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WO2024210580A1 - Cpi-455를 포함하는 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물 - Google Patents

Cpi-455를 포함하는 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물 Download PDF

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Publication number
WO2024210580A1
WO2024210580A1 PCT/KR2024/004453 KR2024004453W WO2024210580A1 WO 2024210580 A1 WO2024210580 A1 WO 2024210580A1 KR 2024004453 W KR2024004453 W KR 2024004453W WO 2024210580 A1 WO2024210580 A1 WO 2024210580A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
disease
stem cells
cpi
composition
present
Prior art date
Application number
PCT/KR2024/004453
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English (en)
French (fr)
Inventor
김현정
Original Assignee
중앙대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 중앙대학교 산학협력단 filed Critical 중앙대학교 산학협력단
Publication of WO2024210580A1 publication Critical patent/WO2024210580A1/ko

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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/08—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cells of the nervous system

Definitions

  • the present invention relates to a composition for inducing differentiation of stem cells into stellate cells, including CPI-455.
  • Neurodegenerative disorders are degenerative diseases that occur as we age, and they refer to diseases that occur in the brain or spinal cord, and are diseases that occur due to the gradual loss of structure and function of specific brain cell groups in the brain and spinal cord due to unknown causes, genetic defects, or environmental factors. It is known that nerve cell death or damage caused by degenerative nervous system diseases causes problems in the formation or function of synapses that transmit information between nerve cells, which is most important for information transmission in the brain nervous system, and abnormal increases or decreases in the electrical activity of the nerves. The nerve cells in the brain and spinal cord perform very diverse functions depending on their location, and damage to nerve cells in specific areas causes characteristic dysfunction, and also shows very diverse clinical aspects depending on the form in which this dysfunction progresses. These neurodegenerative diseases include amyotrophic lateral sclerosis (ALS), also known as Lou Gehrig's disease, Parkinson's disease (PD), Alzheimer's disease (AD), Huntington's disease (HD), and multiple sclerosis (MS).
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • PD
  • Alzheimer's disease research has been conducted mainly on the pathogenesis of the disease by differentiating cells into neurons that are abundant in the forebrain. Differentiation into forebrain neurons is accomplished by a neural cell differentiation method that proceeds without the addition of any special external substances. Recently, methods such as monolayer culture through 'dual-SMAD inhibition', embryoid body formation, and cerebral organoid formation have been developed, and both 'glutamatergic neurons' and 'GABAergic neurons' are widely used in research on the discovery of Alzheimer's disease.
  • astrocytes are also reported to play a very important role in the pathogenesis of Alzheimer's disease. It has been reported that astrocytes can treat neurodegenerative diseases by playing a crucial role in synapse formation and maturation. In general, astrocytes are differentiated from the same precursor cells as neurons, and cell fractionation and purification using astrocyte-specific expression factors are possible in cell populations where the two types of cells are mixed.
  • CPI-455 is effective in inducing neural stem cells into astrocytes.
  • the present inventors have made extensive efforts to find a method for inducing stem cells into astrocytes, and as a result, have confirmed that CPI-455 of the present invention can be treated to induce neural stem cells into astrocytes, thereby completing the present invention.
  • the purpose of the present invention is to provide a composition for inducing differentiation of stem cells into stellate cells, comprising CPI-455 as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for differentiating stem cells into stellate cells, comprising a step of culturing stem cells by treating them with a composition for inducing differentiation of stem cells into stellate cells according to the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for inducing differentiation of stem cells into astrocytes, comprising CPI-455 or a composition for inducing differentiation of stem cells into astrocytes according to the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a use of CPI-455 or a composition for inducing differentiation of stem cells into stellate cells according to the present invention for inducing differentiation of stem cells into stellate cells.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases, comprising CPI-455 as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating a neurodegenerative disease, comprising the step of administering CPI-455 or a composition containing it as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a use of CPI-455 or a composition containing it as an active ingredient for preventing or treating neurodegenerative diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a use of CPI-455, or a composition comprising it as an active ingredient, for the manufacture of a therapeutic agent for neurodegenerative diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a cell therapy agent for preventing or treating neurodegenerative diseases, which comprises astrocytes produced by a method for differentiating stem cells into astrocytes according to the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating a neurodegenerative disease, comprising a step of administering a cell therapy agent according to the present invention to a subject in need thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the cell therapy agent according to the present invention for preventing or treating neurodegenerative diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a use for producing a cell therapy agent using astrocytes produced by a method for differentiating stem cells into astrocytes according to the present invention.
  • the present invention provides a composition for inducing differentiation of stem cells into stellate cells, comprising CPI-455 as an effective ingredient.
  • the stem cell may be at least one selected from the group consisting of embryonic stem cells, adult stem cells, embryonic germline stem cells, and embryonic tumor stem cells, but is not limited thereto.
  • the CPI-455 may be included in a concentration of 0.1 to 100 ⁇ M relative to the total composition, but is not limited thereto.
  • the CPI-455 may satisfy one or more of the following characteristics, but is not limited thereto:
  • the present invention provides a method for differentiating stem cells into stellate cells, comprising a step of culturing stem cells by treating them with a composition for inducing differentiation of stem cells into stellate cells according to the present invention.
  • the stellate cells may express GFAP (Glial fibrillary acidic protein), but are not limited thereto.
  • the present invention provides a kit for inducing differentiation of stem cells into astrocytes, comprising CPI-455 or a composition for inducing differentiation of stem cells into astrocytes according to the present invention.
  • the present invention provides a use of CPI-455 or a composition for inducing differentiation of stem cells into stellate cells according to the present invention for inducing differentiation of stem cells into stellate cells.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases, comprising CPI-455 as an active ingredient.
  • the present invention provides a cell therapy agent for preventing or treating neurodegenerative diseases, which comprises astrocytes produced by a method for differentiating stem cells according to the present invention into astrocytes.
  • the neurodegenerative disease is Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, adrenoleukodystrophy, Alexander's disease, Alper's disease, ataxia telangiectasia, Batten's disease, bovine spongiform encephalopathy (BSE), Canavan's disease, corticobasal degeneration, Creutzfeldt-Jakob disease, dementia with Lewy bodies, fatal familial insomnia, frontotemporal lobar degeneration, Huntington's disease, Kennedy's disease, Crabb's disease, Lyme's disease, Machado-Joseph's disease, multiple sclerosis, multiple systemic atrophy, neuromyelopathy, Niemann-Pick's disease, Parkinson's disease, Pick's disease, primary lateral sclerosis, progressive supranuclear palsy, Refsum's disease, Sandhoff's disease, diffuse myelinolytic sclerosis, spinocerebellar ataxi
  • the present invention provides a method for preventing or treating a neurodegenerative disease, comprising a step of administering CPI-455 or a composition comprising it as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a use of CPI-455 or a composition containing it as an active ingredient for preventing or treating neurodegenerative diseases.
  • the present invention also provides a use of CPI-455, or a composition comprising it as an active ingredient, for the manufacture of a therapeutic agent for neurodegenerative diseases.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a neurodegenerative disease, comprising a step of administering a cell therapy agent according to the present invention to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a use of the cell therapy agent according to the present invention for preventing or treating neurodegenerative diseases.
  • the present invention provides a use for producing a cell therapy agent using stellate cells produced by a method for differentiating stem cells according to the present invention into stellate cells.
  • the present inventors By demonstrating a technique for inducing stem cells into astrocytes using CPI-455, the present inventors expect that differentiation into astrocytes can be induced without using existing stem cell differentiation inducers, and that neurodegenerative diseases can be effectively treated using differentiated astrocytes.
  • Figure 1a is a drawing showing the results of Western blot analysis of the expression levels of TUBB3 (Tubulin beta 3 class III), GFAP, and OLIG2 (Oligodendrocyte transcription factor 2) after neural stem cells were treated with 0.1% DMSO or CPI-455 for 4 days in the absence of EGF and FGF2 (D: DMSO, the same applies hereinafter).
  • Figure 1b is a diagram showing the results of RT-qPCR for the expression of tubb3 and gfap mRNA after neural stem cells were treated with 0.1% DMSO or CPI-455 for 3 days in the absence of EGF and FGF2.
  • Figure 2a shows the results of immunostaining with TUBB3 (green) or anti-GFAP (red) after neural stem cells were treated with 0.1% DMSO or CPI-455 for 4 days in the absence of EGF and FGF2.
  • Scale bar 100 ⁇ m.
  • Figure 2b is a diagram showing the ratio of TUBB3-positive cells and GFAP-positive cells to DAPI-positive cells after neural stem cells were treated with 0.1% DMSO or CPI-455 for 4 days in the absence of EGF and FGF2.
  • Figure 3a is a drawing showing the results of Western blot analysis of the phosphorylation level of STAT3 in neural stem cells treated with CPI-455.
  • Figure 3b is a diagram showing the results of RT-qPCR measurement of the expression of il-6, lif, cntf, and bmp2 mRNA in neural stem cells treated with CPI-455.
  • active ingredient means an ingredient that exhibits the intended activity alone or can exhibit the intended activity together with a carrier or the like that is inactive on its own.
  • the present invention provides a composition for inducing differentiation of stem cells into stellate cells, comprising CPI-455 as an active ingredient.
