WO2024195854A1 - 肺サーファクタントプロテインｄの測定方法、測定キット、モノクローナル抗体及び細胞 - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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- G—PHYSICS
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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- G—PHYSICS
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- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
- G01N33/545—Synthetic resin
Definitions
- Pulmonary surfactant is a protein produced and secreted by type II alveolar epithelial cells in the lungs. Pulmonary surfactant weakens the surface tension of the alveolar surface, making the alveoli easier to expand and aiding in breathing and gas exchange.
- Pulmonary surfactants include pulmonary surfactant protein-A (hereinafter sometimes referred to as SP-A), pulmonary surfactant protein-B (hereinafter sometimes referred to as SP-B), pulmonary surfactant protein-C (hereinafter sometimes referred to as SP-C), and pulmonary surfactant protein-D (hereinafter sometimes referred to as SP-D).
- SP-A and SP-D are hydrophilic glycoproteins. SP-A and SP-D have a biological defense function and bind to specific lipids. SP-B and SP-C are hydrophobic proteins and associate with phospholipids.
- SP-D is useful for the differentiation of interstitial pneumonia, as an indicator of activity, and for predicting prognosis. SP-D is also used for monitoring the progress of treatment, as it decreases rapidly when treatment for interstitial pneumonia is effective.
- SP-D in the blood can be measured by sandwich ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) using two types of antibodies, as described in Non-Patent Document 1, for example.
- SP-D is known to form a wide range of polymers in vivo, from trimers to 36-mers or even larger.
- the distribution of SP-D polymers in blood varies depending on the constitution and pathological condition of the sample donor.
- conventional SP-D measurement methods such as sandwich ELISA
- the reactivity of antibodies with SP-D of each polymer can differ due to changes in the number of monomers constituting the polymer (for example, from 12-mer to 36-mer), which can cause epitopes to concentrate and change avidity, or the exposed surface of the epitope to change. Therefore, if the distribution of SP-D polymers differs, the quantitative value of SP-D can change.
- the object of the present invention is to provide a method and kit for measuring pulmonary surfactant protein D that allows accurate quantification regardless of the number of monomers that make up the pulmonary surfactant protein D multimer, as well as a monoclonal antibody used therein and a hybridoma that produces this antibody.
- One aspect of the invention includes the following. [1] A step of contacting a sample containing pulmonary surfactant protein D with an insoluble carrier carrying an anti-pulmonary surfactant protein D monoclonal antibody; detecting a complex between said pulmonary surfactant protein D and at least two of said anti-pulmonary surfactant protein D monoclonal antibodies; A method for measuring pulmonary surfactant protein D, wherein the insoluble carrier carries only one type of antibody as the anti-pulmonary surfactant protein D antibody. [2] The measurement method according to [1], wherein the insoluble carrier is a latex particle.
- the insoluble carrier is flat, The measurement method according to [1], wherein the complex comprises the anti-pulmonary surfactant protein D antibody supported on the insoluble carrier, and a labeled antibody comprising the anti-pulmonary surfactant protein D monoclonal antibody and a label.
- the pulmonary surfactant protein D comprises at least one basic unit which is a trimer of pulmonary surfactant protein D; The method according to any one of [1] to [4], wherein only one anti-pulmonary surfactant protein D antibody binds to one basic unit.
- [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein trimer of pulmonary surfactant protein D is not detected in the detection step.
- [7] The method according to any one of [1] to [6], wherein in the detection step, pulmonary surfactant protein D associated with two or more of the basic units is detected.
- a kit for measuring pulmonary surfactant protein D comprising: a first reagent containing an insoluble carrier on which an anti-pulmonary surfactant protein D monoclonal antibody is supported; and a second reagent containing a labeled antibody comprising the anti-pulmonary surfactant protein D monoclonal antibody and a label.
- the measuring kit described in [8], wherein the insoluble carrier and the label are the same substance.
- the above aspect provides a method and kit for measuring pulmonary surfactant protein D that allows accurate quantification regardless of the number of monomers that make up the polymeric pulmonary surfactant protein D, as well as a monoclonal antibody used therein and a cell that produces this antibody.
- 1 is a graph showing the reactivity of anti-SP-D monoclonal antibodies with SP-D derived from biological samples. This is a chromatogram obtained by analyzing rSP-D manufactured by Genscript by gel filtration chromatography. This is a chromatogram obtained by analyzing rSP-D manufactured by R&D and rSP-D manufactured by Genscript by gel filtration chromatography. 1 is a graph showing the measured SP-D concentration values of each fraction obtained in Analysis 5 in Example 2. 1 is a graph showing the SP-D concentration measurement values of each fraction obtained in Analysis 5 in Comparative Example 3. 1 is a graph showing the SP-D concentration measurement values of each fraction obtained in Analysis 5 in Comparative Example 4.
- a method for measuring pulmonary surfactant protein D includes the steps of contacting a sample containing SP-D with an insoluble carrier carrying an anti-SP-D monoclonal antibody, and detecting a complex between the SP-D and at least two of the anti-SP-D monoclonal antibodies, and the insoluble carrier carries only one type of antibody as the anti-SP-D antibody.
- sample in this specification can mainly include body fluids derived from a living body. Examples of samples include blood, serum, plasma, and amniotic fluid, with serum and plasma being preferred.
- the subject from which the sample is collected includes humans or animals (e.g., monkeys, dogs, or cats), and is preferably a human.
- the sample may be a sample from the subject itself, or may be a sample that has been subjected to a commonly performed treatment such as dilution or concentration on the collected sample.
- the person who collects and prepares the sample used in the present invention may be the same person as the person who performs the measurement method of the present invention, or may be a different person.
- the sample used in the measurement method of the present invention may be collected or prepared when the measurement method of the present invention is performed, or may be collected or prepared in advance and stored.
- SP-D SP-D is a monomer, but forms a trimer in which three monomers are associated.
- this trimer may be referred to as a basic unit.
- four basic units are associated to form a dodecamer.
- this dodecamer is further associated to form a 36-mer, etc.
- a multimer of SP-D refers to one formed by the association of two or more basic units. It is preferable that the multimer of SP-D is one in which four or more basic units are associated. In this specification, when simply referring to SP-D, it means a collective term including the monomer, trimer, and each multimer of SP-D.
- the term "monoclonal antibody” refers to an antibody or antibody molecule obtained from a hybridoma derived from a single antibody-producing cell.
- an antibody fragment having the function of this monoclonal antibody can also be used as long as the effect of the present invention can be obtained.
- Examples of antibody fragments having the function of a monoclonal antibody include functional fragments containing the Fab portion of the monoclonal antibody obtained by enzymatic digestion of the monoclonal antibody, functional fragments containing the Fab portion of the monoclonal antibody produced by genetic recombination, and functional fragments containing scFv produced by phage display.
- the monoclonal antibody in one embodiment of the present invention can be prepared by dissolving SP-D as an antigen (also called immunogen) in a solvent such as phosphate-buffered saline, and administering this solution to a non-human animal for immunization. If necessary, an appropriate adjuvant may be added to the solution, and then the emulsion may be used for immunization.
- SP-D an antigen
- a solvent such as phosphate-buffered saline
- the adjuvant in addition to commonly used adjuvants such as water-in-oil emulsions, water-in-oil-in-water emulsions, oil-in-water emulsions, liposomes, and aluminum hydroxide gel, proteins or peptide substances derived from biological components may also be used.
- Freund's incomplete adjuvant or Freund's complete adjuvant can be suitably used.
- the administration route, dosage, and administration time of the adjuvant are not particularly limited, but it is desirable to select them appropriately so as to enhance the desired immune response in the animal immunized with the antigen.
- the type of animal used for immunization is not particularly limited, but mammals such as mice, rats, cows, rabbits, goats, sheep, alpacas, mice, or rats are preferred, and mice or rats are more preferred.
- Animals can be immunized according to a general method, for example, by injecting a solution of an antigen, preferably a mixture with an adjuvant, subcutaneously, intradermally, intravenously, or intraperitoneally into the animal. Since immune responses generally differ depending on the type and strain of the animal being immunized, it is desirable to set an immunization schedule appropriately depending on the animal used. It is preferable to repeat antigen administration several times after the first immunization.
- the following operations can be carried out, but are not limited to these.
- Methods for producing monoclonal antibodies themselves are well known and widely used in the art. Therefore, those skilled in the art can prepare the monoclonal antibody of the present invention by using the above antigen (see, for example, Chapter 6 of Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)).
- hybridomas can be produced by cell fusion with a myeloma-derived cell line with high proliferation ability.
- cell fusion it is preferable to use cells with high antibody production ability (quality and quantity). It is also more preferable that the myeloma-derived cell line is compatible with the animal from which the antibody-producing cells to be fused are derived.
- Cell fusion can be performed according to a method known in the field. For example, the polyethylene glycol method, a method using Sendai virus, or a method using electric current can be adopted.
- the obtained hybridomas can be grown according to general conditions in this field.
- the desired hybridomas can be selected while confirming the properties of the produced antibodies.
- Hybridomas can be cloned by well-known methods such as limiting dilution and soft agar methods.
- the binding ability of the produced monoclonal antibody to SP-D can be assayed using methods such as ELISA, RIA, or fluorescent antibody testing. These procedures make it possible to confirm whether the selected hybridoma produces a monoclonal antibody with the desired properties.
- the anti-SP-D monoclonal antibody of the present invention is preferably an antibody derived from cells obtained by subcutaneously and intraperitoneally immunizing Balb/c mice or F344/Jc1 rats with recombinant human SP-D produced by Genscript as an immunogen.
- the anti-SP-D monoclonal antibody is preferably S21208 or S21202 produced by hybridomas deposited on February 14, 2023 at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganism Deposit Center (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) under accession numbers NITE BP-03826 and NITE BP-03825, respectively, and more preferably S21208.
- a sandwich system is a method in which the substance to be detected, i.e., SP-D, is sandwiched between at least two monoclonal antibodies.
- At least one of the at least two anti-SP-D monoclonal antibodies is a solid-phase antibody and at least one is a labeled antibody.
- a solid-phase antibody means a monoclonal antibody that is directly or indirectly immobilized on a solid phase, i.e., an insoluble carrier.
- a labeled antibody means a monoclonal antibody that is directly or indirectly labeled with a labeling substance commonly known and commonly used by those skilled in the art, as described below.
- the solid-phase antibody and the labeled antibody are anti-SP-D monoclonal antibodies of the same type, i.e., with the same amino acid sequence.
- the measurement method of this embodiment can detect SP-D that contains two or more basic units, such as a 12-mer or a 36-mer.
