KR20170081783A - 신경줄기세포의 분화 조절을 위한 신규 벤조티아졸 유도체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경줄기세포의 분화 조절을 위한 신규 벤조티아졸 유도체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서, 유기 합성적인 방법으로 제조한 신규한 벤조티아졸 유도체를 신경줄기세포에 처리함으로써, 신경세포로의 분화를 촉진시킬 수 있음을 확인하였는바, 신경세포 손상 질환의 치료제로 유용하게 이용할 수 있으며, 상기 신경세포로의 분화 촉진 과정에서, LIF IL-6, 및 CNTF 등의 사이토카인의 분비의 현격한 증가를 확인하였는바, 이들을 생산하기 위한 시약 등으로도 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

신경줄기세포의 분화 조절을 위한 신규 벤조티아졸 유도체 및 이의 용도 {Novel benzothiazole derivatives for differentiation of neural stem cells and use thereof}

본 발명은 신경줄기세포의 분화 조절을 위한 신규 벤조티아졸 유도체 및 이의 용도에 관한 것이다.

난치병으로 알려진 뇌졸중(stroke), 알츠하이머병, 파킨슨병, 탈수초질환(demyelinating disease), 및 척추 손상(spinal cord injury) 등은 신경세포 손상에 의해 신경 기능에 이상이 생기는 질환으로서, 환경, 유전 등의 요인에 의하여 신경세포가 퇴화, 감소, 세포사하거나 상해를 입는 경우에 발병하며, 평균 수명의 증가, 및 고령화 사회로 빠르게 진입함에 따라 상기 질환에 의해 고통을 받고 있는 환자의 수가 급증하고 있는 추세이다.

한편, 신경 세포 손상에 의한 질환들로 인해 손상된 신경세포는 재생되지 않아 근본적인 치료가 어려운 실정이며, 상기 질환의 치료를 위해 일반적으로 이용되고 있는 약물요법이나 외과적 수술법은 손상된 세포뿐만 아니라, 다른 정상적인 세포까지 영향을 미쳐 부작용을 유발시키는 바, 치료에 어려움을 겪고 있다.

최근에는 질환에 의해 파괴되거나 손상받은 세포를 외부로부터 공급해주는 세포 대체 요법 (cell replacement therapy)이 효과적인 치료법으로 주목을 받고 있으며, 이러한 세포 치료 요법 중에서도 재생이 필요한 조직으로 증식 및 분화가 가능한 줄기세포 (stem cell)를 이용한 치료법이 각광을 받고 있다. 특히, 뇌신경계 조직은 다른 조직과는 달리 면역거부반응이 거의 없기 때문에, 신경줄기세포를 이식하였을 때, 이식된 세포의 장 기간 생존을 기대할 수 있다. 따라서 신경세포 손상에 의해 유발되는 다양한 신경 질환의 치료법으로서, 신경줄기세포를 이용한 세포 치료제에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있다.

신경줄기세포는 신경계에 존재하는 전구세포 (progenitor cell)의　서브타입으로, 성상세포 (astrocytes), 희돌기교세포 (oligodendrocytes), 뉴런 (neurons)으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 중추신경계 (CNS)와 말초신경계 (PNS)에서 분리하여 다세포성 뉴로스피어(Multicellular neurospheres)를 만들 수 있고 이 세포가 각각의 조건에서 글리아 (glia) 계통과 신경 계통으로 분화된다고 알려져 있다.

내인성 신경줄기세포도 성체에 존재하는데 알츠하이머 병으로 손상받는 부위인 해마 및 여러 다른 뇌 부위에도 신경줄기세포가 존재하므로 내인성 신경줄기세포의 분화를 조절하는 물질을 개발하는 것은 추후 치료제 개발의 가능성을 높여주게 된다.

