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WO2018004308A2 - 신규 내열성 과당-6-인산-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법 - Google Patents

신규 내열성 과당-6-인산-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법 Download PDF

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WO2018004308A2
WO2018004308A2 PCT/KR2017/006985 KR2017006985W WO2018004308A2 WO 2018004308 A2 WO2018004308 A2 WO 2018004308A2 KR 2017006985 W KR2017006985 W KR 2017006985W WO 2018004308 A2 WO2018004308 A2 WO 2018004308A2
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phosphate
glucose
allulose
fructose
microorganism
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양성재
조현국
이영미
김성보
조성준
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씨제이제일제당 (주)
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Publication date
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    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the present application relates to fructose-6-phosphate-3-epimerase and a method for preparing allulose using the same.
  • D-psicose-3-epimerase EC 5.1.3.30
  • tagatose-3-epimerase EC 5.1.3.31
  • D- fructose is known as an enzyme capable of producing allulose by 3-epimerization.
  • allulose-6-phosphate phosphatase can be produced using allulose-6-phosphate phosphatase which performs an irreversible reaction pathway. It is noted that fructose-6 can produce allulose by one-pot enzymatic conversions that can simultaneously use a plurality of enzymes involved in the allulose production pathway, and can significantly increase the conversion rate to allulose.
  • the present application was completed by discovering a novel heat resistant enzyme that can be applied to the pathway to convert phosphoric acid to allulose-6-phosphate.
  • One object of the present application is to provide a fructose-6-phosphate-3-epimerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Another object of the present application is to provide a nucleic acid encoding the fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application.
  • Another object of the present application is to provide a transformant comprising a nucleic acid encoding the fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application.
  • Still another object of the present application is to provide a composition for producing allulose comprising fructose-6-phosphate-3-epimerase, a microorganism expressing the same or a culture of the microorganism.
  • Another object of the present application is to provide a method for preparing allulose using fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application.
  • the heat-resistant fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application is heat-resistant, which can industrially carry out the route of converting fructose-6-phosphate to allulose-6-phosphate, and allele using economical raw materials. It is possible to proceed with the Ross synthesis route, and to allow the production of allulose by the allulose-6-phosphate dephosphorylation reaction, which is an irreversible reaction route, it is possible to significantly increase the conversion to allulose.
  • the method for preparing allulose using fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application may simplify or remove the separation and purification process by including a high concentration of allulose by increasing the conversion rate to allulose. There is a simple and economical advantage of the manufacturing method.
  • FIG. 1 shows a reaction pathway capable of preparing allulose from starch (eg maltodextrin), sucrose or glucose.
  • Figure 2 shows the results of analyzing the molecular weight of fructose-6-phosphate-3-epimerase (E: FP3E) of the present application by protein electrophoresis (SDS-PAGE).
  • M is a protein size marker.
  • Figure 3 confirms the conversion activity of fructose-6-phosphate to allulose-6-phosphate of the fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application.
  • Figure 4 shows the activity according to the buffer and pH range of fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application.
  • Figure 5 shows the activity according to the temperature of fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application.
  • Figure 6 confirms the activity according to the addition of metal ions of fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application.
  • the present application provides, in one embodiment, a fructose-6-phosphate-3-epimerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. .
  • the fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application may comprise a polypeptide having at least 80%, 90%, 95%, 97% or 99% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence having such homology and exhibiting efficacy corresponding to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 even if some sequences have an amino acid sequence deleted, modified, substituted or added, the scope of the present application Included within is obvious.
  • the fructose-6-phosphate-3-epimerase may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and also at least 80%, 90%, It may be encoded by a nucleotide sequence having 95%, 97% or 99% homology. It is obvious that polynucleotides that can be translated into a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a protein having homology thereto by codon degeneracy may also be included in the scope of the present application.
  • homology means a degree of agreement with a given amino acid sequence or base sequence and may be expressed as a percentage.
  • homologous sequences thereof having the same or similar activity as a given amino acid sequence or base sequence are designated as "% homology”.
  • % homology For example, using standard software that calculates parameters such as score, identity and similarity, in particular BLAST 2.0, or by hybridization experiments used under defined stringent conditions Appropriate hybridization conditions, which are defined within the scope of the art, are well known to those skilled in the art, and are well known to those skilled in the art (e.g. J.
  • stringent conditions refers to conditions that enable specific hybridization between polynucleotides. For example, such conditions are described specifically in the literature (eg, J. Sambrook et al., Homology).
  • the stringent conditions can be adjusted to confirm homology.
  • low stringency hybridization conditions corresponding to Tm values of 55 ° C.
  • 5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 0.25% milk, and formamide free or 30% formamide, 5XSSC, 0.5% SDS conditions
  • Mild stringency hybridization conditions correspond to high Tm values, for example 40% formamide with 5X or 6XSSC can be used.
  • High stringency hybridization conditions correspond to the highest Tm values, for example 50% formamide, 5X or 6XSSC conditions may be used. However, it is not limited to the above example.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatch between bases is possible depending on the stringency of the hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases that can hybridize with each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the present application may also include isolated nucleic acid fragments that are complementary to the entire sequence as well as substantially similar nucleic acid sequences.
