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WO2014141477A1 - 細胞培養装置 - Google Patents

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Publication number
WO2014141477A1
WO2014141477A1 PCT/JP2013/057510 JP2013057510W WO2014141477A1 WO 2014141477 A1 WO2014141477 A1 WO 2014141477A1 JP 2013057510 W JP2013057510 W JP 2013057510W WO 2014141477 A1 WO2014141477 A1 WO 2014141477A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture
culture vessel
cell
flow path
base
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/057510
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
貴之 野崎
広斌 周
政春 木山
亮太 中嶌
志津 松岡
中村 拓
菅谷 昌和
光一 寺田
Original Assignee
株式会社日立製作所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社日立製作所 filed Critical 株式会社日立製作所
Priority to EP13877993.9A priority Critical patent/EP2975110A4/en
Priority to JP2015505205A priority patent/JP6097817B2/ja
Priority to PCT/JP2013/057510 priority patent/WO2014141477A1/ja
Priority to US14/768,770 priority patent/US10138450B2/en
Publication of WO2014141477A1 publication Critical patent/WO2014141477A1/ja

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/50Means for positioning or orientating the apparatus
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/58Reaction vessels connected in series or in parallel
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C12M41/14Incubators; Climatic chambers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements

Definitions

  • the present invention relates to a culture apparatus for culturing cells or tissues by automatic operation.
  • Regenerative medicine that restores the function of organs and the like using biological samples such as regenerative tissues produced using cells as raw materials is expected as a radical treatment method for diseases for which there has been no conventional treatment method.
  • Regenerated tissue is manufactured in accordance with SOP (Standard Operating Procedure) by CPC (Cell Processing Center), which provides a clean manufacturing environment, by manufacturing workers with specialized cell culture technology.
  • SOP Standard Operating Procedure
  • CPC Cell Processing Center
  • automatic culture equipment is an alternative to manual labor, but it is necessary to comply with GMP (Good Manufacturing Practice: Practice) for manual labor.
  • GMP Good Manufacturing Practice: Practice
  • Development guidelines for clinical culture automatic culture equipment regenerative medicine field (design guidelines for human cell culture processing equipment [revised]), 2009) have been presented by the Ministry of Economy, Trade and Industry, and it is necessary to comply with them.
  • the automatic culture device can produce high-quality regenerative tissue with high reproducibility in a clean environment based on scientific evidence, taking into account GMP for manual labor and development guidelines for automatic culture devices. Is required.
  • Patent Document 1 For a plurality of culture vessels arranged in a matrix, the flow tube lengths from the solenoid valves are aligned in units of columns, and a plurality of culture vessels in the same matrix are used.
  • An apparatus for making the quality of regenerated tissue uniform by culturing is disclosed.
  • Patent Document 2 discloses an apparatus in which components necessary for culture such as a culture vessel and a medium bottle are always connected by a flow tube or the like to reduce the risk of biological contamination, thereby forming a closed culture space. ing.
  • Patent Document 1 since the method for adjusting the flow path length in Patent Document 1 merely aligns the flow path lengths to the culture vessels arranged in the same row, cell loss is reduced when the cell suspension used for culture is fed. The degree differs depending on the culture container in the row unit, and there is a problem that the quality cannot be made uniform among a plurality of culture containers cultured at the same time.
  • the present invention has been made in view of such problems, and provides a closed-system cell culture apparatus that enables high-quality and reproducible cell culture. Specifically, the present invention provides a cell culturing apparatus that makes it possible to uniformize the quality of cells after production and to suppress user work mistakes in channel installation.
  • a cell culture apparatus for culturing cells in order to solve the above-described problem, a cell culture apparatus for culturing cells, a solution holding unit for holding a solution used for culture, a plurality of units each connecting a solution holding unit and a plurality of culture containers
  • the plurality of flow paths provide a cell culture device having a structure having the same length from the solution holding unit to each of the plurality of previous culture containers.
  • the cell culture device using the closed culture vessel according to the present invention enables high-quality cell culture. Specifically, high quality and homogenization of cultured cells are realized in each of a plurality of culture containers. In addition, a mechanism that normally performs the flow path setting operation on the user's device suppresses cell quality degradation due to the user's erroneous operation.
  • regeneration tissue which shows a 1st Example.
  • Example 1 the basic configuration and operation flow of the cell culture device according to each example including Example 1 will be described in detail with reference to the drawings.
  • the basic configuration and the operation flow are not limited to this, and a configuration may be added or the operation flow may be changed as appropriate depending on the application.
  • an automatic culture apparatus comprising 12 components will be described in detail below.
  • the twelve components are a culture vessel section 1, a flow path section 2, a rotary valve mechanism 3, a culture cell and feeder cell bottle section 4, a medium bottle section 5 including a refrigerator, and a preheating bottle section 6. , Drainage bag unit 7, observation unit 8, incubator unit 9, gas supply unit 10, humidifying bottle unit 11, and control unit 12.
  • the control unit 12 includes a control terminal 13.
  • the automatic culture apparatus uses the cell bottle installed by the user, the cell suspension in the medium bottle, and the medium for the closed system flow path that is a closed culture space, and the flow path unit of the present apparatus.
  • the control unit 12 controls a solenoid valve (not shown), a tube pump, and the like provided in 2 and the like, so that the cells are seeded into the culture vessel of the culture vessel unit 1 and cultured.
  • control unit 12 controls the observation unit 8 including a microscope provided in the apparatus to capture a cell image in the culture vessel. Except at the time of automatic photographing, cell seeding, medium exchange, and gas exchange, it is possible to control the position of the microscope based on the input from the operation screen of the control terminal and to photograph and store the cell image by manual observation of the microscope.
  • FIG. 2 shows a closed circuit flow path circuit of the above-described automatic culture apparatus.
  • the closed system flow path includes the culture container section 1, the flow path section 2, the rotary valve mechanism 3, the cell bottle section 4, the culture bottle section 5, the preheating bottle section 6, and the drainage bag section among the components shown in FIG. 7 includes a gas supply unit 10 and a humidification bottle unit 11.
  • Example 1 will be described by way of example for the purpose of producing a regenerative tissue of epithelial cells such as corneal epithelial cells, oral mucosal epithelial cells, and epidermal cells.
  • cell types that can be cultured by this cell culture device Is not limited to this.
  • the flow path circuit uses two types of cells. However, when only one type of cells such as cardiomyocytes and fibroblasts are to be cultured, one cell is used. It is good also as a flow path circuit of the cell bottle and the flow path with respect to it.
  • a channel circuit that uses two types of cells only a channel circuit that targets one type of cell may be used.
  • the flow path circuit of FIG. 2 uses 10 culture vessels, it is also possible to use a flow path circuit composed of different numbers of culture vessels by installing or removing the culture vessels in parallel.
  • the closed system flow path shown in FIG. 2 mainly has the following components.
  • ten culture vessels 201 are provided to produce ten regenerated tissues.
  • the whole culture vessel 201 is installed on a culture vessel base 202 which is a flat plate, and an actuator 203 for changing the inclination is attached to the culture vessel base 202.
  • two cell bottles 204 and 205 are used.
  • One type of cell is placed in each cell bottle 204,205.
  • the entire culture vessel has a two-layer structure, and one type of cell is cultured in each layer.
  • the flow path circuits from the cell bottles 204 and 205 to each layer of the culture container use different flow path circuits (1) and (2) in order to prevent cells from being mixed during the liquid feeding.
  • the cell suspension in the cell bottle 204 passes through the solid line channel circuit (1) 206 and is fed to a layer on one side of each culture vessel, for example, the upper layer of all the culture vessels.
  • the cell suspension in the cell bottle 205 passes through the dotted channel circuit (2) 207, and is sent to one layer of each culture vessel, for example, the lower layer of all the culture vessels.
  • reference numeral 222 denotes a multi-branch unit which will be described later.
  • the cell bottle is different for each cell type, since the medium is common, one medium bottle 208 is used.
  • the medium bottle is stored at 4 ° C. using a refrigerator as described in FIG.
  • the amount necessary for one medium exchange is transferred to the preheating bottle 209, and after heating to 36 ° C., for example, it is used for medium exchange.
  • the flow path circuit (1) 206 and the flow path circuit (2) 207 are appropriately branched via the bifurcation 210. Thereafter, the medium sent to the channel circuit (1) 206 is sequentially sent to one layer of each culture vessel. The same applies to the medium fed to the flow path circuit (2) 207.
  • the tube pump 211 gives a driving force for liquid feeding and air feeding in the flow path.
  • the liquid feeding direction is controlled by the electromagnetic valve 212 and the rotary valve mechanism 213 corresponding to the rotary valve mechanism 3 of FIG.
  • oxygen and carbon dioxide are supplied to each culture vessel 201 as gas exchange. This is because cells consume oxygen and discharge carbon dioxide.
  • a gas cylinder 216 filled with air containing 5% CO 2 is adjusted to a predetermined air supply speed with a gas flow meter 217, and then passed through a humidifying bottle 218 containing sterilized water. Saturate and air. Gas is sent to each culture vessel through an air supply circuit 219 located in parallel with the tube pump 211.
  • the flow path circuit of the present embodiment there is a sterile desorption part 220 and a sterile connection part 221.
  • the aseptic desorption part 220 is installed on the flow channel tube in the vicinity of each culture vessel 201.
  • one culture container can be removed aseptically to inspect as a sample the day before transplantation.
  • the removed culture container and the remaining culture containers and flow paths after removal can each maintain sterility.
  • the culture vessel 201 is removed using the aseptic desorption part 220.
  • the aseptic desorption part 220 is a flow-path tube which can be heat-welded as an example, and cuts between two places sandwiching the cut portion after heat-welding.
  • the aseptic connection part 221 is installed on the flow path tubes in the vicinity of the cell bottles 204 and 205, the medium bottle 208, and the humidification bottle 218.
  • the cell bottles 204 and 205, the medium bottle 208, and the humidification bottle 218 are brought into a CPC (Cell Processing Center) in an empty state, and the user enters a predetermined cell suspension, medium and sterilized water into a closed system flow. Install on the road. At that time, aseptic connection is made using the aseptic connection part 221.
  • CPC Cell Processing Center
  • FIG. 3 shows an example of the culture container base 202 of the apparatus of the present embodiment and a state in which ten culture containers 201 are installed on the culture container base 202.
  • the culture vessel base 202 of this example has a horseshoe shape. That is, the culture vessel base 202 has a structure in which a gap is formed by hollowing out a central portion with a rectangular flat plate, and a notch is provided at an end of the flat plate on the side to be inserted into the apparatus, that is, a part of the outer periphery. And has a so-called U-shaped shape.
  • the inner side of the central part of the culture vessel base 202 is circular, and the culture vessel 201 is arranged in a circle around it.
  • the culture vessel base 202 is formed with holding means such as a recess for holding each culture vessel 201.
  • a microscope of the observation unit 8 to be described later is disposed in the hollow space portion that is hollowed out.
  • An observation hole 301 for microscopic observation is provided in a portion that holds the culture vessel 201.
  • the installation direction in the apparatus is uniquely determined. That is, when the culture vessel base 202 is installed, the culture vessel base 202 is brought close to the microscope from the scraping side formed on one side of the culture vessel base 202, the microscope is guided into the gap, and installed in the actuator or the like. With the shape having the cut-out gap, the culture vessel base 202 can be arranged at the center of the plurality of culture vessels 201. In addition, since the user can easily install and remove the plurality of culture vessels 201 on the culture vessel base 202 without contacting the microscope, the quality deterioration of the cell culture can be suppressed by damaging the flow path or the like due to human error. It becomes possible.
  • another culture vessel installation base (not shown) having the same shape as the culture vessel base 202 or divided into a plurality of pieces is provided in the apparatus, and the culture vessel base 202 is placed on the other culture vessel installation base.
  • the installation work may be simplified.
  • FIG. 3 shows a state in which ten culture vessels 201 are installed on the culture vessel base 202.
  • four channel tubes 302 are connected to each of the culture vessels 201, and the four channel tubes 302 are arranged outwardly with respect to the culture vessel base 202.
  • the channel tube 302 By disposing the channel tube 302 outside the culture vessel base 202, that is, on the outer periphery, it is possible to suppress deterioration in cell quality due to contact between the microscope, the culture vessel base 202, the channel tube, and the like when the microscope is driven.
  • the sterilization / removal part 303 for enabling the removal of each culture vessel.
  • the culture surface of the culture vessel is subjected to a temperature response when the temperature of the culture vessel 201 falls below the phase transition temperature of the temperature-responsive culture surface, for example, 32 ° C.
  • the nature of the surface of the sex culture changes from hydrophobic to hydrophilic, and the cells that have adhered, spread and proliferated spontaneously at 37 ° C. are detached.
  • the culture conditions change greatly, and the quality of the cells at the time of transplantation also changes.
  • a small door for taking out the work before the day before the completion of the culture for the purpose of quality confirmation in the culture process Can be prepared in the upper part of the door of the incubator unit 9, and the time and range of exposing the inside of the incubator unit 9 to the outside air can be reduced to reduce the temperature drop during operation.
  • a small door for taking out the day before with a transparent material such as glass it is possible to check the progress of the culture, for example, pH due to the color of the medium, biological contamination due to turbidity, etc. from the small door. Is also possible.
  • a tube pump 401, a solenoid valve 402, a flow tube 403, cell bottles 404 and 405, a preheating bottle 406, and the like are installed in the flow channel unit 2.
  • a tube pump 401, a solenoid valve 402, a flow tube 403, cell bottles 404 and 405, a preheating bottle 406, and the like are installed in the flow channel unit 2.
  • it may be set as a solution holding part as a general term for these bottles.
  • the tube pump 401 squeezes the flow tube 403 from the outside of the flow tube and supplies liquid or air.
  • the electromagnetic valve 402 opens and closes the flow path tube 403 by energization to control the liquid feeding or air feeding direction.
  • a filter having a pore diameter of 0.22 ⁇ m, for example is used so that the pressure inside and outside the flow path is adjusted so that bacteria and the like do not enter from the outside of the flow path.
  • the positions of the tube pump, the solenoid valve, the filter, and the branching portion of the flow path unit 2 are determined according to the following priority conditions.
  • the first condition is that the flow path length from the cell bottle of the cell bottle portion 4 containing the cell suspension of epithelial cells to each culture vessel 201 is the shortest and equal length.
  • the highest priority is to minimize the influence of the epithelial cells to be cultured on the culture process during the seeding process.
  • the second condition is that the flow path length from the cell bottle in which the cell suspension of the feeder cells of the cell bottle part 4 is placed to each culture vessel 201 is the shortest and equal length. It is also desirable that feeder cells for calculating growth factors given to epithelial cells have a minimum effect on the culture during the seeding process.
  • the third condition is that the flow path length from the medium bottle in which the medium of the medium bottle part 5 is put to each culture vessel 201 is the shortest and equal length. This is because the medium is fed through the shortest flow path to avoid a decrease in liquid feed accuracy due to adhesion of protein as a medium component in the flow path tube or residual liquid droplets.
  • the solution holding unit to the multi-branch unit 222 are common to each culture vessel, By making the length from the multi-branch portion 222 to each culture vessel 201 equal, it is possible to achieve the purpose of making each channel length equal. Details of the method for equalizing the length from the multi-branch portion 222 to each culture vessel 201 will be described later.
  • FIG. 5 shows an example of a rotary valve mechanism as the solution supply mechanism shown in FIG. 1 in the present embodiment.
  • the solution supply mechanism in the present embodiment is not limited to this rotary valve mechanism, and is a supply mechanism that can control the supply of the solution that has passed through the multi-branch portion 222 to each of the culture vessels 201. Needless to say, this is applicable.