  • CPI-455 is named 4,7-dihydro-6-(1-methylethyl)-7-oxo-5-phenyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-3-carbonitrile (Cas No. 1628208-23-0) and is represented by the following chemical formula 1.
  • CPI-455 can be obtained as a commercial product or prepared by a known method (Benjamin R. Leadem. NOVEL HISTONE DEMETHYLASE INHIBITORS SYNERGISTICALLY).
  • the CPI-455 is present in an amount of 0.1 to 100 uM, 1 to 90 uM, 1 to 80 uM, 1 to 70 uM, 1 to 60 uM, 1 to 55 uM, 1 to 50 uM, 1 to 45 uM, 1 to 40 uM, 10 to 90 uM, 10 to 80 uM, 10 to 70 uM, 10 to 60 uM, 10 to 50 uM, 20 to 80 uM, 30 to 70 uM, 40 to 60 uM, 43 to 60 uM, 45 to 60 uM, 47 to 60 uM, 50 to 58 uM, 50 to 55 uM, 50 to 54 uM, 50 to It may be present at a concentration of, but is not limited to, 52 uM, 46uM, 47uM, 48uM, 49uM, 50uM, 51uM, 52uM, 53uM, or 54uM.
  • the CPI-455 can induce differentiation of neural stem cells into astrocytes by increasing BMP2 secretion and promoting phosphorylation of STAT3, and is characterized by satisfying at least one of the following characteristics:
  • BMP2 (Bone morphogenic protein 2) is one of the TGF-beta family cytokines, a polypeptide dimer composed of 114 amino acids, and is known to interact with fibroblast growth factor to induce not only the formation of chondrocyte and osteoblast precursors, but also the development of epidermal tissue, and can also induce differentiation of neural cells.
  • STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3
  • STAT3 is a transcription factor that exists in an inactive form in the cytoplasm and then forms a dimer after phosphorylation by stimulation by various cytokines, growth factors, and hormones and then moves into the nucleus to transmit a signal.
  • STAT3 induces cell differentiation, survival, proliferation, and apoptosis by regulating the expression of various types of genes, and is known to be especially expressed increased in many tumor cells.
  • STAT3 The activity of STAT3 is regulated by the phosphorylation of Janus kinase2 (JAK2), an upstream kinase of STAT that promotes STAT3 phosphorylation, the expression level of suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) protein that binds to JAK2 and suppresses its activity, and the activity of SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase (SHP-1), a tyrosine phosphatase.
  • JAK2 Janus kinase2
  • SOCS3 suppressor of cytokine signaling 3
  • SHP-1 SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase
  • stem cell is not particularly limited as long as it is an undifferentiated cell that has the ability to proliferate indefinitely and differentiate into stellate cells.
  • stem cells may include embryonic stem cells, adult stem cells, embryonic germline stem cells, embryonic tumor stem cells, etc., but are not limited thereto.
  • the stem cell may be a neural stem cell.
  • astrocyte may be, but is not limited to, an astrocyte having an increased expression level of GFAP, an astrocyte marker.
  • the present invention provides a method for differentiating stem cells into stellate cells, comprising a step of culturing stem cells by treating them with a composition for inducing differentiation of stem cells into stellate cells according to the present invention.
  • astrocytes produced by the method of differentiating stem cells into astrocytes according to the present invention express GFAP (Glial fibrillary acidic protein), which is an astrocyte marker, and may have an increased GFAP expression level compared to stem cells.
  • GFAP Glial fibrillary acidic protein
  • “culturing” may be performed in any one cell culture medium selected from Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12), Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640), Minimum Essential Media (MEM), and Ham F10, and sodium pyruvate, glutamine, etc. may be additionally added to the culture medium.
  • the culture period may be 1 to 10 days, 1 to 8 days, 1 to 6 days, 2 to 6 days, 3 to 6 days, 3 to 5 days, or 3 to 4 days, but is not limited thereto.
  • the above 'culture medium' or 'culture medium' refers to a mixture for in vitro differentiation and proliferation of cells such as stellate cells, which contains essential elements for cell growth and proliferation, such as sugars, amino acids, various nutrients, serum, growth factors, and minerals.
  • the 'culture medium' in the present invention is a medium for differentiation and proliferation of stellate cells.
  • the culture means including differentiation and proliferation of stellate cells.
  • the “medium” can use any basic medium known in the art without limitation.
  • the basic medium can be manufactured by artificial synthesis, and commercially manufactured media include, but are not limited to, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), and Iscove's Modified Dulbecco's Medium.
  • the culture medium of the present invention may additionally contain a nutrient mixture.
  • the nutrient mixture is a mixture containing various amino acids, vitamins, mineral salts, etc. that are generally used in cell culture, and may be prepared by mixing the amino acids, vitamins, mineral salts, etc., or a commercially prepared nutrient mixture may be used.
  • Commercially prepared nutrient mixtures include, but are not limited to, B27, N2, F-12, M199, MCDB110, MCDB202, MCDB302, etc.
  • the culture medium of the present invention may not contain a growth factor.
  • the growth factor may be, for example, EGF or FGF2, but is not limited thereto.
  • the culture medium for culturing stem cells includes all culture mediums commonly used in the field for stellate cell differentiation.
  • the culture medium used for culturing generally includes carbon sources, nitrogen sources, and trace element components.
  • it may be a method for differentiating stem cells into stellate cells, including a step of culturing stem cells in a differentiation medium treated with a composition containing CPI-455 as an active ingredient to differentiate them into stellate cells.
  • the above stem cells include, but are not limited to, embryonic stem cells, adult stem cells, embryonic germline stem cells, and embryonic tumor stem cells.
  • the above differentiation medium may include, but is not limited to, one or more selected from the group consisting of antibiotic-antifungal agent, and B27.
  • the above differentiation medium may comprise, but is not limited to, one or more selected from the group consisting of antibiotic-antimycotic 0.1 to 5% (v/v); and B27 0.5 to 5% (v/v).
  • the above differentiation medium may, but is not limited to, not containing growth factors EGF and FGF2.
  • the present invention provides a kit for inducing differentiation of stem cells into astrocytes, comprising CPI-455 or a composition for inducing differentiation of stem cells into astrocytes according to the present invention.
  • the above kit is not limited to the above and may include other reagents or devices.
  • it may include a culture plate for culturing target cells or a reagent capable of evaluating the differentiation status into stellate cells, and may also have stem cells to be cultured.
  • the kit according to the present invention may be provided in a single container containing all of the additives for the differentiation-inducing medium, or CPI-455, or the nutrient mixture, the growth factors, or the basal medium and other reagents in appropriate volumes and/or forms, or may be provided in separate containers.
  • a kit according to the present invention may include an instruction manual describing the procedure for carrying out the method according to the present invention described above.
  • the present invention provides a use of CPI-455 or a composition for inducing differentiation of stem cells into stellate cells according to the present invention for inducing differentiation of stem cells into stellate cells.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases, comprising CPI-455 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • CPI-455 according to the present invention can be used as is or in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • pharmaceutically acceptable salt includes a salt derived from a pharmaceutically acceptable inorganic acid, organic acid, or base.
  • acids examples include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, propionic acid, maleic acid, tartaric acid, gluconic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid, benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid, benzoic acid, citric acid, lactic acid, and the like.
  • Acid addition salts can be prepared by conventional methods, for example, by dissolving the compound in an excess of an aqueous acid solution and precipitating the salt using a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Alternatively, it can be prepared by heating an equimolar amount of a compound and an acid or alcohol in water, then evaporating the mixture to dryness, or by suction filtration of the precipitated salt.
  • a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • Salts derived from suitable bases may include, but are not limited to, alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium.
  • the alkali metal or alkaline earth metal salt can be obtained, for example, by dissolving the compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering out the undissolved compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • it is pharmaceutically suitable to produce a sodium, potassium or calcium salt as the metal salt
  • the corresponding silver salt can be obtained by reacting the alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (e.g., silver nitrate).
  • neurodegenerative disease used in the present invention is not particularly limited.
  • Non-limiting examples of the above neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, adrenoleukodystrophy, Alexander's disease, Alper's disease, ataxia-telangiectasia, Batten's disease, bovine spongiform encephalopathy (BSE), Canavan's disease, corticobasal degeneration, Creutzfeldt-Jakob disease, dementia with Lewy bodies, fatal familial insomnia, frontotemporal lobar degeneration, Huntington's disease, Kennedy's disease, Crabb's disease, Lyme's disease, Machado-Joseph's disease, multiple sclerosis, multiple systemic atrophy, neuroblastoma, Niemann-Pick's disease, Parkinson's disease, Pick's disease, primary lateral sclerosis, progressive supranuclear palsy, Refsum's disease, Sandhoff's disease
  • the content of the compound in the composition of the present invention can be appropriately adjusted depending on the symptoms of the disease, the degree of progression of the symptoms, the condition of the patient, etc., and for example, it can be 0.0001 to 99.9 wt%, 0.001 to 80 wt%, or 0.01 to 50 wt% based on the total weight of the composition, but is not limited thereto.
  • the content ratio is a value based on the dry amount after removing the solvent.
