ES2950576T3 - Fructosa-6-fosfato-3-epimerasa resistente al calor novedosa y método para producir alulosa mediante su uso - Google Patents
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Abstract
La presente solicitud se refiere a una fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, un ácido nucleico que codifica la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa y un transformante que contiene el ácido nucleico. Además, la presente solicitud se refiere a una composición que comprende la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente solicitud para producir alulosa, y a un método para producir alulosa mediante el uso de la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente solicitud. . (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Fructosa-6-fosfato-3-epimerasa resistente al calor novedosa y método para producir alulosa mediante su uso
[Campo técnico]
La presente descripción se refiere a la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa y a un método para producir alulosa usando la misma.
[Técnica anterior]
La D-psicosa-3-epimerasa (EC 5.1.3.30) y la D-tagatosa-3-epimerasa (EC 5.1.3.31) se conocen como enzimas capaces de producir alulosa mediante 3-epimerización (epimerización C3) de D-fructosa. Cuando se produce alulosa a partir de fructosa mediante una única reacción enzimática usando las enzimas anteriores, existe un cierto nivel de equilibrio de reacción entre la fructosa (es decir, el sustrato) y la alulosa (es decir, el producto) (producto/sustrato = aproximadamente 20 % a 35 %). Por lo tanto, en el caso de producir alulosa de alta pureza usando la reacción enzimática única, se requiere un proceso de purificación adicional para aislar y eliminar una alta concentración de fructosa de la reacción resultante.
Por otro lado, Chan et.al. (2008. Biochemistry. 47:9608-9617) describieron la D-ribulosa-5-fosfato-3-epimerasa derivada de Streptococcuspyogenes (EC 5.1.3.1) y la D-alulosa-6-fosfato-3-epimerasa derivada de E. coli (EC 5.1.3.-) que son capaces de llevar a cabo la 3-epimerización de D-fructosa-6-fosfato y D-alulosa-6-fosfato; sin embargo, estas enzimas no son termoestables y, por lo tanto, no se pueden usar industrialmente.
[Descripción]
[Problema técnico]
Los presentes inventores han realizado grandes esfuerzos para desarrollar un método que pueda aumentar económica e industrialmente la velocidad de conversión en alulosa. Como resultado, cuando la alulosa-6-fosfato se produce a través de la conversión de sacarosa, almidón o maltodextrina, que son materias primas económicas, en glucosa o glucosa-1-fosfato, glucosa-6-fosfato y fructosa-6-fosfato, se descubrió que la alulosa se puede producir usando alulosa-6-fosfato fosfatasa implicada en una ruta de reacción irreversible. Por lo tanto, considerando que es posible producir alulosa con conversiones enzimáticas en un solo recipiente, en las que se puede usar simultáneamente una pluralidad de enzimas involucradas en la ruta de producción de alulosa, y que la velocidad de conversión a alulosa se puede aumentar notablemente, los presentes inventores han completado la presente descripción descubriendo una nueva enzima termoestable que se puede aplicar a la ruta para convertir la fructosa-6-fosfato en alulosa-6-fosfato.
[Solución técnica]
La presente invención se refiere al uso de una fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1 para producir alulosa.
La presente invención también se refiere al uso de una composición para producir alulosa, que comprende fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del dicho microorganismo.
La presente invención también se refiere a una composición para su uso en la producción de alulosa que comprende la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del dicho microorganismo, y además comprende alulosa-6-fosfato fosfatasa, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del dicho microorganismo.
La presente invención también se refiere a un método para producir alulosa, que comprende: convertir fructosa-6-fosfato en alulosa-6-fosfato haciendo reaccionar la fructosa-6-fosfato con fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo.
La presente invención también se refiere a un método para producir alulosa, que comprende hacer reaccionar almidón, maltodextrina, sacarosa, o una combinación de estos, y fosfato con (a) alulosa-6-fosfato fosfatasa; fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1; glucosa-6-fosfato isomerasa; fosfoglucomutasa o glucoquinasa; y a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa, sacarosa fosforilasa, a-amilasa, pululanasa, isoamilasa, glucoamilasa o sacarasa; o (b) un microorganismo que expresa alulosa-6-fosfato fosfatasa o un cultivo del microorganismo; un microorganismo que expresa fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1 o un cultivo del microorganismo; un microorganismo que expresa glucosa-6-fosfato isomerasa o un cultivo del
microorganismo; un microorganismo que expresa fosfoglucomutasa o glucoquinasa, o un cultivo del microorganismo; y un microorganismo que expresa a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa, sacarosa fosforilasa, a-amilasa, pululanasa, isoamilasa, glucoamilasa o sacarasa, o un cultivo del microorganismo.
Además, un objeto de la presente descripción puede ser proporcionar fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1.
Otro objeto de la presente descripción puede ser proporcionar un ácido nucleico que codifica la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción.
Otro objeto adicional de la presente descripción puede ser proporcionar un transformante que comprende el ácido nucleico que codifica la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción.
