WO2012057363A1

WO2012057363A1 - 神経系細胞への遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルスビリオン

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Publication number: WO2012057363A1
Application number: PCT/JP2011/075240
Authority: WO
Inventors: 村松慎一
Original assignee: 学校法人自治医科大学
Priority date: 2010-10-27
Filing date: 2011-10-26
Publication date: 2012-05-03
Also published as: CN103189507A; CN107828820B; JP5907579B2; EP2634253A4; JP5704361B2; US20130224836A1; US10738326B2; US20200325493A1; JPWO2012057363A1; JP2015051009A; CN107828820A; US11674156B2; EP2634253B1; EP2634253A1

Abstract

本発明は、目的の治療用遺伝子を、高い効率でより平易な手段により神経系細胞に送達する手段を提供する。より詳細には、本発明は、アデノ随伴ウイルス（AAV）を用いる組換えベクター、それを作製する方法、それを用いる方法が提供される。より具体的には、血液脳関門を通過可能であり、神経系細胞に対して高い効率で目的の治療用遺伝子を導入するための組換えアデノ随伴ウイルスビリオン、それを含む医薬組成物、それを作製する方法、キットなどを提供する。

Description

神経系細胞への遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルスビリオン

　本発明は、遺伝子導入に用いられる組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに関する。より具体的には、本発明は、神経系細胞に対して高い効率で目的の遺伝子を導入するための、血液脳関門を通過可能である組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン、それを含む組成物などに関する。

　中枢神経障害は、大きな公衆衛生上の問題をもたらしている。神経細胞の変性脱落により認知機能障害をきたすＡｌｚｈｅｉｍｅｒ病だけでも、日本国内で６０万人以上の患者がいると推定される。現在、多くの中枢神経障害が治療薬の全身投与により治療される。しかし、全身投与の場合、薬物が血液脳関門を通過できないことが多く、しばしば非効率的であり、多くの潜在的に有用な治療用タンパク質等が全身投与され得ない。

　遺伝子治療用のウイルス由来のベクターとして、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を利用する方法が公知である（例えば、ＷＯ２００３／０１８８２１、ＷＯ２００３／０５３４７６、ＷＯ２００７／００１０１０など）。しかしながら、脳などの神経系細胞に遺伝子導入を図る場合、上記の血液脳関門などの防御機能、神経系細胞の導入効率、発現効率、より安全な投与手段などの問題を検討する必要がある。

　Ｎａｋａｉ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．（Ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ　ｓｅｒｏｔｙｐｅ　８　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５　Ｊａｎ；７９（１）：２１４−２４．）には、肝細胞への遺伝子導入を目的として、ＥＦ１αプロモーターによりＬａｃＺ遺伝子のマーカーを発現する８型ＡＡＶベクターＡＡＶ８−ＥＦ１α（−ｎｌｓｌａｃＺ）を用いた例が記載されている。

　Ｆｏｕｓｔ　ＫＤ，ｅｔ　ａｌ．（Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ　ＡＡＶ９　ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｔａｒｇｅｔｓ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ａｎｄ　ａｄｕｌｔ　ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９　Ｊａｎ；２７（１）：５９−６５．）には、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）の外被蛋白を有し、ｃｈｉｃｋｅｎ　β−ａｃｔｉｎ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＣＢ）により蛍光蛋白ＧＦＰを発現するｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ（ｓｃ）型ベクターについて記載されている。また、Ｄｕｑｕｅ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＡＡＶ９　Ｅｎａｂｌｅｓ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｔｏ　Ａｄｕｌｔ　Ｍｏｔｏｒ　Ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００９　Ｊｕｌ；１７（７）：１１８７−９６．）（結果の要約はＴａｂｌｅ　１を参照）によると、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）のカプシドタンパク質を有し、ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＣＭＶ）の制御下で蛍光蛋白ＧＦＰを発現するｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ型のベクター（ｓｃＡＡＶ９−ＧＦＰ）が開示されている。

　これら組換えＡＡＶ９ベクターの血管内投与によって脳（新生仔のニューロン、成体のアストロサイトなど）に遺伝子導入されているが、ウイルスゲノムがｓｃ型となるよう逆向き配列を含める必要性に起因して、このゲノム中に組込み可能な遺伝子は、非ｓｃ型の場合の半分の長さになる。具体的には、ｓｃ型ベクターに組込み可能な遺伝子は、プロモーターとｐｏｌｙ（Ａ）領域を含めて２ｋｂと短いものに制限される。この制限によって、組換えウイルスベクターの治療用途もまた制限されることになる。

　上記のように、従来までに種々の組換えアデノ随伴ウイルスベクターが作製されているが、平易な投与手段によって生体の血液脳関門を通過して特に脳の神経系細胞に効率よく遺伝子導入でき、より広範な治療用途が期待できる非ｓｃ型ＡＡＶゲノムを利用可能である組換えＡＡＶベクターは知られていない。

Ｎａｋａｉ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５　Ｊａｎ；７９（１）：２１４−２４．）Ｆｏｕｓｔ　ＫＤ，ｅｔ　ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９　Ｊａｎ；２７（１）：５９−６５．）Ｄｕｑｕｅ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００９　Ｊｕｌ；１７（７）：１１８７−９６．）

　上記のような状況において、生体の脳、脊髄などに存在する神経細胞、特に脳の神経細胞に対して目的の治療用遺伝子を高い効率でより平易な投与手段により送達可能であり、目的遺伝子の長さをより広く選択可能にするため非ｓｃ型ウイルスゲノムをパッケージング可能なウイルスベクター（ウイルスビリオン）の開発が望まれていた。

　本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、通常の一本鎖ＡＡＶに対して野生型カプシドタンパク質の改変を行い、さらに神経系細胞に特異的であるオリゴデンドロサイト特異的プロモーターまたはシナプシンＩプロモーターを含む組換えＡＡＶゲノム組み合わせることによって、被検体への末梢投与により非常に高い効率で神経系細胞に遺伝子導入可能な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンの作製に成功した。

　すなわち、本発明は、治療用遺伝子を生体の脳、脊髄などの神経系細胞に高い効率で遺伝子導入できる、血液脳関門を通過可能である組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン、それを含む医薬組成物などを提供する。
［１］　（ａ）配列番号：２、４若しくは６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、少なくとも１つの表面露出チロシン残基が他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含むタンパク質であって、ウイルスビリオンを形成可能であるタンパク質を含むキャプソメア、ならびに
　（ｂ）該キャプソメア内にパッケージングされるポリヌクレオチドであって、神経系細胞特異的プロモーター配列および該プロモーター配列と作動可能に連結されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
を含む、組換えアデノ随伴ウイルスビリオン。
［１ａ］　前記神経系細胞特異的プロモーター配列が、神経細胞、神経膠細胞または乏突起膠細胞に由来する、［１］に記載のウイルスビリオン。
［２］　前記タンパク質は少なくとも、配列番号：２において４４５位のチロシン残基、配列番号：４において４４４位のチロシン残基、又は配列番号：６において４４６位のチロシン残基が置換されているアミノ酸配列を含む、［１］に記載のウイルスビリオン。
［３］　前記チロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されている、請求項１又は２に記載のウイルスビリオン。
［４］　前記タンパク質が、配列番号：８、１０若しくは１２のアミノ酸配列、又は配列番号：８、１０若しくは１２のアミノ酸配列の４４４~４４６位以外の位置に１~数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／若しくは付加を含むアミノ酸配列を含み、ウイルスビリオンを形成可能である、［１］~［３］のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
［５］　前記ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端が、それぞれ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３またはＡＡＶ４に由来する５’末端および３’末端のインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲ）配列を含む、［１］~［４］のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
［６］　前記ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端が、それぞれ配列番号：１３および配列番号：１４のヌクレオチド配列を含む、［１］~［５］のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
［７］　前記ポリヌクレオチドが全長約２~６ｋｂの長さを有し、センス鎖またはアンチセンス鎖の一本鎖ＤＮＡである、［１］~［５］のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
［８］　前記プロモーター配列が、シナプシンＩプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム／カルモジュリン−依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チュブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター配列、Ｌ７プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、およびグルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）からなる群より選択される、［１］~［６］のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
［９］　前記プロモーター配列が配列番号：２３または配列番号：２４に記載のポリヌクレオチドを含む、［７］に記載のウイルスビリオン。
［１０］　前記プロモーター配列と作動可能に連結されるヌクレオチド配列が、抗体、神経栄養因子（ＮＧＦ）、成長因子（ＨＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、膠細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）、アミロイドβタンパク質分解酵素（Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ）からなる群より選択されるタンパク質をコードする、［７］に記載のウイルスビリオン。
［１０ａ］　前記プロモーター配列と作動可能に連結されるヌクレオチド配列が、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）又はα−シヌクレインに対するｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡを発現する、［７］に記載のウイルスビリオン。
［１１］　前記抗体が凝集性アミロイドβタンパク質に対する抗体である、［９］に記載のウイルスビリオン。
［１１ａ］　前記抗体が凝集性アミロイドβタンパク質に対する単鎖抗体である、［９］に記載のウイルスビリオン。
［１１ｂ］　前記ヌクレオチド配列が、アミロイドβタンパク質分解酵素（Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ）である、請求項１０に記載のウイルスビリオン。
［１２］　被検体の血液脳関門を通過可能である、［１］~［１１］のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
［１２ａ］　被検体への末梢投与によって神経細胞に遺伝子導入するための、［１］~［１２］のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
［１２ｂ］　被検体が母体中の胎児であり、母体への末梢投与によって胎児の神経細胞に遺伝子導入するための、［１］~［１２］のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
［１３］　前記ウイルスビリオンがアデノ随伴ウイルスベクターである、［１］~［１２］のいずれかに記載のウイルスビリオン。
［１４］　［１］~［１３］のいずれか１項に記載のウイルスビリオンを含む、医薬組成物。
［１５］　被検体の脳における凝集性アミロイドβタンパク質を低減させる、［１４］に記載の医薬組成物。
［１５ａ］　被検体の脳神経細胞内のα−シヌクレインの量を低減させる、［１３］に記載の医薬組成物。
［１６］　アルツハイマー病の治療薬である、［１４］または［１５］に記載の医薬組成物。
［１６ａ］　パーキンソン病の治療に有用である、［１４］または［１５ａ］に記載の医薬組成物。
［１７］　［１］~［１２］のいずれか１項に記載のウイルスビリオンを被検体に末梢投与する工程を含む、方法。
［１７ａ］　被検体が母体中の胎児であり、ウイルスビリオンが母体に末梢投与される、［１７］に記載の方法。
［１８］　被検体の脳における凝集性アミロイドβタンパク質を低減させる工程をさらに含む、［１７］に記載の方法。
［１８ａ］　被検体の脳神経細胞内のα−シヌクレインの量を低減させる工程をさらに含む、［１７ａ］に記載の方法。
［１９］　アルツハイマー病を治療するための、［１８］に記載の方法。
［１９ａ］　パーキンソン病の治療に有用である、［１８ａ］に記載の方法。