  • the “pharmaceutical composition” means a composition manufactured for the purpose of preventing or treating a disease, and may be formulated and used in various forms according to conventional methods. For example, it may be formulated in oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, and syrups, and may be formulated and used in the form of external preparations, suppositories, and sterile injection solutions.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the excipients may be, for example, at least one selected from the group consisting of diluents, binders, disintegrants, lubricants, adsorbents, moisturizers, film-coating materials, and controlled-release additives.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated and used in the form of external preparations such as powders, granules, sustained-release granules, enteric-coated granules, liquids, eye drops, ellipses, emulsions, suspensions, alcohols, troches, aromatic waters, limonades, tablets, sustained-release tablets, enteric-coated tablets, sublingual tablets, hard capsules, soft capsules, sustained-release capsules, enteric capsules, pills, tinctures, soft extracts, dry extracts, fluid extracts, injections, capsules, irrigants, ointments, pastes, sprays, inhalants, patches, sterile injection solutions, or aerosols, and the external preparations may have formulations such as creams, gels, patches, sprays, ointments, ointments, lotions, liniments, pastes, or cataplasmas.
  • external preparations may have formulations such as creams, gels, patches, sprays
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharides, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as fillers, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Additives for tablets, powders, granules, capsules, pills and troches according to the present invention include excipients such as corn starch, potato starch, wheat starch, lactose, sucrose, glucose, fructose, D-mannitol, precipitated calcium carbonate, synthetic aluminum silicate, calcium hydrogen phosphate, calcium sulfate, sodium chloride, sodium bicarbonate, purified lanolin, microcrystalline cellulose, dextrin, sodium alginate, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, kaolin, urea, colloidal silica gel, hydroxypropyl starch, hydroxypropyl methyl cellulose (HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, propylene glycol, casein, calcium lactate and Primogel; Gelatin, gum arabic, ethanol, agar powder, cellulose acetate phthalate, carboxymethylcellulose, calcium carboxymethylcellulose, glucose, purified water, sodium caseinate, glycerin,
  • Additives that can be used in the liquid formulation according to the present invention include water, diluted hydrochloric acid, diluted sulfuric acid, sodium citrate, monostearate sucrose, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (twin esters), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, ammonia water, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, etc.
  • the syrup according to the present invention may use a solution of white sugar, other sugars or sweeteners, and may also use a fragrance, a colorant, a preservative, a stabilizer, a suspending agent, an emulsifier, a viscosity increasing agent, etc., as needed.
  • Purified water may be used in the emulsion according to the present invention, and an emulsifier, a preservative, a stabilizer, a fragrance, etc. may be used as needed.
  • the suspension according to the present invention may use suspending agents such as acacia, tragacanth, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910, and the like.
  • suspending agents such as acacia, tragacanth, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910, and the like.
  • Surfactants, preservatives, stabilizers, colorants, and fragrances may also be used as needed.
  • the injection according to the present invention includes: solvents such as distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection, Ringer's injection, dextrose injection, dextrose + sodium chloride injection, PEG, lactated Ringer's injection, ethanol, propylene glycol, nonvolatile oils such as sesame oil, cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, and benzene benzoate; solubilizers such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethyl acetamide, butazolidine, propylene glycol, Tween, nitrile acid amide, hexamine, and dimethyl acetamide; buffers such as weak acids and their salts (acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, albumin, peptone, and gums
  • the suppository according to the present invention comprises cocoa butter, lanolin, witepsol, polyethylene glycol, glycerogelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, a mixture of stearic acid and oleic acid, subanal, cottonseed oil, peanut oil, palm oil, cocoa butter + cholesterol, lecithin, ranette wax, glycerol monostearate, Tween or Span, Imhausen, monolene (propylene glycol monostearate), glycerin, Adeps solidus, Buytyrum Tego-G, Cebes Pharma 16, hexalide base 95, Cotomar, Hydroxocote SP, S-70-XXA, S-70-XX75 (S-70-XX95), Mechanisms such as Hydrokote 25, Hydrokote 711, Idropostal, Massa estrarium (A, AS, B, C, D, E, I, T), Massa-MF, Masupol, Masupol-15, Neos
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations are prepared by mixing the extract with at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, and syrups, and in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, flavoring agents, and preservatives may be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dosage level can be determined according to the type and severity of the patient's disease, the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the excretion rate, the treatment period, the concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or in multiple doses. It is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects by taking all of the above factors into consideration, and this can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention belongs.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be envisaged, for example, oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, intrathecal injection, sublingual administration, buccal mucosa administration, rectal insertion, vaginal insertion, ocular administration, otic administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, skin administration, transdermal administration, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as an active ingredient along with various related factors such as the disease to be treated, route of administration, age, sex, weight of the patient, and severity of the disease.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a neurodegenerative disease, comprising a step of administering CPI-455 or a composition comprising it as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a use of CPI-455 or a composition containing it as an active ingredient for preventing or treating neurodegenerative diseases.
  • the present invention also provides a use of CPI-455, or a composition comprising it as an active ingredient, for the manufacture of a therapeutic agent for neurodegenerative diseases.
  • subject means a subject requiring treatment for a disease, and more specifically, a mammal such as a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, and cow.
  • “administration” means providing a composition of the present invention to a subject by any appropriate method.
  • prevention means any act of suppressing or delaying the onset of a target disease
  • treatment means any act of improving or beneficially changing a target disease and its resulting metabolic abnormality symptoms by administering a pharmaceutical composition according to the present invention
  • improvement means any act of reducing a parameter related to a target disease, for example, the degree of symptoms, by administering a composition according to the present invention.
  • composition of the present invention can be administered in combination with a known compound having a preventive or therapeutic effect on neurodegenerative diseases.
  • stem cells were differentiated into stellate cells using CPI-455. Differentiated stellate cells have a very high potential for use as cell therapy for patients.
  • the present invention provides a cell therapy agent for preventing or treating neurodegenerative diseases, which comprises astrocytes produced by a method for differentiating stem cells into astrocytes according to the present invention.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a neurodegenerative disease, comprising a step of administering a cell therapy agent according to the present invention to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a use of the cell therapy agent according to the present invention for preventing or treating neurodegenerative diseases.
  • cellular therapeutic agent refers to a medicine (US FDA regulations) used for the purposes of treatment, diagnosis, and prevention by cells and tissues isolated, cultured, and specially manipulated from humans, and means a medicine used for the purposes of treatment, diagnosis, and prevention of diseases by a series of actions such as proliferating and selecting living autologous, allogenic, and xenogenic cells in vitro or changing the biological characteristics of cells by other methods to restore the function of cells or tissues.
  • a medicine US FDA regulations
  • a medicine used for the purposes of treatment, diagnosis, and prevention by cells and tissues isolated, cultured, and specially manipulated from humans
  • a medicine used for the purposes of treatment, diagnosis, and prevention of diseases by a series of actions such as proliferating and selecting living autologous, allogenic, and xenogenic cells in vitro or changing the biological characteristics of cells by other methods to restore the function of cells or tissues.
  • the route of administration of the cell therapy agent according to the present invention may be through any common route as long as it can reach the target tissue. It may be parenteral administration, for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, or intradermal administration, but is not limited thereto.
  • the above cell therapy agent can be formulated into a suitable form together with a pharmaceutical carrier generally used in cell therapy.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and does not typically cause allergic reactions such as gastrointestinal upset, dizziness, or similar reactions when administered to humans.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for parenteral administration such as water, suitable oils, saline solution, aqueous glucose, and glycol, and may further include stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium bisulfite, sodium sulfite, or ascorbic acid. Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben, and chlorobutanol.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers may be referred to those described in the following literature (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
  • composition may be administered by any device capable of transporting the cell therapy agent to the target cell.
  • the cell therapy agent according to the present invention may contain a therapeutically effective amount of stellate cells for the treatment of a disease.
  • the term 'therapeutically effective amount' means an amount of an effective ingredient or therapeutic agent that induces a biological or medical response in a tissue system, animal or human, as considered by a researcher, veterinarian, physician or other clinician, and includes an amount that induces alleviation of symptoms of a disease or disorder being treated.
  • the optimal cell therapy agent content can be easily determined by those skilled in the art, and can be adjusted according to various factors including the type of disease, the severity of the disease, the content of other ingredients contained in the composition, the type of formulation, and the patient's age, weight, general health, sex and diet, administration time, administration route and secretion rate of the therapeutic agent, treatment period, and concurrently used drugs. It is important to include an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects by considering all of the above factors.
  • the daily dosage of the stellate cells of the present invention can be administered once or in several divided doses at 1.0 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 11 cells/kg body weight, preferably 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 9 cells/kg body weight.
  • the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of various related factors such as the disease to be treated, the severity of the disease, the route of administration, the patient's weight, age, and sex, and therefore, the dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention provides a treatment method comprising administering to a mammal a therapeutically effective amount of a cell therapy agent according to the present invention.
  • mammal refers to a mammal that is the subject of treatment, observation or experiment, and preferably refers to a human.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving neurodegenerative diseases, comprising CPI-455 or a food-wise acceptable salt thereof as an active ingredient, and the food composition may be a health functional food composition.
  • the term “food-wise acceptable salt” includes a salt derived from an organic acid, inorganic acid, or base that is food-wise acceptable.
  • the CPI-455 of the present invention may be added as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be used appropriately according to a conventional method.
  • the amount of the active ingredient mixed may be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment).
  • the CPI-455 of the present invention may be added in an amount of 15 wt% or less, or 10 wt% or less, based on the raw material.
  • the amount may be below the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may also be used in an amount greater than the above range.
