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TW202102526A - 重組腺相關病毒及其用途 - Google Patents

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TW202102526A TW109111391A TW109111391A TW202102526A TW 202102526 A TW202102526 A TW 202102526A TW 109111391 A TW109111391 A TW 109111391A TW 109111391 A TW109111391 A TW 109111391A TW 202102526 A TW202102526 A TW 202102526A
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奧利斐爾 達諾斯
曄 劉
安德魯 摩瑟
莎曼薩 約斯特
伊萊德 芬堡
梅勒錫 蘇巴 卡魯木錫
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美商銳進科斯生物股份有限公司
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Abstract

本發明係關於重組腺相關病毒(rAAV)，其具有經工程改造以包含賦予及/或增強期望性質之胺基酸序列之衣殼蛋白。特定而言，本發明提供包括來自異源蛋白之肽插入物之經工程改造衣殼蛋白，該等肽插入物插入該病毒衣殼之可變區IV (VR-IV)內或其附近，從而該插入物係表面暴露於AAV顆粒上。本發明亦提供將rAAV引導至靶組織之衣殼蛋白，尤其係包括衍生自促紅血球生成素或動力蛋白之肽之衣殼蛋白，該等肽插入表面暴露之可變區中且使rAAV靶向視網膜組織及/或包含中樞神經系統在內之神經組織，並遞送用於治療神經及/或眼睛病症之治療劑。

Description

重組腺相關病毒及其用途
本發明係關於重組腺相關病毒(rAAV)，其具有經工程改造以包含賦予及/或增強期望性質之胺基酸序列之衣殼蛋白。特定而言，本發明提供包括來自異源蛋白之肽插入物之經工程改造衣殼蛋白，該等肽插入物插入該病毒衣殼之可變區IV (VR-IV)內或其附近或替代地可變區VIII (VR-VIII)內或其附近，從而該插入物係表面暴露於AAV顆粒上。本發明亦提供將rAAV引導至靶組織之衣殼蛋白，尤其係包括衍生自(例如)促紅血球生成素或動力蛋白之肽之衣殼蛋白，該等肽插入表面暴露之可變區中以使rAAV靶向視網膜及神經組織(包含中樞神經系統)及/或改良轉導，並遞送用於治療神經病症之治療劑。
使用腺相關病毒(AAV)作為基因遞送載體係用於處理許多未滿足性患者需求之有前景途徑。已報導數十種天然AAV衣殼，且在靈長類動物組織中挖掘AAV序列之天然多樣性已鑑別出超過100種分佈於進化枝中之變體。AAV屬細小病毒家族且係具有相對較小基因體及較簡單基因組分之單鏈DNA病毒。在無輔助性病毒下，AAV即可確立潛伏性感染。AAV基因體通常具有Rep基因及Cap基因，該等基因側接有反向末端重複(ITR)且用作載體產生之複製及包裝信號。衣殼蛋白形成攜載基因體DNA且可決定將DNA遞送至靶細胞中之組織嗜性之衣殼。
因低病原性及長期靶向基因表現之前景，已使用重組AAV (rAAV)作為基因轉移載體，其中將治療序列包裝至各種衣殼中。該等載體已用於臨床前基因療法研究中且目前有超過20種基因療法產品處於臨床研發中。重組AAV (例如AAV9)已顯示期望親神經性性質且使用重組AAV9來治療CNS疾病之臨床試驗正在進行中。然而，增強rAAV在人類個體中之親神經性性質之嘗試所取得之成功有限。
仍需要具有增強之親神經性性質之rAAV載體，其用於(例如)穿越血腦障壁以遞送療法，從而治療與中樞神經系統及眼睛、尤其視網膜有關之病症。亦需要具有增強之組織特異性靶向及/或增強之組織特異性轉導以遞送療法之rAAV載體。
提供重組腺相關病毒(rAAV)，其具有經工程改造以包含賦予及/或增強期望性質(例如rAAV基因體之組織靶向、轉導及/或整合)之胺基酸序列之衣殼蛋白。特定而言，本發明提供包括一或多個來自異源蛋白之肽插入物之經工程改造衣殼蛋白，該等肽插入物插入該病毒衣殼之可變區IV (VR-IV)內或其附近或可變區VIII (VR-VIII)內或其附近，從而該插入物係表面暴露於AAV顆粒上。在特定實施例中，插入物緊接在對應於AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO:118且如圖 8 中所編號)之胺基酸451至461中之一者之胺基酸殘基之後，包含在AAV9衣殼之胺基酸454之後(亦即在胺基酸454與455之間)或對於不同AAV類型之衣殼蛋白而言在對應於AAV9之胺基酸454之殘基之後(例如SEQ ID NO: 110至117或119至121)，「對應於」意指使用圖 8 中之序列比對或對於圖 8 中未包含之AAV類型而言使用AAV9衣殼蛋白序列(SEQ ID NO:118)及如業內所熟知之AAV衣殼蛋白的類似胺基酸序列比對進行比對)。因此，本發明提供包括來自異源蛋白之肽插入物之經工程改造衣殼蛋白，該肽插入物插入至緊接在對應於AAV9之位置454之胺基酸殘基的胺基酸之後或其附近(如圖 8 中所編號)。在其他特定實施例中，插入物緊接在對應於AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO:118且如圖 8 中所編號)之胺基酸588之胺基酸殘基之後(亦即在胺基酸588與589之間)，或對於不同AAV類型之衣殼蛋白而言在對應於AAV9之胺基酸588之殘基之後(例如SEQ ID NO: 110至117或119至121)。衣殼蛋白可為AAV9衣殼蛋白，但亦可為任一AAV衣殼蛋白，例如AAV血清型1 (SEQ ID NO: 110)；AAV血清型2 (SEQ ID NO: 111)；AAV血清型3 (SEQ ID NO: 112) AAV血清型4 (SEQ ID NO: 113)；AAV血清型5 (SEQ ID NO: 114)；AAV血清型6 (SEQ ID NO: 115)；AAV7衣殼(SEQ ID NO: 116)之451至461；AAV8衣殼(SEQ ID NO: 117)之451至461；AAV血清型9 (SEQ ID NO: 118)；AAV血清型9e (SEQ ID NO: 119)；AAV血清型rh10 (SEQ ID NO: 120)；AAV血清型rh20 (SEQ ID NO: 121)；及AAV血清型hu.37 (SEQ ID NO: 122)、AAV血清型rh39 (SEQ ID NO: 124)及AAV血清型rh74 (SEQ ID NO: 123或SEQ ID NO: 154) (參見圖 8 )。
亦提供將rAAV引導至靶組織之衣殼蛋白，尤其係包括衍生自促紅血球生成素或動力蛋白(包含軸絲或細胞質動力蛋白)之肽或促進rAAV基因體之組織靶向及/或細胞攝取及/或整合之肽的衣殼蛋白，該等肽插入表面暴露之可變區中且使rAAV靶向神經組織(包含中樞神經系統)及視網膜組織，並遞送用於治療神經及眼部病症之治療劑。該等肽有利地插入衣殼蛋白之胺基酸序列中，從而在將衣殼蛋白納入AAV顆粒中時，所插入肽係表面暴露的。該等肽插入至緊接在AAV9衣殼(SEQ ID NO:118且參見圖 8 之比對)之胺基酸262至273、451至461或585至593中之一者之後或在對應於該等胺基酸之胺基酸中之一者之後，或緊接在對應於編碼VP2之第一密碼子之胺基酸殘基(其係AAV9衣殼之胺基酸138及對應於AAV9衣殼(SEQ ID NO:118且參見圖 8 之比對)之位置138之胺基酸)之後。在某些實施例中，所插入肽係軸絲動力蛋白重鏈之肽KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)、TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)、QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)、RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)、LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)、PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)或TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)中之一者之至少4個鄰接胺基酸或其5、6、7個鄰接胺基酸，或替代地係QEQLERALNSS (SEQ ID NO: 8) (其係稱為ARA290之促紅血球生成素之非線性表位)之5、6、7、8、9、10或11個鄰接胺基酸。
提供包括靶向特定組織之肽(包含促進或增加rAAV基因體之細胞攝取及/或整合者)之經工程改造衣殼蛋白，其中該等肽係插入衣殼蛋白之表面暴露之可變區中。在某些實施例中，肽靶向以下組織之細胞及/或促進其中之轉導或基因體整合：骨(例如DDDDDDDD (SEQ ID NO: 9)之至少4個鄰接胺基酸或至少7或8個鄰接胺基酸)、腦(LSSRLDA (SEQ ID NO: 10)之至少4個胺基酸或至少7個鄰接胺基酸或係7個鄰接胺基酸或係CLSSRLDAC (SEQ ID NO: 11)之7、8或9個鄰接胺基酸)、腎(肽CLPVASC (SEQ ID NO: 12)或LPVAS (SEQ ID NO: 13)之至少4或5個鄰接胺基酸或係該肽)、肌肉(肽ASSLNIA (SEQ ID NO: 14)之至少4、5、6或7個鄰接胺基酸或係該肽)、視網膜(LGETTRP (SEQ ID NO: 15)或LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)之至少4個鄰接胺基酸或係5、6或7個鄰接胺基酸)，或係衍生自轉鐵蛋白受體(HAIYPRH (SEQ ID NO: 17)、THRPPMWSPVWP (SEQ ID NO: 18)、RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)或CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)之至少4個鄰接胺基酸或至少7個鄰接胺基酸或係7個鄰接胺基酸)。在某些實施例中，肽係CLPVASC (SEQ ID NO: 12)或係ASSLNIA (SEQ ID NO: 14)且含有此肽(例如插入AAV9之位置454之後)之衣殼優先地使具有該衣殼之rAAV靶向腎(與肝相比)。在其他實施例中，所插入肽係肽SITLVKSTQTV (SEQ ID NO: 21)或TILSRSTQTG (SEQ ID NO: 22)或QAVRTSL (SEQ ID NO: 23)或QAVRTSH (SEQ ID NO: 24)之至少4個鄰接胺基酸或至少7或8個鄰接胺基酸或係該肽。在一些實施例中，肽不超過12個鄰接胺基酸。在其他實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之經工程改造衣殼，該等取代可改良嗜性、轉導或減小免疫中和活性。該等胺基酸修飾包含AAV8之A269S及其他AAV類型衣殼中之相應取代、AAV9之S263F/S269T/A273T及其他AAV類型衣殼中之相應取代、AAV9之W530R或Q474A及其他AAV類型衣殼中之相應取代。具有該等胺基酸取代之衣殼可進一步在AAV8衣殼之498至500使用AAA (丙胺酸)取NNN (天門冬醯胺酸)或在AAV9衣殼之496至498使用AAA (丙胺酸)取代NNN (天門冬醯胺酸)，或具有其他AAV類型衣殼中之相應取代。
亦提供在全身性、靜脈內、鞘內、鼻內、腹膜腔內或玻璃體內投與時促進rAAV在一或多種組織(包含一或多種細胞類型)中之轉導之經工程改造衣殼蛋白，其中衣殼蛋白包括插入衣殼之表面暴露之可變區(VR) (例如VR-I、VR-IV或VR-VIII)中或插入VP2之第一胺基酸之後(例如緊接在AAV9衣殼 (SEQ ID NO:118之胺基酸序列)殘基138之後或緊接在另一AAV衣殼之相應殘基之後)的肽，或替代地經本文所闡述胺基酸取代中之一或多者工程改造，且與具有相應未工程改造衣殼之AAV之轉導相比，在該投與後具有經工程改造衣殼之AAV在至少一種組織中之轉導有所增加。在某些實施例中，藉由檢測轉基因(例如GFP螢光)來量測轉導。
