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WO2017146529A1 - 대장암 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법 - Google Patents

대장암 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법 Download PDF

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Publication number
WO2017146529A1
WO2017146529A1 PCT/KR2017/002081 KR2017002081W WO2017146529A1 WO 2017146529 A1 WO2017146529 A1 WO 2017146529A1 KR 2017002081 W KR2017002081 W KR 2017002081W WO 2017146529 A1 WO2017146529 A1 WO 2017146529A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
expression level
colorectal cancer
mrna
krs
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/002081
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김성훈
박민철
찰스 고흐너 피터
Original Assignee
재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to CN201780023863.2A priority patent/CN109312405A/zh
Priority to EP17756867.2A priority patent/EP3409790A4/en
Publication of WO2017146529A1 publication Critical patent/WO2017146529A1/ko
Priority to US16/111,087 priority patent/US11360093B2/en

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
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    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/9015—Ligases (6)

Definitions

  • the present invention is one or more mRNAs selected from the group consisting of KRS (lysyl-tRNA synthetase) and AIMPl (aminoacyl-tRNA synthetase complex-inter acting mul ti funct ional Protein 1) or It provides a composition for diagnosing colorectal cancer comprising an agent for measuring the expression level of the protein thereof.
  • the present invention provides an agent for measuring the expression level of one or more mRNA or protein selected from the group consisting of KRS and AIMP1. It provides a kit for diagnosing colorectal cancer.
  • the present invention provides information necessary for the diagnosis of colorectal cancer,
  • the present invention is for diagnosing colon cancer comprising an agent for measuring the expression level of one or more mRNAs or proteins thereof selected from the group consisting of KRS lysyl -tRNA synthetase) and AIMPl (aminoacyl-tRNA synthetase comp 1 ex-interacting multifunctional Protein 1)
  • KRS lysyl-tRNA synthetase and AIMPl are significantly more weighted than normal controls in colorectal cancer patients, making them valuable as new colon cancer diagnostic markers. It was confirmed that it is very high.
  • KRS stimulated out of the cells by TNF- ⁇ increased the activity of TNF- ⁇ in macrophage cells by signaling by p38 mitogen activivated kinase. It has been reported to promote the migration of cells.
  • KS has also recently been found to be involved in a variety of diseases. It has been reported that autoantibodies to KRS are present in inflammatory muscle disease patients, and that KRS binds to this enzyme in S0D1 gene mutations that cause Lou Gehrig's disease.
  • KRS can be used as a marker for diagnosing colorectal cancer because the protein level is significantly higher than that in the sera of colorectal cancer patients, and is disclosed for the first time in the present invention.
  • the term "diagnostic marker, diagnostic marker, or diagnostic marker” refers to a material that can diagnose colorectal cancer patients from a normal control group, and is increased in patients with colorectal cancer as compared to a normal control group.
  • Organic biomolecules such as reduced polypeptides or nucleic acids (eg mRNA), lipids, glycolipids, glycoproteins or sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.) and the like.
  • the colorectal cancer diagnostic markers of the present invention are specific in cancer cells as compared to cells in normal gastric tissue.
  • KRS with a high level of expression of the transferred (lysyl-tRNA synthetase) and AIMPKaminoacyl eu tRNA synthetase complex-interact ing mul ti funct ional Protein 1) is a protein which is a gene "and encoded by this.
  • expression 'means that the protein or nucleic acid is produced in the cell. Proteins are used interchangeably with polypeptides or peptide ides and refer to polymers of amino acid residues, for example as commonly found in proteins in nature.
  • Diagnosis in the present invention is to determine the presence or onset of colorectal cancer by measuring the expression level of KRS and / or AIMP1, that is, the level of one or more proteins or mRNA of the markers.
  • the agent for measuring mRNA expression level may be a probe or primer set that specifically binds to mRNA of KS and / or AIMP1.
  • the KRS and AIMP1 mRNA may be derived from a mammal including a human, and preferably, the mRNA of KRS may include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the mRNA of AIMP1 is represented by SEQ ID NO: 2.
  • the primer specifically binds to a polynucleotide that is a template at appropriate buffer and temperature conditions, and the DNA polymerase is linked to the primer by adding nucleoside triphosphate having a base complementary to the template DNA. DNA is synthesized by this.
  • the primer is generally composed of 15 to 30 nucleotide sequences, and the melting temperature (T) of the template strand varies depending on the base composition and length.
  • T melting temperature
  • the sequence of the primer is completely complementary to some nucleotide sequences of the template. It is not necessary to have a sequence, and it is stratified as long as it has a sufficient complementarity within a range that can be unique to the template and can act as a primer.
  • a primer for measuring the expression level of mRNA of each marker is It is not necessary to have a sequence that is perfectly complementary to each gene sequence, and if it has a length and complementarity suitable for the purpose of measuring the amount of mRNA by amplifying a specific section of the mRNA or cDNA through DNA synthesis.
  • Primers for the amplification reaction may be used by template (or sense, sens) at both ends of a specific section of mRNA to be amplified. It consists of a set (pair) of complementary binding to e) and an opposite (ant i sense), respectively, Primers can be easily designed by those skilled in the art by referring to mRNA or cDNA sequences of KRS or AIMP1.
  • the primer of the present invention may preferably be a set, a pair or a combination thereof that specifically binds to the KRS mRNA sequence represented by SEQ ID NO: 1, the AIMP1 mRNA sequence represented by SEQ ID NO: 2, Most preferably, at least one selected from the forward primer selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6 and the reverse primer selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8, but is not limited thereto.
  • SEQ ID NO: 5 and 7 is a primer specific for the KRS mRNA base sequence
  • SEQ ID NO: 6 and 8 is a primer specific to the AIMP1 mRNA sequence.
  • the primer or probe can be variously modified according to methods known in the art within a range that does not interfere with the hybridization with KRS or AIMP1 mRNA.
  • modifications include methylation, encapsulation, substitution of one or more homologs of natural nucleotides and modifications between nucleotides, for example uncharged linkages (e.g. methyl phosphonate, phosphoester, phosphoroamidate, carba). Mate, etc.) or charged linkages (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), and binding of labeling material using fluorescence or enzymes.
  • the agent for measuring the protein expression level may be an antibody that specifically binds to KRS or AIMP1 protein, respectively.
  • the KRS and AIMP1 protein may be derived from a mammal including a human, and preferably, the KRS protein may include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and the AIMP1 protein is SEQ ID NO: 4.