  • foods to which the above substances can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, and vitamin complexes, and include all health functional foods in the conventional sense.
  • the health beverage composition according to the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients, like conventional beverages.
  • the natural carbohydrates mentioned above are monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • a natural sweetener such as thaumatin and stevia extract, or a synthetic sweetener such as saccharin and aspartame can be used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01-0.20 g, or about 0.04-0.10 g per 100 mL of the composition of the present invention.
  • composition of the present invention may contain various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, etc.
  • composition of the present invention may contain fruit pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice drinks, and vegetable drinks. These components may be used independently or in combination. The proportion of these additives is not particularly important, but is generally selected in the range of 0.01-0.20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • health functional food is the same term as food for special health use (FoSHU), and means a food with high medical and therapeutic effects that is processed to efficiently exhibit a bioregulatory function in addition to providing nutrition.
  • the food can be manufactured in various forms such as tablets, capsules, powders, granules, liquids, and pills in order to obtain a useful effect in preventing or improving neurodegenerative diseases.
  • the health functional food of the present invention can be manufactured by a method commonly used in the art, and can be manufactured by adding raw materials and ingredients commonly added in the art during the manufacturing process.
  • unlike general drugs it has the advantage of not having side effects that may occur when taking drugs for a long period of time by using food as a raw material, and can be highly portable.
  • NSCs Neural stem cells
  • DMEM/F12 Dulbecco's modified Eagle's media
  • F-12 Ham's nutrient mixture F-12 containing final concentrations of 1% antibiotic-antimycotic (Cat no. 15240-062 Gibco), 2% B-27 supplement (Cat no. 17504-044, Gibco), 20 ng/ml EGF (Cat no.
  • GF144 Chemicon, Burlington, MA, USA
  • 20 ng/ml FGF2 (Cat no. GF003AF, Chemicon) at 37°C in 5% CO2 for 6 days to form neurospheres.
  • the neurospheres were dissociated into individual cells using Accutase (Cat No. SCR005, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
  • the cells were attached to the culture plates in the medium enriched with EGF and FGF2 for 1 day.
  • the NSCs were treated with DMEM/F12 medium mixed with a final concentration of 1% antibiotic-antimycotic, 2% B-27 supplement, and DMSO (Cat no.
  • CPI-455 Cat no. HY-100421, Medchemexpress, Princeton, NJ, USA
  • the medium was changed every 2 days.
  • Cells for Western blot and immunostaining were cultured for 4 days after CPI-455 treatment.
  • Cells for RT-qPCR and ChIP-qPCR were cultured for 3 days after CPI-455 treatment.
  • TUBB3 (1:3000; Cat no. T5076, Sigma-Aldrich), GFAP (1:9000; Cat No. G9269, Sigma-Aldrich), OLIG2 (1:2000; Cat No. AB9610, Millipore), GAPDH (1:1000; Cat no. sc-32233, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, U.S.A.), STAT3 (1:2000; Cat no. 4904, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, U.S.A.), and pSTAT3 (1:2000; Cat no. 9145, Cell Signaling Technology).
  • Anti-mouse IgG F(ab')2 (1:5000; Cat no. ADI-SAB-100, Enzo, Farmingdale, NY, U.S.A.
  • Anti-Rabbit IgG (1:5000; Cat no. ADI-SAB-300-J, Enzo).
  • Chemiluminescence was detected on CP-BU novel film (Agfa, Mortsel, Belgium) using Western blotting luminol reagent (Cat no. sc-2048, Santa Cruz Biotechnology). Band intensities were measured with ImageJ version 2.3.0. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was measured as a housekeeping protein.
  • Immunocytochemistry was performed as previously reported (Faseb j 2018, 32 (2), 1108-1119). Specifically, cells were fixed with 4% paraformaldehyde solution (Cat no. P231, Biosesang, Seongnam, South Korea) for 30 min. Cells were blocked by treating with 5% goat serum (Cat no. S26, Millipore) diluted in 0.2% Triton X-100 (Cat no. 0694-1L, VWR International, Radnor, PA, U.S.A.).
  • TUBB3 (1:1000; Cat no. T5076, Sigma-Aldrich) and GFAP (1:500; Cat no. Z0334, Dako, Santa Clara, CA, U.S.A.).
  • DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindole
  • PBS phosphate-buffered saline
  • Complementary DNA cDNA was synthesized using QuantiTect reverse transcriptase kit (Cat no. 205311, Qiagen, Hilden, Germany) using 1 ⁇ g of RNA per sample.
  • the primers used are shown in Table 1. qPCR was performed using a CFX Connect thermal cycler (Bio-Rad) for 40 cycles under the following conditions: 95°C for 10 s, 58°C for 15 s, and 72°C for 20 s.
  • Chromatin immunoprecipitation was performed according to the modified method described in Nature 2007, 450 (7168), 415-419 as described in Faseb j 2018, 32 (2), 1108-1119. Specifically, cells were fixed with 1% formaldehyde (Cat no. BP531, Fisher Scientific, Waltham, MA, U.S.A.) for 10 min and collected by scraping. The cell suspension was centrifuged at 700 g for 5 min and lysed in buffer. Chromatin was fragmented to 0.5-1 kb in size using a VCX-500 sonicator (Sonics & Materials, Newtown, CT, U.S.A.) equipped with a 2-mm stepped microtip. 1% volume of each sample was isolated as 1% input.
  • VCX-500 sonicator Sonics & Materials, Newtown, CT, U.S.A.
  • Chromatin was immunoprecipitated using Rabbit H3K4me3 antibody (Cat no. 07-473, Millipore) and protein A-agarose beads (Cat no. 16-157, Millipore). Chromatin was reverse-crosslinked overnight at 65°C by incubation with 200 mM NaCl. DNA fragments were purified using the QIAquick PCR Purification Kit (Cat no. 28104, Qiagen). qPCR was performed as described in 4. RT-qPCR. 1% input of each sample was reverse-crosslinked, purified, and qPCR was performed in parallel with the immunoprecipitated sample.
  • results of the bar chart are expressed as the mean ⁇ SEM or SD.
  • Two-tailed Student's t test was performed to evaluate the statistical significance of the results between two groups, and the threshold was set at p ⁇ 0.05 vs. the control group.
  • One-way ANOVA was performed to evaluate the statistical significance of the results between three or more groups, and then Dunnett's multiple comparisons test was performed with GraphPad Prism 7.00.
  • NSCs proliferate in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibrous growth factor-2 (FGF2), and differentiate into neurons and astrocytes in the absence of growth factors in the medium.
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF2 fibrous growth factor-2
  • FIG. 1a Western blot results targeting TUBB3, a neuronal marker protein, GFAP, an astrocyte marker protein, and OLIG2, a oligodendrocyte marker protein, in differentiating neurons showed that CPI-455 significantly increased GFAP protein expression compared to the control group, but there was no significant change in TUBB3 or OLIG2 expression.
  • RT-qPCR results showed that gfap mRNA expression was significantly increased in cells treated with 50 uM CPI-455 compared to the control group. This suggests that CPI-455 treatment increases astrocyte production during NSC differentiation.
  • Example 2 CPI-455 induces stellate cell production through BMP2-STAT3 signaling
  • phosphorylated STAT3 (pSTAT3) for total STAT3 was significantly increased in differentiating neurons treated with 50 uM CPI-455.
  • the Janus kinase (JAK)/STAT pathway is one of the signaling pathways involved in various cellular events, including cell differentiation, inflammation, and regeneration. It has been previously reported that the JAK/STAT pathway is involved in the regulation of astrocyte differentiation in NSCs.
  • STAT3 is activated during ciliary neurotrophic factor (CNTF)-induced astrocyte formation, and disruption of STAT3 using a dominant negative mutant has been shown to inhibit astrocyte formation.
  • STAT3 has also been reported to be a regulator of proliferation, differentiation, and self-renewal in several stem cells and cancer cells. Induction of STAT3 phosphorylation suggests that the JAK/STAT3 signaling pathway is activated during CPI-455-induced astrocytogenesis.
  • the cell fate and differentiation of NSCs are regulated by several cytokines.
  • the JAK/STAT pathway can be activated by interleukin-6 (IL-6) family cytokines, including leukemia inhibitory factor (LIF) and CNTF.
  • IL-6 interleukin-6
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • BMP2 a TGF-ß (transforming growth factor-beta) family cytokine, can also induce astrocytic differentiation in fetal mouse brain cells and NSCs. Therefore, to investigate the expression of cytokines related to astrocytic differentiation and STAT3 signaling in CPI-455-treated neurons, the levels of il-6, lif, cntf, and bmp2 were determined by RT-qPCR. As a result, as shown in Fig. 3b, bmp2 was significantly increased in neurons treated with 50 uM CPI-455.
  • bmp2 was identified as the only cytokine mRNA that showed a significant increase. Since BMP2 has been reported to induce developmental changes toward astrocyte production via activation of the Smad pathway, CPI-455-induced astrocyte production may be due to activation of the BMP2 signaling pathway. In general, LIF and BMP2 synergistically induce astrocyte production via activation of the JAK-STAT3 and Smad pathways, respectively. However, increased STAT3 phosphorylation and astrocyte production in CPI-455-induced astrocyte production were observed with increased bmp2 expression, but not with increased lif expression.