다만, 세포 치료제로서의 신경줄기세포의 유용성을 높이기 위해서는 신경줄기세포를 효율적으로 특정 세포로 분화시키는 기술이 필요하며, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 (한국공개특허 10-2014-0130593), 아직은 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 신경줄기세포의 분화 조절을 위한 신규 물질을 찾고자 예의 연구한 결과, 신경줄기세포에서 신경세포로의 우수한 분화 촉진 효과를 나타내는 벤조티아졸 유도체를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 벤조티아졸 유도체 또는 이의 염을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화유도용 조성물 및/또는 신경세포 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화유도용 조성물을 신경줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물 또는 이의 염을 신경줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 사이토카인 생산방법을 제공한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 벤조티아졸 유도체 또는 이의 염을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화유도용 조성물 및/또는 신경세포 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 신경세포는 성상세포 (astrocyte)일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 벤조티아졸 유도체 또는 이의 염을 5 내지 9 μM의 농도로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 백혈병 억제인자 (LIF, Leukemia inhibitory factor), 인터류킨-6 (IL-6, interleukin-6), 뼈형성단백질 (BMP2, Bone morphogenic protein 2), 및 섬모 향신경성 인자 (CNTF, Ciliary neurotrophic factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 사이토카인의 분비를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 신경세포 손상 질환은 파킨슨씨병, 알츠하이머, 피크병(Pick's disease), 헌팅톤병 (Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(amyotriophic lateral sclerosis), 허혈성 뇌질환 (stroke), 탈수초질환 (demyelinating disease) 및 척추 손상 (spinal cord injury)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 분화유도용 조성물을 신경줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 염을 신경줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 사이토카인의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 분화인자는 LIF (Leukemia inhibitory factor), IL-6 (interleukin-6), BMP2 (Bone morphogenic protein 2), 및 CNTF (Ciliary neurotrophic factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경세포 손상 질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명은 상기 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물의 신경세포 손상 질환의 치료용도를 제공한다.

본 발명은 신경줄기세포의 분화 촉진 활성을 갖는 신규 벤조티아졸 유도체 및 이를 포함하는 신경세포로의 분화유도용 조성물 및/또는 신경세포 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서, 유기 합성적인 방법으로 신규한 벤조티아졸 유도체를 합성하였으며, 신경줄기세포에 상기 유도체를 처리함으로써, 신경세포로의 분화를 촉진시킬 수 있음을 확인하였는바, 신경세포 손상 질환의 치료제로 유용하게 이용할 수 있다.

아울러, 상기 유도체의 처리에 의한 신경세포로의 분화 촉진 과정에서, LIF, IL-6, 및 CNTF 등의 사이토카인의 분비의 현격한 증가를 확인하였는바, 이들을 생산하기 위한 시약 등으로도 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은, 다양한 벤조티아졸 유도체 처리 (화합물 1 내지 10)에 따른 성상세포로의 분화를 (a) 형광현미경으로 확인한 결과, 및 (b) 정량화한 결과이다.
도 2는, 다양한 농도 (5.0, 7.5, 10.0, 및 20.0μM)의 화합물 5를 처리한 신경줄기세포에서, (a) 분화된 성상세포를 형광현미경으로 확인한 결과, (b) 분화된 성상세포의 수를 정량화한 결과, (c) 분화된 뉴런의 수를 정량화한 결과, 및 (d) 전체 세포의 수를 정량화한 결과이다.
도 3은, 7.5μM의 화합물 5를 처리한 신경줄기세포에서, 성상세포의 마커인 GFAP 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 4는, 화합물 5 또는 이의 구조이성질체인 화합물 5′를 처리한 신경줄기세포에서, GFAP의 발현을 정량화하여 비교한 결과이다.
도 5는, 화합물 5를 처리한 신경줄기세포에서, (a) STAT3, 및 (b) SMAD1/5/8의 인산화 정도를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 6은, 화합물 5를 처리한 신경줄기세포에서, (a) LIF, (b) IL-6, (c) BMP-2, 및 (d) CNTF mRNA의 발현을 정량화한 결과이다.
도 7은, 화합물 5를 처리한 신경줄기세포에서, (a) miR-9, (b) miR-124, 및 (c) miR-29a의 발현을 정량화한 결과이다.
도 8은, 화합물 5를 처리한 신경줄기세포에서, ERK 1/2의 인산화 정도를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 9는, 화합물 5를 처리한 신경줄기세포에서, (a) TGF-β1, (b) FGF2, 및 (c) FGF8 mRNA의 발현을 정량화한 결과이다.
도 10은, 화합물 5의 처리에 따른 신경줄기세포에서 성상세포로의 분화 촉진 과정에서, 관련 인자간 상호관계를 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 11은, 화합물 5의 처리에 따른 신경줄기세포에서 성상세포로의 분화 촉진 과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.