在某些實施例中，提供納入本文所闡述之經工程改造衣殼之rAAV，包含具有包括所關注治療劑之轉基因之基因體之rAAV。提供用於產生本文所闡述之rAAV之包裝細胞。亦提供藉由遞送本文所闡述之經工程改造rAAV進行治療之方法及包括本文所闡述之經工程改造rAAV的醫藥組合物。亦提供製造具有本文所闡述之經工程改造衣殼之rAAV之方法。
下文藉由實例方式來闡釋本發明，該等實例闡述經肽插入物(基於人類軸絲動力蛋白重鏈尾部、ARA290及其他組織靶向或歸巢肽來設計)工程改造之rAAV9衣殼及經胺基酸取代工程改造之衣殼之構築。 3.1.  實施例
1. 一種重組腺相關病毒(rAAV)衣殼蛋白，其包括來自非衣殼蛋白之異源蛋白之具有至少4個且最多20個鄰接胺基酸之肽插入物，該肽插入物緊接在對應於圖8中AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO:118)之胺基酸451至461中之一者的胺基酸殘基之後，其中在該衣殼蛋白包裝為AAV顆粒時該肽插入物係表面暴露的。
2. 如實施例1之rAAV衣殼蛋白，其中該衣殼蛋白係來自至少一種以下AAV血清型：AAV血清型1 (AAV1)、血清型2 (AAV2)、血清型3 (AAV3)、血清型4 (AAV4)、血清型5 (AAV5)、血清型6 (AAV6)、血清型7 (AAV7)、血清型8 (AAV8)、血清型rh8 (AAVrh8)、血清型9 (AAV9)、血清型9e (AAV9e)、血清型rh10 (AAVrh10)、血清型rh20 (AAVrh20)、血清型rh39 (AAVrh39)、血清型hu.37 (AAVhu.37)或血清型rh74 (AAVrh74)。
3. 如實施例2之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物出現於緊接在以下位置內之胺基酸殘基中之一者之後： AAV1衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO 110)之450至459； AAV2衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 111)之449至458； AAV3衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 112)之449至459； AAV4衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 113)之443至453； AAV5衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 114)之442至445； AAV6衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 115)之450至459； AAV7衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 116)之451至461； AAV8衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 117)之451至461； AAV9衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 118)之451至461； AAV9e衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 119)之452至461； AAVrh10衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 120)之452至461； AAVrh20衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 121)之452至461； AAVhu.37衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 122)之452至461； AAVrh74衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO 123或SEQ ID NO: 154)之452至461；或 AAVrh39衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 124)之452至461 該等序列繪示於圖8中。
4. 如實施例3之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物出現於緊接在AAV9衣殼之胺基酸殘基I451、N452、G453、S454、G455、Q456、N457、Q458、Q459、T460或L461中之一者之後，或緊接在對應於AAV9衣殼(SEQ ID NO:118)之胺基酸I451、N452、G453、S454、G455、Q456、N457、Q458、Q459、T460或L461之AAV衣殼中的胺基酸殘基之後，如根據圖8之胺基酸編號所比對。
5. 如任一前述實施例之rAAV衣殼蛋白，其中該異源蛋白係歸巢結構域、中和抗體表位或純化標籤。
6. 如實施例5之rAAV衣殼蛋白，其中該歸巢結構域係 神經組織歸巢結構域； 軸絲或細胞質動力蛋白歸巢結構域； 骨歸巢結構域； 腎歸巢結構域； 肌肉歸巢結構域； 內皮細胞歸巢結構域； 整聯蛋白受體結合結構域； 轉鐵蛋白受體結合結構域； 腫瘤細胞靶向結構域；或 視網膜細胞歸巢結構域。
7. 如實施例6之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括具有以下胺基酸序列之至少4個或至少7個鄰接胺基酸之動力蛋白肽或動力蛋白歸巢肽或由其組成：SITLVKSTQTV (SEQ ID NO: 21)、TILSRSTQTG (SEQ ID NO: 22)、VVMVGEKPITITQHSVETEG (SEQ ID NO: 25)、RSSEEDKSTQTT (SEQ ID NO: 26)、KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)、LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)、PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)、TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)、QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)、RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)、TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)、TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)、LGETTRP (SEQ ID NO: 15)或LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)。
8. 如實施例6之rAAV衣殼蛋白，其中來自該轉鐵蛋白受體結合結構域之該肽插入物包括胺基酸序列RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)或CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)之至少4個或至少7個鄰接胺基酸。
9. 如實施例6之rAAV衣殼蛋白，其中來自該視網膜細胞歸巢結構域之該肽插入物包括胺基酸序列LGETTRP (SEQ ID NO: 15)或LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)。
10.  如實施例9之rAAV衣殼蛋白，其中該LGETTRP (SEQ ID NO: 15)或LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)肽插入物出現於AAV8衣殼蛋白或AAV9衣殼蛋白中。
11.  如前述實施例中任一項之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入在AAV9衣殼蛋白中發生於該AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO:118)之胺基酸S454之後，或在AAV衣殼蛋白中發生於對應於該AAV9衣殼蛋白之S454之殘基之後，如根據圖8中之該胺基酸編號所比對。
12.  如前述實施例中任一項之rAAV衣殼蛋白，條件係該衣殼蛋白並非AAV2衣殼蛋白。
13.  一種核酸，其包括編碼如前述實施例中任一項之rAAV衣殼蛋白或編碼與其共有至少80%一致性之胺基酸序列之核苷酸序列。
14.  一種包裝細胞，其能夠表現如實施例13之核酸以產生包括由該核苷酸序列編碼之該衣殼蛋白之AAV載體。
15.  一種rAAV載體，其包括如實施例1至12中任一項之衣殼蛋白。
16.  如實施例15之rAAV載體，其進一步包括轉基因。
17.  一種醫藥組合物，其包括如實施例15或16之rAAV載體及醫藥上可接受之載劑。
18.  一種將轉基因遞送至細胞之方法，該方法包括使該細胞與如實施例16之rAAV載體接觸，其中將該轉基因遞送至該細胞。
19.  一種將轉基因遞送至有需要之個體之靶組織或靶細胞或其細胞基質之方法，該方法包括向該個體投與如實施例16之rAAV載體，其中將該轉基因遞送至該個體之該靶組織。
20.  一種用於將轉基因遞送至細胞之醫藥組合物，該組合物包括如實施例16之rAAV載體，其中使該細胞與該載體接觸。
21.  一種用於將轉基因遞送至有需要之個體之靶組織之醫藥組合物，該醫藥組合物包括如實施例16之rAAV載體，其中該肽插入物係歸巢肽且其中將該載體投與該個體。
22.  如實施例18至21之方法或使用之醫藥組合物，其中該rAAV載體係全身性、經靜脈內、經鞘內、經鼻內、經腹膜腔內或經玻璃體內投與。
23.  如實施例18至21之方法或使用之醫藥組合物，其中該靶組織或靶細胞或其細胞基質係： 神經組織，且該載體包括來自該神經組織歸巢結構域之肽插入物； 骨，且該載體包括來自該骨歸巢結構域之肽插入物； 腎，且該載體包括來自該腎歸巢結構域之肽插入物； 肌肉，且該載體包括來自該肌肉歸巢結構域之肽插入物； 內皮細胞，且該載體包括來自該內皮細胞歸巢結構域之肽插入物； 表現整聯蛋白受體之細胞，且該載體包括來自該整聯蛋白受體結合結構域之肽插入物； 表現轉鐵蛋白受體之腫瘤細胞，且該載體包括來自該轉鐵蛋白受體結合結構域之肽插入物；及 腫瘤細胞，且該載體包括來自該腫瘤細胞靶向結構域之肽插入物；或 視網膜細胞，且該載體包括來自該視網膜細胞歸巢結構域之肽插入物。
24.  一種重組腺相關病毒(rAAV)衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括來自選自由以下組成之群之異源蛋白或結構域之具有至少4個且最多20個鄰接胺基酸的肽插入物： 神經組織歸巢蛋白或結構域，條件係該肽插入物不包括序列TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)； 軸絲或細胞質動力蛋白歸巢結構域； 骨歸巢結構域； 腎歸巢結構域； 肌肉歸巢結構域； 內皮細胞歸巢結構域； 整聯蛋白受體結合結構域； 轉鐵蛋白受體結合結構域，條件係該肽插入物不包括序列RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)及CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)二者； 腫瘤細胞靶向結構域；及 視網膜細胞歸巢結構域，條件係該肽插入物不包括序列LGETTRP (SEQ ID NO: 15)及LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)二者。 其中在該衣殼蛋白包裝為AAV顆粒時，該肽插入物表面暴露。
25.  如實施例24之rAAV衣殼蛋白，其中該神經組織歸巢蛋白或視網膜細胞歸巢結構域係人類軸絲動力蛋白(HAD)重鏈尾部。
26.  如實施例25之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括至少4個且最多12個來自該HAD重鏈尾部之二聚合結構域之鄰接胺基酸。
