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WO2021006511A1 - 저색소 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

저색소 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Publication number
WO2021006511A1
WO2021006511A1 PCT/KR2020/008437 KR2020008437W WO2021006511A1 WO 2021006511 A1 WO2021006511 A1 WO 2021006511A1 KR 2020008437 W KR2020008437 W KR 2020008437W WO 2021006511 A1 WO2021006511 A1 WO 2021006511A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
leu
transformant
present
ser
recombinant vector
Prior art date
Application number
PCT/KR2020/008437
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
오상호
이진우
김동현
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
의료법인 성광의료재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 연세대학교 산학협력단, 의료법인 성광의료재단 filed Critical 연세대학교 산학협력단
Publication of WO2021006511A1 publication Critical patent/WO2021006511A1/ko

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    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/18—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with another compound as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.18)
    • C12Y114/18001—Tyrosinase (1.14.18.1)

Definitions

  • the present invention relates to a composition capable of preventing or treating hypopigmentation diseases.
  • UVR ultraviolet
  • These defense mechanisms include DNA damage mechanisms, various enzymes such as catalase and peroxide scavenging enzymes, and skin pigmentation.
  • pigmentation is the most important photo-protective factor.
  • Tyrosinase acts as an important regulator of pigmentation as it promotes two rate-limiting reactions in the synthesis pathway of melanin pigments. These rate-limiting reactions include 1) tyrosine hydroxylation to produce 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA), and 2) DOPA oxidation process to produce dopaquinone. There is this.
  • the visual color in mammalian skin, head, and eyes is due to the quantity, quality and distribution of epithelial cells of melanosomes.
  • the melanosomes are formed by melanocytes, one of the special dendritic cells.
  • Melanin pigments are synthesized in melanosomes and migrate to keratinocytes by dendrites of melanocytes. Thus, the distribution pattern of melanin determines the color of the skin.
  • Melanin pigment protects the skin from UV radiation in a wide wavelength range and absorbs free radicals produced by the skin. Melanin synthesis is regulated by the expression of enzymes involved in melanogenesis. More than 100 proteins are involved in controlling pigmentation.
  • melanin synthesis is initiated by oxidation of tyrosine to dopaquinone, and the oxidation process is catalyzed by a tyrosinase enzyme. Dopaquinone is then converted into eumelanin by intramolecular cyclization and polymerization.
  • vitiligo is a relatively common acquired hypopigmented disease caused by an autoimmune mechanism. Vitiligo occurs when CD8 T cells that recognize autologous melanocyte antigens destroy melanocytes, and innate immunity plays a very important role before the development of an autoimmune mechanism in which CD8 T cells recognize melanocytes. Damage-associated molecular patterns (DAMPs) are well known as substances related to innate immunity as described above, and there are various substances corresponding thereto.
  • DAMPs Damage-associated molecular patterns
  • ATP is a substance that acts as a very important cellular energy source for cell metabolism, but ATP leaked out of the cell while the cell is damaged is known to act as a trigger of autoimmunity and cause various immune diseases.
  • treatments for vitiligo include steroids, immunomodulators, and other treatments aimed at immunomodulating functions, such as ultraviolet treatment, as the main treatment, but the treatment effect is still low, so new treatments are required.
  • An object of the present invention is to provide a composition capable of preventing, improving or treating hypopigmented diseases by introducing a gene encoding a tyrosinase and a gene encoding a PMEL (premelanosome protein) into keratinocytes. .
  • tyrosinase or a gene encoding the same tyrosinase or a gene encoding the same
  • PMEL premelanosome protein
  • a composition for preventing, improving, or treating hypopigmented diseases comprising at least one of the active ingredients.
  • the "tyrosinase” is an oxidase which is a rate-limiting enzyme that regulates melanin production. These enzymes are involved in two distinct reactions of melanin synthesis: the first is the process of hydroxylation of monophenols, and the second is the process of converting o-diphenol to o-quinone. The resulting o-quinone finally forms melanin.
  • the tyrosinase is an enzyme containing copper, may consist of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and may be encoded by a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the "premelanosome protein (PMEL)” corresponds to a type I transmembrane glycoprotein having a size of 100 kDa.
  • the PMEL may consist of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and may be encoded by a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the composition is preferably treated on keratinocytes because it can prevent, improve or treat hypopigmented diseases caused by death of melanocytes.
  • the composition comprises tyrosinase or a gene encoding it; And PMEL (premelanosome protein) or a gene encoding the same; At least one of them may be included as an active ingredient, but preferably, a gene encoding tyrosinase and a gene encoding PMEL may be included.
  • the tyrosinase when only the tyrosinase (or its gene) is introduced into keratinocytes, it is distributed in the cytoplasm and may cause cytotoxicity, but when PMEL (or its gene) is introduced into keratinocytes together, the tyrosinase is added to the keratinocytes.
  • PMEL or its gene
  • composition of the present invention can be used as a pharmaceutical composition, a cosmetic composition or a food composition according to its use.
  • the hypopigmented disease may be any disease induced by the death of melanocytes, such as vitiligo.
  • a gene encoding tyrosinase relates to a recombinant vector comprising at least one of the genes encoding PMEL (premelanosome protein).
  • the "vector” means a means for expressing a gene of interest in a host cell.
  • the vector includes elements for expression of a gene of interest, and may include a replication origin, a promoter, an operator, a transcription termination sequence, etc., and into the genome of a host cell.
  • An appropriate enzyme site e.g., a restriction enzyme site
  • a selectable marker to confirm successful introduction into a host cell
  • a ribosome binding site RBS
  • IRES Internal Ribosome Entry Site
  • the vector may be engineered by a conventional genetic engineering method to have the above-described fusion polynucleotide (fusion promoter) as a promoter.
  • the vector may further contain transcriptional control sequences (eg, enhancers, etc.) other than the promoter.
  • the recombinant vector may be a viral or non-viral vector
  • the viral vector may be an adenovirus vector, a retroviral vector including a lentivirus, an adeno-associated virus vector, or a herpes simplex virus vector.
  • the non-viral vector may be a plasmid vector, a bacteriophage vector, a liposome, an artificial bacterial chromosome, or an artificial yeast chromosome, but is not limited thereto.
  • the target gene in the recombinant vector, may be operably linked to the fusion polynucleotide.
  • operatively linked refers to a functional linkage between a gene expression control sequence and another nucleotide sequence.
  • the gene expression control sequences can be “operatively linked” to control transcription and/or translation of other nucleotide sequences.
  • the fusion polynucleotide in order for the fusion polynucleotide to be operably linked to the target gene, the fusion polynucleotide may be linked to the 5'end of the target gene.
  • the recombinant vector of the present invention can be used as an expression vector of a target protein capable of expressing the target protein with high efficiency in an appropriate host cell when the gene encoding the target protein to be expressed is operably linked.
  • the recombinant vector of the present invention may further include a transcriptional control sequence.
  • the transcription control sequence may include a transcription termination sequence such as a polyadenylation sequence (pA); It may be one or more selected from the group consisting of an origin of replication such as f1 origin of replication, SV40 origin of replication, pMB1 origin of replication, adeno origin of replication, AAV origin of replication, BBV origin of replication, etc., but is not limited thereto.
  • the recombinant vector may further include a selection marker.
  • the selection marker is a gene for confirming whether a recombinant vector has been successfully introduced into a host cell or for constructing a stable cell line, for example, one selected from the group consisting of a drug resistance gene such as an antibiotic, a metabolism-related gene, a gene amplification gene, etc. It can be more than that.
  • the recombinant vector may be one capable of being expressed in a host cell.
  • the host cell may be one capable of strongly inducing the initiation of transcription in an animal cell, and specifically may be one that induces the initiation of transcription in an animal cell such as a mammalian cell, for example, a cell derived from a human. have.
  • the recombinant vector of the present invention can be constructed through various methods known in the art.
  • the recombinant vector provided in the present invention relates to a transformant transformed by introducing it into a host cell.
  • transport (introduction) of the recombinant vector into cells may use a transport method well known in the art.
  • the delivery method is, for example, microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, sonoporation, magnetic injection using a magnetic field (magnetofection), liposome-mediated transfection, gene bombardment (gene bombardment), dendrimers, and inorganic nanoparticles may be used, but are not limited thereto.
  • the host cell may be a mammalian cell, for example, a cell derived from a human, and preferably, a keratinocyte is stably expressed in a hypopigmented disease site induced by apoptosis of melanocytes. Can induce
  • it relates to artificial skin comprising the transformant provided by the present invention.
  • the "artificial skin” is a three-dimensionally reconstructed skin using skin cells and skin-constituents such as collagen and elastin, and consists of living fibroblasts and keratinocytes. It is also called skin equivalent or reconstructed skin because it exhibits structural and functional properties similar to real skin.
  • the artificial skin may include a dermal layer and an epidermal layer, and may include the transformant according to the present invention in the dermal layer, the epidermal layer, or in between, and preferably the transformant according to the present invention in the epidermal layer. It may include.
  • the method of manufacturing the artificial skin is not particularly limited, and may be constructed through various methods known in the art, but may be manufactured, for example, according to the following method.
  • a method of manufacturing artificial skin according to an exemplary embodiment of the present invention includes forming at least one dermal layer; And culturing the transformant according to the present invention on the dermal layer.
