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WO2018088455A1 - 敗血症診断薬 - Google Patents

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WO2018088455A1
WO2018088455A1 PCT/JP2017/040348 JP2017040348W WO2018088455A1 WO 2018088455 A1 WO2018088455 A1 WO 2018088455A1 JP 2017040348 W JP2017040348 W JP 2017040348W WO 2018088455 A1 WO2018088455 A1 WO 2018088455A1
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sepsis
septic
patients
glycoprotein
leucine
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PCT/JP2017/040348
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Inventor
孝明 中田
知明 橋田
Original Assignee
国立大学法人千葉大学
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Publication date
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes

Definitions

  • the present invention relates to a sepsis diagnostic method and a diagnostic reagent.
  • Sepsis is a disease that presents life-threatening organ dysfunction due to dysregulation of host biological responses to infection, and its mortality rate is still high. It is said that products resulting from infection or from the host cause stimulation, and various humor mediators are released from the innate immune response, causing sepsis. Therefore, a blood purification method using a membrane material having a mediater adsorption ability has been implemented for sepsis and has exhibited clinical effects (Non-Patent Documents 1 to 4).
  • Non-Patent Documents 1 to 4 the concentration of cytokines such as TNF, IL-6, and IL-8 decreases after passing through the blood purification membrane.
  • cytokines such as TNF, IL-6, and IL-8 decreases after passing through the blood purification membrane.
  • they are limited to specific substances, and the analysis of substances adsorbed on the membrane is indirect measurement of the blood concentration difference before and after the blood purification membrane, and is not sufficient.
  • An object of the present invention is to develop a new biomarker useful for diagnosis of sepsis and provide a diagnostic agent and a diagnostic technique.
  • the present inventor separated and eluted the substance adsorbed on the blood purification membrane in septic patients and non-septic acute kidney injury patients who had undergone the blood purification method, and analyzed them by a proteomic technique.
  • a proteomic technique As a result, it has been found that two substances that have not been known to be related to sepsis are present in the blood of sepsis patients at a significantly high concentration and are useful as a diagnostic marker for sepsis. Completed the invention.
  • the present invention provides the following [1] to [7].
  • [1] A method for measuring a component selected from carbonic anhydrase 1 and leucine-rich ⁇ -2-glycoprotein in a blood sample for the purpose of diagnosis of sepsis.
  • [2] Diagnosis of sepsis when the concentration or activity of a component selected from carbonic anhydrase 1 and leucine-rich ⁇ -2-glycoprotein in the blood sample is significantly higher than that of healthy subjects or non-septic kidney injury patients The measurement method according to [1].
  • [3] The measuring method according to [1] or [2], which is a purpose of diagnosing sepsis in an acute kidney injury patient.
  • a method for diagnosing sepsis comprising measuring a component selected from carbonic anhydrase 1 and leucine-rich ⁇ -2-glycoprotein in a blood sample.
  • Diagnosis of sepsis when the concentration or activity of a component selected from carbonic anhydrase 1 and leucine-rich ⁇ -2-glycoprotein in the blood sample is significantly higher than that of healthy subjects or non-septic kidney injury patients.
  • the diagnostic method according to [4] or [5] which is a diagnosis of sepsis in an acute kidney injury patient.
  • a sepsis diagnostic agent comprising a reagent for measuring a component selected from carbonic anhydrase 1 and leucine-rich ⁇ -2-glycoprotein in a blood sample.
  • a patient with a high concentration or activity of carbonic anhydrase 1 or leucine-rich ⁇ -2-glycoprotein in a blood sample can be diagnosed as having sepsis.
  • patients with high concentration or activity of carbonic anhydrase 1 or leucine-rich ⁇ -2-glycoprotein can be diagnosed as having sepsis. If it is possible to diagnose sepsis at an early stage, it is possible to formulate appropriate treatment guidelines.
  • CA1 carbonic anhydrase 1
  • LRG1 leucine-rich ⁇ -2-glycoprotein
  • cystatin C cystatin C
  • the sepsis diagnostic marker of the present invention is a component selected from carbonic anhydrase 1 (CA1) and leucine-rich ⁇ -2-glycoprotein (LRG).
  • CA1 is an enzyme that assists in transporting carbon dioxide from tissues by maintaining the acid-base equilibrium of blood and other tissues by exchanging carbon dioxide and hydrogen carbonate ions in a living body.