　本発明の組換えウイルスベクターは、血液脳関門を通過可能であるので、末梢投与によって脳の神経系細胞に遺伝子導入可能である。さらに、本発明のベクターは非ｓｃ型ゲノムを利用することによって、特に長さに関して目的の治療用遺伝子をより広く選択できる。したがって、例えば、抗体、神経栄養因子などの有用タンパク質（１種以上であってもよい）をコードする目的の遺伝子を含むウイルスゲノムをパッケージングした本発明のｒＡＡＶベクターを使用することにより、末梢投与などのより安全な投与方法によって、被験体の脳などの神経系細胞に遺伝子導入することが可能である。例えば、パーキンソン病の治療に有用なα−シヌクレインをコードする遺伝子、アルツハイマー病の原因となるアミロイドβタンパク質凝集体に対する抗体をコードする遺伝子などを本発明の組換ベクターに組込むことによって、各疾患のためのより安全な治療薬を提供できる。また、本発明のウイルスベクター調製方法、および／または本発明のキットを使用することによって、末梢投与により脳や中枢神経の神経系細胞に目的の遺伝子を高い効率で送達し導入するためのｒＡＡＶベクターを作製することができる。

本発明のｒＡＡＶビリオンを用いた、１頭あたりの大脳におけるＧＦＰ陽性細胞個数をグラフにより示す。ｙｆＡＡＶ９−ＣＡＧ−ＧＦＰを含むｒＡＡＶベクターを末梢投与した後の、マウス脳組織の冠状断写真、およびその部分拡大写真を示す。ＧＦＰ陽性細胞の多くはグリア細胞（矢頭）である（緑：ＧＦＰ，赤：ＮｅｕＮ）。ｙｆＡＡＶ９−ＳｙｎＩ−ＧＦＰを含むｒＡＡＶベクターを末梢投与した後の、マウス脳組織の冠状断写真、およびその部分拡大写真を示す。ｙｆＡＡＶ９−ＭＢＰ−ＧＦＰを含むｒＡＡＶベクターを末梢投与した後の、マウス脳組織の冠状断写真、およびその部分拡大写真を示す。本発明のｒＡＡＶビリオンを用いた、大脳皮質０．０４ｍｍ^３あたりのＧＦＰ陽性細胞個数を示す。本発明のｒＡＡＶビリオンを用いた、脊髄におけるＧＦＰおよびＣｈＡＴが陽性の神経細胞を示す写真、およびその部分拡大写真を示す。本発明のｒＡＡＶビリオンを用いた、母親マウスへの心腔内投与により胎仔脳の神経細胞に遺伝子導入した結果の画像写真（左図）、およびその部分拡大図（右図）を示す。実施例３に記載のｙｆＡＡＶ９−ＳｙｎＩ−ＧＦＰ−ｍｉＡＡＤＣを心腔内投与したマウスの脳神経細胞の黒質緻密部における、各種抗体免疫染色の結果の画像写真を示す。使用した１次抗体は、ａｎｔｉ−ＧＦＰ（左図）、ａｎｔｉ−ＡＡＤＣ（中央図）、ａｎｔｉ−ＴＨ（右図）である。

１．本発明の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン
　本発明は、１実施形態において、以下のｒＡＡＶビリオンを提供する：
　（ａ）配列番号：２、４若しくは６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、少なくとも１つの表面露出チロシン残基が他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含むタンパク質であって、ウイルスビリオンを形成可能であるタンパク質を含むキャプソメア、ならびに
　（ｂ）該キャプソメア内にパッケージングされるポリヌクレオチドであって、神経系細胞特異的プロモーター配列および該プロモーター配列と作動可能に連結されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
を含む、組換えアデノ随伴ウイルスビリオン。

１．１　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
　天然のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は非病原性ウイルスである。この特徴を利用して、種々の組換ウイルスベクターを作製して、遺伝子治療のために所望の遺伝子を送達することが行われている（例えば、ＷＯ２００３／０１８８２１、ＷＯ２００３／０５３４７６、ＷＯ２００７／００１０１０、薬学雑誌１２６（１１）１０２１−１０２８などを参照のこと）。野生型ＡＡＶゲノムは、全長が約５ｋｂのヌクレオチド長を有する一本鎖ＤＮＡ分子であり、センス鎖またはアンチセンス鎖である。ＡＡＶゲノムは、一般に、ゲノムの５’側および３’側の両末端に約１４５ヌクレオチド長のインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲ）配列を有する。このＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの複製起点としての機能及びこのゲノムのビリオン内へのパッケージングシグナルとしての機能等の多様な機能を有することが知られている（例えば、上記の文献である薬学雑誌１２６（１１）１０２１−１０２８などを参照のこと）。ＩＴＲに挟まれた野生型ＡＡＶゲノムの内部領域（以下、内部領域）は、ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）遺伝子及びカプシド（ｃａｐ）遺伝子を含む。これらｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子は、それぞれ、ウイルスの複製に関与するタンパク質Ｒｅｐ及び正２０面体構造の外殻であるキャプソメアを形成するカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の少なくとも１つ）をコードする。さらなる詳細については、例えば、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，１３，ｐｐ．３４５−３５４，２００２、Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　４５，ｐｐ．９２−１０３，２００１、実験医学２０，ｐｐ．１２９６−１３００，２００２、薬学雑誌１２６（１１）１０２１−１０２８、Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ，１６，５４１−５５０，２００５などを参照のこと。

　天然のアデノ随伴ウイルスは、種々の型が知られており、それぞれ感染する対象細胞に傾向が認められる（例えば、Ｇａｏ，Ｇ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．５：２８５−２９７，２００５、Ｘｉｎ，Ｋ−Ｑ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１１８９９−９１０，２００６、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｅｍ，Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．１６：５２１−３２，２００９などに記載される）。本発明のｒＡＡＶベクターは、好ましくは由来の天然のアデノ随伴ウイルス１型（ＡＡＶ１）、２型（ＡＡＶ２）、３型（ＡＡＶ３）、４型（ＡＡＶ４）、５型（ＡＡＶ５）、６型（ＡＡＶ６）、７型（ＡＡＶ７）、８型（ＡＡＶ８）、９型（ＡＡＶ９）などより作製できるが、これらに限定されない。これらのアデノ随伴ウイルスゲノムのヌクレオチド配列は公知であり、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ０６３４９７．１（ＡＡＶ１）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１７２９（ＡＡＶ３）、ＮＣ＿００１８２９．１（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２．１（ＡＡＶ５）、ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ＿００６２６０．１（ＡＡＶ７）、ＮＣ＿００６２６１．１（ＡＡＶ８）、ＡＹ５３０５７９（ＡＡＶ９）のヌクレオチド配列を参照できる。これらのうち、２型、３型、５型および９型がヒト由来である。本発明において、特にＡＡＶ１、ＡＡＶ２またはＡＡＶ９に由来するカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を利用することが好ましい。ＡＡＶ１とＡＡＶ９はヒト由来のＡＡＶのうちで神経細胞への感染効率が比較的高いことが報告されている（Ｔａｙｍａｎｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　１８：１９５−２０６，２００７など）。また、ＡＡＶ２は既にパーキンソン病に対する遺伝子治療などで臨床応用されている（Ｋａｐｌｉｔｔ，ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ　３６９：２０９７−２１０５，２００７、Ｍａｒｋｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ　Ｎｅｕｒｏｌ　７：４００−４０８，２００８、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ　ｅｔ．ａｌ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　７３：１６６２−１６６９，２００９、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，ｅｔ　ａｌ，Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　１８：１７３１−１７３５，２０１０など）。

１．２．本発明のｒＡＡＶビリオン中のカプシドタンパク質
　本発明のｒＡＡＶビリオンが含むカプシドタンパク質は、ＶＰ１アミノ酸配列（配列番号：２、４又は６）において、表面露出チロシン残基（例えば、ウイルスビリオン表面にアミノ酸側鎖が露出されているチロシン残基）の少なくとも１つが別のアミノ酸に置換される。このようなタンパク質としては、配列番号：２、４又は６のアミノ酸配列と約９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、表面露出されるチロシン残基の少なくとも１つが別のアミノ酸に置換されており、かつウイルスビリオンを形成できるタンパク質が挙げられる。上記数値は一般的に大きい程好ましい。本発明のｒＡＡＶビリオンに含まれるカプシドタンパク質は、単独で又は他のカプシドタンパク質メンバー（例えば、ＶＰ２および／またはＶＰ３など）と一緒になってキャプソメアを形成し、該キャプソメア内にＡＡＶゲノム（又はＡＡＶベクターゲノム）がパッケージングされている本発明のｒＡＡＶビリオンを形成できる。このような本発明のｒＡＡＶは、生体の血液脳関門（未完成な胎児及び新生児の血液脳関門、および確立した成体の血液脳関門を含む）を通過できる。さらに、本発明のｒＡＡＶビリオンは、末梢投与によって成体の脳、脊髄などに含まれる神経細胞を標的とすることができる。本明細書において末梢投与とは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、心腔内投与、筋肉内投与、臍帯血管内投与（例えば、胎児を対象とする場合）など、当業者に末梢投与として通常理解される投与経路をいう。相互に置換可能なアミノ酸残基としては、その残基が属する類似アミノ酸残基の群（後述）内に含まれる他の残基が挙げられる。相互に置換可能なアミノ酸残基によって改変されたカプシドタンパク質は、通常の遺伝子操作技術など、当業者に公知の方法に従って作製することができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ．２００１、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　１９８７−１９９７などを参照することができる。