Otro objeto adicional de la presente descripción puede ser proporcionar una composición para producir alulosa, que comprende la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción, un microorganismo que expresa la misma o un cultivo del microorganismo.
Otro objeto adicional de la presente descripción puede ser proporcionar un método para producir alulosa usando la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción.
[Efectos ventajosos]
Dado que la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa termoestable de la presente descripción es termoestable, puede usarse para explotar la ruta para convertir fructosa-6-fosfato en alulosa-6-fosfato industrialmente, es posible proceder usando la ruta para sintetizar alulosa debido al uso de materias primas económicas, y la producción de alulosa es posible debido a la desfosforilación de alulosa-6-fosfato, que es una ruta de reacción irreversible; por lo tanto, la velocidad de conversión a alulosa puede aumentarse notablemente.
De forma adicional, en el método para producir alulosa usando la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción, el proceso de aislamiento/purificación puede simplificarse o eliminarse porque el resultado de la reacción incluye una alta concentración de alulosa debido al aumento en la velocidad de conversión en alulosa y, por lo tanto, el método de producción es ventajoso porque es simple y económico.
[Breve descripción de los dibujos]
La Figura 1 muestra la ruta de reacción capaz de producir alulosa a partir de almidón (por ejemplo, maltodextrina), sacarosa o glucosa.
La Figura 2 muestra los resultados del análisis del peso molecular de la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa (E: FP3E) de la presente descripción mediante electroforesis de proteínas (SDS-PAGE). “ M” representa un marcador de tamaño de proteína.
La Figura 3 es un gráfico que muestra la actividad de conversión de la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción de fructosa-6-fosfato a alulosa-6-fosfato.
La Figura 4 es un gráfico que muestra la actividad de la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción según la solución tamponadora y el intervalo de pH.
La Figura 5 es un gráfico que muestra la actividad de la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción según la temperatura.
La Figura 6 es un gráfico que muestra la actividad de la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción tras la adición de un ion de metal.
[Mejor modo]
A continuación, se describirá la presente descripción en detalle. Mientras tanto, cada una de las explicaciones y realizaciones ilustrativas descritas en la presente descripción puede aplicarse a otras explicaciones y realizaciones ilustrativas. Es decir, todas las combinaciones de diversos factores descritos en la presente descripción pertenecen al alcance de la presente descripción. Además, el alcance de la presente descripción no debe estar limitado por la descripción específica proporcionada a continuación en la presente descripción.
Con el fin de lograr el objeto de la presente descripción, un aspecto de la presente descripción proporciona fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident. 1.
De forma adicional, la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción puede comprender un polipéptido que tiene una homología con la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1 de al menos 80 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 %. Por ejemplo, es evidente que una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene deleción, modificación, sustitución o adición de algunas secuencias cae dentro del alcance de la presente descripción siempre que tenga la homología y exhiba la eficacia correspondiente a la de la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident. 1.
De forma adicional, siempre que una proteína tenga una eficacia correspondiente a la de la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción, que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.
1, no excluye una mutación que puede ocurrir por una adición de secuencia sin sentido en dirección 5’ (upstream) o en dirección 3' (downstream) de la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident. 1, una mutación de origen natural o una mutación silenciosa. Además, una proteína que incluye la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident. 1 también pertenece al alcance de la presente descripción.
Además, la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. 2, o la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa puede estar codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene una homología con la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. 2 de al menos 80 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 %, pero no se limita a esto. En base a la degeneración (o redundancia) de codones, es evidente que las proteínas que consisten en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident. 1, o los polinucleótidos que pueden traducirse en proteínas que tienen una homología con las proteínas anteriores, también pueden incluirse en el alcance de la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, el término “ homología” se refiere a un grado de coincidencia con una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos dada, y la homología puede expresarse como un porcentaje. En la presente descripción, una secuencia de homología que tiene una actividad que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos dada o secuencia de nucleótidos se expresa como “% de homología” . La secuencia de homología puede determinarse, por ejemplo, mediante software estándar, específicamente, BLAST 2.0, que calcula los parámetros tales como puntuación, identidad, similitud, etc., o comparando las secuencias en un experimento de hibridación Southern en condiciones rigurosas definidas, y definir condiciones de hibridación apropiadas forma parte del conocimiento de la técnica, y puede determinarse mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica (por ejemplo, J. Sambrooket.a/., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratorypress, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et.al., CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, Inc., Nueva York). Como se usa en la presente descripción, el término “condiciones rigurosas” se refiere a condiciones que se diseñan para permitir la hibridación específica entre polinucleótidos. Por ejemplo, estas condiciones se describen específicamente en la bibliografía (por ejemplo, J. Sambrook et al., supra).