- Solid-phase antibodies can be produced by physically adsorbing or chemically binding (possibly via a suitable spacer) monoclonal antibodies to an insoluble carrier.
- an insoluble carrier a solid phase made of a polymer substrate such as polystyrene resin, an inorganic substrate such as glass, or a polysaccharide substrate such as cellulose or agarose can be used.
- the shape of the insoluble carrier is not particularly limited, and any shape can be selected, such as a flat plate (e.g., microplates and membranes), beads or particles (e.g., latex particles and magnetic particles), or a cylindrical shape (e.g., test tube).
- the amount of SP-D can also be measured by using a labeled antibody that can bind directly to the monoclonal antibody used in the SP-D measurement method of the present invention.
- a labeled antibody that can bind directly to the monoclonal antibody used in the SP-D measurement method of the present invention.
- an antibody that binds to the monoclonal antibody of the present invention and has a labeled substance bound thereto is referred to as a secondary antibody.
- the labeled substance may be indirectly bound to the monoclonal antibody of the present invention using this secondary antibody.
- the amount of SP-D in a sample can be measured by measuring the intensity of the signal emitted by the labeling substance or the turbidity caused by the aggregation of the labeling substance.
- labeling substances for preparing labeled antibodies include metal complexes, enzymes, insoluble particles, fluorescent substances, chemiluminescent substances, biotin, avidin, radioisotopes, gold colloid particles, and colored latex.
- Methods for binding the labeling substance to the monoclonal antibody include physical adsorption, glutaraldehyde method, maleimide method, pyridyl disulfide method, and periodic acid method available to those skilled in the art.
- the enzyme activity can be measured using a specific substrate for that enzyme.
- HRP horseradish peroxidase
- OPD O-phenylenediamine
- TMB 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
- p-nitrophenyl phosphate can be used to measure the enzyme activity.
- biotin a monoclonal antibody can be labeled with biotin and reacted with avidin or streptavidin labeled with an enzyme, dye, or fluorescent label (preferably HRP).
- the physical or chemical support of an antigen or antibody on a solid phase or the state of being supported thereon may be expressed as “immobilization” or “solid-phase”.
- the terms “analysis”, “detection”, and “measurement” include quantification of SP-D.
- the method for measuring SP-D in the present invention is a method for measuring the concentration of SP-D contained in a sample by utilizing the reaction between an antigen and an antibody.
- Methods for measuring SP-D in the present invention include, but are not limited to, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and latex turbidimetric immunoassay (LTIA).
- ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
- LTIA latex turbidimetric immunoassay
- the method for measuring SP-D of the present invention may be an in vivo or in vitro immunoassay method.
- a sensitizer may also be used to enhance sensitivity.
- the order in which the anti-SP-D monoclonal antibody and the sample are added to the measurement system is not limited as long as the effects of the present invention are obtained.
- the anti-SP-D monoclonal antibody can be added to the measurement system before, simultaneously with, or after the addition of the sample.
- latex particles act as an insoluble carrier and as a labeling substance.
- monoclonal antibody that binds to SP-D carried by latex particles that is, an anti-SP-D monoclonal antibody with the same amino acid sequence.
- an automatic biochemical analyzer e.g., Hitachi Automatic Analyzer 3500 manufactured by Hitachi Ltd.
- Hitachi Automatic Analyzer 3500 manufactured by Hitachi Ltd.
- ELISA refers to a method in which SP-D, a substance to be detected contained in a sample, is captured using an anti-SP-D monoclonal antibody and then detected using an enzyme reaction.
- the solid phase is preferably a plate (also called an immunoplate).
- HRP or ALP can be used as a label.
- the measurement procedure and principle when sandwich ELISA is used as the SP-D measurement method of the present invention are as follows. (1) A sample is brought into contact with a solid phase on which an anti-SP-D monoclonal antibody is immobilized, and SP-D in the sample binds to the anti-SP-D monoclonal antibody, i.e., the solid phase antibody.
- the labeled antibody When a labeled anti-SP-D monoclonal antibody, i.e., the labeled antibody, is added to the solid phase and allowed to react, the labeled antibody binds to SP-D to form a solid phase antibody-SP-D-labeled antibody complex, i.e., a sandwich. (3) After washing, the labeling substance is allowed to develop color and the absorbance is measured.
- a labeled anti-SP-D monoclonal antibody i.e., the labeled antibody
- the amount of SP-D in the sample can be measured according to the amount of labeled substance measured.
- a secondary antibody can also be used.
- the reaction is amplified, and the detection sensitivity can be increased.
- the secondary antibody is an antibody that specifically recognizes the anti-SP-D monoclonal antibody.
- steps (1) to (5) can be adopted. (1) A sample is added to a solid phase on which an anti-SP-D monoclonal antibody is immobilized, followed by incubation, followed by removal of the sample and washing. (2) An anti-SP-D monoclonal antibody is added, followed by incubation and washing. (3) An enzyme-labeled secondary antibody is then added and incubated. (4) Add substrate to develop color. (5) The amount of SP-D is measured by measuring the color development using a plate reader or the like.
- the solid-phase antibody that binds to SP-D and the labeled antibody are of the same type, i.e., anti-SP-D monoclonal antibodies with the same amino acid sequence.
- the above embodiment makes it possible to accurately quantify SP-D regardless of the number of monomers that make up the SP-D multimer.
- the SP-D measurement kit comprises a first reagent containing an insoluble carrier on which an anti-pulmonary surfactant protein D monoclonal antibody is supported, and a second reagent containing a labeled antibody comprising the anti-pulmonary surfactant protein D monoclonal antibody and a label.
- the insoluble carrier and the label may be the same substance, or may be latex particles.
- the SP-D monoclonal antibody carried on the insoluble carrier and the SP-D monoclonal antibody of the label are of the same species, i.e., antibodies with the same amino acid sequence.
- the SP-D monoclonal antibody, insoluble carrier, label, and labeled antibody are as described above, and the contents thereof can be applied.
- the SP-D measurement kit may also include at least one of other test reagents and sample dilution solutions, such as standard antigen substances used in the measurement of SP-D and antigen samples for quality control.
- the present invention also covers the above-described method for preparing the monoclonal antibody of the present invention, the nucleic acid molecule encoding the monoclonal antibody of the present invention, the vector or plasmid containing this nucleic acid molecule, the cell containing this nucleic acid molecule, the vector or plasmid, the hybridoma producing the antibody of the present invention, and the like.
- rSP-D Recombinant human SP-D manufactured by Genscript was used as the immunogen.
- rSP-D was mixed 1:1 with Freund's Complete Adjuvant (Difco Laboratories) for the first immunization and with Freund's Incomplete Adjuvant (Difco Laboratories) for the second immunization and thereafter.
- Balb/c mice or F344/Jcl rats were immunized subcutaneously every other week using 25 ⁇ g of immunogen for the first immunization and 20 ⁇ g (diluted with PBS) for the second immunization and thereafter.
- blood antibody titers were evaluated by antigen solid-phase ELISA.
- the immunogen diluted with PBS was intraperitoneally immunized 1 to 3 days before dissection. Thereafter, spleen cells, iliac lymph node cells, and inguinal lymph node cells were collected and fused with myeloma cells SP2/0 by electrofusion. The fused cells (i.e., hybridomas) were cultured in 96-well plates, and the culture supernatant was collected 7 or 8 days after fusion. Screening was then performed by antigen-immobilized ELISA, as described below, to select strains that showed reactivity to rSP-D. The medium was replaced the day before screening.
- rSP-D (1 ⁇ g/mL in PBS) was dispensed at 50 ⁇ L/well into a 96-well ELISA plate (NUNC442404) and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing three times with PBST at 400 ⁇ L/well, blocking solution (1% BSA-PBST) was dispensed at 100 ⁇ L/well and allowed to stand at room temperature for 1 hour or at 4° C. overnight. After removing the blocking solution, cell culture supernatant and 1000- and 10000-fold diluted antisera were dispensed at 50 ⁇ L/well, respectively, and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
- blocking solution 1% BSA-PBST
- a blocking solution 1% BSA-PBST
- each anti-SP-D monoclonal antibody solution 5 ⁇ g/mL shown in Table 2 was dispensed at 50 ⁇ L/well and left to stand at room temperature for 1 hour.
- the detection values were calculated by subtracting the measurement values of wells that were measured without dispensing anti-SP-D monoclonal antibodies from the measurement values of each well, and the results are shown in Table 2. All of the anti-SP-D monoclonal antibodies reacted strongly only with rSP-D, and had no or very low reactivity with antigens other than SP-D.
- Anti-SP-D monoclonal antibodies as solid-phase antibodies prepared with PBS at 5 ⁇ g/mL were dispensed into each well of an ELISA plate at 50 ⁇ L/well and left to stand at room temperature for 2 hours.
- Each well was washed three times with TBST (washing solution) containing 5 mM calcium chloride at 400 ⁇ L/well, and 1% BSA/TBST (blocking solution) was dispensed into each well at 100 ⁇ L/well and left to stand at room temperature for 1 hour.
- the blocking solution was removed from each well, and a solution obtained by diluting serum with 1% BSA/TBST containing 5 mM calcium chloride so that the SP-D concentration was 100 ng/mL was dispensed into each well at 50 ⁇ L/well and left to stand at room temperature for 1 hour.
- Each well was washed three times with 400 ⁇ L of washing solution per well, and a solution of 0.2 ⁇ g/mL of biotinylated anti-SP-D monoclonal antibody prepared with 1% BSA/TBST containing 5 mM calcium chloride was dispensed at 50 ⁇ L/well and left at room temperature for 1 hour.
- Table 3 shows the results, with antibody combinations with an absorbance of less than 0.1 rated as -, monoclonal antibody combinations with an absorbance of 0.1 or more but less than 0.5 rated as +, monoclonal antibody combinations with an absorbance of 0.5 or more but less than 1.0 rated as ++, and monoclonal antibody combinations with an absorbance of 1.0 or more rated as +++.
- SP-D in serum could be detected with multiple antibody combinations, including combinations of the same monoclonal antibodies.
- the combination of S21202, S21205, and S21208 antibodies enabled high-sensitivity detection of SP-D derived from biological samples.
- a solution containing 55 ⁇ g of rSP-D manufactured by Genscript was added to a Superdex 200 Increase 10/300GL column (Cytiva) equilibrated with TBS, and gel filtration chromatography was performed at a flow rate of 0.7 mL/min. The UV absorbance was recorded.
- the eluate was dispensed in 400 ⁇ L portions into tubes previously filled with 100 ⁇ L of TBS containing 5% BSA. The fractions after separation were mixed well, dispensed, and stored at -30°C.