  • the step of forming the dermal layer may be performed by culturing fibroblasts in a dermal cell culture medium with dermal cells, preferably dermal cells isolated from human skin.
  • the composition of the dermal cell culture medium is not particularly limited, but, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GIBCO, USA); MEM (Minimal Essential Medium, GIBCO, USA); BME (Basal Medium Eagle, GIBCO, USA); RPMI 1640 (GIBCO, USA); DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10; GIBCO, USA); ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal Essential Medium; GIBCO, USA); G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium, GIBCO, USA); IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium, GIBCO, USA); Alternatively, a medium of KnockOut DMEM (GIBCO, USA) may be used, and preferably a DMEM medium may be used.
  • a medium of KnockOut DMEM GIBCO, USA
  • the "DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)" is a DMEM used in a normal medium
  • the B27 solution (Gibco® B-27® Supplements, Life Technologies) is biotin, DL alpha tocophenol acetate, DL alpha tocophenol , Vitamin A, BSA, catalase, insulin, superoxide dismutase, corticosterone, D-galactose, ethanolamine HCl, glutathione, L-carnitine HCl, linoleic acid, linolenic acid, progesterone, putrescine 2HCl, sodium dialysis High (sodium selenite) and triodo-1-tyronine.
  • the medium for culturing the dermis of the present invention includes 1 to 10% by weight of fetal bovine serum (FBS); And 0.1 to 3% by weight of antibiotics, but is not limited thereto.
  • FBS fetal bovine serum
  • the medium for culturing the dermis of the present invention may further contain ascorbic acid in an amount of 30 to 200 ⁇ g/ml, preferably 50 to 100 ⁇ g/ml.
  • the culture of the dermal cells may be performed under culture conditions of 37° C., 5 vol% CO 2 , and 7 to 40 days, preferably 21 to 35 days, more preferably 25 to 30 days Can be cultivated during.
  • At least one layer of the dermal layer may be formed, and preferably, two to five layers of the dermal layer may be stacked.
  • the step of culturing the transformant according to the present invention on the dermal layer can be performed.
  • keratinocytes when culturing the transformant, may be co-cultured with the transformant as epidermal cells.
  • the cultivation of the transformant may be performed under culture conditions of 37° C., 5 vol% CO 2 , and after primary culture for 3 to 10 days, preferably 5 to 7 days, 7 days It can be secondary cultured for to 30 days, preferably 10 to 20 days.
  • the composition of the culture medium for the primary culture is not particularly limited, but, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GIBCO, USA); MEM (Minimal Essential Medium, GIBCO, USA); BME (Basal Medium Eagle, GIBCO, USA); RPMI 1640 (GIBCO, USA); DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10; GIBCO, USA); ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal Essential Medium; GIBCO, USA); G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium, GIBCO, USA); IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium, GIBCO, USA); Alternatively, a medium of KnockOut DMEM (GIBCO, USA) may be used, and preferably a DMEM medium may be used.
  • a medium of KnockOut DMEM GIBCO, USA
  • the first culture medium of the present invention is fetal bovine serum (FBS) 1 to 10% by weight; And 0.1 to 3% by weight of antibiotics, but is not limited thereto.
  • FBS fetal bovine serum
  • the secondary culture may be performed under air-exposed liquid interface culture conditions.
  • the composition of the culture medium for the secondary culture is not particularly limited, but, for example, DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), a-MEM (Alpha Modification of Eagle's Medium), F12 (Nutrient Mixture F-12), RPMI 1640, Williams' s medium E, McCoy's 5A, or DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) medium can be used.
  • DMEM/F12 medium may be used.
  • the secondary culture medium of the present invention is fetal bovine serum (FBS) 1 to 10% by weight; And 0.1 to 3% by weight of antibiotics, but is not limited thereto.
  • FBS fetal bovine serum
  • the secondary culture medium of the present invention may further contain CaCl 2 in an amount of 0.1 to 2 mM, preferably 0.5 to 1 mM.
  • the artificial skin provided by the present invention can be used for skin transplantation in a mammal, preferably a mammal having a low-pigmentation disease or a high possibility of developing it.
  • the artificial skin provided by the present invention contains the transformant according to the present invention in the epidermal layer, so that pigmentation is induced, and can be used for skin improvement, preferably for testing the efficacy of a cosmetic composition for skin whitening. .
  • the present invention relates to a composition for preventing, improving or treating hypopigmented diseases including artificial skin.
  • composition of the present invention can be used as a pharmaceutical composition, a cosmetic composition or a food composition according to its use.
  • the hypopigmented disease may be any disease induced by the death of melanocytes, such as vitiligo.
  • prevention may include, without limitation, any action of blocking, suppressing or delaying the symptoms of hypopigmented disease using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • treatment may include, without limitation, any action that improves or benefits the symptoms of hypopigmentation disease using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • “improvement” may include, without limitation, any action in which symptoms of a hypopigmented disease are improved or beneficially changed by using the cosmetic composition or food composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders, or beverages, and the pharmaceutical composition may be characterized in that for humans.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not limited thereto, but can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, etc., external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to a conventional method. have.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can be used as binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, coloring agents, flavoring agents, etc. for oral administration, and buffers, preservatives, painlessness, etc. for injections.
  • Agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, and the like can be mixed and used, and in the case of topical administration, a base agent, excipient, lubricant, preservative, etc. can be used.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be variously prepared by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, for oral administration, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixir, suspension, syrup, wafers, etc., and in the case of injections, it can be prepared in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. have.
  • Others, solutions, suspensions, tablets, capsules can be formulated as sustained-release preparations.
  • suitable carriers, excipients and diluents for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil may be used.
  • fillers, anti-aggregating agents, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifying agents, preservatives, and the like may further be included.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not limited thereto, but oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, Includes sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on a number of factors including the activity of the specific compound used, age, weight, general health, sex, formulation, time of administration, route of administration, excretion rate, drug formulation and the severity of the specific disease to be prevented or treated.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's condition, weight, degree of disease, drug form, route and duration of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art, and 0.0001 to 50 mg/kg per day or It can be administered at 0.001 to 50 mg/kg. Administration may be administered once a day, or may be divided several times. The above dosage does not in any way limit the scope of the present invention.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated as a pill, dragee, capsule, liquid, gel, syrup, slurry, or suspension.
  • the cosmetic composition is a lotion, nutritional lotion, nutritional essence, massage cream, beauty bath water additive, body lotion, body milk, bath oil, baby oil, baby powder, shower gel, shower cream, sunscreen lotion, sunscreen cream, Suntan cream, skin lotion, skin cream, sunscreen cosmetics, cleansing milk, depilatory ⁇ cosmetics ⁇ , face and body lotion, face and body cream, skin whitening cream, hand lotion, hair lotion, cosmetic cream, jasmine oil, Bath soap, water soap, beauty soap, shampoo, hand sanitizer (hand cleaner), medicinal soap (non-medical), cream soap, facial wash, body cleaner, scalp cleaner, hair rinse, makeup soap, tooth whitening gel, toothpaste, etc. It can be manufactured in a form.
  • the composition of the present invention may further include a solvent or a suitable carrier, excipient, or diluent that is commonly used in the manufacture of cosmetic compositions.
  • the type of solvent that can be further added to the cosmetic composition of the present invention is not particularly limited, but, for example, water, saline, DMSO, or a combination thereof may be used.
  • a carrier excipient or diluent, purified water, oil, wax , Fatty acids, fatty acid alcohols, fatty acid esters, surfactants, humectants, thickeners, antioxidants, viscosity stabilizers, chelating agents, buffers, lower alcohols, and the like, but are not limited thereto.
  • whitening agents, moisturizing agents, vitamins, sunscreen agents, perfumes, dyes, antibiotics, antibacterial agents, and antifungal agents may be included as needed.
  • Hydrogenated vegetable oil, castor oil, cottonseed oil, olive oil, palm seed oil, jojoba oil, and avocado oil may be used as the oil, and waxes include beeswax, spermaceti, carnauba, candelilla, montan, ceresin, liquid paraffin, and lanolin. Can be used.
  • Stearic acid, linoleic acid, linolenic acid, oleic acid may be used as fatty acids, and cetyl alcohol, octyl dodecanol, oleyl alcohol, panthenol, lanolin alcohol, stearyl alcohol, hexadecanol may be used as fatty alcohols.
  • fatty acid ester isopropyl myristate, isopropyl palmitate, and butyl stearate may be used.
  • surfactant cationic surfactants, anionic surfactants, and nonionic surfactants known in the art can be used, and surfactants derived from natural products are preferred as far as possible.
  • hygroscopic agents thickeners, antioxidants, and the like, which are widely known in the cosmetic field, may be included, and the types and amounts thereof are as known in the art.
  • the food composition comprising the composition of the present invention as an active ingredient can be prepared in the form of various foods, for example, beverages, gum, tea, vitamin complexes, powders, granules, tablets, capsules, confectionery, rice cakes, and bread. . Since the food composition of the present invention is composed of plant extracts with little toxicity and side effects, it can be safely used even when taken for a long time for prophylactic purposes.
  • the amount may be added in a proportion of 0.1 to 50% of the total weight.