  • CA1 activity and concentration are known to be useful as markers for iron deficiency anemia, respiratory distress syndrome, hyperthyroidism / hypothyroidism, etc., but the relationship with sepsis is not known.
  • LRG is known to increase in idiopathic normal pressure hydrocephalus, diabetes, pancreatic cancer, etc., but its relationship with sepsis is not known.
  • the concentration or activity of CA1 or LRG in the blood sample is measured.
  • the blood sample may be a blood sample collected from a subject, but it is preferable from the viewpoint of simplicity to use serum or plasma.
  • the components adsorbed on the blood purification membrane after the blood purification method is implemented can be the measurement target.
  • examples of the blood purification method include hemodialysis, hemofiltration dialysis, peritoneal dialysis, and plasma exchange, and any of these can be used.
  • mass spectrometry using proteomic analysis means can be mentioned, but specific measurement means for each component may be used.
  • CA1 in addition to capillary electrophoresis / mass spectrometry and liquid chromatography / mass spectrometry, carbonic acid dehydrogenation activity measurement method, hydrolase activity measurement method (WO2005 / 098026 etc.), immunological measurement method ( ELISA, RIA, etc.).
  • LRG in addition to capillary electrophoresis / mass spectrometry and liquid chromatography / mass spectrometry, immunological measurement methods such as ELISA and latex agglutination can be used.
  • CA1 or LRG is useful as a diagnostic marker for sepsis and a diagnostic marker for septic kidney injury in patients with renal injury. For example, for the purpose of diagnosing sepsis, comparing the activity or concentration of CA1 or LRG in a blood sample with a threshold determined based on the activity or concentration in patients with septic kidney injury and healthy or non-septic kidney injury patients Can do.
  • the above threshold value is calculated using an ROC (Receiver-Operating-Characteristic) curve using statistical analysis software based on a standard method, for example, data on septic kidney injury patients or data on healthy subjects or non-septic kidney injury patients. be able to.
  • the sepsis diagnostic agent of the present invention contains a CA1 or LRG measurement reagent in a blood sample.
  • CA1 or LRG measuring reagents include reagents used in capillary electrophoresis / mass spectrometry, liquid chromatography / mass spectrometry, carbonic acid dehydrogenation activity measuring reagent, hydrolase activity measuring reagent, immunological measuring reagent (ELISA, RIA). , Latex agglomeration, etc.).
  • these measurement reagents can include standard products for each marker and measurement protocols, and can also be supplied as measurement kits.
  • Example 1 A Method (1) Patients This study was conducted at Chiba University Hospital. In this study, 20 patients with acute kidney injury (AKI) who received continuous renal replacement therapy who entered the ICU between June 2012 and March 2014 were studied. Of the 20 patients, 10 were sepsis (according to ACCP / SCCM criteria) patients and the remaining 10 were non-septic patients. The Chiba University graduate School Screening Committee approved the study. Written informed consent was obtained from the patient and his legal representative.
  • AKI acute kidney injury
  • the blood purification membrane after use was washed with 1 L of physiological saline. And the housing
  • the hollow fiber membrane was cut into a certain size (length 5 cm, thickness 1 cm), centrifuged in a 50 mL tube (5 minutes, 2000 rpm) to remove moisture, and stored at ⁇ 80 ° C. Serum samples at the time of ICU admission were collected from 20 patients and stored at -80 ° C.
  • the purified peptide was incorporated into the LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific, San Jose, CA, USA), which is a hybrid ion-trap Fourier transform mass spectrometer, from HPLC.
  • Proteome Discoverer search engine version 2.2.6, Matrixscience, London, UK was used to identify proteins from peptide mass and tandem mass spectra.
  • Peptide mass data was searched with UniProtKB Homo sapiens database (SwissProt 2014, 20268 entries).
  • the database search parameters were as follows: peptide mass tolerance, 2 ppm; fragment tolerance, 0.6 Da; enzyme was set to trypsin, allowing up to one miscellaneous modification, measurement.
  • the standard of protein identification was set as alse discovery rate (FDR) ⁇ 1%.
  • the FDR is a randomized estimate created by the Mascot Perl program of the supplied by Matrix Science of the FDR was established by searching a created a the by. Differences in baseline characteristics and results were analyzed by Fisher's exact test and Mann-Whitney U test. The functional classification of the sepsis group and the non-septic group was analyzed by the chi-square test. Differences in blood levels of CA1, LRG1 and Cys between the sepsis and non-septic groups were analyzed by Mann-Whitney U test. P values ⁇ 0.05 were considered significant.
