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WO2017030410A1 - 검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체를 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 또는 치료용, 또는 항산화용 조성물 - Google Patents

검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체를 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 또는 치료용, 또는 항산화용 조성물 Download PDF

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WO2017030410A1
WO2017030410A1 PCT/KR2016/009163 KR2016009163W WO2017030410A1 WO 2017030410 A1 WO2017030410 A1 WO 2017030410A1 KR 2016009163 W KR2016009163 W KR 2016009163W WO 2017030410 A1 WO2017030410 A1 WO 2017030410A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
leaf extract
black bean
bean leaf
metabolic syndrome
composition
Prior art date
Application number
PCT/KR2016/009163
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
정태숙
박호용
신동하
최명숙
이화
조한영
지현선
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones

Definitions

  • the present invention relates to a prophylaxis or treatment of metabolic syndrome or an antioxidant composition containing black bean leaf extract and flavonol glycosides isolated therefrom as an active ingredient.
  • Metabolic Syndrome develops, and metabolic syndrome soon causes damage to coronary arteries, causing heart disease or stroke, or lacking the ability to remove salt from the kidneys, causing high blood pressure and providing cardiovascular disease.
  • Increasing the ratio of total cholesterol and triglycerides, increasing the risk of blood clotting, and type 2 diabetes is known to cause hyperglycemia and insulin secretion disorders, causing damage to the eyes, kidneys and nerves.
  • ⁇ -glucosidase is an enzyme involved in the end of carbohydrate digestion. Substances with inhibitory activity inhibit the absorption of carbohydrates, which can suppress rapid blood sugar rise after eating, resulting in diabetes and obesity. Used to control patients (Int. J. Obes. 11 (Supple 2): 28, 1987).
  • continuous use of drugs such as acarbose, a conventional glycemic control agent, has a strong inhibitory effect on blood sugar rise, but continuous use of hypoglycemic shock, gas generation, and starch decomposition caused by ingestion of undigested starch directly into the colon Side effects such as bloating and diarrhea due to abnormal fermentation of bacteria have been reported (J. Pharm. Exp. Ther., 241: 915-920, 1987; Diabetes Care, 14: 732-737, 1991). Therefore, it is necessary to develop a hypoglycemic agent with less side effects and safer.
  • Dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4; EC 3.4.14.5) functionally belongs to serine proteases (Barrett AJ et al., Arch. Biochem. Biophys., 318: 247-250, 1995), Extensively present in mammalian tissues including kidney, liver and small intestine (Hegen, M. et al., J. Immunol., 144: 2908-2914, 1990).
  • DPP-4 is a major enzyme that breaks down glucagon-like protein-1 (GLP-1) in the small intestine (Mentlein, R. et al., Eur. J. Biochem., 214: 829-835, 1993). GLP-1 is known to have a powerful effect on insulin action on postprandial glycemic control in response to nutrients ingested into the small intestine (Creutzfeldt, WO. Et al., Diabetes Care, 19: 580-586, 1996). Thus, DPP-4 inhibitors have shown potential as a very potent therapeutic agent for type 2 diabetes, and research for the development of DPP-4 inhibitors has been accelerated.
  • GLP-1 glucagon-like protein-1
  • Atherosclerosis a representative vascular disorder, is an inflammatory disease in which lipids and fibrous elements accumulate in the artery wall. Hypertension, smoking, obesity, and an increase in plasma low-density lipoprotein (LDL) are the main causes. The atherosclerosis easily occurs in the cerebral arteries or coronary arteries, thereby developing into circulatory diseases such as heart disease and cerebrovascular disease.
  • LDL plasma low-density lipoprotein
  • LDL oxidation is most important as an early cause of atherosclerosis, including atherosclerosis (Circulation, 91: 2488-2496, 1995; Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17: 3338 -3346, 1997).
  • Oxidative stress produced in vivo and in vivo transforms LDL in the blood into oxidized-LDL, which then enters the intima through an adhesion molecule.
  • Monocytes are introduced into the oxidized-LDL to form foam cells, producing fat streak, an early lesion of atherosclerosis.
  • ROS reactive oxygen species
  • the body In one aerobic energy metabolism in the human body required the use of oxygen, part of the oxygen supplied by the breathing process, the body is in the active oxygen species by-product of normal cell metabolism (O 2 -, HO, ROO , H 2 O 2 And oxidative stress on cells.
  • Catalase in the cytoplasm is an enzyme that decomposes H 2 O 2 into water and oxygen in peroxisome, an organelle, and is present in high concentrations in hepatocytes or erythrocytes of stray animals to protect cells from oxidative damage caused by H 2 O 2 . Plays an important role (Physiol. Rev. 50: 319-375, 1970).
  • Monocyte chemoattractant protein (MCP-1) is secreted by vascular endothelial cells and vascular smooth muscle cells and is distributed mainly in atherosclerotic plaques, which are activated by macrophages of plaques and induced into foam cells to accelerate the development of atherosclerosis ( Atherosclerosis. 147: 213-225, 1999). Recent increases in MCP-1 induce inflammatory cells into adipose tissue in obese, type 2 diabetes and nonalcoholic fatty liver patients, resulting in insulin resistance (J. Clin. Endocrinol. Metab. 90: 2282-2289, 2005; Biomolecules 5: 1563-1579, 2015).
  • Fibrinolytic dysfunction resulting from diabetes or atherosclerosis is associated with increased activity of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) (Diabetes. 41: 1009-1015, 1992). Increased levels of PAI-1 secreted from vascular endothelial and hepatocytes can lead to imbalances in the process of blood coagulation and thrombolysis, resulting in hyperplasia of blood coagulation (J. Clin. Invest. 88: 1067-1072, 1991). Indeed, PAI-1 is increased in acute myocardial infarction and is known as an important predictor of recurrence of myocardial infarction (N. Engl. J. Med. 313: 1557-1563, 1985).
  • Soybean is an annual plant of the legume legume, which is widely distributed in Asia, Africa, and Australia, and is widely grown as an edible crop. Soybeans are rich in protein and lipids and contain high amounts of bioactive substances. Bioactive substances contained in soybeans in large amounts are mainly diedzin, genistin, isoflavones (ISF), malonylgenistin (6 “-O-Malonylgenistin), diedzein, and genistein (genistein). Much research has been conducted on the functionality of soybeans by these bioactive substances.
  • soybean soybean
  • soybean has been reported to inhibit the development of coronary heart disease, breast cancer, prostate cancer, colon cancer, etc., and is effective in preventing adult diseases such as osteoporosis, hormone-related diseases, hyperlipidemia, arteriosclerosis inhibition.
  • Soybean leaves have three or five small leaves and are covered with short hairs.
  • the content of these soy bean leaves is much different from soy bean or soybean root as shown in Table 1.
  • Soybean leaves contain soy isoflavones, the main component of soybeans, so they have not been used as a functional material.
  • the bioactive substance contained in soybean leaves is very different depending on the growth time, and especially soybean leaves of soybeans harvested after 90 days of life are found to contain a large amount of camphorol, and thus the present inventors extract of soybean soybean leaves. This has been shown to be effective in obesity, hyperlipidemia, arteriosclerosis, fatty liver or diabetes (Republic of Korea Patent Registration 10-1158856).
  • Black soybean is the same legume as Soybean ( Glycine max. (L.) Merr . ), But is different from the plants in Korea, and soybean, soybean or soybean paste belongs to black soybean. This means black coated Glycine max (L.) Merr. All black beans, including Seoritae and Rhynchosia Nulubilis , are included.
  • black soybeans are called medicinal soybeans and have been widely used in folk medicine because they are effective in blood nourishment, wind communication, vision enhancement, and headache treatment, and have been used as antipyretics, antidote, and other medicinal herbs in Korean medicine.
  • anthocyanins and isoflavones (Lee, L.-S. et al., Korean J. Food Sci. Technol., 46: 757-761, 2014) in black soybean seedlings have been widely used as raw materials for health food.
  • studies on functional materials of black soybeans are very poor.
  • ACAT cholesterol acyl transferase
  • a 2 Lp-PLA 2
  • a 2 Lp-PLA 2
  • a 2 Lp-PLA 2
  • quercetin improves metabolic syndrome and inflammation in obese model animals Zucker rat (Rivera, L. et al., Obesity 16: 2081-). 2087, 2008), the effects of flavonol glycosides contained in black bean leaf extract and black bean leaf extract on the prevention and treatment of metabolic syndrome Not been known.
  • the present inventors are trying to find a substance effective for preventing or treating metabolic syndrome, in particular, diabetes, obesity, insulin resistance, fatty liver, hyperlipidemia, arteriosclerosis or complications thereof, and black bean leaves with water, an organic solvent or a mixed solvent thereof.
  • Flavonol glycosides isolated from soybean leaf extracts and black soybean leaves showed significant effects than soybean leaf extracts for the prevention or treatment of metabolic syndromes such as diabetes, obesity, insulin resistance, fatty liver, hyperlipidemia, and atherosclerosis
  • An object of the present invention is to provide a composition for the prevention or treatment of metabolic syndrome, or antioxidant containing black bean leaf extract and flavonol glycosides isolated therefrom as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of metabolic syndrome containing black bean leaf extract as an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of metabolic syndrome containing a flavonol glycoside compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food for the prevention or improvement of metabolic syndrome containing black bean leaf extract as an active ingredient.
  • the present invention also provides a health functional food for preventing or improving metabolic diseases or complications thereof containing a flavonol glycoside compound as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for antioxidant containing any one selected from the group consisting of black soybean leaf extract, flavonol glycoside compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention also provides a cosmetic composition for antioxidant containing any one selected from the group consisting of black soybean leaf extract, flavonol glycoside compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention also provides a feed additive for antioxidant containing any one selected from the group consisting of black soybean leaf extract, flavonol glycoside compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Black bean leaf extract of the present invention and flavonol glycosides isolated therefrom effectively inhibit ⁇ -glucosidase activity, effectively inhibit LDL oxidation and DDP-4, and effectively promote insulin secretion in pancreatic beta cells.
  • Black bean leaf extract inhibits weight gain and body fat gain by high fat diet, lowers fasting glucose, glycated hemoglobin, free fatty acid, insulin, and insulin resistance, lowers total cholesterol and triglyceride levels, Increasing the ratio of HDL-cholesterol, decreasing the content of GOT and GPT which are indicators of hepatotoxicity in the blood, increasing plasma adiponectin levels and adiponectin expression in adipose tissue, increasing liver AMPK activity, insulin sensitivity in liver and adipose tissue Regulates the expression of genes associated with fat metabolism, and overweight or obese adults It has excellent ability of reducing waist / hip ratio, decreases plasma free fatty acid and plasma triglyceride levels, increases plasma HDL-cholesterol concentration, decrease
  • Obesity, insulin resistance, fatty liver, hyperlipidemia, atherosclerosis or metabolic syndrome can be usefully used for the prevention or treatment, as well as excellent antioxidant activity can be useful as an antioxidant composition.
  • 1 is a graph showing an HPLC analysis graph of a standard.
  • Figure 2 is a graph showing the HPLC analysis of soybean soybean 70% ethanol extract.
  • Figure 3 is a diagram showing the HPLC analysis of the seoritae 70% ethanol extract.
  • Figure 4 is a diagram showing the HPLC analysis of Seomoktae 70% ethanol extract.
  • Figure 5 is a diagram showing the HPLC analysis of soybean leaf 70% ethanol extract.
  • Figure 6 is a graph showing the HPLC analysis of frost extract 70% ethanol extract.
  • FIG. 7 is a diagram showing an HPLC analysis graph of 70% ethanol extract of Seomoktae Leaf.
  • Figure 8 is a diagram showing the HPLC analysis of soybean leaf 70% ethanol extract (magnification of 7.5 minutes-15 minutes).
  • FIG 9 is a graph showing the HPLC analysis of frost leaf 70% ethanol extract (magnification of 7.5 min-15 min).
  • FIG. 10 is a graph showing the HPLC analysis graph of 70% ethanol extract of Seomokmok Leaf (magnification of 7.5 min-15 min).
  • Figure 11 is a diagram showing the HPLC analysis of soybean leaf 95% ethanol extract.
  • FIG. 12 is a diagram showing an HPLC analysis graph of frost extract 95% ethanol extract.
  • Figure 13 is a diagram showing the HPLC analysis of 95% ethanol extract of Seomoktae.
  • FIG. 14 is a graph showing an HPLC analysis graph of high flavonol glycoside fractions of 75% ethanol extract of soy bean leaf.
  • 1 to 13 are 10 mg / ml concentration
  • Figure 14 and 15 is a 1 mg / ml concentration.
  • FIG. 15 is a graph showing an HPLC analysis graph of high flavonol glycoside fraction of frost extract 75% ethanol extract.
  • FIG. 16 is a flowchart illustrating a method of preparing flavonol glycosides compounds according to the present invention.
  • Figure 17 is a diagram showing the change in activity of AMPK enzyme, a sub-mechanism of AdipoR1 in the liver of a high fat diet-induced mouse model.
  • FIG. 18 is a diagram showing the expression change of adiponectin gene in the northern fat tissue of the mouse model induced by a high fat diet.
  • Adiponectin receptors AdipoR1, AdipoR2
  • AdipoR1 adiponectin receptors
  • 20 is a diagram showing the expression changes of genes (Glut-2, IRS-2, Foxo1 and Foxa2) that deliver the signal of insulin in the liver of a high fat diet-induced mouse model.
  • FIG. 21 is a diagram showing the change in expression of lipid metabolism regulatory transcription factors (PGC-1, PPAR ⁇ , PPAR ⁇ , PPAR ⁇ ) in the liver of a high fat diet-induced mouse model.
  • PPC-1 lipid metabolism regulatory transcription factors
  • Figure 22 is a diagram showing the expression changes of the lower genes (CPT-1 ⁇ , ACC1, ACC2 and FAS) in the liver of a high fat diet-induced mouse model.
  • Figure 23 is a diagram showing the expression changes of insulin sensitivity regulators InsR, IRS-1, GLUP-4, and TNF ⁇ genes in abdominal adipose tissue of a high fat diet-induced mouse model.
  • FIG. 24 is a diagram showing the expression changes of HSL and UCP3, the lipolysis regulators in the abdominal adipose tissue of the mouse model induced by high fat diet.
  • 25 is a diagram showing the waist / hip ratio of the control group and the test subjects before and after taking the test substance for 12 weeks in the human test.
  • FIG. 26 shows changes in plasma free fatty acid concentrations of control and test subjects before and after taking test substance for 12 weeks in human testing.
  • FIG. 27 is a diagram showing plasma triglyceride concentration changes of control and test subjects before and after taking test substance for 12 weeks in a human test.
  • FIG. 28 is a diagram illustrating plasma HDL-cholesterol concentration changes of control and test subjects before and after taking test substance for 12 weeks in a human test.
  • FIG. 29 is a diagram illustrating changes in arteriosclerosis index of control and test subjects before and after taking test substance for 12 weeks in human testing.
  • FIG. 30 is a diagram showing changes in plasma glucose concentrations of control subjects and test group subjects before and after taking test substance for 12 weeks in a human test.
  • FIG. 31 shows changes in Catalase activity in erythrocyte antioxidant enzymes of control and test subjects before and after taking 12 weeks of test substance in human testing.
  • FIG. 32 is a diagram illustrating changes in the activity of superoxide dismutase (SOD) in erythrocyte antioxidant enzymes of control and test subjects before and after taking 12 weeks of test substance in human testing.
  • SOD superoxide dismutase
  • FIG. 33 is a diagram showing changes in the activity of Glutathion reductase (GR) in erythrocyte antioxidant enzymes of control and test subjects before and after taking 12 weeks of test substance in human testing.
  • GR Glutathion reductase
  • FIG. 34 is a diagram illustrating changes in the concentration of erythrocyte TBARS, a lipid peroxide, of control and test subjects before and after taking 12 weeks of test substance in human testing.
  • FIG. 35 is a diagram illustrating changes in the concentration of inflammatory cytokine plasma MCP-1 in control and test subjects before and after taking 12 weeks of test substance in human testing.
  • 36 is a diagram showing the change in the concentration of inflammatory cytokine plasma PAI-1 of the control group and the test group subjects before and after taking 12 weeks in the human test.
  • FIG. 37 is a diagram illustrating changes in the concentration of plasma resistin, a hormone secreted from adipocytes of control and test subjects, before and after taking test substance for 12 weeks in a human test.
  • FIG. 38 is a diagram illustrating changes in the concentration of plasma Adiponectin, a hormone secreted from adipocytes of control and test subjects, before and after taking 12 weeks of test substance in human tests.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of metabolic syndrome containing black bean leaf extract as an active ingredient.
  • the black bean leaf extract is preferably prepared by a manufacturing method comprising the following steps, but is not limited thereto:
  • step 3 Concentrating the filtered extract of step 2) under reduced pressure and drying to prepare a black bean leaf extract.
  • the black bean leaves of step 1) can be used without limitation, such as those grown or commercially available.
  • Black bean leaves can be used if all the leaves of black beans, wherein the black beans are Glycine max (L.) Merr. Seoritae, Rhynchosia Nulubilis, etc., but is not limited to such.
  • the extraction solvent of step 1) is preferably water, alcohol or a mixture thereof and an organic solvent.
  • the alcohol C 1 to C 2 lower alcohols are preferably used, and as the lower alcohols, ethanol or methanol is preferably used.
  • the extraction method it is preferable to use shaking extraction, Soxhlet extraction or reflux extraction, but is not limited thereto.
  • the extraction solvent is preferably extracted by adding 1 to 20 times the amount of dried black bean leaf, and more preferably by adding 5 to 10 times.
  • the extraction temperature is preferably 20 ° C to 100 ° C, more preferably 20 ° C to 40 ° C, and most preferably room temperature, but is not limited thereto.
  • the extraction time is preferably 10 to 48 hours, more preferably 15 to 30 hours, most preferably 24 hours, but is not limited thereto.
  • the number of extraction is preferably 1 to 5 times, more preferably repeated extraction 2 to 4 times, most preferably 2 times, but is not limited thereto.
  • the concentration and drying process under reduced pressure of step 2) may be performed by conventional methods used in the art.
  • the obtained black bean leaf extract may be stored in a freezer until use.
  • the metabolic syndrome is preferably diabetes, obesity, insulin resistance, fatty liver, hyperlipidemia, arteriosclerosis or complications thereof, but is not limited thereto.
  • the complications are preferably coronary artery disease, angina pectoris, carotid artery disease, stroke, cerebral arteriosclerosis, hypercholesterolemia, cholesterol stones, hypertriglyceridemia, hypertension, cataracts, kidney disease, neuropathy, chronic inflammatory disorders or infections It doesn't work.
  • the black bean leaf extract inhibits weight gain and body fat increase by high fat diet, fasting blood glucose, glycated hemoglobin, free fatty acid, insulin and insulin resistance decrease, total cholesterol and triglyceride level decrease, increase ratio of HDL-cholesterol to total cholesterol Regulating the expression of genes related to insulin sensitivity and fat metabolism in the liver and adipose tissues, decreasing the content of GOT and GPT, an indicator of blood hepatotoxicity, increased plasma adiponectin levels and adiponectin expression in adipose tissues, increased hepatic AMPK activity It is done.
  • the active ingredient of the black soybean leaf extract contains a lot of Quercetin glycosides and Isorhamnetin glycosides
  • the active ingredient of the soybean leaf extract contains a lot of Kaempferol glycosides
  • frost leaf extract and flavonol glycoside compounds according to the present invention has an ⁇ -glucosidase inhibitory activity essential for carbohydrate metabolism (see Table 5 of Experimental Example 2).
  • frost leaf extract and flavonol glycoside compounds according to the present invention have DPP-4 activity, which is a major enzyme that breaks down glucagon-like protein-1 (GLP-1), which has a powerful effect on postprandial glycemic control. It was confirmed to inhibit (see Table 6 of Experimental Example 3).
  • frost leaf extract and flavonol glycoside compound according to the present invention was confirmed to increase insulin secretion in high concentration glucose-induced pancreatic ⁇ cell line (see Table 7 of Experimental Example 4 and Table 8 of Experimental Example 5).
  • black bean leaf extract and flavonol glycoside compounds according to the present invention were shown to inhibit the oxidation of low-density lipoprotein (LDL), which is considered to be an important factor inducing atherosclerosis (see Table 9 of Experimental Example 6). .