  • the food composition is prepared in the form of a beverage
  • various flavoring agents or natural carbohydrates, etc. may be included as in a conventional beverage. That is, as natural carbohydrates, monosaccharides such as glucose, disaccharides such as fructose, and common sugars such as sucrose and polysaccharides, dextrins and cyclodextrins, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol are included. can do.
  • flavoring agent examples include natural flavoring agents (taumatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.).
  • the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavors and natural flavoring agents, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners. , pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonates used in carbonated beverages, and the like.
  • These components may be used independently or in combination.
  • the proportion of these additives is not so important, but is generally selected in the range of 0.1 to about 50 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • tyrosinase or a gene encoding the same provided in the present invention a) tyrosinase or a gene encoding the same provided in the present invention; And PMEL (premelanosome protein) or a gene encoding the same; At least one of; b) a recombinant vector comprising the same; c) a transformant transfected with the recombinant vector; Or d) it provides a method of preventing, improving or treating hypopigmented diseases comprising administering artificial skin containing the transformant.
  • the "individual” is an individual who has or is suspected of developing a hypopigmented disease, and refers to mammals including mice, livestock, etc., including humans, but the subject that can be treated with the effective substance provided by the present invention is limited Included without.
  • the hypopigmented disease may be any disease induced by the death of melanocytes, such as vitiligo.
  • the method of the present invention comprises a) tyrosinase or a gene encoding the same provided in the present invention; And PMEL or a gene encoding the same; At least one of; b) a recombinant vector comprising the same; c) a transformant transfected with the recombinant vector; Or d) it may include administering the artificial skin containing the transformant in a pharmaceutically effective amount.
  • Exemplary routes of administration include intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intrapulmonary, intravascular, intramuscular, intratracheal, subcutaneous, intraocular, intrathecal or transdermal.
  • the dose administered to a subject may vary depending on, for example, the specific type of active ingredient administered, the route of administration, and the specific type and stage of the disease being treated.
  • the amount should be sufficient to bring about the desired response, such as a therapeutic response to cancer, without severe toxicity or adverse events.
  • the amount of active ingredient is at least about 10%, 20%, 30%, 40% compared to the corresponding disease in the same subject prior to treatment, or compared to the corresponding activity in another subject not receiving treatment. , 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or 100% to reduce the progression of the disease, improve the disease or treat the disease by any one of an amount sufficient.
  • Standard methods such as in vitro assays using purified enzymes, cell-based assays, animal models or human experiments can be used to measure the scale of the effect.
  • the transformant (eg, keratinocyte) of the present invention is 1 ⁇ 10 5 ⁇ 5 ⁇ 10 5 , 5 ⁇ 10 5 ⁇ 1 ⁇ 10 6 , 1 ⁇ 10 6 ⁇ 2 ⁇ 10 6 , 2 ⁇ 10 6 ⁇ 3 ⁇ 10 6 , 3 ⁇ 10 6 ⁇ 4 ⁇ 10 6 , 4 ⁇ 10 6 ⁇ 5 ⁇ 10 6 , 5 ⁇ 10 6 ⁇ 6 ⁇ 10 6 , 6 ⁇ 10 6 ⁇ 7 ⁇ 10 6 , 7 ⁇ 10 6 ⁇ 8 ⁇ 10 6 , 8 ⁇ 10 6 ⁇ 1 ⁇ 10 8 , 1 ⁇ 10 6 ⁇ 3 ⁇ 10 6 , 3 ⁇ 10 6 ⁇ 5 ⁇ 10 6 , 5 ⁇ 10 6 ⁇ 7 ⁇ 10 6 , 2 ⁇ 10 6 ⁇ 4 ⁇ 10 6 , 1 ⁇ 10 6 ⁇ 5 ⁇ 10 6 or 5 ⁇ 10 6 ⁇ 1 ⁇ 10 7 It may be administered at a dose of any one cell/individual, but is not limited thereto.
  • the method of preventing or treating the hypopigmented disease may be a combination therapy further comprising administering a compound or substance having therapeutic activity against one or more diseases.
  • the "combination" should be understood to represent simultaneous, individual or sequential administration.
  • the interval between administrations of the second component should be such that the beneficial effects of the combination are not lost.
  • the step of contacting the test substance to the artificial skin provided by the present invention the step of contacting the test substance to the artificial skin provided by the present invention.
  • It relates to a method for screening a cosmetic composition for improving skin comprising the step of measuring the amount of melanin expression after contact with the test substance.
  • the test substance is any substance, molecule, element, compound, entity, or these, which is expected to have skin improvement, preferably skin whitening effect. Includes a combination of. Examples include, but are not limited to, proteins, polypeptides, small organic molecules, polysaccharides, polynucleotides, and the like. It may also be a natural product, a synthetic compound, or a combination of two or more substances.
  • the method of measuring the amount of melanin expression is not particularly limited, and may be performed by a method generally used in the art.
  • NaOH preferably 1N NaOH
  • the absorbance can be measured at 475nm.
  • the step of determining the test substance as a skin improvement preferably a cosmetic composition for skin whitening It may contain more.
  • Recombinant vectors, transformants, and artificial skin provided in the present invention stably induce gene expression of tyrosinase and/or PMEL in keratinocytes to stably induce pigmentation in keratinocytes, thereby killing melanocytes. It is possible to effectively prevent, improve or treat hypopigmented diseases caused by.
  • the artificial skin provided by the present invention may be used for skin improvement, preferably for testing the efficacy of a cosmetic composition for skin whitening.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the expression levels of tyrosinase and PMEL for the tyrosinase and PMEL overexpressing keratinizing cell lines prepared in Example 1 in Experimental Example 1 of the present invention.
  • Figure 2 shows a photograph of the pellets of the tyrosinase and PMEL overexpressing keratinizing cell lines prepared in Example 1 in Experimental Example 2 of the present invention.
  • FIG 3 shows photographs of the artificial skin prepared in Example 2 and the artificial skin prepared in Comparative Example 1 in Experimental Example 3 of the present invention.
  • Example 4 is a cross-sectional view of each artificial skin after performing H&E, Fontana-Masson, and Melan-A tissue staining on the artificial skin prepared in Example 2 and the artificial skin prepared in Comparative Example 1 in Experimental Example 4 of the present invention. It shows the picture taken.
  • tyrosinase or a gene encoding the same tyrosinase or a gene encoding the same
  • PMEL premelanosome protein
  • a composition for preventing, improving or treating hypopigmented diseases comprising a recombinant vector comprising at least one of or a transformant transformed by introducing the recombinant vector into a host cell as an active ingredient.
  • tyrosinase provided in the present invention or a gene encoding the same; And PMEL (premelanosome protein) or a gene encoding the same; It provides a method for preventing, improving or treating hypopigmented diseases comprising the step of administering a recombinant vector comprising at least one of or a transformant transformed by introducing the recombinant vector into a host cell.
  • the host cell may be a mammalian cell, for example, a cell derived from a human, and preferably, a keratinocyte is stably expressed in a hypopigmented disease site induced by apoptosis of melanocytes. Can induce
  • it relates to artificial skin comprising the transformant provided by the present invention.
  • the step of contacting the test substance to the artificial skin provided by the present invention relates to a method for screening a cosmetic composition for skin improvement comprising the step of measuring the expression amount of melanin after contact with the test substance.
  • Transfer plasmid is a cDNA purchased from the Korea Gene Bank (KRIBB) as a template (Accession: NM_000372 Clone ID: KU036121), PCR amplification using the primers shown in Table 1 below, and then EcoR1, Xba1 restriction enzymes was cut and inserted into a pLVX-EIP vector (Clontech, Mountain View, CA, United States).
  • KRIBB Korea Gene Bank
  • HEK293T cells Human Embryonic Kidney Cell 293T
  • DMEM medium containing 10% FBS fetal calf serum
  • DMEM medium without antibiotics fetal calf serum
  • the medium collected in 2 above was filtered and then transduced into HaCaT cells. Specifically, a 24-well plate was inoculated with HaCaT cells one day before, followed by treatment with a mixture of 200 ⁇ l of a lentivirus-containing medium, 400 ⁇ l of fresh medium, and 4 ⁇ g/ml of polybrene. The next day, after replacing with fresh medium, two days later, puromycin was selected with 2 ⁇ g/ml.
  • Example 2 After the protein was isolated from the tyrosinase and PMEL overexpressing keratinocyte cell line prepared in Example 1, the expression levels of tyrosinase and PMEL were measured by Western blot using a tyrosinase antibody and a PMEL antibody, and the results are shown in FIG. . At this time, untreated HaCaT cells were used as a control.
  • Photographs of the tyrosinase and PMEL overexpressing keratinogenic cell lines prepared in Example 1 were taken and the results are shown in FIG. 2, and the cell pellet was treated with 1N NaOH at 60° C. for 2 hours, and then standard melanin using synthetic melanin.
  • the melanin content was quantified by checking the melanin absorbance at 405 nm with an ELISA reader based on the curve. The measured absorbance and melanin content are shown in Table 2 below.
  • protein absorbance, protein content, and ratio of melanin content to protein were measured based on the standard protein curve, and the results are shown in Table 3 below. At this time, untreated HaCaT cells were used as a control.
  • 3M paper was placed in a 6-well plate and wetted with DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline). The weight was put so that the 3M paper was fixed to the bottom of the 6-well plate.