- Figure 2 shows a chromatogram of rSP-D produced by Genscript analyzed by gel filtration chromatography.
- the 12-mer SP-D was mainly eluted in fraction 14, and the trimer SP-D was mainly eluted in fraction 23.
- rSP-D in each fraction obtained in Analytical Example 4 was measured according to the procedure described below using four ELISA systems: S21208 solid phase-S21208 liquid phase (Example 1), S21202 solid phase-S21202 liquid phase (Example 2), S21205 solid phase-S21208 liquid phase (Comparative Example 1), and S21202 solid phase-S21205 liquid phase (Comparative Example 2).
- Solid-phase antibodies prepared at 5 ⁇ g/mL in PBS were dispensed into ELISA plates at 50 ⁇ L/well and left to stand at room temperature for 2 hours. After washing three times with TBST containing 5 mM calcium chloride at 400 ⁇ L/well, 1% BSA/TBST (blocking solution) was dispensed at 100 ⁇ L/well and left to stand at room temperature for 1 hour. After removing the blocking solution, each fraction obtained in Analysis Example 4, diluted 1000-fold with 1% BSA/TBST containing 5 mM calcium chloride, was dispensed at 50 ⁇ L/well and left to stand at room temperature for 1 hour.
- OPD color development solution was dispensed at 50 ⁇ L/well and left at room temperature for 10 minutes. Stop solution was dispensed at 50 ⁇ L/well, and the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured using a plate reader.
- Figure 3 shows chromatograms of rSP-D manufactured by R&D and rSP-D manufactured by Genscript analyzed by gel filtration chromatography.
- SP-D of 36 or more mers was mainly eluted in fraction 8
- SP-D of 12 mers in fraction 12 and SP-D of trimers in fraction 20.
- R&D rSP-D was mainly composed of SP-D of 36 or more mers
- Genscript rSP-D was mainly composed of SP-D of 12 mers.
- the fraction eluted nth when R&D SP-D was analyzed will be referred to as fraction Rn
- fraction Gn the fraction eluted nth when Genscript SP-D was analyzed
- rSP-D in each fraction obtained in Analytical Example 5 was measured in the same manner as in ⁇ Detection of rSP-D gel filtration fraction with anti-SP-D monoclonal antibodies 1> using three ELISA systems: S21208 solid phase-S21208 liquid phase (Example 1), S21205 solid phase-S21208 liquid phase (Comparative Example 1), and S21202 solid phase-S21205 liquid phase (Comparative Example 2).
- Example 1 in which SP-D was detected by sandwich detection using the same anti-SP-D monoclonal antibody, the ratio of absorbance when measuring fraction R8 containing SP-D of 36 or more mers to the absorbance when measuring fraction G12 containing SP-D of 12 mers was 2.76:1, which was equivalent to the protein amount ratio of SP-D of 36 or more mers to SP-D of 12 mers in gel filtration chromatography, 2.14:1. Furthermore, Example 1 did not detect trimer SP-D contained in fraction G20.
- Example 2 The S21208 antibody-sensitized latex particle solution prepared by the procedure described in 2) was diluted with 5 mM MOPS-NaOH (pH 7.0) buffer so that the absorbance at a wavelength of 600 nm became 6.0 Abs. to prepare a second reagent.
- ⁇ Quantification of rSP-D gel filtration fraction using SP-D measurement reagent 1) Measurement method using LTIA reagent The first and second reagents were combined, and the SP-D concentration in each fraction obtained in Analysis Example 5 was measured and calculated using a biochemical automatic analyzer (Hitachi, Hitachi automatic analyzer 3500) according to the following procedure (Example 2 and Comparative Example 3). 120 ⁇ L of the first reagent was added to 5 ⁇ L of each fraction, and heated at 37° C. for 5 minutes. 40 ⁇ L of the second reagent was added and stirred. The change in absorbance over 5 minutes was measured at a main wavelength of 570 nm and a sub-wavelength of 800 nm.
- Table 6 shows the SP-D concentration measurement values when fractions R8, R12, and R20 obtained in analysis 5 were used.
- Figure 4 is a graph showing the SP-D concentration measurement values of each fraction obtained in analysis 5 in Example 2.
- Figure 5 is a graph showing the SP-D concentration measurement values of each fraction obtained in analysis 5 in Comparative Example 3.
- Figure 6 is a graph showing the SP-D concentration measurement values of each fraction obtained in analysis 5 in Comparative Example 4.
- Example 2 similar to the ELISA in Example 1, SP-D was detected at a protein ratio equivalent to the protein ratio (2.14:1) of 36-mer or greater SP-D to 12-mer SP-D in gel filtration chromatography.
- the measured value of fraction G20, which contains trimer SP-D was equivalent to the measured value of fraction G18, which was measured to have a lower protein content than fraction G20 in gel filtration chromatography, and it was considered that Example 2 did not substantially detect trimer SP-D.
- the above aspect provides a method and kit for measuring pulmonary surfactant protein D that allows accurate quantification regardless of the number of monomers that make up the polymeric pulmonary surfactant protein D, as well as a monoclonal antibody used therein and a cell that produces this antibody.
- NPMD NITE BP-03825
- NPMD NITE BP-03826 is an acronym for the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganism Depositary Center (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan).
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Abstract
この肺サーファクタントプロテインＤの測定方法は、肺サーファクタントプロテインＤを含む試料と、抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体を担持させた不溶性担体とを接触させる工程と、前記肺サーファクタントプロテインＤと少なくとも２つの前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体との複合体を検出する工程と、を含み、前記不溶性担体は、前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体として一種の抗体のみが担持されている。
Description
本発明は、肺サーファクタントプロテインＤの測定方法、測定キット、モノクローナル抗体及び細胞に関する。
本願は、２０２３年３月２３日に日本に出願された特願２０２３－０４６６３３号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０２３年３月２３日に日本に出願された特願２０２３－０４６６３３号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
肺サーファクタントは、肺のＩＩ型肺胞上皮細胞より産生及び分泌されるタンパク質である。肺サーファクタントは、肺胞表面の表面張力を弱めることで肺胞を膨らみやすくし、呼吸やガス交換を助ける働きがある。
肺サーファクタントは、肺サーファクタントプロテイン－Ａ（以降、ＳＰ－Ａと記載することがある。）、肺サーファクタントプロテイン－Ｂ（以降、ＳＰ－Ｂと記載することがある。）、肺サーファクタントプロテイン－Ｃ（以降、ＳＰ－Ｃと記載することがある。）及び肺サーファクタントプロテイン－Ｄ（以降、ＳＰ－Ｄと記載することがある。）を含む。ＳＰ－Ａ及びＳＰ－Ｄは、親水性糖タンパク質である。ＳＰ－Ａ及びＳＰ－Ｄは、生体防御作用を有しており、特異脂質と結合する。ＳＰ－Ｂ及びＳＰ－Ｃは、疎水性タンパク質であり、リン脂質と会合する。
ＳＰ－Ｄの測定は、間質性肺炎の鑑別、活動性の指標及び予後予測において有用である。またＳＰ－Ｄは、間質性肺炎の治療が効果的であると速やかに減少することから、治療経過観察にも用いられる。血液中のＳＰ－Ｄの測定は、例えば非特許文献１に記載のように、２種の抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）により行うことができる。
Preston E. Bratcher et al., Factors Influencing the Measurement of Plasma/Serum Surfactant Protein D Levels by ELISA PLOS ONE, November 2014, Volume 9, Issue 11
ＳＰ－Ｄは、生体内で３量体から３６量体、若しくはそれ以上の幅広い多量体を形成することが知られている。血液中のＳＰ－Ｄの多量体の分布は、試料提供者の体質や病態により異なる。一方で、これまでのサンドイッチＥＬＩＳＡ等によるＳＰ－Ｄの測定方法では、多量体を構成する単量体の数の変化（例えば、１２量体から３６量体への変化）に伴いエピトープが集中してアビディティが変動したり、エピトープの露出面が変化したりすることで、抗体と各多量体のＳＰ－Ｄとの反応性が異なることがある。そのため、ＳＰ－Ｄの多量体の分布が異なると、ＳＰ－Ｄの定量値が変化する場合がある。
本発明の目的は、肺サーファクタントプロテインＤの多量体を構成する単量体数の多寡によらず正確な定量が可能である肺サーファクタントプロテインＤの測定方法、測定キット、及びこれらに用いられるモノクローナル抗体並びにこの抗体を生産するハイブリドーマを提供することにある。
本発明の一態様は、以下を包含する。
［１］肺サーファクタントプロテインＤを含む試料と、抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体を担持させた不溶性担体とを接触させる工程と、