27.  如實施例26之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括至少4個且最多12個來自由以下(繪示於圖7A至7M中)組成之群之鄰接胺基酸： (DYH1_HUMAN UniProtKB - Q9P2D7之aa 1至1542) (SEQ ID NO: 97)； (DYH2_HUMAN UniProtKB - Q9P225之aa 1至1764) (SEQ ID NO: 98)； (DYH3_HUMAN UniProtKB - Q8TD57之aa 1至1390) (SEQ ID NO: 99)； (DYH5_HUMAN UniProtKB - Q8TE73之aa 1至1941) (SEQ ID NO: 100)； (DYH6_HUMAN UniProtKB - Q9C0G6之aa 1至1433) (SEQ ID NO: 101)； (DYH7_HUMAN UniProtKB - Q8WXX0之aa 1至1289) (SEQ ID NO: 102)； (DYH8_HUMAN UniProtKB - Q96JB1之aa 1至1807) (SEQ ID NO: 103)； (DYH9_HUMAN UniProtKB - Q9NYC9之aa 1至1831) (SEQ ID NO: 104)； (DYH10_HUMAN UniProtKB - Q8IVF4之aa 1至1793) (SEQ ID NO: 105)； (DYH11_HUMAN UniProtKB - Q96DT5之aa 1至1854) (SEQ ID NO: 106)； (DYH12_HUMAN UniProtKB - Q6ZR08之aa 1至1214) (SEQ ID NO: 107)； (DYH14_HUMAN UniProtKB - Q0VDD8之aa 1至200) (SEQ ID NO: 108)；或 (DYH17_HUMAN UniProtKB - Q9UFH2之aa 1至1794) (SEQ ID NO: 109)。
28.  如實施例27之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括至少4個且最多12個來自任一軸絲動力蛋白重鏈序列(圖7A至7M)之殘基1至200之鄰接胺基酸。
29.  如實施例27之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括7個來自圖7A至7M之該等動力蛋白重鏈序列中之任一者之鄰接胺基酸。
30.  如實施例28之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括7個來自該等動力蛋白重鏈序列(圖7A至7M)中之任一者之殘基1至200之鄰接胺基酸
31.  如實施例25之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括以下中之一者之至少4個鄰接胺基酸： KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)； TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)； QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)； RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)； LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)； PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)；或 TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)。
32.  如實施例25之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物由來自以下中之一者之肽組成： KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)； TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)； QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)； RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)； LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)； PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)；或 TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)。
33.  如實施例32之rAAV衣殼蛋白，其中該肽體插入包括胺基酸序列TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)；
34.  如實施例24之rAAV衣殼蛋白，其中該神經組織歸巢蛋白係小鼠軸絲動力蛋白(MAD)重鏈尾部。
35.  如實施例24之rAAV衣殼蛋白，其中該神經組織歸巢結構域係結合先天性修復受體且並非紅血球生成性之EPO (促紅血球生成素)結構域或該結構域之構形類似物。
36.  如實施例35之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括至少4個且最多11個來自QEQLERALNSS (SEQ ID NO: 8)之鄰接胺基酸。
37.  如實施例36之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物係ARA290序列QEQLERALNSS (SEQ ID NO: 8)。
38.  如實施例24之rAAV衣殼蛋白，其中該神經組織歸巢蛋白係具有SRL (絲胺酸-精胺酸-離胺酸)基序之腦歸巢結構域。
39.  如實施例38之rAAV衣殼蛋白，其中來自該腦歸巢結構域之該肽插入物包括胺基酸序列LSSRLDA (SEQ ID NO: 10)或CLSSRLDAC (SEQ ID NO: 11)之至少7個鄰接胺基酸。
40.  如實施例24之rAAV衣殼蛋白，其中該軸絲或細胞質動力蛋白歸巢結構域係動力蛋白輕鏈歸巢結構域。
41.  如實施例40之rAAV衣殼蛋白，其中來自該動力蛋白輕鏈歸巢結構域之該肽插入物係SITLVKSTQTV (SEQ ID NO: 21)、TILSRSTQTG (SEQ ID NO: 22)、VVMVGEKPITITQHSVETEG (SEQ ID NO: 25)或RSSEEDKSTQTT (SEQ ID NO: 26)中之一者。
42.  如實施例24之rAAV衣殼蛋白，其中該骨歸巢蛋白係羥磷灰石(HA)結合結構域。
43.  如實施例42之rAAV衣殼蛋白，其中來自該羥磷灰石(HA)結合結構域之該肽插入物係序列DDDDDDDD (SEQ ID NO: 9)之至少6個胺基酸殘基。
44.  如實施例24之rAAV衣殼蛋白，其中該腎歸巢結構域係胺基酸序列CLPVASC (SEQ ID NO: 12)。
45.  如實施例44之rAAV衣殼蛋白，其中來自該腎歸巢結構域之該肽插入物係胺基酸序列LPVAS (SEQ ID NO: 13)或CLPVASC (SEQ ID NO: 12)。
46.    如實施例24之rAAV衣殼蛋白，其中來自該肌肉歸巢結構域之該肽插入物係胺基酸序列ASSLNIA (SEQ ID NO: 14)。
47.  如實施例24之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物係胺基酸序列QAVRTSL (SEQ ID NO: 23)或QAVRTSH (SEQ ID NO: 24)。
48.  如實施例24之rAAV衣殼蛋白，其中來自該內皮細胞歸巢結構域之該肽插入物係胺基酸序列SIGYPLP (SEQ ID NO: 28)。
49.  如實施例24之rAAV衣殼蛋白，其中來自該整聯蛋白結合結構域之該肽插入物具有胺基酸序列CDCRGDCFC (SEQ ID NO: 29)。
50.  如實施例24之rAAV衣殼蛋白，其中該轉鐵蛋白受體結合結構域係轉鐵蛋白結構域或其構形類似物或鐵模擬物。
51.  如實施例50之rAAV衣殼蛋白，其中來自該轉鐵蛋白結構域之該肽插入物包括來自序列HAIYPRH (SEQ ID NO: 17)或THRPPMWSPVWP (SEQ ID NO: 18)之至少4個鄰接胺基酸且最多12個鄰接胺基酸。
52.  如實施例51之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物係胺基酸序列HAIYPRH (SEQ ID NO: 17)或THRPPMWSPVWP (SEQ ID NO: 18)。
53.  如實施例24之rAAV衣殼蛋白，其中來自該腫瘤細胞靶向結構域之該肽插入物係胺基酸序列NGRAHA (SEQ ID NO: 30)。
54.  如實施例24至53中任一項之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物發生於緊接在以下胺基酸殘基中之一者之後(如圖8中所繪示)： AAV1衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 110)之138；262至272；450至459；或585至593； AAV2衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 111)之138；262至272；449至458；或584至592； AAV3衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 112)之138；262至272；449至459；或585至593； AAV4衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 113)之137；256至262；443至453；或583至591； AAV5衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 114)之137；252至262；442至445；或574至582； AAV6衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 115)之138；262至272；450至459；585至593； AAV7衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 116)之138；263至273；451至461；586至594； AAV8衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 117)之138；263至274；452至461；587至595； AAV9衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 118)之138；262至273；452至461；585至593； AAV9e衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 119)之138；262至273；452至461；585至593； AAVrh10衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 120)之138；263至274；452至461；587至595； AAVrh20衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 121)之138；263至274；452至461；587至595； AAVhu37衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 122)之138；263至274；452至461；587至595 AAVrh74衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 123或SEQ ID NO: 154)之138；263至274；452至461；587至595；或 AAVrh39衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 124)之138；263至274；452至461；587至595。