En la presente descripción, las condiciones rigurosas pueden ajustarse para determinar la homología. Con el fin de confirmar la homología entre polinucleótidos, se pueden usar condiciones de hibridación de bajo rigor, correspondientes a un valor de Tm de 55 °C. Por ejemplo, condiciones de SSC 5X, SDS al 0,1 %, leche al 0,25 % y sin formamida; o se puede usar formamida al 30 %, SSC 5X y SDS al 0,5 %. Las condiciones de hibridación de bajo rigor corresponden a valores de Tm altos; por ejemplo, se puede usar formamida al 40 % y SSC 5X o 6X. Las condiciones de hibridación de elevado rigor corresponden a los valores de Tm más altos; por ejemplo, se puede usar formamida al 50 % y SSC 5X o 6X, pero las condiciones de hibridación no se limitan a los ejemplos anteriores.
La hibridación requiere que dos ácidos nucleicos tengan secuencias complementarias, aunque son posibles apareamientos erróneos entre bases dependiendo del grado de rigor de la hibridación. El término “complementario” se usa para describir la relación entre bases nucleotídicas que son capaces de hibridarse entre sí. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina. Por lo tanto, la presente descripción también puede incluir secuencias de ácido nucleico sustancialmente similares, así como fragmentos de ácido nucleico aislados complementarios a la secuencia completa.
Específicamente, el polinucleótido que tiene homología puede detectarse usando condiciones de hibridación que incluyen una etapa de hibridación a un valor de Tm de 55 °C y usando las condiciones descritas anteriormente. Además, el valor de Tm puede ser de 60 °C, 63 °C o 65 °C, pero no se limita a los mismos. Los expertos en la técnica pueden ajustar apropiadamente el valor de Tm según su propósito.
El grado de rigor apropiado de la hibridación de los polinucleótidos depende de la longitud y el grado de complementariedad de los polinucleótidos, y las variables son bien conocidas en la técnica. A medida que aumenta la similitud u homología entre los dos nucleótidos, aumenta el valor de Tm para los híbridos de los polinucleótidos que tienen dicha secuencia. La estabilidad relativa para la hibridación de los polinucleótidos (correspondiente a un valor de Tm más alto) disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. La fórmula de cálculo de los valores de Tm para los híbridos, cuya longitud es superior a 100 nucleótidos, se ha publicado en la técnica (Sambrook et al., supra, 9.50-9.51). Para la hibridación con polinucleótidos más cortos, por ejemplo, oligonucleótidos, la posición de desapareamiento puede
ser más importante, y la longitud de los oligonucleótidos puede determinar la especificidad de los mismos (Sambrook et al., supra, 11.7-11.8).
Específicamente, los polinucleótidos pueden detectarse usando las siguientes condiciones de hibridación: 1) una etapa de hibridación con una concentración de sal inferior a 500 mM y una temperatura de al menos 37 °C; y una etapa de lavado a al menos 63 0C con SSPE 2X; 2) una etapa de hibridación con una concentración de sal inferior a 200 mM y una temperatura de al menos 37 0C; o 3) etapas de hibridación y lavado a 63 0C con SSPE 2X.
La longitud del ácido nucleico de hibridación puede ser, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 nucleótidos, 15 nucleótidos, 20 nucleótidos o al menos 30 nucleótidos. Además, los expertos en la técnica pueden ajustar la temperatura y la concentración de sal de la solución de lavado según sea necesario dependiendo de factores tales como la longitud de la sonda.
La fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción puede ser una enzima derivada de Thermotoga sp., y específicamente puede ser una enzima derivada de Thermotoga neapolitana, pero no se limita a esta.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona un ácido nucleico que codifica la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción.
Otro aspecto adicional de la presente descripción proporciona una transformante que comprende el ácido nucleico que codifica la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, el término “transformación” se refiere a un proceso de introducción, en una célula huésped, de un vector que incluye un ácido nucleico que codifica una proteína diana, permitiendo así la expresión de la proteína codificada por el ácido nucleico en la célula huésped. Para el ácido nucleico transformado, no importa si el ácido nucleico transformado se inserta en el cromosoma de una célula huésped y se ubica en el mismo o si se ubica fuera del cromosoma, siempre que pueda expresarse en la célula huésped, y se incluyen ambos casos. De forma adicional, el ácido nucleico incluye a Dn y ARN que codifican la proteína diana. El ácido nucleico puede insertarse en cualquier forma siempre que pueda introducirse en una célula huésped y expresarse en la misma. Por ejemplo, el ácido nucleico puede introducirse en una célula huésped en forma de un casete de expresión, que es un constructo génico que incluye todos los elementos esenciales requeridos para la autoexpresión. El casete de expresión puede incluir convencionalmente un promotor unido operativamente al ácido nucleico, una señal de terminación de la transcripción, un dominio de unión al ribosoma y una señal de terminación de la traducción. El casete de expresión puede estar en forma de un vector de expresión capaz de autorreplicarse. De forma adicional, el ácido nucleico puede introducirse en una célula huésped tal como está y unirse operativamente a una secuencia esencial para su expresión en la célula huésped, pero el ácido nucleico no está limitado a ello.