  • the analysis used SPSS (SPSS, version 20, Chicago, IL) statistical software.

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Abstract

新たな敗血症の診断に有用なバイオマーカーを開発し、診断薬及び診断手法の提供。　敗血症診断の目的で、血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα－２－グリコプロテインから選ばれる成分の測定法。

Description

敗血症診断薬
　本発明は、敗血症の診断方法及び診断試薬に関する。
　敗血症は、感染に対する宿主生体反応の調節不全により、生命を脅かす臓器機能障害(organ dysfunction)を呈する疾患であり、その死亡率は依然として高い。感染に起因するもしくは宿主に起因する産物が刺激となり、自然免疫応答から様々なｈｕｍｏｒａｌ　ｍｅｄｉａｔｅｒが放出され敗血症を引き起こすと言われている。そこで、ｍｅｄｉａｔｅｒ吸着能を有する膜素材を用いた血液浄化法が敗血症に施行され、臨床的効果を発揮してきた（非特許文献１～４）。
　今まで、ＴＮＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－８などのサイトカインが血液浄化膜通過後に濃度低下することは報告されてきた（非特許文献１～４）。しかしそれらは、特定の物質に限定されており、膜へ吸着した物質の解析も、血液浄化膜前後の血中濃度差を測定した間接的なものであり十分ではなかった。
　また、急性腎傷害（Acute kidney injury, AKI）の中でも、敗血症性腎傷害は早期診断・早期治療が重要であるにも関わらず、敗血症性腎傷害を診断するバイオマーカーは報告がない。
Ther Apher 2001, 5(4): 306-314 Transfus Apher Sci 2006, 35(3): 253-264 Blood Purif 2011,31(1-3): 18-25 Blood Purif 2012, 34(2): 164-170
　本発明の課題は、新たな敗血症の診断に有用なバイオマーカーを開発し、診断薬及び診断手法を提供することにある。
　そこで本発明者は、血液浄化法を施行した敗血症患者と非敗血症性急性腎傷害患者において、血液浄化膜に吸着した物質を溶出分離し、プロテオミクスの手法により解析を行った。その結果、従来、敗血症との関連性が全く知られていなかった２種の物質が、敗血症患者の血液中に有意に高濃度で存在し、敗血症の診断マーカーとして有用であることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔７〕を提供するものである。
〔１〕敗血症診断の目的で、血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα－２－グリコプロテインから選ばれる成分の測定法。
〔２〕血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα－２－グリコプロテインから選ばれる成分の濃度又は活性が、健常者又は非敗血症腎傷害患者に比べて有意に高い場合に敗血症と診断する〔１〕記載の測定法。
〔３〕急性腎傷害患者における敗血症診断の目的である〔１〕又は〔２〕記載の測定法。
〔４〕血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα－２－グリコプロテインから選ばれる成分を測定することを特徴とする敗血症の診断方法。
〔５〕血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα－２－グリコプロテインから選ばれる成分の濃度又は活性が、健常者又は非敗血症腎傷害患者に比べて有意に高い場合に敗血症と診断する〔４〕記載の診断方法。
〔６〕急性腎傷害患者における敗血症の診断である〔４〕又は〔５〕記載の診断方法。
〔７〕血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα－２－グリコプロテインから選ばれる成分の測定試薬を含有する敗血症診断薬。
　血液試料中のカルボニックアンテヒドラーゼ１又はロイシンリッチα－２－グリコプロテインの濃度又は活性が高い患者は敗血症であると診断できる。また、腎傷害患者のうち、カルボニックアンヒドラーゼ１又はロイシンリッチα－２－グリコプロテインの濃度又は活性が高い患者は敗血症であると診断できる。敗血症であることが早期に診断できれば、適確な治療指針の策定が可能となる。
敗血症患者（Ｓｅｐｓｉｓ）及び非敗血症患者（Ｎｏｎ－Ｓｅｐｓｉｓ）のカルボニックアンヒドラーゼ１（ＣＡ１）、ロイシンリッチα－２－グリコプロテイン（ＬＲＧ１）、及びシスタチンＣ（Ｃｙｓｔａｔｉｎ　Ｃ）の濃度差を示す。
　本発明の敗血症診断マーカーは、カルボニックアンヒドラーゼ１（ＣＡ１）及びロイシンリッチα－２－グリコプロテイン（ＬＲＧ）から選ばれる成分である。
