CN113088579B

CN113088579B - 一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法

Info

Publication number: CN113088579B
Application number: CN202110279354.4A
Authority: CN
Inventors: 叶枫; 占扬清; 高晓庆; 李少强; 李征途; 斯叶琦; 段昆; 韩序; 汤健丽; 王珺
Original assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Health; Hangzhou Jieyi Biotechnology Co ltd; First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Current assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Health; Hangzhou Jieyi Biotechnology Co ltd; First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2021-03-16
Filing date: 2021-03-16
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2041-03-16
Also published as: CN113088579A

Abstract

本发明提出了一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法。利用RNA恒温扩增和CRISPR检测技术开发的耶氏肺孢子菌定性检测试剂盒，主要包括：1)扩增缓冲液；2)扩增酶；3)检测缓冲液；4)检测酶；5)矿物油；6)质控品，此技术是对待测样本中核糖核苷酸(RNA)进行扩增检测，具有灵敏度高，特异性强，适用于活菌检测。操作简单，对温控要求低，可降低实验室设备要求，缩短检测时间，易实现自动化操作。为所检测样本的定植、感染状态提供参考，具有重大的临床意义。

Description

一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法

技术领域

本发明属于耶氏肺孢子菌检测技术领域，具体涉及一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法。

背景技术

肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia，PCP)，又称为耶氏肺孢子菌肺炎(Pneumocystis jirovecii pneumonia，PJP)，是由耶氏肺孢子菌(Pneumocystisjirovecii)引起，曾经被命名为卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii)，发生于免疫功能受损者，特别是HIV感染者、造血干细胞移植(HCT)和实体器官移植受者、血液系统恶性肿瘤，以及接受糖皮质激素、肿瘤化疗药物和其他免疫抑制药物的患者。其经呼吸道进入人体后，可长期潜伏于气管、支气管或肺泡腔内，形成无症状的隐性感染；当宿主免疫力降低时，处于潜伏状态或新侵入的P.jirovecii开始进行繁殖，产生大量滋养体和包囊，并在肺组织内迅速扩散，引起严重的PCP。

自1984年发现首例艾滋病以来，PCP发病率呈急剧增加的趋势，相关资料表明，该病已是艾滋病患者最主要的并发症和致死原因。另外，随着肿瘤化疗患者、长期接受免疫抑制剂治疗的器官移植受者、自身免疫性疾病患者的增加，非人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者的PCP发病率明显增高，病死率高达30％～50％。大概全世界95％的人口在出生后2年内被感染，但健康的成年人是P.jirovecii的无症状携带者。在这些不同的人群中，症状和疾病的严重程度不仅取决于潜在的疾病，还取决于P.jirovecii的负载量，早期发现真菌载量低的携带者和感染的患者至关重要。

目前国内诊断PCP主要依据患者存在的高危感染因素、临床表现、肺部影像学、P.jirovecii病原学结果。其中以呼吸道标本镜检发现特征性包囊、滋养体作为诊断金标准，但由于PCP临床表现缺乏特异性，传统的染色法检测肺孢子菌对检验人员的技术要求较高，而且操作繁琐，以及非HIV感染的PCP患者体内肺孢子菌的负荷量较少，临床阳性诊断率低，制约了PCP病原学诊断率的提高。许多因素会使PCP的诊断变得棘手，例如非特异性症状、其他感染共存以及难以建立该病原体的可靠培养系统等，使得目前的标准临床试验缺乏高灵敏度和灵活性。因此，PCP的准确诊断仍然是一个严峻挑战。