  • the present invention demonstrates a technique for inducing stem cells into astrocytes using CPI-455, thereby enabling differentiation into astrocytes without using existing stem cell differentiation inducers, and is expected to have industrial applicability as it is expected to effectively treat neurodegenerative diseases using differentiated astrocytes.

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Abstract

본 발명은 CPI-455를 포함하는 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물 등에 관한 것으로, 본 발명의 조성물을 사용하면 기존의 줄기세포 분화 촉진제를 사용하지 않고 성상세포로 분화를 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 분화된 성상세포를 이용하여 신경퇴행성 질환을 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

CPI-455를 포함하는 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물
본 발명은 CPI-455를 포함하는 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물 등에 관한 것이다.
본 발명은 2023년 4월 5일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2023-0044632호에 기초한 우선권을 주장하며, 상기 출원들의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
신경퇴행성 질환(Neurodegenerative disorders)이란 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중에서 뇌(brain) 또는 척수(Spinal cord)에서 발생하는 질환을 말하며, 현재까지 알려지지 않은 원인 또는 유전적 결함이나 환경적 요인에 의해 뇌와 척수의 특정 뇌세포군의 점진적 구조의 손실 및 기능의 손실에 의해 나타나는 질환을 말한다. 퇴행성 신경계 질환으로 인해 야기된 신경세포 사멸 또는 손상은 뇌신경계의 정보전달에 가장 중요한 뇌신경세포와 뇌신경세포 사이의 정보를 전달하는 시냅스의 형성이나 기능상의 문제, 뇌신경의 전기적 활동성의 이상적 증가나 감소를 야기하는 것으로 알려져 있다. 뇌와 척수의 신경세포들은 위치에 따라 매우 다양한 기능을 하고 있어 특정 부위의 신경세포 손상에 의해 특징적인 기능장애를 유발하며, 또 이러한 기능장애가 어떤 형태로 진행되는가에 따라 매우 다양한 임상 양상을 보인다. 이러한 퇴행성 신경계 질환에는 루게릭병으로 알려진 근 위축성 측삭 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 파킨슨씨병(Parkinson's disease: PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease: AD) 및 헌팅턴병(Huntington's disease: HD), 다발성 경화증(Multiple sclerosis: MS) 등이 있다.
한편, 현재까지 알츠하이머병에 관한 연구를 위해 주로 전뇌에 많이 존재하는 신경세포로 분화시킨 후, 병인에 관한 연구를 진행하고 있다. 전뇌 신경세포로의 분화는 특별한 외부 물질의 첨가 없이 진행되는 신경세포 분화방법에 의해 이루어지며, 최근에 'dual-SMAD inhibition'을 통한 monolayer culture 방법, embryoid body 형성을 통한 방법, cerebral organoid 형성을 통한 방법 등이 개발되고 있으며, 'glutamatergic neuron' 과 'GABAergic neuron' 모두 알츠하이머 병인 발굴에 관한 연구에 많이 이용되고 있다. 최근에 발표된 논문에 따르면, 환자유래 유도만능줄기세포를 'GABAergic neuron'으로 분화시킨 경우 아밀로이드베타에 의한 세포사멸에 좀 더 저항성이 있는 것으로 확인되었다. 즉, 특정 신경세포로의 분화에 따라 다양한 표현형이 나타날 수 있다는 것을 보여준 경우이다.
신경세포와 더불어 성상세포 또한 알츠하이머 병인에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 성상세포는 시냅스 형성 및 성숙에서 결정적인 역할을 함으로써 신경퇴행성 질환을 치료할 수 있다고 보고되어 왔다. 일반적으로, 성상세포는 신경세포와 동일한 전구세포로부터 분화가 진행되며, 두 가지 세포가 혼합되어있는 세포군에서 성상세포 특이 발현 인자를 이용한 세포 분획 및 정제가 가능하다.
한편, CPI-455가 신경 줄기세포를 성상세포로 유도하는데 효과적인지는 알려진 바 없다.
본 발명자들은 줄기세포를 성상세포로 유도하는 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 CPI-455가 신경 줄기세포를 성상세포로 유도하기 위해 처리될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 CPI-455를 유효성분으로 포함하는, 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물을 처리하여 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포를 성상세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CPI-455 또는 본 발명에 따른 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물을 포함하는, 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 CPI-455 또는 본 발명에 따른 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물의 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CPI-455를 유효성분으로 포함하는, 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CPI-455, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CPI-455, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CPI-455, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 신경퇴행성 질환 치료제 제조를 위한 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 줄기세포를 성상세포로 분화시키는 방법에 의해 제조된 성상세포를 포함하는, 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 세포치료제를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 세포치료제의 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 줄기세포를 성상세포로 분화시키는 방법에 의해 제조된 성상세포의 세포치료제 제조 용도를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CPI-455를 유효성분으로 포함하는, 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 배아생식 줄기세포 및 배아종양 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 CPI-455는 전체 조성물 대비 0.1 내지 100 μM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 CPI-455는 하기 특징 중 하나 이상을 만족할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
(a) STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)의 인산화를 촉진시킴; 및
(b) BMP2 (Bone morphogenic protein 2) 분비를 증가시킴.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물을 처리하여 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포를 성상세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 성상세포는 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)를 발현할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 CPI-455 또는 본 발명에 따른 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물을 포함하는, 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 CPI-455 또는 본 발명에 따른 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물의 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 CPI-455를 유효성분으로 포함하는, 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 줄기세포를 성상세포로 분화시키는 방법에 의해 제조된 성상세포를 포함하는, 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 근육위축 측삭 경화증, 부신백질형성 장애증, 알렉산더병, 알퍼병, 혈관확장성 운동실조증, 배튼병, 소해면양 뇌증 (BSE), 카나반병, 피질기저 퇴화, 크로이츠펠트-야콥병, 루이체들을 가진 치매, 치명적 가족성 불면증, 전두 측두엽 퇴화, 헌팅턴병, 케네디병, 크랩병, 라임병, 마카도-요세프병, 다발성 경화증, 다발성 전신 위축증, 신경 유극적혈구증, 니만-피크병, 파킨슨병, 피크병, 일차 측삭 경화증, 진행성 핵상 마비, 레프섬병, 샌드호프병, 확산성 미엘린분해 경화증, 척수소뇌성 실조증, 척수의 아급성 조합된 퇴화, 척수 매독, 테이-삭스병, 독성 뇌증, 전파가능한 해면양 뇌증, 및 불안정 헤지호그 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 CPI-455, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 CPI-455, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 CPI-455, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 신경퇴행성 질환 치료제 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세포치료제를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세포치료제의 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 줄기세포를 성상세포로 분화시키는 방법에 의해 제조된 성상세포의 세포치료제 제조 용도를 제공한다.
본 발명자들은 CPI-455를 이용하여 줄기세포를 성상세포로 유도하는 기법을 보여줌으로써, 기존의 줄기세포 분화 촉진제를 사용하지 않고 성상세포로 분화를 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 분화된 성상세포를 이용하여 신경퇴행성 질환을 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 신경 줄기세포를 EGF 및 FGF2 없이 4일 동안 0.1% DMSO, 또는 CPI-455로 처리한 후, TUBB3 (Tubulin beta 3 class III), GFAP, 및 OLIG2 (Oligodendrocyte transcription factor 2)의 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (D: DMSO, 이하 동일).
도 1b는 신경 줄기세포를 EGF 및 FGF2 없이 3일 동안 0.1% DMSO, 또는 CPI-455로 처리한 후, tubb3, 및 gfap mRNA의 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2a는 신경 줄기세포를 EGF 및 FGF2 없이 4일 동안 0.1% DMSO, 또는 CPI-455로 처리한 후, TUBB3 (녹색) 또는 항-GFAP (적색)로 면역염색한 결과를 나타낸 도면이다. (상단) 0.1% DMSO 처리, (하단) CPI-455 처리. 핵은 DAPI (청색)로 염색. 스케일 바 = 100 μm.
도 2b는 신경 줄기세포를 EGF 및 FGF2 없이 4일 동안 0.1% DMSO, 또는 CPI-455로 처리한 후, DAPI-양성 세포에 대한 TUBB3-양성 세포 및 GFAP-양성 세포의 비율을 나타낸 도면이다.
도 3a는 CPI-455를 처리한 신경 줄기세포에서 STAT3의 인산화 정도를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3b는 CPI-455를 처리한 신경 줄기세포에서 il-6, lif, cntf, 및 bmp2 mRNA의 발현을 RT-qPCR로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
본원 명세서에서 사용되는 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에서 “유효성분”은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 CPI-455를 유효성분으로 포함하는, 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, “CPI-455”는 4,7-디하이드로-6-(1-메틸에틸)-7-옥소-5-페닐-피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-카르보니트릴(4,7-dihydro-6-(1-methylethyl)-7-oxo-5-phenyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-3-carbonitrile, Cas No. 1628208-23-0)로 명명되며, 하기 화학식 1로 표시된다. 또한, CPI-455는 시판품으로서 입수하거나, 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다(Benjamin R. Leadem. NOVEL HISTONE DEMETHYLASE INHIBITORS SYNERGISTICALLY).
