JP2001033450A - 安定化された抗原含有水溶液 - Google Patents
安定化された抗原含有水溶液Info
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Abstract
安定化法、安定化された抗原含有水溶液、および安定化
された抗原含有水溶液を構成試薬として含有する肺サー
ファクタント蛋白質測定用キットを提供する。 【解決手段】肺サーファクタント蛋白質と２価金属イオ
ンを共存させ、肺サーファクタント蛋白質の抗原活性を
安定化する方法に関する。
Description
白質における抗原活性の安定化法、安定化された抗原含
有水溶液、および安定化された抗原含有水溶液を構成試
薬として含有する肺サーファクタント蛋白質測定用キッ
トに関するものである。
クタントに特異的なアポタンパク質（ＳＰ）であり、現
在までに親水性のＳＰ−ＡとＳＰ−Ｄ、および疎水性の
ＳＰ−ＢとＳＰ−Ｃの４種類が報告されている。その中
でも、ＳＰ−Ｄは気道−肺胞系における生体防御機構に
おいて重要な役割を果たしていると考えられており、抗
原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル（血
清など）中のＳＰ−Ｄを測定し、特発性間質性肺炎など
の肺疾患を診断できることが報告されている（医学と薬
学 36(4):803-808（1996）参照）。
ている方法は、組換えＤＮＡ手法により取得されるリコ
ンビナントSP-D（ｒＳＰ−Ｄ）を標準物質として使用し
ており、このｒＳＰ−Ｄが25℃以上になると抗原性を徐
々に失ってしまうため、標準抗原溶液を低温で保存する
とともに測定時の反応温度も4℃などの低温で行わなけ
ればならず、更なる操作性、安定性の向上が望まれてい
た。
点を解決すべく鋭意検討した結果、まったく意外なこと
にＳＰ−Ｄとカルシウムなどの２価金属イオンを共存さ
せるだけで、37℃の条件下でも抗原活性が失活せずに安
定化されること見いだし、本発明を完成させた。
白質と２価金属イオンを共存させ、肺サーファクタント
蛋白質の抗原活性を安定化する方法に関するものであ
る。また、本発明は、肺サーファクタント蛋白質と２価
金属イオンとからなる安定化された抗原含有水溶液に関
するものである。さらに、本発明は、抗原抗体反応を利
用した免疫学的手法によりサンプル中の肺サーファクタ
ント蛋白質を測定するためのキットであって、標準抗原
溶液として肺サーファクタント蛋白質と２価金属イオン
とからなる抗原含有水溶液を構成試薬として含有するこ
とを特徴とする、肺サーファクタント蛋白質測定用キッ
トに関するものである。
ト蛋白質とは、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−ＣおよびＳ
Ｐ−Ｄのいずれであってもかまわないが、特に断らない
限り診断項目として有用性が確認されているＳＰ−Ａま
たはＳＰ−Ｄを意味する。
白質と２価金属イオンを共存させ、肺サーファクタント
蛋白質の抗原活性を安定化する方法に関するものであ
る。共存させる２価金属イオンとしては、周期表２族ａ
亜族元素の２価金属イオンであればよく、具体的にはカ
ルシウム、バリウム、マグネシウムなど各イオン例示す
ることができ、特にカルシウムイオンが好適である。こ
のような２価金属イオンは、肺サーファクタント蛋白質
と共存していればよく、必ずしも水溶液の状態である必
要はない。後述の実施例に示すように、溶液状はもとよ
り、肺サーファクタント蛋白質をプレートに結合させ、
大方の水分を取り除いた状態であっても２価金属イオン
を共存させることにより肺サーファクタント蛋白質を安
定化させることが可能である。共存させる２価金属イオ
ンの濃度は特に制限されるものではないが、通常０．０
０１〜１０００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１００ｍＭ
の範囲から適宜選定すればよい。
質と２価金属イオンとからなる安定化された抗原含有水
溶液に関するものである。肺サーファクタント蛋白質と
２価金属イオンは上述したものを使用することができ
る。ＳＰ−Ｄとカルシウムイオンを例に挙げ、具体的に
説明すれば、塩化カルシウムなどの金属無機塩を水また
は適当な緩衝液に溶解させ、これに組換えＤＮＡ手法に
より調製したリコンビナントＳＰ−Ｄ（ｒＳＰ−Ｄ）を