分子诊断技术利用标本中核酸作为检测对象，具有特异性高、灵敏度高、诊断范围广、适应性强而被广泛应用。大量研究指出，荧光定量PCR(qPCR)对微生物检测的灵敏度及阳性预测值都远远高于传统PCR，同时能通过定量方式初步评估菌体定植及感染负荷状态，对确定是否开展抗PCP治疗及制定抗PCP治疗的方案都至关重要。但多数荧光定量检测均是检测P.jirovecii的脱氧核糖核苷(DNA)，而DNA具有双链结构，较稳定，不易降解。治愈后仍有“死菌”残留，人体内完全代谢需2-3周时间，因此在DNA核酸用于分子诊断过程中，易出现“死菌检测为阳性”，不能区分“潜伏感染”和“活动性感染”，易产生交叉污染等，与临床相关性差。相反，RNA呈单链结构，易降解，病原体死亡后2-3天后完全降解，与临床相关性好，有利于疗效评估和及时判愈。有些情况下，可以直接诊断“活动性感染”。并且产物易降解，减少实验室污染风险，维护实验室质控水平。

本专利中一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的方法即利用RNA等温扩增技术，对提取后的靶标RNA进行特异性扩增富集；再通过CRISPR核酸酶特异性识别扩增后的靶标RNA并获得RNA酶活性，切割荧光底物使得荧光基团和荧光淬灭基团分离，从而产生荧光信号；最后由核酸扩增分析仪读取荧光数值，根据荧光信号强弱对检验结果进行分析判定。

发明内容

本发明基于RNA恒温扩增和CRISPR检测，提供了一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法。相比于目前的荧光定量PCR，本试剂盒不需要精密的荧光定量PCR仪器，扩增检测产物为RNA，不易产生污染，特异性好，可实现对P.jirovecii的定性检测。为P.jirovecii核酸检测提供了一种快速，方便，灵敏度高的方法，对PCP的临床诊断具有重大的指导意义。

本发明的第一个目的是提供一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)扩增缓冲液：包括针对P.jirovecii线粒体大亚基设计的一对特异性扩增引物(上游扩增引物SEQ ID NO.1、下游扩增引物SEQ ID NO.2)，dNTP，NTP，ITP，DTT，二甲基亚砜DMSO，氯化镁，氯化钾，山梨醇，牛血清白蛋白(BSA)；其中，上游扩增引物SEQ ID NO.1序列为TGCGAAAATTGTTTTGGCAA，下游扩增引物SEQ ID NO.2序列为aattctaatacgactcactatagggagaTCTACCTTATCGCACATAGTCTGA；

(2)扩增酶：包括逆转录酶AMV，T7 RNA聚合酶和RNA酶H；

(3)检测缓冲液：包括针对P.jirovecii线粒体大亚基设计的一条特异性检测探针(SEQ ID NO.3)，荧光报告探针(SEQ ID NO.7)，NTP，DTT，氯化钠，氯化镁等；其中，SEQ IDNO.3序列为taatacgactcactataggggatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacAATCTCAAAATAACTATTTCTTAAAATAA；SEQ ID NO.7序列为FAM-/i2OMeA/AUGGC/i2OMeA/-BHQ1；

(4)检测酶：包含Cas13a，T7 RNA聚合酶和RNA酶抑制剂；

(5)矿物油；

(6)质控品：包含阳性质控品和阴性质控品。

进一步地，所述特异性检测探针SEQ ID NO.3经过检测酶在检测缓冲液中反应后产生crRNA，可以与Cas13蛋白结合并特异性的识别靶向RNA序列，其crRNA序列(SEQ IDNO.4)序列为gaUUUagacUaccccaaaaacgaaggggacUaaaacAAUCUCAAAAUAACUAUUUCUUAAAAUAA。

所述荧光报告探针为一段单链RNA序列，其5’端标记有荧光基团(FAM)，3’端标记有淬灭基团(BHQ1)。

下游扩增引物5’端包含一段含有T7启动子的序列SEQ ID NO.5，其序列为aattctaatacgactcactatagggaga。

上述试剂盒扩增的核酸序列SEQ ID NO.8，其序列为TGCGAAAATTGTTTTGGCAAATTGTTTATTCCTCTAAAAAATAGTAGGTATAGCACTGAATATCTCGAGGGAGTATGAAAATATTTATCTCAGATATTTAATCTCAAAATAACTATTTCTTAAAATAAATAATCAGACTATGTGCGATAAGGTAGA。