  • the rotary valve mechanism 3 shown in FIG. 5 collectively controls medium and gas supply to a plurality of culture vessels 201 to be cultured at the same time.
  • this is a valve mechanism that opens and closes a plurality of flow channel tubes, and a clip portion 502 that closes the flow channel tube 501 and a multiple cam portion 503 that opens the clip portion 502 by contact.
  • the clip portion 502 includes a spring 505 that closes the clip and a clip contact portion 506 that contacts the multiple cam portion 503. Since the clip contact portion 506 can change the clip to be closed by the rotation of the multiple cam portion 503, the liquid feeding and air feeding directions can be controlled.
  • two cell bottles 404 and 405, which will be described later, and a preheating bottle 406 are located in a state where they are connected to each other by a flow path portion and a flow path tube. It is installed on the top.
  • the amount of liquid to be fed is confirmed from the change in weight after feeding the cells to each culture vessel 201 when the cell suspension is fed.
  • the amount of liquid delivered is controlled by the operating time of the tube pump, the amount of liquid delivered can be grasped more reliably by monitoring the change in weight.
  • the preheating bottle 406 grasps the amount of liquid to be fed by two items of tube pump operating time and weight change.
  • FIG. 6 shows an example of a cell bottle, a preheating bottle, and a humidification bottle of the solution holding unit included in the flow path circuit used in the apparatus of this example.
  • the cell bottle 601 of this embodiment includes a cell bottle main body 602 and a cell bottle lid 603.
  • the cell bottle lid 603 is provided with a liquid-feeding channel tube 604 and an internal pressure adjusting channel tube 605, and one end of each is in the cell bottle main body 602.
  • the end on the cell bottle side of the flow channel tube 604 is in contact with the bottom surface of the cell bottle main body 602.
  • the cell suspension can be used efficiently, and as a result, the amount of cells collected from the patient is reduced and the burden on the patient is reduced.
  • a sterile connection portion 606 is attached to the end of the flow channel tube 604 for liquid feeding opposite to the cell bottle.
  • the end on the cell bottle side of the internal pressure adjusting channel tube 605 is in a portion that becomes a gas phase when the cell suspension is put into the cell bottle main body 602.
  • a filter 607 is attached to the end opposite to the cell bottle side of the internal pressure adjusting flow channel tube 605, and for example, a filter that does not pass particles of 0.22 ⁇ m or more is used.
  • the medium bottle is built in the refrigerator, because the medium is common to the two types of cells.
  • the medium bottle has the same configuration as the above-described cell bottle 601, and a medium is used instead of the cell suspension.
  • the medium is stored in a refrigerator at a low temperature of 4 ° C., for example, in order to prevent deterioration of growth factors and the like in the medium.
  • the preheating bottle portion of this embodiment includes a preheating bottle 608 and a receiving portion 609.
  • the medium is stored at 4 ° C. until use, but since the culture is performed at 37 ° C., the medium is preheated in the preheating bottle section 6 before the medium replacement.
  • this method does not require temperature control of the heater, and it is possible to avoid an increase in the number of parts and an increase in channel tube length.
  • the preheating bottle 608 includes a preheating bottle main body 610 and a preheating bottle lid 611.
  • the periphery of the preheating bottle 608 is surrounded by a receiving portion 609 made of a material such as aluminum having high thermal conductivity.
  • a supply channel tube 612 and a liquid supply channel tube 613 are attached to the preheating bottle lid 611, and one end of each is in the preheating bottle main body 610.
  • the end of the pre-heating bottle side of the liquid-feeding channel tube 613 is in contact with the bottom surface of the pre-heating bottle main body 610.
  • the end of the supply channel tube 612 on the preheating bottle side is in a portion that becomes a gas phase when the culture medium is put into the preheating bottle main body 610.
  • a preheating bottle is installed in the back of a cell bottle, for example. Since both the cell bottle and the preheating bottle measure the weight at the time of liquid feeding, the installation space of the weigh scale may be reduced by placing all containers on the same weigh scale as necessary.
  • the humidifying bottle portion of this embodiment is composed of a humidifying bottle 614.
  • the humidifying bottle 614 includes a humidifying bottle main body 615 and a humidifying bottle lid 616.
  • An air supply channel tube 617 and a gas supply channel tube 618 are attached to the humidifying bottle lid 616, and one end of each is in the humidifying bottle main body 615.
  • the end of the air supply channel tube 617 on the cell bottle side is in a portion that becomes a gas phase when sterilized water is put into the humidifying bottle main body 615.
  • a filter 619 is attached to the end of the air flow channel tube 617 opposite to the humidifying bottle side.
  • the filter 619 is of a quality that does not pass particles of, for example, 0.22 ⁇ m or more.
  • a sterile connection 620 is attached further outside the filter 619.
  • the filter may be attached at any location as long as it is between the sterile connection portion 620 and the gas supply portion 10.
  • the end of the gas supply flow channel tube 618 on the humidifying bottle side is in contact with the bottom surface of the humidifying bottle main body 615.
  • the purpose of the humidification bottle is to saturate the water with respect to the gas delivered. Therefore, the efficiency of saturating the gas is improved when the time of contact with the sterilized water is increased.
  • a filter may be installed at the end of the gas supply channel tube 618 on the humidifying bottle side to make the bubbles fine. Since the surface area increases, the saturation efficiency also increases.
  • a connecting portion 621 is installed at the end of the gas supply channel tube 618 opposite to the humidifying bottle side and used for connection to the gas supply portion 10.
  • the drainage bag portion 7 of this embodiment shown in FIG. 1 collects drainage which is an old medium used for culture.
  • the flow path of the present embodiment shown in FIG. 2 separates the upper and lower drainage of the culture vessel 201 and collects the next drainage in a batch. In this way, the medium of each layer is analyzed by collecting the upper and lower layers separately at each medium exchange, and determining whether the cells are cultured normally during the culture process Is possible.
  • the drainage bag 7 is provided in the container. However, when the component analysis of the drainage is performed, the drainage bag 7 is also stored in the refrigerator to maintain the quality of the drainage. Also good.
  • the waste liquid when the component analysis of the waste liquid is not performed, the waste liquid may be collected in a lump without dividing the upper layer and the lower layer.
  • a sterile desorption part is introduced immediately before the drainage bag and removed aseptically.
  • a solenoid valve is introduced immediately before each drainage bag.
  • the rotary valve mechanism described above is introduced, or a clip that is handled manually and does not require energization because it is used only once. You may do it.
  • This apparatus does not move the stage on which the culture vessel is placed and observes the cells in the observation. Instead, the phase contrast microscope 700 is applied to the culture vessel base 202 on which the culture vessel 201 is installed. Rotate and observe the direction of rotation and the horizontal direction of the installation surface.
  • the culture container itself is moved back and forth in the horizontal direction with respect to the installation surface of the culture container base 202, a mechanism for independently moving each culture container is required, which complicates the apparatus.
  • the relative position of the flow tube with respect to the culture vessel base 202 also changes when each culture vessel 201 is moved independently.
  • the length of the flow path tube becomes longer, and there is a case where the risk of cell loss or occurrence of damage to the cell membrane increases at the time of sowing. Furthermore, when the culture vessel itself is driven, the connected flow channel tube is twisted, and there is a risk of cell loss or the like as described above.
  • the phase contrast microscope 700 moves with respect to the culture vessel base 202 as described above.
  • the culture vessel base can be fixed and handled during cultivation, so that twisting of the flow tube caused by rotation of the culture vessel base for observation can be avoided, and the risk of flow channel damage can be avoided. It is.
  • the phase-contrast microscope 700 has an operating part 702 that is a driving means for operating the culture vessel base 202. Therefore, rotational movement in the rotation direction of the phase-contrast microscope 700 and back-and-forth movement in the horizontal direction with respect to the installation surface of the culture vessel base 202 are possible. Note that another configuration example related to microscopic observation shown in FIG. 7B will be described later in Example 6.
  • FIG. 8 shows a state where the door 802 of the incubator 801 in the incubator section of the automatic culture apparatus is closed.
  • a monitor monitor 803 is installed in the incubator 801.
  • the monitor monitor 803 displays the temperature in the incubator and the operation status indicating whether the operation of the solenoid valve, tube pump, microscope, or the like is normal.
  • Incubator 801 maintains the interior at 37 ° C.
  • the gas supply unit 804 corresponding to the gas supply unit 10 of FIG. 1 includes a gas cylinder and a gas flow controller.
  • the gas cylinder is filled with air containing 5% CO2.
  • the type of gas to be filled can be changed according to the medium used for culture and the cell type to be cultured. During the gas exchange, the gas flow rate is adjusted by the gas flow controller.
  • the incubator 801 is on a desk 805.
  • a refrigerator 806 for storing medium bottles at, for example, 4 ° C., and a drainage bag for the drainage bag unit 7 are provided under the desk. It has a storage 807 for storage.
  • the incubator 801, the refrigerator 806, and the storage 807 are connected by a flow channel tube 808.
  • This means that the incubator 801 maintained at 37 ° C. and the refrigerator 806 maintained at about 4 ° C. are not spatially close to each other with a CPC air-conditioned space generally being about 25 ° C. between them. Yes.
  • This configuration eliminates the need for advanced heat insulating material between the incubator 801 and the refrigerator 806, and enables cost reduction and temperature maintenance performance to be improved by simplifying the device configuration.
  • the fully automatic culture apparatus can be controlled by a single control apparatus.
  • a management monitor that enables management from outside the CPC will be installed if necessary.
  • the components inside the apparatus such as the flow path section 2 and the culture vessel base 202, which are installed in the incubator 801, are connected to the rails installed in the incubator 801. Can be pulled out from the door 802 in a lump.
  • the user connects and installs the flow channel to the flow channel unit etc. at the start of culture, etc., it becomes possible to install with the mounting table pulled out, reducing the complexity when installing the flow channel, It is possible to suppress human error due to.
  • it is desirable that the flow path unit 2 and the microscope 700 of the observation unit 8 are not completely taken out from the incubator 801 but only a part thereof.
  • the microscope 700 may be fixed in the apparatus.
  • the part to be removed from the incubator 801 may be the flow path unit 2 and the culture vessel base 202, and the system without removing the microscope may be used. In this case, since the number of components to be pulled out is reduced as compared with the above-described method, the drawing operation becomes easier.
  • a bundle of channel tubes 902 is arranged on the outer peripheral side of the culture vessel base 202 from the culture vessel base 202 toward the rotary valve mechanism 903 corresponding to the rotary valve mechanism 3 of FIG. This is because the driving of the microscope 700 is not hindered as described above.
  • a bundle 902 of flow tube is a bundle of 20 flow tubes for supplying various solutions to the culture vessel and 20 flow tubes for discharging.
  • a sterile desorption part is also arranged on the inner peripheral side with respect to each culture container.
  • the rotary valve mechanism 903 is positioned on the rotary valve mechanism base 904, and 40 channel tubes are installed on the rotary valve mechanism base 904.
  • the bundle 902 of the flow tube is positioned near the center of the 40 flow tubes arranged in the rotary valve mechanism 903. This is to make the length of each flow tube uniform while making it easy for the user to handle the bundled flow tube.
  • the ten culture vessels on the culture vessel base 202 are arranged symmetrically with respect to the bundle 902 of flow channel tubes. This makes it possible to minimize the difference in the distance between the culture vessel 201 located farthest from the rotary valve mechanism 903 and the culture vessel located closest.
  • the lengths of the flow tube to each culture container equal. Specifically, the length from the multi-branch portion branching from one channel tube to 10 to each culture vessel is made uniform.
  • the flow path tube in order to make the manufactured cells uniform in the plurality of culture vessels 201, it is important to equalize the length of the flow path tube to each culture vessel 201. In order to improve the quality of the regenerated tissue, it is desirable to configure the flow path tube having a uniform length between the culture vessels so as to be the shortest.
  • the rotary valve mechanism 903 is installed on the door side and below the culture vessel base 202 as shown in (A) on the left side of FIG.
  • the reason for installing on the door side is to make it easier for the user to attach a flow path or the like to the rotary valve mechanism 903.
  • the reason for installing the culture vessel base 202 below the culture vessel base 202 is to prevent the culture vessel base 202 from becoming an obstacle when inserted into the apparatus.
  • the portion farthest from the rotary valve mechanism 903 is a notch portion where the culture vessel 201 cannot be disposed in the culture vessel base 202.
  • the culture vessel 201 is not arranged on the extended line in the direction from the rotary valve mechanism 3 side to the microscope 700 side.
  • the culture vessel 201 can be configured not to be disposed at a position farthest from the rotary valve mechanism 903. Therefore, the culture vessel 201 that is the farthest from the rotary valve mechanism 903, which serves as a reference for equalizing the length of the flow path, is disposed closest to the cut portion, such as 201-1, 201-10. Culture container.
  • the rotary valve mechanism 903 is arranged at a position on the flow path side or the like, the position farthest from the rotary valve mechanism 903, that is, the extension in the direction from the rotary valve mechanism 903 side to the microscope side 700. Since there is no notch portion on the line, the culture vessel is arranged on the side facing the rotary valve mechanism 903 via the microscope 700. Therefore, since this culture container serves as a standard for making the length of the flow path uniform, the flow path becomes longer than the configuration of the present embodiment.
  • the cells produced in the culture vessel are more uniform and more uniform than other arrangement relationships. Higher quality can be achieved.
  • the flow path tube bundle 902 shown in (A) on the left side of FIG. By installing the jig 905 to be arranged between the rotary valve mechanism 903 and the culture vessel base 202, troublesomeness when the culture vessel base 202 is attached to and detached from the apparatus is eliminated, and it is also easier to check whether there is a wiring mistake during manufacturing. It becomes.
  • the 20 channel tubes supplied to the culture vessel 201 are branched from one for each cell type. That is, one flow tube 403 for the purpose of supplying various solutions from the cell bottle 404 of epithelial cells to the upper layer of the culture vessel 201 via the electromagnetic valve 402 and the tube pump 401 is divided into ten in the multi-branch portion 222. Divided. The same applies to the feeder cell cell bottle 405. Although not shown in the figure, the medium is sent from the medium bottle stored at 4 ° C. in the refrigerator to the preheating bottle 406, and is sent to each culture vessel 201 after preheating.
  • the two cell bottles 404 and 405 are each branched into ten at the multi-branch portion 222, but the length from the multi-branch portion 222 to each culture vessel 201 is equal as described above. Thereby, it becomes possible to make the liquid feeding conditions at the time of cell seeding and medium exchange the same. If the flow path length to each culture vessel is uniform, the distance from the multi-branch portion branching from 1 to 10 to each culture vessel differs for each culture vessel, so the flow path from the multi-branch portion to each culture vessel Among the lengths, the flow path tubes corresponding to different lengths may be installed as adjustment paths in an adjustment path installation area provided in the apparatus.
  • FIG. 10 is a diagram showing a three-dimensional arrangement of only the portion related to the flow path of the apparatus of the present embodiment and the state of the apparatus when the flow path is installed. If the flow tube is arranged in a straight line according to the distance from the multi-branch portion to each culture vessel, the difference between the length of the flow tube and the distance is generated as the deflection of the flow tube. A group of these portions is an adjustment path 1001 shown in FIG. In order to prevent the adjustment path 1001 from being affected by potential energy during liquid feeding, the adjustment path 1001 is arranged so that the flow path tubes are on the same plane. Thereby, the influence on the liquid feeding speed etc. by the difference in potential energy can be suppressed.
  • the position of the adjustment path 1001 is installed between the multi-branch portion and each culture vessel, the purpose of equalizing the distance to each culture vessel is achieved.