  • LDL low-density lipoprotein
  • black bean leaf extract and flavonol glycoside compound according to the present invention has DPPH radical scavenging activity (see Table 10 of Experimental Example 7).
  • the black bean leaf extract and the flavonol glycoside compound according to the present invention have reactive oxygen species (ROS) accumulation inhibitory activity (see Table 11 of Experimental Example 8).
  • ROS reactive oxygen species
  • blood is collected and separated into plasma (fasting glucose), glycated hemoglobin (HbA1c), free fatty acid (NEFA), insulin (insulin), insulin resistance (HOMA) -IR) levels, total cholesterol (TC), HDL-cholesterol / TC and triglyceride levels, indicators of lipid content, and GOT and GPT, indicators of liver function, were measured.
  • the test group ingested with ethanol extract confirmed a decrease in fasting blood glucose, a decrease in glycated hemoglobin, a decrease in free fatty acids, a decrease in insulin, a decrease in insulin resistance index (HOMA-IR), and an increase in adiponectin.
  • a decrease in total cholesterol an increase in the ratio of HDL-cholesterol to total cholesterol, a decrease in triglycerides, a decrease in GOT levels, and a decrease in GPT levels (see Table 14 in Experiment 9).
  • AMPK AMP-activated protein kinase
  • adiponectin receptors AdipoR1 and AdipoR2 was significantly increased compared to the control group.
  • CPT-1 ⁇ (carnitine palmitoyltransferase 1A) gene that regulates fatty acid oxidation through the transcription factor was significantly increased
  • Expression of ACC1, ACC2 and FAS genes that regulate fat accumulation was found to be significantly reduced (see FIG. 22).
  • HSL hormone-sensitive lipase
  • UCP3 uncoupling protein-3
  • black bean leaf extract of the present invention can be usefully used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of metabolic syndrome.
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additive may include starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate, lactose , Mannitol, malt, gum arabic, pregelatinized starch, corn starch, powdered cellulose, hydroxypropyl cellulose, opiodry, sodium starch glycolate, carnauba lead, synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate, calcium stearate , Sucrose, dextrose, sorbitol, talc and the like can be used.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included 0.1 to 90 parts by weight based on the composition, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention can be administered in various oral and parenteral formulations during actual clinical administration, and when formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc., which are commonly used It can be prepared using.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose ( Sucrose), lactose (Lactose) or gelatin can be prepared by mixing.
  • lubricants such as magnesium styrate talc may also be used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents, water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • composition of the present invention can be administered orally or non-orally according to the desired method, the external or intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection or intramuscular injection It is preferable to select. Dosage varies depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and severity of the patient.
  • the dosage of the composition of the present invention varies depending on the weight, age, sex, health status, diet, time of administration, administration method, excretion rate and severity of the disease of the patient, the daily dosage is the amount of black bean leaf extract 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg, and may be administered 1 to 6 times per day.
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of metabolic syndrome containing a flavonol glycoside compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the flavonol glycoside compound is characterized in that the compound of Formula 1 to 7:
  • the present invention includes not only the compounds represented by the formulas 1 to 7, but also pharmaceutically acceptable salts thereof, and possible solvates, hydrates, racemates or stereoisomers which can be prepared therefrom.
  • the present invention can be used in the form of a compound represented by formulas (1) to (7) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the salt conventional acid addition salts formed by pharmaceutically acceptable free acid are useful.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • the present invention provides a health functional food for the prevention or improvement of metabolic syndrome containing black bean leaf extract as an active ingredient.
  • the present invention also provides a health functional food for preventing or improving metabolic syndrome or its complications containing the flavonol glycoside compound as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food for the prevention or improvement of metabolic diseases or complications thereof, characterized in that the flavonol glycoside compound is a compound of Formula 1 to 7.
  • the "health functional food” of the present specification is manufactured by using nutrients or ingredients (functional raw materials) having useful functions to the human body, which are easily deficient in a daily meal, and maintaining health through physiological functions or maintaining normal functions of the human body.
  • the food is to maintain and improve the food as defined by the Commissioner of Food and Drug Safety, but is not limited to this and is not used to exclude the health food in the normal sense.
  • Black bean leaf extract or flavonol glycoside of the present invention inhibits the activity of ⁇ -glucosidase, DDP-4 inhibitory effect, insulin secretion promoting activity effect, and black bean leaf extract is metabolized through mouse animal model experiment By confirming that there is a preventive effect of the syndrome, it can be usefully used as an active ingredient of the health functional food for the prevention or improvement of metabolic syndrome or its complications.
  • the black soybean leaf extract or flavonol glycoside of the present invention can be added to a food as it is or used with other food or food ingredients, and can be suitably used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention or improvement).
  • the amount of the compound in the dietary supplement may be added at 0.01 to 90 parts by weight of the total food weight.
  • the amount may be below the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety.
  • the health functional beverage composition of the present invention is not particularly limited to other ingredients except the black bean leaf extract or flavonol glycosides as essential ingredients in the indicated ratios, and additional ingredients such as various flavors or natural carbohydrates, such as ordinary drinks. It may contain as.
  • the proportion of said natural carbohydrates is generally about 1 to 20 g, preferably about 5 to 12 g per 100 g of the composition of the present invention.
  • black bean leaf extract or flavonol glycoside of the present invention various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, such as flavoring agents, colorants and neutralizing agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and Salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.
  • the black bean leaf extract of the present invention, its flavonol glycosides may contain the flesh for the production of natural fruit juices and fruit juice drinks and vegetable drinks.
  • the ratio of such additives is not so important but is generally selected from 0.1 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the black bean leaf extract of the present invention or 0.0001 to about 0.02 parts by weight per 100 parts by weight of the flavonol glycoside compound of the black bean leaf extract. to be.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for antioxidant containing any one selected from the group consisting of black soybean leaf extract, flavonol glycoside compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the frost and leaf extract of lycopene and lycopene leaves are in low-density lipoprotein (LDL) of 54.5-93.1% at a concentration of 40 ⁇ g / ml compared to soybean leaf extract (26.7-42.7%)
  • LDL low-density lipoprotein
  • the flavonol glycoside compound represented by Chemical Formulas 1 to 5 exhibited an excellent antioxidant activity with an IC 50 value of 0.4-2.3 ⁇ M, a concentration that inhibits 50% of the antioxidant activity against LDL.
  • Flavonol glycoside compounds represented by 6 to 7 showed an antioxidant activity against LDL of 55.7-65.7% at a concentration of 100 ⁇ g / ml (see Table 9 of Experimental Example 6).
  • frost and leaf extract of seomulgogi showed DPPH radical scavenging activity of 36.5-64.6% at a concentration of 200 ⁇ g / ml compared to soybean leaf extract (18.8-23.8%), the formula 1 to Flavonol glycoside compound represented by 5 was confirmed to exhibit excellent DPPH radical scavenging activity of 52.0-85.9% at a concentration of 50 ⁇ M (see Table 10 of Experimental Example 7).
  • frost and leaf extract of seomulgogi showed 30.5-45.2% active oxygen species accumulation inhibitory activity at a concentration of 100 ⁇ g / ml compared to soybean leaf extract (8.1-36.2%),
  • the flavonol glycoside compound represented by 1 to 7 was found to exhibit an excellent active oxygen species accumulation inhibitory activity of 21.9-58.8% at a concentration of 100 ⁇ M (see Table 11 of Experimental Example 8).
  • the black soybean leaf extract of the present invention and the flavonol glycosides isolated therefrom are excellent in LDL antioxidant activity, DPPH radical scavenging activity, and active oxygen species accumulation inhibitory activity, and thus can be usefully used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for antioxidant. have.
  • the present invention also provides a cosmetic composition for antioxidant containing any one selected from the group consisting of black soybean leaf extract, flavonol glycoside compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Black bean leaf extract of the present invention and flavonol glycosides isolated from it can be usefully used as an active ingredient of the cosmetic composition for antioxidant by confirming the excellent LDL antioxidant activity, DPPH radical scavenging activity and active oxygen species accumulation inhibitory activity.
  • composition of the present invention may further contain at least one active ingredient exhibiting the same or similar function to the black bean leaf extract and the flavonol glycoside compound isolated therefrom.
  • the cosmetic composition is in addition to the black soybean leaf extract and flavonol glycoside compound of the present invention, fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickeners and gelling agents, emollients, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents (forming agents) , Fragrances, surfactants, water, ionic or nonionic emulsifiers, fillers, metal ion sequestrants and chelating agents, preservatives, vitamins, blockers, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic active agents, lipid vesicles Or any other ingredient commonly used in cosmetics, such as auxiliaries commonly used in the cosmetic field.
  • the black soybean leaf extract and the flavonol glycoside compound isolated therefrom are preferably contained in an amount of 0.005 to 90% by weight based on the total weight of the composition. It may be used above or below the range.
  • the present invention also provides a feed additive for antioxidant containing any one selected from the group consisting of black soybean leaf extract flavonol glycoside compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • frosted and seomoktae leaves were harvested at regular intervals after 50 days of growth and dried with hot air.
  • 1L per 100 g of the dried or dried frost leaves were added to 1 L of 50%, 70%, or 95% ethanol (alcohol), and extracted at room temperature for 4 days with stirring. Then, only the ethanol soluble portion was recovered using a filter paper. The filtrate was repeated one more time in the same manner, and then the ethanol soluble part was collected and concentrated under reduced pressure to obtain a black soybean leaf ethanol extract.
  • Example ⁇ 1-1> The black bean leaf ethanol extract obtained in Example ⁇ 1-1> was concentrated under reduced pressure to prepare a water suspension from which all ethanol was removed.
  • the water suspension was slowly adsorbed onto a Diaion HP-20 resin column (95 ⁇ 200 mm), which is a synthetic adsorbent, and the unabsorbed material was washed with water.
  • methanol / water as the effluent solvent
  • fractions B and C contained many flavonol glycoside compounds.
  • the mixed fraction (55.5 g) obtained by combining the B and C fractions of the fractions and concentrating under reduced pressure was subjected to C18-reverse column chromatography (RP-C18, 95 ⁇ 150 mm) using a methanol / water mixture as an outlet solvent. Separated. The MeOH / H 2 O mixed solution was transferred to the mobile phase under gradient conditions (MeOH / H 2 O 0: 10 ⁇ 1: 9 ⁇ 2: 8 ⁇ 3: 7 ⁇ 4: 6 ⁇ 5: 5 ⁇ 7: 3) Fractions were made into seven fractions (BC1 to BC7).
  • the compound represented by (yellow green color) was obtained.
  • 16 is a flowchart illustrating a method for preparing flavonol glycosides compounds according to the present invention.
  • ⁇ -D-galactopyranoside (Formula 1), Quercetin 3-O- ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 2)-[ ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 6)]- ⁇ -D-glucopyranoside (Formula 2) , Quercetin 3-O- (2- ⁇ -D-glucopyranosyl) - ⁇ -D-galactopyranoside (Formula 3), Quercetin 3-O- (2- ⁇ -D-glucopyranosyl) - ⁇ -D-glucopyranoside (Formula 4) , Quercetin 3-O- (2- ⁇ -D-rhamnopyranosyl) - ⁇ -D-galactopyranoside (Formula 5), Isorhamnetin 3-O- (2- ⁇ -D-glucopyranosyl) - ⁇ -D-galactopyranoside (Formula 6) And Isorhamnetin 3-O-
  • the high content of flavonol glycosides was prepared by the following method.
  • the suspension was prepared by dissolving the concentrated black soybean leaf 70% ethanol extract (18.9 g) obtained in Example ⁇ 1-1> in 30% methanol.
  • the 30% methanol suspension and the same amount of chloroform (Chloroform, CHCl 3 ) was added to the fraction funnel and fractionated by layer separation. This process was repeated three times and concentrated under reduced pressure to obtain a 30% methanol fraction layer (16.8 g).
  • the fraction was slowly adsorbed onto a Diaion HP-20 resin column (45 ⁇ 200 mm), a synthetic adsorbent, and the non-adsorbed material was washed with water.
  • Soybean leaf ethanol extract was prepared in the same manner as in Example ⁇ 1-1>, except that 1 kg of soybean leaf was used instead of black bean leaf (frost leaf or seomok leaf).
  • soy bean leaf extract 70% ethanol extract (24.6 g) was used in the same manner as in Example 3 to prepare a high content of flavonol glycoside-derived flavonol glycosides (6.0 g).
  • the main constituents of 70% ethanol extract and 95% ethanol extract of soybean leaves are kaempferol glycosides and pterocarpan-based compounds among isoflavone glycosides, and 70% ethanol extracts of soybean and seomoktae, black bean leaves.
  • the main components of and 95% ethanol extracts were quercetin glycosides and isorhamnetin glycosides in isoflavone glycosides, and few terokapane compounds were detected. Also, quercetin glycosides and aglycons of aceramonetin glycosides were not detected in the black bean leaf extract.
  • black bean leaf extract is very different from the active ingredient of the black bean extract, it can be seen that very different from the active ingredient of soybean leaf extract.
  • the main components of the black soybean leaf extract are high in quercetin glycosides and isorametine glycosides, while the black soybean extracts are made of diidzin, genistin, isoflavones (ISF) and malonylzenithine. (6 “-O-malonylgenistin), diedzein, genistein, etc. are the main active ingredients, and the active ingredient of soybean leaf extract contains a lot of camphorol glycosides.
  • frost leaf and seomok leaf were significantly different from soybean leaf.
  • soybean leaves contain a lot of kaempferol glycosides and pterocarpans, while frost and lycaine leaves contain a large amount of quercetin glycosides and isoramnetine glycosides.
  • the concentration of the injected extract solution was 1-10 ⁇ g / ml
  • the amount of the injected extract solution was 10 ⁇ l
  • the detection wavelength was analyzed at 345 nm.
  • Flavonol glycosides, the markers were dissolved in ethanol to prepare a standard solution in the range of 6.25-500.0 ⁇ g / ml, and tested according to HPLC analysis conditions.
  • the peak area obtained from the chromatogram corresponding to the concentration of the standard was corresponded to the X-axis.
  • a calibration curve was created by mapping the values to the Y axis.
  • the standard used for analysis was Quercetin 3-O- (2- ⁇ -D-rhamnopyranosyl) - ⁇ -D-galactopyranoside (Formula 1), which is a major component of black soybean leaf, and Kaempferol 3-O- ⁇ -D, which is a major component of soybean leaf.
  • -glucopyranosyl (1 ⁇ 2) -O- [ ⁇ -L-rhamnopyranosyl (1 ⁇ 6)]- ⁇ -D-glucopyranoside, all of which used high purity standards above 95%.
  • the inhibitory activity against ⁇ -glucosidase was performed by partially modifying the nitrophenol method (J. Med. Chem. 48: 2036-2044, 2005) by Kato. Accumulation of p-nitrophenyl- ⁇ -D-glucopyranoside (Sigma-Aldrich), a substrate by ⁇ -glucosidase (EC 3.2.1.20, Baker Yeast), using chromophores of monosaccharides such as glucose produced during hydrolysis was measured by absorbance.
  • Buffer solution in a 96-well plate (NUNC TM Corporation) (70 mM phosphate, pH 6.8) for 50 ⁇ l, sample extract or compound 50 ⁇ l, ⁇ - glucosidase during Days (0.1 unit / ml) 50 ⁇ l dissolved in 50% DMSO Finally, the substrate (5 mM, p-nitrophenyl- ⁇ -D-glucopyranoside) was added to react at 37 ° C. for 30 minutes, and then 2 M NaOH was added to terminate the reaction. The amount of chromophore produced was measured at 405 nm using a microplate reader (ANTHOS TM) and the inhibitory activity was calculated.
  • NUNC TM Corporation 70 mM phosphate, pH 6.8
  • the substrate (5 mM, p-nitrophenyl- ⁇ -D-glucopyran
  • the frost leaf extract shows about 20.5% to 39.1% of ⁇ -glucosidase inhibitory activity at 50 ⁇ g / ml, and the flavonol glycoside compound represented by Formulas 1 to 7 is about 8.7 to 63.9% of ⁇ -glucose at 100 ⁇ M. While showing Seasides inhibitory activity,
  • Soybean leaf extract was found to have an ⁇ -glucosidase inhibitory activity of about 15.6% to 26.7% at 50 ⁇ g / ml.
  • frost leaf extract and flavonol glycoside compound according to the present invention has a significantly superior ⁇ -glucosidase inhibitory activity compared to soybean leaf extract.
  • the frost leaf extract (100 ⁇ g / ml) and flavonol glycoside compound (200 ⁇ M) was dissolved in DMSO to prepare a sample solution.
  • 10 ⁇ l of human recombinant DPP-IV (Prospec, USA) at a concentration of 1 ⁇ g / ml, 78 ⁇ l of incubation buffer (50 mM Tris, pH 7.5) and 2 ⁇ l of the prepared sample solution were added to a 96 well microplate.
  • DPP-4 inhibitory effect (%) 100-(A / A1 x 100)
  • A1 AFC concentration of negative control
  • the frost leaf extract according to the present invention showed an inhibitory activity against DPP-4 of 22.8-36.0% at 100 ⁇ g / ml, flavonol glycoside represented by the formula 1 to 7
  • the compound showed inhibitory activity against DPP-4 of 39.4-48.7% at 200 ⁇ M concentration.
  • quercetin an aglycone of the quercetin glycoside of Formulas 1 to 5
  • the inhibitory activity against DPP-4 of Formulas 1 to 5 ranges from 42.2 to 48.7% of quercetin.
  • isoramnetine glycoside aglycone (aglycone) of formulas 6 and 7 has 21.6% inhibitory activity against DPP-4, while the inhibitory activity against DPP-4 of formulas 6 and 7 is 39.4%, respectively. And 48.1%, which is very good compared to isoramnetine.
  • Mouse pancreatic ⁇ cell line MIN6 beta cells 15% FBS (Gibco Inc.), 100 units / ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml streptomycin containing a DMEM (Lonza, Inc.), using the medium 37 °C wet a 5% CO 2 incubator Incubated at.
  • Frost leaf ethanol extract and flavonol glycoside compounds according to the present invention was shown to increase insulin secretion in pancreatic beta cells induced by high glucose (30 mM), especially frost leaf 115 days 70% Ethanol extract was found to induce a significant increase in insulin secretion of 89.6%.
  • soybean leaves 115 days 70% ethanol extract showed a very low insulin secretion increase of 36.2% compared to the 115 days 70% ethanol extract of frost tea leaves of the present invention.
  • the high fraction of flavonol glycosides of the frost leaves according to the present invention was shown to significantly increase the insulin secretion compared to the extract to induce an excellent insulin secretion increase of 206.4% at 100 ⁇ g / ml administration.
  • quercetin glycoside represented by the formula (4) according to the present invention has been shown to induce an increase in insulin secretion about 2 times better than quercetin, which is its aglycone.
  • quercetin which is its aglycone.
  • isorametine glycosides represented by the formulas (6) and (7) according to the present invention have been shown to induce an increase in insulin secretion compared to its aglycone, isoramnetine, and in particular, the isoram represented by the formula (7).
  • Netine glycosides have been shown to induce an increase in insulin secretion that is about four times better than its aglycone, isorametine.
  • the frost leaf extract and glycoside represented by the formula (1) according to the present invention the soybean leaf extract, soybean leaf extract is significantly superior to the camphorol glycosides, camphorol aglycone, isorametine aglycone present in the soybean leaf extract It can be seen that there is an ability to induce increased secretion.
  • the black kongip extract and flavonol glycoside compound antioxidants Cu 2 + D aldehyde (dialdehyde) of the oxidation products of unsaturated fatty acid-induced oxidation of LDL, and generated using in order to determine the activity of the LDL in accordance with the present invention
  • TBARS thiobarbituric acid-reactive substances
  • the amount of malondialdehyde produced was determined using a standard curve (Jeong TS et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14: 2719-2723, 2004). The results are shown in Table 9 below.
  • the frost leaf extract according to the present invention exhibited an LDL antioxidant activity of at least 50% at a concentration of 40 ⁇ g / ml, among which 50% and 70% ethanol extracts had a significantly superior LDL antioxidant activity of at least 91%. .
  • Seokmoktae Leaf Extract showed an LDL antioxidant activity of 54% or more at a concentration of 40 ⁇ g / ml, and among these, especially 50% and 70% ethanol extracts were found to have remarkably excellent LDL antioxidant activity of 91% or more.