上述试剂盒扩增产物为RNA，其序列如SEQ ID NO.9所示：UCUACCUUAUCGCACAUAGUCUGAUUAUUUAUUUUAAGAAAUAGUUAUUUUGAGAUUAAAUAUCUGAGAUAAAUAUUUUCAUACUCCCUCGAGAUAUUCAGUGCUAUACCUACUAUUUUUUAGAGGAAUAAACAAUUUGCCAAAACAAUUUUCGCA。

所述特异性检测探针包含一段T7启动子序列SEQ ID NO.6，用于T7 RNA聚合酶的作用下产生crRNA，其序列为taatacgactcactataggg。

进一步地，用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，具体包括以下组分：

(1)扩增缓冲液：10-100mM Tris-HCl pH7.5-pH8.5，扩增引物0.1～2μM，dNTP0.1-10mM，NTP 0.2-20mM，ITP 0.1-5mM，1～10mM DTT，0-25％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)，2-50mM氯化镁，20-100mM氯化钾，0.01M-0.5M山梨醇，牛血清白蛋白(BSA)0.1-100μg/反应；

(2)扩增酶：逆转录酶AMV 0.5-100U/反应，T7 RNA聚合酶1-1000U/反应，RNA酶H0.02-5U/反应，20-300mM Potassium Phosphate,pH 7.5，1-10mM Dithiothreitol(DTT)，20-50％(v/v)甘油，0.01％-1％Triton X-100，20-100mM Tris-HC1(pH 7.5)，0.01-0.5mMEDTA，20-200mM NaCl，20～200mM KCl；

(3)检测缓冲液：特异性检测探针crDNA 1ng-100ng，荧光报告探针0.01-2μM，0.1-20mM NTP，1-20mM DTT，20-100mM氯化钠，1-50mM氯化镁，0-50mM氯化钾，1-50mM氯化镁，1％-25％(v/v)聚乙二醇4000；

(4)检测酶：Cas13a蛋白1ng-10μg/反应，T7 RNA聚合酶1～1000U/反应，RNA酶抑制剂1～200U/反应，20-100mM Tris-HC1(pH 7.5)，1-10mM Dithiothreitol(DTT)，20-50％(v/v)甘油，0.01％-1％Triton X-100，0.01-0.5mM EDTA，20-600mM NaCl；

(5)矿物油：矿物油5-100μL/反应；

(6)质控品：所述阳性质控品为含P.jirovecii-mtLSUrRNA基因检测片段的RNA核酸和人源细胞核酸溶液；所述阴性质控品为提取后的人源细胞核酸。

本发明的第二个目的是提供一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样本的RNA核酸；

(2)以提取的RNA为模板，根据权利要求1所述试剂盒组分，配制RNA核酸扩增体系及CRISPR检测体系，并以阳性质控品和阴性质控品为对照；

(3)分别进行RNA扩增和检测，根据检测荧光信号值进行结果分析，判断样本中是否存在感染状态的P.jirovecii。

进一步地，步骤(2)所述的扩增体系为：3.5μl扩增反应液，1.5μl的RNA模板；步骤(2)所述的检测体系为：45μl检测反应液。

步骤(3)所述的扩增程序为41℃，50min；步骤(3)所述的检测程序为37℃，30min。

所述的RNA模板为65℃，预变性5min后的RNA核酸。

步骤(3)所述结果分析方法为：荧光检测曲线呈上升趋势，30min的终点荧光信号值高于4200判定为P.jirovecii为阳性；荧光检测曲线呈水平状态，30min的终点荧光信号值低于4000判定为P.jirovecii为阴性。