  • the flow path tubes constituting the adjustment path 1001 are located on the same plane, but the plane to be installed is most preferably on the plane where the rotary valve mechanism 903 is installed. This is because the rotary valve mechanism 903 is located below the culture vessel base 202 on which the user works and is also outside the driving range of the microscope 700, so that it is a position that is unlikely to become an obstacle during cell culture.
  • an area where the adjustment path 1001 is arranged may be referred to as an adjustment area.
  • the rotary valve mechanism 903 is positioned on the rotary valve mechanism base 904.
  • the rotary valve mechanism installation plate 1002 When the rotary valve mechanism installation plate 1002 is installed, the rotary valve mechanism 903 is rotated in the horizontal direction with respect to the rotary valve mechanism base 904 as shown in FIG.
  • the rotary valve mechanism seems to close vigorously when the rotary valve mechanism installation plate is installed. In this case, it is possible to suppress the risk of injury to the operator.
  • FIG. 11 shows the movement of the culture vessel base immediately after cell seeding and at the time of medium exchange and the movement of the microscope at the time of cell observation in the apparatus of this example.
  • the culture vessel base 202 changes the installation angle with respect to the horizontal plane by three actuators 901.
  • the cell distribution in the culture vessel 201 can be made uniform by swinging the culture vessel base 202.
  • the culture vessel 201 and feeding the solution there is an effect that the generation of bubbles in the vessel can be suppressed.
  • the time of arrangement replacement as shown in the sectional view of FIG.
  • FIG. 12 shows different apparatus configuration examples for equalizing the channel lengths from the multi-branch portion to the respective culture vessels in the apparatus of the present embodiment.
  • the flow channel length may be equal to each flow tube while minimizing the flow channel length from the multi-branch portion for feeding epithelial cells and feeder cells to each culture vessel.
  • 12A to 12D a microscope 700, a rotary valve mechanism 902, a flow path unit 2, and a culture vessel base 202 which are main components of the apparatus are shown, and the others are omitted.
  • FIG. 13 is a functional block diagram illustrating the functional configuration of the above-described automatic culture apparatus.
  • Each component controlled by the control device 1301 corresponding to the control unit in FIG. 1 is arranged inside the incubator unit / refrigerator / housing 1303 and connected to the culture vessel 201. Needless to say, what is placed in the incubator / refrigerator / storage 1303 is a culture vessel installed in the automatic culture apparatus.
  • the control device 1301 includes a temperature adjusting unit 1304 that controls the temperature of the incubator, refrigerator, and storage 1303, a temperature sensor 1305, and a gas supply unit 1306 that supplies gas into the culture vessel corresponding to the previous gas supply unit 10.
  • a temperature adjusting unit 1304 that controls the temperature of the incubator, refrigerator, and storage 1303, a temperature sensor 1305, and a gas supply unit 1306 that supplies gas into the culture vessel corresponding to the previous gas supply unit 10.
  • fluid movement control unit 1308 for automatically feeding the liquid and gas in the channel corresponding to the previous channel unit 2, and the previous microscope 700
  • a cell observation microscope 1309 is connected.
  • FIG. 14 is a flowchart for explaining the operation of the automatic culture apparatus.
  • the operation of the automatic culture apparatus of this example will be described with reference to FIG.
  • the culture procedure may be carried out by sequentially performing the following operations on each culture vessel.
  • Step S1 Start> Activate the automatic culture device.
  • the operation is started when the operator presses the start switch of the operation unit in the control device.
  • a value related to the internal environment of the automatic culture apparatus is displayed on the operation screen of the display of the control unit 12.
  • Step S2 Schedule determination> An automatic culture schedule to be executed by an automatic culture apparatus is input according to the type and amount of cells to be cultured. Conditions such as date, frequency, fluid volume, etc. for operations such as cell seeding, medium exchange, microscopic observation, drainage collection, examination tissue collection, transplantation tissue collection, etc. are controlled from the control terminal 13 connected to the control unit 12 or the like. input.
  • Step S3 Cell seeding> After opening and closing the appropriate solenoid valve, operate the tube pump to draw the cell suspension from the cell bottle.
  • the cell suspension is composed of oral mucosal epithelial cells suspended in KCM medium (keratinocyte culture medium) and 3T3-J2 cells or NIH suspended in KCM medium. -3T3 cells and the like. Each is in a different cell bottle.
  • each cell suspension is sent to the culture vessel 201 from two cell bottles.
  • the state is set so that the liquid can be fed by opening the culture vessel and the electromagnetic valve connected to the flow path.
  • the solenoid valve connected to the culture vessel and the flow path that are not the liquid supply target is closed so that the liquid cannot be supplied.
  • Cell seeding is sequentially performed on the upper and lower layers of 10 culture vessels.
  • Step S4 Cell Culture> Incubation is performed for a predetermined time in a state where the culture vessel 201 is left horizontally.
  • the stationary period is about 3 days after seeding.
  • the inside is maintained at 37 ° C. by an incubator.
  • the air in the apparatus is constantly stirred by a fan so that the temperature distribution is always uniform.
  • gas exchange is performed by supplying a predetermined component gas into the culture vessel. Gas exchange is also performed several times a day during the culture period.
  • air containing 5% CO2 is supplied into the culture container.
  • the gas is supplied from a gas supply unit, and water molecules are saturated by passing the humidifying bottle unit 11 before supplying the gas to each culture vessel. Thereby, it is avoided that water is evaporated from the culture medium in each culture vessel, and as a result, the culture medium components are changed. Further, the gas is directly supplied to each culture vessel through a gas supply circuit in parallel with the tube pump without using a tube pump.
  • the air supply speed can be increased as compared with the case through the tube pump, and the gas exchange efficiency is improved. Also, the load on the tube pump is eliminated. Unnecessary gas after being supplied to the culture vessel is discharged out of the flow path through the filter. Further, the air pressure in the flow path is adjusted through a filter as necessary. For example, a filter having a quality that does not pass particles of 0.22 ⁇ m or more is used.
  • the culture vessel 201 used in the apparatus of the present embodiment does not distinguish between a channel tube used for liquid feeding and a channel tube used for air feeding. That is, the air supply function is used in combination in the flow channel tube used for liquid supply.
  • the number of channel tubes connected to the culture vessel is reduced as compared with the case where the channel tube used for liquid feeding and the channel tube used for air feeding are made independent. As a result, the flow path can be simplified.
  • ⁇ Step S5 Observation with a microscope>
  • Cell images are acquired using a microscope placed in an automatic culture device.
  • the light source installed in the automatic culture apparatus is appropriately illuminated, and the cells are focused and imaged with a microscope. If necessary, set a fixed point on the culture surface and take a picture.
  • the acquired cell image is stored in a database and viewed on a control terminal installed outside the apparatus. Judging from the information regarding the growth state of the cells obtained by microscopic observation, the frequency and timing of medium replacement are adjusted. For example, when the cell adhesion is insufficient, the culture of S4 cells is continued without performing the medium exchange of S6.
  • ⁇ Step S6 Medium replacement> Medium exchange is performed once every few days during the culture period.
  • the medium stored at 4 ° C. in the refrigerator is fed to the preheating bottle and preheated. It heats by the heat conduction by the contact with the receiving part arrange
  • the old medium is discharged from the culture vessel 201.
  • the culture vessel is tilted to the outlet side by the actuator so that the entire amount of the old medium is discharged.
  • a new pre-heated new medium is supplied into the culture vessel. This avoids cell drying and temperature drop on the culture surface.
  • the old medium is finally discharged to the drainage bag unit 7. Assuming that it is used for medium component analysis, in this embodiment, the upper and lower layers of the culture container are collected in a separated state.
  • the cell suspension and medium flow in one direction in the channel circuit shown in FIG. That is, the old medium used for culture in the culture container and the new medium not used for culture are not mixed.
  • an old medium and a new medium have different amounts of glucose consumed by cells and lactic acid produced, which means that the culture environment changes when they are mixed at the time of medium exchange.
  • the effect of improving the reproducibility of cell culture can be obtained by preventing both from being mixed by the apparatus configuration of the present embodiment.
  • the effect of improving the accuracy of medium component analysis can be obtained because the new medium and the old medium are not mixed.
  • Step S7 Collection of examination tissue>
  • one culture container is aseptically removed from the apparatus for testing for determining whether or not transplantation is possible. If necessary, the number of culture vessels taken out for testing may be plural.
  • a sterile desorption part installed in a flow channel tube in the vicinity of each culture vessel is used.
  • the aseptic desorption part is, for example, a heat-sealable flow channel tube, and cuts between two parts sandwiching the cut part after heat welding. This makes it possible to maintain the sterility of the removed culture container and the culture container and the flow channel that have not been removed even after the removal. Thereafter, the removed culture container is promptly inspected to determine whether transplantation is possible.
  • Step S8 Culture and medium exchange just before transplantation> As in steps S4 and S6, cell culture and medium exchange are performed.
  • Step S9 Collection of transplanted tissue>
  • the fact that the culture is completed is displayed on the display of the control unit.
  • the tissue is aseptically removed from the apparatus, transported to the operating room, and used for regenerative medical treatment.
  • the length of the flow path from the culture vessel to the multi-branch portion or the cell bottle is shortened as much as possible, and the length of each flow path is made equal to each culture.
  • Treatment with a regenerated tissue with uniform quality of cells cultured in the container can be performed.
  • Example 1 In the automatic culture apparatus of Example 1, the configuration in which the flow tube connected to each culture vessel is bundled by using a jig or the like is shown. However, in the automatic culture apparatus of Example 2, the flow tube is not bundled. An embodiment in which the valves of the corresponding rotary valve mechanisms are installed independently will be described.
  • FIG. 23 shows a perspective view of a configuration example of an automatic culture apparatus capable of suppressing the crossing and twisting of the flow paths of this example.
  • the flow channel on the right side of the culture vessel base 202 is shown for explanation, but the flow channel is similarly arranged on the left side of the vessel base 202.
  • each culture vessel 201 is sequentially connected from the culture vessel 201-1 farthest from the rotary valve mechanism 903 to the valve on the center side from the end side valve of the rotary valve mechanism 903. That is, the culture vessel 201-5 located near the center as viewed from the door side is placed on the end side of the grip of the valve 2001 provided near the center of the rotary valve mechanism 903. 201-1 are respectively connected to the grips of the valve 2002 provided on the end side.
  • the flow path length is made uniform with reference to the length of the flow path 2301 disposed in the grip of the valve 2002 on the endmost side of the rotary valve mechanism 903.
  • the adjustment path connected to the same plane as the rotary valve mechanism 903 is longer in the center position of the rotary valve mechanism, that is, the culture container arranged at a position closer to the rotary valve mechanism. Therefore, the arrangement area of the adjustment path arranged in the adjustment region is large, and the installation area can be reduced toward the end.
  • a notch 1501 for stably arranging the flow paths in the culture vessel base 202 is provided. You may provide in both right and left. One notch 1501 may be provided on each of the left and right sides, or may be provided for each flow path connected to each culture vessel 201.
  • a partition 1502 may be provided on the culture vessel base 202 so as to partition the flow paths, and the installation space for arranging the flow paths may be divided.
  • the notch 1501 and the partition 1502 in each flow path, it becomes possible to reduce the risk of tangling with a flow path tube connected to another culture vessel 201.
  • a holding means for holding the flow path such as forming the notch 1501 or forming a partition, may be provided.
  • Example 3 describes an example of observing the microscope by driving the outer peripheral side of the culture vessel base.
  • the flow tube is arranged on the inner peripheral side of the culture vessel base 202 described in Example 1, there is no flow tube that can interfere with driving the microscope on the outer peripheral side. It becomes possible to make it.
  • FIG. 16 shows an example in which a flow tube is arranged toward the center of the culture vessel base 202 and the microscope 700 moves and observes the outer peripheral side of the culture vessel base 202 as a configuration of the present embodiment. Since the bundle of flow channel tubes has a volume smaller than that of the microscope 700, the inner space of the culture vessel base 202 can be made smaller than that of the first embodiment, and the entire apparatus can be downsized.
  • Examples 1, 2, and 3 the configuration in which the culture vessel base is arranged at the center or the outer periphery has been described, but the shape of the culture vessel base and the arrangement position of the microscope are not limited thereto.
  • a fourth embodiment an arrangement of a microscope and a culture vessel base different from the above embodiments will be described.
  • FIG. 17A shows an example of the configuration.
  • This is a system in which a CCD camera microscope 1701 having a lens and illumination is installed on an incubator upper surface 1702, and each culture vessel is observed from above.
  • the ceiling has a rail for operating the microscope 1701.
  • the flow channel tubes are arranged so as to converge toward the inner peripheral side, the flow channels can be bundled closer to each culture vessel.
  • the curvature of the flow tube can be made uniform as compared with the case where it is arranged on the outer peripheral side of the culture vessel base, so that the shear stress caused by the flow tube can be made uniform.
  • Cell quality can be made uniform.
  • FIG. 17B shows an example in which the flow channel tube bundle 1704 is bundled and the notch 1705 provided on the outer periphery of the culture vessel base 202 on the door side is passed. Also in this configuration example, since the microscope 1701 as the observation unit is suspended from above the apparatus, there is no need to provide a gap or the like in the culture container base 202. As a result, the culture container base becomes small and the installation area of the apparatus is small. It becomes possible to do. In the case of this example, since the shape of the culture vessel base and the arrangement position of the culture vessel are not dependent on the arrangement position of the observation unit, the arrangement of the culture vessel 201 may be other than the circumferential shape.
  • the culture vessels 201 may be arranged in a line and arranged in parallel in a plurality of lines.
  • the aseptic detachment part 1706 of each culture vessel 201 is arranged on the same side as the flow tube bundle 1703 installed on one side.
  • the distance of each culture vessel to the flow channel tube can be shortened. It is desirable to arrange in the direction.
  • Example 5 an example of another shape configuration of the culture vessel base shape when the microscope is arranged on the floor or side surface of the incubator will be described with reference to FIG. Needless to say, the culture vessel base shape described in the present embodiment may be applied to a configuration in which the microscope is suspended on the upper surface of the incubator described in the second embodiment.
  • the L-shaped culture vessel base 1801 shows a case where the culture vessel base is refracted to form an L-shaped crank shape (hereinafter referred to as “L-shaped”).
  • L-shaped culture vessel base 1801 can narrow the driving range of the microscope while securing the observation unit arrangement region 1802, that is, the microscope arrangement space. Since the culture vessel 201 is disposed along the L-shaped culture vessel base 1801, the rotation angle during observation with a microscope is 90 °. In the U-shaped arrangement shown in the first embodiment, the rotation angle of the microscope is approximately 360 °, but the rotation mechanism of the microscope can be reduced as the angle becomes smaller.
  • Example 6 As shown in FIG. 19, an example of another configuration when using a U-shaped culture vessel base as in Example 1 will be described.
  • the culture vessel 201 in the culture vessel base 202 shown in Example 1 is installed twice or more on the same plane. Thereby, a plurality of culture vessels can be integrated.
  • (B) of FIG. 17 is a case where the culture container base 202 shown in Example 1 is installed in multiple stages. Similarly, integration is realized.
  • Example 1 Although the example which slides a U-shaped culture container base and arrange
  • Example 7 describes an example in which another photographing means is installed around the microscope in the microscope of Example 1.
  • FIG. 7B shows a phase contrast microscope disposed on the front surface of the microscope 705 and a pH evaluation device based on color temperature measurement disposed on the back surface.
  • the pH evaluation apparatus includes a web camera 703 and a white plate 704.
  • the pH is determined by the color temperature of the medium.
  • phenol red is used as a pH indicator of a medium, it is close to yellow when acidic, and close to red when alkaline.
  • the white plate 704 as a background, a clear image can be taken by the web camera 703.
  • the pH is evaluated based on the quantified RBG component value.
  • evaluation is performed by mounting an absorptiometer.