  • polynucleotides having homology can be detected using hybridization conditions including hybridization steps at Tm values of 55 ° C. and using the conditions described above.
  • the Tm value may be 60 ° C, 63 ° C or 65 ° C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
  • DNA RNA
  • DNA DNA
  • mismatch positions can be even more important and the length of the oligonucleotide can determine its specificity (Sambrook et al., Supra, 11.7-11.8 Reference).
  • polynucleotides can be detected using hybridization conditions that are lower than 500 mM salt and include a hybridization step of at least 37 ° C., and a wash step in 2 ⁇ SSPE of at least 63 ° C.
  • the hybridization conditions may comprise a hybridization step lower than 200 mM salt and at least 37 ° C.
  • the hybridization conditions may include 63 ° C. and 2 ⁇ SSPE in both hybridization and washing steps.
  • the length of the hybridizing nucleic acid can be, for example, at least about 10 nucleotides, 15 nucleotides, 20 nucleotides, or at least 30 nucleotides.
  • those skilled in the art can adjust the temperature and wash solution salt concentration as needed depending on factors such as the length of the probe.
  • the fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application may be an enzyme derived from the genus Thermotoga , and specifically, the thermotoga neapolitana neapolitana ) may be an enzyme derived from, but is not limited thereto.
  • the present application provides a nucleic acid encoding the fructose-6-phosphate-3-epimerase.
  • the present application provides a transformant comprising a nucleic acid encoding a fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application.
  • the term "transformation” refers to introducing a vector comprising a nucleic acid encoding a target protein into a host cell so that the protein encoding the nucleic acid in the host cell can be expressed.
  • the transformed nucleic acid may include all of them, as long as they can be expressed in the host cell, regardless of whether they are inserted into or located outside the chromosome of the host cell.
  • the nucleic acid also includes DNA and RNA encoding the target protein.
  • the nucleic acid may be introduced in any form as long as it can be introduced into and expressed in a host cell.
  • the nucleic acid may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all the elements necessary for its expression.
  • the expression cassette may include a promoter, a transcription termination signal, a ribosomal binding site, and a translation termination signal, which are typically operably linked to the nucleic acid.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self replication.
  • the nucleic acid may be introduced into the host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked means that the gene sequence and the promoter sequence to initiate and mediate the transcription of the nucleic acid encoding the target protein of the present application.
  • Methods for transforming a vector of the present application include any method for introducing nucleic acids into cells, and can be carried out by selecting appropriate standard techniques as known in the art depending on the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, and Lithium acetate-DMSO method and the like, but is not limited thereto.
  • electroporation calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, and Lithium acetate-DMSO method and the like, but is not limited thereto.
  • the host cell it is preferable to use a host having high DNA introduction efficiency and high expression efficiency of the introduced DNA.
  • the host cell may be E. coli, but is not limited thereto.
  • the present application provides a microorganism expressing the fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application, the fructose-6-phosphate-3-epimerase of the present application or fructose-6 of the present application. It provides a composition for producing allulose comprising a culture of a microorganism expressing phosphate-3-epimerase.
  • the composition for producing allulose of the present application is a microorganism expressing an enzyme involved in the allulose production route of the present application (see FIG. 1), an microorganism expressing an enzyme involved in the allulose production route of the present application, or the production of allulose of the present application It may further comprise a culture of microorganisms expressing enzymes involved in the pathway.
  • this is only an example, if allulose can be produced using the fructose-6-phosphate-epimerase of the present application, the enzymes included in the composition for producing allulose of the present application and the substrate used for the production of allulose are limited. It doesn't work.
  • Composition for producing allulose of the present application is allulose-6-phosphate phosphatase (allulose-6-phosphate phosphatase), microorganisms expressing the allulose-6-phosphate dephosphorase or the allulose-6-phosphate dephosphorase It may further comprise a culture of microorganisms expressing phosphorylation enzyme.
  • composition for producing allulose of the present application may comprise (a) (i) starch, maltodextrin, sucrose or a combination thereof, glucose, glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate, or fructose-6-phosphate; (ii) phosphate; (iii) allulose-6-phosphate dephosphorase; (iv) glucose-6-phosphate-isomerase; (v) phosphoglucomutase or glucose phosphatase; And / or (vi) ⁇ -glucan phosphorylase, starch phosphorylase, maltodextrin phosphorylase, sucrose phosphorylase, ⁇ -amylase, pullulanase, isoamylase, glucoamylase or sucrase ; Or (b) additionally a culture of a microorganism expressing the enzyme of item (a) or a microorganism expressing the enzyme of item (a), but is not limited thereto.
  • starch / maltodextrin phosphorylase (EC 2.4.1.1) and ⁇ -glucan phosphorylase of the present application are phosphorylated transfer of phosphate to glucose to glucose from starch or maltodextrin Any protein that has activity to produce -1-phosphate may be included.
  • Sucrose phosphorylase (EC 2.4.1.7) of the present application may include any protein as long as it has an activity of phosphorylating and transferring phosphate to glucose to produce glucose-1-phosphate from sucrose.
