgão e até mesmo
ao óbito do paciente.
Outro campo que utiliza a PCR é a pesquisa científica. Em diversas ocasiões, a PCR
pode ser utilizada para manipulação genética de organismos simples, como bactérias,
leveduras e células em cultivo. Nesse contexto, podemos usar a PCR para, por
exemplo, clonarmos um gene. Fazemos isso ao amplificarmos a sequência gênica que
desejamos clonar usando oligonucleotídeos longos que têm duas regiões distintas. A
primeira região liga-se ao gene que queremos manipular – deletar, adicionar ou mutar
– no organismo alvo; a segunda é a região que se liga ao DNA molde do vetor dentro
do qual queremos colocar nosso gene clonado.
Normalmente, usamos a clonagem por PCR em duas etapas: uma para amplificarmos
o gene alvo que queremos clonar; na segunda etapa, usamos o produto amplificado,
juntamente com o vetor, para inserirmos o gene clonado no vetor. Outra forma de
clonagem inclui o uso de enzimas de restrição para cortar o DNA em pontos
específicos, após amplificação por PCR.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Questão 1
Questão 2
Considerações finais
Vimos que a amplificação de DNA in vitro é feita pela reação em cadeia da polimerase,
em que a variação cíclica de temperatura permite a desnaturação, o anelamento e a
extensão de sequências-alvo específicas, de acordo com aquelas que desejamos
detectar. Como estudado, os oligonucleotídeos iniciadores se ligam à fita simples de
DNA que foi aberta por desnaturação por complementariedade entre as bases
nitrogenadas. Essas últimas são elementos fundamentais dos nucleotídeos por
conterem a informação genética.
Além disso, aprendemos algumas das diversas aplicações que a PCR e as suas
variações têm em áreas da ciência, como na forense, na pesquisa e na clínica,
participando do diagnóstico, acompanhamento e prognóstico.
headset Podcast
Para encerrar, ouça um resumo dos aspectos mais relevantes deste conteúdo.
Explore +
Confira as indicações que separamos especialmente para você!
PCR.
Para conhecer mais sobre as técnicas de PCR, leia Outras aplicações da PCR
e as suas variações.
Referências
ASSOCIAÇÃO BRASIL HUNTINGTON. O que é a Doença de Huntington. ABH.
Consultado na internet em: 18 out. 2020.
NEW ENGLAND BIOLABS’ FEATURE ARTICLES. Polymerase Fidelity: What is it, and
what does it mean for your PCR? NEB. Consultado na internet em: 18 out. 2020.
REAL-TIME PCR BASICS. TaqMan vs. SYBR Chemistry for Real-Time PCR.
ThermoFisher Scientific website. Consultado na internet em: 18 out. 2020.
ZHAO, M.; et al. Improved high sensitivity screen for Huntington disease using a one-
step tripletprimed PCR and melting curve assay. PLoS ONE. Consultado na internet
em: 18 out. 2020.
21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Download material