前記肺サーファクタントプロテインＤと少なくとも２つの前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体との複合体を検出する工程と、を含み、
前記不溶性担体は、前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体として一種の抗体のみが担持されている、肺サーファクタントプロテインＤの測定方法。
［２］前記不溶性担体がラテックス粒子である、［１］に記載の測定方法。
［３］前記不溶性担体が平板状であり、
前記複合体が前記不溶性担体に担持されている前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体と、前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体と標識物とを含む標識抗体とを含む、［１］に記載の測定方法。
［４］前記試料が血清または血漿である、［１］～［３］のいずれか一項に記載の測定方法。
［５］前記肺サーファクタントプロテインＤが３量体の肺サーファクタントプロテインＤである基本ユニットを少なくとも１つ含み、
１つの前記基本ユニットに対し、前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体が１つのみ結合する、［１］～［４］のいずれか一項に記載の測定方法。
［６］前記検出する工程において３量体の肺サーファクタントプロテインＤが検出されない、［１］～［５］のいずれか一項に記載の測定方法。
［７］前記検出する工程において、前記基本ユニットが２つ以上会合した肺サーファクタントプロテインＤを検出する、［１］～［６］のいずれか一項に記載の測定方法。
［８］抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体が担持されている不溶性担体を含む第１試薬と、前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体と標識物とを含む標識抗体を含む第２試薬と、を含む肺サーファクタントプロテインＤの測定キット。
［９］前記不溶性担体と前記標識物とが同一の物質である、［８］に記載の測定キット。
［１０］３量体の肺サーファクタントプロテインＤに結合するモノクローナル抗体であって、１つの前記３量体の肺サーファクタントプロテインＤに対し、１つのみが結合する、モノクローナル抗体。
［１１］１２量体の肺サーファクタントプロテインＤに少なくとも２つが結合する、［１０］に記載のモノクローナル抗体。
［１２］［１０］又は［１１］に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
［１３］独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２５又は受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２６として寄託された、ハイブリドーマ。
［１］肺サーファクタントプロテインＤを含む試料と、抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体を担持させた不溶性担体とを接触させる工程と、
前記肺サーファクタントプロテインＤと少なくとも２つの前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体との複合体を検出する工程と、を含み、
前記不溶性担体は、前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体として一種の抗体のみが担持されている、肺サーファクタントプロテインＤの測定方法。
［２］前記不溶性担体がラテックス粒子である、［１］に記載の測定方法。
［３］前記不溶性担体が平板状であり、
前記複合体が前記不溶性担体に担持されている前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体と、前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体と標識物とを含む標識抗体とを含む、［１］に記載の測定方法。
［４］前記試料が血清または血漿である、［１］～［３］のいずれか一項に記載の測定方法。
［５］前記肺サーファクタントプロテインＤが３量体の肺サーファクタントプロテインＤである基本ユニットを少なくとも１つ含み、
１つの前記基本ユニットに対し、前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体が１つのみ結合する、［１］～［４］のいずれか一項に記載の測定方法。
［６］前記検出する工程において３量体の肺サーファクタントプロテインＤが検出されない、［１］～［５］のいずれか一項に記載の測定方法。
［７］前記検出する工程において、前記基本ユニットが２つ以上会合した肺サーファクタントプロテインＤを検出する、［１］～［６］のいずれか一項に記載の測定方法。
［８］抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体が担持されている不溶性担体を含む第１試薬と、前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体と標識物とを含む標識抗体を含む第２試薬と、を含む肺サーファクタントプロテインＤの測定キット。
［９］前記不溶性担体と前記標識物とが同一の物質である、［８］に記載の測定キット。
［１０］３量体の肺サーファクタントプロテインＤに結合するモノクローナル抗体であって、１つの前記３量体の肺サーファクタントプロテインＤに対し、１つのみが結合する、モノクローナル抗体。
［１１］１２量体の肺サーファクタントプロテインＤに少なくとも２つが結合する、［１０］に記載のモノクローナル抗体。
［１２］［１０］又は［１１］に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
［１３］独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２５又は受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２６として寄託された、ハイブリドーマ。
上記態様によれば、多量体の肺サーファクタントプロテインＤを構成する単量体数の多寡によらず正確な定量が可能である肺サーファクタントプロテインＤの測定方法、測定キット、及びこれらに用いられるモノクローナル抗体並びにこの抗体を生産する細胞を提供することができる。
＜肺サーファクタントプロテインＤの測定方法＞
本発明の一態様における肺サーファクタントプロテインＤ（以降、ＳＰ－Ｄと記載する）の測定方法は、ＳＰ－Ｄを含む試料と、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を担持させた不溶性担体とを接触させる工程と、前記ＳＰ－Ｄと少なくとも２つの前記抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体との複合体を検出する工程と、を含み、前記不溶性担体は、前記抗ＳＰ－Ｄ抗体として一種の抗体のみが担持されている。
以下に本発明の一態様におけるＳＰ－Ｄの測定方法について説明する。ただし、以下に示す実施形態は、あくまでも例示に過ぎず、実施形態で明示しない種々の変形例や技術の適用は排除されない。すなわち、本実施形態をその趣旨を逸脱しない範囲で種々変更して実施することができる。
（試料）
本明細書における「試料」としては、主に生体由来の体液を挙げることができる。試料としては、血液、血清、血漿及び羊水が挙げられ、血清及び血漿が好ましい。試料を採取する対象は、ヒト又は動物（例えば、サル、イヌ、又はネコ）を含み、好ましくはヒトである。試料は、対象からの試料そのものであってもよく、採取した試料に通常行われる希釈又は濃縮等の処理を行ったものであってもよい。なお、本発明に用いられる試料の採取や調製を行う者は、本発明の測定方法を行う者と同一人物でもよく、別人物であってもよい。また、本発明の測定方法に用いられる試料は、本発明の測定方法の実施時に採取又は調製されたものでもよく、予め採取又は調製され保存されたものであってもよい。
本明細書における「試料」としては、主に生体由来の体液を挙げることができる。試料としては、血液、血清、血漿及び羊水が挙げられ、血清及び血漿が好ましい。試料を採取する対象は、ヒト又は動物（例えば、サル、イヌ、又はネコ）を含み、好ましくはヒトである。試料は、対象からの試料そのものであってもよく、採取した試料に通常行われる希釈又は濃縮等の処理を行ったものであってもよい。なお、本発明に用いられる試料の採取や調製を行う者は、本発明の測定方法を行う者と同一人物でもよく、別人物であってもよい。また、本発明の測定方法に用いられる試料は、本発明の測定方法の実施時に採取又は調製されたものでもよく、予め採取又は調製され保存されたものであってもよい。
（ＳＰ－Ｄ）
ＳＰ－Ｄは、モノマーであるが、モノマー３つが会合している３量体を形成する。本明細書では、この３量体を基本ユニットと記載することがある。ＳＰ－Ｄは、基本ユニットが４つ会合して１２量体を形成する。さらに、この１２量体が更に会合して３６量体等を形成する。本明細書において、ＳＰ－Ｄの多量体とは基本ユニットが２つ以上会合して形成されたものを示す。ＳＰ－Ｄの多量体は、基本ユニットが４つ以上会合したものであることが好ましい。本明細書において、単にＳＰ－Ｄと記載している場合、単量体、３量体及び各多量体のＳＰ－Ｄを含む総称を意味する。
ＳＰ－Ｄは、モノマーであるが、モノマー３つが会合している３量体を形成する。本明細書では、この３量体を基本ユニットと記載することがある。ＳＰ－Ｄは、基本ユニットが４つ会合して１２量体を形成する。さらに、この１２量体が更に会合して３６量体等を形成する。本明細書において、ＳＰ－Ｄの多量体とは基本ユニットが２つ以上会合して形成されたものを示す。ＳＰ－Ｄの多量体は、基本ユニットが４つ以上会合したものであることが好ましい。本明細書において、単にＳＰ－Ｄと記載している場合、単量体、３量体及び各多量体のＳＰ－Ｄを含む総称を意味する。
（モノクローナル抗体）
本明細書において、「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するハイブリドーマから得られた抗体又は抗体分子を意味する。本発明の測定方法では、本発明の効果が得られる限りにおいて、このモノクローナル抗体の機能を有する抗体断片も使用することができる。モノクローナル抗体の機能を有する抗体断片としては、例えば、モノクローナル抗体の酵素的消化により得られる前記モノクローナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片、遺伝子組換えによって作製される前記モノクローナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片、及びファージディスプレイ法で作製されたｓｃＦｖを含む機能性断片等が挙げられる。
本明細書において、「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するハイブリドーマから得られた抗体又は抗体分子を意味する。本発明の測定方法では、本発明の効果が得られる限りにおいて、このモノクローナル抗体の機能を有する抗体断片も使用することができる。モノクローナル抗体の機能を有する抗体断片としては、例えば、モノクローナル抗体の酵素的消化により得られる前記モノクローナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片、遺伝子組換えによって作製される前記モノクローナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片、及びファージディスプレイ法で作製されたｓｃＦｖを含む機能性断片等が挙げられる。
（モノクローナル抗体の調製方法）
本発明の一態様におけるモノクローナル抗体は、抗原（免疫原ともいう）として、ＳＰ－Ｄをリン酸緩衝生理食塩水などの溶媒に溶解し、この溶液を非ヒト動物に投与して免疫することにより調製できる。必要に応じて前記溶液に適宜のアジュバントを添加した後、エマルジョンを用いて免疫を行ってもよい。アジュバントとしては、油中水型乳剤、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲルなどの汎用されるアジュバントのほか、生体成分由来のタンパク質又はペプチド性物質などを用いてもよい。例えば、フロイントの不完全アジュバント又はフロイントの完全アジュバントなどを好適に用いることができる。アジュバントの投与経路、投与量、投与時期は特に限定されないが、抗原を免疫する動物において所望の免疫応答を増強できるように適宜選択することが望ましい。
本発明の一態様におけるモノクローナル抗体は、抗原（免疫原ともいう）として、ＳＰ－Ｄをリン酸緩衝生理食塩水などの溶媒に溶解し、この溶液を非ヒト動物に投与して免疫することにより調製できる。必要に応じて前記溶液に適宜のアジュバントを添加した後、エマルジョンを用いて免疫を行ってもよい。アジュバントとしては、油中水型乳剤、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲルなどの汎用されるアジュバントのほか、生体成分由来のタンパク質又はペプチド性物質などを用いてもよい。例えば、フロイントの不完全アジュバント又はフロイントの完全アジュバントなどを好適に用いることができる。アジュバントの投与経路、投与量、投与時期は特に限定されないが、抗原を免疫する動物において所望の免疫応答を増強できるように適宜選択することが望ましい。
免疫に用いる動物の種類も特に限定されないが、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、アルパカ、マウス、又はラットが好ましく、より好ましくはマウス又はラットを用いることができる。動物の免疫は、一般的な手法に従って行えばよく、例えば、抗原の溶液、好ましくはアジュバントとの混合物を動物の皮下、皮内、静脈、又は腹腔内に注射することにより行うことができる。免疫応答は、一般的に免疫される動物の種類及び系統によって異なるので、免疫スケジュールは使用される動物に応じて適宜設定することが望ましい。抗原投与は、最初の免疫後に何回か繰り返し行うことが好ましい。
本発明のモノクローナル抗体を得るために、引き続き以下の操作が行われることができるが、これらに限定されることはない。モノクローナル抗体それ自体の製造方法については当業界で周知されており、かつ汎用されている。よって当業者は、前記の抗原を用いることによって本発明のモノクローナル抗体を調製することが可能である（例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８） 第６章などを参照のこと）。
最終免疫後、免疫した動物から抗体産生細胞である脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を摘出し、高い増殖能を有する骨髄腫由来の細胞株と細胞融合することによりハイブリドーマを作製することができる。細胞融合には抗体産生能（質及び量）が高い細胞を用いることが好ましい。また骨髄腫由来の細胞株は、融合する抗体産生細胞の由来する動物と適合性があることがより好ましい。細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、又は電流を利用する方法などを採用することができる。得られたハイブリドーマは、本分野の汎用の条件に従って増殖させることができる。産生される抗体の性質を確認しつつ、所望のハイブリドーマを選択することができる。ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法や軟寒天法などの周知の方法により行うことが可能である。