  • DPBS Denbecco's Phosphate-Buffered Saline
  • dermal cells were aliquoted into each well at 3 ⁇ 10 ⁇ 5 cells, and then ascorbic acid was added to the dermal cell culture solution at a concentration of 100 ⁇ g/ml and cultured.
  • the dermal cell culture solution was cultured at 37° C. and 5 vol% CO 2 culture conditions for a total of 4 weeks by changing the medium once every 2 days.
  • the genetically modified keratinogenic cell line prepared in Example 1 and the untreated HaCaT cell line were 5% FBS (Hyclone, SH30084.03) and 1% penicillin (Penicillin)-streptomycin ( Streptomycin) (Welgene, LS202-02) was cultured in the epidermal cell culture medium of DMEM (Hyclone, SH30243.01) containing.
  • the dermal cells were carefully removed from the 6-well plate using forceps, stacked on a 6cm dish, and fixed with a weight.
  • the genetically modified keratinogenic cell line prepared in Example 1 and the untreated HaCaT cell line prepared inside the ring were dispensed with 2.5 ⁇ 10 5 cells per well, and the composition
  • the epidermal cell culture solution was cultured at 37° C. and 5 vol% CO 2 under culture conditions.
  • the ring was removed and the medium was exchanged once every 2 days, and cultured under 37° C. and 5 vol% CO 2 culture conditions for a total of 6 days.
  • a control artificial skin was prepared in the same manner as in Example 2, but using only the untreated HaCaT cell line instead of the genetically modified keratinogenic cell line prepared in Example 1.
  • Example 2 The artificial skin prepared in Example 2 and the artificial skin of Comparative Example 1 were photographed, and a photograph thereof is shown in FIG. 3.
  • Example 2 As shown in FIG. 3, the color of the artificial skin of Example 2 prepared by using the genetically modified keratinocytes of Example 1 compared to the artificial skin of the control prepared using only the untreated keratinocytes cell line even when viewed with the naked eye. This dark thing could be confirmed.
  • Example 2 The artificial skin prepared in Example 2 and the artificial skin of Comparative Example 1 were stained with H&E, Fontana-Masson, and Melan-A tissues, and a cross-section of the artificial skin was taken, and the photographs are shown in FIG. 4. Done.
  • the artificial skin prepared in Example 2 had a black pigment compared to the artificial skin of Comparative Example 1. Through this, it was found that the artificial skin according to the present invention can be used for transplantation in patients with low pigmentation diseases.
  • the present invention relates to a composition capable of preventing or treating hypopigmentation diseases.
  • composition for preventing or treating hypopigmentation disorders Composition for preventing or treating hypopigmentation disorders

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Abstract

본 발명은 저색소(hypopigmentation) 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 재조합 벡터, 형질 전환체 및 인공 피부 등은 각질 형성 세포에서 티로시나제 및/또는 PMEL의 유전자 발현을 안정적으로 유도하여 상기 각질 형성 세포에서 안정적으로 색소 형성을 유도함에 따라 멜라닌 세포의 사멸에 기인한 저색소 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

저색소 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 저색소(hypopigmentation) 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
인간 피부는 다양한 외부 환경적 스트레스에 노출되는 장기로, 자외선(UVR) 등에 의한 잠재적 손상을 방어하기 위하여 다양한 메커니즘이 존재한다. 이러한 방어 메커니즘으로는 DNA 손상 메커니즘, 카탈레이즈 및 과산화물 제거효소와 같은 다양한 효소, 및 피부 색소 침착을 포함한다. 이러한 요소 중에는, 색소 침착이 가장 중요한 광-보호적인 요소에 해당한다. 티로시네이즈 효소(tyrosinase)는 멜라닌 색소의 합성 경로에서 두가지의 속도 제한적인 반응을 촉진시키므로 색소 침착에 중요한 조절자로 작용한다. 이러한 속도 제한적인 반응으로는 1) 3,4-디히드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)을 생성하기 위한 티로신 히드록실화와, 2) 도파퀴논(dopaquinone)을 생성하기 위한 DOPA 산화 공정이 있다.
한편, 포유동물의 피부, 머리 및 눈 등에서 시각적 색깔은 멜라노솜(melanosomes)의 양, 질 및 상피세포의 분포에 기인한다. 상기 멜라노솜은 특별한 수지 세포 중 하나인 멜라닌 세포(melanocyte)에 의하여 형성된다. 멜라닌 색소는 멜라노솜에서 합성되어 멜라닌 세포의 수상 돌기에 의하여 케라틴 세포(keratinocytes)로 이동한다. 따라서, 멜라닌의 분포 패턴이 피부 색깔을 결정한다. 멜라닌 색소는 태양 UV 방사선으로부터 넓은 파장 범위로 피부를 보호하고, 피부에서 생산되는 자유 라디칼을 흡수하는 기능을 한다. 멜라닌 형성에 관련된 효소의 발현에 의하여 멜라닌 합성이 조절된다. 색소 침착을 조절함에 있어서 100개 이상의 단백질이 관여한다. 예를 들어, 멜라닌 합성은 티로신(tyrosine)의 도파퀴논(dopaquinone)으로 산화되면서 개시되는데, 상기 산화 과정은 티로시나아제 효소에 의하여 촉매화된다. 도파퀴논은 이후 분자 내 고리화 반응 및 중합 반응에 의하여 유멜라닌(eumelanin)으로 전환된다.
상기한 멜라닌 합성 과정에서 조절 장애가 발생하거나 멜라닌 세포가 증식 또는 감소가 발생되면 색소의 과다한 침착 혹은 저색소를 초래한다.
저색소 질환(hypopigmentation)은 멜라닌 부족으로 발생되거나 멜라닌 세포의 결손에 의해 발생하게 되며 노출된 피부를 시각적으로 보기에 흉하게 만들어 심리사회학적 문제를 야기시킨다. 특히 대표적인 저색소 질환으로 백반증은 자가면역 기전에 의해 발생되는 비교적 흔한 후천성 저색소 질환이다. 백반증은 자가 멜라닌세포 항원을 인지하는 CD8 T 세포가 멜라닌 세포를 파괴하여 나타나며 CD8 T 세포가 멜라닌 세포를 인지하는 자가면역 기전의 발생 이전에 선천 면역이 매우 중요한 역할로 작용한다. 이와 같이 선천 면역과 관련되어있는 물질로 댐프(damage-associated molecular patterns; DAMPs)가 잘 알려져 있고, 이에 해당되는 물질로 다양한 것이 있다. 이 중에 ATP는 세포 대사에 매우 중요한 세포 에너지원으로 작용하는 물질이지만, 세포가 손상을 받으면서 세포 밖으로 유출된 ATP는 자가면역의 방아쇠 역할을 하여 다양한 면역 질환을 유발시키는 것으로 알려져 있다. 현재까지 백반증의 치료법으로는 스테로이드제, 면역조절제와 함께 자외선 치료와 같이 면역조절 기능을 목적으로 갖는 치료법이 주치료법으로 사용되지만 아직까지 치료 효과가 낮아 새로운 치료법이 요구되고 있다.
본 발명의 일 목적은 티로시나제(tyrosinase)를 코딩하는 유전자 및 PMEL(premelanosome protein)을 코딩하는 유전자를 각질 형성 세포(keratinocyte)에 도입하여 저색소 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 티로시나제(tyrosinase) 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 PMEL(premelanosome protein) 또는 이를 코딩하는 유전자; 중 적어도 하나를 유효 성분으로 포함하는, 저색소 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "티로시나제(tyrosinase)"는 멜라닌 생성을 조절하는 속도-제한 효소인 산화효소이다. 이러한 효소는 멜라닌 합성의 두 구별되는 반응에 관여하는데, 첫째는 모노페놀의 수산화 과정이고, 둘째는 o-디페놀을 o-퀴논으로 전환시키는 과정이다. 이렇게 생성된 o-퀴논은 최종적으로 멜라닌을 형성하게 된다. 본 발명에서 상기 티로시나제는 구리를 포함하는 효소로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 서열번호 2로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명에서 상기 "PMEL(premelanosome protein)"은 100 kDa 크기의 타입 I 막관통 당단백질에 해당한다. 본 발명에서 상기 PMEL은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 서열번호 4로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 각질 형성 세포(keratinocyte)에 처리되는 것이, 멜라닌 세포가 사멸되어 유발되는 저색소 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있어 바람직하다.
본 발명에서 상기 조성물은 티로시나제(tyrosinase) 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 PMEL(premelanosome protein) 또는 이를 코딩하는 유전자; 중 적어도 하나를 유효 성분으로 포함할 수 있지만, 바람직하게는 티로시나제(tyrosinase)를 코딩하는 유전자 및 PMEL을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 티로시나제(또는 이의 유전자) 만을 각질 형성 세포 내로 도입하는 경우 세포 질 내에 분포하며 세포 독성을 유발할 수 있지만, PMEL(또는 이의 유전자)을 함께 각질 형성 세포 내로 도입하는 경우 상기 티로시나제를 상기 각질 형성 세포 내 멜라노좀 (멜라닌소체)의 구조 속으로 유도하여 안정적으로 세포에 색소 침착을 유도할 수 있다.