　ＣＡ１は、生体中で、二酸化炭素と炭酸水素イオンとを相互交換することで、血液や他の組織の酸－塩基平衡を維持し、組織から二酸化炭素を運び出す補助をする酵素である。ＣＡ１活性や濃度は、鉄欠乏性貧血、ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｄｉｓｔｒｅｓｓ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ、甲状腺機能亢進症・低下症等のマーカーとして有用であることが知られているが、敗血症との関係については知られていない。
　ＬＲＧは、特発性正常圧水頭症、糖尿病、膵がんなどで上昇することは知られているが、敗血症との関係については知られていない。
　本発明においては、血液試料中のＣＡ１又はＬＲＧの濃度又は活性を測定する。
　血液試料としては、被検者から採取した血液試料であればよいが、血清、血漿を用いるのが簡便性の点で好ましい。また、腎傷害患者を対象とする場合には、血液浄化法施行後の血液浄化膜に吸着した成分を測定対象とすることができる。ここで、血液浄化法としては、血液透析、血液濾過透析、腹膜透析、血漿交換等が挙げられるが、これらのいずれも使用できる。
　血液試料中のＣＡ１又はＬＲＧの測定手段としては、プロテオミクス解析手段による質量分析が挙げられるが、それぞれの成分の特異的測定手段を用いてもよい。例えば、ＣＡ１の場合には、キャピラリー電気泳動・質量分析、液体クロマトグラフィー・質量分析の他、炭酸脱水素活性測定法、加水分解酵素活性測定法（ＷＯ２００５／０９８０２６等）、免疫学的測定法（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなど）等が挙げられる。また、ＬＲＧの場合には、キャピラリー電気泳動・質量分析、液体クロマトグラフィー・質量分析の他、ＥＬＩＳＡ、ラテックス凝集法等の免疫学的測定法が挙げられる。
　血液試料中のＣＡ１又はＬＲＧの活性又は濃度は、敗血症患者において健常者に比べて有意に高い値を示す。また、腎傷害患者のうち、非敗血症性腎傷害患者に比べて、敗血症性腎傷害患者において有意に高い値を示す。従って、ＣＡ１又はＬＲＧは、敗血症の診断マーカー、腎傷害患者における敗血症性腎傷害の診断マーカーとして有用である。例えば、敗血症診断の目的で、血液試料中のＣＡ１又はＬＲＧの活性又は濃度を、敗血症性腎傷害患者及び健常者または非敗血症性腎傷害患者における活性または濃度に基づいて決定した閾値と比較することができる。上記閾値は、定法、例えば、敗血症性腎傷害患者のデータや、健常者または非敗血症性腎傷害患者のデータを基に、統計解析ソフトウェアを用いたＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を用いて算出することができる。
　本発明の敗血症診断薬は、血液試料中のＣＡ１又はＬＲＧの測定試薬を含有する。ＣＡ１又はＬＲＧの測定試薬としては、例えばキャピラリー電気泳動・質量分析、液体クロマトグラフィー・質量分析に用いる試薬、炭酸脱水素活性測定試薬、加水分解酵素活性測定試薬、免疫学的測定試薬（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ラテックス凝集等）が挙げられる。また、これらの測定試薬には、前記測定試薬の他、各マーカーの標準品、測定用プロトコールを含めることができ、測定キットとして供給することもできる。
　次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例１
Ａ．方法
（１）患者
　この研究は千葉大学医学部付属病院で行われた。本研究では、２０１２年６月から２０１４年３月の間にＩＣＵ入室した持続的腎代替療法を受けた急性腎傷害（Acute kidney injury, AKI）２０人の患者を研究対象とした。２０人の患者のうち、１０人は、敗血症（ＡＣＣＰ／ＳＣＣＭ基準による）患者であり、残り１０人は非敗血症患者であった。千葉大学大学院治験審査委員会は、この研究を承認した。書面によるインフォームドコンセントは患者やその法定代理人から入手した。
（２）検体採取
　ポリメタクリレート血液浄化膜は、（Ｈｅｍｏｆｅｅｌ　ＣＨ－１．０，Ｔｏｒａｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）は、上記の１０人の患者（敗血症のｎ＝５、非敗血症のｎ＝５）から血液浄化法を施行した最初の日に収集した（施行条件は血流量１２０ｍＬ／分、濾過流量を５００ｍＬ／ｈ、透析液流量１０００ｍＬ／ｈ）。使用後の血液浄化膜は、生理食塩水１Ｌで洗浄した。そして筐体を切断し、中空糸膜を取り出した。中空糸膜は一定の大きさに切断し（長さ５ｃｍ、厚さ１ｃｍ）、水分除去の為、５０ｍＬチューブで遠心分離（５分間、２０００ｒｐｍ）し、－８０℃で保存した。ＩＣＵ入院時の血清検体は、２０人の患者から採取し、－８０℃で保存した。
（３）血液浄化膜からの溶出及び単離
　マイクロチューブに、冷凍保存した膜検体とサンプルバッファー（６２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ，２％ＳＤＳ，２０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．０１％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　Ｂｌｕｅ，ｐＨ６．８／ＢＩＯＲＡＤ社）１ｍＬ入れ、９７℃、５分間加熱し、その抽出液を採取した。その抽出液を、５μＬずつｗｅｌｌに注入し、１５０Ｖ、９０ｍｉｎで電気泳動し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ行った。使用するゲルは２～１００ＫＤａをより詳細に分離出来る低分子用ゲル（ＤＲＣ　Ｐｅｒｆｅｃｔ　ＮＴ　Ｇｅｌ　ＮＴＨ－７Ｇ６ＨＰ）を用いた。泳動後のゲルはＣＢＢ染色を行い可視化した。