De forma adicional, como se usa en la presente descripción, la expresión “ unido operativamente” se refiere a un enlace funcional entre una secuencia del promotor, que inicia y media la transcripción del ácido nucleico que codifica la proteína diana de la presente descripción, y la secuencia génica anterior.
El método de la presente descripción para transformar el vector incluye cualquier método para introducir un ácido nucleico en una célula, y puede llevarse a cabo seleccionando una técnica estándar adecuada conocida en la técnica según una célula huésped. Los ejemplos del método pueden incluir electroporación, precipitación con fosfato de calcio (CaPO4), precipitación con cloruro de calcio (CaCl2), microinyección, una técnica de polietilenglicol (PEG), una técnica de DEAE-dextrano, una técnica de liposomas catiónicos, una técnica de acetato de litio-DMSO, etc., pero no se limitan a las mismas.
Como célula huésped, es preferible usar un huésped que tenga una alta eficacia de introducción de ADN y una alta eficacia de expresión del ADN introducido. Por ejemplo, puede ser E. coli, pero no se limita a la misma.
Otro aspecto adicional de la presente descripción proporciona una composición para producir alulosa, que comprende la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción, un microorganismo que expresa la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción, o un cultivo del microorganismo que expresa la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción.
La composición de la presente descripción para producir alulosa puede también comprender una enzima implicada en la ruta de producción de alulosa (véase la Figura 1) de la presente descripción, un microorganismo que expresa la enzima implicada en la ruta de producción de alulosa de la presente descripción, o un cultivo del microorganismo que expresa la enzima implicada en la ruta de producción de alulosa de la presente descripción. Sin embargo, esto es simplemente un ejemplo; es decir, una enzima que va a estar contenida en la composición de la presente descripción para producir alulosa y un sustrato usado para la producción de alulosa no están limitados, siempre que la alulosa pueda producirse usando la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa de la presente descripción.
La composición de la presente descripción para producir alulosa puede también comprender alulosa-6-fosfato fosfatasa, un microorganismo que expresa la alulosa-6-fosfato fosfatasa o un cultivo del microorganismo que expresa la alulosa-6-fosfato fosfatasa.
De forma adicional, la composición de la presente descripción para producir alulosa puede también comprender: (a) (i) almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos, glucosa, glucosa-1-fosfato, glucosa-6-fosfato o fructosa-6-fosfato; (ii) fosfato; (iii) alulosa-6-fosfato fosfatasa; (iv) glucosa-6-fosfato isomerasa; (v) fosfoglucomutasa o glucoquinasa; y/o (vi) a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa, sacarosa fosforilasa, a-amilasa, pululanasa, isoamilasa, glucoamilasa o sacarasa; o (b) un microorganismo que expresa alulosa-6-fosfato fosfatasa o un cultivo del microorganismo; un microorganismo que expresa fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1 o un cultivo del microorganismo; un microorganismo que expresa glucosasfosfato isomerasa o un cultivo del microorganismo; un microorganismo que expresa fosfoglucomutasa o glucoquinasa, o un cultivo del microorganismo; y un microorganismo que expresa a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa, sacarosa fosforilasa, a-amilasa, pululanasa, isoamilasa, glucoamilasa o sacarasa, o un cultivo del microorganismo.
Específicamente, la fosforilasa de almidón/maltodextrina (EC 2.4.1.1) y la a-glucanofosforilasa de la presente descripción pueden incluir cualquier proteína siempre que estas sean proteínas que se sometan a transferencia de fosforilo de fosfato a glucosa, con lo que tienen la actividad de producir glucosa-1-fosfato a partir de almidón o maltodextrina. La sacarosa fosforilasa (EC 2.4.1.7) de la presente descripción puede incluir cualquier proteína siempre que sea una proteína que se someta a transferencia de fosforilo de fosfato a glucosa, teniendo así la actividad de producir glucosa-1-fosfato a partir de sacarosa. La a-amilasa (EC 3.2.1.1), la pululanasa (EC 3.2.1.41), la glucoamilasa (EC 3.2.1.3) y la isoamilasa de la presente descripción, que son enzimas para la sacarificación del almidón, pueden incluir cualquier proteína siempre que sean proteínas que tengan la actividad de convertir almidón o maltodextrina en glucosa. La sacarasa (EC 3.2.1.26) de la presente descripción puede incluir cualquier proteína siempre que sea una proteína que tenga la actividad de convertir sacarosa en glucosa. La fosfoglucomutasa (EC 5.4.2.2) de la presente descripción puede incluir cualquier proteína siempre que sea una proteína que tenga la actividad de convertir glucosa-1 -fosfato en glucosa-6-fosfato. La glucoquinasa puede incluir cualquier proteína siempre que sea una proteína capaz de transferir fosfato a glucosa, teniendo así la actividad de conversión en glucosa-6-fosfato. Específicamente, la glucoquinasa puede ser una glucoquinasa dependiente de polifosfato, y más específicamente puede ser una glucoquinasa dependiente de polifosfato derivada de Deinococcusgeothermalis que consiste en la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 5 y la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. 7, o puede ser una glucoquinasa dependiente de polifosfato derivada de Anaerolinea thermophila que consiste en la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 6 y la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. 8. La glucosa-6-fosfato isomerasa de la presente descripción puede incluir cualquier proteína siempre que sea una proteína que tenga una actividad de conversión de glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. La alulosa-6-fosfato fosfatasa de la presente descripción puede incluir cualquier proteína siempre que sea una proteína que tenga una actividad de conversión de alulosa-6-fosfato en alulosa. Más específicamente, la alulosa-6-fosfato fosfatasa puede ser una proteína que tiene una actividad de conversión irreversible de alulosa-6-fosfato en alulosa.