  • soybean leaf extract showed less than 43% LDL oxidation inhibitory activity at all concentrations of 40 ⁇ g / ml, frost or leaf extract according to the invention has significantly superior LDL antioxidant activity than the soybean leaf extract It can be seen.
  • the isorametine glycoside of Formulas 1 to 5 present in the black soybean leaf extract according to the present invention exhibited very high LDL oxidation inhibitory activity with IC 50 values of 0.4 to 2.3 ⁇ M
  • the isorametine glycoside of Formulas 6 and 7 Showed relatively high LDL antioxidant activity of 65.7% or 55.7%, respectively, at a concentration of 100 ⁇ M.
  • Comparative Example 2 and Comparative Example 4 glycosides present in the soybean leaf extract showed relatively low LDL oxidation inhibitory activity of 28.4% or 41.3%, respectively, at a concentration of 100 ⁇ M, so that the glycosides present in the black soybean leaf extract were soybean leaf extract. It can be seen that there is a remarkably excellent LDL oxidation inhibitory activity compared to the glycosides present in.
  • the frost leaf extract according to the present invention exhibited at least 36% of DPPH radical scavenging activity at a concentration of 200 ⁇ g / ml, among which 50% and 70% ethanol extracts had a significantly superior DPPH radical scavenging activity of at least 48%. .
  • the extract of Seokmoktaegi according to the present invention exhibits at least 36% of DPPH radical scavenging activity at a concentration of 200 ⁇ g / ml, among which 50% and 70% ethanol extracts have remarkably good DPPH radical scavenging activity of 54% or more. Appeared.
  • soybean leaf extract shows a DPPH radical scavenging activity of less than 24% all at a concentration of 200 ⁇ g / ml, so that the frost or leaf extract of the present invention has a significantly superior DPPH radical scavenging activity than the soybean leaf extract It can be seen.
  • the high flavonol glycosides fraction of the black soybean leaves according to the present invention was significantly increased DPPH radical scavenging activity compared to the extract showed an excellent DPPH radical scavenging activity of 82% at 50 ⁇ g / ml.
  • Comparative Examples 2 and 3 which are camphorol glycosides and Comparative Example 4, which are genistein glycosides, which are present in the soybean leaf extract, both exhibit less than 8% of LDL oxidation inhibitory activity, the chemical formula 1 present in the black bean leaf extract of the present invention.
  • LDL oxidation inhibitory activity of the flavonol glycosides of 5 to 52% or more, it can be seen that the glycosides present in the black soybean leaf extract is significantly superior to the glycosides present in the soybean leaf extract.
  • the flavonol glycoside compounds present in the black soybean leaf extract (Soritae and Seomoktae varieties) and the black soybean leaf extract according to the present invention has a significantly superior antioxidant activity than the flavonol glycoside compounds present in the soybean leaf extract and soybean leaf extract. Able to know.
  • ROS Reactive Oxygen Species
  • DCFH 2 -DA (2 ', 7'-dichlorofluorescein diacetate) was added to a final concentration of 15 ⁇ M and reacted for 30 minutes.
  • the reaction was terminated, washed five times with PBS, and then measured the fluorescence value of DCF using a Fluorometer (480/530, ex / em) (Hayakaya M. et al., EMBO J., 22: 3356-3366, 2003) .
  • the results are shown in Table 11 below.
  • the frost leaf extract according to the present invention exhibits inhibitory activity against ROS accumulation of more than 30% at all concentrations of 100 ⁇ g / ml, among which 50% and 70% ethanol extracts have inhibitory activity against remarkably good ROS accumulation of more than 40%. It was found to have.
  • Seomoktae leaf extract exhibits inhibitory activity against ROS accumulation of more than 31% at all concentrations of 100 ⁇ g / ml, among which 50% and 70% ethanol extract has a significantly superior inhibitory activity against ROS accumulation of more than 40% Appeared.
  • the soybean leaf extract exhibits an inhibitory activity against ROS accumulation of less than about 36% at a concentration of 100 ⁇ g / ml, so that the black bean leaf extract (frost leaf and seomok leaf extract) of the present invention is significantly higher than the soy bean leaf extract. It can be seen that it has an inhibitory activity against excellent ROS accumulation.
  • the flavonol glycosides of Formulas 1 to 7 present in the black bean leaf extract of the present invention have inhibitory activity against ROS accumulation of 22% to 59% at a concentration of 100 ⁇ M.
  • the black soybean leaf extract and the flavonol glycoside compound according to the present invention can exhibit excellent anti-inflammatory activity.
  • the following experiment was performed to investigate the effects on the metabolic syndrome, particularly hyperlipidemia, diabetes mellitus, type 2 diabetes, obesity, fatty liver of frost leaf extract according to the present invention.
  • mice were used by importing male C57BL / 6J mice from Japan SLC.
  • the pretreated animals were acclimated to the laboratory environment with free feeding of AIN-76A diet and water for 2 weeks, and then 6-week-old mice with good health were used for the experiment.
  • the experimental group was classified as follows:
  • Test group supplemented with frost extract ethanol extract (1%, wt / wt diet) of the present invention to a high-fat diet.
  • the experimental group was tested for 12 weeks to observe the lipid lowering, antidiabetic and anti-obesity effects.
  • the environment of the animal breeding room was maintained at constant temperature (25 ⁇ 2 °C), constant humidity (50 ⁇ 5%) and photoperiods (lighting 07: 00-19: 00) at 12 hour intervals, and experimental animals 3 to 4
  • the animals were reared separately, and the diet and drinking water were taken freely. Dietary intake and body weight were measured and recorded at a regular time every week, and after fasting at 12-week intervals for 2 hours, blood was collected from the posterior eye and venous gun using capillary tubes to prevent coagulation using EDTA, and blood biochemical tests. For 30 minutes after blood collection, the plasma was separated by centrifugation at 3,000 rpm and 4 ° C. for 15 minutes, and stored at ⁇ 70 ° C. for analysis.
  • RNA stabilization solution Qiagen
  • results between the negative control, the control group and the test group were expressed as the mean ⁇ standard deviation.
  • the difference between the groups was one-way ANOVA followed by Turkey hoc test ( JMP® software, SAS Institute Inc., USA).
  • a statistical significance was determined when less than% (P ⁇ 0.05). That is, the superscript a, b, c means that there is statistical significance between different groups.
  • Table 12 shows the results of measuring the weight of the test animals and the adipose tissue, liver, muscle weight of each experimental animal of ⁇ 9-1>.
  • the weight gain of the negative control group fed the basic diet was 12.5 ⁇ 1.1 g after 12 weeks, and the weight gain of the control group fed the high fat diet was significantly increased to 23.6 ⁇ 0.5 g.
  • the weight gain of the test group intake of frost extract ethanol extract with high fat diet was 19.4 ⁇ 1.3 g, which was 17.8% suppressed by the intake of ethanol extract.
  • the weight of the abdominal adipose tissue of the negative control group was 0.60 ⁇ 0.06 g, and the weight of the abdominal adipose tissue of the control group was 1.06 ⁇ 0.07 g, whereas the weight of the abdominal adipose tissue of the test group was 0.98 ⁇ 0.10 g.
  • Increasing body fat was inhibited by the intake of ethanol extract.
  • the muscle weight of the negative control group was 0.29 ⁇ 0.01 g, and the control group's muscle weight was 0.32 ⁇ 0.01 g, whereas the muscle weight of the test group fed with frost extract of frost extract was 0.34 ⁇ 0.00 g. Increased compared to
  • the liver weight of the negative control group was 1.29 ⁇ 0.05 g, and the liver weight of the control group was increased to 1.56 ⁇ 0.10 g, whereas the liver weight of the test group ingested with frost extract of ethanol was 0.98 ⁇ 0.10 g. Fat liver was significantly inhibited.
  • the amount of total cholesterol per g weight of liver was significantly decreased by 30.4% in the test group to 1.03 ⁇ 0.05 mg, compared to the control group was 1.48 ⁇ 0.06 mg.
  • the total triglyceride per liver weight was significantly decreased by 50.6% in the test group (22.18 ⁇ 2.25 mg), compared to 44.93 ⁇ 3.67 mg in the control group.
  • glycated hemoglobin was measured using EASY A1CTM glycated hemoglobin cartridge [Inpopia], insulin concentration Insulin ELISA kit (Alpco diagnostics) was used and adiponectin concentration was measured using Adiponectin ELISA kit (R & D Systems, Inc.). Insulin resistance index (HOMA-IR index) is calculated according to the reference (Matthews et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
  • Fasting blood glucose was significantly decreased in the negative control group (106.0 ⁇ 2.8 mg / dL) and the control group intake of frost extract ethanol extract was 124.0 ⁇ 8.6 mg / dL compared to 143.7 ⁇ 3.9 mg / dL.
  • Glycated hemoglobin significantly decreased (P ⁇ 0.05) to 4.2 ⁇ 0.0% compared to 4.4 ⁇ 0.0% in the negative control group and 4.6 ⁇ 0.1% in the control group.
  • Free fatty acid significantly decreased in the test group to 1.4 ⁇ 0.0 mEq / L compared to 2.3 ⁇ 0.1 mEq / L in the negative control group and 1.9 ⁇ 0.1 mEq / L in the control group (P ⁇ 0.05).
  • adiponectin an anti-obesity hormone, an obesity inhibitor, insulin sensitivity enhancer, and anti-arteriosclerosis
  • Total cholesterol was 111.3 ⁇ 2.6 mg / dl in the negative control group and 145.5 ⁇ 3.9 mg / dl in the control group.
  • the ratio of HDL-cholesterol per total cholesterol was significantly increased to 55.6 ⁇ 1.0% in the control group compared to 52.3 ⁇ 5.4% in the negative control group and 42.6 ⁇ 3.8% in the control group (P ⁇ 0.05).
  • Triglycerides were 139.8 ⁇ 10.5 mg / dl in the negative control group and 88.2 ⁇ 5.7 mg / dl in the control group, while the test group significantly decreased to 59.2 ⁇ 3.0 mg / dl (P ⁇ 0.05).
  • the control group fed the high-fat diet showed fatty liver symptoms and increased GOT (aspartate transaminase; AST) and GPT (alanine transaminase (ALT)) contents. That is, the GOT content was 56.2 ⁇ 1.3 IU / L in the negative control group and 69.8 ⁇ 2.7 IU / L in the control group.
  • the test group significantly decreased to 28.5 ⁇ 1.1 IU / L, compared with 33.5 ⁇ 1.3 IU / L and the control group was 40.2 ⁇ 1.9 IU / L (P ⁇ 0.05).
  • AMPK AMP-activated protein kinase
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • RT-PCR device (Applied Biosystems 7500 Real Time) using SYBR Green Supermix reagent (Applied Biosystems) using the characteristics of SYBR Green intervening in dsDNA with oligos synthesized to amplify each gene PCR system, Life Technologies, USA) confirmed the amplification process of cDNA in real time.
  • the primers used were found to form a single amplicon of 150 to 200 bp in the PCR amplification process, and their base sequences are shown in Table 15 below.
  • the expression level of the gene is expressed as the number of PCR cycles at the point where the cDNA is amplified and the fluorescence reaches the saturation state, which is corrected to the value for GAPDH and finally calculated as a relative value to the control group that consumed the high fat diet. It was.
  • the test group administered the frost extract of frost leaf of the present invention in Table 15 the plasma adiponectin level significantly increased compared to the control group, as shown in Figure 18, adiponectin gene expression in adipose tissue It was confirmed that the increase significantly compared to the control.
  • the test group administered frost extract ethanol extract of the present invention was found that the expression of AdipoR1 and AdipoR2, adiponectin receptors in the liver significantly increased compared to the control group, shown in Figure 20 As shown, the expression of GLUT-2 and IRS-2, which is regulated by AMPK and enhances insulin sensitivity in the liver, was markedly increased, and the expression of forkhead box protein O1 (FoxO1) and forkhead box protein A2 (Foxa2), which cause insulin resistance, was markedly increased. Expression was significantly reduced.
  • the peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR ⁇ , PPAR ⁇ , PPAR ⁇ ) gene which is a peroxysome proliferator-activated receptor that regulates lipid metabolism in hepatocytes, and PGC-, a transcription cofactor of PPAR, is a sub-mechanism of AdipoR2. 1 Gene expression was changed to effectively regulate lipid metabolism. In other words, the expression of PPAR ⁇ and PPAR ⁇ , which increased fatty acid oxidation and insulin sensitivity, were significantly increased in the test group compared to the control group treated with frost extract of ethanol, and the expression of PPAR ⁇ , which increased the intracellular fat accumulation, was higher than the control group.
  • the test group administered frost extract ethanol extract of the present invention the gene expression of insulin receptors InsR, IRS-1, GLUT-4, which are insulin sensitivity regulators in abdominal adipose tissue, was more effective than the control group.
  • hormone-sensitive lipase (HSL) and uncoupling protein-3 (UCP3) which regulate the degradation of adipose tissue were shown. Expression was confirmed to increase compared to the control group.
  • the frost leaf extract according to the present invention In order to determine the effect of the frost leaf extract according to the present invention on the metabolic syndrome, in particular hyperlipidemia, diabetes, type 2 diabetes, obesity, the following human test was performed.
  • the human body test was conducted after the review and approval of the Institutional Review Board (IRB) of Kyungpook National University (Approval number: KNU 2015-0032, date of approval: April 9, 2015).
  • the effects of frost leaf are overweight (BMI> 23) or obesity (BMI> 25) between 35-65 years old and semi-healthy adults with fasting blood glucose above 100 mg / dL.
  • Each body measurement and blood analysis were performed before and after the test with corn starch at a 2 g / day dose or the test group for 12 weeks at a 2 g / day dose of frost leaf extract. There were about 20 subjects in the control and test groups.
  • the monitoring was conducted once every two weeks during the test period to investigate whether the food was ingested and the side effects or discomforts (diarrhea, intestinal gas generation, dizziness, abdominal pain, vomiting, etc.) that might occur during the test period.
  • a total of 4 visits (0, 4, 8, 12 weeks) to complete nutrition surveys and 24-hour meal journals, body measurements, body composition measurements, waist and hip circumferences, blood pressure, fasting blood glucose, prescription food distribution, blood collection and urine The collection was performed. Fasting blood and urine were collected after 12 hours of fasting before the test (week 0) and after the test (12 weeks).
  • the collected blood was collected in a test tube treated with heparin, centrifuged at 1000 ⁇ g and 4 ° C. for 15 minutes to separate plasma and stored at ⁇ 70 ° C. until sample analysis.
  • the body weight, body mass percentage (BMI), body fat percentage (BFP), waist circumference and hip circumference were measured before and after taking the test substance for 12 weeks. The results are shown in FIG.
  • HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, total cholesterol, and triglyceride concentrations of whole blood were measured, and free fatty acids and fasting glucose in plasma were also measured.
  • a measurement solution (Asan Pharmaceutical Kit) using an enzyme method (Clin. Chem. 20: 470-475, 1974) such as Allain was used.
  • HDL-cholesterol was measured using Asan Pharmaceutical Reagent (Clin. Chem. 28: 1379-1388, 1982).
  • Neutral lipid concentration of blood was measured using a reagent for measuring triglycerides (Asan Pharmaceutical Kit) according to the color development method using the enzyme method (Clin. Chem. 29: 538-542, 1983) by McGowan et al.
  • Atherosclerotic index was calculated as [(total cholesterol-HDL-cholesterol) / HDL-cholesterol).
  • Plasma free fatty acid was measured using a free fatty acid measurement solution (Non-esterified fatty acid, NEFA kit, Wako, Osaka, Japan) according to the principle of color development using the enzyme method.
  • a free fatty acid measurement solution Non-esterified fatty acid, NEFA kit, Wako, Osaka, Japan
  • Commercial glucose measurement reagent was used to measure the plasma glucose content.
  • plasma free fatty acid, triglyceride, HDL-cholesterol and glucose concentrations of the control group showed no significant difference after 12 weeks.
  • the test group taking frost leaf extract showed significantly lower plasma free fatty acid concentration of 11.9% and plasma triglyceride concentration of 21.1%.
  • Atherosclerotic index decreased by 15.8% as plasma HDL-cholesterol concentration increased by 11.6%.
  • the test group taking frost leaf extract showed a significantly lower plasma glucose concentration of 9.1%.
  • erythrocyte catalase, SOD and GR activities were significantly increased by 9.5%, 7.9% and 46.3%, respectively, after taking frost leaf extract and TBARS, a erythrocyte lipid peroxide, was frost leaf extract. There was a significant decrease (20.9%) compared with the control group after taking, which also showed a significant decrease (13.9%) after taking compared to before taking the frost leaf extract.
  • MCP-1, PAI-1, Lecithin and Adiponectin and concentrations of plasma were measured before and after 12 weeks of taking test substance.
  • MCP-1, PAI-1 and lecithin were measured using a Multiplex detection kit (Bio-Rad, USA) and adiponectin was measured using Human total adiponectin / Acrp30 (R & D systems).
  • MCP-1 and PAI-1 are inflammatory cytokines. Resistin and adiponectin are hormones secreted by fat cells. Resistin is a major cause of so-called adult diseases such as obesity, arteriosclerosis and diabetes, and adiponectin improves insulin resistance and anti-arteriosclerosis.
  • plasma MCP-1, PAI-1 and lecithin concentrations were significantly lower by 20.0%, 27.9%, and 14.2%, respectively, than after administration of the frost leaf extract.
  • plasma adiponectin concentration was significantly increased by 9.9% after taking frost leaf extract.
  • Black bean leaf extract of the present invention and flavonol glycosides isolated therefrom effectively inhibit ⁇ -glucosidase activity, effectively inhibit LDL oxidation and DDP-4, and effectively promote insulin secretion in pancreatic beta cells.
  • Black bean leaf extract inhibits weight gain and body fat gain by high fat diet, lowers fasting glucose, glycated hemoglobin, free fatty acid, insulin, and insulin resistance, lowers total cholesterol and triglyceride levels, Increasing the ratio of HDL-cholesterol, decreasing the content of GOT and GPT which are indicators of hepatotoxicity in the blood, increasing plasma adiponectin levels and adiponectin expression in adipose tissue, increasing liver AMPK activity, insulin sensitivity in liver and adipose tissue Regulates the expression of genes associated with fat metabolism, and overweight or obese adults It has excellent ability of reducing waist / hip ratio, decreases plasma free fatty acid and plasma triglyceride levels, increases plasma HDL-cholesterol concentration, decrease
  • Obesity, insulin resistance, fatty liver, hyperlipidemia, atherosclerosis or metabolic syndrome can be usefully used for the prevention or treatment, as well as excellent antioxidant activity is useful as an antioxidant composition.
  • soybean leaves, flavonol glycosides as an active ingredient soybean leaves, flavonol glycosides as an active ingredient

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Abstract

본 발명은 검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체(flavonol glycosides)를 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 또는 치료용, 또는 항산화 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체는 α-글루코시데이즈 활성을 효과적으로 억제하고, LDL 산화 및 DDP-4를 효과적으로 억제하고, DPPH 라디칼 소거활성이 우수하고, 활성산소종(ROS)의 축적 억제 활성이 우수하며, 췌장 베타세포에서 인슐린 분비를 효과적으로 촉진시키며, 또한 고지방식이로 인한 당뇨, 비만, 인슐린저항성, 지방간, 고지혈증, 동맥경화에 대한 주요 유전자의 발현을 조절하고, 과체중 또는 비만의 성인 남녀에 대하여 허리/엉덩이 둘레비의 감소능이 우수하고, 혈장 유리지방산 및 혈장 중성지방의 농도는 감소시키고, 혈장 HDL-콜레스테롤 농도는 증가시키며, 동맥경화지수를 감소시키고, 적혈구 catalase, SOD 및 GR 활성도를 증가시키고, 적혈구 지질과산화물인 TBARS는 감소시키며, 염증성 사이토카인인 MCP-1 및 PAI-1과 지방세포에서 분비되는 호르몬인 레시스틴의 농도를 감소시키고, 혈장 아디포넥틴 농도는 증가시킴을 확인함으로써, 상기 검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체는 대사증후군의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 항산화 활성이 우수하므로 항산화용 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체를 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 또는 치료용, 또는 항산화용 조성물
본 발명은 검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체(flavonol glycosides)를 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 또는 치료용, 또는 항산화 조성물에 관한 것이다.