　本発明のｒＡＡＶビリオン中に含まれるカプシドタンパク質は、好ましくは、配列番号：２において、表面露出される２５２位、２７３位、４４５位、７０１位、７０５位若しくは７３１位のチロシン残基のうち１つ以上が他のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニン残基に置換されている。好ましくは、配列番号：２のアミノ酸配列において、４４５位のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されている。本発明のｒＡＡＶビリオン中に含まれるカプシドタンパク質は、好ましくは、配列番号：４において表面露出される２５２位、２７２位、４４４位、５００位、７００位、７０４位若しくは７３０位のチロシン残基のうち１つ以上が他のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニン残基に置換されている。好ましくは、配列番号：４のアミノ酸配列において、４４４位のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されている。本発明のｒＡＡＶビリオンが含むカプシドタンパク質は、好ましくは、配列番号：８において表面露出される２５２位、２７４位、４４６位、７０１位、７０５位、７０６位若しくは７３１位のうちの少なくとも１つのチロシン残基のうち１つ以上が他のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニン残基に置換されている。好ましくは、配列番号：６のアミノ酸配列において、４４６位のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されている。本発明のｒＡＡＶビリオンのキャプソメアは、上記のタンパク質単独を含んでもよいし、または他のメンバー（ＶＰ２および／またはＶＰ３）を一緒に含んでもよい。本発明において、上記の置換されるアミノ酸残基の位置は、それぞれのウイルス型のＶＰ２およびＶＰ３において対応する位置のアミノ酸残基の置換、好ましくは対応するチロシン残基のフェニルアラニン残基への置換を含む。これらの改変されたカプシドタンパク質は、通常の遺伝子操作技術など、当業者に公知の方法に従って作製することができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）などを参照のこと。これらのカプシドタンパク質を含む本発明のウイルスビリオンは、上記のように、成体及び胎児の血液脳関門を通過できる。好ましくは、機能的に同等なカプシドタンパク質を含むウイルスビリオンは、末梢投与によって成体の脳、脊髄などに含まれる神経系細胞に感染できる。本発明において使用される神経系とは、神経組織により構成される器官系を指す。本発明において、遺伝子導入標的としての神経系細胞は、少なくとも脳、脊髄など中枢神経系に含まれる神経細胞を含み、さらに、神経膠細胞、小膠細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、脳室上衣細胞、脳血管内皮細胞などを含んでもよい。遺伝子導入される神経系細胞のうち神経細胞の割合は、好ましくは、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、または１００％である。

　本発明のｒＡＡＶビリオンはさらに、配列番号：８、１０または１２のアミノ酸配列、あるいは配列番号：８、１０または１２のアミノ酸配列において４４４~４４６位以外の位置に１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含み、依然としてウイルスビリオンを形成することが可能であるタンパク質を含む。より詳細には、本発明のｒＡＡＶビリオンに含まれるカプシドタンパク質は、単独で又は他のカプシドタンパク質メンバー（例えば、ＶＰ２および／またはＶＰ３など）と一緒に本発明のｒＡＡＶビリオンのキャプソメアに含まれ、該キャプソメア内にＡＡＶゲノム（又は組換えＡＡＶベクターゲノム）がパッケージングされている。上記のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このようなタンパク質としては、例えば、配列番号：８、１０又は１２のアミノ酸配列、あるいは配列番号：８、１０又は１２のアミノ酸配列において４４４~４４６位以外の位置に、例えば、１~５０個、１~４０個、１~３９個、１~３８個、１~３７個、１~３６個、１~３５個、１~３４個、１~３３個、１~３２個、１~３１個、１~３０個、１~２９個、１~２８個、１~２７個、１~２６個、１~２５個、１~２４個、１~２３個、１~２２個、１~２１個、１~２０個、１~１９個、１~１８個、１~１７個、１~１６個、１~１５個、１~１４個、１~１３個、１~１２個、１~１１個、１~１０個、１~９個（１~数個）、１~８個、１~７個、１~６個、１~５個、１~４個、１~３個、１~２個、または１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつウイルスビリオンを形成できるタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的に小さい程好ましい。形成される本発明のｒＡＡＶビリオンは、上記のとおり、成体及び胎児の血液脳関門を通過でき、好ましくは末梢投与によって脳、脊髄などの神経細胞に遺伝子導入できる。また本発明のｒＡＡＶビリオンは、母体への末梢投与によって、母体中の胎児の脳、脊髄などに含まれる神経系細胞に遺伝子導入できる。これらの改変されたカプシドタンパク質は、通常の遺伝子操作技術など、当業者に公知の方法に従って作製することができる。

　本発明のタンパク質（ポリペプチド）において相互に置換可能なアミノ酸残基の例を以下に示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；　Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；　Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；　Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；　Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；　Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；　Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。

　本発明のｒＡＡＶビリオンに含まれる上記のカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３は、１種類以上のポリヌクレオチドによってコードされ得る。好ましくは、本発明におけるカプシドタンパク質は全て、１種類のポリヌクレオチドによってコードされる。より好ましくは、カプシドタンパク質は、配列番号：７、９または１１のポリヌクレオチドによってコードされる。

　本発明のｒＡＡＶビリオンに含まれる上記のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明の組換えウイルスビリオンを形成可能であるカプシドタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする。このようなポリヌクレオチドは、例えば、配列番号：７、９または１１のポリヌクレオチド配列、あるいは配列番号：７、９または１１のポリヌクレオチド配列において１個以上（例えば、１~５０個、１~４０個、１~３０個、１~２５個、１~２０個、１~１５個、１~１０個、１~９個（１~数個）、１~８個、１~７個、１~６個、１~５個、１~４個、１~３個、１~２個、１個など）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を有するポリヌクレオチドであって、配列番号：８、１０または１２のアミノ酸配列、あるいは配列番号：８、１０または１２のアミノ酸配列において４４４~４４６位以外の位置に１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含みウイルスビリオンを形成することが可能であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。これら欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。そのようなポリヌクレオチドによってコードされるカプシドタンパク質を含む本発明のｒＡＡＶビリオンは、上記のとおり、成体及び胎児の血液脳関門を通過できる。本発明のｒＡＡＶビリオンは、好ましくは、末梢投与によって成体の脳、脊髄などに含まれる神経系細胞に遺伝子導入できる。また本発明のｒＡＡＶビリオンは、母体への末梢投与によって、母体中の胎児の脳、脊髄などに含まれる神経系細胞に遺伝子導入できる。上記ヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的に小さい程好ましい。このようなポリヌクレオチドは、例えば、配列番号：７、９もしくは１１またはその相補配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであって、本発明の組換えウイルスビリオンを形成可能であるタンパク質（例えば、配列番号：８、１０又は１２のアミノ酸配列、あるいは配列番号：８、１０または１２のアミノ酸配列において４４４~４４６位以外の位置に１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を含むタンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含み得る。

　ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ、２００１）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、製造業者により提供される使用説明書などに記載の方法に従って行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

　ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号：７、９又は１１のヌクレオチド配列と、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。

　なお、アミノ酸配列やポリヌクレオチド配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ，ｅｔ　ａｌ：Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。

　本発明において用いられるＲｅｐタンパク質は、ＩＴＲ配列を認識してその配列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスビリオン内へと野生型ＡＡＶゲノム（又はｒＡＡＶゲノム）をリクルートしてパッケージングする機能、本発明のｒＡＡＶビリオンを形成する機能など公知の機能を同程度に有する限り、上記と同様の数のアミノ酸配列同一性を有してもよいし、上記と同様の数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加を含み得る。機能的に同程度の範囲については、上記の比活性に関する説明において記載される範囲が挙げられる。本発明において、好ましくは、公知のＡＡＶ３由来のＲｅｐタンパク質が使用される。さらに好ましくは、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が使用される。

　本発明において用いられるＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＩＴＲ配列を認識してその配列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスビリオン内へと野生型ＡＡＶゲノム（又はｒＡＡＶゲノム）をリクルートしてパッケージングする機能、本発明のｒＡＡＶビリオンを形成する機能などの公知の機能を同程度に有するＲｅｐタンパク質をコードする限り、上記と同様の数の同一性を有してもよいし、上記と同様の数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含んでもよい。機能的に同程度の範囲については、上記の比活性に関する説明において記載される範囲が挙げられる。本発明において、好ましくは、ＡＡＶ３由来のｒｅｐ遺伝子が使用される。さらに好ましくは、配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが使用される。

　本発明の１実施形態において、上記の野生型ＡＡＶゲノムの内部領域にコードされるカプシドタンパク質ＶＰ１など（ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３）、およびＲｅｐタンパク質は、これをコードするポリヌクレオチドが本発明のＡＡＶヘルパープラスミドに組込まれて提供される。本発明において用いられるカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３）、ならびにＲｅｐタンパク質は、必要に応じて１種、２種、３種またはそれ以上のプラスミドに組込まれていてもよい。場合によって、これらのカプシドタンパク質およびＲｅｐタンパク質のうちの１種以上がＡＡＶゲノムに含まれてもよい。本発明において、好ましくは、カプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３）およびＲｅｐタンパク質は全て、１種のポリヌクレオチドにコードされ、ＡＡＶヘルパープラスミドとして提供される。例えば、本明細書中の実施例を参照のこと。

１．３．本発明のｒＡＡＶゲノム
　本発明のｒＡＡＶビリオン中にパッケージングされる組換えアデノ随伴ウイルスゲノム（以下、本発明のｒＡＡＶゲノム）は、野生型ゲノムの５’側および３’側に位置するＩＴＲの間に位置する内部領域（すなわち、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の一方または両方）のポリヌクレオチドを、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（治療用遺伝子）およびこのポリヌクレオチドを転写するためのプロモーター配列などを含む遺伝子カセットによって置換することにより作製できる。好ましくは、５’側および３’側に位置するＩＴＲは、それぞれＡＡＶゲノムの５’末端および３’末端に位置する。好ましくは、本発明のｒＡＡＶゲノムは、５’末端および３’末端に位置するＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３またはＡＡＶ９のゲノムに含まれる５’側ＩＴＲおよび３’側ＩＴＲを含む。特に好ましくは、本発明のｒＡＡＶビリオンにパッケージングされるウイルスゲノムは、５’側のＩＴＲは配列番号：１３のポリヌクレオチドであり、３’側ＩＴＲは配列番号：１４のポリヌクレオチドである。一般的に、ＩＴＲ部分は容易に相補配列が入れ替わった配列（ｆｌｉｐ　ａｎｄ　ｆｌｏｐ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）をとるため、本発明のｒＡＡＶゲノムに含まれるＩＴＲは、５’と３’の方向が逆転していてもよい。本発明のｒＡＡＶゲノムにおいて、内部領域と置き換えられるポリヌクレオチド（すなわち、治療用遺伝子）の長さは、元のポリヌクレオチドの長さと同程度が実用上好ましい。すなわち、本発明のｒＡＡＶゲノムは、全長が野生型の全長である５ｋｂと同程度、例えば約２~６ｋｂ、好ましくは約４~６ｋｂであることが好ましい。本発明のｒＡＡＶゲノムに組込まれる治療用遺伝子の長さは、プロモーター、ポリアデニレーションなどを含めた転写調節領域の長さ（例えば、約１~１．５ｋｂと仮定する場合）を差し引くと、好ましくは長さが約０．０１~３．７ｋｂ、より好ましくは長さが約０．０１~２．５ｋｂ、さらに好ましく約０．０１~２ｋｂであるが、これに限定されない。さらに、公知のｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）配列を介在させるなどの公知の手法を用いて、ｒＡＡＶゲノムの全長が上記の範囲内である限り、約０．０１~１．５ｋｂの二種類以上の複数の治療用遺伝子を同時に組み込むことが可能である。