55.  一種重組AAV衣殼蛋白，其包括插入AAV9衣殼(SEQ ID NO:118)之胺基酸殘基588至589之間或如圖8中所比對對應於該AAV9衣殼之胺基酸殘基588至589之間的胺基酸序列TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)。
56.  一種重組AAV衣殼蛋白，其包括插入至緊接在AAV9衣殼(SEQ ID NO:118)之胺基酸I451至L461或S268中之一者或如圖8中所比對對應於該AAV9衣殼之胺基酸I451至L461或S268中之一者之後的胺基酸序列TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)。
57.  一種重組AAV衣殼蛋白，其包括插入AAV9衣殼(SEQ ID NO:118)之胺基酸殘基588至589之間或如圖8中所比對對應於該AAV9衣殼之胺基酸殘基588至589之間的胺基酸序列QEQLERALNSS (SEQ ID NO: 8)。
58. 一種重組AAV衣殼蛋白，其包括插入至緊接在AAV9衣殼(SEQ ID NO:118)之胺基酸I451至L461或S268中之一者或如圖8中所比對對應於該AAV9衣殼之胺基酸I451至L461或S268中之一者之後的胺基酸序列QEQLERALNSS (SEQ ID NO: 8)。
59.  如實施例24至54中任一項之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物出現於緊接在如圖8中所比對對應於AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO:118)之胺基酸451至461、S268或Q588中之一者的胺基酸殘基之後。
60   如實施例59之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物出現於緊接在該AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO:118)之胺基酸451至461中之一者之後。
61.  如實施例24至53中任一項之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物出現於第8可變區(VR-VIII)中。
62.  如實施例24至61中任一項之rAAV衣殼蛋白，條件係該衣殼蛋白並非AAV2衣殼蛋白。
63.  一種核酸，其包括編碼如實施例24至62中任一項之rAAV衣殼蛋白或編碼與其共有至少80%一致性之胺基酸序列之核苷酸序列。
64.  一種包裝細胞，其能夠表現如實施例63之核酸以產生包括由該核苷酸序列編碼之該衣殼蛋白之AAV載體。
65.  一種rAAV載體，其包括如實施例24至62中任一項之衣殼蛋白。
66.  如實施例65之rAAV載體，其進一步包括轉基因。
67.  一種醫藥組合物，其包括如實施例65或66之rAAV載體及醫藥上可接受之載劑。
68.  一種將轉基因遞送至細胞之方法，該方法包括使該細胞與如實施例66之rAAV載體接觸，其中將該轉基因遞送至該細胞。
69.  一種將轉基因遞送至有需要之個體之靶組織之方法，該方法包括向該個體投與如實施例66之rAAV載體，其中將該轉基因遞送至該個體。
70.  一種用於將轉基因遞送至細胞之醫藥組合物，該醫藥組合物包括如實施例66之rAAV載體，其中將該轉基因遞送至該細胞。
71.  一種用於將轉基因遞送至有需要之個體之靶組織之醫藥組合物，該醫藥組合物包括如實施例66之rAAV載體；其中將轉基因遞送至該靶組織。
72.  如實施例68至71之方法或使用之醫藥組合物，其中該rAAV載體係全身性、經靜脈內、經鞘內、經鼻內、經腹膜腔內或經玻璃體內投與。
73.  如實施例68至71之方法或使用之醫藥組合物，其中該載體係經由腰部穿刺或經由小腦延髓池來投與。
74.  一種重組腺相關病毒(rAAV)衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括具有至少4個來自TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)、RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)、CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)、LGETTRP (SEQ ID NO: 15)或LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)中之一者之鄰接胺基酸之肽插入物；
其中該肽插入物出現於緊接在如圖8中所比對對應於AAV9衣殼蛋白之胺基酸268、454或588之胺基酸殘基之後。
75.  如實施例74之rAAV衣殼蛋白，條件係該衣殼蛋白並非AAV2衣殼蛋白。
76.  如實施例74之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括位於該AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO:118)之胺基酸殘基454與455之間之胺基酸序列TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)。
77.  如實施例74之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括緊接在該AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO:118)之胺基酸殘基262至273中之一者之後的胺基酸序列TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)。
78.  如實施例74之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括位於AAV8衣殼蛋白(SEQ ID NO:117)之胺基酸殘基454至455之間之胺基酸序列LGETTRP (SEQ ID NO: 15)。
79.  如實施例78之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括胺基酸序列LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)。
80.  如實施例74之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括插入AAV8衣殼蛋白(SEQ ID NO:117)之胺基酸殘基590至591之間之胺基酸序列LGETTRP (SEQ ID NO: 15)。
81.  如實施例80之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括胺基酸序列LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)。
82.  如實施例74之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括緊接在AAV8衣殼蛋白(SEQ ID NO:117)之胺基酸殘基263至274中之一者之後的胺基酸序列LGETTRP (SEQ ID NO: 15)。
83.  如實施例82之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括胺基酸序列LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)。
84.  一種核酸，其包括編碼如實施例74至83中任一項之rAAV衣殼蛋白或編碼與其共有至少80%一致性之胺基酸序列之核苷酸序列。
85.  一種包裝細胞，其能夠表現如實施例84之核酸以產生包括由該核苷酸序列編碼之該衣殼蛋白之AAV載體。
86.  一種rAAV載體，其包括如實施例74至83中任一項之衣殼蛋白。
87.  如實施例86之rAAV載體，其進一步包括轉基因。
88.  一種醫藥組合物，其包括如實施例86或87之rAAV載體及醫藥上可接受之載劑。
89.  一種將轉基因遞送至細胞之方法，該方法包括使該細胞與如實施例86或87之rAAV載體接觸，其中將該轉基因遞送至該細胞。
90.  一種將轉基因遞送至有需要之個體之靶組織之方法，該方法包括向該個體投與如實施例86或87之rAAV載體，其中將該轉基因遞送至該靶組織。
91.  一種用於將轉基因遞送至細胞之醫藥組合物，該醫藥組合物包括如實施例86或87之rAAV載體，其中將該轉基因遞送至該細胞。
92.  一種用於將轉基因遞送至有需要之個體之靶組織之醫藥組合物，該醫藥組合物包括如實施例86或87之rAAV載體，其中將該轉基因遞送至該靶組織。
93.  如實施例89至92之方法或使用之醫藥組合物，其中該靶組織係視網膜細胞且該肽插入物包括胺基酸序列LGETTRP (SEQ ID NO: 15)或LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)。
94.  如實施例89至93之方法或使用之醫藥組合物，其中該rAAV載體係全身性、經靜脈內、經鞘內、經鼻內、經腹膜腔內或經玻璃體內投與。
95.  如實施例89至93之方法或使用之醫藥組合物，其中該載體係經由腰部穿刺或經由小腦延髓池來投與。
96.  一種重組AAV衣殼蛋白，其相對於野生型或未工程改造衣殼蛋白包括一或多個胺基酸取代，其中該rAAV衣殼蛋白係具有A269S胺基酸取代之AAV8衣殼蛋白(SEQ ID NO:117)或係具有S263G/S269R/A273T取代或W503R或Q474A取代或另一AAV類型衣殼之衣殼蛋白中之相應取代的AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO:118)。
97.  如實施例96之重組AAV衣殼蛋白，其進一步包括498-NNN/AAA-500 (對於AAV8衣殼蛋白)或496-NNN/AAA-498 (對於AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO:118))或另一AAV類型衣殼之衣殼蛋白中之相應取代。
98.  一種核酸，其包括編碼如實施例96或97之rAAV衣殼蛋白或編碼與其共有至少80%一致性之胺基酸序列之核苷酸序列。
99.  一種包裝細胞，其能夠表現如實施例98之核酸以產生包括由該核苷酸序列編碼之該衣殼蛋白之AAV載體。
100.  一種rAAV載體，其包括如實施例96或97中任一項之衣殼蛋白。
101.  如實施例100之rAAV載體，其進一步包括轉基因。
102.  一種醫藥組合物，其包括如實施例100或101之rAAV載體及醫藥上可接受之載劑。
103.  一種將轉基因遞送至細胞之方法，該方法包括使該細胞與如實施例101之rAAV載體接觸，其中將該轉基因遞送至該細胞。
104.  一種將轉基因遞送至有需要之個體之靶組織之方法，該方法包括向該個體投與如實施例101之rAAV載體，其中將該轉基因遞送至該靶組織。
105.  一種用於將轉基因遞送至細胞之醫藥組合物，該醫藥組合物包括如實施例101之rAAV載體，其中將該轉基因遞送至該細胞。
106.  一種用於將轉基因遞送至有需要之個體之靶組織之醫藥組合物，該醫藥組合物包括如實施例101之rAAV載體，其中將該轉基因遞送至該靶組織。
107.  如實施例102至106之方法或使用之醫藥組合物，其中該rAAV載體係全身性、經靜脈內、經鞘內、經鼻內、經腹膜腔內或經玻璃體內投與。
108.  如實施例102至106之方法或使用之醫藥組合物，其中該載體係經由腰部穿刺或經由小腦延髓池來投與。
提供重組腺相關病毒(rAAV)，其具有經工程改造以包含賦予及/或增強期望性質(例如rAAV基因體之組織靶向、轉導及整合)之胺基酸序列之衣殼蛋白。特定而言，提供經工程改造衣殼蛋白，其在病毒衣殼之可變區IV (VR-IV)內或其附近包括來自異源蛋白之具有4至20或7個鄰接胺基酸及在實施例中不超過12個鄰接胺基酸之肽插入物，從而在衣殼蛋白包裝為AAV顆粒時肽插入物表面暴露。亦提供重組衣殼蛋白及包括其之rAAV，其具有(例如)來自人類軸絲動力蛋白中重鏈尾部區域之二聚合結構域之靶向特定組織及/或促進rAAV細胞攝取、轉導及/或基因體整合之插入肽及如本文所闡述的其他者(參見表1A及1B)。