Otro aspecto adicional de la presente descripción proporciona un método para producir alulosa, que comprende: convertir fructosa-6-fosfato en alulosa-6-fosfato haciendo reaccionar la fructosa-6-fosfato con fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1, un microorganismo que expresa la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa, o un cultivo del microorganismo que expresa la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa.
El método de producción de la presente descripción puede también comprender convertir alulosa-6-fosfato en alulosa haciendo reaccionar la alulosa-6-fosfato con alulosa-6-fosfato fosfatasa, un microorganismo que expresa la alulosa-6-fosfato fosfatasa, o un cultivo del microorganismo que expresa la alulosa-6-fosfato fosfatasa, después de convertir la fructosa-6-fosfato de la presente descripción en la alulosa-6-fosfato.
De forma adicional, el método de producción de la presente descripción puede también comprender convertir glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato haciendo reaccionar la glucosa-6-fosfato con glucosa-6-fosfato isomerasa, un microorganismo que expresa la glucosa-6-fosfato isomerasa, o un cultivo del microorganismo que expresa la glucosa-6-fosfato isomerasa, antes de convertir la fructosa-6-fosfato de la presente descripción en alulosa-6-fosfato.
De forma adicional, el método de producción de la presente descripción puede también comprender convertir glucosa-1-fosfato en glucosa-6-fosfato haciendo reaccionar la glucosa-1-fosfato con fosfoglucomutasa, un microorganismo que expresa la fosfoglucomutasa o un cultivo del microorganismo que expresa la fosfoglucomutasa, antes de convertir la glucosa-6-fosfato de la presente descripción en fructosa-6-fosfato.
De forma adicional, el método de producción de la presente descripción puede también comprender convertir glucosa en glucosa-6-fosfato haciendo reaccionar la glucosa con glucoquinasa, un microorganismo que expresa la glucoquinasa o un cultivo del microorganismo que expresa la glucoquinasa y fosfato, antes de convertir la glucosa-6-fosfato de la presente descripción en fructosa-6-fosfato.
De forma adicional, el método de producción de la presente descripción puede también comprender convertir almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos en glucosa-1-fosfato haciendo reaccionar el almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos con fosfato y a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa o sacarosa fosforilasa; un microorganismo que expresa la fosforilasa; o un cultivo del microorganismo que expresa la fosforilasa, antes de convertir la glucosa-1-fosfato de la presente descripción en glucosa-6-fosfato.
De forma adicional, el método de producción de la presente descripción puede también comprender convertir almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos en glucosa haciendo reaccionar el almidón, la maltodextrina, la sacarosa, o una combinación de estos, con a-amilasa, pululanasa, glucoamilasa, sacarasa o isoamilasa; un microorganismo que expresa la amilasa, pululanasa o sacarasa; o un cultivo del microorganismo que expresa la amilasa, pululanasa o sacarasa, antes de convertir la glucosa de la presente descripción en glucosa-6-fosfato.
El método de producción de la presente descripción puede también comprender convertir glucosa en almidón, maltodextrina o sacarosa haciendo reaccionar la glucosa con 4-a-glucanotransferasa, un microorganismo que expresa la 4-a-glucanotransferasa o un cultivo del microorganismo que expresa la 4-a-glucanotransferasa.