　一般的に、組換えアデノ随伴ウイルスビリオン内にパッケージングされるウイルスゲノムは、このゲノムが一本鎖であることに起因して、ゲノムに含まれる目的の遺伝子を発現するまで時間（数日）を要するという問題がある。この問題を解決するため、導入される治療用遺伝子を自己相補性に設計し（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ（ｓｃ）型ベクターと称される）、ウイルスベクター感染後の発現を促進することが図られている。この場合、二本鎖形成のため逆向きの配列も含める必要性に起因して、上記の治療用遺伝子の長さは、非ｓｃ型ゲノムベクターと比較しておよそ半分の長さになるよう設計されるべきである。より具体的には、組換えウイルスゲノムをｓｃ型とする場合、組込み可能な目的の遺伝子の長さは、プロモーター、ポリアデニレーション等に要する領域を含めて約２ｋｂに設計される。具体的な実施の詳細については、例えば、前述のＦｏｕｓｔ　ＫＤ，ｅｔ　ａｌ．（Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９　Ｊａｎ；２７（１）：５９−６５、非特許文献３）などに記載されている。本発明において、目的遺伝子の長さが短い場合にはｓｃ型ゲノムベクターも利用可能である。すなわち、本発明において用いられるｒＡＡＶゲノムは、非ｓｃ型であってもよいし、ｓｃ型であってもよい。ｓｃ型の場合、目的の遺伝子を含む発現カセット全体、またはその一部が二本鎖ＤＮＡを形成できる。

　本発明のｒＡＡＶゲノムは、目的のポリペプチドを発現させるため、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が種々の公知のプロモーター配列と作動可能に組み合わされる。しかしながら、例えば通常使用される強力なプロモーターであるＣＭＶ　ｐｒｏｍｏｔｅｒを用いたｒＡＡＶベクターを用いた場合、成体では神経細胞ではなくグリア様細胞に大部分の目的遺伝子が導入された（例えば、本明細書中の実施例１を参照のこと）。したがって、本発明のｒＡＡＶビリオンにおいて使用されるプロモーター配列は神経系細胞に特異的なものである。本発明において使用される神経系とは、前述のとおり神経組織により構成される器官系を指す。本発明において使用される神経系細胞特異的プロモーター配列は、例えば、神経細胞、神経膠細胞、乏突起膠細胞、脳血管内皮細胞、小膠細胞、脳室上皮細胞などに由来するが、これらに限定されない。このようなプロモーター配列としては、具体的には、シナプシンＩプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、グリア線維性酸性タンパク質プロモーター配列、Ｌ７プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、グルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明のｒＡＡＶビリオンにおいて、カルシウム／カルモジュリン−依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チュブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーターなどのプロモーター配列も使用され得る。上記のこれらプロモーター配列は、単独であっても任意の複数の組み合わせであってもよい。特に好ましくは、シナプシンＩプロモーター配列およびミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列である。本発明のｒＡＡＶゲノムは、さらに、ｍＲＮＡの転写、タンパク質への翻訳などを補助するエンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、適切なポリアデニル化シグナル配列などの公知の配列を含んでもよい。

　本発明のｒＡＡＶゲノムには、目的の治療用遺伝子が組込まれる。この治療用遺伝子は、種々の疾患を治療するために用いられるタンパク質をコードしてもよい。コードするタンパク質は、１種類であってもそれ以上であってもよいが、目的の遺伝子を含めてパッケージングされるｒＡＡＶゲノムの長さは約５ｋｂ以下（ＩＴＲ領域を除いて約４．７ｋｂ以下）であるべきである。例えば、パッケージングされるｒＡＡＶゲノムが非ｓｃ型である場合、ｒＡＡＶゲノム中に組み込まれる目的の遺伝子の長さは実質的に約３．５ｋｂ以下に制限される。ｓｃ型ゲノムであればさらにその半分の長さに制限される。したがって、一実施形態において、目的の治療用遺伝子は、短いポリペプチドからなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用することが好ましい。そのようなタンパク質としては、例えば、抗体（抗原結合部位、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などを含む）、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長因子（ＨＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３及びＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューツリン、アグリンのヘレグルイン（ｈｅｒｅｇｌｕｉｎ）／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１つ、セマフォリン／コラプシン、ネツリン−１およびネツリン−２、塩基性維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、膠細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）、アミロイドβタンパク質分解酵素（Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ）などが挙げられるが、これらに限定されない。また、神経障害を呈する代謝酵素病（例えば、ゴーシェ病を含むムコ多糖体症、ホモシスチン尿症を含むアミノ酸代謝異常症、異染性白質ジストロフィーを含む脂質代謝異常症など）と関連する遺伝子、例えばグルコセレブロシダーゼ、シスタチオニンβ−シンターゼ、アリスサルファターゼＡなどをコードする遺伝子を組込むことも可能である。

　本発明の１実施形態において、本発明のｒＡＡＶゲノムにコードされる抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体を含む。但し、抗体をコードするポリヌクレオチドの長さについては実用上制限があることを注意すべきである。本明細書において、用語「抗体」はまた、任意の抗体断片または誘導体を含むことを意味し、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ、ヒト化抗体、キメラ抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）などを含む。本発明において、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）をコードするポリヌクレオチドを目的の治療用遺伝子として利用することが好ましい。

　本発明のｒＡＡＶゲノムにコードされるタンパク質は、目的の機能を有する限り、遺伝子操作によってアミノ酸残基の挿入、欠失、置換および／または付加を含むタンパク質変異体を含んでもよい。このタンパク質変異体において、これら欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。好ましくは、これらタンパク質変異体は、元のタンパク質と同等の機能（例えば、抗原結合能）を有する。好ましくは、このようなタンパク質変異体としては、例えば、抗アミロイドβタンパク質（Ａβ）の単鎖抗体（ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列において、例えば、１~５０個、１~４０個、１~３９個、１~３８個、１~３７個、１~３６個、１~３５個、１~３４個、１~３３個、１~３２個、１~３１個、１~３０個、１~２９個、１~２８個、１~２７個、１~２６個、１~２５個、１~２４個、１~２３個、１~２２個、１~２１個、１~２０個、１~１９個、１~１８個、１~１７個、１~１６個、１~１５個、１~１４個、１~１３個、１~１２個、１~１１個、１~１０個、１~９個（１~数個）、１~８個、１~７個、１~６個、１~５個、１~４個、１~３個、１~２個、または１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ元のタンパク質と同等の抗原結合能を有するタンパク質が挙げられる。本発明において、同等の機能を有することは、例えば、比活性が約０．０１~１００倍、好ましくは約０．５~２０倍、より好ましくは約０．５~２倍である範囲に含まれる抗原結合能を有することを意味するが、これらに限定されない。

　本発明のｒＡＡＶゲノムに組込まれる目的の治療用遺伝子は、アンチセンス分子、リボザイム、干渉性ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のような、標的とする内在性遺伝子の機能を変化（例えば、破壊、低下）させるためのポリヌクレオチド、または内在性タンパク質の発現レベルを変化（例えば、低下）させるためのポリヌクレオチドであってもよい。標的とされる遺伝子としては種々の疾患の原因遺伝子が挙げられ、例えば、パーキンソン病に関するα−シヌクレインをコードする遺伝子、癌の原因となる公知の種々のオンコジーンが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、好ましくは、アンチセンス核酸の長さは、１０塩基以上、、１５塩基以上、２０塩基以上であり、１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常、用いられるアンチセンス核酸の長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。

　リボザイムを用いることによって、目的のタンパク質のｍＲＮＡを特異的に切断してそのタンパク質の発現を抑制できる。このようなリボザイムの設計については、種々の公知文献を参照することができる（例えば、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２２８：２２８，１９８８；ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２３９：２８５，１９８８；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７０５９，１９８９；Ｎａｔｕｒｅ　３２３：３４９，１９８６；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：６７５１，１９９１；Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ　３：７３３，１９９０；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９：３８７５，１９９１；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９：５１２５，１９９１；Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　１８６：１２７１，１９９２など参照）。

　また、「ＲＮＡｉ」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、２１~２５塩基長のＲＮＡ干渉を生ずる二重鎖ＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ　ｓｔｒａｎｄ　ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）、又はｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖ＲＮＡが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表２００２−５１６０６２号公報；米国公開許第２００２／０８６３５６Ａ号；Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４（２），１８０−１８３，２０００　Ｆｅｂ．；Ｇｅｎｅｓｉｓ，２６（４），２４０−２４４，２０００　Ａｐｒｉｌ；Ｎａｔｕｒｅ，４０７：６８０２，３１９−２０，２００２　Ｓｅｐ．２１；Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１６，（８），９４８−９５８，２００２　Ａｐｒ．１５；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９（８），５５１５−５５２０，２００２　Ａｐｒ．１６；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６（５５６７），５５０−５５３，２００２　Ａｐｒ．１９；Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：９，６０４７−６０５２，２００２　Ａｐｒ．３０；Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），４９７−５００，２００２　Ｍａｙ；Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），５００−５０５，２００２　Ｍａｙ；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，３０：１０，ｅ４６，２００２　Ｍａｙ　１５等参照）。

　本明細書中で使用される場合、特に述べられない限り、「ウイルスビリオン」、「ウイルスベクター」、「ウイルス粒子」の各用語は、相互に交換可能に用いられる。

　本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」、「遺伝子」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。例えば、「配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。

　本発明に係る「ウイルスゲノム」および「ポリヌクレオチド」は各々、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得るが、場合によってはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態であってもよい。本明細書において使用されるウイルスゲノムおよびポリヌクレオチドは各々、二本鎖または一本鎖のＤＮＡであり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの場合、コード鎖（センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。特に述べられない限り、本明細書中、ｒＡＡＶゲノムがコードするプロモーター、目的遺伝子、ポリアデニレーションシグナルなどの遺伝子上の配置について説明される場合、ｒＡＡＶゲノムがセンス鎖である場合についてはその鎖自体について、アンチセンス鎖である場合はその相補鎖について記載される。

　本明細書において、「タンパク質」と「ポリペプチド」とは相互に交換可能に用いられ、アミノ酸の重合体が意図される。本明細書において使用されるポリペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のポリペプチドの部分ペプチド（本明細書中、本発明の部分ペプチドと略記する場合がある）としては、前記した本発明のポリペプチドの部分ペプチドで、好ましくは、前記した本発明のポリペプチドと同様の性質を有するものである。

　本明細書において、用語「プラスミド」は、種々の公知の遺伝子要素、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体等を意味する。プラスミドは特定の宿主において複製することができ、そして細胞間で遺伝子配列を輸送できる。本明細書において、プラスミドは、種々の公知のヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびその混合物）を含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖である。例えば、本明細書において、用語「ｒＡＡＶベクタープラスミド」は、特に明記しない限り、ｒＡＡＶベクターゲノムおよびその相補鎖により形成される二本鎖を含むことが意図される。本発明において使用されるプラスミドは、直鎖状であっても環状であってもよい。