亦提供具有本文所闡述之一或多個促進轉導及/或組織嗜性之胺基酸取代之經工程改造衣殼。亦提供包括衣殼蛋白之重組載體以及其醫藥組合物、編碼衣殼蛋白之核酸以及製備衣殼蛋白及具有經工程改造衣殼之rAAV載體及使用其來靶向遞送、改良轉導及/或治療與靶組織有關之病症的方法。特定而言，提供包括rAAV之組合物及使用衣殼蛋白之方法，該等衣殼蛋白包括衍生自促紅血球生成素或動力蛋白之肽或與動力蛋白有關者以使rAAV靶向視網膜及/或神經組織(包含中樞神經系統)，且促進了用於治療神經病症及/或眼睛、尤其視網膜之病症之治療劑之遞送。亦提供包括rAAV之組合物以及其使用方法，該等rAAV包括靶向或歸巢於靶組織(例如骨、腎、肌肉、肺、視網膜及心臟)之肽插入物。 5.1.  定義
術語「AAV」或「腺相關病毒」係指小病毒科(Parvoviridae)病毒屬內之依賴性細小病毒(Dependoparvovirus)。AAV可為衍生自天然「野生型」病毒之AAV、衍生自包裝至包括由天然cap基因所編碼衣殼蛋白之衣殼中之rAAV基因體及/或包裝至包括由非天然衣殼cap基因所編碼衣殼蛋白之衣殼中之rAAV基因體的AAV。後者之一實例包含具有在天然衣殼之胺基酸序列中包括肽插入物之衣殼蛋白的rAAV。
術語「rAAV」係指「重組AAV」。在一些實施例中，重組AAV具有其中rep及cap基因中之一部分或全部已經異源性序列代替之AAV基因體。
術語「rep-cap輔助質體」係指提供病毒rep及cap基因功能且有助於自缺乏功能rep及/或cap基因之rAAV基因體序列產生AAV之質體。
術語「cap基因」係指編碼形成或幫助形成病毒之衣殼外殼之衣殼蛋白之核酸序列。對於AAV而言，衣殼蛋白可為VP1、VP2或VP3。
術語「rep基因」係指編碼病毒複製及產生所需之非結構蛋白之核酸序列。
如本文中所使用，術語「核酸」及「核苷酸序列」包含DNA分子(例如cDNA或基因體DNA)、RNA分子(例如mRNA)、DNA及RNA分子之組合或雜合DNA/RNA分子及DNA或RNA分子之類似物。可使用(例如)核苷酸類似物(包含(但不限於)肌苷或三苯甲基化鹼基)來生成該等類似物。該等類似物亦可包括含有賦予該等分子有益屬性(例如核酸酶抗性或增加穿越細胞膜之能力)之經修飾骨架之DNA或RNA分子。核酸或核苷酸序列可為單鏈、雙鏈，可含有單鏈及雙鏈部分二者，且可含有三鏈部分，但較佳係雙鏈DNA。
如本文中所使用，術語「個體」、「宿主」及「患者」可互換使用。如本文中所使用，個體係哺乳動物，例如非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)及靈長類動物(例如猴及人類)或(在某些實施例中)人類。
如本文中所使用，術語「治療劑」係指任一可用於治療、管控或改善與疾病或病症有關之症狀之藥劑，其中疾病或病症與擬由轉基因提供之功能有關。如本文中所使用，「治療有效量」係指在投與患有靶疾病或病症之個體時在治療或管控該靶疾病或病症中提供至少一種治療性益處之藥劑之量(例如由轉基因表現之產物之量)。另外，關於本發明藥劑之治療有效量意指在治療或管控疾病或病症中提供至少一種治療性益處之藥劑(單獨或與其他療法組合)之量。
如本文中所使用， 術語「防治劑」係指任一可用於預防疾病或病症、延遲或減緩其進展之藥劑，其中該疾病或病症與擬由轉基因提供之功能有關。如本文中所使用，「防治有效量」係指在投與易患靶疾病或病症之個體時在預防或延遲該靶疾病或病症中提供至少一種防治性益處之防治劑之量(例如由轉基因表現之產物之量)。防治有效量亦可係指足以預防或延遲靶疾病或病症之發生或減緩靶疾病或病症之進展之藥劑的量；足以延遲或最小化靶疾病或病症之發作之量；或足以預防或延遲其復發或擴散之量。防治有效量亦可係指足以預防或延遲靶疾病或病症症狀之惡化之藥劑之量。另外，關於本發明防治劑之防治有效量意指在預防或延遲疾病或病症中提供至少一種防治性益處之防治劑(單獨或與其他藥劑組合)之量。
可將本發明防治劑投與「易患」靶疾病或病症之個體。「易患」疾病或病症之個體係展示與疾病或病症發生有關之症狀者，或具有此一疾病或病症之基因組成、環境暴露或其他風險因子但其中該等症狀尚未處於之診斷為疾病或病症之程度者。舉例而言，具有與缺失基因(擬由轉基因提供)有關之疾病之家族史之患者可視為易患該疾病者。另外，在去除原發性腫瘤之後持續存在休眠腫瘤之患者可視為易於復發腫瘤者。
本文所用之「中樞神經系統」 (「CNS」)係指循環藥劑在穿越血腦障壁之後所到達之神經組織，且包含(例如)腦、視神經、顱神經及脊髓。CNS亦包含腦脊髓液，腦脊髓液填充脊髓之中央管以及腦心室。 5.2.  重組AAV衣殼及載體
一態樣係關於重組腺相關病毒(rAAV)之衣殼蛋白，該衣殼蛋白經工程改造以包括來自並非AAV蛋白之異源蛋白之肽插入物，其中在包裝為AAV顆粒時該肽插入物表面暴露。在一些實施例中，肽插入物出現於AAV9衣殼之可變區IV (VR IV)內(亦即在兩個胺基酸之間且並不缺失任何衣殼胺基酸)，或發生於另一類型AAV衣殼之相應區域中(參見圖 8 中之比對)。在一些實施例中，肽插入物出現於AAV9衣殼之可變區VIII (VR-VIII)內(亦即在兩個胺基酸之間且並不缺失任何衣殼胺基酸)，或發生於另一AAV類型之衣殼之相應區域中(參見圖 8 中之比對)。在一些實施例中，肽插入物係來自異源蛋白或結構域(其並非AAV衣殼蛋白或結構域)，其將rAAV顆粒引導至靶組織及/或促進rAAV攝取、轉導及/或基因體整合。亦提供編碼經工程改造衣殼蛋白及其變體之核酸、用於表現核酸以產生rAAV載體之包裝細胞、進一步包括轉基因之rAAV載體及rAAV載體之醫藥組合物以及使用rAAV載體將轉基因遞送至有需要之個體之靶細胞類型或靶組織的方法。
在各個實施例中，靶組織可為神經組織、骨、腎、肌肉、眼睛/視網膜或內皮組織或特定受體或腫瘤，且肽插入物係衍生自特異性識別及/或結合該組織或(例如)一或多個特定細胞類型(例如在靶組織內)或其細胞基質之異源蛋白或結構域。特定而言，衍生自促紅血球生成素或動力蛋白(尤其軸絲動力蛋白或細胞質動力蛋白之重鏈二聚合結構域)或結合至插入任何表面暴露之可變區中之細胞質動力蛋白或與其締合之肽可使rAAV靶向神經組織，包含穿越血腦障壁到達CNS且遞送用於治療神經病症之治療劑。 5.2.1   具有肽插入物之rAAV載體
本發明者令人吃驚地發現適用於AAV9衣殼VR-IV環(參見圖 2 )內及其附近及其他AAV類型衣殼之VR-IV環上之相應區域中之肽插入的位置。儘管先前研究分析了各種AAV中之潛在位置，但無人將AAV9 VR-IV鑑別為適用於此目的(例如參照Wu等人，2000, 「Mutational Analysis of the Adeno-Associated Virus Type 2 (AAV2) Capsid Gene and Construction of AAV2 Vectors with Altered Tropism,」J of Virology 74(18):8635-8647；Lochrie等人，2006, 「Adeno-associated virus (AAV) capsid genes isolated from rat and mouse liver genomic DNA define two new AAV species distantly related to AAV-5,」Virology 353:68-82；Shi及Bartlett, 2003, 「RGD Inclusion in VP3 Provides Adeno-Associated Virus Type 2 (AAV2)-Based Vectors with a Heparan Sulfate-Independent Cell Entry Mechanism,」Molecular Therapy 7(4):515525-；Nicklin等人，2001, 「Efficient and Selective AAV2-Mediated Gene Transfer Directed to Human Vascular Endothelial Cells」Molecular Therapy 4(2):174-181；Grifman等人，2001, 「Incorporation of Tumor-Targeting Peptides into Recombinant Adeno-associated Virus Capsids,」Molecular Therapy 3(6):964-975；Girod等人，1999, 「Genetic capsid modifications allow efficient re-targeting of adeno-associated virus type 2,」Nature Medicine 3(9):1052-1056；Douar等人，2003, 「Deleterious effect of peptide insertions in a permissive site of the AAV2 capsid,」Virology 309:203-208；及Ponnazhagan等人，2001,J. of Virology 75(19):9493-9501)。
因此，提供在新穎插入點處、尤其在衣殼外殼中之表面暴露之可變區內、尤其在衣殼蛋白之可變區IV內或其附近攜載肽插入物的rAAV載體。在一些實施例中，rAAV衣殼蛋白在緊接在對應於AAV9衣殼蛋白(胺基酸序列SEQ ID NO:118且參見圖 8 中其他AAV血清型之衣殼蛋白胺基酸序列與AAV9衣殼之胺基酸序列之比對)之胺基酸451至461中之一者的胺基酸殘基之後(亦即由肽鍵C-末端連結)包括肽插入物，其中在衣殼蛋白包裝為AAV顆粒時該肽插入物表面暴露。肽插入不應刪除AAV衣殼蛋白之任何殘基。通常，肽插入物出現於衣殼蛋白之可變(保守性較差)區(與其他血清型相比)及表面暴露之環中。
闡述為插入既定位點「處」之肽插入係指插入緊接在通常發現於野生型病毒中之該位點處之殘基之後，亦即具有至其羧基之肽鍵。舉例而言，AAV9中之Q588處之插入意指，肽插入出現於AAV9野生型衣殼蛋白序列(SEQ ID NO:118)中之Q588與後續胺基酸(A589)之間。在實施例中，在插入點處或其附近(在5、10、15個殘基內或在作為插入位點之結構環內)並不缺失胺基酸殘基。
在特定實施例中，衣殼蛋白係AAV9衣殼蛋白且插入物出現於緊接在胺基酸殘基451至461中之至少一者之後。在特定實施例中，肽插入物出現於緊接在AAV9衣殼(胺基酸序列SEQ ID NO: 118)之胺基酸I451、N452、G453、S454、G455、Q456、N457、Q458、Q459、T460或L461之後。在某些實施例中，肽插入AAV9衣殼蛋白之殘基S454與G455之間或除AAV9衣殼蛋白(胺基酸序列SEQ ID NO: 118)外之AAV衣殼蛋白中對應於S454及G455之殘基之間。
在其他實施例中，提供包括靶向肽之經工程改造衣殼蛋白，該等靶向肽與衣殼蛋白異源且插入AAV衣殼蛋白中，從而在納入AAV載體中時，異源肽表面暴露。該等肽較佳地來自人類軸絲動力蛋白(HAD)重鏈尾部或係下文表1A及1B中所列示者或用於特定組織類型之其他靶向肽。
在其他實施例中，衣殼蛋白係來自至少一種選自以下AAV血清型之AAV類型：血清型1 (AAV1)、血清型2 (AAV2)、血清型3 (AAV3)、血清型4 (AAV4)、血清型5 (AAV5)、血清型6 (AAV6)、血清型7 (AAV7)、血清型8 (AAV8)、血清型rh8 (AAVrh8)、血清型9e (AAV9e)、血清型rh10 (AAVrh10)、血清型rh20 (AAVrh20)、血清型rh39 (AAVrh39)、血清型hu.37 (AAVhu.37)及血清型rh74 (AAVrh74，形式1及2) (參見圖 8 )，且插入物出現於緊接在對應於胺基酸殘基451至461中之至少一者之胺基酸殘基之後。該等不同AAV血清型之比對(如圖 8 中所展示) 指示不同衣殼胺基酸序列中之「相應」胺基酸殘基，從而「相應」胺基酸殘基與參考序列中之殘基在相同比對位置處對齊。在一些特定實施例中，在圖 8 中所繪示之序列中，肽插入物出現於緊接在以下各項內之胺基酸殘基中之一者之後：AAV1衣殼(SEQ ID NO: 110)之450至459；AAV2衣殼(SEQ ID NO: 111)之449至458；AAV3衣殼(SEQ ID NO: 112)之449至459；AAV4衣殼(SEQ ID NO: 113)之443至453；AAV5衣殼(SEQ ID NO: 114)之442至445；AAV6衣殼(SEQ ID NO: 115)之450至459；AAV7衣殼(SEQ ID NO: 116)之451至461；AAV8衣殼(SEQ ID NO: 117)之451至461；AAV9衣殼(SEQ ID NO: 118)之451至461；AAV9e衣殼(SEQ ID NO: 119)之452至461；AAVrh10衣殼(SEQ ID NO: 120)之452至461；AAVrh20衣殼(SEQ ID NO: 121)之452至461；AAVhu.37 (SEQ ID NO: 122)之452至461；AAVrh74 (SEQ ID NO: 123或SEQ ID NO: 154)之452至461；或AAVrh39 (SEQ ID NO: 124)之452至461。在某些實施例中，rAAV衣殼蛋白包括緊接在AAV9衣殼蛋白(具有SEQ ID NO:118之胺基酸序列且參見圖 8 )之胺基酸588之後(亦即C-末端連接)之肽插入物，其中在衣殼蛋白包裝為AAV顆粒時該肽插入物表面暴露。在其他實施例中，rAAV衣殼蛋白具有並不緊接在AAV9之胺基酸588之後或對應於AAV9之胺基酸588之肽插入物。