  • Antibody refers to an immunoglobulin (i ⁇ unoglobul in) that specifically binds to the antigenic site.
  • the antibody in the present invention is an antibody that specifically binds only to KRS or AIMP1 protein without reacting to other proteins including other types of aminoacyl thial-NA synthase other than KRS or AIMP1.
  • KRS or AIMP1 antibodies can be prepared by cloning each gene into an expression vector to obtain a protein encoded by the gene, and from the obtained protein according to a conventional method in the art. Fragments of KRS or AIMP1 proteins comprising KRS or AIMP1 antigenic sites may also be used to prepare respective protein specific antibodies.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, polyclonal ant ibody or monoclonal antibody It contains a body (monoclonal ant ibody).
  • a part of the whole antibody is included in the antibody of the present invention as long as it has antigen-antibody binding, and includes all kinds of immunoglobulin antibodies that specifically bind to KRS or AIMP1.
  • immunoglobulin antibodies that specifically bind to KRS or AIMP1.
  • the antibodies of the present invention also include special antibodies and recombinant antibodies such as humanized antibodies and chimeric antibodies as long as they can specifically bind to KRS or AIMP1 proteins.
  • the diagnostic composition of the present invention comprising each of the marker protein-specific antibodies as an agent for measuring the expression level of KRS or AIMP1 may further include an agent necessary for a method for detecting a known protein. Any known method of detecting proteins can be used to determine the level of one or more proteins selected from the group consisting of KRS or AIMP1 in a subject.
  • the present invention provides a kit for diagnosing colon cancer comprising an agent for measuring the expression level of any one or more mRNA or protein selected from the group consisting of KRS and AIMP1.
  • the diagnostic kit of the present invention includes an antibody that recognizes any one or more proteins selected from the group consisting of KRS and AIMP1 as a marker, or a primer or probe that recognizes any one or more mRNAs selected from the group consisting of KRS and AIMP1 as a marker.
  • the diagnostic kit may be a diagnostic kit comprising essential elements necessary for performing reverse transcription polymerase reaction.
  • the reverse transcriptase polymerase kit includes each primer pair specific for the marker gene.
  • the primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of each maca gene, the length of about 7bp to 50bp, more preferably about 10bp to.
  • reverse transcription polymerase reaction kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffer fluid (pH and magnesium concentrations vary), deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymera Enzymes such as agents and reverse transcriptases, DNAse, RNAse inhibitors DEPC-water, sterile water and the like.
  • Another embodiment may be a diagnostic kit characterized by including the necessary elements necessary to carry out the DNA chip.
  • kits can bind to reagents capable of detecting bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (as conjugated to antibodies) and substrates or antibodies thereof. Other substances, and the like.
  • the kit of the present invention may include a washing solution or an eluent capable of removing the enzyme, the substrate to be reacted with, the unbound protein, and the like, and retaining only the bound protein marker.
  • Samples used for analysis include biological samples that can identify infectious inflammatory disease-specific proteins that can be distinguished from normal conditions such as blood, serum, urine, tear fluid, and saliva. Preferably from a biological liquid sample such as blood, serum, plasma.
  • Samples may be prepared to increase the detection sensitivity of protein markers, for example serum samples obtained from patients may be subjected to anion exchange chromatography, affinity chromatography, size exclusion chromatography, liquid chromatography, It may be pretreated using a method such as continuous extract (ion extract) or gel electrophoresis. To provide the information needed to diagnose colorectal cancer
  • Step (c) comparing the expression level of each gene mRNA or the expression level of the protein with the expression level or protein expression level of the corresponding gene mRNA in the normal control sample to determine that the subject with increased expression level has colon cancer; It provides a method for detecting a marker of colorectal cancer comprising.
  • the present inventors provide a method of and to a KRS and AIMP1 first found that it is possible to function as a novel marker of colorectal cancer measuring the expression level of each of the marker provides the information i needed for the diagnosis of colorectal cancer Ah present eu
  • Step (a) of the method of the present invention is a step of receiving a sample of a subject.
  • the sample may be used without limitation as long as it is collected from a subject to diagnose colorectal cancer, for example, cells or tissues obtained by biopsy, blood, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid, various secretions, urine, Feces and the like.
  • Step (b) of the method of the present invention is a step of measuring at least one expression level selected from the group consisting of KRS and AIMP1 in the sample provided in step (a).
  • a method for screening a colorectal cancer therapeutic agent comprising the step of identifying the anticancer activity of a selected candidate substance in a cell or an animal. Specifically, it may be useful for screening a colorectal cancer therapeutic agent by comparing the increase or decrease in the expression of one or more mRNAs or proteins selected from the group consisting of KRS and AIMP1 in the presence and absence of a candidate candidate for treating colorectal cancer. Substances that indirectly or directly reduce the expression level of one or more mRNAs or proteins selected from the group consisting of KRS and AIMP1 may be selected as therapeutic agents for colorectal cancer.
  • the substance whose expression level when the candidate substance for colorectal cancer treatment is present is reduced to the level of marker expression in the absence of the candidate substance for colorectal cancer can be selected as a therapeutic agent for colorectal cancer.
  • the 'anticancer activity' of the present invention means inhibiting abnormal increase in cell division, conversion from normal cells to cancer cells, cell division and proliferation of cancer cells, tumor growth and growth.
  • the cell or animal of the present invention is a cell or animal of a cancer or tumor model, and is commonly used in the art, and may be a cell, tissue, organ, etc. derived from a mammal, including a human, or an animal.
  • the present invention is an expression of one or more mRNAs or proteins thereof selected from the group consisting of lysyl-tRNA synthetase (KRS) and AIMPl (aminoacyl-tRNA synthetase complex ⁇ interacting mult i funct ional Protein 1) for the preparation of a diagnostic agent for colorectal cancer Provide the use of the formulation to determine the level.
  • the agent for measuring mRNA expression level of the gene of the present invention is KRS or AIMP1 It may be a probe or primer set that specifically binds to mRNA, and is the same as described above.
  • the agent for measuring the expression level of the protein of the present invention may be an antibody specific for the protein of KRS or AIMP1, and is the same as described above.