本发明用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法，其靶点选择如下：

(1)国内外研究中，用于检测P.jirovecii的可供选择的靶基因有肺孢子菌的内转录间隙rRNA基因、18SrRNA基因、5SrRNA基因、线粒体大亚基rRNA基因(mtLSUrRNA)、二氢叶酸合成酶(DHFS)基因、主要表面糖蛋白(MSG)基因和胸苷酸合成酶等基因。最常用于临床诊断PCP的是mtLSUrRNA基因、DHFS基因，及MSG基因。根据靶标基因设计的qPCR引物和探针，定量检测P.jirovecii，借此来判断患者的定植、感染状态。

(2)线粒体DNA(mtDNA)存在于真核细胞的线粒体内，其组成包括编码线粒体内大小亚基rRNA的基因及一些特有酶的基因等，素有“分子钟”之称，常用于检测种内变异及分子系统发生的研究。由于其基因组序列的高重复性，因此以其为靶基因利用PCR扩增检测肺孢子菌的敏感性及特异性均高于其他方法。

(3)并且线粒体基因组拷贝数与P.jirovecii(Pj)的生存状态相关，当Pj快速繁殖时线粒体基因组数量增加以提供足够能量，而此时Pj可能处于致病状态。当Pj处于静息状态时，线粒体数量维持低水平，此时Pj可能处于定植状态，所以以mtLSUrRNA基因为靶基因的qPCR临床应用价值较高。

(4)本研究中以mtLSUrRNA基因为靶基因，对其RNA核酸进行扩增检测，通过定性的方式来判断患者的定植、感染状态。

本发明试剂盒的主要优点在于：

(1)不需要昂贵且精密的荧光定量PCR仪器；

(2)反应的全过程中都不易产生污染；

(3)灵敏度高；

(4)特异性高；

(5)实现了对真菌的“活动性感染”诊断。

附图说明

图1为阴性质控品和阳性质控品实时荧光检测曲线图；

图2为阴性质控品和阳性质控品30min时荧光信号图；

图3为耶氏肺孢子菌灵敏度检测结果，灵敏度高达2*10³copies/ml，即最低检测限为3拷贝/反应；

图4为耶氏肺孢子菌特异性检测结果，特异性高，常见的病原体均是阴性的信号；

图5为部分临床样本检测结果；

图6为特异性扩增RNA核酸验证结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图，对本发明提供的技术方法进行详细的阐述与说明，所述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，并不局限于本发明全部的实施例。以下实施例中所用到的试剂组分除特别说明外，均为本发明试剂盒中的组分。本领域的专业人员在本发明基础上的修改或者改动，这些等价修改的方式同样落在本发明权利要求书中所述的权利要求范围。

实施例1：

用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，具体包括以下组分：

(1)扩增缓冲液：10-100mM Tris-HCl pH7.5-pH8.5，扩增引物0.1～2μM(SEQ IDNO.1,SEQ ID NO.2)，dNTP 0.1-10mM，NTP 0.2-20mM，ITP 0.1-5mM，1～10mM DTT，0-25％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)，2-50mM氯化镁，20-100mM氯化钾，0.01M-0.5M山梨醇，牛血清白蛋白(BSA)0.1-100μg/反应；

(3)检测缓冲液：特异性检测探针crDNA1ng-100ng，荧光报告探针0.01-2μM，0.1-20mM NTP，1-20mM DTT，20-100mM氯化钠，1-50mM氯化镁，0-50mM氯化钾，1-50mM氯化镁，1％-25％(v/v)聚乙二醇4000；

(5)矿物油：矿物油5-100μL/反应；

质控品：所述阳性质控品为含mtLSUrRNA基因检测片段的RNA核酸和人源细胞核酸溶液；所述阴性质控品为提取后的人源细胞核酸。

实施例2：阴性质控品和阳性质控品的检测

(1)实验材料

体外转录试剂盒使用的是HiScribeT7 Quick High Yield RNA Synthesis kit(New England Biolabs)；RNA纯化试剂盒使用的是RNA Clean&Concentrator-5kit(ZymoResearch)。