본 발명의 조성물은 그 용도에 따라 약학 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 저색소 질환은 멜라닌 세포의 사멸로 유도되는 모든 질환일 수 있는데, 예컨대 백반증일 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 티로시나제(tyrosinase)를 코딩하는 유전자; 및 PMEL(premelanosome protein)을 코딩하는 유전자 중 적어도 하나를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 상기 벡터는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (replication origin), 프로모터, 작동 유전자 (operator), 전사 종결 서열 (terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site; RBS), IRES (Internal Ribosome Entry Site) 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 벡터는 프로모터로서 상기한 융합 폴리뉴클레오타이드 (융합 프로모터)를 갖도록 통상적인 유전공학적 방법으로 조작된 것일 수 있다. 상기 벡터는 상기 프로모터 이외의 전사 조절 서열 (예컨대 인핸서 등)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터는 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터일 수 있으며, 상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스를 포함하는 레트로바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 비바이러스성 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 리포솜, 세균인공염색체, 효모인공염색체 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터에서 상기 목적 유전자는 상기 융합 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된 (operatively linked)"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 "작동 가능하게 연결 (operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다. 상기 재조합 벡터에 있어서, 상기 융합 폴리뉴클레오타이드가 상기 목적 유전자에 작동 가능하게 연결되기 위해서, 상기 융합 폴리뉴클레오타이드는 상기 목적 유전자의 5' 말단에 연결된 것일 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는, 발현시키고자 하는 목적 단백질의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 단백질을 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 단백질의 발현 벡터로 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 벡터는 전사 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 전사 조절 서열은 폴리아데닐화 서열(pA)과 같은 전사 종결 서열; f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, BBV 복제원점 등의 복제 원점 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 재조합 벡터는 선별 마커를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 재조합 벡터가 숙주 세포 내에 성공적으로 도입되었는지 여부를 확인하거나 안정적인 세포주 구축을 위한 유전자로서, 예컨대, 항생제와 같은 약물 저항 유전자, 대사 관련 유전자, 유전자 증폭 유전자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 숙주 세포는 동물 세포에서 전사 개시를 강력하게 유도할 수 있는 것일 수 있으며, 구체적으로 포유동물 세포, 예를 들어 인간으로부터 유래된 세포와 같은 동물 세포에서 전사 개시를 유도하는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 형질 전환된 형질 전환체에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터의 세포 내로의 운반 (도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예컨대, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법 (electroporation), 초음파 천공법 (sonoporation), 자기장을 이용한 자기주입법 (magnetofection), 리포좀-매개 형질감염법, 유전자 밤바드먼트 (gene bombardment), 덴드리머 및 무기 (inorganic) 나노 입자의 사용 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 숙주세포는 포유동물 세포, 예를 들어 인간으로부터 유래된 세포일 수 있는데, 바람직하게는 각질 형성 세포 (keratinocyte)인 것이 멜라닌 세포가 사멸되어 유도되는 저색소 질환 부위에서 안정적으로 색소 발현을 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 형질 전환체를 포함하는 인공 피부에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "인공 피부 (artificial skin)"는 피부 세포와 피부 구성물질인 콜라겐, 엘라스틴 등을 이용하여 3차원적으로 상기와 같은 피부를 재구성한 것으로서, 살아있는 섬유아세포와 각질 형성 세포로 구성되어 실제 피부와 유사한 구조적, 기능적 특성을 나타내기 때문에 피부 모사체 (skin equivalent 또는 reconstructed skin)라고도 불린다.
본 발명에서 상기 인공 피부는 진피층 및 표피층을 포함할 수 있고, 상기 진피층, 표피층, 또는 그 사이에 본 발명에 따르는 형질 전화체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 표피층에 본 발명에 따르는 형질 전환체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 인공 피부를 제조하는 방법은 특별히 제한하지 않으며, 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으나, 예를 들면 이하의 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 일 예시에 따르는 인공 피부의 제조 방법은 적어도 1층의 진피층을 형성하는 단계; 및 진피층 상에 본 발명에 따르는 형질 전환체를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 진피층을 형성하는 단계는, 진피 세포, 바람직하게는 인간 피부로부터 분리한 진피 세포로 섬유아세포를 진피 세포 배양액에서 배양하며 수행할 수 있다.
본 발명에서 상기 진피 세포 배양액의 조성은 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GIBCO, USA); MEM (Minimal Essential Medium, GIBCO, USA); BME (Basal Medium Eagle, GIBCO, USA); RPMI 1640 (GIBCO, USA); DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10; GIBCO, USA); α-MEM (α-Minimal essential Medium; GIBCO, USA); G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium, GIBCO, USA); IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium, GIBCO, USA); 또는 KnockOut DMEM (GIBCO, USA)의 배지를 사용할 수 있고, 바람직하게는 DMEM 배지를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 "DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)"은 통상 배지에 사용하는 DMEM이며, 상기 B27 용액 (Gibco® B-27® Supplements, Life Technologies)은 비오틴, DL 알파 토코페놀 아세테이트, DL 알파 토코페놀, 비타민 A, BSA, 카탈라아제, 인슐린, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 코티코스테론, D-갈락토오스, 에탄올아민 HCl, 글루타티온, L-카르니틴 HCl, 리놀레산, 리노레닉산, 프로게스테론, 푸트레신 2HCl, 나트륨 투석고 (sodium selenite) 및 트리오도-1-티로닌을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 진피 배양용 배지는 소 태아 혈청 (Fetal bovine serum; FBS) 1 내지 10 중량%; 및 항생제 0.1 내지 3 중량% 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 상기 진피 배양용 배지는 아스코르브산 (ascorbic acid)을 30 내지 200 ㎍/ml, 바람직하게는 50 내지 100 ㎍/ml의 양으로 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 진피 세포의 배양은 37 ℃, 5 부피% CO2의 배양 조건 하에서 수행될 수 있고, 7일 내지 40일, 바람직하게는 21일 내지 35일, 보다 바람직하게는 25일 내지 30일 동안 배양할 수 있다.
본 발명에서는 상기 진피층을 적어도 1층 형성할 수 있고, 바람직하게는 형성된 2층 내지 5층의 진피층을 적층할 수 있다.
본 발명에서 상기와 같이 진피층이 형성되면, 상기 진피층 상에 본 발명에 따르는 형질 전환체를 배양하는 단계를 수행할 수 있다.
본 발명에서 상기 형질 전환체의 배양 시 표피 세포로 각질 형성 세포를 상기 형질 전환체와 함께 공배양 (co-culture)할 수 있다.
본 발명에서 상기 형질 전환체의 배양은 37 ℃, 5 부피% CO2의 배양 조건 하에서 수행될 수 있고, 3일 내지 10일, 바람직하게는 5일 내지 7일 동안 1차 배양한 뒤, 7일 내지 30일, 바람직하게는 10일 내지 20일 동안 2차 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 1차 배양을 위한 배양액의 조성은 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GIBCO, USA); MEM (Minimal Essential Medium, GIBCO, USA); BME (Basal Medium Eagle, GIBCO, USA); RPMI 1640 (GIBCO, USA); DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10; GIBCO, USA); α-MEM (α-Minimal essential Medium; GIBCO, USA); G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium, GIBCO, USA); IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium, GIBCO, USA); 또는 KnockOut DMEM (GIBCO, USA)의 배지를 사용할 수 있고, 바람직하게는 DMEM 배지를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 1차 배양용 배지는 소 태아 혈청 (Fetal bovine serum; FBS) 1 내지 10 중량%; 및 항생제 0.1 내지 3 중량% 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 2차 배양 시 공기노출 액체배양 (Air liquid interface culture) 조건 하에서 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 2차 배양을 위한 배양액의 조성은 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), a-MEM (Alpha Modification of Eagle's Medium), F12 (Nutrient Mixture F-12), RPMI 1640, 윌리암 배지 E (Williams' s medium E), 맥코이 5A (McCoy's 5A) 또는 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)의 배지를 사용할 수 있고, 바람직하게는 DMEM/F12 배지를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 2차 배양용 배지는 소 태아 혈청 (Fetal bovine serum; FBS) 1 내지 10 중량%; 및 항생제 0.1 내지 3 중량% 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 상기 2차 배양용 배지는 CaCl2를 0.1 내지 2 mM, 바람직하게는 0.5 내지 1 mM의 양으로 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 인공 피부는 포유 동물, 바람직하게는 저색소 질환이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 포유 동물에게 피부 이식용으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공하는 인공 피부는 표피층에 본 발명에 따르는 형질 전환체를 포함되어, 색소 침착이 유도된 것으로, 피부 개선, 바람직하게는 피부 미백용 화장료 조성물의 효능 테스트를 위한 것으로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 인공 피부를 포함하는 저색소 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 그 용도에 따라 약학 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 저색소 질환은 멜라닌 세포의 사멸로 유도되는 모든 질환일 수 있는데, 예컨대 백반증일 수 있다.
한편, 본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 저색소 질환의 증상을 차단하거나, 그 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 저색소 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서, "개선"은 본 발명의 화장료 조성물 또는 식품 조성물을 이용하여 저색소 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명에서 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.
상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.
지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.
그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.
여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.
그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 투여가 필요한 개체에게, 본 발명에서 제공하는 a) 티로시나제(tyrosinase) 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 PMEL(premelanosome protein) 또는 이를 코딩하는 유전자; 중 적어도 하나; b) 이를 포함하는 재조합 벡터; c) 상기 재조합 벡터가 형질 감염된 형질 전환체; 또는 d) 상기 형질 전환체를 포함하는 인공 피부를 투여하는 단계를 포함하는 저색소 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 "개체"는 저색소 질환의 발병하였거나 발병이 의심되는 개체로서, 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물을 의미하나, 본 발명에서 제공하는 유효 물질로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.
