KR100931997B1

KR100931997B1 - 간세포암 종양 마커로서의 ｋｌｋ-5 유전자 및 이를 이용한간세포암 진단 방법

Info

Publication number: KR100931997B1
Application number: KR1020080007281A
Authority: KR
Inventors: 송은영; 박미영; 이희구; 김대곤; 유경란; 윤도영; 염영일; 김선영
Original assignee: 한국생명공학연구원; 전북대학교산학협력단
Priority date: 2008-01-23
Filing date: 2008-01-23
Publication date: 2009-12-15
Also published as: KR20090081289A

Abstract

본 발명은 간세포암 종양 마커로서의 KLK-5 및 이를 이용한 간세포암의 진단 방법에 관한 것이다. 또한 상기 간세포암 종양 마커의 존재를 측정하는 제제를 포함하는 간세포암 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다.

간세포암, 진단, 표지자, 키트

Description

간세포암 종양 마커로서의 ＫＬＫ-5 유전자 및 이를 이용한 간세포암 진단 방법{KLK-5 as a tumor associated marker of Hepatocellular carcinoma and a method of diagnosing Hepatocellular carcinoma using the same}

본 발명은 새로운 간세포암 진단 마커로서의 KLK-5 유전자의 규명 및 이를 이용한 간세포암의 진단 및 예후 측정에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 간세포암 진단 마커인 KLK-5 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하여 간세포암을 진단 및 예후를 측정할 수 있는 진단 키트 및/또는 이를 이용한 간세포암의 진단 및 예후 측정 방법에 관한 것이다.

간세포암(Hepatocellular carcinoma)은 간에서 발생하는 원발성 간암을 의미하며, 다른 부위에서 생겨서 간으로 전이된 암은 간세포암이 아니다. 이것은 전체 간암의 90％ 이상을 차지한다. 이 암은 치료를 하더라도 환자의 40∼80％는 재발한다. 대부분 다시 간에 재발하지만, 폐와 림프절, 복강을 둘러싸고 있는 안쪽 벽과 종격동에서 나타날 수도 있다. 남성과 여성 환자의 비율은 5 대 1 정도이고, 대부분 중년 이후에 발생한다.

원인은 B형간염 바이러스와 C형간염 바이러스, 알코올성 간질병, 대사성 만성 간질병, 독성물질 등이다. 특히 국내에서는 이 질병 환자의 65∼80％는 B형간염 항원 보균자로 알려져 있다.

간세포암은 초기에는 증세가 나타나지 않고, 증세가 나타난 경우 이미 많이 진행된 것이다. 증세는 주로 피로감, 복부 통증이나 때로 팽만감과 식욕부진이 나타난다. 특징적인 증세는 명치에서 응어리가 느껴지는 것으로 상당히 진행된 상태에서 나타난다. 만약 복강 안에서 간세포암이 터진 경우에는 갑작스러운 복부 통증 및 팽만, 저혈압이나 쇼크 등이 일어난다.

이 질병 환자는 간세포암이 진행하여 사망하기도 하지만 동반하고 있는 간경화증 때문에 사망하는 경우도 있으므로 간세포암의 진행을 막는 동시에 간경화증의 진행을 방지하는 치료를 시행하여야 한다. 조기에 암을 발견하여 수술을 시행하면 완전히 치료할 수 있다. 그러나 암이 많이 진행한 경우, 간기능 상태가 나쁜 경우, 신체 다른 부위로 이미 전이한 경우에는 수술을 할 수 없어 경피적 에탄올주입법과 경도자동맥화학색전술, 고주파전기소작치료 등을 시행한다.

간세포암은 예후가 나쁜 질병이기 때문에 예방과 조기발견이 중요하다. 이를 위해서는 B형 간염 백신을 접종하고, 만성간염 또는 간경화증을 가진 환자의 경우에는 3∼6개월에 1번씩 검진을 한다.

최근에 p53, β-catenin, Axin1과 같은 종양억제 유전자(tumor suppressor gene) 또는 종양성 유전자(oncogene)의 변이(mutation)가 종양 조직에서 발견되었고 이들이 간암발생에 관여할 것이라는 보고가 있지만, 이들 유전자 변이 빈도가 매우 낮아 이러한 유전자 변형으로 간암 발생 또는 발병의 인과관계를 설명하기는 부족하다. 따라서 간암의 원인과 진행에 대한 분자 생물학적 기전은 아직도 연구해야 할 과제로 남아있다.