  • Glycyl-tRNA synthetase Glycyl-tRNA synthetase (GRS), lysyl-tRNA synthetase (KRS), histylyl-tRNA synthetase (HRS), tryptophanyl-tRNA synthetase (RS), and AIMP-l (aminoacyl-tRNA) secreted into the serum of normal or colorectal cancer patients
  • Glycyl-tRNA synthetase KRS
  • HRS histylyl-tRNA synthetase
  • RS tryptophanyl-tRNA synthetase
  • AIMP-l aminoacyl-tRNA secreted into the serum of normal or colorectal cancer patients
  • the P value between blood serum secreted proteins in normal and colon cancer patients was analyzed by XLASTAT software using the Mann-Whitney test / Two-tai led test. Dotblot plots, ROC curves, AUC, and standard deviation were analyzed using Graphpad Prism 6 software.
  • the AUC of R0C of KRS and AIMP1 is greater than 0.6 and the p value is less than 0.01, and the amount of KRS and AIMP1 in the serum of colorectal cancer patients is significantly higher than that of normal patients. It was a good biomarker. It was also confirmed that KRS and AIMP1 were better than CA-19-9, a biomarker of colon cancer.
  • the colorectal cancer diagnostic marker of the present invention consisting of KRS and AIMP1 has an increased expression level in the serum of colorectal cancer patients compared to the normal control group. Therefore, by measuring the expression level of one or more markers selected from the group consisting of KRS and AIMP1, it is possible to determine the presence of colorectal cancer accurately and quickly, which is very excellent in industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 대장암 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, KRS( lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMPl(aminoacyl-tRNA synthetasecomplex-interact ing mul t i funct ional Protein 1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물 및 대장암 진단쎄 필요한 정보를 제공하기 위하여 피검체로부터 수득한 시료로부터 상기 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다. KRS 및 AIMP1으로 이루어진 본 발명의 대장암 진단 마커는 대장암 환자의 혈청에서 정상 대조군과 비교해 그 발현수준이 증가해 있다. 따라서, KRS 및 AIMP1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정함으로써 대장암 유무를 정확하고 신속하게 판단할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
대장암 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법
【기술분야】
본 출원은 2016년 2월 25일에 출원된 대한민국 특허출원 게 10-2016-0022470 호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 본 발명은 대장암 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법에 관한 것으로， 보 다 상세하게는， KRS( lysyl-tRNA synthetase) 또는 AIMPl(aminoacyl-tRNA synthetase comp 1 ex- i nt er ac t i ng mul t i funct ional Protein 1) mRNA 또는 이의 단백 질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물， 대장압 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 피검체로부터 수득한 시료로부터 상기 마커를 검출 하는 방법 및 대장암 진단용 제제를 제조하기 위한 KRS( lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMPKaminoacyl-tRNA synthetase com lex- inter act ing mul t i funct ional Protein 1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제의 용도에 관한 것이다.
【배경기술]
우리나라 암 (악성신생물) 사망자 수는 2002년 우리나라 총 사망자 246， 515명 (조사망률 인구 10만 명당 512명) 가운데 25.5% (남성 사망자의 29.6¾>， 여성 사망자 의 20.5%)인 62 , 887명으로 암으로 인한 사망 (사망률 인구 10만명당 130.7명)이 사 망원인 1위를 차지하고 있다. 암 사망순위는 폐암， 위암， 간암, 대장암 및 췌장암 순으로， 이들 5대 암에 의한 사망이 전체 암 사망의 약 70%를 차지하고 있다. 또한 남성에 있어 주요 암 사망원인은 폐암， 위암， 간암 및 대장암 등으로 이들 4대 암 에 의한 사망자 수 (28， 147명)가 전체 남성 암 사망자 수 (40 , 177명)의 70%를 차지하 고 있으며， 여성에 있어 주요 암 사망원인은 위암， 폐암, 간암， 대장암 및 췌장암 등으로 이들 5대 암에 의한 사망자 수 ( 13 , 630명)가 전체 여성 암 사망자 수 (22， 710 명 )의 60%를 차지하고 있다. 대장암은 결장과 직장에 생기는 악성 종양을 말하며, 세계적으로 2000년 발 생률 (945 , 000명 신규 발생， 세계 전체 암의 9.4%)과 사망률 (492 , 000명 사망, 전체 암중 7.9%)이 모든 암 중 세 번째로 높고， 성별로 비교해보면 남자와 여자에게서 비슷한 비율로 발생한다 (남:여 1.1:1). 다른 암들에 비해 상대적으로 예후가 좋기 때문에 유병률은 유방암에 이어 세계적으로 두 번째로 높은데， 과거 5녔 이내에 대 장암으로 진단되어 생존하고 있는 사람이 약 240만 명으로 추정돤다 (Parkin DM, Global cancer statistics in the year 2000, Lancet Oncol 2： 533-543 , 2001). 대 장암 예후는 초기 (1기) 환자의 경우 5년 생존율이 90% 이상인데 반해 전이된 (4기) 환자의 5년 생존율은 5%에 불과하다 (Cancer Facts and Figures 2004. American Cancer Society, 2004) . 우리나라에서는 최근 식생활 문화의 서구화로 대장암의 발생률과 사망률이 현저히 증가하고 있다. 보건복지부와 한국증앙암등록본부에서 발간한 한국중앙암등 록사업 연례 보고서 (2002. 1 ~ 2002. 12)에 따르면 2002년에 대장암 발생건수가 11，097건으로 전체 발생 암의 11. 를 차지하는 네 번째로 많은 암이다. 성별로는 남성이 6 ,423명으로 여성 (4， 674명 )보다 많으며 연령별로는 60대가 가장 많고 (3， 751 명), 50대가 그 뒤를 잇고 있다 (2，400명). 1999년부터 2002년까지 4년간 자료에 의 하면 대장암의 발생률이 꾸준히 증가하고 있으며 조발생률 (인구 100,000명당 새로 발생한 암환자수)을 보면 1999년에 비해 2002년에 남자의 경우 22.5에서 30.7로 36.4% 증가하였으며， 여자의 경우 18.8에서 23.1로 22.9% 증가하여 전체적으로 20.6에서 26.9로 30.6%나 크게 증가하였다 (1993-2002년 암발생자의 생존율 및 1999-2002년 암 발생률， 보건복지부， 2007. 7.). 2006년에 대장암으로 사망한 사람 은 총 6 ,277명으로 전체 암 사망의 4위 (9.5%)이며 남자는 3， 453명으로 4위 (8.0%), 여자는 2, 824명으로 3위 (11.5%)를 차지하였다. 또한 대장암은 폐암 다음으로 지난 10년 동안 사망률이 가장 많이 증가한 암이다 (2006년 사망 및 사망원인통계결과, 통계청, 2007. 9.). 대장암의 경우 제거할 수 있는 전암성 병변이나 치료할 수 있는 초기단계 암 으로부터 발달이 느리기 때문에 대장암 스크리닝은 이 질병의 발생률과 사망률을 줄일 수 있는 가능성이 있다. 50세 이상의 성인 남녀 모두에 대한 대장암 스크리닝 검사를 통해 대장암으로 인한 사망률을 감소시킬 수 있다고 믿어진다 (Walsh JM & Terdiman JP, JAMA 289:1288-96, 2003). 그러나 현재 가장 신뢰성 있는 스크 리닝 방법인 대장내시경에 대한 순응도와 보급률이 낮다. 반대로 현재 가장 널리 시행되는 비침입성 스크리닝 (noninvasive screening) 읍션인 분변 잠혈검사 (fecal occul t blood test , FOBT)는 무.엇보다 민감도가 낮다는 문제를 포함하여 여러 중요 한 한계점들이 있다. 미국의 경우 2002년에 50세 이상 성인 중 40%만 지난 5년 이 내에 대장내시경 검사를 받았고， 12개월 이내에 분변 잠혈검사를 받은 사람은 22% 에 불과했다 (Behavior r i sk factor survey, Nat ional center for chroni c di sease prevent ion and heal th promot ion. Centers for di sease control and prevent ion , 2002) . 대장암 스크리닝 검사에 대한 참여율이， 특히 유방암과 자궁경부암에 비해 낮은 이유는 환자의 불편함， 비용， 인지도 부족， 현재 스크리닝 방법에 대한 낮은 수용성 등을 포함하는 여러 요인들 때문이다. 따라서 정확하고 신속하게 대장암을 조기 진단하기 위한 새로운 마커의 개발 이 매우 중요하다고 할 수 있다.