본 발명에서 상기 저색소 질환은 멜라닌 세포의 사멸로 유도되는 모든 질환일 수 있는데, 예컨대 백반증일 수 있다.
본 발명의 상기 방법은 본 발명에서 제공하는 a) 티로시나제 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 PMEL 또는 이를 코딩하는 유전자; 중 적어도 하나; b) 이를 포함하는 재조합 벡터; c) 상기 재조합 벡터가 형질 감염된 형질 전환체; 또는 d) 상기 형질 전환체를 포함하는 인공 피부를 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 a) 티로시나제 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 PMEL 또는 이를 코딩하는 유전자; 중 적어도 하나; b) 이를 포함하는 재조합 벡터; c) 상기 재조합 벡터가 형질 감염된 형질 전환체; 또는 d) 상기 형질 전환체의 투여량, 스케줄 및 투여 경로는 개체의 크기 및 조건에 따라, 그리고 표준 약제학적 관행에 따라 결정될 수 있다. 예시적인 투여 경로는 정맥내, 동맥내, 복강내, 폐내, 혈관내, 근육내, 기관내, 피하, 안내, 척수강내 또는 경피를 포함한다.
개체에 투여되는 용량은, 예를 들어, 투여되는 유효 성분의 특정 유형, 투여 경로 및 치료되는 질환의 특정 유형과 병기에 따라 달라질 수 있다. 상기 양은 심한 독성 또는 유해 사례없이, 암에 대한 치료 반응과 같은 원하는 반응을 가져오기 충분해야 한다. 일부 실시 형태에서, 유효 성분의 양은 치료 전의 동일한 개체에서의 상응하는 질환과 비교하여, 또는 치료를 받지 않은 다른 개체에서의 상응하는 활성과 비교하여 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 하나만큼 질환의 진행을 감소시키거나, 질환을 개선시키거나 질환을 치료시키기 충분한 양이다. 정제된 효소를 사용한 시험관내 검정, 세포 기반 검정, 동물 모델 또는 인체 실험과 같은 표준 방법을 사용하여 효과의 규모를 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 본 발명의 형질 전환체(예컨대 각질 형성 세포)는 1Х105~5Х105, 5Х105~1Х106, 1Х106~2×106, 2Х106~3Х106, 3Х106~4Х106, 4Х106~5Х106, 5Х106~6Х106, 6Х106~7Х106, 7Х106~8Х106, 8Х106~1Х108, 1Х106~3Х106, 3Х106~5Х106, 5Х106~7Х106, 2Х106~4Х106, 1Х106~5Х106 또는 5Х106~1Х107개 중 어느 하나의 세포/개체의 투여량으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 이에 제한되지 않으나, 상기 저색소 질환의 예방 또는 치료 방법은 하나 이상의 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 화합물 또는 물질을 투여하는 것을 더 포함하는 병용 요법일 수 있다.
본 발명에서 상기 "병용"은 동시, 개별 또는 순차 투여를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차 또는 개별적인 경우, 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이어야 한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 인공 피부에 피검 물질을 접촉시키는 단계; 및
상기 피검 물질의 접촉 후 멜라닌의 발현 양을 측정하는 단계를 포함하는, 피부 개선용 화장료 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 피검 물질은 피부 개선, 바람직하게는 피부 미백 효능이 있을 것으로 예상되는, 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 이들로 한정되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기분자(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한, 천연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.
본 발명에서 상기 멜라닌 발현 양을 측정하는 방법은 특별히 제한하지 않으며, 당해 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있으나, 예를 들면, 세포에 NaOH, 바람직하게는 1N 농도의 NaOH를 넣고, 멜라닌을 녹여낸 뒤 475nm에서 흡광도를 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기 피검 물질의 접촉 후 상기 인공 피부에서 상기 멜라닌의 발현 양이 상기 피검 물질의 접촉 전에 비하여 감소된 경우, 상기 피검 물질을 피부 개선, 바람직하게는 피부 미백용 화장료 조성물로 판별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 재조합 벡터, 형질 전환체 및 인공 피부 등은 각질 형성 세포에서 티로시나제 및/또는 PMEL의 유전자 발현을 안정적으로 유도하여 상기 각질 형성 세포에서 안정적으로 색소 형성을 유도함에 따라 멜라닌 세포의 사멸에 기인한 저색소 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공하는 인공 피부는 피부 개선, 바람직하게는 피부 미백용 화장료 조성물의 효능 테스트를 위한 것으로도 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실험예 1에서 실시예 1에서 제조한 티로시나제 및 PMEL 과발현 각질 형성 세포주에 대하여 티로시나제 및 PMEL의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실험예 2에서 실시예 1에서 제조한 티로시나제 및 PMEL 과발현 각질 형성 세포주의 펠렛을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실험예 3에서 실시예 2에서 제조한 인공 피부와, 비교예 1에서 제조한 인공 피부를 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실험예 4에서 실시예 2에서 제조한 인공 피부와, 비교예 1에서 제조한 인공 피부에 H&E, Fontana-Masson 및 Melan-A 조직 염색을 수행한 뒤 각 인공 피부의 단면을 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 티로시나제(tyrosinase) 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 PMEL(premelanosome protein) 또는 이를 코딩하는 유전자; 중 적어도 하나를 포함하는 재조합 벡터 또는 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 형질 전환된 형질 전환체를 유효 성분으로 포함하는, 저색소 질환을 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 투여가 필요한 개체에게, 본 발명에서 제공하는 티로시나제(tyrosinase) 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 PMEL(premelanosome protein) 또는 이를 코딩하는 유전자; 중 적어도 하나를 포함하는 재조합 벡터 또는 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 형질 전환된 형질 전환체를 투여하는 단계를 포함하는 저색소 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 숙주세포는 포유동물 세포, 예를 들어 인간으로부터 유래된 세포일 수 있는데, 바람직하게는 각질 형성 세포(keratinocyte)인 것이 멜라닌 세포가 사멸되어 유도되는 저색소 질환 부위에서 안정적으로 색소 발현을 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 형질 전환체를 포함하는 인공 피부에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 인공 피부에 피검 물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 피검 물질의 접촉 후 멜라닌의 발현 양을 측정하는 단계를 포함하는, 피부 개선용 화장료 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
[실시예 1] 티로시나제 및 PMEL 과발현 각질 형성 세포주의 제조
1. 전달 플라스미드(transfer plasmid)의 제조
전달 플라스미드(transfer plasmid)는, 한국유전자은행 (KRIBB)으로부터 구입한 cDNA를 (Accession: NM_000372 Clone ID: KU036121) 주형으로 하여 하기 표 1에 나타낸 프라이머를 이용해 PCR 증폭을 시행한 후 EcoR1, Xba1 제한효소로 절단하여 pLVX-EIP 벡터(Clontech, Mountain View, CA, United States)에 삽입해 제조하였다.
구분 서열
TYR U1 5'- TATA GAATTCGCACG ATGCTCCTGGCTGTTTTG-3'
TYR L1 5'- ATAT TCTAGA TTATAAATGGCTCTGATACAAG-3'
PMEL 정방향 5'- TATA GAATTC AACACA ATGGATCTGGTGC-3'
PMEL 역방향 5'- ATAT TCTAGA T TCAGACCTGCTGCCCA-3'
2. 렌티바이러스의 제조
상기 1.에서 제조된 전달 플라스미드를 함유하는 렌티바이러스를 제조하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다. 숙주세포로 HEK293T 세포(Human Embryonic Kidney Cell 293T)를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지를 이용하여 6웰 플레이트에 7x105세포/웰의 농도로 접종한 후 24시간 뒤에 항생제를 포함하지 않는 DMEM 배지로 교체하였다. 이후, 상기 HEK293T 세포에 상기 1.에서 제조한 전달 플라스미드 1500 ng, 패키징 플라스미드(packaging plasmid) (psPAX2, Addgene #12260) 1125 ng, VSV-G 인벨로프 플라스미드(envelope plasmid) (pMD2.G, Addgene #12259) 375 ng를 동시에 형질 감염(transfection)시켰다. 단, 상기 형질 감염에는 PEI (polyethylenimine)를 사용하였다. 다음날 10% FBS와 항생제가 포함된 DMEM/F12 배지로 교체하고 이틀에 걸쳐 렌티바이러스를 포함하는 배지를 수집하였다.
3. 렌티바이러스의 형질 도입(transduction)
상기 2.에서 수집한 배지를 여과한 후 HaCaT 세포에 형질 도입(transduction) 하였다. 구체적으로는 24-웰 플레이트에 하루 전에 HaCaT 세포를 접종한 뒤 다음 날 렌티바이러스를 포함하는 배지 200 μl, 신선한 배지 400 μl, 폴리브렌(polybrene) 4 ㎍/ml를 혼합하여 처리하였다. 다음날 신선한 배지로 교체해준 후 이틀 뒤에 퓨로마이신(puromycin) 2 ㎍/ml로 선별하였다.