우리나라 간세포암종의 경우 대부분 선행적으로 간경화와 더불어 진행되기 때문에 간경화를 동반한 간조직의 경우 간암 전구병변이라 할 수 있는 비종양성 재생성 결절(nonneoplastic regenerating nodule)과 악성 간세포암종(malignant hepatocellular carcinoma)의 중간 단계를 포함하고 있을 것으로 알려져 있다. 이러한 결절병변을 이형성 결절(dysplastic nodule)이라고 하며, 그 정도에 따라 저등급(low grade dysplastic nodule) 또는 고등급(high grade dysplastic nodule) 이형성 결절로 세분할 수 있다. 고등급 이형성 결절은 경우에 따라 조직내 미세한 간세포 암종이 관찰됨에 따라 간세포암종의 전암단계로 여겨지고 있다. 그러나 간암의 전구병변에 대한 구분에서도 병리학자들에 따라 조직 형태학적 차이를 구분하여 초기 간세포암(early hepatocelluar carcinoma), 인시투 암종(carcinoma in situ) 등으로 나누기도 하지만, 간암의 전암단계에 대해서는 아직도 논란의 여지가 있으며, 따라서 이러한 전암단계로부터 간세포암종 발달과정을 설명할 수 있는 분자기작에 대해서는 밝혀지지 않고 있다. 간세포암종은 조직병리학적으로 에드몬슨등급(Edmoson grade) 방법에 따라 모두 4등급으로 나눌 수 있다. 주목할 점은 이러한 종양 세포의 분화 정도와 종양 크기가 형태학적인 변화를 잘 반영하고 있으며, 이러한 사실은 간암의 정도가 단계별로 진행한다는 사실을 의미하지만, 여기에 대한 분자 생물학적 기전은 아직까지 밝혀지지 않고 있다.

최근 소개된 DNA 마이크로어레이(microarray) 기법은 유전자의 발현 정도를 대단위로 포괄적으로 검색 가능하게 하였으며 종양학 연구에 많이 활용되는 최신 유전체학 기법 중에 하나이다. 이미 몇몇 연구자들이 이러한 기법을 통하여 간암의 분자 발현양상을 이용하여 간암 발생에 대한 설명을 시도하였지만, 초기 간암발생에 대한 포괄적 유전자 발현에 대한 연구는 시도된 바 없다. 더 나아가, 간암 발생 및 진행에 관련된 간암 발달 단계별 대단위 유전자군이 조사된 바는 없으며, 이러한 조사는 초기 간암 발생과정을 이해하는데 매우 중요한 정보를 제공할 수 있을 것이다.

간세포암의 대표적인 분자마커인 AFP는 간세포가 형질전환되어 암세포로 전환되었을 때 비정상적으로 생성되는 당단백으로, 원발성 간암, 간염, 간경변과 태아성암 등의 발견과 치료경과 관찰에 이용된다. 대개 태아의 간이나 난황막에서 주로 만들어져 13주째에 최고치를 보이다가 이후에는 급격히 농도가 낮아져 정상의 성인에게서는 극히 낮은 농도(정상의 경우 7-10ng/mL 이하)로만 존재하나, 혈액 내부의 AFP 수준의 증가는 심각한 종양세포의 증가를 의미할 수 있으며, 특히 간(liver)세포와 관련된 종양 환자의 70% 이상에서 AFP의 수치 증가가 확인되어, 일반적으로 혈액 1ml당 AFP 7~15 ng 이하를 음성이라고 판정한다.

간암의 경우, 간암과 동시에 합병하는 일이 많은 간염, 간경변에서도 종양 마커 AFP가 만들어지기도 하며 양은 500ng/mL 정도까지는 상승한다고 알려져 있고, 산부인과 질환에서 임신부의 혈중 및 양수 중 AFP 증가는 무뇌아, 척추파열, 수두증 등 선천성 이상의 지표로 활용되기도 한다. AFP는 특히 조기 간암에서 저감도와 저특이성을 보이며 간경변이나 만성간염의 악화시에도 각각 증가한다. 따라서 몇 가지의 새로운 바이오 마커 DCP(Des-gamma carboxyprothrombin)라고도 명명되는 PIVKA-II(prothrombin induced by vitamin K absence-II), AFP-L3(lens cularis agglutinin-reactive), GPC3(glypican-3) 등에 대하여 현재 조기간암을 진단할 수 있는지에 관한 연구가 이루어지고 있으며, 조기간암의 진단율을 효과적으로 증가시킬 수 있는 추가적 마커가 필요한 실정이다.