[발명의 상세한 설명]
【기술적 과제】
이에 본 발명자들은 대장암을 효과적으로 진단할 수 있는 바이오 마커를 개 발하고자 예의 노력한 결과， 대장암 환자의 혈청에서 간단하고 신속하게 검출이 가 능하고， 민감도 및 특이도가 높은 바이오 마커를 발견하고 본 발명을 완성하였다. 따라서， 본 발명의 목적은 KRS( lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMP aminoacyl— tRNA synthetase complex- inter act ing mul t i funct ional Protein 1)로 이루어진 군 에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 키트 를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
(a) 피검체로부터 시료를 제공받는 단계 ;
(b) 상기 시료에서 KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 유전자 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자 mRNA의 발현 수준 또는 단백질 발현 수준과 비교하여 발현 수 준이 증가한 피검체를 대장암에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 대장암의 마커를 검출하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은
(a) 대장암 환자로부터 제공받은 시료에 대장암의 치료 후보물질을 투여하는 단계; ,
(b) 후보물질의 존재 또는 부존재하에서, 상기 시료에서, KRS 및 AIMP1로 이 루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
(c) 후보물질 존재하에서 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준과 후보 물질 부존재하에서 해당 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 비교하는 단 계;
(d) 후보물질 존재하에서 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 감소 시키는 물질을 선별하는 단계; 및
(e) 선별된 후보물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계를 포 함하는， 대장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 대장암 진단용 제제를 제조하기 위한 KRS( lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMPl(aminoacyl-tRNA synthetase complex— interact ing mul t i funct ional Protein 1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KRS( lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMPl(aminoacyl-tRNA synthetase complex- inter act ing mul t i funct ional Protein 1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제 공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 KRS 및 AIMP1으로 이루어 진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 대장암 진단에 필요한 정 보를 제공하기 위하여，
(a) 피검체로부터 시료를 제공받는 단계;
(b) 상기 시료에서 KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 유전자 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자 mRNA의 발현 수준 또는 단백질 발현 수준과 비교하여 발현 수 준이 증가한 피검체를 대장암에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 대장암의 마커를 검출하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여
(a) 대장암 환자로부터 제공받은 시료에 대장암의 치료 후보물질을 투여하는 단계;
(b) 후보물질의 존재 또는 부존재하에서， 상기 시료에서， KRS 및 AIMP1로 이 루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계 ;
(c) 후보물질 존재하에서 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준과 후보 물질 부존재하에서 해당 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 비교하는 단 계;
(d) 후보물질 존재하에서 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 감소 시키는 물질을 선별하는 단계; 및
(e) 선별된 후보물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계를 포 함하는， 대장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 대장암 진단용 제제를 제조하기 위 한 KRS( lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMPl(aminoacyl-tRNA synthetase complex- interact ing mul t i funct ional Protein 1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공하는 것이다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 KRS lysyl -tRNA synthetase) 및 AIMPl(aminoacyl-tRNA synthetase comp 1 ex- interacting multifunctional Protein 1)으로 이루어진 군에서 선택된 하 나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명자들은 KRS lysyl -tRNA synthetase) 및 AIMPl(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional Protein 1)가 대장암 환자에서 정상인 대조군보다 현저하게 중가함을 처음으로 확인하여， 새로운 대장암 진단 마 커로서의 가치가 매우 높다는 것을확인 -하였다. 본 발명의 다른 일실시예에서는 KRS lysyl -tRNA synthetase) 및 AIMPl(arainoacyl-tRNA synthetase complex—interacting multifunctional Protein 1) 의 ROC curve 분석을 통하여 상기 각 마커들이 대장암을 진단함에 있어서 민감 성 (sensitivity)과 정확성 (specif icity)이 뛰어난 것을 확인하였다. 본 발명의 진 단 마커들의 민감성과 정확성은 종래 대장암 진단 마커 증 하나인 CA19-9과 비교해 도 현저히 우수하였다. 본 발명자들의 발견을 바탕으로 본 발명은 KRS(lysyl-tRNA synthetase) 및 / 또는 AIMPl(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional Protein 1)의 발현 수준， 즉 KRS(lysyl-tRNA synthetase) 및 /또는 AIMPl(aminoacyl-tRNA synthetase comp lex- inter act ing multifunctional Protein 1) 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제 공한다.