  • the microscope 705 since the microscope 705 has an operation unit 702 as a driving means as a rotation function like the microscope 700 of the previous embodiment, the microscope 705 can be implemented without using another individual microscope, and the installation space is small. can do.
  • Example 8 as shown in FIG. 20, an example will be described in which the length of the channel tube connected to each culture vessel and the rotary valve mechanism is made more uniform and shorter.
  • each flow tube is bundled on the rotary valve mechanism 903 side. Since each culture vessel 201 is circumferentially arranged on the culture vessel base 202, the length from the bundled point (referred to as a convergence point) 2001 to each culture vessel 201 is different.
  • the valves (clips) for opening and closing the respective flow path tubes in the rotary valve mechanism 903 are arranged in a row facing the culture vessel base 903. The length of the flow tube up to the convergence point 2003 is also different.
  • a flow path tube indicated by a broken line connected to the culture vessel 201-5 having a short distance from the convergence point 2003 is disposed on the valve 2002 far from the convergence point 2003, that is, on the end side of the rotary valve mechanism 903,
  • the flow path tube shown by the dotted line connected to the culture vessel 201-1 far from the convergence point is arranged on the valve 2001 having a short distance from the convergence point 2003, that is, on the center side of the rotary valve mechanism 903.
  • Example 9 an example in which the inflow conditions of cells when passing through each flow tube are made uniform will be described with reference to FIG.
  • the multi-branch part for dispersing the solution from the cell bottle to each culture vessel branches to the power of 2 through the two branch parts in order, Thus, a configuration with ten branched flow paths is adopted.
  • the number of bifurcated portions 2101 relayed for each branched flow path is different.
  • the connecting portion between the bifurcated portion 2101 and the channel tube has a step difference because the channel diameter is different.
  • the friction applied to the solution at the bifurcated portion 2101 is different from the friction with the channel tube. That is, shear stress is generated in the cell every time it passes through the bifurcated portion 2101. Therefore, if the number of bifurcated portions 2101 relayed by each branched flow path is different, such as 3 or 4, the conditions of the cells to be cultured also differ. There is a possibility that the quality of the cells after culturing becomes non-uniform.
  • the two branch portions 2101 that relay each branched flow path are connected so as to have the same number of four, so that the conditions for inflow of the solution into the culture vessel 201 are uniform.
  • the closed part 2102 is formed in the path for the branch that does not connect the flow path tube by heat welding or the like.
  • a relay member using the same material and flow path diameter as that of the bifurcated portion may be used without using the bifurcated portion with the one-side path closed as described above.
  • the present embodiment is an embodiment having a configuration in which the normality of the flow channel installation to the measure can be determined more accurately by providing a pressure sensor in the flow channel in the flow channel installation to the apparatus in the first embodiment. .
  • the normality and flow of the flow path are set for each solenoid valve by performing pressurization and depressurization while sequentially opening and closing the solenoid valves provided in the rotary valve mechanism. Evaluate whether the road is damaged.
  • the electromagnetic valve in the route is opened and gas is supplied from the gas cylinder. Whether the pressure has increased thereby is evaluated by the pressure sensor 2201.
  • everything except the pressure sensor 2201 is the same as the configuration of FIG. 2, and thus the figure numbers described in FIG. 2 are not shown.
  • the same check is performed on the solenoid valve outside the shortest route. That is, the gas is supplied from the gas cylinder to the second route including the shortest route and the flow path to the solenoid valve located outside the shortest route, and it is confirmed whether the pressure increases. Subsequently, the solenoid valve is opened and it is confirmed whether the pressure decreases.
  • This operation is sequentially performed on all the solenoid valves by a signal from the control unit.
  • the present invention is useful as a culture apparatus for automatically culturing cells or tissues using a culture vessel, particularly as an automatic culture apparatus capable of producing a regenerated tissue that can be used for regenerative medicine.
  • this invention is not limited to the above-mentioned Example, Various modifications are included.
  • the above-described embodiments have been described in detail for better understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
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Abstract

 閉鎖系培養容器を用いた自動培養装置において、流路部2や回転弁機構3を構成する際に、培養容器部1の複数の培養容器間で流路長の調節等により送液条件を揃えることを可能とする。その結果、複数の培養容器夫々において培養した細胞の品質均一化を実現する。また、ユーザによる装置への流路設置作業を正常に実施する機構を提供することで、同じく細胞の品質均一化を実現する。

Description

細胞培養装置
 本発明は、細胞又は組織を自動操作により培養する培養装置に関する。
 細胞を原料として製造した再生組織等の生体試料を用い、臓器等の機能を回復させる再生医療は、従来治療法のなかった疾病に対する根治療法として期待されている。再生組織は清潔な製造環境を提供するCPC(Cell Processing Center:細胞処理施設)において、専門の細胞培養技術を有した製造従事者によりSOP(Standard Operating Procedure:標準手順書)に従い製造される。そのため多大な人件費、労力、運用コストが発生する。また全ての製造工程は人手でなされるため、再生組織の製造量には限界がある。よって製造コストは高くなり、結果として再生医療治療の普及の妨げとなっている。
 このような現状を打破するため、培養工程の一部ないし全てを自動化する自動培養装置の導入が求められている。培養工程を人手ではなく自動培養装置で実施し、省力化とコストダウンと大量生産の実現が可能となる。加えて自動培養装置の操作は一定なため、再生組織の品質一定化への寄与も期待される。
 ここで自動培養装置は手作業の代替となるが、手作業に対するGMP(Good Manufacturing Practice:への準拠が必要とされる。また自動培養装置に特化したGMPは現在のところ規定されていないが、臨床用途の自動培養装置に関する開発ガイドライン(再生医療分野(ヒト細胞培養加工装置についての設計ガイドライン[改訂])、2009)が経済産業省より提示されており、それへの準拠も必要である。以上より、自動培養装置は手作業に対するGMP及び自動培養装置の開発ガイドラインを鑑みて、科学的根拠に基づき、清浄な環境を維持した状態で高品質の再生組織を再現性良く製造可能であることが求められる。
 これらの課題を解決する手段として、例えば特許文献1には、マトリクス状に配置した複数の培養容器に対し、列単位で電磁弁からの流路チューブ長を揃え、同列マトリクスの複数培養容器を用い培養することで再生組織の品質を均一にする装置が開示されている。
 また特許文献2には、生物学的汚染リスクを低減すべく培養容器、培地ボトル等の培養に必要な構成要素が流路チューブ等により常時接続し、閉鎖系培養空間を形成する装置が開示されている。
特開2010-75200号公報 特開2007-312668号公報
 しかしながら特許文献1の流路長の調節方法は、あくまでも同列上に配置された培養容器への流路長を揃えているだけであるため、培養に用いる細胞懸濁液の送液時に細胞損失の程度が列単位の培養容器毎により異なり、同時に培養する複数の培養容器間で品質を均一にできないという課題があった。
 また特許文献2の自動培養装置は、ユーザによる装置への流路セッティング作業において培養容器を装置内へ搬入、搬出する際に他の機器へ衝突させる等の作業ミスにより、培養された細胞の品質に支障をきたす恐れがあるという課題があった。
 本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、高品質で再現性の良い細胞培養を可能とする閉鎖系の細胞培養装置を提供する。具体的には、製造後の細胞の品質均一化と、流路設置におけるユーザ作業ミスの抑制等を可能とする細胞培養装置を提供する。
 本発明においては、上記の課題を解決するため、細胞を培養する細胞培養装置であって、培養に用いる溶液を保持する溶液保持部と、溶液保持部と複数の培養容器とを夫々接続させる複数の流路とを備え、複数の流路は、溶液保持部から前複数の培養容器夫々まで長さが等しい構成の細胞培養装置を提供する。
 また、本発明においては、上記の課題を解決するため、細胞を培養する細胞培養装置であって、培養に用いる溶液を保持する溶液保持部と、溶液保持部から供給された溶液を保持する複数の培養容器と、溶液保持部と接続され、溶液を通過させる多分岐部と、多分岐部と複数の培養容器とを夫々接続させ、多分岐部を通過した溶液を複数の培養容器夫々に供給させる複数の流路とを備え、複数の流路は、多分岐部から複数の培養容器夫々までの長さが等しい構成の細胞培養装置を提供する。
 本発明に係る閉鎖系培養容器を用いた細胞培養装置によれば、高品質な細胞の培養が可能となる。具体的には複数の培養容器夫々において、培養した細胞の高品質化及び均一化を実現する。またユーザの装置への流路セッティング作業を正常に実施する機構により、ユーザの誤操作による細胞の品質低下を抑制する。
第1の実施例を示す、再生組織を培養するための自動培養装置の全体構成図を示した図。 第1の実施例に係る、自動培養装置の閉鎖系流路の流路回路を示した図。 第1の実施例に係る、流路回路に含まれる培養容器ベースの一例を示した図。 第1の実施例に係る、流路回路に含まれる流路部の一例を示した図。 第1の実施例に係る、流路回路に含まれる回転式弁機構の一例を示した図。 第1の実施例に係る、流路回路に含まれる細胞ボトル、予熱ボトル、加湿ボトルの一例を示した図。 第1の実施例に係る、顕微鏡の一構成例を示した図。 第7の実施例に係る、顕微鏡の一構成例を示した図。 第1の実施例を示す、自動培養装置の概略の一例を示した図。 第1の実施例を示す、自動培養装置の流路部及び顕微鏡の一例を示した図。 第1の実施例を示す、自動培養装置の流路の一例を示した図。 第1の実施例を示す、自動培養装置の細胞播種及び培地交換時、細胞観察時の顕微鏡と流路ベースの動きの一例を示した図。 第1の実施例を示す、自動培養装置の機能構成レイアウトの一例を示したブロック図。 第1の実施例を示す、自動培養装置の制御機構を示したブロック図。 第1の実施例に係る、自動培養装置の培養プロトコルのフローチャート図。 第1、第2の実施例に係る、培養容器ベースを示した図。 第3の実施例に係る、培養容器ベースを示した図。 第4の実施例に係る、顕微鏡の配置を示した図。 第5の実施例に係る、顕微鏡及び培養容器ベースを示した図。 第6の実施例に係る、培養容器ベースを示した図。 第8の実施例に係る、顕微鏡及び培養容器ベースを示した図。 第9の実施例に係る、多分岐部を示した図。 第10の実施例に係る、流路配置を示した図。 第2の実施例に係る、培養容器ベースを装置内に挿入させる際の斜視図。