이에 본원 발명자는 정상인의 간 조직과 간세포암 환자의 간 조직을 대상으로 cDNA 마이크로어세이를 실시한 결과, 간세포암 환자의 간 조직에서 정상인의 간 조직에서보다 높은 KLK-5의 RNA 발현 양상을 관찰하였다. 본원 발명자들은 이를 기반으로 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 및 웨스턴 블랏(Western blot) 등을 실시하였으며, 이로부터 정상 간 조직보다 간세포암 조직에서 KLK-5 유전자 및 단백질이 많이 발현됨을 확인하였다. 또한, KLK-5에 대한 항체를 이용해 이뮤노닷(Immunodot)과 엘라이자(ELISA)를 실시하여 혈청 중의 KLK-5 단백질의 농도를 측정해 본 결과, 정상인의 혈청에 비해 간암 환자의 혈청에서 KLK-5 단백질의 양이 많음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 실험 결과를 통해 본원 발명자는 KLK-5가 간세포암의 조기 진단과 예후에 대한 마커로서의 가치가 높음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 간세포암에 특이적인 진단 마커 KLK-5, 및 이를 이용하여 간세포암을 조기에 진단하고 예후를 측정하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 KLK-5 유전자 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간세포암 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 간세포암 진단용 조성물을 포함하는 간세포암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 간세포암 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 간세포암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 간세포암 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 간세포암을 조기에 진단하고, 간세포암의 예후 및 치료 모니터링에 효과적으로 사용하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 새로운 간세포암 진단 마커로서 유용한 KLK-5 유전자에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 간세포암의 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 용어 "간세포암(Hepatocellular carcinoma)"은 간에서 발생하는 원발성 간암을 의미하며, 편의상 "간세포암" 또는 "간암"으로 혼용하여 사용한다.

본 발명에서 용어 "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 간세포암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 간세포암을 가진 세포에서 증가 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 간세포암 진단 마커는 KLK-5 유전자로서, 간세포암 세포에서 발현이 증가하는 유전자이다.

KLK-5는 칼리크레인 유사 단백질 2(kallikrein-like protein 2) 또는 인간 스트라툼 코네움 트립틱 엔자임(human stratum corneum tryptic enzyme)이라고 불리우며 인간 칼리크레인 유전자군(human kallikrein gene familly)에 속한다. KLK-5는 주로 고환(testis), 유방(breast), 뇌(brain) 또는 표피(epidermis)에서 발현된다는 보고가 있다(George M Yousef, et al, J Bio Chem. 274: 37511-37516, 1999, Brattsand M. et al, J Bio Chem. 274: 30033-30040, 1999).

인간 KLK-5는 유방암과 난소암 환자의 혈청에서 높은 수준으로 발현된다는 보고가 있다(George M. et al, Cancer Res. 63: 3958-3965, 2003). KLK-5는 정상 난소 조직에서는 거의 발현되지 않지만, 난소암 1기와 2기 조직에서는 매우 높게 발현된다는 보고도 있다(H Kim, et al, British Journal of Cancer. 84(5): 643-650, 2001). 그리고, 폐암에서는 정상 조직에 비해 암 조직에서 높게 발현되며(C. Planque, et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329: 1260-1266, 2005), 신세포 암에서는 발현이 저해된다는 보고가 있다(C.D. Petraki, Tumour Biol. 27: 1-7, 2005). 또한, KLK-5는 전립선암에서는 정상 조직과 비교했을 때 암 조직에서 낮게 발현되며, 1기와 2기보다 3기에서 더욱 낮게 발현된다는 보고가 있다(George M Yousef, et. al, The Prostate 51: 126-132, 2002). KLK-5는 정상 조직에서는 매우 높게 발현되나, 정소암에서는 낮게 발현됨을 보여주는 보고도 있다(George M Yousef, et al, Urology 60: 714-718, 2002). 그러나, 지금까지 KLK-5와 간세포암과의 관련성에 대한 보고는 없었다.