현대사회의 급속한 발전과 영양 섭취상태가 풍요로워 짐에 따라 성인병 또는 현대병이라 불리는 비만, 제2형 당뇨병, 인슐린저항성, 고혈압, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증, 동맥경화 등의 질환의 발병률이 증가하고 있다. 보건복지부가 2010-2012년 제5기 국민건강 영양조사 자료를 분석한 결과, 상기 질환들 중 2개 이상이 복합적으로 나타나는 대사증후군의 유병률이 남성 30.4%, 여성 28.5%로 매우 높다고 보고되었으며, 이로부터 발병되는 심장질환과 뇌졸중은 한국인 사망원인 2, 3위를 차지할 만큼 증가하고 있는 실정이다.
이는 균형있는 신진대사가 잘 이루어지지 않아 발생하는 대사성 노폐물과 독소를 방출시키지 못함으로 인해 인체 내에 쌓인 노폐물들이 각 인체의 기능을 상실시킴으로 발생하는 증상으로 인슐린저항성증후군(insulin resistance syndrome)으로도 알려져있는 대사증후군(Metabolic Syndrome)으로 발전하고, 대사증후군은 곧 관상동맥내 손상을 줘 심장질환 또는 중풍의 원인을 제공하거나, 신장에서 소금을 제거하는 능력이 떨어져서 고혈압을 일으키고, 심혈관 질환의 원인을 제공하는 총콜레스테롤과 중성지방 비율을 증가시키고, 혈액 응고의 위험을 가중시키며 또한, 제2형 당뇨로 고혈당과 인슐린 분비 장애가 생겨 눈, 신장, 신경에 손상을 초래하는 것으로 알려져 있다.
α-글루코시데이즈(α-glucosidase)는 탄수화물의 소화과정의 마지막에 관여하는 효소로, 이의 억제활성을 갖는 물질들은 탄수화물의 흡수를 저해하여 식후의 급격한 혈당상승을 억제할 수 있어, 당뇨 및 비만환자를 조절하는데 이용된다(Int. J. Obes. 11(Supple 2): 28, 1987). 한편, 기존의 혈당조절제인 아카보스 등의 약을 지속적으로 사용하는 경우 혈당상승 억제효과는 강하지만, 지속적인 복용은 소화되지 못한 전분이 바로 대장 유입됨으로 인해 발생되는 저혈당 쇼크, 가스발생, 대장 내 전분분해 세균류의 비정상적인 발효로 인한 복부팽만, 설사 등의 부작용이 보고되고 있다(J. Pharm. Exp. Ther., 241: 915-920, 1987; Diabetes Care, 14: 732-737, 1991). 따라서 보다 부작용이 적고 안전한 혈당강하제의 개발이 필요하다.
다이펩티딜 펩티다아제-4(Dipeptidyl peptidase-4; DPP-4; EC 3.4.14.5)는 기능적으로는 세린 프로테아제에 속하며(Barrett A. J. 등, Arch. Biochem. Biophys., 318: 247-250, 1995), 신장, 간 및 소장을 포함하여 포유동물 조직에서 광범위하게 존재한다(Hegen, M. 등, J. Immunol., 144: 2908-2914, 1990).
DPP-4는 소장에서 글루카곤-유사 단백질-1(glucagon-like protein-1; GLP-1)을 분해하는 주된 효소이다(Mentlein, R. 등, Eur. J. Biochem., 214: 829-835, 1993). GLP-1은 소장으로 섭취된 영양물에 반응하여 식후 혈당량 조절에 대한 인슐린 작용에 강력한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Creutzfeldt, WO. 등, Diabetes Care, 19: 580-586, 1996). 따라서 DPP-4 저해제는 제 2형 당뇨병에 있어서 매우 유력한 치료제로서의 가능성을 제시하게 되었고, DPP-4 저해제의 개발을 위한 연구가 가속화되었다.
또한, 최근 성인병 증가와 더불어 동맥경화 등의 혈관장애 질환이 크게 증가하고 있다. 대표적인 혈관장애 질환으로서 동맥경화는 동맥벽에 지질과 섬유질 요소가 축적되어 진행되는 염증성 질환으로서, 고혈압, 흡연, 비만, 혈장 저밀도 지질 단백질(low-density lipoprotein: LDL)의 증가 등이 그 주요 원인이다. 상기 동맥경화는 뇌동맥 또는 관상동맥에서 일어나기 쉬우며, 이로 인하여 심장질환, 뇌혈관 질환 등의 순환계 질환으로 발전하게 된다.
LDL 산화는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)을 포함하는 동맥경화(arteriosclerosis)를 유발하는 초기 요인으로 가장 중시되고 있다(Circulation, 91: 2488-2496, 1995; Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17: 3338-3346, 1997). 생체 내외에서 생성되는 산화적 스트레스(oxidative stress)는 혈액 내의 LDL을 산화된-LDL(oxidized-LDL)로 변형시키고, 이후 부착분자(adhesion molecule)를 통해 맥관내막(intima) 내로 유입된다. 유입된 산화된-LDL을 단핵구(monocyte)가 탐식하여 거품세포(foam cell)를 형성하면서 동맥경화 초기 병변인 지방선조(fatty streak)를 생성하게 된다.
신체의 노화나 성인병과 관련된 각종 질환은 생체내 산화적 스트레스에 의해 생성된 자유 라디칼(free radical)에 의해 일어나게 된다. 이 자유 라디칼은 세포막 내의 불포화 지방산, nucleotides, sulfhydryl 결합과 반응함으로써 세포의 생화학적인 특성 변화를 포함한 조직의 손상을 초래하게 된다. DPPH는 일종의 자유라디칼이며 항산화 활성을 평가하는 가장 보편적인 방법으로 DPPH 라디칼 소거능을 측정한다. 또한 활성산소종(ROS, reactive oxygen species)은 산소의 정상적인 신진대사의 자연 부산물로 형성되며 세포 신호전달과 향상성에 중요한 역할을 한다. 그러나, 자외선 노출 또는 열 노출과 같은 환경 스트레스를 받는 동안 ROS 수준이 크게 증가할 수 있으며, 이것은 세포 구조에 상당한 손상을 초래한다. 또한 현대인의 질병 중 90%가 활성산소와 관련이 있다고 알려져 있으며, 구체적으로 암, 동맥경화증, 당뇨병, 뇌졸증, 심근경색증, 간염, 신장염, 아토피, 파킨슨병 및 염증과 관련이 있다고 알려져 있다.
인체의 호기성 에너지 대사에는 반드시 산소의 이용이 필요하나, 호흡과정에서 체내로 공급된 산소 중 일부분은 정상세포 대사의 부산물인 활성 산소종 (O2 -, HO, ROO, H2O2 등)으로 전환되어 세포에 산화적 스트레스를 유발한다. 세포질내에 존재하는 catalase는 세포소기관인 peroxisome 내에서 H2O2를 물과 산소로 분해하는 효소로 표유 동물의 간세포나 적혈구내에 고농도로 존재하여 H2O2에 의한 산화적 손상으로부터 세포를 보호해주는 중요한 역할을 한다(Physiol. Rev. 50: 319-375, 1970).
Monocyte chemoattractant protein (MCP-1)은 혈관내피세포와 혈관 평활근 세포에서 분비되어 주로 죽상경화성 플라그(plaque)에 분포되어 있고, 플라그의 대식구로 활성화 후 거품 세포로 유도되면서 동맥경화의 발병을 가속화한다(Atherosclerosis. 147: 213-225, 1999). 최근 MCP-1의 증가는 비만, 제2형 당뇨병 및 비알콜성지방간 환자에서 염증세포를 지방조직 내로 유도하여 인슐린 저항성을 일으킨다(J. Clin. Endocrinol. Metab. 90: 2282-2289, 2005; Biomolecules. 5: 1563-1579, 2015).
당뇨병이나 동맥경화에서 초래되는 섬유소 용해부전은 plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)의 활성도 증가와 관련이 있다(Diabetes. 41: 1009-1015, 1992). 혈관내피세포와 간세포에서 분비된 PAI-1의 농도가 증가되면 혈액응고와 혈전용해 과정에 불균형을 가져와 혈액응고의 과형성을 초래할 수 있다(J. Clin. Invest. 88: 1067-1072, 1991). 실제로 PAI-1은 급성심근경색에서 증가되어 나타나고 심근경색의 재발에 대한 중요한 예측인자로 알려져 있다 (N. Engl. J. Med. 313: 1557-1563, 1985).
콩은 아시아, 아프리카, 오스트레일리아 등지에 널리 분포하는 콩목 콩과의 한해살이풀로 식용작물로 널리 재배하고 있다. 대두콩에는 단백질과 지질의 함량이 풍부하며, 생리활성물질을 다량 함유하고 있다. 대두콩에 다량 함유되어 있는 생리활성물질은 주로 다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 이소플라본(ISF), 말로닐제니스틴(6“-O-Malonylgenistin), 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein)이다. 이들 생리활성물질에 의한 콩(대두)의 기능성에 대하여는 많은 연구가 되어 있다. 보다 구체적으로, 콩(대두)는 관상심장 질환, 유방암, 전립선암, 대장암 등의 발병을 억제하며, 골다공증, 호르몬관련 질환, 고지혈증, 동맥경화 억제 등 성인병 예방에 효과가 있는 것으로 보고되었다.
한편, 대두 콩잎은 3개 혹은 5개의 작은 잎으로 되어 있고, 짧은 털로 덮여있다. 이러한 대두 콩잎의 함유성분은 표 1에서 보는 바와 같이 대두 콩 또는 대두 콩 뿌리와는 많이 다르다. 대두콩잎에는 콩의 주 성분인 이소플라본이 매우 적은 양으로 들어 있어, 콩잎은 기능성 소재로서 사용되지 못하고 있었다. 그런데, 최근 콩잎에 들어있는 생리활성물질이 생장시기에 따라 매우 달라지며, 특히 생후 90일 이후에 수확한 대두의 콩잎에는 캄페롤이 다량 함유되어 있는 것이 발견되었고, 이에 본 발명자는 대두 콩잎의 추출물이 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간 또는 당뇨병에 효과가 있음을 밝힌바 있다(대한민국 등록특허 10-1158856).
[표 1]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000001
검정콩(Black soybean)은 대두(Glycine max. (L.) Merr .)와는 같은 콩과이지만 서로 다른 식물로서 우리나라에서는 서리태, 흑태 또는 서목태(쥐눈이콩, 여두) 등이 검정콩에 속하며, 본 발명에서 검정콩이라 함은 black coated Glycine max (L.) Merr. Seoritae, Rhynchosia Nulubilis 등 모든 검은색 콩이 포함된다.
우리나라에서 검정콩은 '약콩'으로 불리며, 혈액자양, 풍의 소통, 시력 증진, 두통 치료 등에 효과가 있다고 하여 민간요법에 많이 활용되었으며, 한방에서 해열제, 해독제 및 기타 약용으로 이용되어 왔다. 최근에는 검정콩 종피에 함유된 안토시아닌과 이소플라본의 항산화 효과(Lee, L.-S. 등, Korean J. Food Sci. Technol., 46: 757-761, 2014)로 인해 건강식품 원료로 많이 사용되고 있으나, 이 외의 검정콩의 기능성물질에 대한 연구는 매우 미흡한 실정이다.
한편, 관련 선행기술로서, 이건 발명의 발명자에 의하여 대두콩잎 추출물 또는 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물이 콜레스테롤 아실 전이효소(ACAT)의 활성 및 지질단백질-결합 포스포리파아제 A2(Lipoprotein-associated phospholipase A2, Lp-PLA2)의 활성을 효과적으로 억제하고, 혈중 및 간의 콜레스테롤 및 중성지방 증가를 억제하며, 대동맥동의 병변크기 및 동맥 병변에 대식세포의 침착을 억제하고, 비만, 동맥경화와 관련되는 유전자의 발현을 조절함이 밝혀졌으며(대한민국 등록특허 10-1158856), 비만 모델동물인 Zucker rat에서 quercetin이 대사증후군과 염증 상태를 개선함을 확인하였으나(Rivera, L. 등, Obesity 16: 2081-2087, 2008), 검정콩잎 추출물 및 검정콩잎 추출물에 함유된 플라보놀배당체의 대사증후군의 예방 및 치료에 대한 효과에 대해서는 현재까지 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 대사증후군 특히, 당뇨, 비만, 인슐린저항성, 지방간, 고지혈증, 동맥경화 또는 이들의 합병증의 예방 또는 치료에 효과적인 물질을 찾고자 노력하던 중, 검정콩잎을 물, 유기용매 또는 이의 혼합용매로 추출한 콩잎 추출물 및 검정콩잎으로부터 분리한 플라보놀배당체가 당뇨, 비만, 인슐린저항성, 지방간, 고지혈증, 동맥경화와 같은 대사증후군의 예방 또는 치료에 대두콩잎 추출물보다 현저한 효과를 나타내고, 항산화 활성이 우수한 효과를 나타내는 것을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체를 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 또는 치료용, 또는 항산화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 검정콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 플라보놀배당체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 검정콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 플라보놀배당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 또는 이의 합병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 검정콩잎 추출물, 플라보놀배당체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 항산화용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 검정콩잎 추출물, 플라보놀배당체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 검정콩잎 추출물, 플라보놀배당체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 항산화용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체(flavonol glycosides)는 α-글루코시데이즈 활성을 효과적으로 억제하고, LDL 산화 및 DDP-4를 효과적으로 억제하며, 췌장베타세포에서 인슐린 분비를 효과적으로 촉진시키고, 검정콩잎 추출물은 고지방식이에 의한 체중 증가 및 체지방 증가를 억제하고, 공복혈당, 당화혈색소, 유리지방산, 인슐린, 및 인슐린저항성을 낮추고, 총콜레스테롤과 중성지방 수준을 낮추며, 총콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 비율을 증가시키고, 혈중 간독성의 지표인 GOT 및 GPT의 함량을 감소시키며, 혈장 아디포넥틴 수준과 지방조직의 아디포넥틴 발현을 증가시키고, 간의 AMPK 활성을 증가시키며, 간 및 지방조직에서 인슐린 민감성 및 지방대사와 관련되는 유전자의 발현을 조절하며, 과체중 또는 비만의 성인 남녀에 대하여 허리/엉덩이 둘레비의 감소능이 우수하고, 혈장 유리지방산 및 혈장 중성지방의 농도는 감소시키고, 혈장 HDL-콜레스테롤 농도는 증가시키며, 동맥경화지수를 감소시키고, 적혈구 catalase, SOD 및 GR 활성도를 증가시키고, 적혈구 지질과산화물인 TBARS는 감소시키며, 염증성 사이토카인인 MCP-1 및 PAI-1과 지방세포에서 분비되는 호르몬인 레시스틴의 농도를 감소시키고, 혈장 아디포넥틴 농도는 증가시킴으로써, 이와 관련되는 당뇨, 비만, 인슐린저항성, 지방간, 고지혈증, 동맥경화 또는 대사증후군의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 항산화 활성이 우수하므로 항산화용 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 표준물질의 HPLC 분석 그래프를 나타낸 도이다.
도 2는 대두콩 70% 에탄올 추출물의 HPLC 분석 그래프를 나타낸 도이다.
도 3은 서리태 70% 에탄올 추출물의 HPLC 분석 그래프를 나타낸 도이다.
도 4는 서목태 70% 에탄올 추출물의 HPLC 분석 그래프를 나타낸 도이다.
도 5는 대두콩잎 70% 에탄올 추출물의 HPLC 분석 그래프를 나타낸 도이다.
도 6은 서리태잎 70% 에탄올 추출물의 HPLC 분석 그래프를 나타낸 도이다.
도 7은 서목태잎 70% 에탄올 추출물의 HPLC 분석 그래프를 나타낸 도이다.
도 8은 대두콩잎 70% 에탄올 추출물 (7.5분-15분을 확대한 그림)의 HPLC 분석 그래프를 나타낸 도이다.
도 9는 서리태잎 70% 에탄올 추출물 (7.5분-15분을 확대한 그림)의 HPLC 분석 그래프를 나타낸 도이다.
도 10은 서목태잎 70% 에탄올 추출물 (7.5분-15분을 확대한 그림)의 HPLC 분석 그래프를 나타낸 도이다.
도 11은 대두콩잎 95% 에탄올 추출물의 HPLC 분석 그래프를 나타낸 도이다.
도 12는 서리태잎 95% 에탄올 추출물의 HPLC 분석 그래프를 나타낸 도이다.
도 13은 서목태잎 95% 에탄올 추출물의 HPLC 분석 그래프를 나타낸 도이다.
도 14는 대두콩잎 75% 에탄올 추출물의 플라보놀배당체 고함유 분획물의 HPLC 분석 그래프를 나타낸 도이다.
도 1부터 도 13까지는 10 mg/ml 농도이며, 도 14 및 도 15는 1 mg/ml 농도이다.
도 15는 서리태잎 75% 에탄올 추출물의 플라보놀배당체 고함유 분획물의 HPLC 분석 그래프를 나타낸 도이다.
도 16는 본 발명에 따른 플라보놀배당체(flavonol glycosides) 화합물들의 제조방법을 나타내는 흐름도이다.
도 17은 고지방식이로 유도된 마우스 모델의 간에서 AdipoR1의 하위기전인 AMPK 효소의 활성 변화를 나타낸 도이다.
도 18은 고지방 식이로 유도된 마우스 모델의 북부지방 조직에서 아디포넥틴(adiponectin) 유전자의 발현 변화를 나타낸 도이다.
도 19는 고지방 식이로 유도된 마우스 모델의 간에서 지방산분해와 인슐린 신호전달을 조절하는 아디포넥틴 수용체들(AdipoR1, AdipoR2)의 발현 변화를 나타낸 도이다.
도 20은 고지방식이로 유도된 마우스 모델의 간에서 인슐린의 신호를 전달하는 유전자들(Glut-2, IRS-2, Foxo1 및 Foxa2)의 발현 변화를 나타낸 도이다.
도 21은 고지방식이로 유도된 마우스 모델의 간에서 AdipoR2의 하위기전인 간의 지질대사 조절 전사인자(PGC-1, PPARα, PPARγ, PPARδ)의 발현 변화를 나타낸 도이다.
도 22는 고지방식이로 유도된 마우스 모델의 간에서 하위 유전자들(CPT-1α, ACC1, ACC2 및 FAS)의 발현 변화를 나타낸 도이다.
도 23은 고지방식이로 유도된 마우스 모델의 복부지방 조직에서 인슐린 민감성 조절 인자인 InsR, IRS-1, GLUP-4, 및 TNFα 유전자의 발현 변화를 나타낸 도이다.
도 24는 고지방식이로 유도된 마우스 모델의 복부지방 조직에서 지방분해 조절 인자인 HSL 및 UCP3의 발현 변화를 나타낸 도이다.
도 25는 인체시험에서 12주간의 시험물질 복용 전후 대조군과 시험군 대상자들의 허리/엉덩이 둘레비를 나타낸 도이다.
도 26은 인체시험에서 12주간의 시험물질 복용 전후 대조군과 시험군 대상자들의 혈장 유리지방산 농도 변화를 나타낸 도이다.
도 27은 인체시험에서 12주간의 시험물질 복용 전후 대조군과 시험군 대상자들의 혈장 중성지방 농도 변화를 나타낸 도이다.
도 28은 인체시험에서 12주간의 시험물질 복용 전후 대조군과 시험군 대상자들의 혈장 HDL-콜레스테롤 농도 변화를 나타낸 도이다.
도 29는 인체시험에서 12주간의 시험물질 복용 전후 대조군과 시험군 대상자들의 동맥경화지수 변화를 나타낸 도이다.
도 30은 인체시험에서 12주간의 시험물질 복용 전후 대조군과 시험군 대상자들의 혈장 포도당 농도 변화를 나타낸 도이다.
도 31은 인체시험에서 12주간의 시험물질 복용 전후 대조군과 시험군 대상자들의 적혈구 항산화효소 중 Catalase 활성도 변화를 나타낸 도이다.
도 32는 인체시험에서 12주간의 시험물질 복용 전후 대조군과 시험군 대상자들의 적혈구 항산화효소 중 Superoxide dismutase(SOD)의 활성도 변화를 나타낸 도이다.
도 33은 인체시험에서 12주간의 시험물질 복용 전후 대조군과 시험군 대상자들의 적혈구 항산화효소 중 Glutathion reductase(GR)의 활성도 변화를 나타낸 도이다.
도 34는 인체시험에서 12주간의 시험물질 복용 전후 대조군과 시험군 대상자들의 지질과산화물인 적혈구 TBARS의 농도 변화를 나타낸 도이다.