在其他實施例中，在肽係表1A及1B中包含至少4個鄰接胺基酸或至少7個鄰接胺基酸或恰好7個鄰接胺基酸但(在實施例中)不超過12個鄰接胺基酸之靶向肽或其功能片段時，衣殼蛋白係來自至少一種選自以下AAV血清型之AAV類型：血清型1 (AAV1)、血清型2 (AAV2)、血清型3 (AAV3)、血清型4 (AAV4)、血清型5 (AAV5)、血清型6 (AAV6)、血清型7 (AAV7)、血清型8 (AAV8)、血清型rh8 (AAVrh8)、血清型9e (AAV9e)、血清型rh10 (AAVrh10)、血清型rh20 (AAVrh20)、血清型rh39 (AAVrh39)、血清型hu.37 (AAVhu.37)及血清型rh74 (AAVrh74，形式1及2) (參見圖 8 )，且肽插入衣殼蛋白中任一使得在納入AAV載體中時肽表面暴露之點處。在具體實施例中，肽插入以下位置之後：AAV1衣殼(SEQ ID NO: 110)之138、262至272、450至459或585至593；AAV2衣殼(SEQ ID NO: 111)之138、262至272、449至458或584至592；AAV3衣殼(SEQ ID NO: 112)之138、262至272、449至459或585至593；AAV4衣殼(SEQ ID NO: 113)之137、256至262、443至453或583至591；AAV5衣殼(SEQ ID NO: 114)之137、252至262、442至445或574至582；AAV6衣殼(SEQ ID NO: 115)之138、262至272、450至459、585至593；AAV7衣殼(SEQ ID NO: 116)之138、263至273、451至461、586至594；AAV8衣殼(SEQ ID NO: 117)之138、263至274、452至461、587至595；AAV9衣殼(SEQ ID NO: 118)之138、262至273、452至461、585至593；AAV9e衣殼(SEQ ID NO: 119)之138、262至273、452至461、585至593；AAVrh10衣殼(SEQ ID NO: 120)之138、263至274、452至461、587至595；AAVrh20衣殼(SEQ ID NO: 121)之138、263至274、452至461、587至595；AAVrh74衣殼(SEQ ID NO: 123或SEQ ID NO: 154)之138、263至274、452至461、587至595；AAVhu37衣殼(SEQ ID NO: 122)之138、263至274、452至461、587至595；或AAVrh39衣殼(SEQ ID NO: 124)之138、263至274、452至461、587至595 (如圖 8 中所編號)。
在一些實施例中，衣殼蛋白係來自除血清型AAV2外之AAV。在一些實施例中，肽插入物不出現於緊接在對應於AAV2衣殼蛋白之胺基酸570或611之胺基酸殘基之後。在一些實施例中，肽插入物不出現於對應於AAV2衣殼蛋白之胺基酸587至588之胺基酸殘基之間(參見頒予Schaffer等人之US 2014/0294771)。在一些實施例中，具有胺基酸序列DDDDDDDD (SEQ ID NO: 9)之骨1肽之插入物不出現於緊接在AAV2衣殼蛋白之胺基酸138之後(參見Alméciga-Díaz等人，2018,Pediatr. Res . 84:545 )。
亦提供包括經工程改造衣殼之AAV載體。在一些實施例中，AAV載體係非複製性的且不包含編碼rep或cap蛋白之核苷酸序列(該等核苷酸序列在rAAV載體之製造中係由包裝細胞供應)。在一些實施例中，基於AAV之載體包括來自一或多種AAV血清型之組分。在一些實施例中，本文所提供之基於AAV之載體包括來自以下中之一或多者的衣殼組分：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他rAAV顆粒或其兩者或更多者之組合。在一些實施例中，本文所提供之基於AAV之載體包括來自以下中之一或多者的組分：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他rAAV顆粒或其兩種或更多種血清型之組合。在一些實施例中，rAAV顆粒包括與(例如)選自以下之AAV衣殼血清型之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更大程度一致(例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即最高100%一致)之衣殼蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、 AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其衍生物、修飾或假型。該等經工程改造AAV載體可包括含有編碼治療蛋白之轉基因之基因體。
在特定實施例中，用於本文之組合物及方法中之重組AAV係c80或Anc80L65 (例如參見Zinn等人，2015,Cell Rep . 12(6): 1056-1068，其全部內容以引用方式併入本文中)。在特定實施例中，用於本文之組合物及方法中之重組AAV係AAV.7m8 (包含其變體) (例如參見US 9,193,956；US 9,458,517；US 9,587,282；US 2016/0376323及WO 2018/075798，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中)。在特定實施例中，用於本文之組合物及方法中之AAV係US 9,585,971中所揭示之任一AAV (例如AAV-PHP.B)。在特定實施例中，用於本文之組合物及方法中之AAV係AAV2/Rec2或AAV2/Rec3載體，其具有衍生自AAV8及血清型cy5、rh20或rh39之雜合衣殼序列(例如參見Issa等人，2013, PLoS One 8(4): e60361，關於該等載體之內容以引用方式併入本文中)。在特定實施例中，用於本文之組合物及方法中之AAV係下列案件中之任一者中所揭示的AAV：US 7,282,199；US 7,906,111；US 8,524,446；US 8,999,678；US 8,628,966；US 8,927,514；US 8,734,809；US9,284,357；US 9,409,953；US 9,169,299；US 9,193,956；US 9,458,517；US 9,587,282；US 2015/0374803；US 2015/0126588；US 2017/0067908；US 2013/0224836；US 2016/0215024；US 2017/0051257；PCT/US2015/034799；及PCT/EP2015/053335，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV顆粒具有與下列專利及專利申請案中之任一者中所揭示之AAV衣殼之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更大程度一致(例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即最高100%一致)的衣殼蛋白：美國專利第7,282,199號；第7,906,111號；第8,524,446號；第8,999,678號；第8,628,966號；第8,927,514號；第8,734,809號；第US 9,284,357號；第9,409,953號；第9,169,299號；第9,193,956號；第9,458,517號；及第9,587,282號；美國專利申請案公開案第2015/0374803號；第2015/0126588號；第2017/0067908號；第2013/0224836號；第2016/0215024號；第2017/0051257號；及國際專利申請案第PCT/US2015/034799號；第PCT/EP2015/053335號，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，rAAV顆粒包括美國專利第9,840,719號及WO 2015/013313中所揭示之任一AAV衣殼(例如AAV.Rh74及RHM4-1)，該等案件中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV顆粒包括WO 2014/172669中所揭示之任一AAV衣殼(例如AAV rh.74)，該案件之全部內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV顆粒包括AAV2/5衣殼，如Georgiadis等人，2016, Gene Therapy 23: 857-862及Georgiadis等人，2018, Gene Therapy 25: 450中所闡述，每一文獻之全部內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV顆粒包括WO 2017/070491中所揭示之任一AAV衣殼(例如AAV2tYF)，該案件之全部內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV顆粒包括AAVLK03或AAV3B衣殼，如Puzzo等人，2017, Sci. Transl. Med. 29(9): 418中所闡述，該文獻之全部內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV顆粒包括美國專利第8,628,966號、第US 8,927,514號、第US 9,923,120號及WO 2016/049230中所揭示之任一AAV衣殼(例如HSC1、HSC2、HSC3、HSC4、HSC5、HSC6、HSC7、HSC8、HSC9、HSC10、HSC11、HSC12、HSC13、HSC14、HSC15或HSC16)，每一文獻之全部內容以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，rAAV顆粒具有以下案件中所揭示之衣殼蛋白：國際申請公開案第WO 2003/052051號(例如參見´051公開案之SEQ ID NO: 2)、第WO 2005/033321號(例如參見´321公開案之SEQ ID NO: 123及88)、第WO 03/042397號(例如參見´397公開案之SEQ ID NO: 2、81、85及97)、第WO 2006/068888號(例如參見´888公開案之SEQ ID NO: 1及3至6)、第WO 2006/110689號(例如參見´689公開案之SEQ ID NO: 5至38)、第WO2009/104964號(例如參見´964公開案之SEQ ID NO: 1至5、7、9、20、22、24及31)、第WO 2010/127097號(例如參見´097公開案之SEQ ID NO: 5至38)及第WO 2015/191508號(例如參見´508公開案之SEQ ID NO: 80至294)及美國申請公開案第20150023924號(例如參見´924公開案之SEQ ID NO: 1、5至10)，每一案件之內容以引用引用方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV顆粒具有與以下案件中所揭示之AAV衣殼之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更大程度一致(例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即最高100%一致)之衣殼蛋白：國際申請公開案第WO 2003/052051號(例如參見´051公開案之SEQ ID NO: 2)、第WO 2005/033321號(例如參見´321公開案之SEQ ID NO: 123及88)、第WO 03/042397號(例如參見´397公開案之SEQ ID NO: 2、81、85及97)、第WO 2006/068888號(例如參見´888公開案之SEQ ID NO: 1及3至6)、第WO 2006/110689號(例如參見´689公開案之SEQ ID NO: 5至38)、第WO2009/104964號(例如參見964公開案之SEQ ID NO: 1至5、7、9、20、22、24及31)、第WO 2010/127097號(例如參見´097公開案之SEQ ID NO: 5至38)及第WO 2015/191508號(例如參見´508公開案之SEQ ID NO: 80至294)及美國申請公開案第20150023924號(例如參見´924公開案之SEQ ID NO: 1、5至10)。