KLK-5의 발현은 일반적인 분자생물학적 방법으로 분석하고 있으며, 유전자 발현에 대한 분석 방법으로는 DNA 마이크로어레이(microarray), 노던 블랏(Northern blot), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)(H Kim, et al, British Journal of Cancer. 84(5): 643-650, 2001) 등의 방법이 많이 사용되고, 단백질 발현 분석 방법으로는 2D 웨스턴 블랏(Western blot)(C. Planque, et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329: 1260-1266, 2005)과 이뮤노플루오로메트릭 어세이(Immunofluorometric assay)(George M. et al, Cancer Res. 63: 3958-3965, 2003; Julie L.V. et al, Clinical Chemistry. 53: 000-000, 2007)와 같은 항체를 이용한 분석법이 실시되고 있다. 정량분석법으로는 주로 정량적 실시간 PCR(Quantitative Real time-PCR)이 이용되고 있다(George M Yousef, et al, Urology 60: 714-718, 2002; C. Planque, et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329: 1260-1266, 2005).

본 발명에서 밝힌 KLK-5의 생물학적 의의와 간세포암과의 연관성은 KLK-5를 이용하여 간암을 진단 및 예후 측정에 중요하게 이용할 수 있으며, KLK-5과 관여된 암화의 기작을 밝히고 이를 이용하여 암을 치료하는데 중요한 역할을 하게 될 것으로 생각된다.

또다른 양태로서, 본 발명은 KLK-5 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간세포암 진단용 조성물에 관한 것이다.

생물학적 시료 중의 유전자 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 확인할 수 있다.

본 발명에서 “mRNA 발현수준 측정”이란 간세포암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 KLK-5 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 “단백질 발현수준 측정”이란 간세포암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 KLK-5 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로 니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명의 구체적인 일 양태에서는 KLK-5 유전자에 특이적인 프라이머 서열을 포함하는 간세포암 진단 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포 스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 간세포암 진단 마커 검출용 조성물은 KLK-5 유전자에 대하여 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 구체적으로는, 염기서열 목록의 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍이다.

또다른 양태로서, 본 발명은 KLK-5가 코딩하는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 간세포암 진단 마커 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 새로운 간세포암 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 간세포암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명에 따른 상기 간세포암 진단용 조성물을 포함하는 간세포암 진단 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 간세포암 진단 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

구체적인 일 양태로서, 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로는, 바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또 는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또다른 양태로서, 본 발명은 상기 간세포암 진단용 조성물 또는 상기 간세포암 진단 키트를 이용한 간세포암 진단 방법을 제공한다.

구체적인 일 양태로서, 본 발명은 KLK-5 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 간세포암 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 mRNA를 측정하는 단계; 및 상기 mRNA 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 간세포암 진단 방법을 제공한다.

생물학적 시료에서 mRNA를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 mRNA 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명에서 용어 “생물학적 시료”란 간세포암 발병에 의해 간세포암 마커의 유전자 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 특히 바람직하게 상기 시료는 간 조직 또는 세포 또는 혈청이다.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 간세포암 의심 환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 간세포암 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여 간세포암 의심 환자의 실제 간세포암 발병 여부를 진단할 수 있다.

mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 간세포암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.

상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 간세포암 진단 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 간세포암 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다.

한편, DNA 칩은 상기 간세포암 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 간세포암의 발병 여부를 판독할 수 있다.

또 다른 구체적인 양태로서, 본 발명은 KLK-5가 코딩하는 단백질에 특이적인 항체를 간세포암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계, 및 상기 단백질 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 간세포암 진단 방법을 제공한다.

생물학적 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 단백질 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 간세포암 의심 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 간세포암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, 간세포암 의심 환자의 실제 간세포암 발병 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 “항원-항체 복합체”란 간세포암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이 트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄ W(CN)₈ , [Os(bpy) ₃ ] ²⁺ ,[RU(bpy) ₃] ²⁺, [MO(CN) ₈ ] ^4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I , ¹⁸⁶Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 간세포암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 간세포암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 간세포암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 간세포암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 간세포암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 간세포암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 간 조직 및 간세포암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 um 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항 체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.