  • Starch liquor glycosylating enzymes of the present application ⁇ -amylase (EC 3.2.1.1), pullulanse (EC 3.2.1.41), glucoamylase (EC 3.2.1.3) and isoamylase May include any protein as long as the protein has an activity of converting starch or maltodextrin into glucose.
  • Sucrase (EC 3.2.1.26) of the present application may include any protein as long as it has a protein converting sucrose to glucose.
  • the phosphoglucomutase (EC 5.4.2.2) of the present application may include any protein as long as the protein has an activity of converting glucose-1-phosphate to glucose-6-phosphate.
  • Glucose kinase may include any protein as long as the protein has the activity of converting the glucose to glucose-6-phosphate.
  • the glucose kinase may be a polyphosphate dependent glucose kinase, more specifically Deinococcus of amino acid SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 polyphosphate-dependent glucose kinase from geothermalis or Anaerolinea of amino acid SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8 thermophila derived polyphosphate-dependent glucose kinase.
  • Glucose-6-phosphate-isomerase of the present application may include any protein as long as it has an activity of converting glucose-6-phosphate to fructose-6-phosphate.
  • the allulose-6-phosphate dephosphatase of the present application may include any protein as long as the protein has an activity for converting allulose-6-phosphate to allulose. More specifically, the allulose-6-phosphate dephosphatase may be a protein having the activity of irreversibly converting allulose-6-phosphate to allulose.
  • the present application provides a fructose-6-phosphate-3-epimerase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in fructose-6-phosphate, the fructose-6-phosphate-
  • the fructose-6-phosphate is allulose-6-phosphate by contacting a culture of microorganisms expressing 3-epimerase or microorganisms expressing said fructose-6-phosphate-3-epimerase. It provides a method for producing allulose comprising the step of converting).
  • allulose-6-phosphate dephosphatase to allulose-6-phosphate
  • Contacting a culture of the microorganism expressing the allulose-6-phosphate dephosphatase or the microorganism expressing the allulose-6-phosphate dephosphatase, thereby converting the allulose-6-phosphate to allulose It may further comprise a step.
  • the preparation method of the present application before the step of converting the fructose-6-phosphate of the present application to allulose-6-phosphate, glucose-6-phosphate-isomerase to glucose-6-phosphate (Glucose-6-phosphate)
  • Glucose-6-phosphate glucose-6-phosphate-isomerase to glucose-6-phosphate
  • Contacting a culture of the microorganism expressing the glucose-6-phosphate-isomerase or the microorganism expressing the glucose-6-phosphate-isomerase to convert the glucose-6-phosphate to fructose-6-phosphate It may further comprise a step.
  • the preparation method of the present application before the step of converting glucose-6-phosphate of the present application to fructose-6-phosphate, phosphoglucomutase to glucose-1-phosphate (Glucose-1-phosphate), the phospho Contacting the culture of the microorganism expressing glucomutase or the microorganism expressing the phosphoglucomutase, may further comprise converting the glucose-1-phosphate to glucose-6-phosphate.
  • the preparation method of the present application is a glucose kinase, a microorganism expressing the glucose kinase in glucose or the glucose kinase before the step of converting the glucose-6-phosphate of the present application to fructose-6-phosphate Contacting the culture of microorganisms expressing phosphate, and phosphate, the glucose may be further converted to glucose-6-phosphate.
  • the preparation method of the present application is a starch, maltodextrin, sucrose or a combination of ⁇ -glucan phosphorylase, starch phospho before the step of converting glucose-1-phosphate of the present application to glucose-6-phosphate Lilase, maltodextrin phosphorylase or sucrose phosphorylase; Microorganisms expressing the phosphorylase; Or contacting the culture of the microorganism expressing the phosphorylase, and phosphate to convert the starch, maltodextrin, sucrose or a combination thereof to glucose-1-phosphate.
  • the preparation method of the present application may include ⁇ -amylase, pullulanase, glucoamylase, sucrase, or starch, maltodextrin, sucrose, or a combination thereof, before the step of converting the glucose of the present application into glucose-6-phosphate.
  • Isoamylase Microorganisms expressing the amylase, pullulase or sucrase; Or converting the starch, maltodextrin, sucrose, or a combination thereof into glucose by contacting the amylase, flulanase or sucrase with the culture of the microorganism.
  • the production method of the present application is a culture of microorganisms expressing 4- ⁇ -glucanotransferase, the 4- ⁇ -glucanotransferase or microorganisms expressing the 4- ⁇ -glucanotransferase.
  • By contacting may further comprise the step of converting the glucose into starch, maltodextrin or sucrose.
  • the 'contacting' of the present application may be carried out for pH 5.0 to 10.0, 50 °C to 90 °C, and / or 1 minute to 24 hours.
  • the contact of the present application is pH 5.0 to 9.0, pH 5.0 to 8.0, pH 5.0 to 7.0, pH 5.0 to 6.0, pH 6.0 to 10.0, pH 6.0 to 9.0, pH 6.0 to 8.0, pH 6.0 to 7.0, pH 7.0 To 10.0, pH 7.0 to 9.0, pH 7.0 to 8.0, pH 8.0 to 10.0, pH 8.0 to 9.0, or pH 9.0 to 10.0.