（４）消化及び蛋白質同定
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分離後、可視領域および可視化されていない部位を、ゲル内トリプシン消化のために１ｍｍ2切片に切断した。Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　２００５，５（４）：１１１３－１１２４の記載に従ってゲル内トリプシン消化を行った。プロテオーム解析に先立ち、消化されたペプチドを脱塩し、選択的にＣ１８－ＳｔａｇｅＴｉｐｓ（Ｎａｔ　Ｐｒｏｔｏｃ　２００７，２（８）：１８９６－１９０６）で強化した。濃縮されたサンプルは、Ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００（ＤＩＯＮＥＸ、ＣＡ、ＵＳＡ）に取り付けた、トラップカラム（Ｃ１８、０．３×５ｍｍ、ＤＩＯＮＥＸ、ＣＡ、ＵＳＡ）、および分析カラム（Ｃ１８、０．０７５×１２０ｍｍ、Ｎｉｋｋｙｏテクノス、東京、日本）に注入した。移動相の流量は、３００ｎＬ／分とした。移動相の溶媒組成物は、１２０分サイクルで以下の様にプログラムされたものである。
　１２０－ｍｉｎ　ｃｙｃｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ｖａｒｙｉｎｇ　ｍｉｘｉｎｇ　ｒａｔｉｏｓ　ｏｆ　ｓｏｌｖｅｎｔ　Ａ（２％ｖ／ｖ　ＣＨ3ＣＮ　ａｎｄ　０．１％ｖ／ｖ　ＨＣＯＯＨ）ｔｏ　ｓｏｌｖｅｎｔ　Ｂ（９０％ｖ／ｖ　ＣＨ3ＣＮ　ａｎｄ　０．１％ｖ／ｖ　ＨＣＯＯＨ）：５－１０％　Ｂ５ｍｉｎ，１０－１３．５％　Ｂ３５ｍｉｎ，１３．５－３５％　Ｂ６５ｍｉｎ，３５－９０％　Ｂ４ｍｉｎ，９０％　Ｂ０．５ｍｉｎ，９０－５％　Ｂ０．５ｍｉｎ，５％　Ｂ１０ｍｉｎ．
　精製されたペプチドはハイブリッドイオン－トラップフーリエ変換質量分析計であるＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ　ＸＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）にＨＰＬＣから取り込まれた。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ　ｓｅａｒｃｈ　ｅｎｇｉｎｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ　２．２．６，Ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）は、ペプチドの質量及びタンデム質量スペクトルからタンパク質を同定するために使用した。ペプチド質量データは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｄａｔａｂａｓｅ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　２０１４，２０２６８　ｅｎｔｒｉｅｓ）で検索した。データベースの検索パラメータは以下の通りであった。ｐｅｐｔｉｄｅ　ｍａｓｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，２ｐｐｍ；ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，０．６Ｄａ；ｅｎｚｙｍｅ　ｗａｓ　ｓｅｔ　ｔｏ　ｔｒｙｐｓｉｎ，ａｌｌｏｗｉｎｇ　ｕｐ　ｔｏ　ｏｎｅ　ｍｉｓｓｅｄ　ｃｌｅａｖａｇｅ；ｖａｒｉａｂｌｅ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．
（５）ウエスタンブロット分析
　プロテオーム解析で同定された３タンパク質（カルボニックアンヒドラーゼ［ＣＡ１］、ロイシンリッチα－２－グリコプロテイン［ＬＲＧ１］、シスタチンＣ［ＣｙｓＣ］）の血中濃度を、ＡＫＩ患者で測定した。測定はＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ法で行った。この実験はｔｅｃｈｎｉｃａｌ　ｄｕｐｌｉｃａｔｅで行った。
（６）統計学的分析