또한, 바람직하게는, 상기 간세포암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 간세포암 발병 여부를 확인할 수 있다.

본 발명은 간세포암의 전이 및 예후를 판단할 수 있는 새로운 진단 마커를 제공함으로써, 간세포암의 치료 및 예후 관리에 유용한 자료를 제공한다. 또한, 상기 간세포암 진단 마커는 간세포암 특이적 항암제 개발 연구에 이용될 수 있다.

본원 발명자들은 간암조직을 대상으로 한 cDNA 마이크로어레이(microarray) 결과, 정상인의 간 조직에서와 발현 차이를 보인 KLK-5 유전자의 생물학적 기능을 밝히고 임상적 의의를 알아보고자 간암 조직에서 단백질의 발현 정도를 밝혀 간암의 진단, 예후 마커로서의 가능성을 평가해 보았다.

이를 위하여 전북대학교 병원으로부터 얻은 간암환자로부터 primary HCC 조 직을 얻어 양성 시료로 사용하였다. 단백질 발현을 보기 위하여 웨스턴 블랏(Western blot)을 실시하였으며, 혈청에서의 분포를 알아보기 위하여 단국대학교와 전북대학교에서 간암으로 판정된 환자로부터 혈액을 채취하고 ELISA법을 이용하여 혈청 중 KLK-5의 양을 분석하였다. cDNA 마이크로어레이 결과와 유사하게, 웨스턴 블랏 실험 결과 KLK-5는 간암 환자의 간 조직은 정상 간 조직과 비교했을 때 보다 높은 KLK-5 단백질의 발현을 보였다.

또한 간암 세포주를 대상으로 웨스턴 블랏을 실시한 결과, HepG2, Hep3B, Huh-7, 및 SKHep-1(서울대학교 세포주 은행) 세포주의 세포 용해물에서 KLK-5의 높은 발현을 확인하였으며, 임상 혈청 시료를 이용하여 KLK-5의 분포도를 조사해 본 결과에서도 간암 환자의 혈청에 높은 농도의 KLK-5가 분비됨을 볼 수 있었다.

따라서, 이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠으나, 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 국한되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 조직 시료 처리.

전북대학교 의과대학교 병원으로부터 40 명의 간암 환자로부터 primary HCC 조직(간암 조직)과 주위 비간암 조직(간암환자의 정상 간 조직)을 얻었다. 조직시료는 액체 질소에서 동결시켰으며, RNeasy midi kit(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 조직시료의 총 RNA를 분리하였다

< 실시예 2> 간암 조직에서의 KLK -5의 발현 조사.

간암 관련 유전자를 발굴하기 위해 cDNA 마이크로어레이를 이용하여 40 명의 간암 환자의 암 조직과 주위 비 간암 조직을 대상으로 RNA 레벨(level)을 조사하였다.

즉, Primer3 software(http://frodo.wi.mit.edu/)를 이용하여 KLK-5에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 서열(Oligonucleotide sequences)을 디자인하였다. RT-PCR 분석에 대한 주형으로는 총 RNA 5 ㎍에 상응하는 1차 스트랜드 cDNA 혼합물을 사용하였으며, 사용한 프라이머는 하기와 같다:

- KLK5 Forward primer CTGGCCACTCTAACGACCT (서열번호 1)

- KLK5 Revere primer TAATCTCCCCAGGACACGA (서열번호 2)

PCR 조건은 다음과 같다:

1 cycle : 95℃에서 3분

35 cycles : 94℃에서 1분,

51.8℃ 에서 1분,

72℃에서 1분

final extension : 72℃에서 7분

50℃에서 1분

상기 RT-PCR 결과는 DNA chip 분석 결과와 마찬가지로 간암 조직에서 KLK-5 발현이 정상 조직과 비교하여 크게 증가함을 볼 수 있었다(도 1 참조).

<실시예 3> Immunodot Assay에 의한 환자 혈청 중 KLK-5 단백질 측정.