  • the contact of the present application may be carried out at 55 °C to 90 °C, 60 °C to 90 °C, 60 °C to 75 °C, 65 °C to 75 °C, or 60 °C to 70 °C.
  • the contact of the present application is 1 minute to 12 hours, 1 minute to 6 hours, 1 minute to 3 hours, 1 minute to 1 hour, 5 minutes to 24 hours, 5 minutes to 12 hours, 5 minutes to 6 hours, 5 It can be carried out for minutes to 3 hours, 5 minutes to 1 hour, 10 minutes to 24 hours, 10 minutes to 12 hours, 10 minutes to 6 hours, 10 minutes to 3 hours, or 10 minutes to 1 hour.
  • the present application is directed to starch, maltodextrin, sucrose, or a combination thereof, and to phosphate: (a) allulose-6-phosphate dephosphatase; Fructose-6-phosphate-3-epimerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID 1; Glucose-6-phosphate-isomerase; Phosphoglucomutase or glucose phosphatase; And ⁇ -glucan phosphorylase, starch phosphorylase, maltodextrin phosphorylase, sucrose phosphorylase, ⁇ -amylase, pullulanase, isoamylase, glucoamylase or sucrase; Or (b) contacting the microorganism expressing the enzyme of item (a) or a culture of the microorganism.
  • thermophilic microorganism Thermotoga ( Thermotoga ), was used to identify novel heat-resistant fructose-6-phosphate-3-epimerase. neapolitana ) genes were isolated and recombinant expression vectors and transforming microorganisms were prepared.
  • Thermomoto registered with Genbank, selects the gene fp3e, which is expected to be fructose-6-phosphate-3-epimerase, against its Neapolitana gene sequences, and its amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and nucleotide sequence ( Based on the information of SEQ ID NO: 2), a forward primer (SEQ ID NO: 3) and a reverse primer (SEQ ID NO: 4) were designed and synthesized.
  • Thermomoto made a polymerase chain reaction (PCR) with Neapolitana or chromosomal DNA (genomic DNA) as a template, denatured at 95 ° C for 30 seconds, annealed at 55 ° C for 30 seconds and 2 at 68 ° C. The reaction was carried out for 25 minutes, and the reactions were performed under 25 repeated conditions. Restriction enzymes Nde and Xho were used to insert a recombinant expression vector named CJ_tn_fp3e by inserting into the plasmid vector pET21a (Novagen) for expression of E. coli. CJ_tn_fp3e was transformed into E.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Nde and Xho were used to insert a recombinant expression vector named CJ_tn_fp3e by inserting into the plasmid vector pET21a (Novagen) for expression of E. coli.
  • CJ_tn_fp3e was
  • coli BL21 (DE3) strain by a conventional transformation method (see Sambrook et al. 1989) to prepare a microorganism transformed with a recombinant vector comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and E. coli BL21 It was named (DE3) / CJ_tn_fp3e.
  • E. coli BL21 (DE3) / CJ_tn_fp3e inoculated to a culture tube containing 5 ml LB broth and shaken at 37 °C at 600 nm until the absorbance to be 2.0
  • the seed culture was carried out in the incubator. Thereafter, the seed cultured culture was inoculated into a culture flask containing an LB liquid medium to carry out the main culture. Then, when the absorbance at 600 nm became 2.0, 1 mM IPTG was added to induce expression production of FP3E.
  • the seed culture and the main culture were carried out at a stirring speed of 200 rpm, temperature 37 °C.
  • the culture solution was centrifuged at 8,000 ⁇ g at 4 ° C. for 20 minutes to recover the cells.
  • Cells recovered with 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) buffer were washed twice, suspended in the same buffer, and disrupted with an ultrasonic cell disruptor.
  • Cell debris was centrifuged at 13,000 ⁇ g for 20 minutes at 4 ° C. and only the supernatant was taken and FP3E was purified from the supernatant using His-tag affinity chromatography. Purified recombinant enzyme solution was used for the characterization of the enzyme after dialysis with 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) buffer.
  • the molecular weight was confirmed through SDS-PAGE analysis, and as a result, the molecular weight of the purified FP3E was found to be about 25 kDa (indicated by FIG. 2, E).
  • fructose-6-phosphate was suspended in 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer, and 0.1 unit / ml of Purified FP3E was added and reacted at 70 ° C for 1 hour.
  • HPLC analysis was carried out using an Aminex HPX-87C (Bio-rad Co., Ltd.) column with a flow rate of 0.5 ml / min as a mobile phase at 80 ° C., and fructose and allulose were detected by a Refractive Index Detector.
  • FP3E showed a maximum activity at pH 7.0-8.0, it was confirmed that the activity of more than 70% compared to the maximum activity in a very wide range over pH 5.0-10.0 (Fig. 4).
  • FP3E showed a maximum activity at pH 7.0-8.0, it was confirmed that the activity of more than 70% compared to the maximum activity in a very wide range over pH 5.0-10.0 (Fig. 4).
  • each metal ion NaSO 4 , CuSO 4 , MnSO 4
  • 50 mM fructose-6-phosphate suspended in 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) buffer.
  • CaCl 2, ZnSO 4, MgSO 4, MgCl 2, the FeSO 4, NaCl, LiCl and KCl was added to a final concentration of 0.5 mM.