　タンパク質同定の基準は、ａｌｓｅ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ（ＦＤＲ）＜１％と設定した。ＦＤＲは、Ｔｈｅ　ＦＤＲ　ｗａｓ　ｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｂｙ　ｓｅａｒｃｈｉｎｇ　ａｇａｉｎｓｔ　ａ　ｃｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｓｕｐｐｌｉｅｄ　ｂｙ　Ｍａｔｒｉｘ　ＳｃｉｅｎｃｅのＭａｓｃｏｔ　Ｐｅｒｌ　ｐｒｏｇｒａｍによって作成されたｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ　ｄｅｃｏｙ　ｄａｔａｂａｓｅで推定した。ベースライン特性と結果の違いは、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ　ｅｘａｃｔ　ｔｅｓｔとＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ　ｔｅｓｔにて解析した。敗血症群と非敗血症群の機能分類は、ｃｈｉ－ｓｑｕａｒｅ　ｔｅｓｔにて解析した。敗血症および非敗血症群とのＣＡ１、ＬＲＧ１及びＣｙｓの血中濃度の差は、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ　ｔｅｓｔにて解析した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。解析はＳＰＳＳ（ＳＰＳＳ，ｖｅｒｓｉｏｎ　２０，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）統計ソフトウェアを使用した。
Ｂ．結果
　敗血症患者５例の膜検体と、非敗血症患者５例の膜検体を前述の方法で溶出分離・質量解析した。敗血症群では４２９種類、非敗血症群では３５７種類のタンパク質を同定した。
　敗血症群と非敗血症群で同定されたタンパク質の機能分析の比較した（表１）。敗血症群において「免疫系システム経路」及び「生物学的接着」を有意に認めた（Ｐ＜０．０５）。「代謝経路」と「刺激に対する反応」は両群ともに認めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　４２９種類のタンパク質のうち１９７種類が、敗血症群のみで同定された。さらに１９７種類のうち、９種類のタンパク質が、全ての検体（５敗血症患者）において同定された。９種類のタンパク質のうち、６種は既に敗血症との関連が報告されていた（表２）。
　一方で、ＣＡ１、ＬＲＧ１、ＣｙｓＣの３種類のタンパク質は敗血症との関連が報告されていなかった（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　そこでこれらの３つのタンパク質に着目し、ウェスタンブロット法を使用して、敗血症群と非敗血症群の血中濃度について解析した（図１）。図１よりＣＡ１及びＬＲＧ１は、両群間に有意差を認めた（ＬＲＧ１；Ｐ＝０．００４０，ＣＡ１；Ｐ＝０．０１５）。ＣｙｓＣは、両群間に有意差は認めなかった（ＣｙｓＣ；Ｐ＝０．３５）。
　以上の結果から、ＣＡ１及びＬＲＧ１は、敗血症の診断マーカーとして有用であることが判明した。これらの２成分は、特に急性腎傷害の原因としての敗血症の早期診断、治療に有効なバイオマーカーであると考えられた。

Claims (7)

  1. 　敗血症診断の目的で、血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα－２－グリコプロテインから選ばれる成分の測定法。
  2. 　血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα－２－グリコプロテインから選ばれる成分の濃度又は活性が、健常者又は非敗血症腎傷害患者に比べて有意に高い場合に敗血症と診断する請求項１記載の測定法。
  3. 　急性腎傷害患者における敗血症診断の目的である請求項１又は２記載の測定法。
  4. 　血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα－２－グリコプロテインから選ばれる成分を測定することを特徴とする敗血症の診断方法。
  5. 　血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα－２－グリコプロテインから選ばれる成分の濃度又は活性が、健常者又は非敗血症腎傷害患者に比べて有意に高い場合に敗血症と診断する請求項４記載の診断方法。
  6. 　急性腎傷害患者における敗血症の診断である請求項４又は５記載の診断方法。
  7. 　血液試料中のカルボニックアンヒドラーゼ１及びロイシンリッチα－２－グリコプロテインから選ばれる成分の測定試薬を含有する敗血症診断薬。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020075691A1 (ja) * 2018-10-09 2020-04-16 積水メディカル株式会社 ロイシンリッチα２グリコプロテインの免疫測定方法及び測定試薬

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005512060A (ja) * 2001-12-04 2005-04-28 ベー・エル・アー・ハー・エム・エス・アクティエンゲゼルシャフト 可溶性サイトケラチンフラグメントの測定による敗血症の診断方法
JP4643445B2 (ja) * 2002-11-12 2011-03-02 ベクトン，ディッキンソン アンド カンパニー バイオマーカープロフィールを使用した敗血症またはｓｉｒｓの診断