　本発明のｒＡＡＶゲノムに組込まれる目的の治療用遺伝子は、従来よりも高い効率で神経系細胞に送達され、その細胞のゲノム中に組込まれる。本発明のｒＡＡＶベクターを使用する場合、従来のｒＡＡＶベクターを用いる場合と比較して、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上または約５０倍以上の数の神経細胞に遺伝子導入可能である。遺伝子導入された神経細胞の数は、例えば、任意のマーカー遺伝子を組込んだｒＡＡＶベクターゲノムをパッケージングするｒＡＡＶビリオンを作製し、次いでこのｒＡＡＶビリオンを被検動物に投与して、ｒＡＡＶベクターゲノムに組込まれたマーカー遺伝子（またはマーカータンパク質）を発現する神経系細胞の数を計測することによって測定可能である。使用されるマーカー遺伝子としては公知のものを選択できる。このようなマーカー遺伝子としては、例えば、ＬａｃＺ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、発光タンパク質遺伝子（ホタルルシフェラーゼなど）などが挙げられる。

　本発明において、ｒＡＡＶベクターゲノムをパッケージングしたｒＡＡＶビリオンは、生体の血液脳関門を通過可能であり、したがって被検体への末梢投与によって、被検体の脳、脊髄などの神経系細胞に目的の治療用遺伝子を導入可能である。本発明のｒＡＡＶゲノムが非ｓｃ型である場合、より広範な長さのプロモーターと目的遺伝子とを選択でき、複数の目的遺伝子を利用することも可能である。

　本明細書中において使用される場合、用語「パッケージング」とは、１本鎖ウイルスゲノムの調製、外被タンパク質（キャプシド）の組み立て、およびウイルスゲノムをキャプシドで包むこと（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）などを含む事象をいう。適切なプラスミドベクター（通常、複数のプラスミド）が適切な条件下でパッケージング可能な細胞株に導入される場合、組換えウイルス粒子（すなわち、ウイルスビリオン、ウイルスベクター）が組み立てられ、培養物中に分泌される。

２．本発明のｒＡＡＶビリオンの調製
　本発明の別の実施形態において、本発明のｒＡＡＶビリオンを調製する方法が提供される。この方法は、（ａ）本発明のカプシドタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド（一般に、ＡＡＶヘルパープラスミドと称される）、および（ｂ）本発明のｒＡＡＶビリオン内にパッケージングされる第２のポリヌクレオチド（目的の治療用遺伝子を含む）を、培養細胞にトランスフェクトする工程を含むことができる。本発明における調製方法はさらに、（ｃ）アデノウイルス（ＡｄＶ）ヘルパープラスミドと称されるアデノウイルス由来因子をコードするプラスミドを培養細胞にトランフェクトする工程、またはアデノウイルスを培養細胞に感染させる工程も含むことができる。さらに、上記のトランスフェクトされた培養細胞を培養する工程、および培養上清より組換えアデノ随伴ウイルスベクターを収集する工程を含むこともできる。このような方法は既に公知であり、本明細書の実施例においても利用される。

　好ましくは、本発明のｒＡＡＶビリオンを調製する方法は、（ａ）配列番号：８、１０および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）神経系細胞特異的プロモーター配列を含むポリヌクレオチドおよび該プロモーター配列と作動可能に連結されるポリヌクレオチドを、配列番号：１３のヌクレオチド配列と配列番号：１４のヌクレオチド配列との間に含む第２のポリヌクレオチドを、培養細胞にトランスフェクトすることを含む。このような第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、例えば、実施例の表１に記載のポリヌクレオチドの組合せを含む。

　第１のポリヌクレオチドにおいて本発明のカプシドタンパク質をコードするヌクレオチドは、好ましくは、培養細胞において作動可能である公知のプロモーター配列に作動可能に結合される。このようなプロモーター配列としては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどを適宜使用することができる。さらに、公知のエンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ付加シグナル配列などを適宜含み得る。

　第２のポリヌクレオチドは、神経系細胞特異的プロモーターと作動可能である位置に治療用遺伝子を含む。さらに、公知のエンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ付加シグナル配列などを適宜含み得る。この第１のポリヌクレオチドはさらに、神経系細胞特異的プロモーター配列の下流に、種々の公知の制限酵素のよって切断可能なクローニングサイトを含み得る。複数の制限酵素認識部位を含むマルチクローニングサイトがより好ましい。当業者は、公知の遺伝子操作手順に従って、目的の治療用遺伝子を神経系細胞特異的プロモーターの下流に組込むことができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ．２００１）などを参照のこと。

　ＡＡＶはヘルパー依存性ウイルスであるので、本発明のｒＡＡＶビリオンを調製するため、ビリオン生産用の細胞（培養細胞）に感染する際、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニア）との共感染を必要とする。ヘルパーウイルスとの共感染がない場合、ＡＡＶは、ウイルスゲノムを宿主細胞染色体に挿入するが、挿入されたウイルスゲノムに由来する感染性ＡＡＶビリオンは生成されない。その挿入されたウイルスゲノムを有する宿主がヘルパーウイルスに感染される場合、組み込まれたゲノムに由来する感染性ＡＡＶビリオンを生じ得る。ＡＡＶ自体は、異なる種由来の細胞に感染し得るが、ヘルパーウイルスは、宿主細胞と同じ種であることが必要とされる。例えば、ヒトＡＡＶは、イヌのアデノウイルスに共感染されたイヌの細胞において複製できる。

　本発明のｒＡＡＶビリオンの調製において、ヘルパーウイルスプラスミド（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニア）を使用して、上記第１および第２のポリヌクレオチドと同時に培養細胞に導入され得る。好ましくは、本発明の調製方法は、アデノウイルス（ＡｄＶ）ヘルパープラスミドを導入する工程をさらに含む。ＡｄＶヘルパープラスミドは、ＡＡＶゲノムの複製などに必要とされるＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４　ｏｒｆ４などのタンパク質をコードする。あるいは、必要なヘルパー機能を運搬する組換えウイルスもしくは非ウイルスベクター（例えばプラスミド、エピソームなど）を利用してもよい。こうした組換えウイルスは当該技術分野で既知でありかつ公表された技術に従って製造できる。多様なアデノウイルス株がＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能であり、また市販されてもいる。あるいは、多くのアデノウイルス株の配列は、例えば、公的なデータベース（例えば、ＰｕｂＭｅｄ、Ｇｅｎｂａｎｋなど）より入手可能である。

　本発明において、好ましくは、ＡｄＶヘルパーは、培養細胞と同じ種のウイルスに由来する。例えば、ヒト培養細胞２９３Ｔを用いる場合、ヒトＡｄＶ由来のヘルパーウイルスベクターを用いることができる。このようなＡｄＶヘルパーベクターとして、市販されているもの（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＡＡＶ　Ｈｅｌｐｅｒ−Ｆｒｅｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号２４００７１））を使用することができる。

　本発明のｒＡＡＶビリオンの調製において、上記の１種以上のプラスミドを培養細胞にトランスフェクションする方法は、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法など、公知の種々の方法を使用することができる。このような方法は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　３ｒｄ　Ｅｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　１９８７−１９９７などに記載されている。

３．本発明のｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物
　本発明のさらなる実施形態において、本発明のｒＡＡＶビリオン（ｒＡＡＶベクター）を含む医薬組成物が提供される。本発明のｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物（以下、本発明の医薬組成物という）利用することによって、被検体の神経系細胞に高い効率で遺伝子導入可能であり、この導入される遺伝子によって目的の疾患を治療できる方法を提供する。本発明のｒＡＡＶは、生体の血液脳関門を通過可能であるので、被検体に末梢投与することによって、本発明のｒＡＡＶを脳、脊髄などの神経系細胞に遺伝子の送達が可能である。すなわち、本発明のｒＡＡＶを使用する場合、脳実質内投与などのより慎重な操作を必要とする投与形態が不要であるので、より高い安全性を期待できる。

　１実施形態において、本発明のｒＡＡＶビリオンは、好ましくは神経系細胞特異的なプロモーター配列およびそのプロモーター配列と作動可能に連結された治療用遺伝子を含む。本発明のｒＡＡＶビリオンは、神経疾患（例、パーキンソン病、アルツハイマー病、トリプレットリピート病、プリオン病、筋萎縮性側策硬化症、脊髄小脳変性症、チャンネル病、てんかんなど）、先天性代謝障害（ウイルソン病、ペロキシゾーム病など）、脱髄性疾患（多発性硬化症など）、中枢神経感染症（例、ＨＩＶ脳炎、細菌性髄膜炎など）、血管障害（脳梗塞、脳出血、脊髄梗塞）、外傷（脳挫傷、脊髄損傷など）、網膜疾患（加齢性黄斑変性症、糖尿病網膜症など）などに対する治療に有用である遺伝子を含むことができ、それら遺伝子を、例えば血液脳関門を通過して脳、脊髄、網膜の神経細胞中に組込むことができる。このような治療用遺伝子を含むｒＡＡＶビリオンは、本発明の医薬組成物に含められる。このような治療用遺伝子としては、例えば上記のような抗体、神経栄養因子（ＮＧＦ）、成長因子（ＨＧＦ）、酸性線維細胞増殖因子（ａＦＧＦ）などをコードするポリヌクレオチドを選択できる。例えば、パーキンソン病に関係する治療標的遺伝子として、α−シヌクレインの発現抑制を行うアンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡｉなどが挙げられる。例えば、凝集性アミロイドβタンパク質を認識することのできる単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを選択することによって、アルツハイマー病を治療するためのｒＡＡＶビリオンを作製することができる。このようなｒＡＡＶビリオンを被検体に末梢投与することによって、パーキンソン病、アルツハイマー病などの神経疾患を治療することが期待できる。本発明の医薬組成物は、例えば、患者の脳神経細胞においてα−シヌクレインの発現量を低下させることによりパーキンソン病の治療に有用であり、あるいは凝集性アミロイドβタンパク質に対する抗体を発現させて患者の脳における凝集性アミロイドβタンパク質を低減させることによりアルツハイマー病の治療に有用である。

　本発明の医薬組成物を使用する場合、例えば、経口、非経口（静脈内）、筋肉、口腔粘膜、直腸、膣、経皮、鼻腔経由または吸入経由などですることができるが、非経口的に投与するのが好ましい。静脈内投与がさらに好ましい。本発明の医薬組成物の有効成分は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明の有効成分は、例えば、製剤中、０．１~９９．９重量％含有することができる。

　製薬学的に許容しうる担体あるいは添加剤としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、安定化剤等を用いることができる。

　経口投与に適する製剤の例としては、例えば散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、液剤またはシロップ剤等を挙げることが出来る。経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシンのような種々の賦形剤を、澱粉、好適にはとうもろこし、じゃがいもまたはタピオカの澱粉、およびアルギン酸やある種のケイ酸複塩のような種々の崩壊剤、およびポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムのような顆粒形成結合剤と共に使用することができる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤も錠剤形成に非常に有効であることが多い。同種の固体組成物をゼラチンカプセルに充填して使用することもできる。これに関連して好適な物質としてラクトースまたは乳糖の他、高分子量のポリエチレングリコールを挙げることができる。経口投与用として水性懸濁液および／またはエリキシルにしたい場合、活性成分を各種の甘味料または香味料、着色料または染料と併用する他、必要であれば乳化剤および／または懸濁化剤も併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。