在其他實施例中，rAAV顆粒包括假型AAV衣殼。在一些實施例中，假型AAV衣殼係rAAV2/8或rAAV2/9假型AAV衣殼。業內已知產生及使用假型rAAV顆粒之方法(例如參見Duan等人，J. Virol., 75:7662-7671 (2001)；Halbert等人，J. Virol., 74:1524-1532 (2000)；Zolotukhin等人，Methods 28:158-167 (2002)；及Auricchio等人，Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001)。
在某些實施例中，可使用單鏈AAV (ssAAV)。在某些實施例中，可使用自我互補性載體(例如scAAV) (例如參見 Wu, 2007,Human Gene Therapy , 18(2):171-82；McCarty等人，2001,Gene Therapy , 8(16):1248-1254；US 6,596,535；US 7,125,717；及US 7,456,683，每一文獻之全部內容以引用方式併入本文中)。
通常，肽插入物係來自異源蛋白或其結構域之鄰接胺基酸之序列。擬插入肽通常足夠長以保留衍生其之蛋白質或結構域之特定生物功能、特性或特徵。擬插入肽通常足夠短以容許衣殼蛋白形成類似或實質上類似於天然無插入衣殼蛋白之外殼。在較佳實施例中，肽插入物具有約4至約30個胺基酸殘基之長度、約4至約20、約4至約15、約5至約10或約7個胺基酸之長度。插入用肽序列之長度為至少4個胺基酸且長度可為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。在一些實施例中，肽序列之長度為16、17、18、19或20個胺基酸。在實施例中，肽長度不超過7個胺基酸、10個胺基酸或12個胺基酸。
AAV衣殼蛋白中之「來自異源蛋白之肽插入物」係指已引入衣殼蛋白中且並非任一AAV血清型衣殼之天然部分的胺基酸序列。非限制性實例包含AAV衣殼蛋白中之人類蛋白質之肽。
在一些實施例中，肽插入物係來自歸巢蛋白或其歸巢結構域或其靶向蛋白或靶向結構域。「歸巢結構域」或「歸巢蛋白」係較其他細胞、組織、器官或腫瘤優先地或選擇性靶向特定細胞類型(包含特定細胞類型之細胞基質)、組織類型、器官、腫瘤類型或諸如此類之結構域或蛋白質。在本發明之上下文中，來自歸巢蛋白或結構域之肽賦予插入衣殼蛋白中以形成衣殼外殼或AAV載體之一部分之肽，該肽然後可引導衣殼、外殼或載體靶向特定細胞類型、組織類型、器官、腫瘤類型或諸如此類或以促進AAV基因體之攝取及/或整合。歸巢蛋白或結構域之非限制性實例包含神經組織歸巢結構域、軸絲或細胞質動力蛋白歸巢結構域、骨歸巢結構域、腎歸巢結構域、肌肉歸巢結構域、內皮細胞歸巢結構域、視網膜細胞歸巢結構域、靶向特定細胞受體之結構域(例如整聯蛋白受體結合結構域及轉鐵蛋白受體結合結構域)、腫瘤細胞靶向結構域、來自其他病毒之靶向肽及諸如此類。如本文中所使用，術語「歸巢」及「靶向」可互換使用。該等肽亦可或替代地促進rAAV細胞攝取、轉導及/或靶組織細胞中之基因體整合。
用作本文所闡述任一AAV衣殼位點之肽插入物之肽實例呈現於下文表 1A 至 1B 中且包含具有肽功能屬性之其至少4胺基酸鄰接部分或其7胺基酸鄰接部分及在一些實施例中不超過12個鄰接胺基酸。亦例如參見Laakkonen及Vuorinen, 2010, 「Homing peptides as targeted delivery vehicles,」Integrative Biology , 2:326-337 (綜述文章)。在某些實施例中，重組AAV衣殼及AAV載體經工程改造以包含來自下文表 1A 及 1B 中之任一者之肽或其至少4、5、6或7胺基酸鄰接部分，該肽或部分以顯示肽插入物之方式插入AAV衣殼序列中。在其他實施例中，肽插入AAV9衣殼(SEQ ID NO: 118)之胺基酸序列中位置138、262至273、451至461或585至593或任一其他AAV血清型中對應於該等位置之位置處之胺基酸殘基之後(參見圖 8 之衣殼序列比對)。 表1A. 歸巢肽
肽序列 ( 胺基酸編號 ) SEQ ID NO: 名稱 靶組織 靶細胞 受體
CLSSRLDAC (9) 11 SRL 腦 NR NR
CLPVASC (7) 12    腎 NR NR
CGFERVRQCPERC (13) 31 GFE-1 肺 肺泡毛細管 膜二肽酶
CGFELETC (8) 32 GFE-2       (MDP)
CVALCREACGEGC (13) 33    皮膚 真皮下血管 NR
SWCEPGWCR (9) 34    胰臟，亦歸巢至子宮 子宮、外分泌胰臟及胰島之毛細管及較大血管 NR
YSGKWGW (7) 35    腸 NR NR
GSLGGRS (7) 36    子宮 NR NR
LMLPRAD (7) 37    腎上腺 NR NR
CKCCRAKDC (9) 38    白色脂肪 血管 抑制素
ASSLNIA (7) 14    肌肉 肌纖維 NR
SMSIARL (7) 39 SMS 前列腺 NR NR
CRPPR (5) 40    心臟 血管 CRIP2；HLP；ESP-1
CKRAVR (5) 41    心臟 血管 Sigirr；TIRS
CPKTRRVPC (9) 42    心臟 血管 bc10
CRSTRANPC (9) 43    心臟 血管 MpcII-3
CARPAR (6) 44    心臟 血管 EST
CPGPEGAGC (9) 45    乳房 血管 胺基肽酶P
表1B
肽序列 SEQ ID NO: 名稱 靶
DDDDDDDD 9 骨1 骨
LSSRLDA 10 腦1 腦
CLSSRLDAC 11 腦2 腦
SITLVKSTQTV 21 DLC-AS1 動力蛋白輕鏈
TILSRSTQTG 22 DLC-AS2 動力蛋白輕鏈
VVMVGEKPITITQHSVETEG 25 DLC-AS3 動力蛋白輕鏈
RSSEEDKSTQTT 26 DLC-AS4 動力蛋白輕鏈
KSTEDKSTQTP 46    動力蛋白輕鏈
LGHFTRSTQTS 47    動力蛋白輕鏈
GVQMAKSTQTF 48    動力蛋白輕鏈
PKTRNSQTQTD 49    動力蛋白輕鏈
VTTQNTASQTM 50    動力蛋白輕鏈
KSSQDKSTQTTGD 51    動力蛋白輕鏈
KMQVPFQ 1 DYH1 動力蛋白肽；神經元、腦及視網膜細胞
TLAAPFK 2 hDyn或DYH3 動力蛋白肽；神經元、腦及視網膜細胞
LKLPPIV 5 DYH12.1 動力蛋白肽；神經元、腦及視網膜細胞
PFIKPFE 6 DYH12.2 動力蛋白肽；神經元、腦及視網膜細胞
TLSLPWK 7 DYH17 動力蛋白肽；神經元、腦及視網膜細胞
QQAAPSF 3 DYH7 動力蛋白肽；神經元、腦及視網膜細胞
RYNAPFK 4 DYH8 動力蛋白肽；神經元、腦及視網膜細胞
QEQLERALNSS 8 EPO-HBSP ARA290
DYKDDDDK 52 FLAG 無(FLAG)
LPVAS 13 腎1 腎
CLPVASC 12 腎2 腎
ASSLNIA 14 肌肉1 肌肉
TLAVPFK 27 PHP.B Ly-6a結合結構域
QAVRTSL 23 PHP.S
QAVRTSH 24 PHP.SH
HAIYPRH 17 TfR1 轉鐵蛋白受體
THRPPMWSPVWP 18 TfR2 轉鐵蛋白受體
RTIGPSV 19 TfR3 轉鐵蛋白受體
CRTIGPSVC 20 TfR4 轉鐵蛋白受體
LGETTRP 15 視網膜細胞1 視網膜細胞
LALGETTRP 16 視網膜細胞2 視網膜細胞
在另一態樣中，提供異源肽插入庫。異源肽插入庫係指在病毒衣殼中之不同插入位點處(例如在衣殼之既定可變區內之不同位置處)攜載相同肽插入物之rAAV載體之集合體。通常，所用衣殼蛋白包括含有經修飾rep及cap序列以防止病毒在其通常可複製條件下發生複製(共感染哺乳動物細胞以及諸如腺病毒等輔助病毒)之AAV基因體。然後可分析肽插入庫之成員之rAAV表面上之肽功能顯示、組織靶向及/或基因轉導。
本發明者亦令人吃驚地發現，可使用特定肽使AAV載體再靶向特定組織、器官或細胞；尤其係使得rAAV載體靶向視網膜組織及/或穿越血腦障壁並靶向CNS神經組織之肽。不受限於任一理論，插入AAV衣殼可變區環中之某些肽(例如動力蛋白及轉鐵蛋白源肽)顯示可增強腦或視網膜中之轉導效率及/或增強攜載轉基因之AAV顆粒在內皮細胞基質中、尤其在富層黏蛋白基底膜(例如血腦障壁及視網膜之內限界膜)中之傳輸。此可增強衣殼化轉基因之AAV顆粒在內皮細胞基質中之傳輸。該等肽及其他肽闡述於下文中。 5.2.2   神經組織歸巢肽
本發明之另一態樣係關於包括經設計以賦予或增強親神經性性質之肽插入物之衣殼蛋白。神經組織包含(但不限於)神經元、星形細胞、神經膠質、內皮細胞及保護腦之富層黏蛋白基底細胞基質。本發明涉及工程改造rAAV衣殼以顯示促進神經元組織靶向及神經元轉導之肽。實例包含(i)來自人類軸絲動力蛋白(HAD)重鏈尾部之區域或小鼠軸絲動力蛋白(MAD)重鏈尾部之區域之肽；(ii)來自結合先天性修復受體且並非紅血球生成性之促紅血球生成素(EPO)結構域或該結構域之構形類似物之肽；及(iii)腦靶向肽。 5.2.2.1    rAAV-HAD載體
在某些實施例中，肽插入物係衍生自人類軸絲動力蛋白(HAD)重鏈尾部之區域之肽，且使用該插入物作為神經組織歸巢肽(或神經細胞歸巢肽)及/或視網膜細胞歸巢肽(其態樣更詳細地論述於下文中)。在本文中稱為「HAD肽」之肽可為來自HAD重鏈尾部區域或經設計以模擬其三維結構之構形類似物之至少4個連續胺基酸的序列。包括一或多個(例如)插入AAV衣殼外殼之表面暴露之環中之HAD肽的重組AAV載體在本文中稱為「rAAV-HAD載體」。
動力蛋白係沿微管移動之細胞骨架馬達蛋白。存在兩個基本類型：(1)細胞質動力蛋白及(2)軸絲動力蛋白。細胞質動力蛋白用於傳輸細胞內負荷且移動有絲分裂紡錘體上之染色體。細胞質動力蛋白通常呈現為兩條相同重鏈及若干條中鏈及輕鏈之二聚體。軸絲動力蛋白使得微管滑動於軸絲(包含纖毛及鞭毛中之結構)中。軸絲動力蛋白係以含有一條、兩條或三條不同重鏈之多種形式發現。
人類軸絲動力蛋白(HAD)之整體結構涉及「尾部」及「頭部」區域。尾部包括募集負荷以供沿微管傳輸之二聚合結構域。頭部包括由6個AAA結構域(三重ATP酶)構成之馬達結構域，該等AAA結構域「生成力」且驅動動力蛋白馬達發生附著及分離，且由此沿微管表面「行走」。亦參見Toda等人，2018,Biophysical Rev 10:677-686；Reck-Peterson, 2018,Nat Rev Mol Cell Biol ；Reck-Peterson等人，2006, 「Single-Molecule Analysis of Dynein Processivity and Stepping Behavior,」Cell 126:335-348；Urnavicius, 2018,Nature 554:202；Urnavicius, 2015,Science 347:1441；及Zhang等人，2017,Cell 169:1303。另外，例如參見Roberts等人，2013, 「Functions and mechanics of dynein motor proteins」Nat Rev Mol Cell Biol ., 14(11):713-726；Wadsworth等人，2013, 「Microtubule Motors:  Doin; It without Dynactin,」Curr Biol 23(13):R563-R565；Kelkar等人，2006, 「A Common Mechanism for Cytoplasmic Dynein-Dependent Microtubule Binding Shared among Adeno-Associated Virus and Adenovirus Serotypes,」J. of Virology , 7781-7785；及Zhang等人，2017, 「Cryo-EM Reveals How Human Cytoplasmic Dynein Is Auto-Inhibited and Activated,」Cell , 169:1303-1314。