WO2013152047A1 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of sepsis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005512060A (ja) * 2001-12-04 2005-04-28 ベー・エル・アー・ハー・エム・エス・アクティエンゲゼルシャフト 可溶性サイトケラチンフラグメントの測定による敗血症の診断方法
JP4643445B2 (ja) * 2002-11-12 2011-03-02 ベクトン，ディッキンソン アンド カンパニー バイオマーカープロフィールを使用した敗血症またはｓｉｒｓの診断
WO2013152047A1 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of sepsis

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HASHIDA, TOMOAKI: "Proteome analysis of hemofilter adsorbates to identify novel substances of sepsis: a pilot study", JOURNAL OF ARTIFICIAL ORGANS, vol. 20, no. 2, 17 November 2016 (2016-11-17), pages 132 - 137, XP036246869 *
HASHIDA, TOMOAKI: "Proteomic analysis of substances adsorbed to blood purification membrane in sepsis", JOURNAL OF JAPAN SOCIETY FOR BLOOD PURIFICATION IN CRITICAL CARE, vol. 6, 15 September 2015 (2015-09-15) *
HATTORI, NORIYUK: "Method for purifying blood against septic shock", JOURNAL OF JAPAN SOCIETY FOR BLOOD PURIFICATION IN CRITICAL CARE, vol. 7, 15 September 2016 (2016-09-15), pages 44 *
KREPS, E. M.: "The respiratory ferment carbonic anhydrase and its diagnostic significance in sepsis", KHIRIRUGIIA, vol. 5, 1945, pages 22 - 25, ISSN: 0023-1207 *
MACALLAN, D. C.: "The effect of endotoxin on skeletal muscle protein gene expression in the rat", THE INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOCHEMISTRY & CELL BIOLOGY, vol. 28, no. 5, May 1996 (1996-05-01), pages 511 - 520, XP055502600 *
NAKATA, TAKAAKI: "Proteome analysis of substances adsorbed to blood purification membrane", JAPANESE JOURNAL OF ARTIFICIAL ORGANS, vol. 45, no. 2, 31 October 2016 (2016-10-31), pages 132 017 - 4 *
REDINA, L. V.: "The carbonic anhydrase of the blood of the newborn and its diagnostic significance", AKUSHERSTVO I GINEKOLOGIYA (MOSCOW, vol. 1, 1948, pages 40 - 42, ISSN: 0002-3906 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020075691A1 (ja) * 2018-10-09 2020-04-16 積水メディカル株式会社 ロイシンリッチα２グリコプロテインの免疫測定方法及び測定試薬
CN112888946A (zh) * 2018-10-09 2021-06-01 积水医疗株式会社 富含亮氨酸的α2糖蛋白的免疫测定法和测定试剂
JPWO2020075691A1 (ja) * 2018-10-09 2021-09-02 積水メディカル株式会社 ロイシンリッチα２グリコプロテインの免疫測定方法及び測定試薬
JP7421711B2 (ja) 2018-10-09 2024-01-25 積水メディカル株式会社 ロイシンリッチα２グリコプロテインの免疫測定方法及び測定試薬
CN112888946B (zh) * 2018-10-09 2024-08-20 积水医疗株式会社 富含亮氨酸的α2糖蛋白的免疫测定法和测定试剂

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