단일 클론 항체를 이용하여 Immunodot 방법을 확립하여 혈청 중 KLK-5의 분비 정도를 비교하였다. 니트로셀룰로즈막(nitrocellulose membrane)에 5 배 및 10 배 희석한 혈청 시료(각 케이스당 6 개체씩)를 1ul씩 dot을 찍은 후 상온에서 건조시키고, 1% BSAT로 4℃에서 밤새 블라킹(overnight blocking)하였다. KLK-5에 대한 단일클론항체를 반응시킨 후 2차 항체 접합 HRP(Horse-radish peroxide)를 가하고 DAB로 발색시켰다. 발색된 정도를 스캔하여 그 정도를 비교하였으며(도 2), 이를 그래프로 표시한 도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이 간암 환자의 혈청에는 정상인 보다 KLK-5가 많이 분비됨을 알 수 있었다.

< 실시예 4> 간암세포주에서의 KLK -5 발현 조사.

간암 세포주에서의 단백질 발현을 비교하기 위하여 단일클론항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 이를 위하여 서울대학교 세포주 은행으로부터 분양받은 간암 세포주 HepG2, Hep3B, Huh-7 및 SKHep-1를 배양한 후, 세포를 용출용액(1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 100 mM KCl, 20 mM HEPES (pH 7.9), 10 mM EDTA, 1 mM sodium orthovanadate, 10 ㎍/ml aprotinin, 10 ㎍/ml leupeptin, 1 M PMSF)에 용출시킨 세포 용해물(cell lysate)과 세포 배양액 중 상등액(pernatent)을 전기영동하고 니트로셀룰로즈 막(nitrocellulose membrane) (Bio-Rad, CA, USA) 에 블라팅(blotting)하였다. Immunoblotting membrane을 5% non fat dry milk, 0.05% Tween 20이 포함된 PBS용액에 넣고 실온에서 2시간 동안 blocking한 후 KLK-5에 대한 항체(1:5000)로 2시간 동안 반응시킨 후, 5,000배 희석된 HRP(Horse-radish peroxide)가 접합된 2차 항체로 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 ECL Plus™ Western Blotting Detection Reagents로 develope하여 분석하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, HepG2, Hep3B, Huh-7 및 SKHep-1 세포주의 세포 용해물(cell lysate)에서 KLK-5가 많이 발현됨을 알 수 있었다.

<실시예 5> KLK-5 단백질에 대한 ELISA system의 확립.

인간 KLK-5 재조합 단백질(R&D Systems, MN U.S.A.)을 0.1M carbonate buffer(pH 9.6)를 이용하여 1ug/ml의 농도로 희석하여 96-well microtiter plate에 100ul씩 분주하고 4℃에서 overnight 코팅을 한 후, 0.05% Tween 20이 포함된 PBS 용액(PBS-T)을 이용하여 3번 세척하였다. 1% BSA 용액으로 상온에서 2시간 동안 blocking한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. 인간 KLK-5 재조합 단백질에 대한 항체 100ul를 넣어 준 후 상온에서 1시간 동안 반응한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. 1000배 희석된 HRP가 접합된 2차 항체 100ul를 넣어 준 후 상온에서 1시간 동안 반응한 후 3번 세척을 하였고, 마지막으로 OPD((O-phenylenediamine)를 이용하여 발색하였다. 발색된 시료의 흡광도는 490nm 파장에서 ELISA reader(Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.

도 5는 각 혈청의 희석비율에 따른 KLK-5 단백질의 반응성을 나타낸 그림이고 도 6 은 KLK-5 단백질에 대한 표준곡선을 나타내는 그림이다.

< 실시예 6> ELISA system에 의한 환자 혈청 중 KLK -5 단백질의 측정.

실시예 5에서 확립한 ELISA system을 이용하여 환자의 혈청 중 KLK-5 단백질 농도를 측정하였다. 정상인(n=12)과 간암 환자(n=22)의 혈청을 2배씩 희석한 후, 실시예 5의 방법을 통해 혈청 중 KLK-5 단백질 농도를 계산하고 그 결과를 하기 표 1 및 도 7의 그래프로 표시하였다.

실험 결과에 따르면, KLK-5 단백질의 농도는 만성 간염, 간경변과 간암의 경우 정상치보다 통계적으로 상승된 농도를 보였다. 이 결과는 혈청 내 KLK-5 단백질의 농도 상승이 간암 발생과 연관이 있음을 뜻한다.