(2)标准品的制备

阴性质控品：提取后的人源细胞核酸，浓度为1～10ng/μL；

阳性质控品：人工合成的含T7启动子序列(SEQ ID NO.10)和P.jirovecii线粒体大亚基目的检测片段(SEQ ID NO.11)的质粒，经体外转录试剂盒得到mtLSUrRNA基因的RNA产物，通过RNA纯化试剂盒进行纯化，得到含mtLSUrRNA基因检测片段的RNA核酸。用1～10ng/μL的人源细胞核酸按照10倍比依次稀释至1fg/μL(约2*10⁶copies/ml)，即阳性质控品。

(3)扩增与检测

a.按照使用说明，将试剂盒中的各组分置于室温解冻，并混匀备用。

b.扩增反应：参照下表中各组分用量，在无核酸酶的离心管中配制4份扩增反应液；分别吸取3.5μL扩增反应液加入反应管1、反应管2、反应管3和反应管4中，再向各反应管中加入8μL矿物油；将阳性质控品和阴性质控品置于65℃条件下，预变性5min，然后分别向反应管1和反应管2中加入1.5μL阴性质控品，向反应管3和反应管4中加入1.5μL阳性质控品；瞬时离心后将反应管至于等温扩增反应设备(如PCR仪或者恒温金属浴)中41℃，反应50min。

c.检测反应：参照下表中各组分用量，在无核酸酶的离心管中配制4份检测反应液；分别吸取45μL检测反应液加入扩增结束的反应管1、反应管2、反应管3和反应管4中；瞬时离心后，将反应管至于核酸扩增分析仪中，进行实时检测。核酸扩增分析仪程序设置如下：37℃，每30s读取一次荧光值，实时检测30min(本发明中试剂盒的荧光读取仪器设备适用于杭州杰毅生物技术有限公司生产的核酸扩增分析仪器FMS-800M)。

(4)结果判断

荧光检测曲线呈上升趋势，且30min的终点荧光信号值高于4200判定为P.jirovecii阳性；荧光检测曲线呈水平状态，且30min的终点荧光信号值低于4000判定为P.jirovecii阴性。

(5)结果分析

由图1可知：阳性质控品荧光检测曲线呈上升趋势，而阴性质控品荧光检测曲线呈水平状态。

由图2可知：阳性质控品30min的终点荧光信号值高于4200；而阴性质控品30min的终点荧光信号值低于4000。

因此，此检测与判断方法可正确快速的区分阴性质控品和阳性质控品。

实施例3：耶氏肺孢子菌灵敏度的检测

(1)同实施例2中标准品的制备过程，继续用1～10ng/μL的人源细胞核酸依次稀释含mtLSUrRNA基因检测片段的RNA核酸，分别获得10ag/μL(约2*10⁴copies/ml)、5ag/μL(1*10⁴copies/ml)、1ag/μL(约2*10³copies/ml)和0.1ag/μL(约2*10²copies/ml)的待检RNA核酸溶液。

(2)同实施例2中的扩增和检测的体系与条件，每个核酸样本设置2个重复进行扩增检测。

(3)结果分析：如图3所示，阴性质控品检测结果为阴性，阳性质控品检测结果为阳性；高于1ag/μL(约2*10³copies/ml)的RNA核酸溶液检测结果均为阳性，而0.1ag/μL(约2*10²copies/ml)的RNA核酸溶液检测结果为阴性。因此，本试剂盒的灵敏度为2*10³copies/ml，即最低检测限为3拷贝/反应。