본 발명자들은, 신경줄기세포에서 신경세포인 성상세포로의 분화를 촉진하는 벤조티아졸 유도체를 유기 합성적인 방법으로 제조하였으며, 구체적인 실험을 통하여 최적의 효과를 얻을 수 있는 유도체의 농도를 도출하였다. 또한, 상기 유도체를 처리함에 따라 STAT3, SMADs 및 ERK 1/2의 인산화가 증진되고, 관련 분화인자들이 현저하게 증가함을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 (2-페닐-N-(2-페닐벤조[d]티아졸-7-일)아세트아마이드) 또는 이의 염을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 실시예 2의 제조방법을 통해 제조될 수 있으나, 이는 화합물 제조방법의 일례에 해당할 뿐이다. 예를 들어 반응용매, 염기 반응물질의 사용량과 같은 반응 조건들이 상기에서 설명된 것으로만 한정되는 것은 아니며, 당업계에서 통상의 지식을 가진 기술자에게 알려진 공지의 다양한 합성방법을 이용하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "염"은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1로 표시되는 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수도 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면, 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 유기 합성적인 방법을 통하여 신규한 벤조티아졸 유도체를 제조하였으며, 상기 제조된 벤조티아졸 유도체 중 화합물 5를 신경줄기세포에 처리한 경우, 성상세포로의 분화가 촉진됨을 확인할 수 있었다 (실시예 2 및 3 참조). 또한, 이러한 결과에 기초하여, 7.5 μM 농도의 화합물 5를 처리한 경우, 무해하면서도 효율적으로 성상세포로의 분화를 촉진시킬 수 있었으며, STAT3, SMADs 및 ERK 1/2의 인산화, 및 이와 관련된 인자들의 발현을 증진시킬 수 있었는바, 본 발명에 따른 2-페닐-N-(2-페닐벤조[d]티아졸-7-일)아세트아마이드는 신경세포로의 분화용 조성물 및 뇌신경세포 손상 질환의 치료제로 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화유도용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "신경줄기세포"는 신경축의 모든 부위에서 모든 분화된 신경세포 타입으로 발생할 수 있는 가능성을 지닌 자가 재생하는 원시 미성숙 세포로서, 상기 분화된 신경세포는 일반적으로 뉴런(Neuron), 성상세포 (astrocyte), 희소돌기아교세포 (Oligodendrocyte)를 의미하나, 바람직하게 성상세포일 수 있다.

본 발명에 따른 분화유도용 조성물은 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화를 유도하는 점에 기술적 특징이 있으며, 상기 조성물 내 유효성분인 화학식 1로 표시되는 화합물은 바람직하게 5 내지 9 μM, 가장 바람직하게는 7.5 μM 농도로 포함될 수있다.

또한, 상기 조성물은 STAT3, SMADs 및 ERK 1/2의 인산화 관련 인자들의 발현을 증가시켜 신경세포, 즉 성상세포로의 분화를 유도하며, 상기 인자들은 바람직하게 LIF (Leukemia inhibitory factor), IL-6 (interleukin-6), BMP2 (Bone morphogenic protein 2), 및 CNTF (Ciliary neurotrophic factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 다른 양태로서, 상기 분화유도용 조성물을 신경줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 신경세포 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 신경세포 손상 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 신경세포 손상 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 예방 또는 치료의 대상인 신경세포 손상 질환은 신경세포 손상에 의해 신경 기능에 이상이 생기는 질환으로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게 피크병(Pick's disease), 헌팅톤병 (Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(amyotriophic lateral sclerosis), 허혈성 뇌질환 (stroke), 탈수초질환 (demyelinating disease) 및 척추 손상 (spinal cord injury)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경세포 손상 질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명에서, "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 신경줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 사이토카인의 생산방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "사이토카인"은 신체의 방어체계를 제어하고 자극하는 신호물질로서, 바람직하게는 신경세포로의 분화를 촉진하는 물질로 LIF (Leukemia inhibitory factor), IL-6 (interleukin-6), BMP2 (Bone morphogenic protein 2), 및 CNTF (Ciliary neurotrophic factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 화합물의 정제 및 분석

플래쉬 컬럼 크로마토그래피는 Silica gel 60 (230-400 mesh; Millipore, Darmstadt, Germany)을 이용하여 수행하였다. ¹H NMR spectra는 JEOL 사의 JNM-LA 300 모델과 Bruker 사의 Avance 400 MHz FT-NMR spectrometer에 기록되었으며, 화학적 이동(Chemical Shift)은 테트라메틸실레인(tetramethylsilane)을 기준으로 하여, ppm 단위로 표기하였다. 질량 분석은 VG 사의 Trio-2 GC-MS와 Aligent 사의 6460 Tiple Quad LC/MS를 이용하여 수행하였다.