Aminoacyl-tRNA synthetase(ARS)는 특정 아미노산을 그 해당하는 tRNA에 붙 여주는 역할을 하는 효소이며. 고등생물의 경우 아미노산 종류에 따른 20 개의 효 소외에 ΑΙΜΡ1(ρ43), (AIMP2)p38, (AIMP3)pl8 등 multi synthetase complex 형성에 관여하는 3종류를 포함하여 23종의 효소로 구성되어 있으며 multi synthetase complex에 참여하는 효소외에 몇몇은 free form 형태로도 존재한다. 그러나 최근에 들어 기본적인 기능외에 특정 환경에서 다양한 다른 활성기능을 가지고 있음이 보 고 되었는데 KRS 및 AIMP1이 그 중의 하나이다. KRS는 macrophage활성화를 통해 면역반웅을 유도하는 것으로 밝혀졌는데 TNF-α에 의하여 세포 밖으로 분비 촉진된 KRS는 p38 mitogen activivated kinase 등에 의한 신호전달에 의하여 macrophage 세포의 TNF- α에 의한 활성올 증가시키거 나 세포의 migration을 촉진시키는 것으로 보고되었다. K S는 또한 다양한 질환에 서 관여하는 것으로 최근 밝혀지고 있다. 염증성 근육질환환자에서 KRS에 대한 자 가항체가 존재함이 보고되었고， 루게릭병의 원인이 되는 S0D1 유전자 변이환자에서 KRS가 이 효소에 결합하여 관여함이 보고된 바 있다. 그러나， KRS가 대장암 환자의 혈청에서 정상인 환자군과 비교해 단백질 수치가 현저히 높아 대장암 진단용 마커 로서 사용될 수 있다는 점에 대해서는 알려진 바가 없으며， 본 발명에서 최초로 공 개하는 것이다.
AIMPKARS-interacting multi-functional protein 1)은 종래에 p43 단백질로 알려진 것으로서 최근 AIMP1으로 재명명된 단백질이다 (Sang Gyu Park, et al. , Trends in Biochemical Sciences, 30:569-574， 2005) . 상기 AIMPl은 312개의 아미 노산으로 이루어진 단백질로서， 다중 tRNA 합성효소 복합체 (mult i-tRNA synthetase complex)에 결합하여 (Deutscher， M. P., Method Enzymol , 29, 577-583, 1974； Dang C. V. et al. , Int. J. Biochem. 14， 539-543, 1982； Mirande, M. et al . , EMBO J. 1， 733-736, 1982; Yang D. C. et al . , Curr . Top Cell . Regul . 26, 325-335, 1985) 상기 다중 -tRNA 합성효소의 촉매적 활성 (catalytic activity)을 증진시키는 단백질이다 (Park S. G. et al . , J. Biol. Chem. 274, 16673-16676, 1999) . 분비된 AIMPl은 단핵구 /마크로파지， 내피세포 및 섬유아세포와 같은 다양한 표적세포에 작 용하는 것으로 알려져 있다. 그러나， AIMP1이 대장암 환자의 혈청에서 정상인 환자 군과 비교해 단백질 수치가 현저히 높아 대장암 진단용 마커로서 사용될 수 있다는 점에 대해서는 알려진 바가 없으며， 본 발명에서 최초로 공개하는 것이다. 본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커 (diagnosis marker)"란 대장암 환자를 정상 대조군과 구분하여 진단할 수 있는 물 질로, 정상 대조군에 비하여 대장암을 가진 환자에서 증가 또는 감소를 보이는 폴 리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질， 당지질, 당단백질 또는 당 (단당류， 이 당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적 상, 본 발명의 대장암 진단 마커는 정상 위 조직의 세포에 비하여, 암 세포에서 특 이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 KRS( lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMPKaminoacylᅳ tRNA synthetase complex—interact ing mul t i funct ional Protein 1) 유전자 '및 이에 의해 코딩되는 단백질이다. 본 발명에서 발현 (express ion) '은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것 을 의미한다. 단백질은 폴리펩타이드 (polypept ide) 또는 펩타이드 (pept ide)와 호환 성 있게 사용되며， 예컨대， 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같 이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 폴리뉴클레오티드 (polynucleot ide) 또는 핵 산은 단일 -또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 리보뉴 클레오티드 (RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한， 자연적으로 생성되는 뉴클레오티 드와 비슷한 방법으로 핵산에 흔성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그 도 포함된다. ' mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자로부터 아미노산 서열을 특정하게 되는 리보솜으로 유전 정보 (유전자 특이적 염기 서열)를 전달하는 RNA이 다. 진단은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서 의 진단은 KRS 및 /또는 AIMP1의 발현 수준， 즉 상기 마커들 중 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하여 대장암의 병리 존재 또는 발병 여부를 확인하는 것이 다. 한편 본 발명의 진단용 조성물이 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 것일 때 에는 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 K S 및 /또는 AIMP1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트일 수 있다. 상기 KRS 및 AIMP1 mRNA는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 것일 수 있으 며, 바람직하게는 상기 KRS의 mRNA는 서열번호 1 및 AIMP1의 mRNA는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 KRS 및 AIMP1로 이루어진 군에 서 선택된 어느 하나 이상의 mRNA 특이적인 프로브 또는 프라이머 세트를 KRS 및 AIMP1로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 제제로 포함하는 본 발명의 진단용 조성물은 공지된 RNA를 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 본 조성물을 이용하여 공지된 RNA를 감지하는 방법을 제한 없이 사용하여 피검체에서 상기 마커들의 mRNA의 수준을 측정할 수 있다. 프라이머 (pr imer)는 DNA 합성의 개시점 (start ing point )으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드 (single strand ol igonucleot ide)이다. 프라이머는 적 합한 완층액 (buffer)와 온도 조건에서 주형 (template)인 폴리뉴클레오티드에 특이 적으로 결합하고， DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴 클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머 는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며， 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도 (mel t ing temperature , T 가 달라진다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며， 주형과 흔성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에 서의 층분한 상보성을 가지면 층분하다. 따라서 본 발명에서 상기 각 마커들의 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머는 각 유전자 서열에 완벽하게 상보적 인 서열을 가질 필요는 없으며， DNA 합성을 통해 mRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증 폭하여 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 층분하 다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형 (또는 센스， sense)과 반대편 (안티센스， ant i sense)에 각각 상보적으 로 결합하는 한 세트 (쌍)으로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 KRS 또는 AIMP1의 mRNA또는 cDNA 염기서열을 참조하여 용이하게 디자인할 수 있다.
― 본 발명의 프라이머는 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 KRS mRNA 염기서 열, 서열번호 2로 표시되는 AIMP1 mRNA 염기서열에 특이적으로 결합하는 한 세트， 한 쌍 또는 이들의 조합일 수 있으며 ，가장 바람직하게는 서열번호 5 및 6으로 이 루어진 군에서 선택되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7 및 8로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머에서 각각 하나 이상씩 선택될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 서열번호 5 .및 7은 KRS mRNA 염기서열에 특이적인 프라이머, 서열번호 6 및 8은 AIMP1 mRNA 염기서열에 특이적인 프라이머이다.