实施例4：耶氏肺孢子菌特异性的检测

(1)以试剂盒内的阴阳性质控品作为对照，以常见呼吸道或肺部感染的病原体核酸样本作为特异性干扰样本进行测试，这些病原体样本包括蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus，溶血葡萄球菌Staphylococcus haemolyticus，铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa，鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii，结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis，流感嗜血杆菌Haemophilus influenzae，鹦鹉热衣原体Chlamydiapsittaci，粘液奈瑟菌Neisseria mucilaginis，纹带棒状杆菌corynebacteriumstriatum，嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia，小韦荣氏球菌Veillonellaparvula，人疱疹病毒1型Human herpesvirus 1，粘滑罗斯氏菌Rosella mucilaginosa，产黑素普雷沃氏菌Prevotella melanogenes，烟曲霉Aspergillus fumigatus，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，洋葱伯克霍尔德氏菌群Burkholderia cepacia，肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae，白色假丝酵母Candida albicans，肺炎克雷伯氏菌klebsiella pneumoniae。

(2)扩增和检测的体系与条件同实施例2，对以上核酸样本分别设置2个重复，进行同步扩增后检测。

(3)结果分析：如图4所示，除阳性质控品检测结果为阳性外，其余样本检测结果均为阴性；由此可见，本试剂盒的特异性高，在常见的其他呼吸道或肺部感染的病原体中均不会产生交叉信号。

实施例5：耶氏肺孢子菌临床样本的检测

(1)选取10例临床上确诊的P.jirovecii患者的肺泡灌洗液，用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒进行RNA核酸提取，作为待检核酸样本。(2)扩增和检测的体系与条件同实施例2，以试剂盒内的阴阳性质控品作为对照，每个待检核酸样本设置2个重复，进行同步扩增后检测。

(3)结果分析：如图5所示，除阴性质控品检测结果为阴性外，其余样本检测结果均为阳性，与临床确诊结果相符合。表明本试剂盒的检测准确性高。

实施例6：特异性扩增耶氏肺孢子菌RNA核酸验证的检测

(1)取1例P.jirovecii阳性的RNA核酸溶液，平均分成3等分，一份不做处理(NoTreatmented)，一份用RNase酶处理(RNase Treatmented)，另一份用DNase酶处理(DNaseTreatmented)；处理结束后，分别用核酸纯化试剂盒进行纯化得到待测核酸样本。

(2)扩增和检测的体系与条件同实施例2，以试剂盒内的阴阳性质控品作为对照，每个待检核酸样本设置2个重复，进行同步扩增后检测。

(3)结果分析：如图6所示，阳性质控品、No Treatmented核酸溶液和DNaseTreatmented核酸溶液检测结果均为阳性，而阴性质控品和RNase Treatmented核酸溶液检测结果均为阴性。由此可见，本试剂盒的检测方法，只对RNA核酸进行扩增并检测。因此能够特异性的检测样本中P.jirovecii的RNA核酸，而不受DNA核酸的影响。

序列表

<110> 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心）

广州呼吸健康研究院

杭州杰毅生物技术有限公司

<120> 一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法

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<212> DNA

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tgcgaaaatt gttttggcaa 20

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

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<210> 3

<211> 85

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

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<211> 28

<212> DNA

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<400> 5

aattctaata cgactcacta tagggaga 28

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taatacgact cactataggg 20

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<212> DNA

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aggc 4

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

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<212> DNA

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<212> DNA

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aatacgactc actataggg 19

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<212> DNA

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taatgaagat gattctgaac agggatataa agtattgtgt attagacccg aaatctagtg 60

atcttactat gatcagacaa cttcaggtcg aactggtgta cgtcgcaaag tactcagaag 120

aattgtggta agtagtgaaa tacaaatcgg actaggatat agctggtttt ctgcgaaaat 180

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attaactgta atttaattaa aaaaaataag gtagcagaac atttagtaaa tgtgtgaaga 600

atagtatttt attattcgga cataactaaa gagagaatgc tgacatgagt aacgttaaaa 660

Claims

1.一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

（1）扩增缓冲液：包括针对P. jirovecii线粒体大亚基设计的一对特异性扩增引物（上游扩增引物SEQ ID NO.1、下游扩增引物SEQ ID NO.2），dNTP，NTP，ITP，DTT，二甲基亚砜DMSO，氯化镁，氯化钾，山梨醇，牛血清白蛋白（BSA）；其中，上游扩增引物SEQ ID NO.1序列为TGCGAAAATTGTTTTGGCAA，下游扩增引物SEQ ID NO.2序列为aattctaatacgactcactatagggaga TCTACCTTATCGCACATAGTCTGA；