クローニング工程後、産生されるモノクローナル抗体とＳＰ－Ｄとの結合能をＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ法、又は蛍光抗体法などの方法を用いてアッセイすることができる。これらの操作により、選択されたハイブリドーマが所望の性質を有するモノクローナル抗体を産生するか否かを確認することができる。
前記のようにして選別されたハイブリドーマを大量培養することにより、所望の特性を有するモノクローナル抗体を製造することができる。大量培養の方法は特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマを適宜の培地中で培養してモノクローナル抗体を培地中に産生させる方法、及び哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注射して増殖させ、腹水中にモノクローナル抗体を産生させる方法などを挙げることができる。
本発明の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体は、Genscript社製の組換えヒトＳＰ－Ｄを免疫原とし、Ｂａｌｂ／ｃマウス又はＦ３４４／Ｊｃ１ラットに対し皮下免疫及び腹腔免疫して得られた細胞由来の抗体であることが好ましい。例えば、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に、２０２３年２月１４日に、それぞれ受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２６及び受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２５として受託されたハイブリドーマから産生されるＳ２１２０８及びＳ２１２０２であることが好ましく、Ｓ２１２０８であることがより好ましい。
本発明におけるＳＰ－Ｄの測定方法において、ＳＰ－Ｄと結合するモノクローナル抗体は、１種類のみ、すなわち同一のアミノ酸配列の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体のみであり、かつサンドイッチ系を構築する。本明細書において、サンドイッチ系とは、被検出物質、すなわちＳＰ－Ｄを少なくとも２つのモノクローナル抗体で挟みこむ方法である。
サンドイッチ系を構築する場合、少なくとも２つの抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体のうち少なくとも１つは、固相抗体であり、少なくとも１つは、標識抗体であることが好ましい。本明細書において、固相抗体とは、固相、すなわち不溶性担体上に直接的又は間接的に固相化されたモノクローナル抗体を意味する。本明細書において、標識抗体とは、後述する当業者に周知慣用の標識物質で直接的又は間接的に標識されているモノクローナル抗体を意味する。本発明において、固相抗体と標識抗体とは、同一種、すなわち同一のアミノ酸配列の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体である。
抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体は、３量体のＳＰ－Ｄ（つまり、基本ユニット）に１つの抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体のみが結合する。このメカニズムとして、エピトープが基本ユニットの１ヶ所に集中しており、１つ目の抗体が結合すると、２つ目の抗体が１つ目の抗体によって立体障害を受けてエピトープに近づけないことが考えられる。したがって基本ユニットを２つの抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体によりサンドイッチすることができず、複合体を形成することができない。よって、本実施形態の測定方法において３量体のＳＰ－Ｄを検出することができない。
一方で基本ユニットが２つ以上含まれるＳＰ－Ｄ、例えば１２量体及び３６量体等のＳＰ－Ｄは、異なる２つの基本ユニットそれぞれに異なる２つの抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が結合することができる。よって、本実施形態の測定方法では、１２量体及び３６量体等の基本ユニットが２つ以上含まれるＳＰ－Ｄを検出することができる。
固相抗体は、不溶性担体にモノクローナル抗体を物理的に吸着させる、又は化学的に結合（適当なスペーサーを介してよい）させることにより製造することができる。不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂などの高分子基材、ガラスなどの無機基材、又はセルロースやアガロースなどの多糖類基材などからなる固相を用いることができる。不溶性担体の形状は特に限定されず、平板状（例えば、マイクロプレート及びメンブレン）、ビーズ若しくは粒子状（例えば、ラテックス粒子及び磁性粒子）、又は筒状（例えば、試験管）など任意の形状を選択できる。
本発明のＳＰ－Ｄの測定方法に使用されるモノクローナル抗体と直接的に結合可能な標識抗体を用いることにより、ＳＰ－Ｄの量を測定することもできる。本明細書では、本発明のモノクローナル抗体に結合し、且つ標識物質を結合させた抗体を二次抗体と称する。この二次抗体を用いて、標識物質を本発明のモノクローナル抗体に間接的に結合させてもよい。
標識物質が発するシグナルの強さや標識物質の凝集による濁度を測定して、試料中のＳＰ－Ｄの量を測定することができる。標識抗体を調製するための標識物質としては、例えば金属錯体、酵素、不溶性粒子、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、放射性同位体、金コロイド粒子、又は着色ラテックスが挙げられる。標識物質とモノクローナル抗体との結合法としては、当業者に利用可能な物理吸着、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法を用いることができる。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などの酵素を標識物質として用いる場合には、その酵素の特異的基質を用いて酵素活性を測定することができる。例えば、酵素がＨＲＰの場合には、Ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いることができ、ＡＬＰの場合にはｐ―ニトロフェニル・ホスフェートを用いて酵素活性を測定することができる。ビオチンを標識物質として用いる場合には、モノクローナル抗体をビオチンで標識し、酵素、色素、又は蛍光標識（好ましくはＨＲＰ）で標識したアビジン又はストレプトアビジンを反応させることもできる。
本明細書において、抗原や抗体を固相に物理的あるいは化学的に担持させることあるいは担持させた状態を「固定化」又は「固相化」と表現することがある。また、「分析」、「検出」、又は「測定」という用語は、ＳＰ－Ｄの定量を含む。
本発明におけるＳＰ－Ｄの測定方法は、抗原と抗体の反応を利用して、試料の中に含まれるＳＰ－Ｄの濃度を測定する方法である。本発明におけるＳＰ－Ｄの測定方法としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）及びラテックス免疫比濁法（ＬＴＩＡ法）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の免疫測定方法は、好ましくは、ＬＴＩＡである。
本発明のＳＰ－Ｄの測定方法は、インビボ又はインビトロの免疫測定方法であってもよい。また、感度を増強するために、増感剤を使用することもできる。本発明のＳＰ－Ｄの測定方法において、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体と試料を測定系に添加する順序は、本発明の効果が得られる限りにおいて、限定されることはない。すなわち、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を、試料の添加前に、試料の添加と同時に、又は試料の添加の後に、測定系に添加することができる。
以下、採用する測定方法毎に、測定の手順及び原理を説明する。下記は、本発明の一実施形態における測定の手順及び原理を単に例示するものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
下記の免疫測定方法の各々において、モノクローナル抗体の固相への固定化の方法、モノクローナル抗体と標識物質との結合方法及び標識物質の種類等の具体的な方法は、前述のものを含め、当業者に周知の方法を制限なく使用することができる。
（ラテックス免疫比濁法）
ラテックス免疫比濁法とは、ラテックス粒子表面に担持された抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体とＳＰ－Ｄとが結合することによって生じるラテックス粒子の凝集を利用した免疫測定方法である。ラテックス粒子としては、体外診断薬に一般的に用いられているラテックス粒子であれば特に制限されない。凝集反応測定時のラテックス粒子の濃度、ラテックス粒子の平均粒径等は、感度又は性能に応じて適宜設定することができる。本発明のＳＰ－Ｄの測定方法として、ラテックス免疫比濁法を使用する場合の測定手順及び原理は、以下のとおりである。
（１）抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子と試料と接触させる。
（２）試料中のＳＰ－Ｄが少なくとも２つの抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体と複合体を形成し、ラテックス粒子が凝集する。
（３）試料に近赤外光（例えば波長６００ｎｍ）を照射して、吸光度の測定又は散乱光の測定を行う。測定値に基づき、ＳＰ－Ｄの濃度を求める。
ラテックス免疫比濁法とは、ラテックス粒子表面に担持された抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体とＳＰ－Ｄとが結合することによって生じるラテックス粒子の凝集を利用した免疫測定方法である。ラテックス粒子としては、体外診断薬に一般的に用いられているラテックス粒子であれば特に制限されない。凝集反応測定時のラテックス粒子の濃度、ラテックス粒子の平均粒径等は、感度又は性能に応じて適宜設定することができる。本発明のＳＰ－Ｄの測定方法として、ラテックス免疫比濁法を使用する場合の測定手順及び原理は、以下のとおりである。
（１）抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子と試料と接触させる。
（２）試料中のＳＰ－Ｄが少なくとも２つの抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体と複合体を形成し、ラテックス粒子が凝集する。
（３）試料に近赤外光（例えば波長６００ｎｍ）を照射して、吸光度の測定又は散乱光の測定を行う。測定値に基づき、ＳＰ－Ｄの濃度を求める。
本発明のＳＰ－Ｄの測定方法としてラテックス免疫比濁法を使用する場合、ラテックス粒子は、不溶性担体であり且つ標識物質として作用する。ラテックス粒子に担持されるＳＰ－Ｄと結合するモノクローナル抗体は、１種類のみ、すなわち同一のアミノ酸配列の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体のみである。
測定装置としては、生化学自動分析装置（例えば日立社製、日立自動分析装置３５００）を用いることができる。
（ＥＬＩＳＡ）
本明細書においてＥＬＩＳＡとは、試料中に含まれる被検出物質であるＳＰ－Ｄを、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を利用して捕捉した後に、酵素反応を利用して検出する方法を意味する。固相はプレート（イムノプレートともいう）が好ましい。標識としては、ＨＲＰ又はＡＬＰを使用することができる。本発明のＳＰ－Ｄ測定方法として、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用する場合の測定手順及び原理は、以下のとおりである。
（１）抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を固定化した固相に試料を接触させ、試料中のＳＰ－Ｄが抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体、つまり固相抗体と結合する。
（２）標識した抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体、すなわち標識抗体を固相に添加して反応させると、標識抗体がＳＰ－Ｄに結合して固相抗体－ＳＰ－Ｄ－標識抗体の複合体、すなわちサンドイッチを形成する。
（３）洗浄後、標識物質を発色させ吸光度を測定する。
本明細書においてＥＬＩＳＡとは、試料中に含まれる被検出物質であるＳＰ－Ｄを、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を利用して捕捉した後に、酵素反応を利用して検出する方法を意味する。固相はプレート（イムノプレートともいう）が好ましい。標識としては、ＨＲＰ又はＡＬＰを使用することができる。本発明のＳＰ－Ｄ測定方法として、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用する場合の測定手順及び原理は、以下のとおりである。
（１）抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を固定化した固相に試料を接触させ、試料中のＳＰ－Ｄが抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体、つまり固相抗体と結合する。
（２）標識した抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体、すなわち標識抗体を固相に添加して反応させると、標識抗体がＳＰ－Ｄに結合して固相抗体－ＳＰ－Ｄ－標識抗体の複合体、すなわちサンドイッチを形成する。
（３）洗浄後、標識物質を発色させ吸光度を測定する。
測定した標識物質の量に応じて、試料中のＳＰ－Ｄの量を測定することができる。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法において、二次抗体を用いることもできる。二次抗体を用いることにより、反応が増幅され、検出感度を高めることができる。二次抗体は、下記の例の場合は、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を特異的に認識する抗体である。二次抗体を用いる場合、以下の手順（１）～（５）を採用することができる。
（１）抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を固定化した固相に試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。
（２）抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を添加してインキュベート及び洗浄を行う。
（３）さらに酵素標識した二次抗体を添加してインキュベートを行う。
（４）基質を加えて発色させる。
（５）プレートリーダー等を用いて発色を測定することによりＳＰ－Ｄの量を測定する。
（１）抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を固定化した固相に試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。
（２）抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を添加してインキュベート及び洗浄を行う。
（３）さらに酵素標識した二次抗体を添加してインキュベートを行う。
（４）基質を加えて発色させる。