1-2. 신경줄기세포의 배양

E14의 랫트 (Sprague-Dawley rats, Orient Bio Inc., Gyeonggi-do, Korea) 배아의 피질로부터 신경줄기세포 (Neural stem cell, NSC)를 동정하였다. 이후, 분리된 신경줄기세포 (200,000 cells/ml)를 1% (v/v)의 PSA, 2% (v/v)의 B27 (Gibco, NY, USA), 20ng/ml의 EGF, 및 20ng/ml의 FGF2 (Chemicon, CA, USA)가 첨가된 Dulbecoo's modified Eagle's 배지/F12에서 신경구 (neurosphere) 형태로 증폭시켰으며, 이를 다시 37℃, 5%의 CO₂ 조건 하에서 배양시켰으며, 이때 배지는 2 일에 한 번씩 교체하였다. 이로부터 6일 경과 후, 단일 신경줄기세포의 현탁물을 생성하기 위하여, 상기 신경구에 accutase (Chemicon)를 처리한 뒤, 37℃에서 10분간 배양하고, 0.01%의 poly-D-lysine (Sigma-Aldrich)과 10㎛/ml의 laminin(Invitrogen, CA, USA)으로 코팅된 조직 배양 플레이트에 분주하였다. 증식 1일 후, 성장인자의 공급없이 분화를 유도하였으며, 실험이 진행되는 동안, 0.1%의 DMSO (Sigma-Aldrich)와 합성된 화합물, 및 10ng/ml의 CNTF 또는 20μM의 Pd98059 (Mollipore, CA, USA)를 신경줄기세포에 처리하였다.

1-3. 면역세포화학 분석

면역세포화학 분석을 위하여, 세포 배양물을 4% 파라포름알데히드에서 30분 동안 고정시키고 인산 완충액 (PBS)으로 세척하였다. 고정된 세포를 5% 정상 염소 혈청 (Milipore) 및 0.2%의 트리톤 X-100 (Amresco, OH, USA)로 30분 동안 blocking한 후, β-튜블린 III (TuJ1, 모노클로날; 1:1000; Sigma-Aldrich), 신경교섬유질산성단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP, 폴리클로날; 1:1000; Dako)에 대한 1차 항체와 함께 1시간 이상 배양하였다. 이를 PBS로 세척한 후, 상기 세포를 Alex Fluor 488 (goat anti-mouse IgG, 1:1000; Invitrogen) 또는 Cy3 (goat anti-rabbit IgG, 1:000; Jackson ImmunoResearch, PA, USA)와 결합된 2차 항체와 함께 30분 동안 배양하였다. 핵 염색을 위해 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) (1:10,000 in PBS; Sigma-Aldrich)을 첨가하였으며, 역상 형광 현미경(DMIL; Leica, Hesse, Germany)을 이용하여 이미지를 얻었다. 실험의 오차를 줄이기 위해 영상은 임의적으로 선택하였으며, 이로부터 TuJ1-양성, GFAP-양성, 또는 DAPI-양성 세포의 수를 산출하였다. TuJ1-양성, 또는 GFAP-양성 세포 수를 DAPI-양성 세포의 수로 나누어 % 값으로 수치화하였으며, 화합물을 처리한 군에서의 % 값을 대조군의 % 값으로 나누어 Fold 값으로 수치화하였다.