En el método de producción de la presente descripción, la “ reacción” se puede llevar a cabo a un pH de 5,0 a 10,0, una temperatura de 50 0C a 90 0C y/o durante 1 minuto a 24 horas. Específicamente, la reacción de la presente descripción se puede llevar a cabo a un pH de 5,0 a 9,0, un pH de 5,0 a 8,0, un pH de 5,0 a 7,0, un pH de 5,0 a 6,0, un pH de 6,0 a 10,0, un pH de 6,0 a 9,0, un pH de 6,0 a 8,0, un pH de 6,0 a 7,0, un pH de 7,0 a 10,0, un pH de 7,0 a 9,0, un pH de 7,0 a 8,0, un pH de 8,0 a 10,0, un pH de 8,0 a 9,0 o un pH de 9,0 a 10,0. De forma adicional, la reacción de la presente descripción puede llevarse a cabo a una temperatura de 55 0C a 90 0C, 60 0C a 90 0C, 60 0C a 75 0C, 65 0C a 75 0C o 60 0C a 70 0C. De forma adicional, la reacción de la presente descripción puede llevarse a cabo durante 1 minuto a 12 horas, 1 minuto a 6 horas, 1 minuto a 3 horas, 1 minuto a 1 hora, 5 minutos a 24 horas, 5 minutos a 12 horas, 5 minutos a 6 horas, 5 minutos a 3 horas, 5 minutos a 1 hora, 10 minutos a 24 horas, 10 minutos a 12 horas, 10 minutos a 6 horas, 10 minutos a 3 horas o 10 minutos a 1 hora.
Otro aspecto adicional de la presente descripción proporciona un método para producir alulosa, que comprende hacer reaccionar almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos y fosfato con (a) alulosa-6-fosfato fosfatasa; fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.
1; glucosa-6-fosfato isomerasa; fosfoglucomutasa o glucoquinasa; y a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa, sacarosa fosforilasa, a-amilasa, pululanasa, isoamilasa, glucoamilasa o sacarasa; o (b) un microorganismo que expresa alulosa-6-fosfato fosfatasa o un cultivo del microorganismo; un microorganismo que expresa fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1 o un cultivo del microorganismo; un microorganismo que expresa glucosa-6-fosfato isomerasa o un cultivo del microorganismo; un microorganismo que expresa fosfoglucomutasa o glucoquinasa, o un cultivo del microorganismo; y un microorganismo que expresa a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa, sacarosa fosforilasa, a-amilasa, pululanasa, isoamilasa, glucoamilasa o sacarasa, o un cultivo del microorganismo.
[Modo para la invención]
A continuación, la presente descripción se describirá en detalle con realizaciones ilustrativas adjuntas. Sin embargo, las realizaciones ilustrativas descritas en la presente descripción son solo con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente descripción.
Ejemplo 1: Preparación del vector de expresión recombinante que contiene el gen de la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa, y microorganismo transformado
Para descubrir una nueva fructosa-6-fosfato-3-epimerasa termoestable, se aisló un gen de Thermotoga neapolitana, un microorganismo termófilo, y luego se produjeron un vector de expresión recombinante y un microorganismo transformado.
Específicamente, basándose en secuencias génicas de Thermotoga neapolitana registradas en Genbank, se seleccionó fp3e, que es un gen que se espera que codifique fructosa-6-fosfato-3-epimerasa. Después de eso, basándose en la información de su secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 1) y la secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 2), se idearon y sintetizaron un iniciador directo (sec. con núm. de ident. 3) y un iniciador inverso (sec. con núm. de ident. 4). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se llevó a cabo con los cebadores sintetizados usando ADN cromosómico de Thermotoga neapolitana (ADN genómico) como molde. Específicamente, la PCR se llevó a cabo durante un total de 25 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y polimerización a 68 °C durante 2 minutos. Los resultantes se insertaron en pET21a (Novagen Inc.), que es un vector plasmídico para la expresión en E. coli, usando las enzimas de restricción Nde y Xho, y después se construyó un vector de expresión recombinante y se denominó CJ_tn_fp3e. Se transformó CJ_tn_fp3e en la cepa de E. coli BL21(DE3) mediante un método de transformación convencional (Sambrook et al. 1989) para preparar un microorganismo transformado en
un vector recombinante que incluye la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. 2, y esto se designó como E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e.
La cepa E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e se depositó en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM), que es una autoridad depositaria internacional en virtud del Tratado de Budapest, el 23 de junio de 2016, y se le asignó el número de acceso KCCM11848P.
Ejemplo 2: Preparación de enzima recombinante
Para preparar una enzima recombinante (de aquí en adelante denominada FP3E), se inoculó E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_fp3e en un tubo de cultivo que contenía 5 mL de medio líquido LB, y luego se inició un cultivo de siembra en una incubadora con agitación a 37 0C hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzó 2,0. La solución de cultivo de siembra se inoculó en un matraz de cultivo que contenía el medio líquido LB, y se llevó a cabo el cultivo principal. Cuando la absorbancia a 600 nm alcanzó 2,0, se añadió IPTG 1 mM para inducir la expresión/producción de FP3E. El cultivo de siembra y el cultivo principal se llevaron a cabo a una velocidad de agitación de 200 rpm a una temperatura de 37 0C. Una vez completado el cultivo principal, la solución de cultivo se centrifugó a 4 0C a 8.000x g durante 20 minutos, y luego se recuperaron las células. Las células recuperadas se lavaron dos veces con un tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,0), se suspendieron en el mismo tampón, y después las células se rompieron usando un disruptor celular ultrasónico. Los residuos celulares se centrifugaron a 4 0C a 13.000x g durante 20 minutos, y después solo se obtuvo el sobrenadante. FP3E se purificó a partir del sobrenadante usando cromatografía de afinidad His-tag. La solución de enzima recombinante purificada se dializó con un tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,0), y después los resultados se usaron para el análisis de propiedades de la enzima.