　非経口投与に適する製剤としては、例えば注射剤、坐剤等を挙げることが出来る。非経口投与の場合、本発明の有効成分をゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて適宜に緩衝し（好適にはｐＨ８以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このような液体希釈剤としては、例えば、生理食塩水を使用できる。調製された水溶液は静脈内注射に適し、一方、油性溶液は関節内注射、筋肉注射および皮下注射に適する。これらすべての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成することができる。さらに、本発明の有効成分は皮膚など局所的に投与することも可能である。この場合は標準的な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投与するのが望ましい。

　本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されず、疾患の種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば、成人（例えば、体重６０ｋｇ）１日当たり１~５０００ｍｇ、好ましくは１０~１０００ｍｇであるが、これらに限定されない。これらの１日投与量は２回から４回に分けて投与されても良い。また、投与単位としてｖｇ（ｖｅｃｔｏｒ　ｇｅｎｏｍｅ）を利用する場合、例えば、体重１ｋｇあたり、１０^９~１０^１４ｖｇ、好ましくは１０^１０~１０^１３ｖｇ、さらに好ましくは１０^１０~１０^１２ｖｇの範囲の投与量を選択することが可能であるが、これらに限定されない。

４．本発明のｒＡＡＶビリオンを用いる生体への遺伝子導入方法
　本発明はさらなる実施形態において、本発明のｒＡＡＶビリオンを用いることによる生体の神経系細胞に遺伝子導入する方法（以下、本発明の方法という）を提供する。具体的には、本発明の方法において、被検体に本発明のｒＡＡＶビリオンを末梢投与する工程を含む。本発明の方法はさらに、本発明のｒＡＡＶビリオンが含む治療用遺伝子を脳、脊髄などの神経系細胞に遺伝子の送達する工程を含む。本発明のｒＡＡＶビリオンは、上記のとおり、生体（成体および胎児を含む）の血液脳関門を通過可能である。したがって、脳内投与などのより慎重な操作を必要とする投与形態が不要であるので、より高い安全性を期待できる。

　１実施形態において、本発明のｒＡＡＶビリオンは、好ましくは神経系細胞特異的なプロモーター配列およびそのプロモーター配列と作動可能に連結された治療用遺伝子を含む組み換えウイルスゲノムを含む（そのようなウイルスゲノムがパッケージングされている）。このような治療用遺伝子としては、例えば上記のような抗体、神経栄養因子（ＮＧＦ）、成長因子（ＨＧＦ）、酸性線維細胞増殖因子（ａＦＧＦ）などをコードするポリヌクレオチドを選択できる。本発明の１実施形態において、例えば、凝集性アミロイドβタンパク質を認識することのできる単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶビリオンを被検体に末梢投与することによって、被検体の脳における凝集性アミロイドβタンパク質を低減させ、アルツハイマー病を治療することが期待できる。また、本発明のｒＡＡＶビリオンを用いて、神経細胞における遺伝子上の不具合（先天的なものおよび後天的なものを含む）を治療（緩和、改善、修復など）することを期待できる。

５．本発明のキット
　本発明は別の実施形態において、本発明のｒＡＡＶを作製するためのキットを提供する。このようなキットは、例えば、上記の（ａ）第１のポリヌクレオチド、および（ｂ）第２のポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、第１のポリヌクレオチドは、配列番号：８、１０および１２のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、第２のポリヌクレオチドは、目的の治療用遺伝子を含んでも含まなくてもよいが、好ましくは、そのような目的の治療用遺伝子を組込むための種々の制限酵素切断部位を含むことができる。

　本発明のｒＡＡＶビリオンを作製するためのキットは、本明細書中に記載されるいずれの構成（例えば、ＡｄＶヘルパーなど）もさらに含むことができる。本発明のキットはまた、本発明のキットを使用してｒＡＡＶビリオンを作製するためのプロトコルを記載した指示書もさらに含み得る。

　本明細書中、特には説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意図される。

　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されるものではない。

材料及び方法
（１）ＡＡＶの外被（カプシド）蛋白ＶＰ１の改変
　１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）という３種類のＡＡＶについて、それぞれの外被蛋白ＶＰ１をコードする塩基配列を含むプラスミドｐＡＡＶ１−ＲＣ、ｐＡＡＶ２−ＲＣ、ｐＡＡＶ９−ＲＣを鋳型として使用した。これらのプラスミドは文献（Ｈａｎｄａ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ，８１：２０７７−２０８４，２０００）に記載されたＡＡＶ３　Ｒｅｐ／ＶＰに由来し、ＡＡＶ３のＲｅｐ配列を含む（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，ｅｔ　ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２２１，２０８−２１７（１９９６））。これらのＡＡＶのＶＰ１の塩基配列はＧｅｎｅＢａｎｋにそれぞれＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ０６３４９７、ＡＦ０４３３０３、ＡＹ５３０５７９として既に報告されている（それぞれ、配列番号：１、３および５に示される）。以下に示すプライマーを合成し、Ｑｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ　ＩＩ　ＸＬ　ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用して、それぞれＡＡＶ１のＶＰ１アミノ酸配列（配列番号：２）の４４５番目、ＡＡＶ２のＶＰ１アミノ酸配列（配列番号：４）の４４４番目、ＡＡＶ９のＶＰ１アミノ酸配列（配列番号：６）の４４６番目に位置するチロシン（Ｙ）残基をフェニルアラニン（Ｆ）残基で置換した。置換されたアミノ酸配列ＡＡＶ１−ｙｆＶＰ１（配列番号：８）、ＡＡＶ２−ｙｆＶＰ１（配列番号：１０）およびＡＡＶ９−ｙｆＶＰ１−３（配列番号：１２）それぞれをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＡＡＶ１−ｙｆＲＣ、ｐＡＡＶ２−ｙｆＲＣ、ｐＡＡＶ９−ｙｆＲＣを作製した。また、ｐＡＡＶ１−ｙｆＲＣ、ｐＡＡＶ２−ｙｆＲＣ、ｐＡＡＶ９−ｙｆＲＣはいずれもＡＡＶ２のＲｅｐをコードするヌクレオチド配列（配列番号：１５）を含む。

（２）ｒＡＡＶベクターの作製
（ａ）ベクターゲノムプラスミドの作製
　神経細胞特異的プロモーターとしてシナプシンＩ（Ｓｙｎａｐｓｉｎ　Ｉ（ＳｙｎＩ）プロモーター（ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ５５３００．１、配列番号：２３）、あるいは乏突起膠細胞（オリゴデンドログリア）特異的プロモーターとしてミエリン塩基性蛋白（ＭＢＰ）プロモーター（ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｍ６３５９９、配列番号：２４）を使用した。また、対照としてｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ　ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｃｈｉｃｋｅｎ　β−ａｃｔｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＣＡＧ）プロモーター（Ｎｉｗａ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　１０８：１９３−２００，１９９１）を使用した。これらのプロモーターと緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の塩基配列（ＴＡＫＡＲＡ製品コードＺ２４６８Ｎ）を、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３）のＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＡＡＶ３の５’側と３’側のインバーテッドターミナルリピートｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔｓ（ＩＴＲ）と呼ばれるヘアピンＤＮＡ配列の間に挿入して、３種類のプラスミドｐＡＡＶ−ＳｙｎＩ−ＧＦＰ、ｐＡＡＶ−ＭＢＰ−ＧＦＰ、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰを作製した。これらのプラスミドの基本構造は、Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　１３：１６０−１６６．２００６に記載される。

（ｂ）ＨＥＫ　２９３細胞へのトランスフェクション
＜第１日目＞
　２２５ｃｍ^２フラスコに１．５×１０^６のＨＥＫ２９３細胞をまき、１０％　ＦＣＳ−ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用して５％ＣＯ_２、３７℃で培養した。
＜第３日目＞
　リン酸カルシウム法でトランスフェクションを行った。以下の１０種類の組み合わせのプラスミド（ＡＡＶベクタープラスミド＋ＡＡＶヘルパープラスミド）と、アデノウイルス（ＡｄＶ）の塩基配列を含むヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＡＡＶ　Ｈｅｌｐｅｒ−Ｆｒｅｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号２４００７１））とを、各２５μｇずつ（計７５μｇ）０．３Ｍ　ＣａＣｌ_２中で混合した。

　その後、２×ＨＢＳ（８０ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｂｕｆｆｅｒ，１．５ｍＭ　Ｎａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ７．１０））を加え、ＤＮＡ−リン酸カルシウムを作製した。フラスコ中の培養液をＤＮＡ−リン酸カルシウムを添加した培地と入れ換え、数時間培養した後に培地を交換した。
＜第６日目＞
　上述の組み合わせで得られる１０種類の組換えウイルスビリオン（上記表中「ｒＡＡＶビリオン」）を回収した。０．５Ｍ　ＥＤＴＡを加えて細胞を培養ディッシュより剥がし、ＴＢＳ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）に懸濁した。ドライアイスエタノールと３７℃のウォーターバスを使用して凍結／融解を３回繰り返し、細胞を破砕した。１０，０００×ｇで１０分間遠心した後、上清を回収して粗大な細胞破片を除去した。

（ｃ）ウイルスベクターの精製
　以下の手順に従って、塩化セシウムＣｓＣｌの密度勾配による超遠心を行いｒＡＡＶベクターを精製した。超遠心チューブ内に１．５Ｍおよび１．２５ＭのＣｓＣｌを重層し密度勾配を作製した。ｒＡＡＶベクターを含む細胞破砕溶液を重層後、超遠心（３０，０００ｒｐｍ、２．５時間）を行った。屈折率を計測してＲＩ：１．３６５~１．３８０のｒＡＡＶベクターを含む画分を回収した。この分画を再度ＣｓＣｌ溶液上に重層し、超遠心（３６，０００ｒｐｍ、２．５時間）を行ってｒＡＡＶを含む分画を得た。

（ｄ）ウイルスベクター力価の測定（リアルタイムＰＣＲ）
　精製したｒＡＡＶの１０^−２~１０^−６の希釈系列を作製した。ＧＦＰ配列をスタンダードとしたプライマーセット（配列番号：２５及び２６）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　７９００ＨＴ　Ｆａｓｔ　リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で定量した。
実施例１