1-4. 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응

TRIzol 시약 (invitrogen)을 사용하여 세포 배양물로부터 총 RNA를 추출하였으며, 20μL의 반응 용액 내에서, QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Limburg, Nethelands)를 사용하여 1μg의 총 RNA로부터 First-strand complementary DNA (cDNA)를 합성하였다. Real-time RT PCR은 iQ SYBR green supermix (Bio-Rad,CA,USA)를 이용하여 수행하였으며, 하기의 조건 하에서 PCR을 수행하였다: 우선, 95℃에서 30초간 반응시킨 후, 1) 주형의 이중가닥 DNA를 변성시키는 단계 (denaturation)로 95℃에서 10초간; 2) 주형과 프라이머가 결합하는 단계 (annealing)로 58℃에서 15초간; 3) 새로운 가닥을 합성하는 단계 (extension)로 72℃에서 20초간 반응시켰고, 이와 같은 단계를 30번 반복하였으며, 내부 대조군으로 항존 유전자 (housekeeping gene)인 gapdh를 이용하였다. DMSO 또는 제조된 화합물의 처리에 따른 신경줄기세포간 유전자 발현 비율은 ratio = 2^{C(t)DMSO/△(t)compound}에 의하여 산출하였다. 여기서, C_(t)DMSO는 DMSO가 처리된 신경줄기세포의 C_(t)target gene에서 C_(t) gapdh을 뺀 값을 의미하며, C_(t)compound는 제조된 화합물이 처리된 신경줄기세포의 C_(t)target gene에서 C_(t) gapdh을 뺀 값을 의미한다.

1-5. 웨스턴 블롯

신경줄기세포를 PBS로 세척하고, 용해 완충액 (50mM의 HEPES, 5mM의 EDTA, 50mM의 NaCl, 1%의 Triton X-100, 1%의 NP-40 (Amresco), Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific, IL, USA), 1mM의 phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.01mg/ml의 leupeptin 및 0.01mg/ml의 aprotinin (Sigma-Aldrich))을 첨가하여 용해시켰으며, 이를 25200xg로 30분 동안 원심분리시켜 잔해물들을 제거하였다. 단백질들은 SDS(sodium dodecyl sulfate) 샘플 완충액 (60mM의 tris-HCl; pH 6.8, 25%의 glycerol, 2%의 SDS, 0.1%의 bromophenol blue (Ameresco), 14.4mM의 β-mercaptoethanol (Bio-Rad), 및 증류수)에서 5분 동안 끓였다. 이를 SDS polyacrylamide gel 상에 전기영동으로 분리하고, polyvinylidenedifluoride 멤브레인으로 이동시킨 후, 상기 멤브레인을 0.03-0.1%의 Tween20 (Amersco)가 첨가된 20mM의 Tris-buffered saline에서, 5%의 non-fat dry milk 또는 소 혈청 알부민(Millipore, IL, USA)으로 blocking시켰다. 이후, 1차 항체인 항-GFAP(1:500), TuJ1(1:2000)(Sigma-Aldrich), 항-STAT3(1:2000), 항-phospho-STAT3 (tyr705, 1:2000), 항-phospho-Smad1(Ser463/465)/Smad5 (Ser463/465)/Smad8 (Ser426/428) (1:1000), 항-ERK1/2 (1:4000), 항-phospho-ERK1/2(Thr202/Tyr204, 1:4000)(Cell Signaling, MA, USA) 및 GAPDH (1:1000, Santa Cruz, CA, USA)를 처리한 후, 4℃에서 밤새도록 배양하였다. 항원-항체 반응은 HSP (Horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항-마우스 또는 항-토끼 IgG 항체 (1:5000; Santa Cruz)와 함께 배양한 후, Western Blotting Luminol Reagent (Santa Cruz)를 처리하여 확인하였다.

1-6. miRNA 발현의 검출

제조사의 지침에 따라 miScript PCR system (Qiagen)을 이용하여, rno-miR-9, rno-miR-124 및 rno-miR-29a의 발현을 분석하였다. TRIzol 시약 (invitrogen)을 사용하여 miRNA를 포함하는 총 RNA를 추출하였으며, miScript II RT kit를 이용하여 2μg의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. Real-time PCR은 Rn_miR-9_1, Rn_miR-124_1, Rn_miR-29a_2 및 Hs_RNU6-2_11의 miScript Primer Assays 및 miScript SYBR Green PCR kit를 이용하여 수행하였다. 상기 PCR 반응은 95℃에서 15분 동안 반응시킨후, 94℃에서 15초간, 55℃에서 30초간, 및 70℃에서 30초간 진행되는 반응을 1 사이클로 하여 40회 반복 실시하였다. 정량화를 위하여, U6 small nuclear RNA (RNU6)를 이용하였다.