El peso molecular se confirmó mediante análisis SDS-PAGE, y como resultado, se encontró que el peso molecular de la FP3E purificada era de aproximadamente 25 kDa (indicado como “ E” en la Figura 2).
Ejemplo 3: Confirmación de actividad de FP3E
Con el fin de analizar la actividad de conversión de FP3E de fructosa-6-fosfato a alulosa-6-fosfato, se suspendió fructosa-6-fosfato (50 mM) en un tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,0), y la FP3E purificada (0,1 unidad/mL) se añadió a la misma. Después de eso, los productos resultantes se hicieron reaccionar a 70 °C durante 1 hora.
Debido a la ausencia del material de referencia de alulosa-6-fosfato en la actualidad, es imposible determinar si se produce alulosa-6-fosfato. Por lo tanto, después de convertir alulosa-6-fosfato en alulosa usando una fitasa, que es alulosa-6-fosfato fosfatasa, la actividad de conversión se midió según la producción de alulosa. Específicamente, después de completar la reacción, se añadió una fitasa (10 unidades/mL) y después se hizo reaccionar a 37 °C durante 1 hora para desfosforilar tanto el sustrato, por ejemplo, fructosa-6-fosfato, como el producto, por ejemplo, alulosa-6-fosfato. Después de eso, se analizaron la fructosa y la alulosa mediante HPLC. El análisis mediante HμLC se llevó a cabo usando una columna Aminex HPX-87C (Bio-rad Inc.) mientras se hacía fluir el producto de reacción en la fase móvil a un caudal de 0,5 mL/min a 80 0C. La fructosa y la alulosa se detectaron mediante un detector de índice de refracción.
Como resultado, se detectaron la fructosa y la alulosa en el producto de reacción de FP3E (Figura 3) y, por lo tanto, se confirmó que FP3E tenía la actividad de producción de alulosa-6-fosfato mediante 3-epimerización de fructosa-6-fosfato (Figura 3).
Ejemplo 4: Confirmación de la actividad de FP3E según el pH, la temperatura y la adición de iones de metal
4-1. Conformación de actividad según el pH
Para investigar la influencia del pH sobre la FP3E, se añadió la FP3E purificada (0,1 unidades/mL) a fructosasfosfato (50 mM) suspendida en un tampón 50 mM con diversos pH (pH 4,0 a 7,0, citrato de sodio; pH 6,0 a 8,0, fosfato potásico: pH 7,0 a 9,0, Tris-HCl), y después se hizo reaccionar a 70 0C durante 10 minutos. Después de eso, los productos resultantes se hicieron reaccionar con una fitasa en las mismas condiciones que en el Ejemplo 3, y la alulosa se analizó cuantitativamente mediante HPLC.
Como resultado, se confirmó que FP3E mostraba la actividad máxima a un pH de 7,0 a 8,0, y que FP3E mantenía el 70 % o más de su actividad a un intervalo de pH muy amplio (de 5,0 a 10,0) en comparación con la actividad máxima (Figura 4).
Ejemplo 4: Confirmación de la actividad de FP3E según el pH, la temperatura y la adición de iones de metal
4-1. Conformación de actividad según el pH
Para investigar la influencia del pH sobre la FP3E, se añadió la FP3E purificada (0,1 unidades/mL) a fructosa-6-fosfato (50 mM) suspendida en un tampón de 50 mM con diversos pH (pH 4,0 a 7,0, citrato de sodio; pH 6,0 a 8,0,
fosfato potásico: pH 7,0 a 9,0, Tris-HCl), y después se hizo reaccionar a 70 0C durante 10 minutos. Después de eso, los productos resultantes se hicieron reaccionar con una fitasa en las mismas condiciones que en el Ejemplo 3, y la alulosa se analizó cuantitativamente mediante HPLC.
Como resultado, se confirmó que FP3E mostraba la actividad máxima a un pH de 7,0 a 8,0, y que FP3E mantenía el 70 % o más de su actividad a un intervalo de pH muy amplio (de 5,0 a 10,0) en comparación con la actividad máxima (Figura 4).
4-3. Confirmación de la actividad según la adición de iones de metal
Con el fin de investigar el efecto de la adición de un ion de metal sobre la actividad de FP3E, se añadió cada uno de los iones de metal (por ejemplo, NiSÜ4, CuSÜ4, MnSÜ4, CaCl2, ZnSÜ4, MgSÜ4, MgCl2, FeSÜ4, NaCl, LiCl y KCl) a fructosa-6-fosfato (50 mM) suspendido en un tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,0) hasta una concentración final de 0,5 mM. Para la eliminación de los iones de metal, se añadió FP3E (0,1 unidades/mL), que se dializó mediante tratamiento con EDTA 10 mM, y después los resultados se hicieron reaccionar a 70 0C durante 10 minutos. Después de eso, los productos resultantes se hicieron reaccionar con una fitasa en las mismas condiciones que en el Ejemplo 3, y la alulosa se analizó cuantitativamente mediante HPLC.