（５）プレートリーダー等を用いて発色を測定することによりＳＰ－Ｄの量を測定する。
本発明のＳＰ－Ｄの測定方法としてＥＬＩＳＡを使用する場合、ＳＰ－Ｄと結合する固相抗体と標識抗体は、同一種、すなわち同一のアミノ酸配列の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体である。
上記の態様によれば、多量体のＳＰ－Ｄを構成する単量体数の多寡によらず、正確なＳＰ－Ｄの定量が可能である。
＜測定キット＞
本発明の一態様におけるＳＰ－Ｄの測定キットは、抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体が担持されている不溶性担体を含む第１試薬と、前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体と標識物とを含む標識抗体を含む第２試薬と、を含む。
本発明の一態様におけるＳＰ－Ｄの測定キットは、抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体が担持されている不溶性担体を含む第１試薬と、前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体と標識物とを含む標識抗体を含む第２試薬と、を含む。
不溶性担体と標識物とは、同一の物質であってもよく、ラテックス粒子であってもよい。不溶性担体に担持されているＳＰ－Ｄモノクローナル抗体と、標識抗体のＳＰ－Ｄモノクローナル抗体は、同一種、つまり同一のアミノ酸配列の抗体である。
ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体は、３量体の肺サーファクタントプロテインＤに結合し、１つの３量体の肺サーファクタントプロテインＤに対し、１つのみが結合する。少なくとも２つのＳＰ－Ｄモノクローナル抗体は、１２量体又は３６量体のＳＰ－Ｄと結合する。
ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体、不溶性担体、標識物及び標識抗体については、上述の通りであり、その内容を適用することができる。
本発明の一態様におけるＳＰ－Ｄの測定キットは、ＳＰ－Ｄの測定に使用される標準抗原物質、精度管理用抗原試料といった、他の検査試薬及び検体希釈液の少なくとも１つを含んでいてもよい。
なお、以上説明した、本発明のモノクローナル抗体の調製方法、本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸分子、この核酸分子を含むベクター又はプラスミド、この核酸分子やベクター又はプラスミドを含む細胞、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ等も、本発明の対象となる。
以下では実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は後述する実施例に限定されるものではない。
＜モノクローナル抗体の調製＞
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製の組換えヒトＳＰ－Ｄ（以下、ｒＳＰ－Ｄ）を免疫原とした。ｒＳＰ－Ｄを、初回免疫はＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ （Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２回目免疫以降はＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ （Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と１：１で混合して用いた。Ｂａｌｂ／ｃマウス又はＦ３４４／Ｊｃｌラットに対し、初回免疫は２５μｇ、２回目免疫以降２０μｇ（ＰＢＳで希釈）の免疫原量を用い、隔週で皮下免疫を継続した。３回免疫実施後に抗原固相化ＥＬＩＳＡにより血中抗体力価を評価した。十分な力価上昇の確認できた個体については、解剖の１～３日前にＰＢＳで希釈した免疫原を腹腔免疫した。その後、脾臓細胞、腸骨リンパ節細胞及び鼠頸部リンパ節細胞を回収し、電気融合法によりミエローマ細胞ＳＰ２／０と融合した。融合細胞（すなわちハイブリドーマ）は、９６ｗｅｌｌプレートで培養し、融合から７又は８日後に培養上清を回収した。その後、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡによるスクリーニングを実施し、ｒＳＰ-Ｄに反応性を示す株を選択した。なお、スクリーニング前日に培地交換を行った。
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製の組換えヒトＳＰ－Ｄ（以下、ｒＳＰ－Ｄ）を免疫原とした。ｒＳＰ－Ｄを、初回免疫はＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ （Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２回目免疫以降はＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ （Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と１：１で混合して用いた。Ｂａｌｂ／ｃマウス又はＦ３４４／Ｊｃｌラットに対し、初回免疫は２５μｇ、２回目免疫以降２０μｇ（ＰＢＳで希釈）の免疫原量を用い、隔週で皮下免疫を継続した。３回免疫実施後に抗原固相化ＥＬＩＳＡにより血中抗体力価を評価した。十分な力価上昇の確認できた個体については、解剖の１～３日前にＰＢＳで希釈した免疫原を腹腔免疫した。その後、脾臓細胞、腸骨リンパ節細胞及び鼠頸部リンパ節細胞を回収し、電気融合法によりミエローマ細胞ＳＰ２／０と融合した。融合細胞（すなわちハイブリドーマ）は、９６ｗｅｌｌプレートで培養し、融合から７又は８日後に培養上清を回収した。その後、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡによるスクリーニングを実施し、ｒＳＰ-Ｄに反応性を示す株を選択した。なお、スクリーニング前日に培地交換を行った。
＜抗ＳＰ－Ｄ抗体のスクリーニング＞
ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（ＮＵＮＣ４４２４０４）にｒＳＰ－Ｄ（１μｇ／ｍＬ ｉｎ ＰＢＳ）を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で２時間静置した。ＰＢＳＴを４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ）を１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間あるいは４℃で終夜静置した。ブロッキング液を除去後、細胞培養上清と１０００及び１００００倍希釈の抗血清をそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄後、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製，９５００倍希釈）又はＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製，８５００倍希釈）を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１０分間静置した。停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、反応停止後、プレートリーダーで測定した（Ａｂｓ．４９２ｎｍ）。これにより、ｒＳＰ-Ｄに反応性を示す抗体を選抜した。獲得した抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を表１に示す。
ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（ＮＵＮＣ４４２４０４）にｒＳＰ－Ｄ（１μｇ／ｍＬ ｉｎ ＰＢＳ）を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で２時間静置した。ＰＢＳＴを４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ）を１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間あるいは４℃で終夜静置した。ブロッキング液を除去後、細胞培養上清と１０００及び１００００倍希釈の抗血清をそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄後、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製，９５００倍希釈）又はＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製，８５００倍希釈）を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１０分間静置した。停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、反応停止後、プレートリーダーで測定した（Ａｂｓ．４９２ｎｍ）。これにより、ｒＳＰ-Ｄに反応性を示す抗体を選抜した。獲得した抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を表１に示す。
＜分析例１＞ 抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体の特異性確認
ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（ＮＵＮＣ４４２４０４）にｒＳＰ－Ｄ、組換えヒトサーファクタントＡ（ＳＰ-Ａ）、組換えヒトＣｏｌｌｅｃｔｉｎ Ｌｉｖｅｒ１（ＣＬＬ１）及び組換えヒトＭａｎｎａｎ-Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｌｅｃｔｉｎ（ＭＢＬ）抗原の混合液（各１μｇ／ｍＬ ｉｎ ＰＢＳ）を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で２時間静置した。ＰＢＳＴを５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ）を１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間あるいは４℃で終夜静置した。ブロッキング液を除去後、表２に示す各抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体溶液（５μｇ／ｍＬ）をそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄後、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製，１０３１－０５、９５００倍希釈）又はＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製，３０５０－１５、８５００倍希釈）を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１０分間静置した。停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、反応停止後、プレートリーダーで測定した（Ａｂｓ．４９２ｎｍ）。各ウェルの測定値から、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を分注せずに測定したウェルの測定値を減算して検出値を算出した結果を表２に示す。いずれの抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体もｒＳＰ－Ｄのみに強く反応し、ＳＰ－Ｄ以外の抗原との反応性は全くないか極めて低かった。
ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（ＮＵＮＣ４４２４０４）にｒＳＰ－Ｄ、組換えヒトサーファクタントＡ（ＳＰ-Ａ）、組換えヒトＣｏｌｌｅｃｔｉｎ Ｌｉｖｅｒ１（ＣＬＬ１）及び組換えヒトＭａｎｎａｎ-Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｌｅｃｔｉｎ（ＭＢＬ）抗原の混合液（各１μｇ／ｍＬ ｉｎ ＰＢＳ）を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で２時間静置した。ＰＢＳＴを５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ）を１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間あるいは４℃で終夜静置した。ブロッキング液を除去後、表２に示す各抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体溶液（５μｇ／ｍＬ）をそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄後、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製，１０３１－０５、９５００倍希釈）又はＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製，３０５０－１５、８５００倍希釈）を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１０分間静置した。停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、反応停止後、プレートリーダーで測定した（Ａｂｓ．４９２ｎｍ）。各ウェルの測定値から、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を分注せずに測定したウェルの測定値を減算して検出値を算出した結果を表２に示す。いずれの抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体もｒＳＰ－Ｄのみに強く反応し、ＳＰ－Ｄ以外の抗原との反応性は全くないか極めて低かった。
＜分析例２＞ 抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体と生体試料由来のＳＰ－Ｄとの反応性評価
Ｏｃｔｅｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｒｅｄ３８４）を用い、分子間相互作用測定により抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体と羊水中に含まれる生体由来ＳＰ－Ｄとの反応性を評価した。Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所）で定法通りにビオチン化した抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体をストレプトアビジンセンサーに結合させ、ブロッキング処理を行った。１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ（ツイーン（登録商標）入りリン酸緩衝食塩水）で５倍希釈した羊水、又は、１μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬに調整したｒＳＰ－Ｄと抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体との反応性を評価した。結果を図１に示す。図１に示す通り、獲得したすべての抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体がｒＳＰ－Ｄ及び羊水中の生体由来ＳＰ－Ｄと反応した。
Ｏｃｔｅｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｒｅｄ３８４）を用い、分子間相互作用測定により抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体と羊水中に含まれる生体由来ＳＰ－Ｄとの反応性を評価した。Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所）で定法通りにビオチン化した抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体をストレプトアビジンセンサーに結合させ、ブロッキング処理を行った。１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ（ツイーン（登録商標）入りリン酸緩衝食塩水）で５倍希釈した羊水、又は、１μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬに調整したｒＳＰ－Ｄと抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体との反応性を評価した。結果を図１に示す。図１に示す通り、獲得したすべての抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体がｒＳＰ－Ｄ及び羊水中の生体由来ＳＰ－Ｄと反応した。
＜分析例３＞ サンドイッチＥＬＩＳＡによる生体試料由来ＳＰ－Ｄ検出
獲得した抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を組み合わせて、血清中のＳＰ－Ｄを検出可能か検討した。ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルにＰＢＳで５μｇ／ｍＬに調製した固相抗体としての抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で２時間静置した。各ウェルを５ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳＴ（洗浄液）が４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄し、各ウェルに１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ（ブロッキング液）を１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注して室温で１時間静置した。各ウェルからブロッキング液を除去し、各ウェルに血清を５ｍＭの塩化カルシウムを含む１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴでＳＰ－Ｄ濃度が１００ｎｇ／ｍＬになるように希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注して室温で１時間静置した。各ウェルを洗浄液が４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄し、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所）で定法通りにビオチン化したビオチン化抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を５ｍＭの塩化カルシウムを含む１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴで０．２μｇ／ｍＬに調製した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるようそれぞれ分注し、室温で１時間静置した。各ウェルを洗浄液が４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、５ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳで０．２μｇ／ｍＬに調製したＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で３０分間静置した。洗浄液３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１０分間静置した。停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、プレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
獲得した抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を組み合わせて、血清中のＳＰ－Ｄを検出可能か検討した。ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルにＰＢＳで５μｇ／ｍＬに調製した固相抗体としての抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で２時間静置した。各ウェルを５ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳＴ（洗浄液）が４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄し、各ウェルに１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ（ブロッキング液）を１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注して室温で１時間静置した。各ウェルからブロッキング液を除去し、各ウェルに血清を５ｍＭの塩化カルシウムを含む１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴでＳＰ－Ｄ濃度が１００ｎｇ／ｍＬになるように希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注して室温で１時間静置した。各ウェルを洗浄液が４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄し、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所）で定法通りにビオチン化したビオチン化抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を５ｍＭの塩化カルシウムを含む１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴで０．２μｇ／ｍＬに調製した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるようそれぞれ分注し、室温で１時間静置した。各ウェルを洗浄液が４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、５ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳで０．２μｇ／ｍＬに調製したＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で３０分間静置した。洗浄液３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１０分間静置した。停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、プレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
吸光度が０．１未満の抗体組合せを－、０．１以上０．５未満のモノクローナル抗体組合せを＋、０．５以上１．０未満のモノクローナル抗体組合せを＋＋、１．０以上のモノクローナル抗体組合せを＋＋＋とした結果を表３に示す。同じモノクローナル抗体同士の組合せを含む、複数の抗体組合せで血清中のＳＰ－Ｄを検出可能であった。特に、Ｓ２１２０２、Ｓ２１２０５及びＳ２１２０８抗体を組み合わせた場合に生体試料由来のＳＰ－Ｄを高感度に検出可能であった。
＜分析例４＞ ｒＳＰ－Ｄの多量体分布解析１
ＴＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬカラム（Ｃｙｔｉｖａ）に、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のｒＳＰ－Ｄを５５μｇ含む溶液をそれぞれ添加し、流速０．７ｍＬ／分でゲルろ過クロマトグラフィーを実施した。その際のＵＶ吸光度を記録した。１００μＬの５％ＢＳＡを含むＴＢＳを予め分注したチューブに、４００μＬずつ溶出液を分取した。分取後のフラクションはよく混合後、分注して－３０℃で保存した。
ＴＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬカラム（Ｃｙｔｉｖａ）に、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のｒＳＰ－Ｄを５５μｇ含む溶液をそれぞれ添加し、流速０．７ｍＬ／分でゲルろ過クロマトグラフィーを実施した。その際のＵＶ吸光度を記録した。１００μＬの５％ＢＳＡを含むＴＢＳを予め分注したチューブに、４００μＬずつ溶出液を分取した。分取後のフラクションはよく混合後、分注して－３０℃で保存した。
図２に、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のｒＳＰ－Ｄをゲル濾過クロマトグラフィーで分析した際のクロマトグラムを示す。主に、１２量体のＳＰ－Ｄはフラクション１４、３量体のＳＰ－Ｄはフラクション２３で溶出した。
＜抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体によるｒＳＰ－Ｄゲルろ過フラクションの検出１＞
抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体Ｓ２１２０８、Ｓ２１２０５及びＳ２１２０２を用いて、Ｓ２１２０８固相―Ｓ２１２０８液相（実施例１）、Ｓ２１２０２固相―Ｓ２１２０２液相（実施例２）、Ｓ２１２０５固相―Ｓ２１２０８液相（比較例１）、Ｓ２１２０２固相―Ｓ２１２０５液相（比較例２）の四つのＥＬＩＳＡ系を用い、以下に記載の手順で分析例４で得られた各フラクションのｒＳＰ－Ｄを測定した。
抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体Ｓ２１２０８、Ｓ２１２０５及びＳ２１２０２を用いて、Ｓ２１２０８固相―Ｓ２１２０８液相（実施例１）、Ｓ２１２０２固相―Ｓ２１２０２液相（実施例２）、Ｓ２１２０５固相―Ｓ２１２０８液相（比較例１）、Ｓ２１２０２固相―Ｓ２１２０５液相（比較例２）の四つのＥＬＩＳＡ系を用い、以下に記載の手順で分析例４で得られた各フラクションのｒＳＰ－Ｄを測定した。
ＥＬＩＳＡ用プレートにＰＢＳで５μｇ／ｍＬに調製した固相抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で２時間静置した。５ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳＴが４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ（ブロッキング液）を１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。ブロッキング液を除去後、５ｍＭの塩化カルシウムを含む１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴで１０００倍希釈した分析例４で得られた各フラクションを５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。洗浄液が４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所）で定法通りにビオチン化したビオチン化抗体を５ｍＭの塩化カルシウムを含む１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴで０．２μｇ／ｍＬに調製した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。洗浄液が４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、５ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳで０．２μｇ／ｍＬに調製したＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で３０分間静置した。洗浄液が４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１０分間静置した。停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、プレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
これらの結果を表４に示す。同一の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体でＳＰ－Ｄをサンドイッチ検出する実施例１及び２においては、フラクション１４に含まれる１２量体のＳＰ－Ｄを検出した一方で、フラクション２３に含まれる３量体のＳＰ－Ｄを検出しなかった。異なる抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体２種を用いてＳＰ－Ｄをサンドイッチ検出する比較例１及び２においては、１２量体、３量体いずれのＳＰ－Ｄも検出可能であった。以上の結果から、同一の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体でＳＰ－Ｄをサンドイッチ検出することによって、３量体よりも大きい量体のＳＰ－Ｄのみを検出可能であることが分かった。
＜分析例５＞ ｒＳＰ－Ｄの多量体分布解析２
分析例４と同様の方法でＲ＆Ｄ社製又はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のｒＳＰ－Ｄのゲル濾過クロマトグラフィーを実施した。２１７μｇのｒＳＰ－Ｄをゲル濾過クロマトグラフィーに供した。
分析例４と同様の方法でＲ＆Ｄ社製又はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のｒＳＰ－Ｄのゲル濾過クロマトグラフィーを実施した。２１７μｇのｒＳＰ－Ｄをゲル濾過クロマトグラフィーに供した。
図３に、Ｒ＆Ｄ社製のｒＳＰ－Ｄ及びＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のｒＳＰ－Ｄをゲル濾過クロマトグラフィーで分析した際のクロマトグラムを示す。主に、３６量体以上のＳＰ－Ｄはフラクション８、１２量体のＳＰ－Ｄはフラクション１２、３量体のＳＰ－Ｄはフラクション２０で溶出した。Ｒ＆Ｄ社製のｒＳＰ－Ｄは、３６量体以上のＳＰ－Ｄが、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のｒＳＰ－Ｄは、１２量体のＳＰ－Ｄが主たる構成物であった。以降、Ｒ＆Ｄ社製のＳＰ－Ｄを分析した際にｎ番目に溶出したフラクションをフラクションＲｎ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のＳＰ－Ｄを分析した際にｎ番目に溶出したフラクションをフラクションＧｎとする。３６量体以上のＳＰ－Ｄが多く含まれるフラクションＲ８のＵＶ吸光度は２４．６８ｍＡＵ、１２量体のＳＰ－Ｄが多く含まれるフラクションＧ１２のＵＶ吸光度は１１．５３ｍＡＵであった。ｒＳＰ－Ｄのタンパク質濃度は、ＵＶ吸光度と比例するため、フラクションＲ８中の３６量体以上のＳＰ－Ｄと、フラクションＧ１２中の１２量体のＳＰ－Ｄのタンパク質量比は２．１４：１である。