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본 발명에 있어서, 상기 CPI-455는 전체 조성물 대비 0.1 내지 100 uM, 1 내지 90 uM, 1 내지 80 uM, 1 내지 70 uM, 1 내지 60 uM, 1 내지 55 uM, 1 내지 50 uM, 1 내지 45 uM, 1 내지 40 uM, 10 내지 90 uM, 10 내지 80 uM, 10 내지 70 uM, 10 내지 60 uM, 10 내지 50 uM, 20 내지 80 uM, 30 내지 70 uM, 40 내지 60 uM, 43 내지 60 uM, 45 내지 60 uM, 47 내지 60 uM, 50 내지 58 uM, 50 내지 55 uM, 50 내지 54 uM, 50 내지 52 uM, 46uM, 47uM, 48uM, 49uM, 50uM, 51uM, 52uM, 53uM, 또는 54uM 의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 CPI-455는 BMP2 분비를 증가시키고, STAT3의 인산화를 촉진함으로써 신경 줄기세포의 성상세포로의 분화를 유도할 수 있는바, 하기 특징 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 한다:
(a) STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)의 인산화를 촉진시킴; 및
(b) BMP2 (Bone morphogenic protein 2) 분비를 증가시킴.
본 발명에서, "BMP2 (Bone morphogenic protein 2)"는 TGF-beta 계열 사이토카인 중 하나로, 114개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드 이량체로, 섬유아세포 성장인자와 상호작용하여 연골세포와 골모세포 전구체의 형성뿐만 아니라, 표피조직의 발생을 유도하며, 신경세포의 분화 또한 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서, “STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)” 는 STAT family 중 하나로 세포질 내에서 비활성형으로 존재하다가 여러 가지의 사이토카인 (cytokine)이나 성장인자 (growth factor), 호르몬의 자극 등에 의해 인산화가 일어난 뒤 이합체(dimer)를 형성한 후 핵 내로 이동하여 신호를 전달하는 전사조절인자(transcription factor)이다. STAT3는 다양한 종류의 유전자 발현을 조절함으로써 세포의 분화, 생존, 증식, 사멸 등을 유발시키며, 특히 많은 종양세포에서 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다. STAT3의 활성은 STAT3 인산화를 촉진하는 STAT의 upstream kinase인 Janus kinase2 (JAK2)의 인산화와 JAK2와 결합하여 활성을 억제하는 suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) 단백질 발현정도와 tyrosine phosphatase인 SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase (SHP-1)의 활성에 의해 조절된다.
본 발명에서, “줄기세포”란 미분화 상태이면서, 무한정 증식 및 성상세포로의 분화기능을 갖는 세포라면 특별히 제한되지는 않는다. 구체적으로 줄기세포로는 배아줄기세포, 성체 줄기세포, 배아생식 줄기세포, 배아종양 줄기세포 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 줄기세포는 신경 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서, “성상세포(astrocyte)”란 성상세포 마커인 GFAP 발현 수준이 증가한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물을 처리하여 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포를 성상세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 줄기세포를 성상세포로 분화시키는 방법에 의해 제조된 성상세포는 성상세포 마커인 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)를 발현하며, 줄기세포와 비교하여 GFAP 발현 수준이 증가한 것일 수 있다.
본 발명에서, “배양”은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12), RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute 1640), MEM(Minimum Essential Media) 및 Ham F10 으로부터 선택된 어느 하나의 세포 배양용 배지에서 수행될 수 있으며, 배양배지에는 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 글루타민(glutamine) 등이 추가로 첨가될 수 있다. 배양기간은 1 내지 10일, 1 내지 8일, 1 내지 6일, 2 내지 6일, 3 내지 6일, 3 내지 5일, 또는 3 내지 4일일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 '배양용 배지' 또는 '배양배지'는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 시험관 내(in vitro)에서 성상세포 등의 세포의 분화 및 증식을 위한 혼합물을 말하며, 특히, 본 발명에서 '배양용 배지'는 성상세포의 분화 및 증식을 위한 배지이다. 본 발명에서 상기 배양은 성상세포의 분화 및 증식을 포함하는 의미이다.
본 발명에서 “배지”는 당업계에 알려진 기본 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지는 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 배양 배지는 영양혼합물 (Nutrient Mixture)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 영양혼합물은 세포 배양에 일반적으로 사용되는 각종 아미노산, 비타민, 무기염 등을 포함하는 혼합물로서, 상기 아미노산, 비타민, 무기염 등을 혼합하여 제조하거나 상업적으로 제조된 영양혼합물을 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 영양혼합물은 예를 들면, B27, N2, F-12, M199, MCDB110, MCDB202, MCDB302 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 배양 배지는 성장인자를 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 성장인자는 예를 들어, EGF 또는 FGF2일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 줄기세포를 배양하는 배양액은 당해 분야에서 성상세포 분화에 통상적으로 사용되는 배지 배양액를 모두 포함한다. 배양에 사용되는 배양액은 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.
보다 상세하게는, 줄기세포를 CPI-455가 유효성분으로 포함된 조성물을 처리한 분화 배지에 배양하여 성상세포로 분화시키는 단계;를 포함하는 줄기세포를 성상세포로 분화시키는 방법일 수 있다.
상기 줄기세포로는 배아줄기세포, 성체 줄기세포, 배아생식 줄기세포, 배아종양 줄기세포 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 분화 배지는 항생제-항진균제, 및 B27로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 분화 배지는 항생제-항진균제 0.1 내지 5 %(v/v); 및 B27 0.5 내지 5 %(v/v)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 분화 배지는 성장인자 EGF 및 FGF2를 포함하지 않는 것일 수 있나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 CPI-455 또는 본 발명에 따른 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물을 포함하는, 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 키트를 제공한다.
상기 키트는 상기한 것에 한정되는 것은 아니며, 다른 시약이나 기구를 포함할 수 있다. 예를 들면, 대상 세포를 배양하기 위한 배양 플레이트나 성상세포로의 분화 상태를 평가 가능한 시약을 포함할 수 있고, 배양하는 대상이 되는 줄기세포를 구비하고 있을 수도 있다.
본 발명에 따른 키트의 제공형태는 분화 유도 배지용 첨가제, 또는 CPI-455, 또는 영양혼합물, 성장인자, 또는 기초 배지와 그 외의 시약 모두를 적절한 용량 및/또는 형태로 함유한 하나의 용기일 수 있거나, 각각 다른 용기에 의해 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 상술한 본 발명에 따른 방법을 실시하기 위한 순서 등을 기재한 설명서를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 CPI-455 또는 본 발명에 따른 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물의 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 CPI-455 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 CPI-455는 그 자체 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.
적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 프로피온산, 말레인산, 주석산, 글루콘산, 트리플루오로아세트산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아질산, 안식향산, 구연산, 젖산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약 상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응 시켜 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "신경퇴행성 질환"의 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 상기 신경퇴행성 질환의 비 제한적인 예로 알츠하이머병, 근육위축 측삭 경화증, 부신백질형성 장애증, 알렉산더병, 알퍼병, 혈관확장성 운 동실조증, 배튼병, 소해면양 뇌증 (BSE), 카나반병, 피질기저 퇴화, 크로이츠펠트-야콥병, 루이체들을 가진 치 매, 치명적 가족성 불면증, 전두 측두엽 퇴화, 헌팅턴병, 케네디병, 크랩병, 라임병, 마카도-요세프병, 다발성 경화증, 다발성 전신 위축증, 신경 유극적혈구증, 니만-피크병, 파킨슨병, 피크병, 일차 측삭 경화증, 진행성 핵상 마비, 레프섬병, 샌드호프병, 확산성 미엘린분해 경화증, 척수소뇌성 실조증, 척수의 아급성 조합된 퇴화, 척수 매독, 테이-삭스병, 독성 뇌증, 전파가능한 해면양 뇌증, 및 불안정 헤지호그 증후군으로 이루어진 군으로 부터 선택된 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물 내의 상기 화합물의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 0.001 내지 80중량% 또는 0.01 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에서 “약학적 조성물”은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨데, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화활 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는 에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 아황산수소나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
또한, 본 발명은 CPI-455, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 CPI-455, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 CPI-455, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 신경퇴행성 질환 치료제 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에서는 CPI-455을 이용하여 줄기세포를 성상세포로 분화유도하였다. 분화유도된 성상세포는 환자를 위한 세포치료제로 활용 가능성이 매우 높다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 줄기세포를 성상세포로 분화시키는 방법에 의해 제조된 성상세포를 포함하는, 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 세포치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세포치료제를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세포치료제의 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 용어 "세포치료제 (cellular therapeutic agent)"란, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품 (미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명에 따른 세포치료제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 세포치료제는 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산 과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.
본 발명에 따른 세포치료제는 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 성상세포를 포함할 수 있다. '치료학적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)'은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 치료제의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다.
본 발명에 따른 세포치료제에 포함되는 세포는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 치료제의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 성상세포의 1일 투여량은 1.0×104 내지 1.0×1011 세포/kg 체중, 바람직하게는 1.0×105 내지 1.0×109 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 세포치료제를 투여하는 것을 포함하는 치료방법을 제공한다. 여기에서 사용된 용어 포유동물은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
또한, 본 발명은 CPI-455 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하며, 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.
본 발명에서 용어, “식품학적으로 허용 가능한 염”이란 식품학적으로 허용되는 유기산, 무기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 본 발명의 CPI-455를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 CPI-455를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 CPI-455는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 명세서에 있어서, “건강기능식품”이란 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험방법]
1. 세포 배양, 화학 처리, 및 샘플링
모든 동물실험은 중앙대학교 동물실험 윤리위원회의 승인을 받았으며, 국립보건원 실험동물 관리 및 사용 지침에 따라 진행하였다.