添加することにより本発明の安定化された抗原含有水溶
液を調製することができる。２価金属イオンの濃度は特
に制限されるものではないが、通常０．００１〜１００
０ｍＭ、好ましくは０．０１〜１００ｍＭの範囲から適
宜選定すればよい。
た免疫学的手法によりサンプル中の肺サーファクタント
蛋白質を測定するためのキットであって、標準抗原溶液
として肺サーファクタント蛋白質と２価金属イオンとか
らなる抗原含有水溶液を構成試薬として含有することを
特徴とする、肺サーファクタント蛋白質測定用キットに
関するものである。このようなキットを、ＥＬＩＳＡ法
によるＳＰ−Ｄ測定キットを例に挙げ、具体的に説明す
れば、たとえば以下のキットを例示することができる。 （キットＡ） 固相化抗ＳＰ−Ｄ抗体試薬 酵素標識化抗ＳＰ−Ｄ抗体試薬 ＳＰ−Ｄ標準抗原溶液（カルシウムイオン含有） さらに、上記キットに診断用キットに通常添付されてい
る酵素反応基質液、酵素反応停止液、洗浄液などを添付
してもよい。特に、２価金属イオンを含有する洗浄液、
具体的には０．００１〜１０００ｍＭ、好ましくは０．
０１〜１００ｍＭのカルシウムイオンを含有する洗浄液
を添付することにより、測定中のＳＰ−Ｄの抗原活性を
より強固に安定化することで測定精度を高めるととも
に、操作性も向上させることができる。このようなキッ
トの使用法は、例えば、医学と薬学 36(4),1996 804
−８０８（１９９６）などに記載の公知の測定方法に準
じて行えばよい。
ＳＰ−Ｄ）と２価金属イオン（たとえば、カルシウムイ
オン）を共存させることで、肺サーファクタント蛋白質
の抗原活性を安定化することは本発明者らによって初め
て見いだされたことである。このことにより、従来低温
保存を要求されていた肺サーファクタント蛋白質の標準
抗原液は常温でも保存流通が可能になるとともに、測定
時の反応温度も常温で行うことができ、肺サーファクタ
ント蛋白質の免疫学的測定の操作性、汎用性を飛躍的に
向上せしめることが可能となった。また、液状の安定性
のみならず、プレート上に結合した肺サーファクタント
蛋白質の安定性も２価金属イオンを共存させることで向
上させることができ、精度および操作性が向上した肺サ
ーファクタント蛋白質の測定が初めて可能となった。
るが、本発明はこれに限定されるものではない。
血清アルブミン、0.5%トライトンX-100、pH7.2）に、最
終濃度で１０ｍＭなるように塩化カルシウム、塩化マグ
ネシウムまたは塩化カリウムを添加、あるいは５ｍＭ
になるようにＥＤＴＡを添加した。この緩衝液を希釈用
緩衝液とする。また、当該希釈用緩衝液にｒＳＰ−Ｄを
一定量添加し、4℃または37℃で3時間インキュベート
し、これをサンプル液とした。このような希釈用緩衝
液、サンプル液を用い、ヤマサ醤油株式会社製のＳＰ−
Ｄ測定キットを使用して、医学と薬学 36(4),804−８
０８（１９９６）記載の測定法（以下、標準操作法とい
う）に従ってサンプル液中のＳＰ−Ｄを測定した。その
結果を表１に記す。表１から明らかなように、２価金属
イオン、特にカルシウムイオンがＳＰ−Ｄの抗原活性の
安定に有効であることが明らかとなった。
mM HEPES、150mM塩化ナトリウム、0.5%トライトンX-10
0、1.0%ウシ血清アルブミン）を用いてｒＳＰ−Ｄを希
釈して標準抗原液を調製した。この標準抗原液ならびに
カルシウム無添加標準抗原液を4℃または37℃で3時間イ
ンキュベート後、標準操作法に従って、標準抗原液中の
ＳＰ−Ｄを測定した。その結果を図１に示す。その結
果、図１に示すように、カルシウム添加標準液は37℃、
３時間処理後も4℃の場合と同等の抗原性を保持するこ
とが認められた。一方、カルシウム無添加の場合は37
℃、３時間処理で50%以上抗原性の失活が確認された。
安定性 実施例２で調製した、10mM塩化カルシウムを添加した標
準抗原液およびカルシウム無添加の標準抗原液を用いて
25℃、30℃または37℃で1、3、6時間または一晩インキ
ュベート後、標準操作法に従って標準抗原液中のＳＰ−
Ｄを測定した。カルシウムの添加により大幅に熱安定性
が向上し、30℃、37℃でも6時間、25℃ならば一晩処理
しても90%以上抗原活性が保持できることが明らかとな
った。
トに結合させ、この固相化抗体と実施例２で調製したカ
ルシウム含有標準抗原液を４℃で一晩反応させた。次
に、洗浄液（10mM HEPES、150mM塩化ナトリウム、pH7.