  • 0.1 unit / ml of FP3E treated with 10 mM EDTA and dialyzed was added thereto, and reacted at 70 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the cellulose was reacted under the same conditions as in Example 3, followed by quantitative analysis of allulose using HPLC.

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Abstract

본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산-3-에피머화 효소 (fructose-6-phosphate-3-epimerase), 상기 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 암호화하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 형질전환체에 관한 것이다. 또한, 본 출원은 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 포함하는 알룰로스(allulose) 생산용 조성물 및 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 이용한 알룰로스 제조방법에 관한 것이다.

Description

신규 내열성 과당-6-인산-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법
본 출원은 과당-6-인산-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법에 관한 것이다.
싸이코스-3-에피머화 효소(D-psicose-3-epimerase, EC 5.1.3.30) 및 타가토스-3-에피머화 효소(D-tagatose-3-epimerase, EC 5.1.3.31)는 과당(D-fructose)을 3-에피머화(3-epimerization, 3번 탄소 에피머화)함으로써 알룰로스를 생산할 수 있는 효소로 알려져 있다. 상기 효소를 이용하여 단일 효소 반응으로 과당에서 알룰로스를 생산하는 경우, 기질인 과당과 산물인 알룰로스 간에 일정 수준의 반응평형(reaction equilibrium)이 존재한다(산물/기질 = 약 20% 내지 35%). 따라서, 상기 단일 효소 반응을 이용하여 고순도의 알룰로스를 제조하는 경우, 반응 결과물에서 고농도의 과당을 분리하여 제거하는 추가 정제공정이 요구된다.
한편, Chan 등(2008. Biochemistry. 47:9608-9617)은 과당-6-인산(D-fructose-6-phosphate) 및 알룰로스-6-인산(D-allulose-6-phosphate)에 대해서 3-에피머화 반응을 수행할 수 있는 Streptococcus pyogenes 유래의 리블로스-5-인산-3-에피머화 효소(D-ribulose-5-phosphate-3-epimerase, EC 5.1.3.1) 및 E. coli 유래의 알룰로스-6-인산-3-에피머화 효소(D-allulose 6-phosphate-3-epimerase, EC 5.1.3.-)를 보고한 바 있으나, 상기 효소들은 내열성을 갖지 못하여 산업적으로 이용이 불가능한 문제점이 있다.
본 발명자들은 경제적이면서 산업적으로 알룰로스로의 전환율을 높일 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력하였다. 그 결과, 경제적 원료인 수크로스, 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당(glucose) 또는 포도당-1-인산(glucose-1-phosphate), 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate) 및 과당-6-인산으로의 전환을 거쳐 알룰로스-6-인산을 생산하는 경우, 이후 비가역 반응경로를 수행하는 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소(allulose-6-phosphate phosphatase)를 이용하여 알룰로스를 생산할 수 있어, 알룰로스 생산 경로에 관여하는 복수의 효소를 동시에 사용 가능한 동시효소반응(one-pot enzymatic conversions)으로 알룰로스를 생산할 수 있고, 알룰로스로의 전환율을 현저히 높일 수 있음에 착안하여, 상기 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 경로에 적용할 수 있는 신규한 내열성 효소를 발굴함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산-3-에피머화 효소(fructose-6-phosphate-3-epimerase)를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 암호화하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 알룰로스(allulose) 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 이용한 알룰로스 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 내열성 과당-6-인산-3-에피머화 효소는 내열성이 있어 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 경로를 산업적으로 수행할 수 있고, 경제적인 원료를 사용하여 알룰로스 합성 경로의 진행을 가능하게 하며, 비가역 반응 경로인 알룰로스-6-인산 탈인산화 반응에 의하여 알룰로스 생산을 가능하게 하는바, 알룰로스로의 전환율을 현저히 높일 수 있다.
또한, 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 이용한 알룰로스 제조방법은 알룰로스로의 전환율 상승에 의하여 반응 결과물이 고농도의 알룰로스를 포함하여 분리정제 공정을 단순화 또는 제거할 수 있는바, 제조 방법이 간단하면서도 경제적인 이점이 있다.
도 1은 전분(예컨대, 말토덱스트린), 수크로스 또는 포도당으로부터 알룰로스를 제조할 수 있는 반응 경로를 나타낸 것이다.
도 2는 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소(E: FP3E)의 분자량을 단백질 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석한 결과를 나타낸다.다. M은 단백질 크기 측정 마커(size marker)이다.
도 3은 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소의 과당-6-인산에서 알룰로스-6-인산으로의 전환 활성을 확인한 것이다.
도 4는 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소의 완충용액 및 pH 범위에 따른 활성을 확인한 것이다.
도 5는 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소의 온도에 따른 활성을 확인한 것이다.
도 6은 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소의 금속 이온 첨가에 따른 활성을 확인한 것이다.
이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 하나의 양태로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산-3-에피머화 효소(fructose-6-phosphate-3-epimerase)를 제공한다.
또한, 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산-3-에피머화 효소와 상응하는 활성을 가지는 단백질이라면 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또한 본 출원의 범위 내에 속한다.