1-7. 통계학적 분석

모든 실험결과는 평균 ± 표준편차 또는 평균의 표준오차 나타내었으며, Student's t-test를 이용하여 통계학적 유의성을 검정하였다 (^*P<0.05, ^**P<0.01)

실시예 2. 2-페닐- N -(2-페닐벤조[d]티아졸-7-일)아세트아마이드 (2-Phenyl- N -(2-phenylbenzo[ d ]thiazol-7-yl) acetamide, 화합물 5)의 제조

본 실시예에서는, 하기 반응식 1에 도시한 바와 같이, N-(3-브로모페닐)벤조티오아마이드로부터 2-페닐-N-(2-페닐벤조[d]티아졸-7-일)아세트아마이드를 합성하였다.

[반응식 1]

2-1. 7-브로모-2-페닐벤조[ d ]티아졸 (7-Bromo-2-phenylbenzo[ d ]thiazole)의 제조

질소가 공급되는 조건 하에서, CF₃CH₂OH (3mL)에 N-(3-브로모페닐)벤조티오아마이드(N-(3-Bromophenyl)benzothioamide)를 용해시킨 혼합 용액에 PIFA (Bis(trifluoroacetoxy)iodo)benzene; Sigma-Aldrich)를 첨가하였다. 이후, 상기 혼합 용액을 실온에서 2시간 동안 교반시킨 후, 감압 상태에서 농축시키고, 실리카 겔 (100-200 mesh) 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 7-브로모-2-페닐벤조[d]티아졸을 수득하였다.

2-2. 2-페닐벤조[ d ]티아졸l-7-아민 (2-Phenylbenzo[ d ]thiazol-7-amine)의 제조

1,4-dioxane (10mL)에 7-브로모-2-페닐벤조[d]티아졸과 벤조페논이민을 용해시킨 혼합 용액에 CS₂CO₃ (357mg, 1.1mmol)를 첨가하고, 5분간 아르곤 가스를 제거하였다. Pd₂dba₃ (45mg, 0.05mmol) 및 Xantphos (29mg, 0.05mmol)를 첨가하고, 가스를 제거한 후, 100℃에서 18시간 동안 가열하였다. 실온에서 상기 반응 혼합물을 식히고, 셀라이트 패드에 통과시킨 후, EtOAC (20mL), 및 brine (25mL)으로 세척, NaSO₄로 건조시키고, 감압 조건 하에서 농축시켰다. 이후, 잔류물은 메탄올 (8mL)에 용해시킨 2M의 HCl (1mL)과 함께 30분 동안 교반시키면서 희석시킨 뒤, 휘발성 물질을 증발시켰다. 증류수 (10mL)로 이를 다시 희석시키고, NH₄OH로 중화시킨 뒤, EtOAc (2x15mL)로 추출하였다. EtOAc 층을 분리하고, Na₂SO₄로 건조시킨 후, 감압 조건 하에서 농축시켰다. EtOAc/Pet ether (1:4)를 용출 용매로 이용한 실리카겔 (100-200 mesh) 칼럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 페닐벤조[d]티아졸l-7-아민을 수득하였다.

2-3. 2-페닐- N -(2-페닐벤조[d]티아졸-7-일)아세트아마이드 (2-Phenyl- N -(2-phenylbenzo[ d ]thiazol-7-yl)acetamide)의 제조

0℃에서 DCM (~10mL)에 페닐벤조[d]티아졸l-7-아민 (1.0eq)을 용해시킨 혼합 용액에 페닐아세틸 클로라이드 (Phenylacetyl chloride, 1.0eq) 및 트리에틸아민 (triethylamine, 1.0 eq)을 첨가하였다. 이후, 상기 혼합 용액을 증류수 (10mL)로 희석시키고, DCM 층을 분리하고, Na₂SO₄로 건조시킨 후, 감압 조건 하에서 농축시켰다. Hexane/EtOAc (1:1)을 용출 용매로 이용한 실리카겔 (100-200 mesh) 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 2-페닐-N-(2-페닐벤조[d]티아졸-7-일)아세트아마이드를 수득하였다.

(White solid; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.09-8.06 (m, 2H), 7.78-7.72 (m, 2H), 7.57-7.38 (m, 6H), 7.32-7.30 (m, 3H), 6.01 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.90 (s, 2H); MS (ESI) m/z 345.1 [M+H]+.)