	개체수	평균 (ng/ml)	표준편차
정상	12	0.78	6.24
간암	22	1.13	5

< 실시예 7> 샌드위치형 ELISA 키트 .

다음의 구성 요소들을 사용하여 KLK-5 단백질의 농도를 측정하여 간암의 발병 여부를 진단할 수 있는 진단 키트를 제조하였다.

A. 고상형 항체: 항체가 흡착된 마이크로타이터 플레이트로서, KLK-5에 대한 다클론 항체 100 ㎕ 를 마이크로타이터 플레이트에 가하고 4℃에서 하룻밤 동안 방치한 후 고상체 표면의 공간에 알부민을 흡착시켜 제조하였다.

B. Detection 항체: KLK-5에 대한 단일클론항체

C. 효소결합 항체: 서양고추냉이 퍼옥시다제가 결합된 2차 항체 용액 (anti-mouse-IgG-퍼옥시다아제)

D. 혈청 희석용액

E. 기질액

F. 세척액: 0.05% 트윈이 포함된 인산염 완충액

G. 표준용액: KLK-5 표준액

상기 키트를 이용하여 간암 환자 중 KLK-5의 혈청 희석 반응을 다음과 같이 검사하였다. A의 고상형 항체, 즉 마이크로타이터 플레이트에 각 혈청 시료를 혈청 희석용액(D)을 사용, 적절히 희석하여 웰당 100 ㎕ 씩 가한 후, B, C, E의 구성요소들을 사용하여 실시예 6과 같은 샌드위치형 측정 방법으로 KLK-5의 농도를 검사하였다.

도 1은 RT-PCR에 의한 간암 환자의 비 간암 조직(N)과 간암 조직(T)에서의 KLK-5 유전자의 발현을 비교분석한 사진이다.

도 2 및3은 간암 환자 혈청에서의 KLK-5의 단백질 분비 차이를 나타낸 것으로서, 도 2는 Immunodot assay에 의한 정상인(Normal)과 간암 환자(HCC)의 혈청에서의 KLK-5의 분비 차이를 보여주는 사진이며, 도 3은 상기 결과를 intensity를 분석하여 수치로 환상하여 나타낸 그래프이다.

도 4는 간암 세포주의 세포 용해물(lysate) 및 상기 세포주 배양액의 상등액으로부터의 KLK-5의 발현 정도를 웨스턴 블랏으로 측정, 분석한 사진으로서, 세포 용해물에서 KLK-5가 많이 발현됨을 알 수 있다.

도 5는 ELISA 법에 의한 간암 시료(HCC)와 정상시료의 희석 곡선을 나타낸 그림이고, 도 6은 KLK-5 단백질에 대한 표준 곡선을 나타내는 그림이다.

도 7은 ELISA system을 이용하여 환자의 혈청 중 KLK-5 단백질 농도를 측정하여 나타낸 그래프이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> KLK-5 as a tumor associated marker of Hepatocellular carcinoma and a method of diagnosing Hepatocellular carcinoma using the same <130> PA070816/KR <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for KLK-5 gene <400> 1 ctggccactc taacgacct 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for KLK-5 gene <400> 2 taatctcccc aggacacga 19

Claims

KLK-5 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간세포암 진단용 조성물.
제1항에서, 상기 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 간세포암 진단용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 쌍을 포함하는 것인 간세포암 진단용 조성물.
제1항에서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 간세포암 진단용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 간세포암 진단용 키트.
제5항에 있어서, RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 간세포암 진단용 키트.
간세포암 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 KLK-5 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및

상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 간세포암의 진단을 위한 정보제공방법.
제 7 항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 것인 간세포암의 진단을 위한 정보제공방법.
제 8 항에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인 간세포암의 진단을 위한 정보제공방법.
제 9 항에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 서열번호 1 및 2로 구성되는 한 쌍의 프라이머 쌍을 이용한 역전사효소 중합반응에 의한 것인 간세포암의 진단을 위한 정보제공방법.
제 7 항에 있어서, 상기 단백질 수준은 해당 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것인 간세포암의 진단을 위한 정보제공방법.
제 7 항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 중 어느 하나를 이용하는 것인 간세포암의 진단을 위한 정보제공방법.
제 7 항에 있어서, 상기 생물학적 시료가 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 뇨로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 간세포암의 진단을 위한 정보제공방법.