나아가, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 과당-6-인산-3-에피머화 효소는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있고, 또한 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다. 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 본 출원의 범위에 포함될 수 있음은 자명하다.
상기에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다. 상기에서 용어 “엄격한 조건”이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다.
본 출원에서 상기 엄격한 조건은 상동성을 확인하기 위해 조절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 간의 상동성을 확인하기 위하여, 55℃의 Tm 값에 대응하는, 낮은 엄격도의 혼성화 조건이 이용될 수 있는데, 예를 들어, 5XSSC, 0.1% SDS, 0.25% 밀크, 및 무 포름아미드; 또는 30% 포름아미드, 5XSSC, 0.5% SDS 조건이 이용될 수 있다. 온화한 엄격도의 혼성화 조건은 높은 Tm 값에 대응하며, 예를 들어, 5X 또는 6XSSC를 갖는 40% 포름아미드가 사용될 수 있다. 높은 엄격도의 혼성화 조건은 가장 높은 Tm 값에 대응하며, 예를 들어, 50% 포름아미드, 5X 또는 6XSSC 조건이 이용될 수 있다. 다만, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다. 두 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 또는 상동성 정도가 더 클수록, 그러한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 하이브리드에 대한 Tm 값은 더 커질 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 혼성화의 상대적 안정성(더 높은 Tm 값에 대응하는)은 하기 순서로 감소한다: RNA : RNA, DNA : RNA, DNA : DNA. 길이가 100 뉴클레오티드 보다 큰 하이브리드에 대하여, Tm 값 계산 수식은 공지되어 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51 참조). 더 짧은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 대하여, 미스매치 위치는 보다 더 중요할 수 있고, 올리고뉴클레오티드의 길이가 그 특이성을 결정할 수 있다(Sambrook et al., supra, 11.7-11.8 참조).
구체적으로, 폴리뉴클레오티드는 500 mM 염보다 낮고 적어도 37℃의 혼성화 단계, 및 적어도 63℃의 2XSSPE에서의 세척 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하여 탐지될 수 있다. 상기 혼성화 조건은 200 mM 염보다 낮고 적어도 37℃의 혼성화 단계를 포함할 수 있다. 또는 상기 혼성화 조건은 혼성화 및 세척 단계 모두에서 63℃ 및 2XSSPE를 포함할 수 있다.
혼성화 핵산의 길이는 예를 들면, 적어도 약 10 뉴클레오티드, 15 뉴클레오티드, 20 뉴클레오티드, 또는 적어도 30 뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도를 프로브의 길이와 같은 요소에 따라 필요할 경우 조절할 수 있다.
본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소는 써모토가(Thermotoga) 속 유래의 효소일 수 있으며, 구체적으로 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 유래의 효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원은 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 핵산 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 핵산은 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 대장균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소, 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 발현하는 미생물 또는 본 출원의 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 포함하는 알룰로스 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 알룰로스 생산용 조성물은, 본 출원의 알룰로스 제조 경로(도 1 참고)에 관여하는 효소, 본 출원의 알룰로스 제조 경로에 관여하는 효소를 발현하는 미생물, 또는 본 출원의 알룰로스 제조 경로에 관여하는 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로 본 출원의 과당-6-인산-에피머화 효소를 이용하여 알룰로스를 생산할 수 있다면, 본 출원의 알룰로스 생산용 조성물에 포함되는 효소 및 알룰로스 생산에 이용되는 기질이 제한되지 않는다.
본 출원의 알룰로스 생산용 조성물은 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소(allulose-6-phosphate phosphatase), 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 알룰로스 생산용 조성물은 (a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 포도당, 포도당-1-인산, 포도당-6-인산, 또는 과당-6-인산; (ii) 포스페이트(phosphate); (iii) 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소; (iv) 포도당-6-인산-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및/또는 (vi) α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 전분/말토덱스트린 포스포릴라아제(starch/maltodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.1) 및 α-글루칸 포스포릴라아제는 포스페이트(phosphate)를 포도당에 인산화 전이시켜 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7)는 포스페이트를 포도당에 인산화 전이시켜 수크로스로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 전분 액당화 효소인 α-아밀라아제(α-amylase, EC 3.2.1.1), 풀루란아제(pullulanse, EC 3.2.1.41), 글루코아밀라아제(glucoamylase, EC 3.2.1.3) 및 이소아밀라아제(isoamylase)는 전분 또는 말토덱스트린을 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 수크라제(sucrase, EC 3.2.1.26)는 수크로스를 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2)는 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 포도당인산화효소(glucokinase)는 포도당에 인산을 전이시켜 포도당-6-인산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당인산화효소는 폴리포스페이트 의존형 포도당인산화 효소일 수 있으며, 보다 구체적으로 아미노산 서열번호 5 및 염기 서열번호 7의 Deinococcus geothermalis 유래 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 또는 아미노산 서열번호 6 및 염기 서열번호 8의 Anaerolinea thermophila 유래 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소일 수 있다. 본 출원의 포도당-6-인산-이성화효소는 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소는 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소는 비가역적으로 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환시키는 활성을 갖는 단백질일 수 있다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산-3-에피머화 효소, 상기 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산(allulose-6-phosphate)으로 전환하는 단계를 포함하는 알룰로스 제조방법을 제공한다.