＜ｒＳＰ－Ｄゲルろ過フラクションの検出２＞
抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体Ｓ２１２０８、Ｓ２１２０５及びＳ２１２０２を用いて、Ｓ２１２０８固相―Ｓ２１２０８液相（実施例１）、Ｓ２１２０５固相―Ｓ２１２０８液相（比較例１）、Ｓ２１２０２固相―Ｓ２１２０５液相（比較例２）の三つのＥＬＩＳＡ系を用い、＜抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体によるｒＳＰ－Ｄゲルろ過フラクションの検出１＞と同様の手順により分析例５で得られた各フラクションのｒＳＰ－Ｄを測定した。
抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体Ｓ２１２０８、Ｓ２１２０５及びＳ２１２０２を用いて、Ｓ２１２０８固相―Ｓ２１２０８液相（実施例１）、Ｓ２１２０５固相―Ｓ２１２０８液相（比較例１）、Ｓ２１２０２固相―Ｓ２１２０５液相（比較例２）の三つのＥＬＩＳＡ系を用い、＜抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体によるｒＳＰ－Ｄゲルろ過フラクションの検出１＞と同様の手順により分析例５で得られた各フラクションのｒＳＰ－Ｄを測定した。
これらの結果を表５に示す。同一の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体でＳＰ－Ｄをサンドイッチ検出する実施例１では、３６量体以上のＳＰ－Ｄが含まれるフラクションＲ８を測定した際の吸光度と１２量体のＳＰ－Ｄが含まれるフラクションＧ１２を測定した際の吸光度との比は、２．７６：１であり、ゲルろ過クロマトグラフィーにおける３６量体以上のＳＰ－Ｄと１２量体のＳＰ－Ｄとのタンパク質量比である２．１４：１と同等であった。また、実施例１は、フラクションＧ２０に含まれる３量体のＳＰ－Ｄを検出しなかった。
異なる抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体２種を用いてＳＰ－Ｄをサンドイッチ検出する比較例１及び２においては、３量体のＳＰ－Ｄを検出可能であった。一方で、３６量体以上のＳＰ－Ｄが含まれるフラクションＲ８を測定した際の吸光度と１２量体のＳＰ－Ｄが含まれるフラクションＧ１２を測定した際の吸光度の比はそれぞれ１：０．８７、１：０．４４であり、ゲル濾過クロマトグラフィーにおけるＳＰ－Ｄの多量体それぞれのタンパク質の量比を反映していなかった。より具体的には、ゲル濾過クロマトグラフィーの結果からタンパク質の量が３６量体以上のＳＰ－Ｄよりも少ないはずである１２量体のＳＰ－Ｄが含まれるフラクションを測定した吸光度の方が３６量体以上のＳＰ－Ｄが含まれるフラクションを測定した際の吸光度より高くなった。
以上の結果から、同一の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体で１２量体以上のＳＰ－Ｄをサンドイッチ検出すると、ＳＰ－Ｄの多量体における基本ユニットの数に依らず、実際のタンパク質の量を反映した測定が可能であると考えられた。
＜ＳＰ－Ｄ測定用ＬＴＩＡ試薬の調製＞
１）第一試薬
第一試薬として下記の組成の溶液を調製した。
１００ｍＭ ＭＥＳ－ＮａＯＨ （ｐＨ６．０）
５００ｍＭ ＮａＣｌ
０．５％ ＢＳＡ
１）第一試薬
第一試薬として下記の組成の溶液を調製した。
１００ｍＭ ＭＥＳ－ＮａＯＨ （ｐＨ６．０）
５００ｍＭ ＮａＣｌ
０．５％ ＢＳＡ
２）抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス粒子溶液
平均粒子径３１７ｎｍ、臨界凝集濃度２８０ｍＭの１％ポリスチレンラテックス溶液（積水メディカル社製）（１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液）に、等量の１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液で０．３５ｍｇ／ｍＬに希釈した抗ＳＰ－Ｄ抗体溶液を添加して４℃、２時間攪拌した。その後、等量の０．５％ＢＳＡを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液を添加して４℃、１時間攪拌し、抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス溶液を作製した。
平均粒子径３１７ｎｍ、臨界凝集濃度２８０ｍＭの１％ポリスチレンラテックス溶液（積水メディカル社製）（１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液）に、等量の１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液で０．３５ｍｇ／ｍＬに希釈した抗ＳＰ－Ｄ抗体溶液を添加して４℃、２時間攪拌した。その後、等量の０．５％ＢＳＡを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液を添加して４℃、１時間攪拌し、抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス溶液を作製した。
３）第二試薬
３－１）実施例２
２）に記載の手順で調製したＳ２１２０８抗体感作ラテックス粒子溶液の波長６００ｎｍにおける吸光度が６．０Ａｂｓ．となるように５ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）緩衝液で希釈して第二試薬とした。
３－１）実施例２
２）に記載の手順で調製したＳ２１２０８抗体感作ラテックス粒子溶液の波長６００ｎｍにおける吸光度が６．０Ａｂｓ．となるように５ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）緩衝液で希釈して第二試薬とした。
３－２）比較例３
２）に記載の手順で調製したＳ２１２０５抗体感作ラテックス粒子溶液の波長６００ｎｍの吸光度が３．０Ａｂｓ．、Ｓ２１２０８抗体感作ラテックス粒子溶液の波長６００ｎｍにおける吸光度が６．０Ａｂｓ．となるように５ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）緩衝液と抗体感作ラテックス粒子溶液とを混合して第二試薬とした。
２）に記載の手順で調製したＳ２１２０５抗体感作ラテックス粒子溶液の波長６００ｎｍの吸光度が３．０Ａｂｓ．、Ｓ２１２０８抗体感作ラテックス粒子溶液の波長６００ｎｍにおける吸光度が６．０Ａｂｓ．となるように５ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）緩衝液と抗体感作ラテックス粒子溶液とを混合して第二試薬とした。
＜ＳＰ－Ｄ測定試薬によるｒＳＰ－Ｄゲルろ過フラクションの定量＞
１）ＬＴＩＡ試薬による測定方法
第一試薬と第二試薬とを組み合わせ、生化学自動分析装置（日立社製、日立自動分析装置３５００）を用いて、以下の手順により分析例５で得られた各フラクション中のＳＰ－Ｄ濃度を測定及び算出した（実施例２及び比較例３）。各フラクション５μＬに第一試薬を１２０μＬずつ加えて、３７℃、５分間加熱した。第二試薬を４０μＬずつ添加して攪拌した。５分間の吸光度変化を、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定した。既知濃度の組み換えＳＰ－Ｄ（Ｒ＆Ｄ社）測定時の単位時間における吸光度変化量を横軸に、組み換えＳＰ－Ｄ濃度を縦軸にプロットして作成した検量線を用いて、各フラクション中のＳＰ－Ｄ濃度を算出した。
１）ＬＴＩＡ試薬による測定方法
第一試薬と第二試薬とを組み合わせ、生化学自動分析装置（日立社製、日立自動分析装置３５００）を用いて、以下の手順により分析例５で得られた各フラクション中のＳＰ－Ｄ濃度を測定及び算出した（実施例２及び比較例３）。各フラクション５μＬに第一試薬を１２０μＬずつ加えて、３７℃、５分間加熱した。第二試薬を４０μＬずつ添加して攪拌した。５分間の吸光度変化を、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定した。既知濃度の組み換えＳＰ－Ｄ（Ｒ＆Ｄ社）測定時の単位時間における吸光度変化量を横軸に、組み換えＳＰ－Ｄ濃度を縦軸にプロットして作成した検量線を用いて、各フラクション中のＳＰ－Ｄ濃度を算出した。
２）ＣＬ ＳＰ－Ｄ「ヤマサ」ＮＸ（ヤマサ醤油株式会社、既認証体外用診断薬（以下、既認証試薬とする））による測定方法
既認証試薬の添付文書に従って分析例５で得られた各フラクションを測定した（比較例４）。既認証試薬の添付文書によると、当該試薬は、異なる２種類の抗ヒトＳＰ－Ｄマウスモノクローナル抗体を用いた化学発光酵素免疫測定法を原理として、血清中のＳＰ－Ｄを測定する試薬である。
既認証試薬の添付文書に従って分析例５で得られた各フラクションを測定した（比較例４）。既認証試薬の添付文書によると、当該試薬は、異なる２種類の抗ヒトＳＰ－Ｄマウスモノクローナル抗体を用いた化学発光酵素免疫測定法を原理として、血清中のＳＰ－Ｄを測定する試薬である。
表６は、分析５で得られたフラクションＲ８、Ｒ１２及びＲ２０を用いたときのＳＰ－Ｄ濃度測定値を示す。図４は、実施例２における分析５で得られた各フラクションのＳＰ－Ｄ濃度測定値を示すグラフである。図５は、比較例３における分析５で得られた各フラクションのＳＰ－Ｄ濃度測定値を示すグラフである。図６は、比較例４における分析５で得られた各フラクションのＳＰ－Ｄ濃度測定値を示すグラフである。
実施例２では、実施例１のＥＬＩＳＡと同様にゲル濾過クロマトグラフィーにおける３６量体以上のＳＰ－Ｄと１２量体のＳＰ－Ｄのタンパク質量比（２．１４：１）と同等の量比でＳＰ－Ｄを検出した。また実施例２では３量体のＳＰ－Ｄを含むフラクションＧ２０の測定値と、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいてフラクションＧ２０よりもタンパク質含有量が低く測定されているフラクションＧ１８の測定値とが同等であり、実施例２は３量体のＳＰ－Ｄを実質的には検出しないと考えられた。
一方、異なる抗体２種を用いた比較例３及び比較例４ではゲル濾過クロマトグラフィーの結果とは異なり、３６量体以上のＳＰ－Ｄを含むフラクションＲ８の測定値よりも１２量体のＳＰ－Ｄを含むフラクションＧ１２の測定値の方が低く算出された。また、比較例３及び比較例４は、いずれも３量体のＳＰ－Ｄを含むフラクションＧ２０測定時にフラクションＧ１８を測定した際よりも高い測定値を示し、３量体のＳＰ－Ｄを検出していた（図５、６）。以上より、同一抗体を用いてＳＰ－Ｄをサンドイッチ検出する場合、ＬＴＩＡ試薬によってもＳＰ－Ｄの多量体における基本ユニットの数に依らず、実際のタンパク質の量を反映した測定が可能であった。
上記態様によれば、多量体の肺サーファクタントプロテインＤを構成する単量体数の多寡によらず正確な定量が可能である肺サーファクタントプロテインＤの測定方法、測定キット、及びこれらに用いられるモノクローナル抗体並びにこの抗体を生産する細胞を提供することができる。
［受託番号］
ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２５
ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２６
なお、ＮＰＭＤは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）を示すアクロニムである。
ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２５
ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２６
なお、ＮＰＭＤは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）を示すアクロニムである。
Claims (13)
- 肺サーファクタントプロテインＤを含む試料と、抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体を担持させた不溶性担体とを接触させる工程と、
前記肺サーファクタントプロテインＤと少なくとも２つの前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体との複合体を検出する工程と、を含み、
前記不溶性担体は、前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体として一種の抗体のみが担持されている、肺サーファクタントプロテインＤの測定方法。 - 前記不溶性担体がラテックス粒子である、請求項１に記載の測定方法。
- 前記不溶性担体が平板状であり、
前記複合体が前記不溶性担体に担持されている前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体と、前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体と標識物とを含む標識抗体とを含む、請求項１に記載の測定方法。 - 前記試料が血清または血漿である、請求項１に記載の測定方法。
- 前記肺サーファクタントプロテインＤが３量体の肺サーファクタントプロテインＤである基本ユニットを少なくとも１つ含み、
１つの前記基本ユニットに対し、前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体が１つのみ結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の測定方法。 - 前記検出する工程において３量体の肺サーファクタントプロテインＤが検出されない、請求項５に記載の測定方法。
- 前記検出する工程において、前記基本ユニットが２つ以上会合した肺サーファクタントプロテインＤを検出する、請求項６に記載の測定方法。
- 抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体が担持されている不溶性担体を含む第１試薬と、前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体と標識物とを含む標識抗体を含む第２試薬と、を含む肺サーファクタントプロテインＤの測定キット。
- 前記不溶性担体と前記標識物とが同一の物質である、請求項８に記載の測定キット。
- ３量体の肺サーファクタントプロテインＤに結合するモノクローナル抗体であって、
１つの前記３量体の肺サーファクタントプロテインＤに対し、１つのみが結合する、モノクローナル抗体。 - １２量体以上の肺サーファクタントプロテインＤに少なくとも２つが結合する、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項１０又は１１に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
- 独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２５又は受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２６として受託された、ハイブリドーマ。
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|---|---|---|---|
| JP2023-046633 | 2023-03-23 | ||
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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