[실험예 1] 티로시나제 및 PMEL 발현 확인
상기 실시예 1에서 제조한 티로시나제 및 PMEL 과발현 각질 형성 세포주로부터 단백을 분리한 뒤 티로시나제 항체 및 PMEL 항체를 사용하여 웨스턴 블럿에 의해 티로시나제 및 PMEL의 발현 수준을 측정하였고, 그 결과는 도 1에 나타내었다. 이때 대조군으로는 무처리한 HaCaT 세포를 사용하였다.
도 1에서 보는 바와 같이, 대조군인 무처리한 각질 형성 세포에 비하여 실시예 1의 각질 형성 세포주에서는 티로시나제와 PMEL이 높게 발현되며, 티로시나제 활성 또한 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 2] 멜라닌 색소 형성 확인(1)
상기 실시예 1에서 제조한 티로시나제 및 PMEL 과발현 각질 형성 세포주의 사진을 촬영하여 그 결과를 도 2에 나타내었고, 상기 세포 펠렛을 1N NaOH에 60 ℃에서 2시간 동안 처리한 후 합성 멜라닌을 이용한 표준 멜라닌 곡선을 바탕으로 405 nm에서 멜라닌 흡광도를 ELISA 리더로 확인함으로써 멜라닌 함량을 정량하였다. 측정한 흡광도와 멜라닌 함량을 하기 표 2에 나타내었다. 또한, 표준 단백 곡선을 바탕으로 단백 흡광도, 단백질 함량 및 단백질에 대한 멜라닌 함량의 비율을 측정하여 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 이때 대조군으로는 무처리한 HaCaT 세포를 사용하였다.
구분 O.D 멜라닌 함량(%)
대조군 0.064 100
실시예 1 0.078 145.1613
구분 O.D 단백 함량(%) 멜라닌/단백 함량(%)
대조군 0.515 100 100
실시예 1 0.434 81.25 178.66
도 2에서 보는 바와 같이, 육안으로 보더라도 대조군인 무처리한 각질 형성 세포에 비하여 실시예 1의 각질 형성 세포주에서 색소 형성이 발생하여 상기 세포주 펠렛의 색이 짙어진 것을 확인할 수 있었다. 또한, 표 2 및 3에서 보는 바와 같이, 실제로 대조군인 무처리한 각질 형성 세포에 비하여 실시예 1의 각질 형성 세포주에서 멜라닌의 함량이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 2] 인공 피부의 제조
상기 실시에 1에서 얻어진 티로시나제 및 PMEL 과발현 각질 형성 세포주를 이용하여 인공 피부를 제조하였다. 구체적으로는 남자 8세 포피(foreskin)로부터 분리한 진피 세포인 섬유아세포를 5% FBS (Hyclone,SH30084.03) 및 1% 페니실린(Penicillin)-스트렙토마이신(Streptomycin) (Welgene, LS202-02)을 포함하는 DMEM (Hyclone, SH30243.01)의 진피세포 배양액에서 37 ℃, 5 부피% CO2 배양 조건으로 배양하여 준비하였다. 3M 페이퍼를 6-웰 플레이트에 맞게 링 모양으로 재단하고, 포셉, 추 및 링을 멸균하여 준비하였다. 진피 세포를 플레이트에 분주하기 전날, 멸균하여 잘 말린 3M 페이퍼를 6-웰 플레이트에 넣고 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 적셔주었다. 3M paper가 6-웰 플레이트의 바닥에 고정되도록 추를 올려 주었다. DPBS를 제거한 후, 진피 세포를 각 웰에 3 X 10^5 세포로 분주한 뒤 진피세포 배양액에 아스코르브산을 100 ㎍/ml의 농도로 첨가하여 배양하였다. 상기 진피세포 배양액을 2일에 한번씩 배지를 교환하는 방식으로 총 4주 동안 37 ℃ 및 5 부피% CO2 배양 조건으로 배양하였다. 배양 4주차 부터는 아스코르브산만 50 ㎍/ml의 농도로 변경하여 배지를 2일에 한번씩 갈아주었다. 상기 진피 세포의 배양 5주차에 상기 실시예 1에서 제조한 유전자 변형된 각질 형성 세포주와, 무처리한 HaCaT 세포주를 5% FBS (Hyclone,SH30084.03) 및 1% 페니실린(Penicillin)-스트렙토마이신(Streptomycin) (Welgene, LS202-02)를 포함하는 DMEM (Hyclone, SH30243.01)의 표피 세포 배양액에서 배양하였다. 6주차에 포셉을 이용하여 6-웰 플레이트로부터 진피 세포를 조심스럽게 떼어내서 6cm 디쉬(dish)에 포개어 주는 방법으로 3장 쌓아서 추로 고정하였다. 이렇게 얻어진 진피 세포의 층 위에 링을 올린 후, 링 안쪽으로 준비한 상기 실시예 1에서 제조한 유전자 변형된 각질 형성 세포주와, 무처리한 HaCaT 세포주를 각 웰당 2.5X 10^5 세포를 분주하여 상기 조성의 표피 세포 배양액으로 37 ℃ 및 5 부피% CO2 배양 조건 하에서 배양하였다. 다음날 링을 제거한 뒤 2일에 한번씩 배지 교환하는 방식으로 총 6일 동안 37 ℃ 및 5 부피% CO2 배양 조건으로 배양하였다. 이렇게 얻어진 진피-표피세포를 A/L(Air liquid interface) 위에 올려준 후, 5% FBS (Hyclone,SH30084.03), 1% 페니실린(Penicillin)-스트렙토마이신(Streptomycin) (Welgene, LS202-02) 및 0.6mM CaCl2 (Sigma)를 포함하는 DMEM/F12 (GIBCO,11320-033)의 배지에 세포 아랫부분만 닿을 정도로 넣어 37 ℃ 및 5 부피% CO2 배양 조건으로 배양하였다. 상기의 배양액을 2일에 한번씩 배지 교환하는 방식으로 총 2주일 동안 37 ℃ 및 5 부피% CO2 배양 조건으로 배양하여 인공 피부를 제조하였다.
[비교예 1] 대조군 인공 피부의 제조
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 제조하되, 실시예 1에서 제조한 유전자 변형된 각질 형성 세포주 대신 무처리한 HaCaT 세포주만을 사용한 대조군 인공 피부를 제조하였다.
[실험예 3] 멜라닌 색소 형성 확인(2)
상기 실시예 2에서 제조한 인공 피부와, 상기 비교예 1의 인공 피부를 촬영하여 그 사진을 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보는 바와 같이, 육안으로 보더라도 무처리한 각질 형성 세포주만을 사용하여 제조한 대조군의 인공 피부에 비하여 실시예 1의 유전자 변형된 각질 형성 세포주를 사용하여 제조한 실시예 2의 인공 피부의 색이 짙은 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 4] 멜라닌 색소 형성 확인(3)
상기 실시예 2에서 각각 제조한 인공 피부와, 상기 비교예 1의 인공 피부를 H&E, Fontana-Masson 및 Melan-A 조직 염색을 수행하고, 상기 인공 피부의 단면을 촬영하여 그 사진을 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이, 실시예 2에서 제조한 인공 피부는 비교예 1의 인공 피부에 비하여 검은 색소가 관찰되었다. 이를 통하여 본 발명에 따른 인공 피부를 저색소 질환자에 이식용으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 저색소(hypopigmentation) 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University
SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION
<120> Composition for preventing or treating hypopigmentation disorders
<130> PDPB192129
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 529
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu Trp Ser Phe Gln Thr Ser
1 5 10 15
Ala Gly His Phe Pro Arg Ala Cys Val Ser Ser Lys Asn Leu Met Glu
20 25 30
Lys Glu Cys Cys Pro Pro Trp Ser Gly Asp Arg Ser Pro Cys Gly Gln
35 40 45
Leu Ser Gly Arg Gly Ser Cys Gln Asn Ile Leu Leu Ser Asn Ala Pro
50 55 60
Leu Gly Pro Gln Phe Pro Phe Thr Gly Val Asp Asp Arg Glu Ser Trp
65 70 75 80
Pro Ser Val Phe Tyr Asn Arg Thr Cys Gln Cys Ser Gly Asn Phe Met
85 90 95
Gly Phe Asn Cys Gly Asn Cys Lys Phe Gly Phe Trp Gly Pro Asn Cys
100 105 110
Thr Glu Arg Arg Leu Leu Val Arg Arg Asn Ile Phe Asp Leu Ser Ala
115 120 125
Pro Glu Lys Asp Lys Phe Phe Ala Tyr Leu Thr Leu Ala Lys His Thr
130 135 140
Ile Ser Ser Asp Tyr Val Ile Pro Ile Gly Thr Tyr Gly Gln Met Lys
145 150 155 160
Asn Gly Ser Thr Pro Met Phe Asn Asp Ile Asn Ile Tyr Asp Leu Phe
165 170 175
Val Trp Met His Tyr Tyr Val Ser Met Asp Ala Leu Leu Gly Gly Ser
180 185 190
Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala His Glu Ala Pro Ala Phe Leu
195 200 205
Pro Trp His Arg Leu Phe Leu Leu Arg Trp Glu Gln Glu Ile Gln Lys
210 215 220
Leu Thr Gly Asp Glu Asn Phe Thr Ile Pro Tyr Trp Asp Trp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Glu Lys Cys Asp Ile Cys Thr Asp Glu Tyr Met Gly Gly Gln His
245 250 255
Pro Thr Asn Pro Asn Leu Leu Ser Pro Ala Ser Phe Phe Ser Ser Trp
260 265 270
Gln Ile Val Cys Ser Arg Leu Glu Glu Tyr Asn Ser His Gln Ser Leu
275 280 285
Cys Asn Gly Thr Pro Glu Gly Pro Leu Arg Arg Asn Pro Gly Asn His
290 295 300
Asp Lys Ser Arg Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val Glu Phe
305 310 315 320
Cys Leu Ser Leu Thr Gln Tyr Glu Ser Gly Ser Met Asp Lys Ala Ala
325 330 335
Asn Phe Ser Phe Arg Asn Thr Leu Glu Gly Phe Ala Ser Pro Leu Thr
340 345 350
Gly Ile Ala Asp Ala Ser Gln Ser Ser Met His Asn Ala Leu His Ile
355 360 365
Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val Gln Gly Ser Ala Asn Asp Pro
370 375 380
Ile Phe Leu Leu His His Ala Phe Val Asp Ser Ile Phe Glu Gln Trp
385 390 395 400
Leu Gln Arg His Arg Pro Leu Gln Glu Val Tyr Pro Glu Ala Asn Ala
405 410 415
Pro Ile Gly His Asn Arg Glu Ser Tyr Met Val Pro Phe Ile Pro Leu
420 425 430