Como resultado, la actividad de FP3E aumentó ligeramente cuando se añadieron iones de Ca y Cu, pero no hubo casi ningún cambio en la actividad enzimática cuando se añadieron otros iones de metal. Por lo tanto, se confirmó que FP3E no era una metaloenzima (Figura 6).
Claims (13)
1. Uso de una fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1, para producir alulosa.
2. Uso de una composición para producir alulosa, que comprende la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del dicho microorganismo.
3. Una composición para su uso en la producción de alulosa que comprende la fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del dicho microorganismo, y comprende además alulosa-6-fosfato fosfatasa, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del dicho microorganismo.
4. La composición para su uso en la producción de alulosa según la reivindicación 3, donde la composición comprende además:
(a) (i) almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos; (ii) fosfato; (iii) alulosa-6-fosfato fosfatasa; (iv) glucosa-6-fosfato isomerasa; (v) fosfoglucomutasa o glucoquinasa; y/o (vi) a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa, sacarosa fosforilasa, aamilasa, pululanasa, isoamilasa, glucoamilasa o sacarasa; o
(b) un microorganismo que expresa cualquiera de las enzimas de (a) o un cultivo del microorganismo.
5. Un método para producir alulosa, que comprende: convertir fructosa-6-fosfato en alulosa-6-fosfato haciendo reaccionar la fructosa-6-fosfato con fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo.
6. El método según la reivindicación 5, donde el método comprende además convertir alulosa-6-fosfato en alulosa haciendo reaccionar la alulosa-6-fosfato con alulosa-6-fosfato fosfatasa, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo, después de convertir la fructosa-6-fosfato en la alulosa-6-fosfato.
7. El método según la reivindicación 5, donde el método comprende además convertir glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato haciendo reaccionar la glucosa-6-fosfato con glucosa-6-fosfato isomerasa, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo, antes de convertir la fructosa-6-fosfato en alulosa-6-fosfato.
8. El método según la reivindicación 7, donde el método comprende además convertir glucosa-1-fosfato en glucosa-6-fosfato haciendo reaccionar la glucosa-1-fosfato con fosfoglucomutasa, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo, antes de convertir la glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato.
9. El método según la reivindicación 7, donde el método comprende además convertir glucosa en glucosa-6-fosfato haciendo reaccionar la glucosa con glucoquinasa, un microorganismo que expresa la misma o un cultivo del microorganismo, y fosfato, antes de convertir la glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato.
10. El método según la reivindicación 8, donde el método comprende además convertir almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos en glucosa-1-fosfato haciendo reaccionar el almidón, la maltodextrina, la sacarosa o una combinación de estos con fosfato y a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa o sacarosa fosforilasa; un microorganismo que expresa las mismas; o un cultivo del microorganismo, antes de convertir la glucosa-1-fosfato en glucosa-6-fosfato.
11. El método según la reivindicación 9, donde el método comprende además convertir almidón, maltodextrina, sacarosa, o una combinación de estos en glucosa haciendo reaccionar el almidón, la maltodextrina, la sacarosa, o una combinación de estos con a-amilasa, pululanasa, glucoamilasa, sacarasa o isoamilasa; un microorganismo que expresa las mismas; o un cultivo del microorganismo, antes de convertir la glucosa en glucosa-6-fosfato.
12. El método según la reivindicación 5, donde la reacción se lleva a cabo a un pH de 5,0 a 10,0, una temperatura de 50 0C a 90 0C, y/o durante 1 minuto a 24 horas.
13. Un método para producir alulosa, que comprende hacer reaccionar almidón, maltodextrina, sacarosa, o una combinación de estos, y fosfato con (a) alulosa-6-fosfato fosfatasa; fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1; glucosa-6-fosfato isomerasa;
fosfoglucomutasa o glucoquinasa; y a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa, sacarosa fosforilasa, a-amilasa, pululanasa, isoamilasa, glucoamilasa o sacarasa; o (b) un microorganismo que expresa alulosa-6-fosfato fosfatasa o un cultivo del microorganismo; un microorganismo que expresa fructosa-6-fosfato-3-epimerasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. 1 o un cultivo del microorganismo; un microorganismo que expresa glucosa-6-fosfato isomerasa o un cultivo del microorganismo; un microorganismo que expresa fosfoglucomutasa o glucoquinasa, o un cultivo del microorganismo; y un microorganismo que expresa a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa, sacarosa fosforilasa, a-amilasa, pululanasa, isoamilasa, glucoamilasa o sacarasa, o un cultivo del microorganismo.
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