 本明細書において、培養装置の流路を流れる気体、液体、気体及び液体を総称して流体と呼ぶ場合がある。図面上の構成の番号について、他の図にて既に番号を付して説明したものについては、別の図にて図番号を省略する場合がある。また、培養容器と流路とを示す図については、説明のため培養容器と流路または流路の一部とを切り離した状態の図を示すこととする。
 まず、実施例1を含め、各実施例に係る細胞培養装置の基本的な構成および動作フローについて、図面を参照して詳細に説明する。ただし基本構成や動作フローはこれに限られるものではなく、用途に応じ適宜構成の追加や動作フローの変更等を行ってもよい。
 図1を用いて、自動培養装置の基本的な構成の一例として、以下12個の構成要素より成る自動培養装置を詳細に説明する。12個の構成要素はすなわち、培養容器部1、流路部2、回転式弁機構3、培養細胞用及びフィーダー細胞用ボトル部4、冷蔵庫などで構成される培地ボトル部5、予熱ボトル部6、排液バッグ部7、観察部8、インキュベータ部9、気体供給部10、加湿ボトル部11、制御部12である。なお、図1に示すように、制御部12は制御用端末13を備えている。
 以上の構成要素において自動培養装置は、閉鎖された培養空間である閉鎖系流路に対し、ユーザが設置した細胞ボトル及び培地ボトル内の細胞懸濁液、培地を用い、本装置の流路部2などに備え付けられた図示を省略した電磁弁、チューブポンプ等を制御部12により制御することで、培養容器部1の培養容器内へ細胞を播種し培養を行う。
 また細胞培養中は、本装置に備え付けられた顕微鏡などからなる観察部8を制御部12により制御することで、培養容器内の細胞画像を撮影する。自動撮影、細胞播種、培地交換、気体交換時以外は、顕微鏡の手動観察により制御用端末の操作画面からの入力に基づく顕微鏡の位置制御、細胞画像の撮影及び保存が可能である。
 本自動培養装置のインキュベータ部9内ではセンサ機構により温度環境を観測し、観測結果を制御用端末13上に表示する。流路部2の電磁弁、チューブポンプ等の各動作と測定の全ログは制御用端末13が備える、図示を省略したハードディスクなどの記憶部に記録する。加えて動作エラー有無を判定し、動作状況を制御用端末13のモニタ画面上に表示する。それらのデータは自動培養装置外へ移行可能である。
 図2は、上述した自動培養装置の閉鎖系流路の流路回路を示している。閉鎖系流路は、図1で示した構成要素のうち培養容器部1、流路部2、回転式弁機構3、細胞ボトル部4、培地ボトル部5、予熱ボトル部6、排液バッグ部7、気体供給部10、加湿ボトル部11よりなる。
 実施例1では角膜上皮系細胞、口腔粘膜上皮系細胞、表皮細胞等の上皮系細胞の再生組織の製造を目的とした場合を例とし説明するが、本培細胞養装置によって培養可能な細胞種はこれに限るものではない。また、図2では上皮系細胞を対象とするため2種類の細胞を使用する流路回路となっているが、心筋細胞、繊維芽細胞といった1種類のみの細胞を培養対象とする場合は1個の細胞ボトルとそれに対する流路の流路回路としても良い。或いは、2種類の細胞を使用する流路回路において、1種類分の細胞を対象とする流路回路のみを使用しても良い。さらに、図2の流路回路は10個の培養容器を使用するが、培養容器を並列に設置または取り外すことで、異なる個数の培養容器から成る流路回路の使用も可能である。
 図2の示す閉鎖系流路は主に次の構成要素を有する。本例では10個の再生組織を製造するため、10個の培養容器201を有する。全培養容器201は平面状の板である培養容器ベース202の上に設置し、培養容器ベース202には傾きを変化させるアクチュエータ203が取り付けられている。
 上述したように、本例では2種類の細胞を用いるため2個の細胞ボトル204、205を用いる。それぞれの細胞ボトル204、205に対し1種類の細胞を入れる。また培養容器内で2種類の細胞が混じることを回避するため全培養容器は2層構造であり、それぞれの層に1種類ずつの細胞を培養する。細胞ボトル204、205から培養容器の各層へ至る流路回路は、送液途中で細胞が混じらないようにするため異なる流路回路(1)、(2)を使用する。細胞ボトル204内の細胞懸濁液は実線の流路回路(1)206を通り、各培養容器の片側の層、例えば全培養容器の上層へ送液される。このように細胞種によって流路を分けることによって、培養容器の上層で培養する細胞と、下層で培養する細胞が混じることを抑制し、異種移植などの危険性を回避することが可能となる。一方、細胞ボトル205内の細胞懸濁液は点線の流路回路(2)207を通り、各培養容器の片側の層、例えば全培養容器の下層へ送液される。なお、図2において、222は後で説明する多分岐部を示している。
 細胞種毎に細胞ボトルは異なるのに対し培地は共通であるため、培地ボトル208は1個を使用する。培地ボトルは図1で説明したように冷蔵庫を用いて4℃で保管する。培地交換時、予熱ボトル209へ1回の培地交換に必要な量を移動させ、例えば36℃まで加温後、培地交換に使用する。予熱ボトルからは流路回路(1)206及び流路回路(2)207へ二分岐部210を介し適宜分岐させる。流路回路(1)206へ送液された培地はその後、各培養容器の片側の層へ順次送液する。流路回路(2)207へ送液された培地も同様である。流路内での送液及び送気に対する駆動力はチューブポンプ211により与える。送液方向は電磁弁212、及び図1の回転式弁機構3に対応する回転式弁機構213により制御する。培地交換時、培養に使用した古い培地は排液バッグ214、215へ送液する。
 培養時、気体交換として各培養容器201へ酸素及び二酸化炭素を供給する。細胞は酸素を消費し二酸化炭素を排出するためである。本装置では気体交換時、5%CO2を含む空気を充填したガスボンベ216より、所定の送気速度へガスフローメータ217にて調整した上で、滅菌水を入れた加湿ボトル218を通過し水分を飽和させ送気する。チューブポンプ211と並列に位置する送気用回路219を通り各培養容器へ気体を送る。
 本実施例の流路回路の他の構成として、無菌脱着部220と無菌接続部221を有する。無菌脱着部220は各培養容器201の近傍の流路チューブ上に設置されている。この構成により、例えば移植前日に1個の培養容器をサンプルとして検査するため無菌的に取り外すことが可能になる。取り外した培養容器と、取り外し後の残りの培養容器及び流路は、それぞれ無菌性を維持可能である。移植当日は、残りの培養容器201を取り外す時に無菌脱着部220を使用し培養容器201を取り外す。無菌脱着部220は例として熱溶着可能な流路チューブであり、切断箇所を挟む2ヶ所を熱溶着後にその間を切断する。
 一方、無菌接続部221は細胞ボトル204、205、培地ボトル208、加湿ボトル218それぞれの近傍の流路チューブ上に設置されている。細胞ボトル204、205、培地ボトル208、加湿ボトル218は空の状態でCPC(Cell Processing Center:細胞処理施設)へ搬入し、ユーザが所定の細胞懸濁液、培地、滅菌水を入れ閉鎖系流路へ取り付ける。その際、無菌接続部221を用い無菌的に接続する。
 図3は、本実施例の装置の培養容器ベース202、及び培養容器ベース202へ10個の培養容器201を設置した状態を示した例である。図3上段の(A)で示すように本例の培養容器ベース202では馬蹄の形状をしている。すなわち、培養容器ベース202は、方形形状の平面板で中央部がくり抜かれた空隙が形成され、平面板における装置へ挿入する側の端、つまりは外周の一部に切りかきが設けられた構造であり、所謂U字型の形状を有している。培養容器ベース202の中央部の内辺は円形形状でその周囲に培養容器201を円状に配置する。培養容器ベース202には、各培養容器201を保持するための窪み等の保持手段が形成されている。くり抜かれた円形の空隙部分には後述する観察部8の顕微鏡を配置する。培養容器201を保持する部分には、顕微鏡観察のための観察孔301が設けられている。
 培養容器ベース202は上記のようにU字型であるため装置への設置方向が一義的に定まる。すなわち、培養容器ベース202を設置する時は培養容器ベース202の一辺に形成された切りかき側から培養容器ベース202を顕微鏡へ接近させ、顕微鏡を空隙内に導き、アクチュエータ等に設置する。この切り抜きの空隙を有した形状により、培養容器ベース202を複数の培養容器201の中心へ配置させることが可能となる。またユーザは顕微鏡に培養容器ベース202上の複数の培養容器201を接触させることなく簡便な設置及び取り外しが可能なため、人的ミスにより流路等が損傷することによる細胞培養の品質劣化抑制が可能となる。
 また、装置内に培養容器ベース202と同形状の、または複数個へ分割した、図示を省略した他の培養容器設置ベースを設け、培養容器ベース202を他の培養容器設置ベースの上に載置させるようにして、培養容器ベースの重量が重い場合などであっても設置作業がより簡便となるようにしてもよい。
 図3下段の(B)は、培養容器ベース202上に10個の培養容器201を設置した状態を示している。本実施例では、培養容器201の各々に対し4本が纏められた流路チューブ302が接続しており、4本の流路チューブ302は培養容器ベース202に対し外側方向に配置されている。培養容器ベース202の外側、すなわち、外周に流路チューブ302を配置することにより、顕微鏡の駆動時に顕微鏡と培養容器ベース202、流路チューブ等が接触することによる細胞の品質低下を抑制可能となる。各培養容器201の近傍の流路チューブ内には、一つ一つの培養容器の取り外しを可能とするための無菌脱着部303を有する。これにより、例えば移植前日に細胞が移植可能な品質を有するか出荷判定を行うため任意の培養容器1個のみを取り外し評価する際、取り外した培養容器内及び、取り外さなかった培養容器と流路内は、取り外し後も無菌性を維持可能となる。
 培養容器の培養表面は、例えばセルシード社製の温度応答性セルカルチャーインサート容器を適用する場合、培養容器201の温度が温度応答性培養表面の相転移温度、例えば32℃よりも低下すると、温度応答性培養表面の性質が疎水性から親水性へと変化し、37℃の培養時に接着、伸展、増殖していた細胞は自発的に剥離する。温度低下により温度応答性培養表面から細胞が剥離すると培養条件は大きく変化するため、移植時の細胞の品質も変化してしまうことになる。よって前日取り出し後に残された培養容器201、及びインキュベータ部9内が37℃より大きく低下しないために、培養過程での品質確認を目的として培養完了の前日以前に取り出し作業を行うための、小扉をインキュベータ部9の扉上部に用意し、インキュベータ部9内を外気に晒す時間及び範囲を低下させ作業時の温度低下を小さくする効果が得られる。また、この前日取り出し用の小扉をガラスなどの透明な素材で作成することで、培養の経過状況、例えば培地の色によるpH、混濁有無による生物学的汚染有無等を小扉から確認することも可能となる。
 移植当日の取り出しでは培養容器に接続された全流路チューブを無菌切断後、複数の培養容器を培養容器ベースに設置した状態で装置から取り外し、培養容器ベースの培養容器が載置された状態で安全キャビネット等へ運搬する。即ち、複数の培養容器に対し一括した取り扱いが可能である。1個のみを装置内に置き忘れるといった人的ミスの回避が可能となる。また全培養容器の取り出しに対する時間的条件と温度条件が同一となる利点も有する。
 図4に示すように、流路部2には、チューブポンプ401、電磁弁402、流路チューブ403、細胞ボトル404、405、予熱ボトル406等が設置されている。尚、本実施例及び他の実施例において、これらボトルの総称として溶液保持部とする場合がある。
 チューブポンプ401は流路チューブ外部より流路チューブ403をしごき液体を送液または空気を送気する。電磁弁402は通電により流路チューブ403を開閉し送液または送気方向を制御する。フィルタを設置する際には、フィルタは流路内外の圧力を調整し、流路外から菌等が侵入しないよう例えば孔径が0.22μmのものを使用する。この場合、流路部2のチューブポンプ、電磁弁、フィルタ、分岐部の配置は以下の優先順位の条件に従い位置を決定する。
 1番目の条件は、上皮系細胞の細胞懸濁液が入れられた細胞ボトル部4の細胞ボトルから各培養容器201までの流路長が最短、かつ等しい長さとなることとする。培養対象である上皮系細胞が播種工程において培養に支障をきたす影響を最小限とすることが最優先である。
 2番目の条件は、細胞ボトル部4のフィーダー細胞の細胞懸濁液が入れられた細胞ボトルから各培養容器201までの流路長が最短かつ等しい長さとなることとする。上皮系細胞に与える成長因子を算出するフィーダー細胞も播種工程において培養に支障をきたす影響を最小限とすることが望ましい。
 3番目の条件は、培地ボトル部5の培地が入れられた培地ボトルから各培養容器201までの流路長が最短かつ等しい長さとなることとする。培地が最短の流路経路を通り送液されることで、流路チューブ内に培地成分であるタンパク質等の付着や液滴残存による送液量精度の低下を回避するためである。
 本実施例の装置においては、上記1~3番目の条件における、各培養容器201までの流路長を等しくする点に関し、溶液保持部から多分岐部222までは各培養容器共通であるため、多分岐部222から各培養容器201までの長さを等しくすることで各流路長を等しくする目的を達成することが可能となる。多分岐部222から各培養容器201までの長さを等しくする方法の詳細については後述することとする。
 図5に本実施例における、図1に示した溶液供給機構としての回転式弁機構の一例を示す。ただし、本実施例における溶液供給機構はこの回転式弁機構に限られるものではなく、多分岐部222を通過した溶液を培養容器201夫々に供給されることを制御することが可能な供給機構であれば適用可能であることはいうまでもない。
 図5に示す回転式弁機構3は、同時培養する複数の培養容器201への培地や気体供給を一括制御する。図5上段の(A)に示すように、複数の流路チューブの開閉を行う弁機構であり、流路チューブ501を閉じるクリップ部502と、接触によりクリップ部502を開く多連式カム部503と、多連式カム部503を回転させるアクチュエータ504を有する。また、図5下段の(B)に示すように、クリップ部502は、クリップを閉じるバネ505と、多連式カム部503と接触するクリップ接触部506を有する。クリップ接触部506が多連式カム部503の回転により閉じるクリップを変更可能なため、送液及び送気方向を制御できる。
 また後述する2個の細胞ボトル404、405と、予熱ボトル406は流路部と流路チューブで連結した状態で位置しているが、それらは流路部2内の図示を省略した重量計の上に設置されている。細胞ボトル404、405については細胞懸濁液の送液時、各培養容器201へ送液後の重量変化から送液量を確認する。送液量はチューブポンプの稼働時間により制御しているが、重量変化もモニタリングすることでより確実に送液量を把握する。予熱ボトル406も同様に送液量をチューブポンプ稼働時間、及び重量変化の2項目により把握する。
 図6に本実施例の装置に用いる、流路回路に含まれる溶液保持部の細胞ボトル、予熱ボトル、加湿ボトルの一例を示した。
細胞ボトル601の場合は、先に説明したように、上皮系細胞の培養では上皮系細胞とフィーダー細胞に対応した2個を使用する。図6左側の(A)が示すように、本実施例の細胞ボトル601は、細胞ボトル本体部602と細胞ボトル蓋部603から成る。細胞ボトル蓋部603には送液用流路チューブ604と内圧調整用流路チューブ605が取り付けられ、それぞれの片方の端は細胞ボトル本体部602内にある。送液用流路チューブ604の細胞ボトル側の端は細胞ボトル本体部602の底面に接している。これにより送液時、送液過程が進むにつれ細胞懸濁液の量が少なくなっても送液を可能とする。細胞懸濁液を効率良い使用が可能となり、結果として患者からの細胞採取量が少なくなり患者への負担は減少する。
 送液用流路チューブ604の細胞ボトルと逆側の端には無菌接続部606が取り付けられている。内圧調整用流路チューブ605の細胞ボトル側の端は、細胞ボトル本体部602に細胞懸濁液を入れた際に気相となる部分にある。内圧調整用流路チューブ605の細胞ボトル側と逆側の端には、フィルタ607が取り付けられ、例えば0.22μm以上の粒子を通さない品質のものを使用する。
 冷蔵庫に内蔵される培地ボトルは、先に説明したように、2種類の細胞に対し培地が共通なため、1個を使用する。培地ボトルは前述の細胞ボトル601と同じ構成であり、細胞懸濁液の代わりに培地を入れ使用する。培地は、培地内の成長因子等の劣化を防止するため、冷蔵庫内で例えば4℃の低温下で保管する。
 図6中央の(B)に示すように、本実施例の予熱ボトル部は、予熱ボトル608、及び受け部609から成る。培地は使用時まで4℃で保管するが、培養は37℃で行うため、培地交換前に予熱ボトル部6にて予熱する。本方式はヒーター等を用い予熱する場合に比べヒーターの温度制御が不要となり、また部品数増加と流路チューブ長の増加回避が可能となる。