본 출원의 제조방법은 본 출원의 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 단계 이후, 알룰로스-6-인산(allulose-6-phosphate)에 알룰로스-6-인산 탈인산화효소, 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 포도당-6-인산-이성화효소, 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당(Glucose)에 포도당 인산화 효소, 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 상기 아밀라아제, 플루란아제 또는 수크라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 아밀라아제, 플루란아제 또는 수크라아제를 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 제조방법은 포도당에 4-α-글루카노트랜스퍼라아제, 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원의 제조방법에 있어서, 본 출원의 '접촉'은 pH 5.0 내지 10.0, 50℃ 내지 90℃, 및/또는 1분 내지 24시간 동안 실시할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 9.0, pH 5.0 내지 8.0, pH 5.0 내지 7.0, pH 5.0 내지 6.0, pH 6.0 내지 10.0, pH 6.0 내지 9.0, pH 6.0 내지 8.0, pH 6.0 내지 7.0, pH 7.0 내지 10.0, pH 7.0 내지 9.0, pH 7.0 내지 8.0, pH 8.0 내지 10.0, pH 8.0 내지 9.0, 또는 pH 9.0 내지 10.0에서 실시할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 55℃ 내지 90℃, 60℃ 내지 90℃, 60℃ 내지 75℃, 65℃ 내지 75℃, 또는 60℃ 내지 70℃에서 실시할 수 있다. 더불어, 본 출원의 접촉은 1분 내지 12시간, 1분 내지 6시간, 1분 내지 3시간, 1분 내지 1시간, 5분 내지 24시간, 5분 내지 12시간, 5분 내지 6시간, 5분 내지 3시간, 5분 내지 1시간, 10분 내지 24시간, 10분 내지 12시간, 10분 내지 6시간, 10분 내지 3시간, 또는 10분 내지 1시간 동안 실시할 수 있다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 및 포스페이트에 (a) 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산-3-에피머화 효소; 포도당-6-인산-이성화효소; 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 알룰로스 제조방법을 제공한다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1: 과당-6-인산-3- 에피머화 효소의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물의 제조
신규 내열성의 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 발굴하기 위해 호열성 미생물인 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana)에서 유전자를 분리하였고, 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.
구체적으로, Genbank에 등록된 써모토가 네아폴리타나 유전자 서열들을 대상으로 과당-6-인산-3-에피머화 효소로 예상되는 유전자 fp3e를 선발하고, 이의 아미노산 서열(서열번호 1)과 염기 서열(서열번호 2) 정보를 바탕으로 정방향 프라이머(서열번호 3) 및 역방향 프라이머(서열번호 4)를 고안하여 합성하였다. 상기 합성된 프라이머를 이용하여 써모토가 네아폴리타나 염색체 DNA(genomic DNA)를 주형으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 95℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링　및 68℃에서 2분 동안 중합하였고　상기 반응들은　25회 반복한 조건을　사용하였으며, 제한효소 Nde 및 Xho을 사용하여 대장균 발현용 플라스미드 벡터 pET21a(Novagen사)에 삽입하여 CJ_tn_fp3e라 명명된 재조합 발현벡터를 제작하였다. CJ_tn_fp3e는 통상적인 형질전환 방법(참조: Sambrook et al. 1989)으로 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질 전환하여 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제조하고 E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e로 명명하였다.
상기 E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e 균주를 부다페스트 조약 하에 2016년 6월 23일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11848P를 부여 받았다.
실시예 2: 재조합 효소의 제조
재조합 효소(이하, FP3E)를 제조하기 위해, E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e를 LB 액체배지 5 ml를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 이후, 종균 배양된 배양액을 LB 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 이후, 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때 1 mM IPTG를 첨가하여 FP3E의 발현생산을 유도하였다. 상기 종균 배양 및 본 배양은 교반 속도 200 rpm, 온도 37℃에서 실시하였다. 배양 완료 후, 배양액을 8,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액으로 회수된 균체를 2회 세척하고, 동일 완충용액으로 현탁 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액 만을 취하고, His-tag 친화 크로마토그래피를 사용하여 상기 상등액으로부터 FP3E를 정제하였다. 정제된 재조합 효소액은 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액으로 투석 후 효소의 특성 분석에 사용하였다.
SDS-PAGE 분석을 통하여 분자량을 확인하였으며, 그 결과 상기 정제된 FP3E의 분자량은 약 25 kDa인 것을 확인하였다(도 2, E로 표시).
실시예 3: FP3E의 활성 확인
FP3E의 과당-6-인산에서 알룰로스-6-인산으로의 전환 활성 분석을 위하여 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액에 50 mM 과당-6-인산을 현탁하고, 이에 0.1 unit/ml의 정제된 FP3E를 첨가하여 70℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
현재시점에서 알룰로스-6-인산 표준물질이 존재하지 않아 알룰로스-6-인산 생성 여부의 측정이 불가능한 바, 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소(alullose-6-phosphate phosphatase)인 파이테이즈(phytase)를 사용하여 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환한 후 알룰로스의 생성 여부로 상기 전환 활성을 측정하였다. 구체적으로, 상기 반응 완료 후, 10 unit/ml 파이테이즈를 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 반응시켜 기질인 과당-6-인산과 산물인 알룰로스-6-인산을 모두 탈인산화 하였다. 이후, 과당 및 알룰로스를 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석은 Aminex HPX-87C(Bio-rad사) 컬럼을 사용하여 80℃에서 이동상으로 0.5 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며, 과당 및 알룰로스는 Refractive Index Detector로 검출하였다.