도 35는 인체시험에서 12주간의 시험물질 복용 전후 대조군과 시험군 대상자들의 염증성 사이토카인인 혈장 MCP-1의 농도 변화를 나타낸 도이다.
도 36은 인체시험에서 12주간의 시험물질 복용 전후 대조군과 시험군 대상자들의 염증성 사이토카인인 혈장 PAI-1의 농도 변화를 나타낸 도이다.
도 37은 인체시험에서 12주간의 시험물질 복용 전후 대조군과 시험군 대상자들의 지방세포에 분비되는 호르몬인 혈장 Resistin의 농도 변화를 나타낸 도이다.
도 38은 인체시험에서 12주간의 시험물질 복용 전후 대조군과 시험군 대상자들의 지방세포에 분비되는 호르몬인 혈장 Adiponectin의 농도 변화를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 검정콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 검정콩잎 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 검정콩잎에 추출 용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계;
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하여 검정콩잎 추출물을 제조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 검정콩잎은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한없이 사용할 수 있다. 검정콩잎은 검은색 콩의 잎이면 모두 사용 가능하며, 여기서 상기 검은색 콩은 Glycine max (L.) Merr. Seoritae, Rhynchosia Nulubilis 등 일수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 추출 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물 및 유기 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C1 내지 C2 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매를 건조된 검정콩잎 분량에 1 내지 20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 5 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 추출온도는 20℃ 내지 100℃ 인 것이 바람직하고, 20℃ 내지 40℃인 것이 더욱 바람직하고, 실온인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 10 내지 48시간인 것이 바람직하며, 15 내지 30시간인 것이 더욱 바람직하고, 24시간인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 횟수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 2 내지 4회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하고, 2회인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 감압농축 및 건조과정은 당업계에서 사용되는 통상의 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 수득한 검정콩잎 추출물은 사용 시까지 냉동고(freezer)에 보관할 수 있다.
상기 대사증후군은 당뇨, 비만, 인슐린 저항성, 지방간, 고지혈증, 동맥경화 또는 이들의 합병증인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 합병증은 관상 동맥 질환, 협심증, 경동맥 질환, 뇌졸중, 뇌동맥경화증, 고콜레스테롤증, 콜레스테롤 결석, 고중성지방혈증, 고혈압, 백내장, 신장질환, 신경장애, 만성 염증성 장애 또는 감염증인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 검정콩잎 추출물은 고지방식이에 의한 체중 증가 및 체지방 증가 억제, 공복혈당, 당화혈색소, 유리지방산, 인슐린 및 인슐린저항성 저하, 총콜레스테롤과 중성지방 수준 저하, 총콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 비율 증가, 혈중 간독성의 지표인 GOT 및 GPT의 함량 감소, 혈장 아디포넥틴 수준과 지방조직의 아디포넥틴 발현 증가, 간의 AMPK 활성 증가, 간 및 지방조직에서 인슐린 민감성 및 지방대사와 관련되는 유전자의 발현을 조절하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 검정콩잎 추출물과 대두콩잎 각각의 에탄올추출물의 활성 성분을 비교하기 위하여, HPLC 분석을 수행하여, 상기 검정콩잎 추출물의 활성성분은 Quercetin 배당체와 Isorhamnetin 배당체가 많이 함유되어 있는 반면에, 대두콩잎 추출물의 활성성분은 Kaempferol 배당체가 많이 함유되어, 이들 추출물의 활성 성분이 상이함을 확인하였다(실험예 1의 도 1-15, 표 3 및 표 4 참조).
또한, 본 발명에 따른 서리태잎 추출물 및 플라보놀 배당체 화합물이 탄수화물 대사에 필수적인 α-글루코시데이즈(α-glucosidase) 저해 활성이 있음을 확인하였다(실험예 2의 표 5 참조).
나아가, 본 발명에 따른 서리태잎 추출물 및 플라보놀 배당체 화합물은 식후 혈당량 조절에 강력한 영향을 미치는 글루카곤 유사 단백질-1(Glucagon-like protein-1, GLP-1)을 분해하는 주된 효소인 DPP-4 활성을 저해하는 것을 확인하였다(실험예 3의 표 6 참조).
또한, 본 발명에 따른 서리태잎 추출물 및 플라보놀 배당체 화합물은 고농도 글루코오스로 유도된 췌장 β 세포주에서 인슐린 분비를 증가시키는 것을 확인하였다(실험예 4의 표 7 및 실험예 5의 표 8 참조).
나아가, 본 발명에 따른 검정콩잎 추출물 및 플라보놀 배당체 화합물은 동맥경화를 유발하는 초기 요인으로 가장 중요시되고 있는 LDL(low-density lipoprotein)의 산화를 억제하는 것으로 나타났다(실험예 6의 표 9 참조).
또한, 본 발명에 따른 검정콩잎 추출물 및 플라보놀 배당체 화합물은 DPPH 라디칼 소거활성을 갖고 있다(실험예 7의 표 10 참조).
나아가, 본 발명에 따른 검정콩잎 추출물 및 플라보놀 배당체 화합물은 활성산소종(ROS) 축적 억제활성을 갖고 있다(실험예 8의 표 11 참조).
또한, 서리태잎 추출물의 대사증후군, 특히 고지혈증, 당뇨, 비만, 및 지방간에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 마우스 동물 모델을 사용하여 기본식이(음성대조군), 고지방식이(대조군), 및 고지방식이와 함께 서리태잎 에탄올 추출물을 섭취한 군(실험군)으로 나누어 실험을 수행하였고, 그 결과, 12주 후의 기본식이 및 고지방식이를 섭취한 대조군의 체중은 현저하게 증가한 반면, 고지방식이와 함께 서리태잎 에탄올 추출물을 섭취한 시험군은 체중 증가가 17.8% 억제되었으며, 복부지방조직 중량 증가도 억제되었고, 근육 중량은 증가하였으며, 간 중량은 감소하여 고지방식이에 의한 지방간을 유의적으로 억제함을 확인하였다(실험예 9의 표 12 참조).
또한, 상기 마우스 동물 모델로부터 채취한 간 조직 내의 총콜레스테롤(TC) 및 중성지방(TG)의 함량을 측정하였고, 그 결과, 간 g 중량당 총콜레스테롤량은 대조군에 비해 시험군이 유의적으로 30.4% 감소하였고, 간 중량당 총중성지방량은 대조군에 비해 시험군이 현저하게 50.6% 감소함을 확인하였다(실험예 9의 표 13 참조).
또한, 상기 마우스 동물 모델을 절식한 후, 혈액을 채취하여 분리한 혈장(plasma)으로 공복혈당(fasting glucose), 당화혈색소(HbA1c), 유리지방산(NEFA), 인슐린(insulin), 인슐린저항성(HOMA-IR) 수치를 측정하였고, 지질 함량의 지표인 총콜레스테롤(TC), HDL-콜레스테롤/TC 및 중성지방(triglyceride) 수치, 및 간 기능의 지표인 GOT 및 GPT를 측정하였고, 그 결과, 서리태잎 에탄올 추출물을 섭취한 시험군은 공복혈당의 저하, 당화혈색소의 저하, 유리지방산의 저하, 인슐린 저하, 인슐린저항성 지수(HOMA-IR)의 저하, 및 아디포넥틴의 증가를 확인하였다. 또한, 총콜레스테롤의 감소, 총콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 비율 증가, 중성지방의 감소, GOT 수치의 감소, 및 GPT 수치의 감소를 확인하였다(실험예 9의 표 14 참조).
아울러, 서리태잎 추출물이 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기 마우스 동물모델로부터 적출한 간 조직에서 AMP-activated protein kinase(AMPK) 효소의 활성을 확인한 결과, 시험군에서 약 3배 정도 현저하게 증가함을 확인하였다(도 17 참조). 또한, 간 및 지방조직들의 유전자 발현 양상을 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction; RT-PCR)을 사용하여 확인한 결과, 본 발명의 서리태잎 에탄올 추출물을 투여한 시험군은 혈장 아디포넥틴 수준이 대조군에 비해 유의적으로 증가함과 동시에, 지방 조직에서의 아디포넥틴 유전자 발현도 대조군에 비해 현저하게 증가함을 확인하였고(도 18 참조), 아디포넥틴 수용체인 AdipoR1과 AdipoR2의 발현이 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 것으로 나타났으며(도 19 참조), 인슐린 민감성을 일으키는 GLUT-2와 IRS-2의 발현은 현저하게 증가하였고, 인슐린 저항성을 일으키는 FoxO1(forkhead box protein O1)과 Foxa2(forkhead box protein A2)의 발현은 유의적으로 감소함을 확인하였다(도 20 참조). 또한, 지방산 산화 및 인슐린 민감성을 높여주는 PPARα(peroxisome proliferator-activated receptor α)와 PPARδ의 발현을 증가시키고, 세포 내 지방축적을 일으키는 PPARγ의 발현을 감소시키고, PPAR의 전사 보조인자인 PGC-1 유전자 발현량을 지질대사를 효과적으로 조절하는 방향으로 변화시키는 것으로 나타났으며(도 21 참조), 상기의 전사인자를 통해 지방산 산화를 조절하는 CPT-1α(carnitine palmitoyltransferase 1A) 유전자의 발현은 현저하게 증가하였고, 지방축적을 조절하는 ACC1, ACC2 및 FAS 유전자의 발현은 현저히 감소함을 확인하였다(도 22 참조). 또한, 복부지방 조직에서 인슐린 민감성 조절인자인 인슐린 수용체 InsR, IRS-1, GLUT-4의 유전자 발현이 대조군에 비해 효과적으로 증가하는 것으로 나타났고, 인슐린 민감성을 저하시키는 TNFα의 발현은 대조군에 비해 현저하게 감소하는 것으로 나타났으며(도 23 참조), 지방조직의 분해를 조절하는 HSL(hormone-sensitive lipase)과 UCP3(uncoupling protein-3)의 발현은 대조군에 비해 증가함을 확인하였다(도 24 참조).
또한, 서리태잎 추출물의 대사증후군, 특히 고지혈증, 당뇨, 비만에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 35-65세 사이의 과체중 (BMI>23) 또는 비만 (BMI>25)이면서 공복혈당이 100 mg/dL 이상에 부합하는 반건강인 성인 남녀를 대상으로 인체시험을 수행한 결과, 12주 후에 대조군(위약대조물질투여군)에 시험군(서리태잎 추출물 투여군)에서 허리/엉덩이 둘레비의 감소능이 우수하고, 혈장 유리지방산 및 혈장 중성지방의 농도는 감소시키고, 혈장 HDL-콜레스테롤 농도는 증가시키며, 동맥경화지수를 감소시키고, 적혈구 catalase, SOD 및 GR 활성도를 증가시키고, 적혈구 지질과산화물인 TBARS는 감소시키며, 염증성 사이토카인인 MCP-1 및 PAI-1과 지방세포에서 분비되는 호르몬인 레시스틴의 농도를 감소시키고, 혈장 아디포넥틴 농도는 증가시킴을 확인하였다(실험예 10의 도 25 내지 도 38 참조).
따라서, 본 발명의 검정콩잎 추출물은 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말 셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 검정콩잎 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비 경구 투여할 수 있으며, 비 경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 검정콩잎 추출물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 플라보놀배당체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 플라보놀배당체 화합물은 하기 화학식 1 내지 7의 화합물인 것을 특징으로 한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000002
,
[화학식 2]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000003
,
[화학식 3]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000004
,
[화학식 4]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000005
,
[화학식 5]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000006
,
[화학식 6]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000007
, 및
[화학식 7]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000008
.
본 발명은 화학식 1 내지 7로 표시되는 화합물뿐만 아니라, 이의 약학적으로 허용되는 염, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세이체 또는 입체이성질체를 모두 포함한다.
본 발명은 화학식 1 내지 7로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 통상적인 산 부가염이 유용하다. 또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능 한 금속염을 만들 수 있다.
또한, 본 발명은 검정콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 플라보놀배당체 화합물을 유효성분으로 함유하는 대사증후군 또는 이의 합병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 플라보놀배당체 화합물은 상기 화학식 1 내지 7의 화합물인 것을 특징으로 하는 대사성 질환 또는 이의 합병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 명세서의 "건강기능식품"이란 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분 (기능성 원료)을 사용하여 제조한 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품으로 식품의약품안전처장이 정한 것을 의미하나, 이에 한정되지 않으며 통상적인 의미의 건강식품을 배제하는 의미로 사용된 것이 아니다.
본 발명의 검정콩잎 추출물 또는 플라보놀배당체는 α-글루코시데이즈의 활성을 억제하고, DDP-4 억제 효과가 있으며, 인슐린 분비 촉진 활성 효과가 있고, 또한 검정콩잎 추출물은 마우스 동물 모델 실험을 통해 대사증후군 예방 효과가 있음을 확인함으로써, 대사증후군 또는 이의 합병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 검정콩잎 추출물 또는 플라보놀배당체는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취시에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 검정콩잎 추출물 또는 플라보놀배당체를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 검정콩잎 추출물 또는 플라보놀배당체는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 검정콩잎 추출물, 이의 플라보놀배당체는 천연 과일 쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 검정콩잎 추출물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부 또는 검정콩잎 추출물의 플라보놀배당체 화합물 100 중량부 당 0.0001 내지 약 0.02 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 본 발명은 검정콩잎 추출물, 플라보놀배당체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 항산화용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 서리태잎 및 서목태잎 추출물은 대두콩잎 추출물(26.7 - 42.7%)에 비하여 40 μg/ml의 농도에서 54.5 - 93.1%의 LDL(low-density lipoprotein; 저밀도 지질 단백질)에 대한 우수한 항산화 활성을 나타내었고, 화학식 1 내지 5로 표시되는 플라보놀배당체 화합물은 LDL에 대한 항산화 활성을 50% 억제하는 농도인 IC50값이 0.4 - 2.3 μM로서 매우 우수한 항산화 활성을 나타내었으며, 화학식 6 내지 7로 표시되는 플라보놀배당체 화합물은 100 μg/ml의 농도에서 55.7 - 65.7%의 LDL에 대한 항산화 활성을 나타냄을 확인하였다(실험예 6의 표 9 참조).
또한 본 발명의 구체적인 실시예에서, 서리태잎 및 서목태잎 추출물은 대두콩잎 추출물(18.8 - 23.8%)에 비하여 200 μg/ml의 농도에서 36.5 - 64.6%의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었고, 화학식 1 내지 5로 표시되는 플라보놀배당체 화합물은 50 μM의 농도에서 52.0 - 85.9%의 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냄을 확인하였다(실험예 7의 표 10 참조).
또한 본 발명의 구체적인 실시예에서, 서리태잎 및 서목태잎 추출물은 대두콩잎 추출물(8.1 - 36.2%)에 비하여 100 μg/ml의 농도에서 30.5 - 45.2%의 활성산소종 축적 억제활성을 나타내었고, 화학식 1 내지 7로 표시되는 플라보놀배당체 화합물은 100 μM의 농도에서 21.9 - 58.8%의 우수한 활성산소종 축적 억제활성을 나타냄을 확인하였다(실험예 8의 표 11 참조).
따라서, 본 발명의 검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체는 LDL 항산화 활성, DPPH 라디칼 소거능 및 활성산소종 축적 억제활성이 우수함을 확인함으로써, 항산화용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 검정콩잎 추출물, 플라보놀배당체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체는 LDL 항산화 활성, DPPH 라디칼 소거 활성 및 활성산소종 축적 억제활성이 우수함을 확인함으로써, 항산화용 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체 화합물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.
또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 검정콩잎 추출물 및 플라보놀배당체 화합물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(forming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 상기 검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.005 내지 90 중량% 함유되는 것이 바람직하지만, 보습 효과가 있고 독성이 나타나지 않는 범위에서 사용 용도에 따라서 상기 범위 이상 또는 이하로도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 검정콩잎 추출물 플라보놀배당체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 항산화용 사료 첨가제를 제공한다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 검정콩잎의 추출물 제조
<1-1> 검정콩잎의 에탄올 추출물
충청남도 일대에서 서리태와 서목태를 파종하여 생육기간 50일 이후에 일정한 간격으로 수확한 서리태잎과 서목태잎을 열풍으로 건조하였다. 건조된 상기 서리태잎 또는 서목태잎 100g 당 50%, 70%, 또는 95% 에탄올(주정) 1L를 가하고 교반하면서 4일 동안 실온에서 추출한 후, 여과지를 사용하여 에탄올 가용부만을 회수하였다. 여과물은 동일한 방법으로 1회 더 반복 실시한 후 에탄올 가용부를 모아 감압하에서 농축하여 검정콩잎 에탄올 추출물을 수득하였다.
<1-2> 검정콩잎의 열수 추출물
상기의 건조된 서리태잎 또는 서목태잎 100 g에 증류수 1 L를 가하고 2시간 동안 85 내지 90 ℃에서 추출하는 것을 2회 반복하였다. 상기로 수득한 추출물을 여과지로 여과하여 침전물을 제거하고 여과액을 수득한 후, 감압 하에서 농축하여 열수 추출물을 얻었다.
<실시예 2> 검정콩잎 추출물로부터 플라보놀배당체 화합물들의 분리 및 동정
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 검정콩잎 에탄올 추출물을 감압 하에서 농축하여 에탄올이 모두 제거된 물현탁액을 준비하였다. 상기 물현탁액을 합성흡착제인 다이아이온(Diaion) HP-20 수지 컬럼(95 × 200 mm)에 천천히 흡착시킨 후 흡착되지 않은 물질은 물로 세척하였다. 유출용매로 메탄올/물을 사용하여 메탄올/물 혼합액(0 : 10 → 3 : 7 → 1 : 1 → 7 : 3 → 10 : 0)으로 순차적으로 용출하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 5개의 분획물(A 내지 E)을 얻었다. 상기 5개의 분획물 중, 분획물 B와 C에 플라보놀배당체 화합물이 많이 함유되어 있었다.
상기 분획물들 중 B와 C 분획물을 합쳐서 감압 하에 농축하여 얻은 혼합 분획물(55.5g)은 유출용매로 메탄올/물 혼합액을 사용하여 C18-역상 컬럼크로마토그래피(RP-C18, 95 × 150 mm)를 수행하여 분리하였다. 이동상으로 MeOH/H2O 혼합용액을 기울기 조건(MeOH/H2O = 0 : 10 → 1 : 9 → 2 : 8 → 3 : 7 → 4 : 6 → 5 : 5 → 7 : 3)으로 수행하여 7개의 분획물(BC1 내지 BC7)로 분획하였다. 상기 분획물 중 BC2 및 BC3의 분획물(21.0 g)을 합쳐서 메탄올/물 = 1:1을 유출용매로 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼크로마토그래피(50 x 900 mm)를 수행하여 다시 5개의 분획물(Fr. 1 내지 Fr. 5)로 분리하였다.
상기 5개의 분획물 중 분획물 2(Fr. 2)는 아세토나이트릴:물=9:93을 유출용매로 사용하여 C18-역상 분취-HPLC 컬럼크로마토그래피(칼럼: YMC-Pack Pro C18, 20×250 mm, 5 μm, YMC사, 일본; 용리속도: 4.0 ml/min; 검출조건: UV 254 nm; 분취용 HPLC 기기: Shimadzu LC-8A Series with PDA detector, 일본)를 수행하여 화학식 1로 표시되는 화합물(yellow green색)과 화학식 2로 표시되는 화합물(yellow green색)을 얻었다.
또한, 상기 5개의 분획물 중 분획물 4(Fr. 4)는 아세토나이트릴:물=3:22를 유출용매로 사용하여 C18-역상 분취-HPLC 컬럼크로마토그래피(상기와 조건 같음)를 수행하여 화학식 6으로 표시되는 화합물(yellow green색)을 얻었다.
나아가, 상기 5개의 분획물 중 분획물 5(Fr. 5)는 메탄올:물=1:4 - 3:7을 유출용매로 사용하여 C18-역상 컬럼크로마토그래피(ODS-Sepak, Merck사, 미국)를 수행하여 다시 3개의 분획물(Fr. 5-1 내지 Fr. 5-3)로 분리하였다. 이중 분획물 5-1(Fr. 5-1)은 아세토나이트릴:물=9:91을 유출용매로 사용하여 C18-역상 분취-HPLC 컬럼크로마토그래피(상기와 조건 같음)를 수행하여 화학식 3으로 표시되는 화합물(dark brown색) 및 화학식 4로 표시되는 화합물(dark brown색)을 얻었다.