予熱ボトル608は、予熱ボトル本体部610と予熱ボトル蓋部611から成る。予熱ボトル608の周囲は熱伝導性の高いアルミ等の素材から成る受け部609により囲われている。予熱ボトル蓋部611には、供給用流路チューブ612と送液用流路チューブ613が取り付けられ、それぞれの片方の端は予熱ボトル本体部610内にある。送液用流路チューブ613の予熱ボトル側の端は予熱ボトル本体部610の底面に接している。これにより送液時、予熱ボトル内の培地量が少なくなっても送液可能ある。供給用流路チューブ612の予熱ボトル側の端は、予熱ボトル本体部610に培地を入れた際、気相となる部分にある。予熱ボトルは、例えば細胞ボトルの奥に設置する。細胞ボトル及び予熱ボトルは共に送液に際し重量を計測するため、必要に応じ全容器を同一の重量計に乗せることで重量計の設置スペースを小さくしても良い。
 図6右側の(C)に示すように、本実施例の加湿ボトル部は、加湿ボトル614から成る。加湿ボトル614は加湿ボトル本体部615と加湿ボトル蓋部616から成る。加湿ボトル蓋部616には送気用流路チューブ617と気体供給用流路チューブ618が取り付けられ、それぞれの片方の端は加湿ボトル本体部615内にある。送気用流路チューブ617の細胞ボトル側の端は加湿ボトル本体部615に滅菌水を入れた際、気相となる部分にある。また送気用流路チューブ617の加湿ボトル側と逆側の端にはフィルタ619が取り付けられている。フィルタ619は、例えば0.22μm以上の粒子を通さない品質のものを使用する。フィルタ619よりもさらに外側には無菌接続部620を取り付ける。尚、フィルタの取り付け位置は無菌接続部620と気体供給部10の間であれば任意の場所で良い。
 気体供給用流路チューブ618の加湿ボトル側の端は加湿ボトル本体部615の底面に接している。加湿ボトルの目的は送気した気体に対する水分の飽和である。よって滅菌水に接触する時間が長くなると気体を飽和させる効率が向上する。また気体供給用流路チューブ618の加湿ボトル側の端にフィルタを設置し気泡を細かくしても良い。表面積が増加するため、同じく飽和効率が上がる。気体供給用流路チューブ618において加湿ボトル側と反対側の端には接続部621を設置し、気体供給部10との接続に使用する。
 図1に示した本実施例の排液バッグ部7は、培養に使用した古い培地である排液を回収する。図2で示した本実施例の流路は、培養容器201の上層と下層の排液を分け、かつ、全回次の排液を一括して回収する。このように、培地交換時ごとに上層と下層の培地を分けて回収することで、各層ごとの培地成分を分析し、細胞が正常に培養しているか否かを、培養過程中に判断することが可能となる。尚、図1では排液バッグ7は収容庫内に設けているが、排液の成分分析を行く場合は、排液バッグ7も冷蔵庫内に格納し、排液の品質を保持するようにしても良い。
 また、廃液の成分分析を行わない場合は、上層と下層を分けずに一括して廃液を回収してもよい。培養途中での排液バッグの回収では、排液バッグ直前に無菌脱着部を導入し無菌的に取り外す。また本図では各排液バッグの直前に電磁弁を導入しているが、前述の回転式弁機構を導入したり、1回しか使用しないので通電不要で手作業で取り扱うクリップ等を導入したりしても良い。
 図7Aに、本実施例の装置の観察部に、位相差顕微鏡を用いる場合を示す。同図が示すように、位相差顕微鏡700は観察孔701を有する。同図では省略しているが観察孔701の下方には対物レンズを有する。また観察孔701を挟み対物レンズと反対側には図示を省略した照明手段を有する。
 本装置は観察において、培養容器を載置したステージを動かし細胞を観察するのではなく、培養容器201を設置した培養容器ベース202に対し位相差顕微鏡700を、後で説明するように、それ自身の自転方向と、設置面に対して水平方向に動かし観察する。培養容器ベース202の設置面に対して水平方向に前後運動させ培養容器自身を動かす場合、各培養容器を単独に動かす機構が必要となり装置が煩雑化する。また、図3に示したように全培養容器201には流路チューブ303が常時接続されているため、各培養容器201を単独に動かすと培養容器ベース202に対する流路チューブの相対的位置も変化し、その分の流路チューブ長が長くなり、播種時に細胞損失や細胞膜への損傷発生等の危険性が増す場合がある。さらには、培養容器自身を駆動させることにより接続された流路チューブにねじれてしまい、上記と同様に細胞損失等の危険性が生じる。
 そこで本実施例の装置は、上述したように培養容器ベース202に対し位相差顕微鏡700が動く方式としている。本方式によれば培養中は培養容器ベースを固定し取り扱うことができるため、観察のための培養容器ベースの回転等により生じる流路チューブのねじれを回避でき、流路損傷の危険性を回避可能である。
 図7Aに示すように、位相差顕微鏡700は培養容器ベース202に対し稼働するための駆動手段である稼働部702を有する。よって位相差顕微鏡700の自転方向に回転運動と、培養容器ベース202の設置面に対して水平方向に前後運動が可能である。尚、図7Bに示す、顕微鏡観察に関する別構成例については、後ほど実施例6にて説明する。
 続いて、図8、9、10により本実施例の装置を構成する流路、及び顕微鏡のレイアウト例を説明する。図8は自動培養装置のインキュベータ部のインキュベータ801の扉802を閉めた状態を示している。本例ではインキュベータ801の中央から外側へ開く2枚扉の例を示している。インキュベータ801には監視モニタ803を設置する。監視モニタ803はインキュベータ内の温度、電磁弁・チューブポンプ・顕微鏡等の稼働の正常/非正常を示す作動ステータスを表示する。インキュベータ801は内部を37℃に維持する。
 図2に示した流路回路が示す通り、全培養容器内へ気体を直接供給するため湿度制御は不要である。その結果、インキュベータ801内の各機器は高湿環境下に晒されないため、湿度による錆等の発生による故障リスクは低減する。さらに内部の空気循環に際しHEPA(High Efficiency Particulate Air Filter)フィルタの使用が可能となる。高湿ではないためHEPAフィルタに目詰まりが生じないためである。よって一般的なフィルタを使用する場合に比べより高度な清浄性を実現することができる。
 図1の気体供給部10に対応する気体供給部804は、ガスボンベとガスフローコントローラから成る。ガスボンベ内には本例では5%CO2を含む空気を充填する。培養に使用する培地、培養する細胞種に応じ充填する気体の種類は変更可能である。気体交換時は送気する気体流量をガスフローコントローラにより調整する。
 図8左側の(A)に示す通り、インキュベータ801は机805の上にあり、机の下には培地ボトルを例えば4℃にて保管する冷蔵庫806と、排液バッグ部7の排液バッグを保管する収容庫807を有する。尚、各種の排液バッグは配置ボトル部を構成する冷蔵庫806に設置してもよい。その場合、設置面積減少とコスト低減の利点を得る。
 インキュベータ801と冷蔵庫806及び収容庫807の間は流路チューブ808により連結されている。これはすなわち、37℃に維持するインキュベータ801と約4℃に維持する冷蔵庫806が空間的に近接しておらず、両者の間は一般に約25℃であるCPCの空調管理された空間を隔てている。この構成により、インキュベータ801と冷蔵庫806の間において高度な断熱材を不要とし、装置構成の単純化によるコスト低減と温度維持性能向上させることが可能となる。
 インキュベータ801の近傍には図1の制御部12が設置され、本装置を稼働させる。本実施例の自動培養装置を複数台、並列稼働させる場合は一台の制御装置で全自動培養装置を制御させることができる。またCPC外からの管理を可能とする管理モニタも必要に応じ設置する。
 インキュベータ801内に設置した、図示を省略したレールにより流路部2、培養容器ベース202等の装置内部の構成部品は、インキュベータ801内に設置したレールに接続された、同じく図示を省略した載置台に夫々載置されているため、扉802から一括して引き出すことが可能である。培養開始時などにユーザが流路を流路部等に接続、設置する際は、載置台を引き出した状態で設置することが可能となるため、流路設置時の煩雑さを軽減させ、ユーザによる人的ミスを抑制することが可能となる。この時インキュベータ801内から流路部2及び観察部8の顕微鏡700を完全に取り出さず一部のみとすることが望ましい。あるいは、顕微鏡700は装置内に固定してもよい。流路部及び顕微鏡は軽量ではないため、落下する事態により破損したり作業者が怪我をしたりすることを回避するためである。尚、インキュベータ801から取り外す部分は流路部2と培養容器ベース202とし顕微鏡は取り外さない方式でも良い。この場合、前述の方式に比べ引き出す構成数が減るため、引き出し作業がより容易となる。
 図9に本実施例の自動培養装置の流路部及び顕微鏡の配置構成の一例を示す。図9左側の(A)は、図2に示した流路回路の配置を立体的に示したものである。まず、顕微鏡700の周囲に、各培養容器201-1~201-10が配置されるよう、培養容器ベース202を配置する。3台のアクチュエータ901が培養容器ベース202を支え、培地交換時には作動により培養容器ベース202を傾ける。培養容器ベース202上には本例では10個の培養容器201を設置し、先に説明したように、それぞれ1個の培養容器201あたり、上層の供給用と排液用、下層の供給用と排出用の、合わせて4本ずつの流路チューブ302が取り付けられている。
 培養容器ベース202から図1の回転式弁機構3に対応する回転式弁機構903へ向かい流路チューブの束902が培養容器ベース202の外周側に配置されている。上述のように顕微鏡700の駆動を阻害しないためである。流路チューブの束902は、培養容器への各種溶液の供給を目的とした20本の流路チューブと、排出を目的とした20本の流路チューブが束状になっている。尚、実施例2で詳細を後述するが、培養容器ベース202から回転式弁機構903へ向かい流路チューブの束902を培養容器ベース202の内周側に配置することも可能である。この場合、各培養容器に対し内周側に無菌脱着部も配置する。
 回転式弁機構903は回転式弁機構台904の上に位置し、40本の流路チューブが回転式弁機構台904に設置されている。流路チューブの束902は回転式弁機構903にて並んでいる40本の流路チューブの中心近傍に位置する。束状の流路チューブをユーザが取り扱いやすくしつつ、各流路チューブの長さを均一化させるためである。加えて流路チューブの束902に対し培養容器ベース202上の10個の培養容器は対称となるよう配置する。これにより回転式弁機構903から最も遠い位置にある培養容器201と、最も近い位置にある培養容器の距離の差を最小限とすることが可能になる。複数の培養容器において製造後の細胞を均一とするためには各培養容器への流路チューブの長さを等しく揃えることが望ましい。具体的には、1本の流路チューブから10本へ分岐する多分岐部から各培養容器までの長さを均一とする。
 図2で説明した多分岐部222は回転式弁機構903と流路部2の間に設置する。前述した図2を用い説明すると、流路回路において上皮系細胞の細胞懸濁液が複数の流路(本例の場合10本の流路)に分岐する多分岐部222から各培養容器201までの10本の流路チューブを均一とする。また同様に、フィーダー細胞の細胞懸濁液が分岐する、図示を省略した多分岐部から各培養容器222までの10本の流路チューブを均一とする。
 均一となる各培養容器201への流路チューブの長さは、回転式弁機構903からの距離が各培養容器により異なるため、回転式弁機構903からの距離が最も遠い位置にある培養容器に長さを揃えることが望ましい。例えば、本実施例のように回転式弁機構903が装置の扉部側に配置されている場合、扉部側からみて装置の最も奥まった位置に配置された培養容器に接続された流路チューブに、他の培養容器と接続された流路チューブの長さを揃えることが望ましい。
 このように、複数の培養容器201において製造後の細胞を均一とするためには、各培養容器201への流路チューブの長さを揃えることが重要であるが、均一化に加えさらに製造後の再生組織を高品質化とするためには、各培養容器間で均一長とされた流路チューブが、最短となるように構成することが望ましい。
 ここで、本実施例のように所謂U字形状の培養容器ベース202を用いる場合に、各流路長を均一かつ最短とするための構成について説明する。
  本実施例では、図8右側の(B)の矢印で示すように、培養容器ベース202を、培養容器ベース202に設けられた切りかき側から、図8左側の(A)に示す扉802を介して装置の筐体内に挿入する。顕微鏡700を、培養容器ベース202が接触しないように空隙部分に導くためである。
 また回転式弁機構903は、図9左側の(A)に示す通り、培養容器ベース202よりも、扉部側かつ下方に設置する。扉部側に設置させる理由は、ユーザが回転式弁機構903への流路等の取り付けなどを行いやすくするためである。また、培養容器ベース202よりも下方に設置する理由は、培養容器ベース202を装置内に挿入する際に障害とならないようにするためである。
 以上詳述した構成によれば、回転式弁機構903から最も遠い距離に位置するのは、培養容器ベース202において培養容器201が配置され得ない切りかき部分である。言い換えれば、回転式弁機構3側から顕微鏡700側へ向かう方向の延長線上に培養容器201は配置されないことになる。
 つまり上記の構成により、回転式弁機構903から最も遠くなる位置には培養容器201は配置されない構成とすることができる。従って、流路の長さを均一化させる基準となる、回転式弁機構903から最も遠い位置に存在する培養容器201は、201-1、201-10といった、切りかき部分から最も近くに配置された培養容器となる。
 回転式弁機構903を、例えば、流路部側等の位置に配置してしまうと、回転式弁機構903から最も遠くなる位置、つまり回転式弁機構903側から顕微鏡側700へ向かう方向の延長線上には、切りかき部分は存在しないため、回転式弁機構903に対して顕微鏡700を介して対向する側に培養容器が配置される構成となってしまう。したがってこの培養容器が、流路の長さを均一化させる基準と成るため、本実施例の構成よりも、流路は長くなってしまう。
 従って、本実施例のように切りかき部分が回転式弁機構903から最も遠くなるように培養容器ベース202を配置させることで、他の配置関係に比べてより培養容器で製造した細胞を均一かつより高品質化させることが可能となる。
 図9左側の(A)に示した流路チューブの束902には、流路を束ねる手段として、図9右側の(B)に示すように、培養容器毎かつ用途毎に各流路チューブを並べる治具905を回転式弁機構903と培養容器ベース202との間に設置することで、培養容器ベース202の装置内着脱時の煩雑さを解消すると共に製造時に配線ミス有無の確認もより容易となる。
 培養容器201へ供給する20本の流路チューブは、細胞種毎に1本ずつから分岐している。すなわち上皮系細胞の細胞ボトル404から電磁弁402、チューブポンプ401を経た培養容器201の上層への各種溶液の供給を目的とした1本の流路チューブ403は、多分岐部222において10本に分かれる。フィーダー細胞の細胞ボトル405も同様である。本図には示していないが、冷蔵庫内にて4℃で保管されている培地ボトルからは培地が予熱ボトル406へ送液され、予熱後に各培養容器201へ送液される。
 2個の細胞ボトル404、405からはそれぞれ多分岐部222にて10本に分岐するが、多分岐部222から各培養容器201までの長さは前述の通り等しい。これにより細胞播種、培地交換時の送液条件が同一とすることが可能となる。各培養容器への流路長を均一とすると、1本から10本へ分岐する多分岐部から各培養容器への距離は培養容器毎に異なるため、多分岐部から各培養容器までの流路長のうち、差異となる長さ分の流路チューブは調整路として、装置内に設けられた調節路設置領域に設置させてもよい。
 図10は、本実施例の装置の流路に関連する部分のみの立体配置と、流路設置時の装置の状態を示した図である。多分岐部から各培養容器までの距離に応じ流路チューブが直線となるよう配置すると、流路チューブの長さと距離の差の分が流路チューブのたわみとして生じる。この部分をひとまとめにしたものが、図10左側の(A)に示す調整路1001となる。送液時に調整路1001にて位置エネルギーの影響を受けないようにするため、調整路1001は流路チューブが同一平面上となるように配置されている。これにより位置エネルギーの違いによる送液速度等への影響を抑制可能である。また調整路1001の位置は、多分岐部から各培養容器までの間に設置されていれば各培養容器までの距離を等しくする目的を達する。上述のように調整路1001を構成する各流路チューブは同一平面上に位置することが望ましいが、設置する平面は回転式弁機構903の設置された平面上が最も望ましい。回転式弁機構903はユーザが作業する培養容器ベース202の下方にあり、顕微鏡700の駆動範囲外でもあるため、細胞培養時に障害となりにくい位置であるためである。なお、この調整路1001が配置される領域を調整領域と呼ぶ場合がある。
 回転式弁機構903に設置する流路チューブは前述と同じく、透明かつ軽量な回転式弁機構用設置プレート1002上に設置する。回転式弁機構903は培養容器への各種溶液の供給及び排出を目的とした40本の流路チューブの開閉を制御するため、それらの流路チューブを整列させた状態とする。この構成によりユーザが流路チューブを接続する際の誤接続のリスクを抑制することができる。