'프로브 (probe) '는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA( complementary DNA)에 특이적 으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기 (base pair) 길이의
RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며， 표지 ( label ing)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무， 발현양 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 KRS 또는 AIMP1 mRNA에 상보적인 프로브를 피검체의 시료와 흔성 화 반웅 (hybridizat ion)을 수행하여 KRS 또는 AIMP1 mRNA의 발현양을 측정함으로써 대장암의 진단에 이용할 수 있다. 프로브의 선택 및 흔성화 조건은 당업계에 공지 된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 (phosphoramidi te) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지 된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있 다. 또한 프라이머 또는 프로브는 KRS 또는 AIMP1 mRNA와의 흔성화를 방해하지 않 는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이 러한 변형의 예로는 메틸화， 캡화， 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치 환 및 뉴클레오티드 간의 변형， 예를 들면 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포 네이트， 포스포트리에스테르， 포스포로아미데이트， 카바메이트 등) 또는 하전된 연 결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등) , 그리고 형광 또는 효소 를 이용한 표지물질 ( label ing material )의 결합 등이 있다. 본 발명의 진단용 조성물이 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 것일 때에 는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 KRS 또는 AIMP1 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 상기 KRS 및 AIMP1 단백질은 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 것일 수 있 으며, 바람직하게는 KRS 단백질은 서열번호 3 및 AIMP1 단백질은 서열번호 4로 표 시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 항체 (ant ibody)는 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 ( i匪 unoglobul in)을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 KRS 또는 AIMP1 이외에는 다 른 종류의 아미노아실 티알엔에이 합성효소를 포함하는 다른 단백질에는 반웅하지 않고， KRS 또는 AIMP1 단백질에만 특이적으로 결합하는 항체이다. KRS 또는 AIMP1 항체는 각 유전자를 발현백터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 을 수득하고， 수득한 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. KRS 또는 AIMP1 항원성 부위를 포함하는 KRS 또는 AIMP1 단백질의 단편을 이용하여 각각의 단백질 특이적인 항체를 제조할 수도 있다. 본 발명의 항체의 형 태는 특별히 제한되지 않으며， 다클론항체 (polyclonal ant ibody) 또는 단일클론항 체 (monoclonal ant ibody)를 포함한다. 또한 항원 -항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며， KRS 또는 AIMP1에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체 뿐 아니라 항체 분자의 기능적 인 단편， 즉 항원 결합 기능올 갖는 Fab , F(ab' ) , F(ab ' )2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 KRS 또는 AIMP1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체， 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다. 상기 각 마커 단백질 특이적인 항체를 KRS 또는 AIMP1의 발현 수준을 측정하 는 제제로 포함하는 본 발명의 진단용 조성물은 공지된 단백질을 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가적으로 포함할 수 있으며， 본 조성물을 이용하여 공지된 단백질 을 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체에서 KRS 또는 AIMP1로 이루어진 군 에서 선택된 하나 이상의 단백질의 수준을 측정할 수 있다. 또한 본 발명은 KRS 및 AIMP1 으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상 의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 키트 를 제공한다. 본 발명의 진단용 키트에는 KRS 및 AIMP1 으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질을 마커로 인식하는 항체 또는 KRS 및 AIMP1 으로 이루어진 군 에서 선택된 어느 하나 이상의 mRNA를 마커로 인식하는 프라이머， 프로브뿐만 아니 라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물， 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 구체적인 양태로서 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반웅을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반웅 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한 다. 프라이머는 각 마카 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타 이드로서 , 약 7bp 내지 50bp의 길이， 보다 바람직하게는 약 10bp 내지 . 30bp의 길이 이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반웅 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너， 반응 완 층액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양)， 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs) , Taq-폴리머라아 제 및 역전사효소와 같은 효소， DNAse , RNAse 억제제 DEPC-수 (DEPC—water)， 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또 다른 양태로는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것 을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 을리고뉴클레오티드 (ol igonucleot ide)가 부착되어 있는 기판， 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약， 제제， 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는， ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것 올 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적 인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반웅성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면， 표지된 2차 항체， 발색단 (chromophores) , 효소 (항체와 컨주게이트된 형태로서) 및 그의 기 질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한， 본 발명의 키트는 효소와 발색 반웅할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커 만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다. 분석을 위해 사용되는 시료는 혈액， 혈청, 소변， 누액， 타액 등 정상적인 상 태와 구별될 수 있는 감염성 염증 질환 특이적 단백질올 확인할 수 있는 생체 시료 를 포함한다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료， 예를 들어 혈액， 혈청， 혈장으로 부터 측정될 수 있다. 시료는 단백질 마커의 탐지 감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 환자로부터 수득한 혈청 시료는 음이온 교환 크로마토그래피， 친 화도 크로마토그래피， 크기별 배제 크로마토그래피 (size exc lusion chromatography) , 액체 크로마토그래피, 연속추출 (sequent i al extract ion) 또는 젤 전기영동 등의 방법올 이용하여 전처리될 수 있다. 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여，