2）と、この洗浄液に10mM塩化カルシウムを添加したカ
ルシウム添加洗浄液にて各ウエルを3回洗浄後、紙タオ
ル等の上で水分を完全に取り除き乾燥状態にした。その
状態のまま5分間または10分間放置した後、以後標準操
作法に従ってＳＰ−Ｄを測定した。その結果を図２およ
び図３に示す。カルシウム無添加洗浄液を用いた場合は
5分放置で10%、10分では15%吸光度が低下した。しかし
カルシウム添加洗浄液を用いた場合では10分放置しても
5%の低下にとどまり、プレート上でもカルシウムイオン
の共存でＳＰ−Ｄが安定化することが明らかとなった。
でのＳＰ−Ｄ抗原活性の安定性を示すものである。縦軸
は４℃での抗原活性を１００％としたときの相対活性
（％）を、横軸は抗原液の濃度を示す。
た場合のプレート上でのＳＰ−Ｄ抗原活性の安定性を示
すものである。縦軸は洗浄直後の放置時間が０分の時の
抗原活性を１００％としたときの相対活性（％）を、横
軸は抗原液の濃度を示す。
場合のプレート上でのＳＰ−Ｄ抗原活性の安定性を示す
ものである。縦軸は洗浄直後の放置時間が０分の時の抗
原活性を１００％としたときの相対活性（％）を、横軸
は抗原液の濃度を示す。
Claims (10)
- 【請求項１】 肺サーファクタント蛋白質と２価金属
イオンを共存させ、肺サーファクタント蛋白質の抗原活
性を安定化する方法。 - 【請求項２】 肺サーファクタント蛋白質が肺サーフ
ァクタント蛋白質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）である、請求項１記載
の方法。 - 【請求項３】 ２価金属イオンがカルシウムイオンで
ある、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 肺サーファクタント蛋白質と２価金属
イオンとからなる抗原含有水溶液。 - 【請求項５】 肺サーファクタント蛋白質が肺サーフ
ァクタント蛋白質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）である、請求項４記載
の抗原含有水溶液。 - 【請求項６】 ２価金属イオンがカルシウムイオンで
ある、請求項４記載の抗原含有水溶液。 - 【請求項７】 抗原抗体反応を利用した免疫学的手法
によりサンプル中の肺サーファクタント蛋白質を測定す
るためのキットであって、標準抗原溶液として肺サーフ
ァクタント蛋白質と２価金属イオンとからなる抗原含有
水溶液を構成試薬として含有することを特徴とする、肺
サーファクタント蛋白質測定用キット。 - 【請求項８】 さらに、洗浄液として２価金属イオン
を含む洗浄液が添付されている、請求項７記載のキッ
ト。 - 【請求項９】 肺サーファクタント蛋白質が肺サーフ
ァクタント蛋白質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）である、請求項７また
は８記載のキット。 - 【請求項１０】 ２価金属イオンがカルシウムイオン
である、請求項７または８記載のキット。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP20769999A JP3573330B2 (ja) | 1999-07-22 | 1999-07-22 | 安定化された抗原含有水溶液 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP20769999A JP3573330B2 (ja) | 1999-07-22 | 1999-07-22 | 安定化された抗原含有水溶液 |
Publications (2)
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|---|---|
| JP2001033450A true JP2001033450A (ja) | 2001-02-09 |
| JP3573330B2 JP3573330B2 (ja) | 2004-10-06 |
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ID=16544113
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20769999A Expired - Lifetime JP3573330B2 (ja) | 1999-07-22 | 1999-07-22 | 安定化された抗原含有水溶液 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3573330B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7776619B2 (en) | 2005-05-11 | 2010-08-17 | Yamasa Corporation | Method of stabilizing pulmonary surfactant protein |
| JP2021063707A (ja) * | 2019-10-11 | 2021-04-22 | 株式会社シノテスト | 安定化されたｈｍｇｂ１含有溶液 |
| JP2021519757A (ja) * | 2018-03-29 | 2021-08-12 | エアウェイ・セラピューティクス・インコーポレイテッド | サーファクタントタンパク質ｄ（ｓｐ−ｄ）を含む方法及び組成物 |
| WO2023145915A1 (ja) * | 2022-01-31 | 2023-08-03 | 積水メディカル株式会社 | 肺サーファクタントプロテインの免疫測定方法及び免疫測定試薬 |
| WO2024195854A1 (ja) * | 2023-03-23 | 2024-09-26 | 積水メディカル株式会社 | 肺サーファクタントプロテインｄの測定方法、測定キット、モノクローナル抗体及び細胞 |
-
1999
- 1999-07-22 JP JP20769999A patent/JP3573330B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
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| JP7425459B2 (ja) | 2019-10-11 | 2024-01-31 | 株式会社シノテスト | 安定化されたｈｍｇｂ１含有溶液 |
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