 図9左側の(A)が示すように、回転式弁機構903は回転式弁機構台904の上に位置する。回転式弁機構用設置プレート1002を設置する際には図10右側の(B)が示すように回転式弁機構903を回転式弁機構台904に対し水平方向へ回転させる。別の実施例として垂直方向へ回転させることも可能であることは言うまでもないが、水平方向への回転であれば、回転式弁機構用設置プレート設置時に回転式弁機構が勢いよく閉じたような場合、作業者が傷害を負う危険性を抑制することが可能となる。
 図11は、本実施例の装置において、細胞播種直後と培地交換時の培養容器ベースの動きと、細胞観察時の顕微鏡の動きを示している。まず、図11の(A)~(D)が示すように培養容器ベース202は3台のアクチュエータ901により水平面に対する設置角度を変える。細胞播種時は培養容器ベース202の揺動により培養容器201内の細胞分布を一様化させることが可能となる。さらに培養容器201を傾けて送液を行うことにより、容器内の気泡の発生を抑制できるといった効果もある。また配置交換時は図11の(D)の断面図に示すように、培養容器201を排出口側に角度θで傾けることで培地の排出効率を向上させる。図11の(E)、(F)は細胞観察時の顕微鏡700の動きを矢印で模式的に示している。細胞観察時、顕微鏡は、培養容器ベース202上の各培養容器201に対し回転と前後に駆動する。
 図12に、本実施例の装置において、多分岐部から各培養容器までの流路長を等しくするための異なる装置構成例を示す。尚、上述のように流路長は上皮系細胞、フィーダー細胞を送液する多分岐部から各培養容器への流路長をできるだけ短くしつつ、各流路チューブが等しい長さになることが望ましい。図12の(A)~(D)において、装置の主要な構成要素である顕微鏡700、回転式弁機構902、流路部2、培養容器ベース202を示し、他は省略してある。
 図12の(A)のレイアウトは回転式弁機構902をインキュベータ部の床上に設置するため、流路設置時の煩雑さを回避可能となる。図12の(B)は回転式弁機構902を培養容器ベース202の側方に設置する。インキュベータの床上ではないため設置台を必要とするが、装置の横幅は図12の(A)の構成に比べ小さくなる利点を得られる。図12の(C)は、回転式弁機構902を顕微鏡700上に設置する。インキュベータの床上ではないので設置台がさらに必要となるが、装置の横幅は図12の(A)や(B)と比べ小さく、結果として設置面積も小さくなる。図12の(D)は回転式弁機構902を顕微鏡700の横に設置する。よって設置は容易であり、また細胞ボトルから各培養容器までのチューブ長がより短くなる利点を得られる。
 続いて、以上説明した本実施例の自動培養装置の制御機構の一例を説明する。
  まず、図13は前述した自動培養装置の機能構成を説明する機能ブロック図である。図1の制御部に対応する制御装置1301により制御される各構成要素が、インキュベータ部・冷蔵庫・収容庫1303の内部に配置され培養容器201に接続されている。尚、インキュベータ・冷蔵庫・収容庫1303中に配置されるものは自動培養装置内に設置された培養容器であることは言うまでもない。
 図13において制御装置1301にはインキュベータ・冷蔵庫・収容庫1303の温度を制御する温度調節部1304、温度センサ1305、先の気体供給部10に対応する培養容器内へ気体を供給する気体供給部1306、細胞ボトル・培地ボトル・予熱ボトル・排液バッグ1307、先の流路部2に対応する流路内の液体及び気体を自動で送液する流体移動制御部1308、先の顕微鏡700に対応する細胞観察用の顕微鏡1309が接続されている。
 先の制御部12と制御用端末12に対応する、制御装置1302と表示画面1310は、CPU(Central Processing Unit:中央処理部)から成る処理部、記憶部や、ディスプレイ装置、キーボードから成る入出力部等を備えた通常のコンピュータの処理部及び記憶部とディスプレイ装置の表示部にそれぞれ対応している。制御装置1302は記憶部で記憶された各種プログラムを、処理部としてのCPU上で動作させる。これにより温度調整部1304、気体供給部1305、流体移動制御機構部1308、顕微鏡1309、溶液保持部・排液バッグ1307によりインキュベータ1303中の培養環境を制御し、培養容器1301中での所定の培養工程の実施を可能とする。
 以上の構成を有する本実施例の自動培養装置を用い、細胞を培養する時の一連の培養手順を説明する。図14は自動培養装置の動作を説明するフローチャート図である。以下、図14を用いて、本実施例の自動培養装置の動作を説明する。尚、使用する培養容器の数を増やす場合は流路の分岐部において並列に培養容器を並べればよい。その培養手順は以下に示す操作を各培養容器に対し順次実施すればよい。
 <ステップS1:スタート>
  自動培養装置を起動させる。操作者が制御装置にある操作部のスタートスイッチを押すことにより起動する。制御部12のディスプレイの操作画面には自動培養装置の内部環境に関する値が表示されている。
 <ステップS2:スケジュール決定>
  培養する細胞の種類と量に合わせ、自動培養装置により実施する自動培養スケジュールを入力する。細胞播種、培地交換、顕微鏡観察、排液回収、検査用組織回収、移植用組織回収等の操作を行う日時、頻度、液量等の条件を制御部12に接続された制御用端末13などより入力する。
 <ステップS3:細胞播種>
  適切な電磁弁の開閉を行った後、チューブポンプを作動させ細胞ボトルより細胞懸濁液を吸引する。細胞懸濁液は、食道再生の例では口腔粘膜上皮細胞を培養するため、KCM培地(keratinocyte culture medium)に懸濁した口腔粘膜上皮細胞と、同じくKCM培地に懸濁した3T3-J2細胞またはNIH-3T3細胞等である。それぞれ異なる細胞ボトル内に入っている。
 細胞播種時は2個の細胞ボトルよりそれぞれの細胞懸濁液を培養容器201へ送液する。事前に送液対象となる培養容器及び流路に連結した電磁弁を開き送液可能な状態とする。一方、送液対象ではない培養容器及び流路に連結する電磁弁は閉じ送液不可能な状態にする。細胞播種は10個の培養容器の上層及び下層に対し順次実施する。
 先に説明したように、上皮系細胞は図2における実線で示した流路回路(1)を通過し10個の培養容器の上層へ順次播種する。フィーダー細胞は破線で示した流路回路(2)を通過し10個の培養容器の下層へ順次播種する。尚、送液直前に細胞懸濁液の吸引・吐出を行うことで細胞ボトル内の細胞分布を一様化させ、送液する細胞懸濁液の細胞濃度を一様化する。全てに対し播種終了後、培養容器を設置する培養容器ベース202下部のアクチュエータ901を作動させる。細胞播種時及び細胞培養時の培養容器は水平状態を保持しているが、細胞播種直後及び培地交換時は培養容器を傾ける。細胞播種時は連続的に揺動させ細胞分布を一様化する。その後培養容器を水平状態に戻し、その状態で培養を行う。
 <ステップS4:細胞の培養>
  培養容器201を水平に静置した状態で所定時間、培養する。例として口腔粘膜上皮細胞の場合、静置期間は播種後3日間程度とする。培養中はインキュベータにより内部を37℃に維持する。装置内の空気はファンにより常に攪拌し、温度分布が常に一様となるようにする。尚、本例では示していないが装置内にパーティクルカウンタや生菌数計測装置を取り付け、清浄度をモニタリングし、製造の安全性を増すことが可能である。
 また培養中及び細胞播種直後において、培養容器の内部へ所定成分の気体を送気する気体交換を行う。気体交換は培養期間中、1日に数回程度の頻度でも実施する。また口腔粘膜上皮細胞の培養の場合、培養容器内はCO2濃度5%を含む空気を供給する。その気体は気体供給部から供給し、各培養容器への送気前に加湿ボトル部11を通すことにより水分子を飽和させたものとする。これにより各培養容器内の培地から水分が蒸発し、結果として培地成分が変化することを回避する。さらに気体は各培養容器へチューブポンプを介さず、チューブポンプと並行な送気用回路より気体圧を利用し直接送気する。これにより送気速度はチューブポンプを介した場合よりも上げることが可能となり気体交換効率は向上する。またチューブポンプへの負荷はなくなる。培養容器へ送気後の不要な気体はフィルタを介し流路外へ排出する。また必要に応じフィルタを介し流路内の気圧を調整する。フィルタは、例えば0.22μm以上の粒子を通さない品質のものを使用する。
 さらに、本実施例の装置で使用する培養容器201は送液に使用する流路チューブと、送気に使用する流路チューブを区別していない。すなわち送液に使用する流路チューブにおいて送気機能を併用させている。この構成の場合、送液に使用する流路チューブと送気に使用する流路チューブを独立させる場合に比べ、培養容器に接続する流路チューブの本数は減る。結果として流路簡略化を実現できる。
 <ステップS5:顕微鏡による観察>
  自動培養装置内に設置した顕微鏡を用い細胞画像を取得する。自動培養装置内に設置した光源を適宜発光させ、顕微鏡により細胞に焦点を合わせ撮像する。必要に応じ培養表面に定点を任意に定め撮影する。取得した細胞画像はデータベースに保存し、装置外に設置した制御用端末上で閲覧する。顕微鏡観察により得た細胞の生育状態に関する情報から判断し、培地交換の頻度、時期の調整を行う。例えば細胞の接着が不十分な場合、S6の培地交換は実施せずS4の細胞の培養を継続する。
 自動細胞撮影時以外はユーザが適宜顕微鏡700を手作業で操作し細胞を観察及び撮影を行う。自動細胞撮影時と同じく撮影後の画像は保存が可能である。
 <ステップS6:培地交換>
  培地交換は培養期間中、数日に一度の頻度で実施する。最初に冷蔵庫内で4℃にて保管されている培地を予熱ボトルまで送液し予熱を行う。予熱ボトルの周囲に配置した受け部との接触による熱伝導と、インキュベータによる37℃の気相により加温する。例えば数時間~1日程度予熱を行うことで温度を36℃以上まで上昇させ、その培地を培地交換に用いる。
 続いて培養容器201から古い培地を排出する。アクチュエータにより培養容器を排出口側へ傾け、古い培地の全量が排出されるようにする。排出後、速やかに予熱した新しい培地を培養容器内へ供給する。これにより培養表面上の細胞の乾燥と温度低下を回避する。古い培地は最終的に排液バッグ部7へ排出する。培地成分分析に用いることを想定し、本実施例では培養容器の上層及び下層を分けた状態で回収する。
 尚、前述した細胞播種及び培地交換において、図2に示した流路回路において細胞懸濁液及び培地は一方向に流れる。つまり培養容器内にて培養に使用した古い培地と、培養に使用していない新しい培地が混じることはない。古い培地と新しい培地は、例えば細胞が消費するグルコースと産出する乳酸の量が異なるため、培地交換時に両者が混じると培養環境が変化することを意味する。逆に本実施例の装置構成により両者が混じらないようにすることで、細胞培養の再現性向上の効果を得ることが可能となる。また排出した古い培地に対し培地成分分析を行う場合、同じく新しい培地と古い培地が混じらないことにより培地成分分析の精度向上の効果が得られる。
 <ステップS7:検査用組織の回収>
  顕微鏡700によって観察した細胞の培養状況を考慮し、移植可否を判定する検査用として1個の培養容器を無菌的に装置から取り出す。尚、必要に応じ検査用に取り出す培養容器数は複数個であっても良い。取り出しに際しては各培養容器の近傍の流路チューブ内に設置された無菌脱着部を使用する。無菌脱着部は例として熱溶着可能な流路チューブであり、切断箇所を挟む2ヶ所を熱溶着後にその間を切断する。これにより取り外した培養容器内及び、取り外さなかった培養容器と流路内は、取り外し後も無菌性を維持可能となる。取り出した培養容器に対しその後、速やかに検査を実施し移植可否を判定する。
 <ステップS8:移植直前の培養及び培地交換>
  ステップS4及びS6と同じく、細胞の培養と培地交換を実施する。
 <ステップS9:移植用組織の回収>
  ステップS7による検査の結果により移植可能と判断された場合、制御部のディスプレイに培養が完了した旨を表示する。その後ステップS7と同じく組織を装置から無菌的に取り出し手術室まで運び、再生医療治療に使用する。
 以上詳述した実施例1の装置構成、培養工程により、培養容器から多分岐部あるいは細胞ボトル迄の流路の長さを極力短くし、各流路の長さを等しく揃える構成により、各培養容器内で培養される細胞の品質を均一化した再生組織による治療を実行可能となる。またユーザが取り扱いし易い構成により人的ミスを抑制し、結果として細胞の品質を高めることが可能となる。
 実施例1の自動培養装置では、治具を用いるなどして培養容器夫々に接続された流路チューブを束ねる構成を示したが、実施例2の自動培養装置では流路チューブを束ねず、夫々独立して対応する回転式弁機構の弁に設置させる実施例について説明する。
 図23に、本実施例の流路同士が交差やねじれを生じることを抑制することが可能な自動培養装置の構成例の斜視図を示す。図23では説明のため、培養容器ベース202の右側の流路のみ記載しているが、容器ベース202の左側も同様に流路を配置する。各培養容器201を、回転式弁機構903からの距離が最も遠い培養容器201-1から、回転式弁機構903の端側の弁から中心側の弁に順次接続させることが望ましい。つまり、扉部側から見て中心に近い場所に位置する培養容器201-5は、回転式弁機構903の中心に近い位置に設けられた弁2001のグリップへ、端側に配置される培養容器201-1は、端側に設けられた弁2002のグリップへ夫々接続させる。
 本実施例の上記の構成の場合、実施例1同様、多分岐部からの距離が最も長くなる流路に他の流路の長さを合わせることが望ましい。つまり、回転式弁機構903の最も端側の弁2002のグリップに配置された流路2301の長さを基準として流路長を均一化させる。
このとき、回転式弁機構903と同一平面に接続される調整路は、回転式弁機構の中央位置、つまりは回転式弁機構からの距離が近い位置に配置された培養容器ほど調整路は長くなるため、調整領域に配置される調整路の配置面積が大きく、端に向かうほど設置面積が小さくすることができる。これは、対応する回転式弁機構の弁のグリップから培養容器ベースまでの距離が遠いほど退避させる流路長が短いため調整路の設置面積が小さく、近いほど長く調整路の設置面積は大きくなるためである。回転式弁機構903の端側、つまり培養容器ベース202の端側の調整路の設置面積を小さくすることで、ユーザの手等が接触し易い培養容器ベース202の端付近において、調整路の流路チューブとユーザとが接触することによる品質低下及び流路破損危険性を低減可能となる。
 また、図15を用いて説明すると、流路同士の絡まり等のリスクを抑制するには、図15の(A)に示すように培養容器ベース202に流路を安定して配置させる切り込み1501を左右両方に設けてもよい。切り込み1501は、左右に一つずつであっても、各培養容器201に接続された流路ごとでもよい。
 あるいは、図15の(B)に示すように培養容器ベース202上に、各流路間を仕切るように仕切り1502を設け、各流路を配置する設置スペースを区切ってもよい。このように各流路に切りかき1501や仕切り1502を設けることにより、他の培養容器201に接続された流路チューブと絡まる等のリスク低減が可能となる。
 尚、実施例1のように流路を束状にする構成であっても、図15の(C)や(D)に示すように培養容器ベース202の外周側、あるいは内周(空隙)側に、切りかき1501を形成したり、仕切りを形成するなどの流路を保持する保持手段を設けてもよい。
 実施例3では、顕微鏡を培養容器ベースの外周側を駆動させて観察する実施例を説明する。実施例1にて説明した培養容器ベース202の内周側に流路チューブを配列した場合、外周側には顕微鏡駆動の障害となり得る流路チューブが存在しないため、顕微鏡を外周側に設けて駆動させることが可能となる。
 図16は、本実施例の構成として、培養容器ベース202の中心部へ向かい流路チューブが配置し、培養容器ベース202の外周側を顕微鏡700が移動し観察する例を示したものである。流路チューブの束は顕微鏡700より体積が小さいため、培養容器ベース202の有する内側の空隙は、実施例1に比べより小さくでき、装置全体の小型化が可能となる。
 実施例1、2、3では培養容器ベースの中央あるいは外周に配置させる構成を説明したが、培養容器ベースの形状及び顕微鏡の配置位置はこれに限定されるものではない。以下、実施例4として、以上の実施例とは異なる顕微鏡と培養容器ベースの配置の実施例を説明する。
 図17の(A)にその構成例を示す。レンズ及び照明を有したCCDカメラ式顕微鏡1701をインキュベータ上面1702に設置し、上側から各培養容器を観察する方式である。天井には顕微鏡1701が稼働するレールを有する。この構成により、培養容器ベース202の内周側に、流路チューブ配置の阻害要因となる顕微鏡等の内部構成部品が存在しなくなるため、流路チューブを培養容器ベース2102の内周側を通過するように配置することが可能となる。このように培養容器ベースの内周側、つまり複数の培養容器201によって形成される内周側に流路チューブを配置することにより、外周側へ流路チューブを配置させる必要がない分、流路長をより短くすることができる。さらに流路チューブは内周側へ収束する形で配置されるため、より各培養容器に近い部分で流路を束ねることができる。これにより培養容器ベースの外周側に配置された場合に比べ流路チューブの曲率などを均一化することができるため、流路チューブによるシアストレスを均一化することができ、各培養容器201内の細胞の品質を均一化が可能になる。
 さらに、内周側に設けられた空隙の中心で各培養容器と接続された流路チューブを束ねれば、各培養容器から束ねられた位置までの距離(円状の空隙の半径距離)が等しくなるため、調整路等を設ける必要なく、分岐部から各流路までの長さを容易に等しくすることが可能となる。