(a) 피검체로부터 시료를 제공받는 단계; (b) 상기 시료에서 KRS 및 AIMP1 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 각 유전자 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조 구 시료의 해당 유전자 mRNA의 발현 수준 또는 단백질 발현 수준과 비교하여 발현 수준이 증가한 피검체를 대장암에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 대장암의 마커를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명자들은 KRS 및 AIMP1가 대장암의 신규한 마커로서 기능할 수 있음을 처음 발견하여 상기 각 마커들의 발현 수준을 측정하여 대장암의 진단에 필요한 정 보ᅵ를 제공하는 방법을 제공한다 아하 본ᅳ발명의 방법을 단계에 따라 설명한다 . 본 발명의 방법의 (a) 단계는 피검체의 시료를 제공받는 단계이다. 상기 시료는 대장암 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 것이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액， 전혈， 혈청, 혈장， 타액, 뇌척수액， 각종 분비물， 소변， 대변 등일 수 있다. 바람직하게 는 혈액, 혈장， 혈청, 타액， 비액， 객담， 관절낭액, 양수， 복수, 자궁경부 또는 질 분비물， 소변 및 뇌척수액일 수 있다. 가장 바람직하게는 혈액, 혈장, 또는 혈청일 수 있다. 본 발명의 방법의 (b) 단계는 (a) 단계에서 제공한 시료에서 KRS 및 AIMP1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계이다. 상기 발현 수준은 KRS 및 AIMP1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준일 수 있다. 각 단백질의 발현 수준은 각 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 검출하거나 측정할 수 있다. 단백질 특이적인 항체는 본 발명의 진단용 조성물에 서술한 바와 같다. 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 당업계에서 공지되어 있 는 방법은 제한 없이 사용할 수 있으며， 그 예로 웨스턴 블랏팅 (western blott ing) , 닷 블랏팅 (dot blott ing) , 효소면역분석법 (enzyme— 1 inked i隱 unosorbent assay, ELISA) , 방사능 면역분석법 (RIA) , 방사면역확산법， 오우크테 ¾니 면역 확산법， 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법 (i瞧 unoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법 (FACS) 또는 단백질 칩 (chip) 방법 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 '아니다. 바람직하게는 ELISA 방법 을 이용할 수 있다. 각 마커들의 mRNA 수준은 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트나 프로 브를 이용하여 피검체의 시료로부터 각 마커들의 mRNA나 cDNA를 증폭하거나, 프로 브와 흔성화 반웅(1¾ ^(1123 011)을 이용하여 피검체 시료 내 각 마커들의 mRNA의 존재와 발현량을 측정할 수 있다. 프라이머와 프로브는 본 발명의 진단용 조성물에 서 서술한 바와 같다. mRNA 발현 수준의 측정은 당업계에서 통상적인 발현 수준 확 인 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 분석 방법의 예로 역전사중합체연쇄반웅 (reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) , 경쟁적 RTᅳ PCRCcompetitive RT-PCR) , 실시간 RT— PCR(real_Ume RT-PCR) , RNase 보호 분석법 (RPA:RNase protection assay) , 노던 블랏팅 (northern blotting), DNA 마이크로어 레이 칩 (microarray chip), RNA 염기서열분석 (RNA sequencing), 나노스트링 (nanostring)을 이용한 흔성화 방법， 조직 절편의 인시투 흔성화 방법 situ hybridization) 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법의 (c) 단계는 (b) 단계에서 측정한 피검체 시료의 KRS 및 AIMP1 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 정상 인과 비교하고 정상인에 비해 그 발현 수준이 증가한 피검체를 대장암에 걸린 것으 로 판정하는 단계이다. 상술한 (b) 단계의 방법으로 측정한 피검체의 각 마커들의 발현 수준을， 동 일한 방법으로 측정한 정상인의 마커 수준과 비교한다. 각 마커들의 발현 수준이 건강한 정상인에 비하여 증가한 피검체를 대장암에 걸린 것으로.판정한다. 본 발명은 또한
(a) 대장암 환자로부터 제공받은 시료에 대장암의 치료 후보물질을 투여하는 단계;
(b) 후보물질의 존재 또는 부존재하에서, 상기 시료에서, RS 및 AIMP1로 이 루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계 ; (c) 후보물질 존재하에서 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준과 후보 물질 부존재하에서 해당 mRNA의 발현 수준'또는 단백질의 발현 수준을 비교하는 단 계;
■ (d) 후보물질 존재하에서 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 감소 시키는 물질을 선별하는 단계; 및
(e) 선별된 후보물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계를 포 함하는， 대장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 구체적으로， 대장암 치료 후보 물질의 존재 및 부존재 하에서 KRS 및 AIMP1 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질 발현의 증가 또는 감 소를 비교하는 방법으로 대장암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있 다. KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발 현 수준올 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 대장암의 치료제로서 선 택할 수 있다. 즉， 대장암 치료 후보 물질의 부존재 하에 대장암 세포에서의 본 발 명의 마커의 발현 수준을 측정하고， 또한 대장암 치료 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후， 대장암 치료 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 마커의 발현 수준이 대장암 치료 후보 물질의 부재 하에서 의 마커 발현 수준보다 감소시키는 물질을 대장암의 치료제로 선택할 수 있는 것이 다.
본 발명의 상기 '항암 활성' 은 비정상적인 세포 분열의 증가， 정상 세포에 서 암 세포로의 전환， 암 세포의 세포 분열과 증식， 종양의 발생과 성장 등을 억제 하는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 '세포 또는 동물' 은 암 또는 종양 모델의 세포 또는 동물 이며， 당업계에서 통상적으로 사용되는 것으로， 인간을 포함하는 포유동물， 동물에 서 유래한 세포， 조직, 기관 등일 수 있다. 본 발명은 대장암 진단용 제제를 제조하기 위한 KRS( lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMPl(aminoacyl-tRNA synthetase complexᅳ interact ing mult i funct ional Protein 1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발 현 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공한다. 본 발명의 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 KRS 또는 AIMP1 의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트일 수 있으며, 상기 기 재된 바와 동일하다.
본 발명의 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 KRS 또는 AIMP1의 단 백질에 특이적인 항체일 수 있으며， 상기 기재된 바와 동일하다.
본 발명의 상기 K S의 mRNA는 서열번호 1 및 AIMP1의 mRNA는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것일 수 있고, 본 발명의 상기 KRS 단백질은 서열 번호 3 및 AIMP1 단백질은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 기재된 바와 동일하다.
본 발명은 대장암 진단용 키트를 제조하기 위한 KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제의 용도 를 제공할 수 있다. 본 발명의 상기 키트는 RT-PCR키트， DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있으며， 이에 제한되지는 않는다.
【유리한 효과】
KRS 및 AIMP1으로 이루어진 본 발명의 대장암 진단 마커는 대장암 환자의 혈 청에서 정상 대조군과 비교해 그 발현수준이 증가해 있다. 따라서， KRS 및 AIMP1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정함으로써 대장암 유 무를 정확하고 신속하게 판단할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 정상인군과 대장암 환자군의 1청 단백질 수치를 dot blot으로 나타 낸 결과이다 (A: GRS, B: KRS, C: AIMP1 , D: HRS, E: WRS, F: CA-19-9, G: TNF- α. , H: IL-10) 도 2는 혈청 단백질 수치의 R0C 커브를 나타낸 도면이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법> 1. 실험시료의 입수
대장암 환자의 혈청을 삼성의료원 (서울，대한민국)에서 임상시험심사위원회의 규정에 따라 입수하였다. 정상환자군은 32명, 대장암 환자군은 총 164명의 샘플올 입수하여 분석하였다.