신경 줄기 세포(Neural stem cells; NSC)는 이전에 보고된 바와 같이(Faseb j 2018, 32 (2), 1108-1119) 배양 및 수확하였다. 구체적으로, 세포는 임신한지 14일된 Sprague-Dawley rat (Orient Bio, Seongnam, South Korea) 배아로부터 대뇌 피질을 분리하여 수확하였다. 세포는 신경구(neurosphere)를 형성하도록 최종 농도가 1% 항생제-항진균제(Cat no. 15240-062 Gibco), 2% B-27 보충제(Cat no. 17504-044, Gibco), 20ng/ml EGF (Cat no. GF144, Chemicon, Burlington, MA, U.S.A.) 및 20ng/ml FGF2 (Cat no. GF003AF, Chemicon)로 혼합된 Ham's nutrient mixture F-12가 포함된 Dulbecco's modified Eagle's media(DMEM/F12)(Cat no. 12500-062, Gibco, Grand Island, NY, U.S.A.)에서 37℃, 5% CO2에서 6일 동안 인큐베이션(incubation) 하였다. 그런 다음, 신경구를 아큐타제(Accutase)(Cat No. SCR005, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.)를 사용하여 개별 세포로 해리하였다. 그런 다음, 세포를 EGF와 FGF2가 농축된 배지에서 하루 동안 배양 플레이트에 부착하였다. 다음으로, NSC를 최종 농도 1% 항생제-항균제, 2% B-27 보충제, 및 DMSO (Cat no. 472301, Sigma-Aldrich) 또는 DMSO에 용해된 각각의 농도의 CPI-455 (Cat no. HY-100421, Medchemexpress, Princeton, NJ, U.S.A.)와 혼합된 DMEM/F12 배지로 처리하였다. 배지는 2일마다 교체하였다. 웨스턴 블롯 및 면역 염색을 위한 세포는 CPI-455 처리 후 4일 동안 배양하였다. RT-qPCR 및 ChIP-qPCR을 위한 세포는 CPI-455 처리 후 3일 동안 배양하였다.
2. 웨스턴 블롯
세포를 PBS로 세척하고 얼음 위에서 NP-40 용해 완충액을 사용하여 용해하였다. 용해물을 30분 동안 16000g로 원심분리하여 전체 단백질을 정제하였다. 단백질을 8-10% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동으로 분리하여 immobilion-P PVDF membrane (Cat no. PVH00010, Millipore, Burlington, MA, U.S.A.)으로 옮겼다. 멤브레인을 TBS/0.03% Tween 20에서 5% 탈지유 또는 TBS/0.1% Tween 20에서 5% 소 혈청 알부민(TBS/0.1% Tween 20)을 사용하여 차단하였다.
다음과 같은 1차 항체를 밤새 멤브레인에 처리하였다: TUBB3 (1:3000; Cat no. T5076, Sigma-Aldrich), GFAP (1:9000; Cat No. G9269, Sigma-Aldrich), OLIG2 (1:2000; Cat No. AB9610, Millipore), GAPDH (1:1000; Cat no. sc-32233, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, U.S.A.), STAT3 (1:2000; Cat no. 4904, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, U.S.A.) 및 pSTAT3 (1:2000; Cat no. 9145, Cell Signaling Technology).
다음과 같은 2차 항체를 1시간 동안 처리하였다: Anti-mouse IgG F(ab')2 (1:5000; Cat no. ADI-SAB-100, Enzo, Farmingdale, NY, U.S.A.) 및 Anti-Rabbit IgG (1:5000; Cat no. ADI-SAB-300-J, Enzo).
웨스턴 블롯팅 루미놀 시약(Cat no. sc-2048, Santa Cruz Biotechnology)을 사용하여 CP-BU 신규 필름(Agfa, Mortsel, Belgium)에서 화학 발광(Chemiluminescence)을 검출하였다. 밴드 강도는 ImageJ 버전 2.3.0으로 측정하였다. GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)는 하우스키핑 단백질(housekeeping protein)로 측정하였다.
3. 면역세포화학(Immunocytochemistry; ICC)
면역세포화학은 이전에 보고된 바와 같이(Faseb j 2018, 32 (2), 1108-1119) 수행하였다. 구체적으로, 세포를 4% 파라포름알데히드 용액(Cat no. P231, Biosesang, Seongnam, South Korea)으로 30분 동안 고정하였다. 세포를 0.2% Triton X-100(Cat no. 0694-1L, VWR International, Radnor, PA, U.S.A.)에 희석한 5% 염소 혈청(Cat no. S26, Millipore)으로 처리하여 차단을 수행하였다.
다음과 같은 1차 항체로 세포를 1시간 동안 염색하였다: TUBB3 (1:1000; Cat no. T5076, Sigma-Aldrich) 및 GFAP (1:500; Cat no. Z0334, Dako, Santa Clara, CA, U.S.A.).
다음으로, 다음과 같은 2차 항체를 30분 동안 처리하였다: Alexa488 goat anti-mouse IgG (1:1000; Cat no. A21131, Invitrogen, Waltham, MA, U.S.A.), Cy3 goat anti-rabbit IgG (1:1000; Cat no. 111-165-144, Jackson, West Grove, PA, U.S.A.).
PBS 용액에서 0.01% DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)(Cat No. D9542, Sigma-Aldrich)를 5분 동안 처리하여 핵을 염색하였다. 형광 이미지는 Leica DM IL inverse fluorescent microscope 및 LAS X software (Leica, Wetzlar, Germany)를 사용하여 캡처하였다.
4. RT-qPCR (Reverse transcriptase-quantitative polymerase chain reaction)
TRIzol® reagent (Cat no. 15596018, Thermo Fisher, Waltham, MA, U.S.A.)를 사용하여 RNA를 추출하고, 디에틸피로카보네이트-처리수(diethylpyrocarbonate-treated water)(Cat no. C-9030, Bioneer, Daejeon, South Korea)에 용해하였다. 샘플당 1ug의 RNA를 사용하여 QuantiTect reverse transcriptase kit (Cat no. 205311, Qiagen, Hilden, Germany)로 상보적 DNA(complementary DNA; cDNA)를 합성하였다. cDNA를 iQ™SYBR® Green supermix (Cat no. 1708880, Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.) 및 각각의 정방향, 역방향 프라이머(Cosmo Genetech, Seoul, South Korea)와 혼합하였다. 사용한 프라이머는 표 1에 나타냈다. qPCR은 CFX Connect thermal cycler (Bio-Rad)를 사용하여 다음과 같은 조건으로 40 cycle 수행하였다: 95℃에서 10초, 58℃에서 15초, 72℃에서 20초.
Figure PCTKR2024004453-appb-img-000002
5. 크로마틴 면역침강(Chromatin Immunoprecipitation; ChIP)
크로마틴 면역침강은 Faseb j 2018, 32 (2), 1108-1119에 기재된 바와 같이 Nature 2007, 450 (7168), 415-419에 기재된 방법을 수정하여 수행하였다. 구체적으로, 세포를 10분 동안 1% 포름알데히드(Cat no. BP531, Fisher Scientific, Waltham, MA, U.S.A.)로 고정하고 스크래핑(scraping)하여 수집하였다. 세포 현탁액을 700g로 5분 동안 원심분리하고 완충액으로 용해하였다. 염색질은 2mm stepped microtip이 장착된 VCX-500 sonicator (Sonics & Materials, Newtown, CT, U.S.A.)를 사용하여 0.5-1kb 크기로 단편화하였다. 각 샘플의 1% 부피를 1% 입력(input)으로 분리하였다. 염색질은 Rabbit H3K4me3 항체 (Cat no. 07-473, Millipore) 및 protein A-agarose bead (Cat No. 16-157, Millipore)를 사용하여 면역침강시켰다. 염색질은 밤새 65℃ 200mM NaCl 인큐베이션에서 역가교(reverse-crosslinked) 시켰다. DNA 단편은 QIAquick PCR Purification Kit (Cat no. 28104, Qiagen)로 정제하였다. qPCR은 4. RT-qPCR에 기재된 바와 같이 수행하였다. 각 샘플의 1% 입력(input)은 역가교하고 정제하여 면역침강된 샘플과 병행하여 qPCR을 수행하였다.
6. 통계 분석
막대형 차트의 결과는 평균 ± SEM 또는 SD로 표시하였다. 두 그룹 간 결과의 통계적 유의성을 평가하기 위해 Two-tailed Student's t test를 수행하였으며, 임계값은 p<0.05 vs. 대조군(control)으로 설정하였다. 3개 이상의 그룹 간 결과의 통계적 유의성을 평가하기 위해 One-way ANOVA를 수행한 다음, GraphPad Prism 7.00으로 Dunnett's multiple comparisons test를 수행하였다.