또한, 상기 분획물 5-2(Fr. 5-2)는 아세토나이트릴:물=11:89를 유출용매로 사용하여 C18-역상 분취-HPLC 컬럼크로마토그래피(상기와 조건 같음)를 수행하여 화학식 5로 표시되는 화합물(yellow green색)을 얻었다. 나아가, 상기 분획물 5-3(Fr. 5-3)은 아세토나이트릴:물=11:89를 유출용매로 사용하여 C18-역상 분취-PLC 컬럼크로마토그래피(상기와 조건 같음)를 수행하여 화학식 7로 표시되는 화합물(상기와 조건 같음)을 얻었다. 본 발명에 따른 플라보놀배당체(flavonol glycosides) 화합물들의 제조방법을 나타내는 흐름도를 도 16에 나타내었다.
FT-NMR 스펙트로미터(spectrometer, JEOL JNM-ECA600, 600MHz, JEOL Ltd., 일본) 및 질량분석기(ESI-MS, Agilent 6410 triple Quadrupole LC/MS, Agilent Technologies, 미국)를 사용하여 상기 분리한 화합물들의 구조분석을 수행하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었으며, 상기 화합물들은 각각 Quercetin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-galactopyranoside (화학식 1), Quercetin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside(화학식 2), Quercetin 3-O-(2-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranoside (화학식 3), Quercetin 3-O-(2-β-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranoside (화학식 4), Quercetin 3-O-(2-α-D-rhamnopyranosyl)-β-D-galactopyranoside (화학식 5), Isorhamnetin 3-O-(2-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranoside (화학식 6) 및 Isorhamnetin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside (화학식 7)로 확인되었다.
[표 2]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000009
Figure PCTKR2016009163-appb-I000010
Figure PCTKR2016009163-appb-I000011
Figure PCTKR2016009163-appb-I000012
Figure PCTKR2016009163-appb-I000013
< 실시예 3> 검정콩잎 추출물로부터 플라보놀배당체 고함유 분획물
검정콩잎의 주요한 활성들이 함유성분인 플라보놀배당체들의 다기능적인 효능임을 증명하기 위해서 플라보놀배당체 고함유 분획물을 하기와 같은 방법으로 제조하였다.
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 농축된 검정콩잎 70% 에탄올 추출물(18.9 g)을 30% 메탄올에 용해하여 현탁액을 준비하였다. 분획깔대기에 상기 30% 메탄올 현탁액과 동량의 클로로포름 (Chloroform, CHCl3)을 넣고 층 분리를 통해 분획하였다. 이 과정을 3회 반복수행하고 감압 농축하여 30% 메탄올 분획층(16.8 g)을 획득하였다. 상기 분획물을 합성흡착제인 다이아이온 (Diaion) HP-20 수지 컬럼 (45 × 200 mm)에 천천히 흡착시킨 후 흡착되지 않은 물질은 물로 세척하였다. 유출용매로 메탄올/물을 사용하여 메탄올/물 혼합액 (0:1 → 1:4 → 3:2-2:3 → 4:1 → 1:0)으로 순차적으로 용출하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 5개의 소분획물 (A 내지 E)을 얻었다. 이들 소 분획물을 얇은 막 크로마토그래피 (Thin layer chromatography, 이하 TLC)에서 확인한 결과, 상기 6개의 분획물 중, 분획물 C가 플라보놀배당체 고함유 분획물(4.4 g)이었다.
< 비교예 1> 대두콩잎 에탄올 추출물의 제조
검정콩잎(서리태잎 또는 서목태잎) 대신, 대두콩잎 1 kg을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 대두콩잎 에탄올 추출물을 제조하였다.
< 비교예 2> 캄페롤 배당체의 준비 1
Figure PCTKR2016009163-appb-I000014
< 비교예 3> 캄페롤 배당체의 준비 2
Figure PCTKR2016009163-appb-I000015
< 비교예 4> 제니스테인 배당체( 제니스틴 )의 준비
Figure PCTKR2016009163-appb-I000016
<비교예 5> 대두콩잎 추출물로부터 플라보놀배당체 고함유 분획물
검정콩잎 70% 에탄올 추출물 대신, 대두콩잎 70% 에탄올 추출물(24.6 g)을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 대두콩잎 추출물 유래 플라보놀배당체 고함유 분획물(6.0 g)을 제조하였다.
<실험예 1> 검정콩잎 및 대두콩잎 에탄올 추출물의 HPLC 분석
서리태잎, 서목태잎 또는 대두콩잎 각각의 에탄올 추출물의 활성성분 조성을 비교해 보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 <1-1> 및 <비교예 1>에서 제조한 에탄올 추출물들을 거름종이(No. 6)로 여과 후, HPLC용 0.45 mm 멤브레인 필터로 한번 더 여과하였다. 이후 추출된 활성성분들을 HPLC(칼럼: Brownlee SPP C18, 4.6×100 mm, 2.7 μm, PerkinElmer사, 미국; 용매: 아세토니트릴(B)/물(A)[0-40분에 대해 5-71%의 B, 40-50분에 대해 71-100%의 B, 50-55분에 대해 100-5%의 B, 및 55-60분에 대해 5%의 B]; 시료: 5-10 ㎕; 용리속도: 1.0 ml/min; 검출조건: UV 254 nm; 분석용 HPLC 기기: Shimadzu 10A Series with PDA detector, 일본)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 2-도 4에 나타난 바와 같이 대두콩, 서리태 품종 검은콩 및 서목태 품종 검은콩의 70% 에탄올 추출물은 모두 다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 이소플라본(ISF), 말로닐제니스틴(6“-O-malonylgenistin), 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein) 등이 주 함유성분이다.
반면에, 대두콩잎 70% 에탄올 추출물과 95% 에탄올 추출물의 주 함유성분은 이소플라본 배당체 중 캄페롤(kaempferol) 배당체와 테로카판(pterocarpan)계 화합물이고, 검정콩잎인 서리태와 서목태의 70% 에탄올 추출물과 95% 에탄올 추출물의 주 함유성분은 이소플라본 배당체 중 퀘르세틴(Quercetin) 배당체와 이소람네틴(Isorhamnetin) 배당체이며, 테로카판계 화합물은 거의 검출되지 않았다. 또한, 검정콩잎 추출물에서 퀘르세틴 배당체와 이소람네틴 배당체의 아글리콘(aglycon)인 퀘르세틴과 이소람네틴은 검출되지 않았다.
따라서, 도 1-도 15에 나타낸 바와 같이 검정콩잎 추출물은 검정콩 추출물의 활성성분과 매우 다르고, 대두콩잎 추출물의 활성성분과도 매우 다른 것을 알 수 있다. 다시 말하자면, 검정콩잎 추출물의 주 함유성분은 퀘르세틴 배당체와 이소람네틴 배당체가 많이 함유되어 있는 반면에, 검정콩 추출물은 다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 이소플라본(ISF), 말로닐제니스틴(6“-O-malonylgenistin), 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein) 등이 주요 활성 성분이고, 대두콩잎 추출물의 활성성분은 캄페롤 배당체가 많이 함유되어 있음을 알 수 있었다.
도 1-도 15의 결과와 함께 현재 공지된 문헌(Ho, H. M. 등, Biomed. Pharmacother., 56: 289-295, 2002; Zang, Y. 등, Biosci. Biotechnol. Biochem., 75: 1677-1684, 2011; Yuk H. J. 등, Food Chem., 126: 1057-1`063, 2011; Yuk H. J. 등, J. Agric. Food Chem., 59: 12683-12690, 2011; Murai, Y. 등, Nat. Prod. Commun., 8: 453-456, 2013; Kim, U.-H. 등, Molecules, 19: 18493-18510, 2014; Li, H. 등, J. Med. Food, 18: 899-908, 2015; Li, H. 등, J. Agric. Food Chem., July 26, 2015. Epub ahead print, PMID: 26211813)을 참조하여, 본 발명에서 분석한 서리태잎 및 서목태잎의 성분을, 대두콩잎, 서리태 및 서목태와 비교하여 보았으며 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
[표 3]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000017
Figure PCTKR2016009163-appb-I000018
상기 표 3에 나타낸 바와 같이,
서리태잎과 서목태잎의 함유성분이 대두콩잎과 많이 다른 것으로 나타났다. 즉, 대두콩잎은 kaempferol 배당체와 pterocarpans가 많이 함유되어 있는 반면, 서리태잎과 서목태잎은 퀘르세틴 배당체와 이소람네틴 배당체가 많이 함유되어 있으며, 테로카판계 화합물이 검출되기는 하나, 그 함유량이 매우 적었다.
추가적으로, 상기 <실시예 3>에 기재된 방법으로 제조된 플라보놀 배당체 고함유 분획물과 <실시예 1>과 동일한 HPLC 기기와 분석 방법을 이용하여 정량분석을 수행 하였다.
구체적으로, 주입된 추출 용액의 농도는 1-10 μg/ml, 주입된 추출 용액의 양은 10 μl이였으며, 검출파장은 345 nm로 분석하였다. 표지물질인 플라보놀배당체를 에탄올에 용해시켜 6.25 - 500.0 μg/ml 범위의 표준용액을 조제하여 HPLC 분석조건에 따라 시험하여 표준품의 농도를 X축에 대응시키고 그 농도에 대한 크로마토그램으로부터 얻은 피크 면적값을 Y축에 대응시켜 검량선을 작성하였다. 분석에 사용된 표준물질은 검정콩잎의 주성분인 Quercetin 3-O-(2-α-D-rhamnopyranosyl)-β-D-galactopyranoside (화학식 1)와 대두콩잎의 주성분인 Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosyl(1→2)-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranoside의 이며, 모두 95% 이상의 고순도 표준물질을 사용하였다.
그 결과, 도 14-15에 나타낸 바와 같이, 검정콩잎과 대두콩잎의 70% 에탄올 추출물에 비해 플라보놀배당체 고함유 분획물 내의 플라보놀배당체의 함량이 월등히 높아진 것을 알 수 있었으며, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 검정콩잎의 70% 에탄올 추출물에 비해 검정콩잎의 플라보놀배당체 고함유 분획물 내의 지표성분의 함량이 9.9배 높아진 것을 확인하였다.
또한, 총페놀과 촐플라보노이드의 함량을 Wolfe 등의 방법(Wolfe K., Wu X., Liu R. H. Food Chem., 51: 609-614, 2003)으로 측정한 결과, 검정콩잎의 70% 에탄올 추출물에 비해 검정콩잎의 플라보놀배당체 고함유 분획물 내의 총페놀의 함량이 5.1배 높아졌으며, 검정콩잎의 70% 에탄올 추출물에 비해 검정콩잎의 플라보놀배당체 고함유 분획물 내의 총플라보노이드의 함량은 6.2배 높아졌음을 확인하였다.
[표 4]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000019
< 실험예 2> 검정콩잎 추출물 및 플라보놀배당체 화합물의 α- 글루코시데이즈 (α-glucosidase) 활성 저해능 확인
본 발명에 따른 상기 서리태잎 추출물 및 플라보놀배당체 화합물이 탄수화물 대사에 필수적인 α-글루코시데이즈 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
구체적으로, α-글루코시데이즈에 대한 저해활성은 Kato 등의 nitrophenol법(J. Med. Chem. 48: 2036-2044, 2005)을 일부 수정하여 수행하였다. α-글루코시데이즈(EC 3.2.1.20, Baker Yeast)에 의해 기질인 p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(Sigma-Aldrich)가 가수분해가 일어나면서 생성되는 포도당과 같은 단당의 발색단을 이용하여 축적량을 흡광도로 측정하였다.
96-웰플레이트(NUNCTM 사)에 완충용액(70 mM 인산칼슘, pH 6.8) 50 ㎕, 50% DMSO에 녹인 시료 추출물 또는 화합물 50 ㎕, α-글루코시데이즈(0.1 unit/ml) 50 ㎕를 넣고, 마지막으로 기질(5 mM, p-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드)을 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 2 M NaOH를 첨가하여 반응을 종결하였다. 생성된 발색단의 양을 마이크로플레이트 리더기(ANTHOS™ 사)를 사용하여 405 nm에서 측정하고 저해활성을 계산하였다.
[표 5]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000020
상기 표 5에 나타난 바와 같이,
서리태잎 추출물은 50 μg/ml에서 약 20.5% 내지 39.1%의 α-글루코시데이즈 저해활성을 나타내고, 화학식 1 내지 7로 표시되는 플라보놀배당체 화합물은 100 μM에서 약 8.7 내지 63.9%의 α-글루코시데이즈 저해활성을 나타내는 반면,
대두콩잎 추출물은 50 μg/ml에서 약 15.6% 내지 26.7%의 α-글루코시데이즈 저해활성을 갖는 것으로 나타났다.
이로부터, 본 발명에 따른 서리태잎 추출물과 플라보놀배당체 화합물은 대두콩잎 추출물에 비해 현저히 우수한 α-글루코시데이즈 저해활성이 있음을 알 수 있다.
< 실험예 3> 서리태잎 추출물 및 플라보놀배당체 화합물의 DPP -4 억제 효과 확인
본 발명에 따른 상기 서리태잎 추출물 및 플라보놀배당체 화합물의 DPP-4 효소에 대한 억제 효과를 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 서리태잎 추출물(100 ㎍/ml) 및 플라보놀배당체 화합물(200 μM)을 DMSO에 녹여 시료 용액을 준비하였다. 그 후, 1 ㎍/ml 농도의 사람 재조합 DPP-IV(프로스펙 사, 미국) 10 ㎕, 인큐베이션 완충액(50 mM 트리스, pH 7.5) 78 ㎕ 및 상기 준비한 시료 용액 2 ㎕을 96 웰 마이크로 플레이트에 첨가하고, 기질인 알라닌(Ala)-프롤린(Pro)-7-아미노-4-트리플루오로메틸-쿠마린(7-amino-4-trifluoromethyl coumarin; Ala-Pro-AFC)(엔자임 시스템 프로덕트 사) 10 ㎕를 첨가하여 최종 농도가 40 μM이 되도록 하여 반응을 개시하였다. 실온에서 60 분간 반응을 진행한 후, 생성되는 산물인 AFC의 양을 형광측정기로 측정하여 수학식 1를 사용해 서리태잎 추출물 및 플라보놀배당체 화합물의 DPP-4 억제 효과를 확인하였다. 양성 대조군으로는 KR-62436(Sigma Aldrich 사, 미국; Eur J Pharmacol. 518: 63-70, 2005) 0.5 μM 용액을 사용하였고, 음성 대조군으로 시료를 포함하지 않는 용매만을 사용하여, 상기와 동일한 방법으로 DPP-4의 억제 효과를 확인하였다.
[수학식 1]
DPP-4 억제효과 (%) = 100 - (A/A1 x 100)
A: 시료의 AFC 농도
A1: 음성 대조군의 AFC 농도
[표 6]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000021
그 결과, 상기 표 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 서리태잎 추출물은 100 μg/ml에서 22.8 - 36.0%의 DPP-4에 대한 저해 활성을 나타내었고, 화학식 1 내지 7로 표시되는 플라보놀배당체 화합물은 200 μM 농도에서 39.4 - 48.7%의 DPP-4에 대한 저해 활성을 나타내었다. 한편, 퀘르세틴 배당체 화학식 1 내지 5의 아글리콘(aglycone)인 퀘르세틴은 DPP-4에 대한 저해 활성이 14.5%로 낮은 반면, 화학식 1 내지 5의 DPP-4에 대한 저해 활성은 42.2 - 48.7%로 퀘르세틴에 비해 매우 우수하였다. 또한, 이소람네틴 배당체 화학식 6 및 7의 아글리콘(aglycone)인 이소람네틴은 DPP-4에 대한 저해 활성이 21.6%인 반면, 화학식 6 및 7의 DPP-4에 대한 저해 활성은 각각 39.4% 및 48.1%로 이소람네틴에 비해 매우 우수하였다.
< 실험예 4> 서리태잎 추출물 및 플라보놀배당체 화합물의 인슐린 분비 촉진 활성 확인
<4-1> 세포배양
마우스 췌장 β 세포주인 MIN6 베타세포는 15% FBS (Gibco사), 100 units/㎖ penicillin, 그리고 100 ㎍/㎖ streptomycin이 함유된 DMEM (Lonza사) 배지를 이용하여 37℃ 습윤한 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
<4-2> MIN6 베타세포에서의 인슐린 분비능 측정
24-웰 플레이트에 웰 당 배지와 세포를 1×105개씩 넣고 37, 습윤한 5% CO2 배양기에서 배양한다. 48시간 후, 먼저 글루코스를 함유하지 않은 DMEM 배지로 교체하고 60분간 방치한 다음, 30 mM 글루코스를 포함한 DMEM 배지에 본 발명에 따른 서리태잎 추출물 및 플라보놀배당체 화합물 시료를 일정한 농도로 처리하여 30분간 반응하였다. 대조군은 동일한 조건에서 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였고, 배지로 분비된 인슐린을 ELISA 인슐린 키트(Alpco diagnostics)를 사용하여 측정하였다.
[표 7]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000022
상기 표 7에 나타난 바와 같이,
본 발명에 따른 서리태잎 에탄올 추출물 및 플라보놀배당체 화합물(화학식 1 내지 7)은 고농도 글루코오스(30 mM)로 유도된 췌장베타세포에서 인슐린 분비 증가량이 우수한 것으로 나타났으며, 특히 서리태잎 115일령 70% 에탄올 추출물의 경우 89.6%의 현저히 우수한 인슐린 분비 증가량을 유도하는 것으로 나타났다. 반면, 대두콩잎 115일령 70% 에탄올 추출물의 경우 36.2%의 매우 낮은 인슐린 분비 증가량을 보여 본 발명의 서리태잎 115일령 70% 에탄올 추출물과 현저히 비교되었다.
또한, 본 발명에 따른 서리태잎의 플라보놀배당체 고함유 분획물은 추출물에 비해 인슐린 분비 증가량이 현저히 증가되어 100 ㎍/㎖의 투여에서 206.4%의 우수한 인슐린 분비 증가량을 유도하는 것으로 나타났다.
또한, 본 발명에 따른 화학식 4로 표시되는 퀘르세틴 배당체는, 이의 아글리콘(aglycone)인 퀘르세틴에 비해 약 2배 우수한 인슐린 분비량 증가를 유도하는 것으로 나타났다. 일반적으로 아글리콘이 이의 배당체에 비해 우수한 활성을 나타내는 것이 통상적으로 잘 알려져 있는 사실인 것을 보면, 본 결과는 예측 불가능한 효과인 것을 알 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 화학식 6 및 7로 표시되는 이소람네틴 배당체는, 이의 아글리콘인 이소람네틴에 비해 우수한 인슐린 분비량 증가를 유도하는 것으로 나타났으며, 이중에서도 특히 화학식 7로 표시되는 이소람네틴 배당체는 이의 아글리콘인 이소람네틴에 비해 약 4배 우수한 인슐린 분비량 증가를 유도하는 것으로 나타났다.
또한, 대두콩잎 추출물에 존재하는 배당체인 비교예 2 및 비교예 3과, 이의 아글리콘인 캄페롤은 모두 19% 이하의 미비한 인슐린 분비량 증가를 유도하는 것으로 나타났다.
이로부터, 본 발명에 따른 서리태잎 추출물과 화학식 1 내지 7로 표시되는 배당체는, 대두콩잎 추출물, 대두콩잎 추출물에 존재하는 캄페롤 배당체, 캄페롤 아글리콘, 이소람네틴 아글리콘에 비해 현저히 우수한 인슐린 분비량 증가 유도능이 있음을 알 수 있다.
<실험예 5> 서리태잎 일령에 따른 인슐린 분비 촉진 활성 비교
일령에 따른 인슐린 분비 촉진 활성을 평가하기 위하여, 대두콩잎 또는 서리태잎을 50일, 65일, 80일, 95일, 또는 115 일령에서 70% 에탄올로 추출한 후 상기 <실험예 4>와 동일하게 실험을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
[표 8]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000023
상기 표 8에 나타난 바와 같이,
서리태잎 추출물의 경우 일령이 증가함에 따라 인슐린 분비량이 지속적으로 증가하는 것으로 나타났다.