１．成体マウス脳神経細胞への遺伝子導入
（１）マウス心腔内へのｒＡＡＶベクターの投与
　生後４か月齢の成体マウスＣ５７ＢＬ６、雄、３０頭（各ベクターにつき３頭）を使用した。ネンブタールを体重３０ｇあたり２００μｌ腹腔内投与して麻酔し、小動物固定装置に固定した。インスリン注射用の１ｍｌシリンジを使用して、経皮的に左心室を穿刺し、ＰＢＳで希釈した上記の各ベクターを２×１０^１２ｖｇ（投与容量：１００μｌ）注入した。麻酔が覚醒するまでヒーティングパッド上に置いたケージで観察した。その後、マウスケージを感染動物用ラックに戻した。

（２）免疫組織化学
　深い麻酔下で、ＰＢＳを使用し、その後、４％氷冷ＰＦＡを使用して、マウスを還流した。脳と脊髄を取り出し、次いで４％ＰＦＡ中で４時間、後固定した。前頂（Ｂｒｅｇｍａ）から前方０．７ｍｍ~後方２．５ｍｍまでの範囲（３．２ｍｍ）の脳の冠状断面切片（４０μｍ）を作製した。また、頚髄の水平断切片（４０μｍ）を作製した。２％　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍ．Ｏ．Ｍ　Ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含有する０．３％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳ中で１時間ブロッキングした。次いでＮｅｕＮ（１：１００，ｍｏｕｓｅ　ａｎｔｉ−Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｎｕｃｌｅｉ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）とＧＦＰ（１：１０００，ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ−ＧＦＰ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）とともに４℃で一晩インキュベートした。その後、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８　ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（１：５００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともに、室温で２時間インキュベーションし可視化した。共焦点レーザー顕微鏡（ＴＣＳ　ＮＴ；Ｌｅｉｃａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のもとで観察し、２００μｍ間隔の切片で、大脳皮質の０．０４ｍｍ^３（１ｍｍ×１ｍｍ×４０μｍ）の範囲、および脊髄の一切片あたりのＧＦＰおよびＮｅｕＮ陽性細胞を計測した。また、脊髄のＧＦＰ陽性細胞を、以下に述べるＧＦＰ／ＣｈＡＴ二重免疫蛍光染色により同定した。頚髄の切片を同様にブロッキングした後ＣｈＡＴ（１：１００に希釈、ｍｏｕｓｅ　ａｎｔｉ−ＣｈＡＴ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）とＧＦＰ（１：１０００に希釈，Ａｂｃａｍ）とともに４℃で一晩インキュベートした。その後、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８　ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（１：５００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、室温で２時間インキュベーションし可視化、ＧＦＰ／ＮｅｕＮ二重染色と同様に観察した。
　ＧＦＰ／Ｏｌｉｇ２二重免疫蛍光染色のために、切片を３％ヤギ血清を含有する０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳ中でブロッキングした後、Ｏｌｉｇ２（１：５０に希釈、ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ−Ｏｌｉｇ２　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＩＢＬ，Ｔａｋａｓａｋｉ，Ｇｕｎｍａ，Ｊａｐａｎ）とともに４℃で一晩インキュベートした。その後Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４　ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ、続いてＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ−ＧＦＰ　ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（１−４００に希釈，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに室温で２時間ずつインキュベートした。他の蛍光免疫染色と同様に観察し、蛍光を発する細胞数を計測した。

２．結果
（１）上記表１に記載の組合せのうち、以下の６種類のｒＡＡＶベクターを生じる組合せでは、大脳皮質および脊髄の神経細胞にＧＦＰの発現は認められなかった。
　ＡＡＶ１−ＣＡＧ−ＧＦＰ　（サンプルＩＤ：１）、
　ｙｆＡＡＶ１−ＣＡＧ−ＧＦＰ　（サンプルＩＤ：２）、
　ＡＡＶ１−ＳｙｎＩ−ＧＦＰ（サンプルＩＤ：３）、
　ＡＡＶ２−ＳｙｎＩ−ＧＦＰ（サンプルＩＤ：５）、
　ｙｆＡＡＶ２−ＳｙｎＩ−ＧＦＰ（サンプルＩＤ：６）、
　ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ＧＦＰ　（サンプルＩＤ：７）

（２）ｙｆＡＡＶ１−ＳｙｎＩ−ＧＦＰの組合せ（サンプルＩＤ：４）では、大脳および脊髄の神経細胞でＧＦＰの発現が認められた。一方、ＡＡＶ１−ＳｙｎＩ−ＧＦＰの組合せ（サンプルＩＤ：３）では、陽性細胞はみられなかった（図１）。したがって、ＡＡＶ１のカプシドタンパク質ＶＰ１の４４５番目のチロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）で置換したことにより、脳内の神経細胞への高効率の遺伝子導入が可能になったこと示す。

（３）ｙｆＡＡＶ９−ＣＡＧ−ＧＦＰ（サンプルＩＤ：８）では、少数の神経細胞でＧＦＰの発現が見られたが、ＧＦＰ陽性細胞の大部分は神経細胞ではなくグリア細胞であった。一方、ｙｆＡＡＶ９−ＳｙｎＩ−ＧＦＰ（サンプルＩＤ：９）では、さらに約４倍の数のＧＦＰ陽性の神経細胞を確認した（図２Ａ、２Ｂおよび図３）。また、ｙｆＡＡＶ９−ＭＢＰ−ＧＦＰでは、多数のＧＦＰ陽性の乏突起膠細胞を確認した（図２Ｃ）。したがって、神経細胞特異的プロモーターあるいは乏突起膠細胞特異的プロモーター配列を用いることによって、末梢投与したｒＡＡＶベクターによる脳内神経細胞および乏突起膠細胞への高効率の遺伝子導入が可能になったことを示す。
　ｒＡＡＶビリオンを末梢投与するのではなく脳内へ直接注入する場合、ＣＡＧプロモーターを利用する場合であっても神経細胞への導入効率が十分高く、遺伝子発現レベルはＳｙｎＩプロモーターより２~４倍以上高いことが具体的に示されている（Ｈｉｏｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　１４：８７２−８８２，２００７など）。しかし、本願のｒＡＡＶビリオンを末梢血管内投与する場合、ＣＡＧプロモーターを利用したｒＡＡＶビリオンは、神経細胞ではなくグリア様細胞で遺伝子発現の大部分が認められた。通常のＣＭＶプロモーターを用いたｒＡＡＶベクターを用いた場合も同様に、成体では大部分のものが神経細胞ではなくグリア様細胞に導入された。
　一方、神経細胞での遺伝子発現は神経細胞特異的プロモーターであるＳｙｎＩの方がＣＡＧプロモーターよりも優れていた。したがって、上記の結果は、本発明のｒＡＡＶビリオンと組み合わせるプロモーターとしては、ＣＡＧプロモーターのような非特異的な一般的に強力なプロモーターよりもむしろ、ＳｙｎＩなどの神経細胞特異的プロモーターがより有利であり、これらの組合せによって、末梢投与による神経細胞への遺伝子導入に対して相乗的な効果を発揮することを示している。

　脊髄では、頚髄の切片１枚あたり２４±３．５個のＧＦＰとＮｅｕＮが陽性の神経細胞が認められた。さらに、各切片のＧＦＰ陽性細胞のうち４~５個はＣｈＡＴ陽性の運動神経細胞であった（図４）。したがって、神経細胞特異的プロモーター（ＳｙｎＩ）または乏突起膠細胞特異的プロモーター（ＭＢＰ）を使用することにより、成体マウスの脳と脊髄の神経細胞および乏突起膠細胞に対して、末梢投与によって安定して遺伝子導入可能であることを示した。

３．まとめ
　上記の結果より、野生型ＡＡＶ１／２／９のカプシドタンパク質ＶＰ１のそれぞれ４４５／４４４／４４６位のチロシン（Ｙ）残基をフェニルアラニン（Ｆ）残基で置換したこと、ならびに神経細胞特異的プロモーターであるＳｙｎＩプロモーター配列又はＭＢＰプロモーター配列を目的の治療用遺伝子と組合せて使用することにより、本発明のｒＡＡＶベクターは、成体マウスに対しする末梢投与によって、血液脳関門を通過可能であり、最終的に脳および脊髄の神経系細胞に高い効率で遺伝子導入可能であることを示した。
実施例２

母親マウスへの末梢投与による胎仔脳への遺伝子導入
　母親マウスの羊膜血管内にｒＡＡＶベクターを投与することによって、胎仔に遺伝子導入を行ったことが報告されている（ＲＡＨＩＭ　ＥＴ　ＡＬ．，ＦＡＳＥＢ　Ｊｏｕｒｎａｌ，ｐｐ１−１４，Ｖｏｌ．２５　Ｏｃｔｏｂｅｒ　２０１１）。そこで、本発明のｒＡＡＶベクターを母親マウスに末梢投与した場合における胎児への遺伝子導入について試験した。

材料及び方法
　ｒＡＡＶベクター：ｙｆＡＡＶ９−ＳｙｎＩ−ＡｃＧＦＰ１（サンプルＩＤ：９）
　力価：　　　　　　１．３　×　１０^１３　ｖｅｃｔｏｒ　ｇｅｎｏｍｅ／ｍｌ
　投与容量：　　　　５０μｌ
　投与方法
　妊娠１３日目に母マウス（３頭）に上記ｒＡＡＶベクターを心腔内投与し、その後生まれた仔マウス（計９頭）について、生後１日、３週、４週および１１週目に４％パラフォルムアルデヒド（ＰＦＡ）により還流固定し、各脳の海馬付近について冠状断切片（厚さ４０μｍ）を作製した。作製した各切片試料において、上記と同様に、神経細胞内に発現されるＧＦＰを検出した。

結果
　５頭分の合計２０枚の切片試料について発現されるＧＦＰを計測したところ、平均して４．６個／切片のＧＦＰ陽性細胞が認められた（図５）。したがって、本発明のｒＡＡＶベクターは、母体に末梢投与する場合であっても、胎仔の脳神経細胞への遺伝子導入が可能であることを示した。
実施例３

組み換えＡＡＶベクター：ｙｆＡＡＶ９−ＳｙｎＩ−ＧＦＰ−ｍｉＡＡＤＣを用いた脳神経細胞における芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）の発現制御
　本発明のｒＡＡＶベクターは、ウイルスゲノム中にｍｉＲＮＡなどを組み込むことによって内在性遺伝子の発現制御を可能とする治療用ベクターとして有用であるかどうか試験した。具体的な手順としては、ｙｆＡＡＶ９−ＳｙｎＩ−ＧＦＰ（サンプルＩＤ：９）をベースに、ｙｆＡＡＶ９を外被蛋白として含み，神経細胞特異的Ｓｙｎａｐｓｉｎ　Ｉプロモーターによりマウス芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）に対するｍｉＲＮＡと蛍光緑色蛋白（ＧＦＰ）とを発現するｒＡＡＶベクターを作製し、これをマウスに投与して、脳神経細胞内のＡＡＤＣを低下できるかを試験した。
　使用するｍｉＲＮＡとしては，マウスＡＡＤＣ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０１６６７２）の塩基番号８３１~８５１に相当する５’−ＴＧＣＣＴＴＴＡＴＧＴＣＣＴＧＡＡＴＴ−３’（配列番号：２７）を目標とした下記の配列を合成した。