실험에 사용된 환자의 임상학적 정보는 표 1에 기재한 바와 같다.
【표 1】
정상군 및 대장암 환자의 임상적 및 병리학적 정보
Figure imgf000019_0001
2. 효소면역분석법 (ELISA assay)
정상인 또는 대장암 환자의 혈청으로 분비된 GRS(glycyl-tRNA synthetase ), KRS(lysyl-tRNA synthetase), HRS(hist idyl-tRNA synthetase), RS(tryptophanyl- tRNA synthetase) , AIMP-l(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interact ing multifunctional Protein 1), TNF- α， IL— 10 및 CA— 19— 9의 수치를 제조사의 지시에 따라 효소면역분석 키트를 이용하여 분석하였다. 단백질의 분비량은 마이크로플레 이트 리더 (TECAN)을 이용하여 측정하였다. 각각의 혈청 단백질 분석 키트의 제조사 는 다음과 같다:
GRS, HRS, WRS ELISA kit(Cusabio, China)
AIMP1 ELISA kit(Elab science, China)
KRS ELISA kit(Mybiosource, USA)
TNF— a, IL-10 (BD science, USA)
CA 19-9 (Abnova, Taiwan) 3. 통계학적 분석
정상인과 대장암 환자의 혈정으로 분비된 단백질 사이의 P value는 Mann- Whi tney test/ Two-tai led test로 XLASTAT 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. Dotblot plot , ROC curve, AUC, 표준편차는 Graphpad Prism 6 소프트웨어를 이용하 여 분서하였다.
<실험결과>
<실시예 1>
정상인과 대장암 환자 혈청 분석결과
대장암에 특이적인 마커를 검색하기 위하여， 정상인 32명 및 대장암 환자 164명의 혈청 단백질을 효소면역분석법 (ELISA)으로 분석하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 2 및 도 1에 나타내었다.
【표 2】
정상인과 대장암 환자의 혈청 단백질 분석결과
561.2*137.3. 535.5433.08
瞧 删
234¾278.2 2628±115.§
ms 1302J55.33
1:711±143J- 2βΰ0±88.32
>3 1425*20,01 6±5,觀.
i7. 0±13.17 167.9^1.54
»爵' 7©,63±11J0 234,3 4® J3
상기 표 2 및 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이， 대장암 환자의 혈청에서 KRS( lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMPKaminoacyl-tRNA synthetase com lex- interact ing mult i funct ional Protein 1)의 단백질 수치가 정상인군과 비교해 현저 하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 특히， KRS의 경우에는 기존의 대장암 진단 마커 중 하나인 CA 19-9 보다도 현저히 우수한 것으로 확인되었다. <실시예 2>
ROC 커브 분석
도 2에 나타낸 바와 같이， KRS, AIMP1의 R0C의 AUC가 0.6보다 크게 나오고 p value 값이 0.01 보다 작게 나와 통계학적으로 KRS, AIMP1의 양이 대장암 환자의 혈청 내의 수치가 정상인의 수치보다 유의미하게 기 때문에 좋은 바이오 마커임 올 알 수 있었다. 또한 KRS, AIMP1이 기존의 대장암의 바이오마커인 CA— 19-9보다도 더 좋은 것을 확인하였다.
【산업상 이용가능성】
KRS 및 AIMP1으로 이루어진 본 발명의 대장암 진단 마커는 대장암 환자의 혈 청에서 정상 대조군과 비교해 그 발현수준이 증가해 있다. 따라서, KRS 및 AIMP1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정함으로써 대장암 유 무를 정확하고 신속하게 판단할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

Claims

【청구의 범위]
【청구항 1】
KRS( lysyl-tRNA, synthetase) 및 AIMPKaminoacyl-tRNA synthetase complex- interact ing mult i funct ional Protein 1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조 성물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 KRS 또는 AIMP1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 KRS 또는 AIMP1의 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 4】
제 1항에 있어서， KRS의 mRNA는 서열번호 1 및 AIMP1의 mRNA는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 5】
제 1항에 있어서， 상기 K S 단백질은 서열번호 3 및 AIMP1 단백질은 서열번호 4로 표시되는 아미노산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 6]
K S 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 키트.
[청구항 7】
제 6항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR키트， DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트 인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 8]
대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여，
(a) 피검체로부터 시료를 제공받는 단계;
(b) 상기 시료에서 KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 유전자 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자 mRNA의 발현 수준 또는 단백질 발현 수준과 비교하여 발현 수 준이 증가한 피검체를 대장암에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 대장암의 마커를 검출하는 방법 .
【청구항 9]
제 8항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청， 타액， 비액, 객담， 관절낭 액， 양수， 복수, 자궁경부 또는 질 분비물， 소변 및 뇌척수액으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 10]
제 8항에 있어서， 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합 효소반응， 경쟁적 역전사효소 중합효소반웅， 실시간 역전사효소 중합효소반웅, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 를 이용하는 것인 방법.
【청구항 111
거] 8항에 있어서， 상기 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블 랏, ELISA, 방사선면역분석， 방사 면역 확산법， 오우크테로니 면역 확산법， 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색， 면역침전 분석법， 보체 고정 분석법, FACS 및 단백 질 칩 방법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것인 방법.
【청구항 12]
(a) 대장암 환자로부터 제공받은 시료에 대장암의 치료 후보물질을 투여하는 단계;
(b) 후보물질의 존재 또는 부존재하에서, 상기 시료에서， KRS 및 AIMP1로 이 루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계 ;
(c) 후보물질 존하에서 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준과 후보 물질 부존재하에서 해당 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준올 비교하는 단. 계;
(d) 후보물질 존재하에서 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 감소 시키는 물질을 선별하는 단계; 및
(e) 선별된 후보물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계를 포 함하는, 대장암 치료제의 스크리닝 방법 .
【청구항 13】
대장암 진단용 제제를 제조하기 위한 KRSUysyl-tRNA synthetase) 및 AIMPl(aminoacyl-tRNA synthetase complex- inter act ing mul t i funct ional Protein 1)으로 이루어진 군에서 선택된 '하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제의 용도.
【청구항 14】
제 13항에 있어서， 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 KRS 또 는 AIMP1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트인 것을 특징으 로 하는 용도.
【청구항 15】
제 13항에 있어서， 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 KRS 또는 AIMP1의 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
PCT/KR2017/002081 2016-02-25 2017-02-24 대장암 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법 WO2017146529A1 (ko)

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