< 실험예 6> 검정콩잎 추출물 및 플라보놀배당체 화합물의 LDL(low-density lipoprotein) 항산화 활성 효과 확인
본 발명에 따른 상기 검정콩잎 추출물 및 플라보놀배당체 화합물의 LDL에 대한 항산화 활성을 확인하기 위하여, Cu2 +를 이용하여 LDL의 산화를 유도하고 생성된 불포화 지방산의 산화산물인 디알데하이드(dialdehyde)를 측정하는 TBARS(thiobarbituric acid-reactive substances)법을 사용하였으며(Packer, L. Ed.(1994) Methods in Enzymology Vol. 234, Oxygen radicals in biological systems Part D. Academic press, San Diego), 다소 수정된 방법으로 생성된 말론디알데하이드의 양을 표준곡선을 이용하여 정량하였다 (Jeong T. S. 등, Bioorg. Med. Chem. Lett. 14: 2719-2723, 2004). 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
[표 9]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000024
상기 표 9에 나타난 바와 같이,
본 발명에 따른 서리태잎 추출물은 40 μg/ml의 농도에서 모두 50% 이상의 LDL 산화 억제 활성을 나타내며, 이중에서도 특히 50% 및 70% 에탄올 추출물은 91% 이상의 현저히 우수한 LDL 산화 억제 활성을 갖는 것으로 나타났다.
또한, 서목태잎 추출물은 40 μg/ml의 농도에서 모두 54% 이상의 LDL 산화 억제 활성을 나타내며, 이중에서도 특히 50% 및 70% 에탄올 추출물은 91% 이상의 현저히 우수한 LDL 산화 억제 활성을 갖는 것으로 나타났다.
반면, 대두콩잎 추출물은 40 μg/ml의 농도에서 모두 43% 미만의 LDL 산화 억제 활성을 나타내어, 본 발명에 따른 서리태잎 또는 서목태잎 추출물이 상기 대두콩잎 추출물보다 현저히 우수한 LDL 산화 억제 활성을 갖고 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 검정콩잎 추출물에 존재하는 화학식 1 내지 5의 이소람네틴배당체는 IC50값이 0.4 - 2.3 μM로 매우 높은 LDL 산화 억제 활성을 나타냈으며, 화학식 6 및 7의 이소람네틴배당체는 100 μM의 농도에서 각각 65.7% 또는 55.7%의 비교적 높은 LDL 산화 억제 활성을 나타내었다. 반면에 대두콩잎 추출물에 존재하는 배당체인 비교예 2 및 비교예 4는 100 μM의 농도에서 각각 28.4% 또는 41.3%의 비교적 낮은 LDL 산화 억제 활성을 나타냄으로써 검정콩잎 추출물에 존재하는 배당체가 대두콩잎 추출물에 존재하는 배당체에 비해 현저히 우수한 LDL 산화 억제 활성이 있음을 알 수 있다.
< 실험예 7> 검정콩잎 추출물 및 플라보놀배당체 화합물의 DPPH 라디칼 소거활성 평가
본 발명에 따른 상기 검정콩잎 추출물 및 플라보놀배당체 화합물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 확인하기 위하여, 시험물질(200μg/mL 또는 50μM)과 DPPH(1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, 25μM)를 각각 메탄올에 용해하였다. 1mL의 시험물질 용액에 2 mL의 DPPH 용액을 혼합하여 잘 저어주었다. UV/Vis 스펙트럼을 사용하여 517 nm에서의 흡광도를 1분 간격으로 20분 동안 측정하여 DPPH 라디칼의 소거활성 정도를 평가하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
[표 10]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000025
상기 표 10에 나타난 바와 같이,
본 발명에 따른 서리태잎 추출물은 200 μg/ml의 농도에서 모두 36% 이상의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내며, 이중에서도 특히 50% 및 70% 에탄올 추출물은 48% 이상의 현저히 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성을 갖는 것으로 나타났다.
또한, 본 발명에 따른 서목태잎 추출물은 200 μg/ml의 농도에서 모두 36% 이상의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내며, 이중에서도 특히 50% 및 70% 에탄올 추출물은 54% 이상의 현저히 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성을 갖는 것으로 나타났다.
반면, 대두콩잎 추출물은 200 μg/ml의 농도에서 모두 24% 미만의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내어, 본 발명의 서리태잎 또는 서목태잎 추출물이 상기 대두콩잎 추출물에 비해 현저히 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성을 갖고 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 검정콩잎의 플라보놀배당체 고함유 분획물은 추출물에 비해 DPPH 라디칼 소거 활성이 현저히 증가되어 50 ㎍/㎖의 투여에서 82%의 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성을 갖는 것으로 나타났다.
또한, 대두콩잎 추출물에 존재하는 캄페롤 배당체인 비교예 2 및 3과, 제니스테인 배당체인 비교예 4는 모두 8% 미만의 LDL 산화 억제 활성을 나타내는 반면, 본 발명의 검정콩잎 추출물에 존재하는 화학식 1 내지 5의 플라보놀 배당체의 LDL 산화 억제 활성은 모두 52% 이상을 나타냄으로써 검정콩잎 추출물에 존재하는 배당체가 대두콩잎 추출물에 존재하는 배당체보다 현저히 우수한 LDL 산화 억제 활성이 있음을 알 수 있다.
이로부터, 본 발명에 따른 검정콩잎 추출물(서리태 및 서목태 품종)과 검정콩잎 추출물에 존재하는 플라보놀배당체 화합물은 대두콩잎 추출물과 대두콩잎 추출물에 존재하는 플라보놀배당체 화합물 비해 현저히 우수한 항산화 활성이 있음을 알 수 있다.
< 실험예 8> 검정콩잎 추출물 및 플라보놀배당체 화합물의 ROS 축적억제 활성 평가
본 발명에 따른 상기 검정콩잎 추출물 및 플라보놀배당체 화합물의 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)의 축적 억제 활성을 확인하기 위하여, 96 웰 플레이트에 웰 당 배지와 RAW 276.7 세포를 5×104 세포/100μL씩 첨가하고, 37℃, 습윤한 5% CO2 배양상자에 넣고 세포수가 80% 이상 될 때까지 배양하였다. DMEM 배지를 사용하여 농도별 시험물질을 준비한 후, 100μL/웰 씩 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 다음으로, LPS (1μg/ml)를 처리하고 18시간 동안 세포를 자극시킨 후, DCFH2-DA(2',7'-dichlorofluorescein diacetate)를 최종농도 15μM로 첨가하고 30분 동안 반응시켰다. 반응이 종결되면 PBS로 5회 수세한 후, Fluorometer (480/530, ex/em)를 사용하여 DCF의 형광 값을 측정하였다 (Hayakaya M. 등, EMBO J., 22: 3356-3366, 2003). 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
[표 11]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000026
상기 표 11에 나타난 바와 같이,
본 발명에 따른 서리태잎 추출물은 100 μg/ml의 농도에서 모두 30% 이상의 ROS 축적에 대한 억제 활성을 나타내며, 이중에서도 특히 50% 및 70% 에탄올 추출물은 40% 이상의 현저히 우수한 ROS 축적에 대한 억제 활성을 갖는 것으로 나타났다.
또한, 서목태잎 추출물은 100 μg/ml의 농도에서 모두 31% 이상의 ROS 축적에 대한 억제 활성을 나타내며, 이중에서도 특히 50% 및 70% 에탄올 추출물은 40% 이상의 현저히 우수한 ROS 축적에 대한 억제 활성을 갖는 것으로 나타났다.
반면, 대두콩잎 추출물은 100 μg/ml의 농도에서 모두 약 36% 미만의 ROS 축적에 대한 억제 활성을 나타내어, 본 발명의 검정콩잎 추출물(서리태잎 및 서목태잎 추출물)이 상기 대두콩잎 추출물에 비해 현저히 우수한 ROS 축적에 대한 억제 활성을 갖고 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 검정콩잎 추출물에 존재하는 화학식 1 내지 7의 플라보놀 배당체는 100 μM의 농도에서 22% 내지 59%의 ROS 축적에 대한 억제 활성이 있음을 알 수 있다.
이로부터, 본 발명에 따른 검정콩잎 추출물 및 플라보놀 배당체 화합물은 우수한 항염증 활성을 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
< 실험예 9> 서리태잎 추출물의 in vivo 동물모델에서의 대사증후군 예방 효능 확인
본 발명에 따른 서리태잎 추출물의 대사증후군, 특히 고지혈증, 당뇨, 제2형 당뇨, 비만, 지방간에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<9-1> 동물의 사육
실험동물은 수컷 C57BL/6J 마우스를 일본 SLC사로부터 수입하여 사용하였다. 분양 받은 실험동물은 2주간 기본사료(AIN-76A diet)와 물을 자유롭게 공급하면서 실험실 환경에 적응시킨 후, 건강상태가 양호한 6주령의 마우스를 실험에 사용하였다. 실험군은 하기와 같이 분류하였다:
(1) 기본 정상식이(AIN76A diet)를 섭취하는 음성대조군;
(2) 고지방식이(60 kcal% 고지방식이; Dyets Inc.)를 섭취하는 대조군; 및
(3) 고지방식이에 본 발명의 서리태잎 에탄올 추출물(1%, wt/wt diet)을 보충한 시험군.
상기 실험군을 12주간 실험하면서 지질강하, 항당뇨 및 항비만 효능을 관찰하였다.
동물 사육실의 환경은 항온(25 ± 2℃), 항습(50 ± 5%) 및 12시간 간격의 광주기(점등 07:00 ∼ 19:00)로 일정한 조건을 유지하였고, 실험동물은 3 내지 4마리씩 분리하여 사육하였으며, 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 식이 섭취량 및 체중은 매주 일정한 시간에 측정하여 기록하였으며, 2주 간격으로 12시간 동안 절식 후 후안와 정맥총으로부터 모세관(capillary tube)을 사용하여 채혈한 후 EDTA를 사용하여 응고를 방지하였고, 혈액생화학적 검사를 위하여 채혈 후 30분 이내에 3,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 혈장(plasma)을 분리하여 -70℃에 보관하였다가 분석하였다. 사육이 끝난 실험동물은 희생 전 12시간 동안 절식시킨 후 혈액을 채취하여 동일한 방법으로 처리하였고, 각 실험동물의 장기조직(지방조직, 췌장, 간 및 근육)은 혈액 채취 후 즉시 적출하여 칭량 후, RNA 실험용은 RNA 안정액(stabilization solution)(Qiagen)에 보관하여 일주일 안에 RNA을 분리하였고, 나머지 부분은 액체질소로 급냉시켜 -70℃ 냉동고에 보관하였다.
<9-2> 동물실험 결과의 통계처리 및 유효성 평가
음성대조군, 대조군과 시험군 간의 결과는 평균치 ± 표준편차로 나타내었으며, 각 군 간의 차이에 대해 one-way ANOVA 후에 Turkey hoc test(JMPⓡ software, SAS Institute Inc., 미국)를 실시하여 유의차가 5% 미만(P<0.05)일 때 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다. 즉, 위첨자로 표시된 a,b,c가 다른 군 간에는 통계적 유의성이 있음을 의미한다.
<9-3> 체중, 지방조직, 간, 근육 중량 변화 측정
상기 실험예 <9-1>의 각 실험동물의 체중 및 지방조직, 간, 근육 중량을 측정한 결과를 하기의 표 12에 나타내었다.
[표 12]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000027
*a,b,c: 윗첨자로 표시된 a,b,c가 서로 다른 군 간에는 통계적 유의성(P<0.05)이 있음을 의미함.
표 12에 나타낸 바와 같이, 실험 시점에 비해 12주 후 기본식이를 섭취한 음성대조군의 체중 증가량은 12.5 ± 1.1 g 이었고, 고지방식이를 섭취한 대조군의 체중 증가량은 23.6 ± 0.5 g으로 현저하게 증가한 반면, 고지방식이와 함께 서리태잎 에탄올 추출물을 섭취한 시험군의 체중 증가량은 19.4 ± 1.3 g으로 에탄올 추출물의 섭취로 인해 체중 증가율이 17.8% 억제되었다.
또한, 12주 후 음성대조군의 복부지방조직(abdominal adipose tissue) 중량은 0.60 ± 0.06 g이었고, 대조군의 복부지방조직 중량은 1.06 ± 0.07 g인 반면, 시험군의 복부지방조직 중량은 0.98 ± 0.10 g으로 에탄올 추출물의 섭취로 인해 체지방 증가가 억제되었다.
12주 후 음성대조군의 근육 중량은 0.29 ± 0.01 g이었고, 대조군의 근육 중량은 0.32 ± 0.01 g인 반면, 서리태잎 에탄올 추출물을 섭취한 시험군의 근육 중량은 0.34 ± 0.00 g 으로 음성대조군과 대조군 모두에 비하여 증가하였다.
12주 후 음성대조군의 간 중량은 1.29 ± 0.05 g이었고, 대조군의 간 중량은 1.56 ± 0.10 g으로 증가한 반면, 서리태잎 에탄올 추출물을 섭취한 시험군의 간 중량은 0.98 ± 0.10 g으로 고지방식이에 의한 지방간을 유의적으로 억제하였다.
<9-4> 간 조직의 지질 함량 측정
상기 실험예 <9-1>의 절식 후 각 실험동물로부터 채취한 간 조직 내의 총콜레스테롤(TC) 및 중성지방(TG)의 함량을 측정하였다. 각 실험동물로부터 적출한 간에서 Folch 등의 방법(J. Biol. Chem. 226: 497-509, 1957)에 따라 유기용매를 이용하여 지질을 추출한 후 아산제약(Asan Pharmaceutical, 한국)에서 구입한 효소분석 키트를 사용하여 측정한 TC와 TG 함량 결과를 하기의 표 13에 나타내었다.
[표 13]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000028
*a,b,c: 윗첨자로 표시된 a,b,c가 서로 다른 군 간에는 통계적 유의성(P<0.05)이 있음을 의미함.
표 13에 나타낸 바와 같이, 간 g 중량당 총콜레스테롤량은 대조군이 1.48 ± 0.06 mg인 것에 비해 시험군은 1.03 ± 0.05 mg으로 유의적으로 30.4% 감소하였다. 또한 간 중량당 총중성지방량은 대조군이 44.93 ± 3.67 mg인 것에 비해 시험군은 22.18 ± 2.25 mg으로 유의적이면서 현저하게 50.6% 감소하였다.
<9-5> 혈중 지질생화학적 지표 분석
상기 실험예 <9-1>의 절식 후 각 실험동물로부터 혈액을 채취한 후 분리한 혈장(plasma)으로 공복혈당(fasting glucose), 당화혈색소(HbA1c), 유리지방산(NEFA), 인슐린(insulin), 인슐린저항성(HOMA-IR) 수치를 측정하였고, 지질 함량의 지표인 총콜레스테롤(TC), HDL-콜레스테롤/TC 및 중성지방(triglyceride) 수치를 측정하였으며, 간 기능의 지표인 GOT 및 GPT를 측정하였다.
구체적으로, 혈당 및 유리지방산은 생화학자동분석기(Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan)를 이용하여 측정하였고, 당화혈색소는 EASY A1CTM 당화혈색소 카트리지 [(주)인포피아]를 사용하여 측정하였으며, 인슐린 농도는 Insulin ELISA kit(Alpco diagnostics)를 사용하여 측정하였고, 아디포넥틴 농도는 Adiponectin ELISA kit(R&D Systems, Inc.)를 사용하여 측정하였다. 인슐린저항성 지수(HOMA-IR index)는 참고문헌(Matthews et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 341: 507-514, 2006)에 따른 계산식[인슐린농도(ng/ml)×24.8×포도당농도(mg/dl)÷405]을 이용하여 계산하였다. 지질조성 지표인 총콜레스테롤 (TC), HDL-콜레스테롤, 중성지방 농도 및 간 기능의 지표인 GOT와 GPT 농도는 모두 아산제약에서 구입한 개별 측정 kit를 사용하여 정량하였다. 그 결과를 하기 표 14에 나타내었다.
[표 14]
Figure PCTKR2016009163-appb-I000029
*a,b,c: 윗첨자로 표시된 a,b,c가 서로 다른 군 간에는 통계적 유의성(P<0.05)이 있음을 의미함.
상기 표 14에 나타낸 바와 같이,
공복혈당은 음성대조군이 106.0 ±2.8 mg/dL이고 대조군이 143.7±3.9 mg/dL에 비해 서리태잎 에탄올 추출물을 섭취한 시험군은 124.0 ± 8.6 mg/dL로 현저하게 감소하였다. 당화혈색소는 음성대조군이 4.4 ± 0.0%이고 대조군이 4.6 ± 0.1%인 것에 비해 시험군은 4.2 ± 0.0%로 유의성있게 현저히 감소하였다(P<0.05). 유리지방산은 음성대조군이 2.3 ± 0.1 mEq/L이고 대조군이 1.9 ± 0.1 mEq/L인 것에 비해 시험군은 1.4 ± 0.0 mEq/L로 유의성있게 현저히 감소하였다(P<0.05). 인슐린은 음성대조군이 0.3 ± 0.0 mEq/L이고 대조군이 3.4 ± 0.3 mEq/L인 것에 비해 시험군은 0.9 ± 0.2 mEq/L로 유의성있게 현저히 감소하였다(P<0.05). 인슐린저항성 지수(HOMA-IR)는 음성대조군이 1.8 ± 0.4 이고 대조군이 28.6 ± 0.6으로 현저하게 증가하였으며, 시험군은 6.8 ± 1.6 으로 유의성있게 현저히 감소하였다(P<0.05). 또한 비만 억제 호르몬이며 비만 억제, 인슐린감수성 증강작용과 항동맥경화 작용을 하는 아디포넥틴은 음성대조군이 12.8 ± 0.3 μg/mL이고 대조군이 9.7 ± 0.6 μg/mL로 현저하게 감소한 반면, 시험군은 12.6 ± 6.6 μg/mL로 유의성있게 현저히 증가하였다(P<0.05).
총콜레스테롤은 음성대조군이 111.3 ± 2.6 mg/dl이고, 대조군이 145.5 ± 3.9 mg/dl인 것에 비해 콩잎 에탄올 추출물을 섭취한 시험군은 126.7 ± 9.3 mg/dl로 감소하였다. 총콜레스테롤 당 HDL-콜레스테롤의 비율은 음성대조군이 52.3 ± 5.4%이고, 대조군이 42.6 ± 3.8%인 것에 비해 대조군은 55.6 ± 1.0%로 유의성있게 증가하였다(P<0.05). 중성지방은 음성대조군이 139.8 ± 10.5 mg/dl이고, 대조군이 88.2 ± 5.7 mg/dl인 반면, 시험군은 59.2 ± 3.0 mg/dl로 유의성있게 현저히 감소하였다(P<0.05).
12주 동안 기본식이를 섭취한 음성대조군에 비해 고지방식이를 섭취한 대조군은 지방간 증상을 나타냈고, 혈중 간독성 지표인 GOT(aspartate transaminase; AST) 및 GPT(alanine transaminase; ALT) 함량이 증가하였다. 즉, GOT 함량은 음성대조군이 56.2 ± 1.3 IU/L이고 대조군이 69.8 ± 2.7 IU/L인데 비해 서리태잎 에탄올 추출물을 섭취한 시험군은 62.9 ± 2.3 IU/L로 감소하였으며, GPT 함량은 음성대조군이 33.5 ± 1.3 IU/L이고 대조군이 40.2 ± 1.9 IU/L인데 비해 시험군은 28.5 ± 1.1 IU/L로 유의성있게 현저히 감소하였으며(P<0.05), 음성대조군보다 더 낮아져 간보호 효과를 나타냈다.
<9-6> 동물조직의 효소활성 및 유전자 발현 분석
본 발명에 따른 서리태잎 추출물이 간의 효소활성 및 간과 지방조직의 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <9-1>의 음성대조군, 대조군 및 시험군으로부터 적출한 간 조직에서 AMP-activated protein kinase(AMPK) 효소의 활성을 확인하였다. 간 조직에서 마이크로솜(microsome)을 분리하였고, AMPK kinase assay kit(Cyclex사)를 이용하여 효소 활성을 확인하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이 AdipoR1에 의해 활성화되는 AMPK 효소 활성이 대조군에 비해 시험군에서 약 3배 정도 현저하게 증가함을 확인하였다.