실시예 3. 성상세포로의 분화 촉진 효과 확인

신경줄기세포 (NSC)는 EGF (Epidermal growth factor) 및/또는 FGF (Fibroblast growth factor) 존재 하에서 증식이 진행되는 반면, 상기 인자들이 결여된 경우, 뉴런 또는 글리아 세포 등으로 분화가 진행된다. 본 실시예에서는, 상기 실시예 2에서 합성한 화합물 5(2-페닐-N-(2-페닐벤조[d]티아졸-7-일)아세트아마이드)를 포함하는 벤조티아졸 유도체가 신경줄기세포의 분화 과정에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 본 실시예에서의 벤조티아졸 유도체는 하기 표 1 및 표 2에 나타내었으며, 실시예 1-3에서 기술한 바와 같이, 면역세포화학 분석을 통해 신경줄기세포에서 성상세포 (Astrocyte)로의 분화 정도를 평가하였다.

[표 1]

[표 2]

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 신경줄기세포에 화합물 5를 처리한 경우, 다른 벤조티아졸 유도체에 비해 신경줄기세포로부터 분화된 다수의 성상세포가 관찰되었으며, 정량적으로, 화합물 5를 처리한 군은 대조군에 비해 약 4.82배 가량 증가됨을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, 본 발명에 따른 2-페닐-N-(2-페닐벤조[d]티아졸-7-일)아세트아마이드는 신경줄기세포에서 성상세포로의 분화를 촉진시킴을 알 수 있었다.

실시예 4. 성상세포로의 분화 촉진을 위한 최적의 농도 도출

상기 실시예 3의 결과에 기초하여, 성상세포로의 분화를 효과적으로 촉진시킬 수 있는 화합물 5의 구체적인 농도를 확인하고자 하였다. 구체적으로, EGF 및 FGF가 처리되지 않은 신경줄기세포에 다양한 농도 (5.0, 7.5, 10.0, 및 20.0 μM)의 화합물 5를 4일간 처리한 후, 형광현미경을 통해 GFAP-positive 성상세포 (적색), TuJ1-positive 뉴런 (녹색), 및 DAPI-positive 핵 (푸른색)을 관찰하고 그 수를 정량화하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 신경줄기세포에 5.0, 7.5, 또는 10.0 μM 농도의 화합물 5를 처리한 경우, 성상세포의 수가 각각 대조군에 비해 3.83배, 6.52배, 또는 6.09배씩 증가함을 확인할 수 있었다. 다만, 뉴런의 수는 7.5 μM 이상, 전체 세포의 수는 10 μM 이상에서 감소되었다. 이러한 결과를 통해 성상세포로의 분화를 위한 화합물 5의 최적의 농도는 7.5 μM임을 알 수 있었다.

한편, 최적의 농도인 7.5 μM 농도의 화합물 5를 상기와 동일한 방법으로 신경줄기세포에 처리하고, 이에 따라 변화하는 성상세포의 마커인 GFAP, 및 뉴런 마커인 βⅢ-Tublulin 단백질의 발현 양상을 확인함으로써, 상기 실험 결과를 검증하고자 하였으며, 비교 실험군으로는 CNTF (Ciliary neurotrophic factor)를 이용하였다. 또한, 화합물 5의 구조 이성질체인 화합물 5′를 처리할 경우, GFAP mRNA 및 βⅢ-Tublulin mRNA의 발현 양상을 화합물 5의 결과와 비교하였다.

그 결과, 도 3 및 4에 나타 바와 같이, 화합물 5의 처리에 따라 GFAP 단백질의 발현을 증가하였으며, 상기 결과와 마찬가지로, 화합물 5는 구조이성질체인 화합물 5′와 달리, GFAP mRNA의 발현을 대조군에 비해 약 6.14배 가량 증가시킴을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, 본 발명에 따른 2-페닐-N-(2-페닐벤조[d]티아졸-7-일)아세트아마이드는 성상세포로의 분화를 현저하게 촉진시킴을 알 수 있었다.