 また、外周に流路チューブを配置した場合は、扉部に近い側に各流路チューブが配置されているため、ユーザにとっては培養容器ベース202の取り扱いが煩雑になり、人的ミスを生じやすいという課題があったが、上記構成により、ユーザが流路チューブに触れてしまうリスクを軽減できるため、人的ミスを抑制することができる。
 図17の(B)は流路チューブ束1704を束ね、培養容器ベース202の扉部側の外周に設けた切りかき1705を通過させる例を示している。本構成例においても、観察部である顕微鏡1701は装置上方から吊るす方式であるため、培養容器ベース202に空隙等を設ける必要がなく、結果として培養容器ベースは小さくなり、装置の設置面積も小さくすることが可能となる。また本例の場合は培養容器ベースの形状や培養容器の配置位置が観察部の配置位置に依存されることがないため、培養容器201の配置は円周状以外であっても良い。
 例えば図17の(C)に示すように培養容器201を列状に配列し、複数列並行に設けるように配置してもよい。本例では片側に設置された流路チューブ束1703と同じ側に各培養容器201の無菌脱着部1706が配置されている。また培養容器ベースの周囲の流路チューブを束とはせず分散させて配置した場合、各培養容器の流路チューブへの距離をより短くする事が可能となるため、無菌脱着部1706は外周方向に向かって配置することが望ましい。
 実施例5として、図18を用い、顕微鏡をインキュベータの床上や側面に配置した場合の、培養容器ベース形状の別形状構成の実施例について説明する。尚、本実施例にて説明する培養容器ベース形状を実施例2にて説明したインキュベータ上面に顕微鏡をつり下げる構成に適用してもよいことは言うまでも無い。
 図18の(A)に培養容器ベースを屈折させ、L字のクランク形状とした場合を示す(以下「L字型」と称し説明する)。L字型培養容器ベース1801は図18の(A)に示すように、観察部配置領域1802、すなわち、顕微鏡の配置スペースを確保しつつ、顕微鏡の駆動範囲を狭くすることが可能となる。培養容器201はL字型の培養容器ベース1801に沿って配置されるため、顕微鏡の観察時の回転角度は90°となる。実施例1で示したU字型の配置では顕微鏡の回転角度がほぼ360°であったのに対し角度が小さくなる分、顕微鏡の回転機構を小さくすることができる。
 また図18の(B)に示すようにS字曲線の形状の培養容器ベース1803を用いれば、顕微鏡配置スペースである観察部配置領域1802を2か所確保することができる。この場合、同時に2つの顕微鏡を用いる事で顕微鏡観察の時間短縮が可能となる。さらに観察時の顕微鏡の回転角度は180°となり、U字型での360°弱比べ角度は約半分となり回転機構の小型化が可能となる。
 また、図18の(C)に示すように培養容器201を列上に配列し、この配列1804を短軸方向に並列して複数儲け、各配列の間を観察部が通過するようにしても良い。これにより観察部の前後の動きを短くして多数の培養容器201を観察することが可能となるため、培養容器を配置するスペースや、観察部が前後に駆動するために配置するレールのスペースを少なくすることが可能となる。
 実施例6では、図19に示すように、実施例1のようにU字型の培養容器ベースを用いた場合の別構成の実施例を説明する。図17の(A)に示すように、実施例1で示した培養容器ベース202において培養容器201を同一平面上に2重以上設置する場合である。これにより複数培養容器の集積化が可能となる。図17の(B)は、実施例1で示した培養容器ベース202を多段に設置する場合である。同じく集積化を実現する。
 また、実施例1等では、U字形状の培養容器ベースをスライドさせて顕微鏡を空隙に配置する例について説明したが、培養容器をベースに円状や馬蹄状の穴部を設けて、顕微鏡の上から穴部を介して培養容器ベースを配置させる形状としてもよい。
 実施例7では、実施例1の顕微鏡において顕微鏡周囲に別の撮影手段を設置する実施例について説明する。図7Bは顕微鏡705の前面に位相差顕微鏡を、背面に色温度計測によるpH評価装置を配置したものである。pH評価装置はウェブカメラ703と白色板704より成る。pHは培地の色温度により判定する。例として培地のpH指示薬にフェノールレッドを使用する場合、酸性では黄色に近くなり、アルカリ性では赤色に近くなる。白色板704を背景とすることで鮮明な画像をウェブカメラ703で撮影可能となる。撮影後の画像において、例えば定量化したRBG成分値によりpHを評価する。或いは吸光度計の搭載により評価を行う。
 このように顕微鏡705に別の撮影手段を設けることにより効率良く細胞を評価し、かつ、別の手段を用いるため評価精度を上げることが可能となる。特に顕微鏡705は、先の実施例の顕微鏡700と同様に回転機能としての駆動手段としての稼動部702を有しているため、別の個体の顕微鏡を使用することなしに実施でき設置スペースも小さくすることができる。
 実施例8では、図20に示すように、各培養容器と回転式弁機構とに接続される流路チューブの長さをより均一かつ短くする実施例について説明する。実施例1にて説明したように各流路チューブは回転式弁機構903側にて束ねられている。各培養容器201は培養容器ベース202上に円周状に配置されているため、束ねられる点(収束点と称する)2001から各培養容器201までの長さは異なっている。対して、図20から明らかなように、回転式弁機構903における各流路チューブを開閉する弁(クリップ)は培養容器ベース903に対向し横一列に並んでいるため、各弁2001、2002と収束点2003までの流路チューブの長さも異なる。
 そこで、収束点2003からの距離が近い培養容器201-5に接続される、破線で示す流路チューブは、収束点2003から遠い弁2002、すなわち、回転式弁機構903の端側に配置し、収束点からの距離が遠い培養容器201-1に接続される、点線で示す流路チューブは、収束点2003からの距離が近い弁2001、すなわち回転式弁機構903の中央側に配置するようにする。
 図20に示すように、本実施例においては、回転式弁機構903の一番中央に位置している弁2001に、回転式弁機構903からの距離が一番遠い位置に配置されている培養容器201-1からの流路チューブを接続し、回転式弁機構903の一番端に位置している弁2002に、回転式弁機構903からの距離が一番近い位置に配置されている培養容器201-5からの流路チューブを接続するので、流路チューブからの距離を等しく揃え、かつ流路チューブの長さを短くして設置することが可能となる。また、長さを等しくするための流路長の余剰分も少なくなるため調整路を設置する調整領域も最小限にとどめる事が可能となる。
 実施例9として、図21を用いて、各流路チューブを通過する際の細胞の流入条件を均一にする実施例について説明する。同図に示すように、本実施例の自動培養装置においては、細胞ボトルから各培養容器に溶液を分散させる多分岐部は、二分岐部を順々に介しながら2のべき乗に分岐し、最終的に10本の分岐した流路とする構成とする。
 図21左側の(A)に示す構成の場合、各分岐した流路ごとに中継した二分岐部2101の数が異なる。二分岐部2101と流路チューブとの接続箇所は流路径が異なるため段差が生じている。さらに二分岐部2101にて溶液にかかる摩擦と、流路チューブとの摩擦は異なる。すなわち二分岐部2101を介すたびに細胞へシアストレスが生じるため、分岐した各流路の中継する二分岐部数2101が、3、又は4のように、異なれば培養する細胞の条件も異なるため、培養後の細胞の品質が不均一となる可能性がある。
 そこで図21右側の(B)に示すように、各分岐した流路を中継する二分岐部2101は同一数の4となるよう接続し、培養容器201への溶液の流入条件を均一にすることで培養する細胞の品質を均一化することが可能となる。二分岐部2101の分岐のうち、流路チューブを接続しない分岐については熱溶着等により経路に閉鎖部2102を形成しておく。またこのように片側経路を閉鎖した二分岐部を用いず、二分岐部と同じ材料・流路径を用いた中継部材を用いてもよい。
 本実施例は、実施例1における装置への流路設置において、流路内に圧力センサを設けることにより、措置への流路設置正常性をより正確に判定可能とする構成の実施例である。
 具体的には、図22の流路回路において、回転式弁機構に設けられた電磁弁を順次開閉した状態で加圧及び減圧を行うことにより、電磁弁単位で流路の設置正常性と流路の破損有無を評価する。ガスボンベから圧力センサまでの最短ルートとなる流路において、そのルート内の電磁弁を開きガスボンベから気体を送気する。それにより圧力が上昇したか圧力センサ2201により評価する。なお、図22において、圧力センサ2201以外は、全て図2の構成と同じであるので、図2で説明した図番は図示を省略してある。
 圧力が上昇した場合、そのルート内において流路破損は無いと判定する。圧力が下降した場合、流路破損があるため新しいものへ交換する。続いて圧力が上昇している状態において、そのルート内の1個の電磁弁を開く。それにより圧力が下降した場合、その電磁弁は正常に稼働していると判定する。圧力が下降しなかった場合、電磁弁が故障しているか、流路チューブが何らかの原因により正常に設置していないため、該当の電磁弁の動作確認と流路チューブの設置状況を確認する。同様の作業を該当のルート内の電磁弁全てに対し実施する。
 最短ルート内の流路設置正常性と流路破損有無を確認後、最短ルートの外側にある電磁弁に対し同様の確認を実施する。すなわち最短ルートとその外側にある電磁弁までの流路を含めた2番目のルートに対し、ガスボンベから気体を送気し圧力が上昇するか確認する。続いてその電磁弁を開き圧力が下降するか確認する。以上の過程により、その電磁弁の動作確認、流路チューブ設置正常性、その電磁弁までの流路の破損有無を確認可能である。この作業を全電磁弁に対し制御部からの信号により順次実施する。
 上記構成により、流路設置ミスを回避することが可能となり、安全な自動培養を実現することが可能となる。
 本発明は、培養容器を用いて細胞又は組織を自動操作により培養する培養装置、特に再生医療に使用可能な再生組織を製造可能な自動培養装置として有用である。
 なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることが可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
 更に、上述した各構成、機能、処理部等は、それらの一部又は全部を実現するプログラムを作成する例を説明したが、それらの一部又は全部を例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現しても良いことは言うまでもない。
1 培養容器部
2、1203 流路部
3、213、903、1202 回転式弁機構
4 細胞ボトル部
5 培地ボトル部
6 予熱ボトル部
7 排液バッグ部
8 観察部
9 インキュベータ部
10、1306 気体供給部
11 加湿ボトル部
12 制御部
13 制御用端末
201 培養容器
202、1201、1204 培養容器ベース
203、504、901、1202 アクチュエータ
204、205、601 細胞ボトル
206 流路回路(1)
207 流路回路(2)
208 培地ボトル
209、608 予熱ボトル
210 分岐部
211、401 チューブポンプ
212、402 電磁弁
214、215 排液バッグ
216、804 ガスボンベ
217 気体フローメータ
218、614 加湿ボトル
219 送気用回路
220、303、1706 無菌脱着部
221、606、620 無菌接続部
222 多分岐部
301、701 観察孔
302、403、501、808、2201 流路チューブ
404、405、601 細胞ボトル
406 予熱ボトル
502 クリップ部
503 多連式カム部
505 バネ
506 クリップ接触部
602 細胞ボトル本体部
603 細胞ボトル蓋部
604、613 送液用流路チューブ
605 内圧調整用流路チューブ
607、619 フィルタ
609 受け部
610 予熱ボトル本体部
611 予熱ボトル蓋部
612 供給用流路チューブ
615 加湿ボトル本体部
616 加湿ボトル蓋部
617 送気用流路チューブ
618 気体供給用流路チューブ
621 接続部
700、705、1201、1309 顕微鏡
702 稼働部
703 ウェブカメラ
704 白色板
801 インキュベータ
802 扉
803 監視モニタ
805 机
806 冷蔵庫
807 収容庫
902 流路チューブ
904 回転式弁機構台
905 治具
1001 調整路
1002 回転式弁機構用設置プレート
1301 制御装置
1302 表示画面
1303 インキュベータ他
1304 温度調節部
1305 温度センサ
1306 気体供給部
1307 溶液保持部他
1308 流体移動制御機構部
1501 切り込み
1502 仕切り
1701、1705 切りかき
1702 敷居
1703、1704 流路チューブ束
1801 L字型培養容器ベース
1802 観察部配置領域
1803 S字型培養容器ベース
2001、2002 弁
2003 収束点
2101 二分岐部
2102 閉鎖部
2201 圧力センサ
2301 流路

Claims (15)

  1. 細胞を培養する細胞培養装置であって、
    培養に用いる溶液を保持する溶液保持部と、
    前記溶液保持部と複数の培養容器とを夫々接続させる複数の流路と、
    を備え、
    前記複数の流路は、前記溶液保持部から前記複数の培養容器夫々まで長さが等しい
    ことを特徴とする細胞培養装置。
  2. 前記複数の培養容器は、前記複数の流路の夫々が接続される多分岐部を介して前記溶液保持部に接続され、
    前記複数の流路は、前記多分岐部から前記複数の培養容器夫々までの長さが等しい
    ことを特徴とする請求項1記載の細胞培養装置。
  3. 筐体内に着脱可能な、前記複数の培養容器を保持する培養容器ベースと、
    前記複数の培養容器内を観察する観察部と、
    を有し、
    前記培養容器ベースには空隙が形成され、
    当該培養容器ベースを前記筐体内に設置した場合、前記空隙内に前記観察部が設置され、
    前記複数の流路は、前記培養容器ベースの外側に配置される
    ことを特徴とする請求項1または2記載の細胞培養装置。
  4. 前記培養容器ベースの外周の一部に、前記観察部を前記空隙側へ通過させるための切りかきを有する
    ことを特徴とする請求項3記載の細胞培養装置。
  5. 前記溶液保持部から前記複数の培養容器の夫々へ、前記複数の流路を介して前記溶液を供給させる供給機構を有する
    ことを特徴とする請求項3または4記載の細胞培養装置。
  6. 前記培養容器ベースを前記筐体内に挿入させる扉部をさらに有し、
    前記培養容器ベースは、前記切りかき側から、前記細胞培養容器内に挿入可能であり、
    前記供給機構は、前記培養容器ベースに対して、扉部側かつ下方に配置される
    ことを特徴とする請求項5記載の細胞培養装置。
  7. 前記供給機構は、前記複数の流路の夫々を設置させる弁機構を有し、
    前記弁機構によって、前記複数の培養容器夫々に供給される前記溶液を制御させ、
    前記弁機構から前記複数の培養容器の夫々との間に位置する流路の一部を調整路として設置させる調整領域を有する
    ことを特徴とする請求項5または6記載の細胞培養装置。
  8. 前記調整領域は、前記培養容器ベースの下方かつ前記供給機構の上方に形成される
    ことを特徴とする請求項7記載の細胞培養装置。
  9. 前記複数の流路を束状に収束させる収束手段を有する
    ことを特徴とする請求項3記載の細胞培養装置。
  10. 前記細胞培養装置内に着脱可能な、前記複数の培養容器を保持する培養容器ベースと、
    前記複数の培養容器内を観察する観察部と、
    を有し、
    前前記培養容器ベースには空隙が形成され、
    前記複数の流路は、前記空隙を介して配置される
    ことを特徴とする請求項1または2記載の細胞培養装置。
  11. 前記培養容器ベースに、前記複数の流路夫々を保持する保持手段が形成されている
    ことを特徴とする請求項3記載の細胞培養装置。
  12. 前記複数の培養容器は、前記空隙の周囲に円周上に配置され、
    前記観察部を自転方向と水平方向に駆動させる駆動手段を有する
    ことを特徴とする請求項3から9までの何れかに記載の細胞培養装置。
  13. 前記複数の培養容器ベースに接続され、前記培養容器ベースの設置角度を変更させるアクチュエータを有する
    ことを特徴とする請求項3から12までの何れかに記載の細胞培養装置。
  14. 前記扉部は、前記培養容器ベースより高い位置に形成される小扉を有する
    ことを特徴とする請求項6記載の細胞培養装置。
  15. 細胞を培養する細胞培養装置であって、
    培養に用いる溶液を保持する溶液保持部と、
    前記溶液保持部から供給された前記溶液を保持する複数の培養容器と、
    前記溶液保持部と接続され、前記溶液を通過させる多分岐部と、
    前記多分岐部と前記複数の培養容器とを夫々接続させ、前記多分岐部を通過した溶液を前記複数の培養容器夫々に供給させる複数の流路と、
    を備え、
    前記複数の流路は、前記多分岐部から前記複数の培養容器夫々までの長さが等しい
    ことを特徴とする細胞培養装置。
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