또한, 상기 실험예 <9-1>의 음성대조군, 대조군 및 시험군으로부터 적출한 간 및 지방조직들의 유전자 발현 양상을 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 증폭법을 사용하여 확인하였다. 간 및 지방조직은 Trizol(Ambion사) 용액과 RNeasy mini kit(Qiagen사)를 사용하여 각 조직으로부터 RNA를 추출한 뒤 QuantiTect Reverse transcriptase kit(Qiagen사)를 사용하여 cDNA를 만들고, 이를 주형(template)으로 하여 각각의 유전자를 증폭시킬 수 있도록 합성된 올리고(oligo)들과 함께 dsDNA에 끼어들어가는 SYBR Green의 특성을 이용한 SYBR Green Supermix reagent(Applied Biosystems사)를 사용하여 RT-PCR 기기(Applied Biosystems 7500 Real Time PCR system, Life Technologies, 미국)로 실시간으로 cDNA의 증폭과정을 확인하였다. 사용된 프라이머들은 PCR 증폭과정에서 150 내지 200 bp정도의 단일 앰플리콘(single amplicon)을 형성함을 확인하였고, 이들의 염기서열은 하기 표 15와 같다.
[표 15]
유전자의 발현 수치는 cDNA가 증폭되어 형광이 포화상태에 이르는 지점의 PCR 사이클(cycle) 횟수로써 표시되는데, 이를 GAPDH에 대한 값으로 보정한 뒤 최종적으로 고지방식이을 섭취한 대조군에 대한 상대적인 수치로 산출하였다.
그 결과, 상기 표 15에서 본 발명의 서리태잎 에탄올 추출물을 투여한 시험군은 혈장 아디포넥틴 수준이 대조군에 비해 유의적으로 증가함과 동시에, 도 18에 나타낸 바와 같이, 지방 조직에서의 아디포넥틴 유전자 발현도 대조군에 비해 현저하게 증가함을 확인하였다.
또한, 도 19에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 서리태잎 에탄올 추출물을 투여한 시험군은 간에서 아디포넥틴 수용체인 AdipoR1과 AdipoR2의 발현이 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 것으로 나타났으며, 도 20에 나타낸 바와 같이, AMPK에 의해 조절되며 간에서 인슐린 민감성을 높여주는 GLUT-2와 IRS-2의 발현은 현저하게 증가하였고, 인슐린 저항성을 일으키는 forkhead box protein O1(FoxO1)과 forkhead box protein A2(Foxa2)의 발현은 유의적으로 감소하였다.
또한, 도 21에 나타낸 바와 같이, AdipoR2의 하위 기전 중 간세포 내 지질대사를 조절하는 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체인 peroxisome proliferator-activated receptor(PPARα, PPARγ, PPARδ) 유전자와 PPAR의 전사 보조인자인 PGC-1 유전자 발현량이 지질대사를 효과적으로 조절하는 방향으로 변화된 것으로 나타났다. 즉 지방산 산화 및 인슐린 민감성을 높여주는 PPARα와 PPARδ의 발현은 서리태잎 에탄올 추출물을 투여한 대조군에 비해 시험군에서 유의적으로 증가하였고, 세포 내 지방축적을 높여주는 PPARγ의 발현은 대조군에 비해 시험군에서 현저하게 감소하였고, PGC-1 유전자 발현은 현저하게 증가하였다. 또한, 도 22에 나타낸 바와 같이, 상기의 전사인자를 통해 지방산 산화를 조절하는 carnitine palmitoyltransferase 1A(CPT-1α) 유전자의 발현은 대조군에 비해 시험군에서 현저하게 증가하였고, 지방축적을 조절하는 ACC1, ACC2 및 FAS 유전자의 발현은 대조군에 비해 시험군에서 유의적으로 현저히 감소하였다.
또한, 도 23에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 서리태잎 에탄올 추출물을 투여한 시험군은 복부지방 조직에서 인슐린 민감성 조절인자인 인슐린 수용체 InsR, IRS-1, GLUT-4의 유전자 발현이 대조군에 비해 효과적으로 증가하였고, 인슐린 민감성을 저하시키는 TNFα의 발현은 대조군에 비해 현저하게 감소하였으며, 도 24에 나타낸 바와 같이, 지방조직의 분해를 조절하는 hormone-sensitive lipase(HSL)과 uncoupling protein-3(UCP3)의 발현은 시험군에서 대조군에 비해 증가함을 확인하였다.
<실험예 10> 서리태잎 추출물의 인체시험에서의 대사증후군 예방 효능 확인
본 발명에 따른 서리태잎 추출물의 대사증후군, 특히 고지혈증, 당뇨, 제2형 당뇨, 비만에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같은 인체시험을 수행하였다.
<10-1> 인체시험 연구대상 선정 및 디자인
본 인체시험은 경북대학교 생명윤리심의위원회(IRB, Institutional Review Board)의 심의 및 승인을 획득한 후 수행하였다(승인번호: KNU 2015-0032, 승인일자: 2015년 4월 9일). 서리태잎의 효능은 35-65세 사이의 과체중 (BMI>23) 또는 비만 (BMI>25)이면서 공복혈당이 100 mg/dL 이상에 부합하는 반건강인 성인 남녀를 대상으로 대조군은 위약대조물질인 콘 스타치(corn starch)를 2 g/일 용량으로 또는 시험군은 서리태잎 추출물 2 g/일 용량으로 12 주간 섭취하면서 시험 전 후 각 신체 계측치 및 혈액분석을 수행하였다. 대조군과 시험군 대상자는 각각 20명 내외로 하였다. 시험기간 중 2주 1회 모니터링으로 시험 식품의 섭취 여부, 시험기간 중 나타날 수 있는 부작용 또는 불편사항 (설사, 장내가스 발생, 어지러움, 복통, 구토 등)을 조사하였다. 총 4회 (0, 4, 8, 12 주) 방문을 통해 영양설문지와 24시간 식사일지 작성, 신체계측, 체성분 측정, 허리 둘레와 엉덩이 둘레 측정, 혈압, 공복혈당, 처방식품 배분 및 채혈 및 소변 수집을 수행하였다. 시험 전 (0주) 및 시험 후 (12주)에 12시간 공복 후 공복혈액과 소변을 채취하였다. 채취된 혈액은 헤파린으로 처리된 시험관에 수집하여, 1000×g, 4℃에서 15분간 원심 분리하여 혈장을 분리한 후 시료 분석 시까지 -70℃에 보관하였다.
<10-2> 인체시험 결과의 통계 분석
대조군과 시험군의 모든 시험 결과는 SPSS 통계 프로그램을 사용하여 각 실험군당 평균과 표준오차로 나타내었고, 각 군간의 평균차이에 대한 유의성 검정은 one-way analysis of variance (ANOVA)를 이용하였다. 다군 간의 차이는 Duncan's multiple range test에 의하여 p < 0.05 수준에서 검정하였고 (Principles and procedures of statistics, MacGraw-Hill, 1960), 또한 각 군별 시험 전후의 수치비교 및 대조군 대비 서리태잎 추출물 복용군의 수치비교를 위해 Student's t-test를 실시하여, p 값이 0.05 미만일 때 통계학적으로 의미가 있는 것으로 판단하였다.
<10-3> 서리태잎 복용 전후 신체계측 및 체지방 측정
12주간의 시험물질 복용 전후 대상자들의 체중, 체질량수 (BMI), 체지방률 (Body fat percentage, BFP), 허리 둘레 및 엉덩이 둘레 (주원메디컬사, 한국)를 각각 측정한 후 허리/엉덩이 둘레비 측정하고 그 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25에 나타난 바와 같이, 시험물질 복용 전에는 군간 차이를 보이지 않았다. 또한, 12주 후에 대조군의 허리/엉덩이 둘레비는 차이가 없는 반면, 서리태잎 추출물을 복용한 후 시험군의 허리/엉덩이 둘레비는 복용 전보다 3.4% 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다.
<10-4> 서리태잎 복용 전후 혈중 지질 및 당뇨 지표 분석
시험물질 복용 12주 전후 전혈의 HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 총콜레스테롤 및 중성지방 농도를 측정하였고, 혈장의 유리지방산 및 공복혈당도 측정하였다. 상기 실험예 <10-1>의 각 대상자로부터 얻은 혈액의 총콜레스테롤은 Allain 등의 효소법 (Clin. Chem. 20: 470-475, 1974)을 응용한 측정용시액(아산제약 키트)를 사용하였다. HDL-콜레스테롤은 아산제약 시약을 사용하여 측정하였다(Clin. Chem. 28: 1379-1388, 1982). 혈액의 중성지질 농도는 McGowan 등의 효소법(Clin. Chem. 29: 538-542, 1983)을 이용한 발색법 원리에 따라 중성지방 측정용 시약 (아산제약 키트)을 사용하여 측정하였다. 동맥경화지수(Atherogenic index)는 [(총콜레스테롤 - HDL-콜레스테롤)/HDL-콜레스테롤)로 산출하였다.
혈장 유리지방산은 효소법을 이용한 발색법 원리에 따라 유리지방산 측정용 시액 (Non-esterified fatty acid, NEFA kit, Wako, Osaka, Japan)을 사용하여 측정하였다. 혈장 포도당 함량 측정을 위해 상업용 glucose 측정용 시약(아산키트)을 사용하였다.
도 26 내지 30에 나타낸 바와 같이, 12주 후에 대조군의 혈장 유리지방산, 중성지방, HDL-콜레스테롤 및 포도당 농도은 유의적인 차이를 보이지 않았다. 반면에 서리태잎 추출물을 복용한 시험군은 복용 전에 비해 혈장 유리지방산의 농도가 11.9% 유의적으로 낮아졌으며, 혈장 중성지방의 농도는 21.1% 유의적으로 낮아졌다. 또한 혈장 HDL-콜레스테롤 농도가 11.6% 유의적으로 증가함에 따라 동맥경화지수도 유의적으로 15.8% 감소하였다. 또한 서리태잎 추출물을 복용한 시험군은 복용 전에 비해 혈장 포도당의 농도가 9.1% 유의적으로 낮아지는 것으로 나타났다.
<10-5> 서리태잎 복용 전후 항산화 효소 활성도 및 과산화물 함량 측정
12 주간의 시험 물질 복용 전후 적혈구의 항산화 효소인 Catalase와 Superoxide dismutase (SOD) 활성도 및 과산화물 함량을 측정하였다. Catalase는 과산화수소를 분해시키는 역할을 하며 활성도는 Aebi 등의 방법 (Eur. J. Biochem. 48: 137-145, 1974)을 수정, 보완하여 측정하였다. SOD는 superoxide anion radical (O2 -)을 H2O2 및 O2로 분해시키는 반응을 촉매하는 효소로서 활성도는 Marklund 등의 방법(Eur. J. Biochem. 47: 469-474, 1974)을 수정하여 알칼리 상태에서 SOD가 pyrogallol의 자동산화를 억제하는 정도를 측정하였다. Glutathion reductase (GR) 활성도는 GSSG가 NADPH가 GR의 작용으로 GSH로 환원될 때 NADPH가 감소되는 정도를 측정하였다(Biochem. J. 112: 109-115, 1969). 적혈구 지질과산화물 함량 측정은 Tarladgis 등의 TBARS법 (J. Sci. Food Agric. 15: 602-604, 1964)을 이용하였다.
도 31 내지 34에 나타낸 바와 같이, 적혈구 catalase, SOD 및 GR 활성도는 서리태잎 추출물 복용 후 복용 전 대비 유의적으로 각각 9.5%, 7.9%, 46.3%씩 증가하였고, 적혈구 지질과산화물인 TBARS는 서리태잎 추출물 복용 후 대조군에 비해 유의적으로 감소(20.9%)되었으며, 이는 또한 대조군과 비교에서도 서리태잎 추출물 복용 전에 비해 복용 후 유의적인 감소(13.9%)를 보이는 것으로 나타났다.
<10-6> 서리태잎 복용 전후 혈장 염증성 사이토카인 및 지방세포 분비 호르몬 함량 측정
시험물질 복용 12주 전후 혈장의 MCP-1, PAI-1, 레시스틴(Resistin) 및 아디포넥틴(Adiponectin) 및 농도를 측정하였다. MCP-1, PAI-1 및 레시스틴은 Multiplex detection kit(Bio-Rad, USA)를 사용하였고, 아디포넥틴은 Human total adiponectin/Acrp30 (R&D systems)을 이용하여 측정하였다. MCP-1과 PAI-1은 염증성 사이토카인이다. Resistin과 adiponectin은 지방세포에서 분비되는 호르몬으로 Resistin은 비만·동맥경화증·당뇨병 등 심장대사질환 이른바 성인병의 주요 원인이며, adiponectin은 인슐린 저항성을 개선시키고 항동맥경화 작용을 한다.
도 35 내지 38에 나타낸 바와 같이, 서리태잎 추출물 복용 후 복용 전보다 혈장 MCP-1, PAI-1 및 레시스틴 농도가 각각 20.0%, 27.9%, 14.2%씩 유의적으로 낮아졌다. 또한 혈장 아디포넥틴 농도는 서리태잎 추출물 복용 후 복용 전보다 유의적으로 9.9% 증가하는 것으로 나타났다.
본 발명의 검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체(flavonol glycosides)는 α-글루코시데이즈 활성을 효과적으로 억제하고, LDL 산화 및 DDP-4를 효과적으로 억제하며, 췌장베타세포에서 인슐린 분비를 효과적으로 촉진시키고, 검정콩잎 추출물은 고지방식이에 의한 체중 증가 및 체지방 증가를 억제하고, 공복혈당, 당화혈색소, 유리지방산, 인슐린, 및 인슐린저항성을 낮추고, 총콜레스테롤과 중성지방 수준을 낮추며, 총콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 비율을 증가시키고, 혈중 간독성의 지표인 GOT 및 GPT의 함량을 감소시키며, 혈장 아디포넥틴 수준과 지방조직의 아디포넥틴 발현을 증가시키고, 간의 AMPK 활성을 증가시키며, 간 및 지방조직에서 인슐린 민감성 및 지방대사와 관련되는 유전자의 발현을 조절하며, 과체중 또는 비만의 성인 남녀에 대하여 허리/엉덩이 둘레비의 감소능이 우수하고, 혈장 유리지방산 및 혈장 중성지방의 농도는 감소시키고, 혈장 HDL-콜레스테롤 농도는 증가시키며, 동맥경화지수를 감소시키고, 적혈구 catalase, SOD 및 GR 활성도를 증가시키고, 적혈구 지질과산화물인 TBARS는 감소시키며, 염증성 사이토카인인 MCP-1 및 PAI-1과 지방세포에서 분비되는 호르몬인 레시스틴의 농도를 감소시키고, 혈장 아디포넥틴 농도는 증가시킴으로써, 이와 관련되는 당뇨, 비만, 인슐린저항성, 지방간, 고지혈증, 동맥경화 또는 대사증후군의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 항산화 활성이 우수하므로 항산화용 조성물로 유용하다.
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agcgtagtga gggtgccttg t 21
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atccatcacc acagccttca 20

Claims (27)

  1. 검정콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 검정콩잎 추출물은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출하는 것을 특징으로 하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 대사증후군은 당뇨, 제2형 당뇨, 비만, 인슐린 저항성, 지방간, 고지혈증, 동맥경화 또는 이들의 합병증인 것을 특징으로 하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 합병증은 관상 동맥 질환, 협심증, 경동맥 질환, 뇌졸중, 뇌동맥경화증, 고콜레스테롤증, 콜레스테롤 결석, 고중성지방혈증, 고혈압, 백내장, 신장질환, 신경장애, 만성 염증성 장애 또는 감염증인 것을 특징으로 하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 하기 화학식 1 내지 7로 표시되는 플라보놀배당체 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016009163-appb-I000031
    ,
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2016009163-appb-I000032
    ,
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2016009163-appb-I000033
    ,
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2016009163-appb-I000034
    ,
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2016009163-appb-I000035
    ,
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2016009163-appb-I000036
    , 및
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2016009163-appb-I000037
    .
  6. 제 5항에 있어서, 상기 대사증후군은 당뇨, 제2형 당뇨, 비만, 인슐린 저항성, 지방간, 고지혈증, 동맥경화 또는 이들의 합병증인 것을 특징으로 하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 합병증은 관상 동맥 질환, 협심증, 경동맥 질환, 뇌졸중, 뇌동맥경화증, 고콜레스테롤증, 콜레스테롤 결석, 고중성지방혈증, 고혈압, 백내장, 신장질환, 신경장애, 만성 염증성 장애 또는 감염증인 것을 특징으로 하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 검정콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사증후군 또는 이의 합병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  9. 하기 화학식 1 내지 7로 표시되는 플라보놀배당체 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 대사증후군 또는 이의 합병증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016009163-appb-I000038
    ,
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2016009163-appb-I000039
    ,
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2016009163-appb-I000040
    ,
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2016009163-appb-I000041
    ,
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2016009163-appb-I000042
    ,
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2016009163-appb-I000043
    , 및
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2016009163-appb-I000044
    .
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 대사증후군은 당뇨, 제2형 당뇨, 비만, 인슐린 저항성, 지방간, 고지혈증, 동맥경화 또는 이들의 합병증인 것을 특징으로 하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 합병증은 관상 동맥 질환, 협심증, 경동맥 질환, 뇌졸중, 뇌동맥경화증, 고콜레스테롤증, 콜레스테롤 결석, 고중성지방혈증, 고혈압, 백내장, 신장질환, 신경장애, 만성 염증성 장애 또는 감염증인 것을 특징으로 하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제1항 또는 제8항에 있어서,
    검정콩잎 추출물은 탄수화물 대사효소인 α-글루코시데이즈(α-glucosidase) 억제활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제1항 또는 제8항에 있어서,
    검정콩잎 추출물은 식후 혈당량을 조절하는 글루카곤 유사 단백질-1 (Glucagon-like protein-1)의 분해효소인 DPP-4(Dipeptidyl peptidase-4) 억제활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제1항 또는 제8항에 있어서,
    검정콩잎 추출물은 췌장 베타세포주에서 인슐린분비 촉진활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제1항 또는 제8항에 있어서,
    검정콩잎 추출물은 LDL(low-density lipoprotein) 항산화활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제1항 또는 제8항에 있어서,
    검정콩잎 추출물은 아디포넥틴(adiponectin) 유전자 및 아디포넥틴 수용체의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제1항 또는 제8항에 있어서,
    검정콩잎 추출물은 AMPK(AMP-activated protein kinase)에 의해 조절되며 인슐린 민감성을 높여주는 GLUT-2(Glucose transporter-2)와 IRS-2(Insulin receptor substrate 2)의 발현을 증가시키고, 인슐린 저항성을 일으키는 Fox01(forkhead box protein O1) 및 Fox02(forkhead box protein A2)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제1항 또는 제8항에 있어서,
    검정콩잎 추출물은 지방산 산화 및 인슐린 민감성을 높여주는 PPARα(peroxisome proliferator-activated receptor α)와 PPARδ(peroxisome proliferator-activated receptor δ)의 발현을 증가시키고, 세포 내 지방축적을 높여주는 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제1항 또는 제8항에 있어서,
    검정콩잎 추출물은 지방산 산화를 조절하는 CPT-1α(carnitine palmitoyltransferase 1A) 유전자의 발현을 증가시키고, 지방축적을 조절하는 ACC(Acetyl-CoA carboxylase)1, ACC2 및 FAS 유전자의 발현은 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제1항 또는 제8항에 있어서,
    검정콩잎 추출물은 인슐린 민감성 조절인자인 인슐린 수용체 InsR, IRS-1, GLUT-4의 유전자 발현이 증가되고, 인슐린 민감성을 저하시키는 TNFα의 발현은 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제1항 또는 제8항에 있어서,
    검정콩잎 추출물은 유전자인 HSL(hormone-sensitive lipase)과 UCP3(uncoupling protein-3)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제1항 또는 제8항에 있어서,
    검정콩잎 추출물은 염증성 사이토카인인 MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1) 및 PAI-1(Plasminogen Activator Inhibitor-1)의 혈중 농도를 감소시키고; 비만, 동맥경화증 및 당뇨병의 주요 원인인 혈장 레시스틴의 농도를 감소시키고; 및 인슐린 저항성 개선 및 항동맥경화 작용을 하는 혈중 아디포넥틴의 농도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 검정콩잎 추출물, 플라보놀배당체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 항산화용 약학적 조성물.
  24. 검정콩잎 추출물, 플라보놀배당체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 항산화용 화장료 조성물.
  25. 검정콩잎 추출물, 플라보놀배당체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 항산화용 사료 첨가제.
  26. 제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서,
    검정콩잎 추출물은 DPPH(1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 라디칼 소거활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서,
    검정콩잎 추출물은 ROS(reactive oxygen species) 축적 억제활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
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