[실시예]
실시예 1. NCS에서 성상세포 분화(astrocytic differentiation)를 유도하는 CPI-455
NSC는 표피 성장 인자(epidermal growth factor; EGF) 및 섬유 성장 인자-2(fibrous growth factor-2; FGF2)의 존재 하에 증식하며, 배지에 성장 인자가 없으면 NSC는 신경 세포와 성상세포(astrocyte)로 분화한다. CPI-455가 NSC 분화에 미치는 영향을 알아보기 위해, Sprague-Dawley rat의 14일차 배아(E14)로부터 뇌 피질 조직(brain cortical tissue)을 채취하고 일주일 동안 EGF와 FGF2가 있는 상태에서 NSC를 증식시켰다. 그런 다음 성장 인자가 없는 NSC에 CPI-455 또는 DMSO(0.1%) 대조군을 처리하여 4일 동안 분화를 유도하였다.
분화중인 신경 세포에서 신경 세포 표지 단백질인 TUBB3, 성상세포 표지 단백질인 GFAP, 희소돌기아교세포 표지 단백질인 OLIG2를 표적으로 한 웨스턴 블롯 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, CPI-455는 대조군과 비교하여 GFAP 단백질 발현을 유의하게 증가시켰으나 TUBB3 또는 OLIG2 발현에서는 유의성 있는 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다. RT-qPCR 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 50 uM CPI-455를 처리한 세포에서 gfap mRNA 발현이 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 이는 NSC 분화 동안 CPI-455를 처리하면 성상세포 생성(astrocytogenesis)이 증가하는 것을 의미한다.
또한, GFAP의 유도가 성상세포의 증가에 의한 것인지 또는 개별 세포에서의 단백질 발현의 증가에 의한 것인지를 알아보기 위해, NSC 분화 동안 성상세포 비율을 평가하기 위해 면역세포화학(ICC)을 수행하였다. 그 결과, 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 분화중인 NSC에 50 uM의 CPI-455를 처리할 경우, GFAP-양성 세포 수가 유의하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 대조적으로, TUBB3-양성 세포의 비율은 대조군과 CPI-455 처리군 간에 유의한 차이가 나타나지 않았다. DAPI-양성 세포 수는 대조군과 CPI-455 처리 세포 간에 유의한 차이가 나타나지 않았다. 이는 NSC 분화 동안 CPI-455 처리가 세포 독성을 유발하지 않으면서 성상세포 생성을 향상시키는 것을 의미한다.
실시예 2. BMP2-STAT3 신호로 성상세포 생성을 유도하는 CPI-455
CPI-455로 처리한 NSC에서 성상세포가 생성되는 메커니즘을 확인하기 위해 STAT3 발현과 인산화를 측정하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 50 uM의 CPI-455 처리로 분화중인 신경 세포에서 전체 STAT3에 대한 인산화 STAT3(pSTAT3)가 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. JAK(Janus kinase)/STAT 경로는 세포 분화, 염증 및 재생을 포함한 여러 세포 사건에 관여하는 신호 전달 경로 중 하나이다. JAK/STAT 경로가 NSC에서 성상세포 분화 조절에 관여한다는 것이 이전에 보고되었다. STAT3는 CNTF(ciliary neurotrophic factor)-유도 성상세포 생성 과정에서 활성화되며, 우성 음성(dominant negative) 돌연변이를 사용한 STAT3의 교란은 성상세포 생성을 억제하는 것으로 나타났다. STAT3는 또한 여러 줄기세포와 암세포에서 증식, 분화 및 자기 재생의 조절자로 보고되었다. STAT3 인산화의 유도는 JAK/STAT3 신호 경로가 CPI-455-유도 성상세포 생성 과정에서 활성화된다는 것을 의미한다.
NSC의 세포 운명과 분화는 여러 사이토카인에 의해 조절된다. JAK/STAT 경로는 LIF(leukemia inhibitory factor) 및 CNTF를 포함한 IL-6(interleukin-6) 계열 사이토카인에 의해 활성화될 수 있다. TGF-ß(transforming growth factor-beta) 계열 사이토카인인 BMP2는 태아 마우스 뇌 세포와 NSC에서 성상세포 분화를 유도할 수도 있다. 따라서, CPI-455-처리 신경세포에서 성상세포 분화 및 STAT3 신호와 관련된 사이토카인 발현을 조사하기 위해, RT-qPCR로 il-6, lif, cntf, 및 bmp2의 수준을 확인하였다. 그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 50uM의 CPI-455로 처리된 신경 세포에서 bmp2가 유의하게 증가하는 것을 확인하였다.
흥미롭게도, NSC에서 성상세포 생성을 유도하는 것으로 알려진 조사된 사이토카인 중, bmp2가 유의한 증가를 보인 유일한 사이토카인 mRNA인 것으로 확인되었다. BMP2는 Smad 경로의 활성화를 통해 성상세포 생성으로의 발달 변화를 유도하는 것으로 보고되었기 때문에, CPI-455에 의한 성상세포 생성은 BMP2 신호 경로의 활성화로 인한 것일 수 있다. 일반적으로, LIF와 BMP2는 각각 JAK-STAT3와 Smad 경로의 활성화를 통해 성상세포 생성을 상승적을 유도한다. 그러나, CPI-455-유도 성상세포 생성에서 증가된 STAT3 인산화 및 성상세포 생성은 lif 발현의 증가 없이 bmp2 발현의 증가와 함께 관찰되었다. 이러한 lif 발현과 STAT3 인산화 사이의 불일치는 STAT3의 인산화를 포함하는 비표준 BMP2-STAT3 신호 경로 때문인 것으로 추측하였다. 실제로, BMP2-STAT3 경로는 LIF 자극 없이 성상세포 생성을 유도할 수 있는 경로로 보고되고 있다. 인간 구강 암종 세포에 대한 재조합 BMP2 처리는 또한 STAT3 인산화를 증가시켰으며, 이는 BMP2 자극이 신호 전달 동안 STAT3 인산화를 증가시킨다는 주장을 뒷받침하였다.
STAT3 인산화 및 BMP2 신호에 대한 이러한 결과를 고려하여, CPI-455의 성상세포 생성 효과는 비표준 BMP2-STAT3 신호 경로를 통한 Gfap 프로모터의 활성화에 의해 유도되는 것으로 추측되었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 CPI-455를 이용하여 줄기세포를 성상세포로 유도하는 기법을 보여줌으로써, 기존의 줄기세포 분화 촉진제를 사용하지 않고 성상세포로 분화를 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 분화된 성상세포를 이용하여 신경퇴행성 질환을 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 기대됨으로 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (18)

  1. CPI-455를 유효성분으로 포함하는, 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 배아생식 줄기세포, 및 배아종양 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 분화 유도용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 CPI-455는 전체 조성물 대비 0.1 내지 100 μM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 분화 유도용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 CPI-455는 하기 특징 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는, 분화 유도용 조성물:
    (a) STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)의 인산화를 촉진시킴; 및
    (b) BMP2 (Bone morphogenic protein 2) 분비를 증가시킴.
  5. 제1항에 따른 조성물을 처리하여 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포를 성상세포로 분화시키는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 성상세포는 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)를 발현하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. CPI-455 또는 제 1항의 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물을 포함하는, 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 키트.
  8. CPI-455 또는 제 1항의 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물의 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도 용도.
  9. CPI-455를 유효성분으로 포함하는, 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 근육위축 측삭 경화증, 부신백질형성 장애증, 알렉산더병, 알퍼병, 혈관확장성 운동실조증, 배튼병, 소해면양 뇌증 (BSE), 카나반병, 피질기저 퇴화, 크로이츠펠트-야콥병, 루이체들을 가진 치매, 치명적 가족성 불면증, 전두 측두엽 퇴화, 헌팅턴병, 케네디병, 크랩병, 라임병, 마카도-요세프병, 다발성 경화증, 다발성 전신 위축증, 신경 유극적혈구증, 니만-피크병, 파킨슨병, 피크병, 일차 측삭 경화증, 진행성 핵상 마비, 레프섬병, 샌드호프병, 확산성 미엘린분해 경화증, 척수소뇌성 실조증, 척수의 아급성 조합된 퇴화, 척수 매독, 테이-삭스병, 독성 뇌증, 전파가능한 해면양 뇌증, 및 불안정 헤지호그 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  11. CPI-455, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료 방법.
  12. CPI-455, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료 용도.
  13. CPI-455, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 신경퇴행성 질환 치료제 제조를 위한 용도.
  14. 제5항의 방법에 의해 제조된 성상세포를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 세포치료제.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 근육위축 측삭 경화증, 부신백질형성 장애증, 알렉산더병, 알퍼병, 혈관확장성 운동실조증, 배튼병, 소해면양 뇌증 (BSE), 카나반병, 피질기저 퇴화, 크로이츠펠트-야콥병, 루이체들을 가진 치매, 치명적 가족성 불면증, 전두 측두엽 퇴화, 헌팅턴병, 케네디병, 크랩병, 라임병, 마카도-요세프병, 다발성 경화증, 다발성 전신 위축증, 신경 유극적혈구증, 니만-피크병, 파킨슨병, 피크병, 일차 측삭 경화증, 진행성 핵상 마비, 레프섬병, 샌드호프병, 확산성 미엘린분해 경화증, 척수소뇌성 실조증, 척수의 아급성 조합된 퇴화, 척수 매독, 테이-삭스병, 독성 뇌증, 전파가능한 해면양 뇌증, 및 불안정 헤지호그 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 세포치료제.
  16. 제14항에 따른 세포치료제를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 방법.
  17. 제14항에 따른 세포치료제의 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료 용도.
  18. 제5항의 방법에 의해 제조된 성상세포의 세포치료제 제조 용도.
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