　この配列を、上記表１のサンプルＩＤ：９に示すｒＡＡＶベクターゲノムプラスミドｐＡＡＶ−ＳｙｎＩ−ＧＦＰ中のＧＦＰ遺伝子の下流に組み込むことによってｐＡＡＶ−ＳｙｎＩ−ＧＦＰ−ｍｉＡＡＤＣを作製し（配列番号：２９を参照）、サンプルＩＤ：９と同様に、ＡＡＶヘルパープラスミドｐＡＡＶ９−ｙｆＲＣ及びＡｄＶヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒを同時に使用して、ｒＡＡＶビリオンｙｆＡＡＶ９−ＳｙｎＩ−ＧＦＰ−ｍｉＡＡＤＣを調製した。

材料及び手順
　ｒＡＡＶベクター：ｙｆＡＡＶ９−ＳｙｎＩ−ＧＦＰ−ｍｉＡＡＤＣ
　力価：　　　　　　１．７×１０^１４ｖｅｃｔｏｒ　ｇｅｎｏｍｅ／ｍｌ
　成体マウス：　　　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ　　１０週齢　雄性　４匹
　心腔内投与：　　　５０μｌ／匹
　脳組織解析の手順
　ｒＡＡＶベクター投与２週間後に４％パラフォルムアルデヒド（ＰＦＡ）で還流固定し，その後，脳を取り出し後、固定４時間，１０％　→　２０％　→　３０％シュクロースを経て，スライドガラス上に厚さ４０μｍの冠状断切片を作製した。免疫染色のため，３％　ｎｏｒｍａｌ　ｇｏａｔ　ｓｅｒｕｍで切片試料をブロッキングした後，一次抗体として、ウサギ抗ＡＡＤＣ（ａｎｔｉ−ＡＡＤＣ、１：５０００に希釈、名古屋大学の永津　俊治博士より供与された）及びマウス抗チロシンヒドロキシラーゼ（ａｎｔｉ−ＴＨ）（Ｄｉａ　Ｓｏｒｉｎ　１：８００に希釈）を切片試料と４℃で一晩反応させた。二次抗体としてＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４抗ウサギＩｇＧとＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５抗マウスＩｇＧ（以上、共にＬｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：１０００に希釈）を用い、これら抗体の各々と各切片試料とを室温で２時間反応させた。その後Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ａｎｔｉ−ＧＦＰ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１：４００に希釈）を用い、この抗体と各切片試料とを室温で１時間反応させた。切片試料中の各蛍光物質を、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＦＶ１０ｉ；Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ）で画像化した（図６）。

結果
　図６の左図（ａｎｔｉ−ＧＦＰ）には、黒質緻密部に５個のＧＦＰ陽性の細胞がみられたことから、本発明のｒＡＡＶベクターが上記実施例と同様に神経細胞に遺伝子導入できたことを確認した。これら神経細胞についてａｎｔｉ−ＡＡＤＣを反応させた結果を見ると、バックグラウンド程度であり、有意には呈色されなかった（図６の中央図、ａｎｔｉ−ＡＡＤＣ）。したがって、本発明のｒＡＡＶベクターを用いて脳神経細胞においてＡＡＤＣの発現を有意に低下させることができた。対照として、細胞内タンパク質であるチロシンヒドロキシラーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ：ＴＨ）の発現が維持されているのを確認した（図６の右図、ａｎｔｉ−ＴＨ）。以上より、本発明のｒＡＡＶベクターは、脳神経細胞に対して遺伝子導入可能であり、ウイルスゲノム中にｍｉＲＮＡなどを組み込むことによって内在性遺伝子を発現抑制させるなどの治療用ベクターとして有用であることを示した。

　本発明の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンは血液脳関門を通過可能であるので、末梢投与といった平易な投与手段によって神経系細胞に遺伝子導入可能である。したがって、例えば、抗体、神経栄養因子などの有用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを本発明の組換えベクターに組込むことにより、神経系細胞への遺伝子導入が可能な医薬組成物を提供できる。例えば、アルツハイマー病の原因となるアミロイドβタンパク質凝集体に対する抗体をコードする遺伝子を組込んだ本発明の組換えベクターは、アルツハイマー病のより安全な治療手段を提供できる。また、本発明のウイルス粒子調製方法、および／または本発明のキットを使用することによって、神経系細胞に目的の遺伝子を導入するためのウイルス粒子を作製できる。

配列番号：１　　野生型ＡＡＶ１由来カプシドタンパク質ＡＡＶ１−ＶＰ１ヌクレオチド配列　（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００２０７７．１）
配列番号：２　　野生型ＡＡＶ１由来カプシドタンパク質ＡＡＶ１−ＶＰ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿２０７７．１）
配列番号：３　　野生型ＡＡＶ２由来カプシドタンパク質ＡＡＶ２−ＶＰ１ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００１４０１．２）
配列番号：４　　野生型ＡＡＶ２由来カプシドタンパク質ＡＡＶ２−ＶＰ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００１４０１．２）
配列番号：５　　野生型ＡＡＶ９由来カプシドタンパク質ＡＡＶ９−ＶＰ１ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ５３０５７９．１）
配列番号：６　　野生型ＡＡＶ９由来カプシドタンパク質ＡＡＶ９−ＶＰ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ５３０５７９．１）
配列番号：７　　ＡＡＶ１由来カプシドタンパク質変異体ＡＡＶ１−ｙｆＶＰ１ヌクレオチド配列
配列番号：８　　ＡＡＶ１由来カプシドタンパク質変異体ＡＡＶ１−ｙｆＶＰ１アミノ酸配列
配列番号：９　　ＡＡＶ２由来カプシドタンパク質変異体ＡＡＶ２−ｙｆＶＰ１ヌクレオチド配列
配列番号：１０　ＡＡＶ２由来カプシドタンパク質変異体ＡＡＶ２−ｙｆＶＰ１アミノ酸配列
配列番号：１１　ＡＡＶ９由来カプシドタンパク質変異体ＡＡＶ９−ｙｆＶＰ１ヌクレオチド配列
配列番号：１２　ＡＡＶ９由来カプシドタンパク質変異体ＡＡＶ９−ｙｆＶＰ１アミノ酸配列
配列番号：１３　ＡＡＶ３由来５’側ＩＴＲヌクレオチド配列　（ＧｅｎＢａｎｋ　ＮＣ＿００１７２９由来）
配列番号：１４　ＡＡＶ３由来３’側ＩＴＲヌクレオチド配列
配列番号：１５　ＡＡＶ２由来ｒｅｐ遺伝子ヌクレオチド配列
配列番号：１６　ＡＡＶ２由来Ｒｅｐタンパク質アミノ酸配列
配列番号：１７　変異導入プライマー１（ｙｆＡＡＶ１−Ｆ）ヌクレオチド配列
配列番号：１８　変異導入プライマー２（ｙｆＡＡＶ１−Ｒ）ヌクレオチド配列
配列番号：１９　変異導入プライマー３（ｙｆＡＡＶ２−Ｆ）ヌクレオチド配列
配列番号：２０　変異導入プライマー４（ｙｆＡＡＶ２−Ｒ）ヌクレオチド配列
配列番号：２１　変異導入プライマー５（ｙｆＡＡＶ９−Ｆ）ヌクレオチド配列
配列番号：２２　変異導入プライマー６（ｙｆＡＡＶ９−Ｒ）ヌクレオチド配列
配列番号：２３　シナプシンＩプロモーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ５５３００．１）
配列番号：２４　ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ６３５９９（ヒト）由来）
配列番号：２５　ＧＦＰ検出用プライマー１ヌクレオチド配列
配列番号：２６　ＧＦＰ検出用プライマー２ヌクレオチド配列
配列番号：２７　マウス芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ：Ｇｅｎｅｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０１６６７２）の８３１~８５１塩基に対して設計したヌクレオチド配列
配列番号：２８　マウス芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）に対するｍｉＲＮＡを生じるためのヌクレオチド配列
配列番号：２９　ＧＦＰ及びマウス芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）に対するｍｉＲＮＡ（配列番号：２８）を発現するヌクレオチド配列

Claims

　（ａ）配列番号：２、４若しくは６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、少なくとも１つの表面露出チロシン残基が他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含むタンパク質であって、ウイルスビリオンを形成可能であるタンパク質を含むキャプソメア、ならびに
　（ｂ）該キャプソメア内にパッケージングされるポリヌクレオチドであって、神経系細胞特異的プロモーター配列および該プロモーター配列と作動可能に連結されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、組換えアデノ随伴ウイルスビリオン。
　前記タンパク質は少なくとも、配列番号：２において４４５位のチロシン残基、配列番号：４において４４４位のチロシン残基、又は配列番号：６において４４６位のチロシン残基が置換されているアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のウイルスビリオン。
　前記チロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されている、請求項１又は２に記載のウイルスビリオン。
　前記タンパク質が、配列番号：８、１０若しくは１２のアミノ酸配列、又は配列番号：８、１０若しくは１２のアミノ酸配列の４４４~４４６位以外の位置に１~数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／若しくは付加を含むアミノ酸配列を含み、ウイルスビリオンを形成可能である、請求項１~３のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
　前記ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端が、それぞれ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３またはＡＡＶ４に由来する５’末端および３’末端のインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲ）配列を含む、請求項１~４のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
　前記ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端が、それぞれ配列番号：１３および配列番号：１４のヌクレオチド配列を含む、請求項１~５のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
　前記ポリヌクレオチドが全長約２~６ｋｂの長さを有し、センス鎖またはアンチセンス鎖の一本鎖ＤＮＡである、請求項１~５のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
　前記プロモーター配列が、シナプシンＩプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム／カルモジュリン−依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チュブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター配列、Ｌ７プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、およびグルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）からなる群より選択される、請求項１~６のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
　前記プロモーター配列が配列番号：２３または配列番号：２４に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載のウイルスビリオン。
　前記プロモーター配列と作動可能に連結されるヌクレオチド配列が、抗体、神経栄養因子（ＮＧＦ）、成長因子（ＨＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）およびアミロイドβタンパク質分解酵素（Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ）からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項７に記載のウイルスビリオン。
　前記プロモーター配列と作動可能に連結されるヌクレオチド配列が、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）又はα−シヌクレインに対するｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡを発現する、請求項７に記載のウイルスビリオン。
　前記抗体が凝集性アミロイドβタンパク質に対する抗体である、請求項９に記載のウイルスビリオン。
　被検体の血液脳関門を通過可能である、請求項１~１２のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
　前記ウイルスビリオンがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１~１３のいずれかに記載のウイルスビリオン。
　請求項１~１４のいずれか１項に記載のウイルスビリオンを含む、医薬組成物。