그 결과, FP3E의 반응 결과물에서 과당 및 알룰로스가 검출되었는바(도 3), FP3E가 과당-6-인산을 3-에피머화하여 알룰로스-6-인산을 생성하는 활성이 있음을 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 4: pH, 온도, 금속이온 첨가에 따른 FP3E의 활성 확인
4-1. pH에 따른 활성 확인
FP3E에 대한 pH 영향성을 조사하기 위하여, 다양한 pH의 50 mM 완충용액(pH 4.0-7.0, 시트르산 나트륨; pH 6.0-8.0, 인산 칼륨: pH 7.0-9.0, Tris-HCl)에 현탁된 50 mM 과당-6-인산에 0.1 unit/ml의 정제된 FP3E를 첨가하여 70℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, 실시예 3과 동일한 조건으로 파이테이즈와 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 알룰로스를 정량 분석하였다.
그 결과, FP3E는 pH 7.0-8.0에서 최대 활성을 보였고, pH 5.0-10.0에 걸친 매우 광범위한 범위에서 최대 활성 대비 70% 이상의 활성이 유지됨을 확인할 수 있었다(도 4).
실시예 4: pH, 온도, 금속이온 첨가에 따른 FP3E의 활성 확인
4-1. pH에 따른 활성 확인
FP3E에 대한 pH 영향성을 조사하기 위하여, 다양한 pH의 50 mM 완충용액(pH 4.0-7.0, 시트르산 나트륨; pH 6.0-8.0, 인산 칼륨: pH 7.0-9.0, Tris-HCl)에 현탁된 50 mM 과당-6-인산에 0.1 unit/ml의 정제된 FP3E를 첨가하여 70℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, 실시예 3과 동일한 조건으로 파이테이즈와 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 알룰로스를 정량 분석하였다.
그 결과, FP3E는 pH 7.0-8.0에서 최대 활성을 보였고, pH 5.0-10.0에 걸친 매우 광범위한 범위에서 최대 활성 대비 70% 이상의 활성이 유지됨을 확인할 수 있었다(도 4).
4-3. 금속 이온 첨가에 따른 활성 확인
금속 이온 첨가가 FP3E의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액에 현탁된 50 mM 과당-6-인산에 각각의 금속이온(NiSO4, CuSO4, MnSO4, CaCl2, ZnSO4, MgSO4, MgCl2, FeSO4, NaCl, LiCl 및 KCl)을 최종농도 0.5 mM로 첨가하였다. 이에, 금속 이온 제거를 위하여 10 mM EDTA를 처리하여 투석한 FP3E를 0.1 unit/ml 첨가하고, 70℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, 실시예 3과 동일 조건으로 파이테이즈와 반응시킨 다음, HPLC를 이용하여 알룰로스를 정량 분석하였다.
그 결과, FP3E는 Ca 및 Cu 이온 첨가 시 활성이 약간 증가였으나, 그 외 금속이온 첨가에 의한 효소활성 변화는 거의 없었다. 따라서 금속 요구성 효소가 아님을 확인할 수 있었다(도 6).
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2017006985-appb-I000001

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산-3-에피머화 효소(fructose-6-phosphate-3-epimerase).
  2. 제1항의 과당-6-인산-3-에피머화 효소를 암호화하는 핵산.
  3. 제2항의 핵산을 포함하는 형질전환체.
  4. 제1항의 과당-6-인산-3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 알룰로스(allulose) 생산용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소(allulose-6-phosphate phosphatase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 알룰로스 생산용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 알룰로스 생산용 조성물은,
    (a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합; (ii) 포스페이트 (phosphate); (iii) 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소; (iv) 포도당-6-인산-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 (vi) α-글루카노포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는
    (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 알룰로스 생산용 조성물.
  7. 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산-3-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산(allulose-6-phosphate)으로 전환하는 단계를 포함하는 알룰로스 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 방법은 상기 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 단계 이후, 알룰로스-6-인산에 알룰로스-6-인산 탈인산화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 알룰로스 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 방법은 상기 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate)에 포도당-6-인산-이성화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 알룰로스 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 알룰로스 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당(glucose)에 포도당 인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 알룰로스 제조방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루카노포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 알룰로스 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 알룰로스 제조방법.
  14. 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 pH 5.0 내지 10.0, 온도 50℃ 내지 90℃, 및/또는 1분 내지 24시간 동안 실시하는, 알룰로스 제조방법.
  15. 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 및 포스페이트에 (a) 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 과당-6-인산-3-에피머화 효소; 포도당-6-인산-이성화효소; 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 알룰로스 제조방법.
PCT/KR2017/006985 2016-06-30 2017-06-30 신규 내열성 과당-6-인산-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법 WO2018004308A2 (ko)

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