（2）扩增酶：包括逆转录酶AMV，T7 RNA聚合酶和RNA酶H；

（3）检测缓冲液：包括针对P. jirovecii线粒体大亚基设计的一条特异性检测探针（SEQ ID NO.3），荧光报告探针（SEQ ID NO.7），NTP，DTT，氯化钠，氯化镁；其中，SEQ IDNO.3序列为taatacgactcactataggggatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacAATCTCAAAATAA CTATTTCTTAAAATAA；SEQ ID NO.7序列为FAM-/i2OMeA/AUGGC/i2OMeA/-BHQ1；

（4）检测酶：包含Cas13a，T7 RNA聚合酶和RNA酶抑制剂；

（5）矿物油；

（6）质控品：包含阳性质控品和阴性质控品。

2.根据权利要求1所述试剂盒，所述特异性检测探针SEQ ID NO.3经过检测酶在检测缓冲液中反应后产生crRNA，可以与Cas13蛋白结合并特异性的识别靶向RNA序列，其crRNA序列（SEQ ID NO.4）序列为gaUUUagacUaccccaaaaacgaaggggacUaaaacAAUCUCAAAAUAACUAUUUCUUAAAAUAA。

3.根据权利要求1所述试剂盒，所述荧光报告探针为一段单链RNA序列，其5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1。

4.根据权利要求1所述试剂盒，下游扩增引物5’端包含一段含有T7启动子的序列SEQID NO.5，其序列为aattctaatacgactcactatagggaga。

5.根据权利要求1所述试剂盒，所述特异性检测探针包含一段T7启动子序列SEQ IDNO.6，用于T7 RNA聚合酶的作用下产生crRNA，其序列为taatacgactcactataggg。

6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于具体试剂组成如下：

（1）扩增缓冲液：10-100mM Tris-HCl pH7.5-pH8.5，扩增引物0.1~2μM，dNTP 0.1-10mM，NTP 0.2-20mM，ITP 0.1-5mM，1~10 mM DTT，0-25%v/v二甲基亚砜（DMSO），2-50mM氯化镁，20-100mM氯化钾，0.01M-0.5M山梨醇，牛血清白蛋白（BSA）0.1-100μg/反应；

（2）扩增酶：逆转录酶AMV 0.5-100U/反应，T7 RNA聚合酶1-1000U/反应，RNA酶H 0.02-5U/反应，20-300 mM Potassium Phosphate, pH 7.5，1-10 mM Dithiothreitol (DTT)，20-50%v/v甘油，0.01%-1% Triton X-100，20 -100mM Tris-HC1，pH 7.5，0.01-0.5mMEDTA，20-200 mM NaCl，20~200mM KCl；

（3）检测缓冲液：特异性检测探针crDNA 1ng-100ng，荧光报告探针0.01-2μM，0.1-20mMNTP，1-20 mM DTT，20-100mM氯化钠，1-50mM氯化镁，0-50mM氯化钾， 1%-25%v/v聚乙二醇4000；

（4）检测酶：Cas13a蛋白1ng-10μg/反应，T7 RNA聚合酶1~1000U/反应，RNA酶抑制剂1~200U/反应，20 -100mM Tris-HC1 pH7.5，1-10 mM Dithiothreitol(DTT)， 20-50%v/v 甘油，0.01%-1% Triton X-100，0.01-0.5mM EDTA，20-600 mM NaCl；

（5）矿物油：矿物油5-100μL/反应；

（6）质控品：所述阳性质控品为含P. jirovecii-mtLSUrRNA基因检测片段的RNA核酸和人源细胞核酸溶液；所述阴性质控品为提取后的人源细胞核酸。