Tyr Arg Asn Gly Asp Phe Phe Ile Ser Ser Lys Asp Leu Gly Tyr Asp
435 440 445
Tyr Ser Tyr Leu Gln Asp Ser Asp Pro Asp Ser Phe Gln Asp Tyr Ile
450 455 460
Lys Ser Tyr Leu Glu Gln Ala Ser Arg Ile Trp Ser Trp Leu Leu Gly
465 470 475 480
Ala Ala Met Val Gly Ala Val Leu Thr Ala Leu Leu Ala Gly Leu Val
485 490 495
Ser Leu Leu Cys Arg His Lys Arg Lys Gln Leu Pro Glu Glu Lys Gln
500 505 510
Pro Leu Leu Met Glu Lys Glu Asp Tyr His Ser Leu Tyr Gln Ser His
515 520 525
Leu
<210> 2
<211> 1590
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atgctcctgg ctgttttgta ctgcctgctg tggagtttcc agacctccgc tggccatttc 60
cctagagcct gtgtctcctc taagaacctg atggagaagg aatgctgtcc accgtggagc 120
ggggacagga gtccctgtgg ccagctttca ggcagaggtt cctgtcagaa tatccttctg 180
tccaatgcac cacttgggcc tcaatttccc ttcacagggg tggatgaccg ggagtcgtgg 240
ccttccgtct tttataatag gacctgccag tgctctggca acttcatggg attcaactgt 300
ggaaactgca agtttggctt ttggggacca aactgcacag agagacgact cttggtgaga 360
agaaacatct tcgatttgag tgccccagag aaggacaaat tttttgccta cctcacttta 420
gcaaagcata ccatcagctc agactatgtc atccccatag ggacctatgg ccaaatgaaa 480
aatggatcaa cacccatgtt taacgacatc aatatttatg acctctttgt ctggatgcat 540
tattatgtgt caatggatgc actgcttggg ggatctgaaa tctggagaga cattgatttt 600
gcccatgaag caccagcttt tctgccttgg catagactct tcttgttgcg gtgggaacaa 660
gaaatccaga agctgacagg agatgaaaac ttcactattc catattggga ctggcgggat 720
gcagaaaagt gtgacatttg cacagatgag tacatgggag gtcagcaccc cacaaatcct 780
aacttactca gcccagcatc attcttctcc tcttggcaga ttgtctgtag ccgattggag 840
gagtacaaca gccatcagtc tttatgcaat ggaacgcccg agggaccttt acggcgtaat 900
cctggaaacc atgacaaatc cagaacccca aggctcccct cttcagctga tgtagaattt 960
tgcctgagtt tgacccaata tgaatctggt tccatggata aagctgccaa tttcagcttt 1020
agaaatacac tggaaggatt tgctagtcca cttactggga tagcggatgc ctctcaaagc 1080
agcatgcaca atgccttgca catctatatg aatggaacaa tgtcccaggt acagggatct 1140
gccaacgatc ctatcttcct tcttcaccat gcatttgttg acagtatttt tgagcagtgg 1200
ctccgaaggc accgtcctct tcaagaagtt tatccagaag ccaatgcacc cattggacat 1260
aaccgggaat cctacatggt tccttttata ccactgtaca gaaatggtga tttctttatt 1320
tcatccaaag atctgggcta tgactatagc tatctacaag attcagaccc agactctttt 1380
caagactaca ttaagtccta tttggaacaa gcgagtcgga tctggtcatg gctccttggg 1440
gcggcgatgg taggggccgt cctcactgcc ctgctggcag ggcttgtgag cttgctgtgt 1500
cgtcacaaga gaaagcagct tcctgaagaa aagcagccac tcctcatgga gaaagaggat 1560
taccacagct tgtatcagag ccatttataa 1590
<210> 3
<211> 661
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Asp Leu Val Leu Lys Arg Cys Leu Leu His Leu Ala Val Ile Gly
1 5 10 15
Ala Leu Leu Ala Val Gly Ala Thr Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp
20 25 30
Leu Gly Val Ser Arg Gln Leu Arg Thr Lys Ala Trp Asn Arg Gln Leu
35 40 45
Tyr Pro Glu Trp Thr Glu Ala Gln Arg Leu Asp Cys Trp Arg Gly Gly
50 55 60
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Asn Ala Ser Phe Ser Ile Ala Leu Asn Phe Pro Gly Ser Gln Lys Val
85 90 95
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Asn Thr Thr Ala Gly Gln Val Pro Thr Thr Glu Val Val Gly Thr Thr
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435 440 445
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ccccgcatct tctgctcttg tcccattggt gagaatagcc ccctcctcag tgggcagcag 1980
gtctga 1986

Claims (19)

  1. 티로시나제(tyrosinase)를 코딩하는 유전자; 및 PMEL(premelanosome protein)을 코딩하는 유전자 중 적어도 하나를 포함하는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 형질 전환된 형질 전환체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 숙주세포는 각질 형성 세포(keratinocyte)인, 형질 전환체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 도입은 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법(electroporation), 초음파 천공법(sonoporation), 자기장을 이용한 자기주입법(magnetofection), 리포좀-매개 형질감염법, 유전자 밤바드먼트 (gene bombardment), 덴드리머 또는 무기(inorganic) 나노 입자에 의해 수행되는 것인, 형질 전환체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 형질 전환체를 포함하는 인공 피부.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 인공 피부는, 적어도 1층의 진피층을 형성하는 단계; 및 상기 진피층 상에 상기 형질 전환체를 배양하는 단계에 의해 제조되는, 인공 피부.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 인공 피부는 피부 이식용인, 인공 피부.
  7. 티로시나제(tyrosinase)를 코딩하는 유전자; 및 PMEL(premelanosome protein)을 코딩하는 유전자 중 적어도 하나를 포함하는 재조합 벡터 또는 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 형질 전환된 형질 전환체를 유효 성분으로 포함하는 저색소 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 숙주세포는 각질 형성 세포(keratinocyte)인, 약학 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 저색소 질환은 백반증인, 약학 조성물.
  10. 티로시나제(tyrosinase)를 코딩하는 유전자; 및 PMEL(premelanosome protein)을 코딩하는 유전자 중 적어도 하나를 포함하는 재조합 벡터.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터인, 재조합 벡터.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 티로시나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것인, 재조합 벡터.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 PMEL을 코딩하는 유전자는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것인, 재조합 벡터.
  14. 적어도 1층의 진피층을 형성하는 단계; 및 진피층 상에 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 형질 전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 인공 피부의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 형질 전환체를 배양하는 단계는 상기 형질 전환체와 각질 형성 세포를 공배양하며 수행되는 것인, 인공 피부의 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 형질 전환체를 배양하는 단계는 37 ℃ 및 5 부피% CO2의 배양 조건 하에서 3일 내지 10일 동안 1차 배양한 뒤, 7일 내지 30일 동안 2차 배양하며 수행되는, 인공 피부의 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 2차 배양 시 공기노출 액체배양 (Air liquid interface culture) 조건 하에서 수행되는, 인공 피부의 제조 방법.
  18. 투여가 필요한 개체에게, a) 티로시나제(tyrosinase) 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 PMEL(premelanosome protein) 또는 이를 코딩하는 유전자; 중 적어도 하나; b) 이를 포함하는 재조합 벡터; c) 상기 재조합 벡터가 형질 감염된 형질 전환체; 또는 d) 상기 형질 전환체를 포함하는 인공 피부를 투여하는 단계를 포함하는 저색소 질환의 예방 또는 치료 방법.
  19. 티로시나제(tyrosinase) 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 PMEL(premelanosome protein) 또는 이를 코딩하는 유전자; 중 적어도 하나를 포함하는 재조합 벡터가 형질 감염된 형질 전환체를 포함하는 인공 피부에 피검 물질을 접촉시키는 단계; 및
    상기 피검 물질의 접촉 후 멜라닌의 발현 양을 측정하는 단계를 포함하는, 피부 개선용 화장료 조성물의 스크리닝 방법.
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