실시예 5. 성상세포로의 분화 관련 메카니즘의 확인

본 실시예에서는 화합물 5의 처리에 따른 신경줄기세포에서 성상세포로의 분화 촉진의 구체적인 메카니즘을 확인하고자 하였다. 우선, 본 실시예에서는, 성상세포로의 분화에 관여하는 STAT3 및 SMADs의 인산화 여부를 시간의 경과에 따라 확인하였으며, 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 화합물 5의 처리에 의해 STATs 및 SMADs의 인산화가 증진됨을 확인할 수 있었으며, 이러한 효과는 화합물 5를 처리한 뒤, 3일 또는 4일째, 최대에 이르렀다.

상기 STATs 및 SMADs의 인산화에 다소의 시간이 소요되었다는 점에 착안하여, 화합물 5의 처리에 따른 상기 인산화 또는 활성화에 다른 분자들이 관여할 수 있다는 가설 하에서, 이와 관련된 사이토카인인 LIF, IL-6, BMP2, 및 CNTF mRNA; STAT3 활성과 역 상관관계에 있다고 보고된바 있는 miR-9, 및 miR-124; 및 허열과 같은 스트레스 조건에서 세포를 손상시킨다고 알려져 있는 miR-29a의 발현 양상을 확인하였다. 또한, 이와 마찬가지로, 화합물 5의 처리에 따른 ERK 1/2의 인산화 여부 및, 이와 관련된 인자인 TGF-β1, FGF2, 및 FGF8 mRNA 발현양상을 확인하였다.

그 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 화합물 5의 처리에 따라 LIF, IL-6, BMP2, 및 CNTF mRNA의 발현은 대조군에 비해 50.20배, 45.08배, 6.52배, 또는 1.28배씩 증가하였으며, STAT3 활성을 감소시키는 miR-9, 및 miR-124의 발현은 화합물 5의 처리에 따라 감소하였으며, 세포 보호효과가 있다고 보고된 miR-29a 발현은 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한, 도 8 및 9에 나타낸 바와 같이, 화합물 5의 처리에 의해 ERK 1/2의 인산화 증진되었으며, 이 역시 화합물 5를 처리한 뒤 3일째 가장 우수한 효과를 나타내었고, 관련 인자인 TGF-β1 mRNA의 발현도 현저하게 증가하였으며, FGF2, 또는 FGF8 mRNA 역시 각각 대조군에 비해 4.33배, 또는 2.50배씩 증가함을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, 도 10 및 도 11에 도시한 바와 같이, 본 발명에 따른 2-페닐-N-(2-페닐벤조[d]티아졸-7-일)아세트아마이드는 lif, IL-6, BMP2, 및 CNTF의 발현을 유도하여 간접적으로 STAT3 및 SMAD1/5/8의 인산화를 촉진시키고, FGFs와 TGF-β1의 발현을 유도하여 ERK 1/2 신호 기작을 활성화시키며, 관련 miRNA (miR-9, miR-124)의 발현을 증진시킴으로써, 성상상세포로의 분화를 촉진시킴을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (9)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 벤조티아졸 유도체 또는 이의 염.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 제1항의 벤조티아졸 유도체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화유도용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 신경세포는 성상세포 (astrocyte)인 것을 특징으로 하는, 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화유도용 조성물.
   
4. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 벤조티아졸 유도체 또는 이의 염을 5 내지 9 μM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화유도용 조성물.
   
5. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 LIF (Leukemia inhibitory factor), IL-6 (interleukin-6), BMP2 (Bone morphogenic protein 2), 및 CNTF (Ciliary neurotrophic factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 사이토카인 분비를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화유도용 조성물.
   
6. 제2항의 분화유도용 조성물을 신경줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화방법.
   
7. 제1항의 벤조티아졸 유도체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 신경세포 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 신경세포 손상 질환은 파킨슨씨병, 알츠하이머, 피크병(Pick's disease), 헌팅톤병 (Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(amyotriophic lateral sclerosis), 허혈성 뇌질환 (stroke), 탈수초질환 (demyelinating disease) 및 척추 손상 (spinal cord injury)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 신경세포 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
9. 제1항의 벤조티아졸 유도체 또는 이의 염을 신경줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 사이토카인 생산방법으로서, 상기 사이토카인은 LIF (Leukemia inhibitory factor), IL-6 (interleukin-6), BMP2 (Bone morphogenic protein 2), 및 CNTF (Ciliary neurotrophic factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 생산방법.

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