表 2 鑑別人類軸絲動力蛋白之尾部及二聚合結構域以及用作本文所闡述之經工程改造衣殼蛋白中之肽插入物的肽。在一些實施例中，使用來自莖部/尾部區域及/或二聚合結構域(NDD)之軸絲動力蛋白序列之至少4個且最多15個鄰接胺基酸或7個鄰接胺基酸之插入物(亦參見圖 7A 至 7M )。 表2.軸絲動力蛋白肽
UniProt 莖部/尾部序列 NDD序列 肽 SEQ ID NO:
DYH1_HUMAN (Q9P2D7) (SEQ ID NO: 97) 1至1542 1至200 K174 MQVPFQ 1
DYH2_HUMAN (Q9P225) (SEQ ID NO: 98) 1至1764 1至200      
DYH3_HUMAN (Q8TD57) (SEQ ID NO: 99) 1至1390 1至200 T92 LAAPFK 2
DYH5_HUMAN (Q8TE73) (SEQ ID NO: 100) 1至1941 1至200      
DYH6_HUMAN (Q9C0G6) (SEQ ID NO: 101) 1至1433 1至200      
DYH7_HUMAN (Q8WXX0) (SEQ ID NO: 102) 1至1289 1至200 Q55 QAAPSF 3
DYH8_HUMAN (Q96JB1) (SEQ ID NO: 103) 1至1807 1至200 R1465 YNAPFK 4
DYH9_HUMAN (Q9NYC9) (SEQ ID NO: 104) 1至1831 1至200      
DYH10_HUMAN (Q8IVF4) (SEQ ID NO: 105) 1至1793 1至200      
DYH11_HUMAN (Q96DT5) (SEQ ID NO: 106) 1至1854 1至200      
DYH12_HUMAN (Q6ZR08) (SEQ ID NO: 107) 1至1214 1至200 L18 KLPPIV P879 FIKPFE 5 6
DYH14_HUMAN (Q0VDD8) (SEQ ID NO: 108)    1至200      
DYH17­_HUMAN (Q9UFH2) (SEQ ID NO: 109) 1至1794 1至200 T854 LSLPWK 7
在一些實施例中，用於插入AAV衣殼中之肽係自HAD重鏈尾部區域之二聚合結構域(NDD)所設計。在替代實施例中，可使用對應於HAD重鏈尾部之其他部分(亦即排除動力蛋白馬達結構域)之胺基酸序列之肽。在一些實施例中，肽插入物包括來自HAD重鏈尾部之二聚合結構域之至少4個(在一實施例中7個)鄰接胺基酸且最多12或15個鄰接胺基酸。在特定實施例中，肽插入物包括來自由以下(繪示於圖 7A 至 7M 中)組成之群之至少4個鄰接胺基酸、係7個鄰接胺基酸且最多12或15個鄰接胺基酸：DYH1_HUMAN UniProtKB - Q9P2D7 (SEQ ID NO: 97)之胺基酸(「aa」) 1至1542；DYH2_HUMAN UniProtKB - Q9P225 (SEQ ID NO: 98)之aa 1至1764；DYH3_HUMAN UniProtKB - Q8TD57 (SEQ ID NO: 99)之aa 1至1390；DYH5_HUMAN UniProtKB - Q8TE73 (SEQ ID NO: 100)之aa 1至1941；DYH6_HUMAN UniProtKB - Q9C0G6 (SEQ ID NO: 101)之aa 1至1433；DYH7_HUMAN UniProtKB - Q8WXX0 (SEQ ID NO: 102)之aa 1至1289；DYH8_HUMAN UniProtKB - Q96JB1 (SEQ ID NO: 3)之aa 1至1807；DYH9_HUMAN UniProtKB - Q9NYC9 (SEQ ID NO: 104)之aa 1至1831；DYH10_HUMAN UniProtKB - Q8IVF4 (SEQ ID NO: 105)之aa 1至1793；DYH11_HUMAN UniProtKB - Q96DT5 (SEQ ID NO: 106)之aa 1至1854；DYH12_HUMAN UniProtKB - Q6ZR08 (SEQ ID NO: 107)之aa 1至1214；DYH14_HUMAN UniProtKB - Q0VDD8 (SEQ ID NO: 108)之aa 1至200；及DYH17¬_HUMAN UniProtKB - Q9UFH2 (SEQ ID NO: 109)之aa 1至1794)，且促進了經工程改造以含有該肽之衣殼之神經組織嗜性及/或轉導。在更佳實施例中，肽插入物包括來自上文所列舉任一動力蛋白重鏈序列、任一來自由以下組成之群者之殘基1至200之至少4個鄰接胺基酸、係7個鄰接胺基酸且最多12或15個鄰接胺基酸：DYH1_HUMAN UniProtKB - Q9P2D7 (SEQ ID NO: 97)之aa 1至1542；DYH2_HUMAN UniProtKB - Q9P225 (SEQ ID NO: 98)之aa 1至1764；DYH3_HUMAN UniProtKB - Q8TD57 (SEQ ID NO: 99)之aa 1至1390；DYH5_HUMAN UniProtKB - Q8TE73 (SEQ ID NO: 100)之aa 1至1941；DYH6_HUMAN UniProtKB - Q9C0G6 (SEQ ID NO: 101)之aa 1至1433；DYH7_HUMAN UniProtKB - Q8WXX0 (SEQ ID NO: 102)之aa 1至1289；DYH8_HUMAN UniProtKB - Q96JB1 (SEQ ID NO: 3)之aa 1至1807；DYH9_HUMAN UniProtKB - Q9NYC9 (SEQ ID NO: 104)之aa 1至1831；DYH10_HUMAN UniProtKB - Q8IVF4 (SEQ ID NO: 105)之aa 1至1793；DYH11_HUMAN UniProtKB - Q96DT5 (SEQ ID NO: 106)之aa 1至1854；DYH12_HUMAN UniProtKB - Q6ZR08 (SEQ ID NO: 107)之aa 1至1214；DYH14_HUMAN UniProtKB - Q0VDD8 (SEQ ID NO: 108)之aa 1至200；及DYH17¬_HUMAN UniProtKB - Q9UFH2 (SEQ ID NO: 109)之aa 1至1794))，且促進經工程改造以含有該肽之衣殼之神經組織或特異性神經細胞嗜性及/或轉導。在更佳實施例中，肽插入物係來自圖 7A 至 7M 之任一動力蛋白重鏈序列之7個鄰接胺基酸，或係來自任一動力蛋白重鏈序列(圖 7A 至 7M )之殘基1至200之7個鄰接胺基酸。
在特定實施例中，肽插入物係來自由以下組成之群之至少4、5、6或7個鄰接胺基酸或由其組成：KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)、TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)、QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)、RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)、LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)、PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)及TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)；且可促進經工程改造以含有該肽之衣殼之神經組織嗜性及/或轉導。在更特定實施例中，肽插入物由來自由以下組成之群之肽組成：KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)、TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)、QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)、RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)、LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)、PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)及TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)，且促進經工程改造以含有該肽之衣殼之神經組織嗜性及/或轉導。在尤其關注之一實施例中，肽插入物包括胺基酸序列TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)或由其組成。
不期望受限於任一理論，本發明之rAAV-HAD載體係基於如下原理：納入肽之rAAV衣殼將在rAAV表面上顯示多個拷貝之人類動力蛋白二聚合結構域。當轉導靶人類細胞時，該等rAAV可直接或經由藉由細胞中之動力蛋白轉接子進行募集來加載於靶細胞中之內源性軸絲動力蛋白上。將該等rAAV加載於軸絲動力蛋白上可促進動力蛋白多聚化及/或穩定動力蛋白構形以增強傳輸活性。
選擇來自人類軸絲重鏈動力蛋白之肽結構域來納入AAV衣殼中以促進rAAV結合至動力蛋白本身儘管違反直覺，但可提供以下若干優點： (1)軸絲動力蛋白出現於睫狀神經元中，且由此本發明之rAAV-HAD載體可在含有該等結構之感覺神經元、嗅覺神經元、聽覺神經元及光感受器中顯示增強之親神經性性質。靶向軸絲動力蛋白(與出現於所有細胞中之細胞質動力蛋白不同)亦可賦予神經組織增加之選擇性； (2)令人吃驚地，重鏈二聚合肽不干擾軸絲動力蛋白馬達結構域之活性(與之相比，先前嘗試不能使用合成動力蛋白輕鏈(LC8)肽來工程改造AAV2衣殼以靶向細胞質動力蛋白，例如參見 Bergen等人，2007, 「Evaluation of an LC8-Binding Peptide for the Attachment of Artificial Cargo,」 Mol Pharm 4(1): 119-128；及Xu等人，2005, 「A combination of mutations enhances the neurotropism of AAV2,」Virology , 341: 203-214)。 (3)本文所用之HAD肽對應於人類蛋白且其免疫原性應小於合成肽(例如用於Terwilliger, 2005, Virol 341:203中；亦參見WO 2016/119150 A2)；且應在人類個體中發揮作用(不同於選擇用於小鼠中之含有隨機化肽群體之先前技術AAV9衣殼-例如參見 Hordeaux等人，2018 Mol Ther 26:664, 「The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B are limited to C57BL/6J Mice」；Matsuzaki等人，2018, Neurosci Lett 665: 182-188 「Intravenous administration of the AAV-PHP.B capsid fails to upregulate transduction efficiency in the marmoset brain」)。
特定而言，在將HAD肽工程改造至AAV衣殼(例如AAV9、AAVrh10及AAVrh20，其對CNS顯示強嗜性)中時，遞送效率及至CNS之遞送進一步得以增強。亦參見Castle等人，2014, 「Long-distance Axonal Transport of AAV9 is Driven by Dynein and Kinesin-2 and Is Trafficked in a Highly Motile Rab7-positive Compartment」Molecular Therapy , 22(3):554-566。
可將HAD肽插入AAV衣殼中(例如)容許表面暴露肽之位點處(例如在可變表面暴露環內)，且在其他實例中插入本文所闡述對應於AAV9之VR-I、VR-IV或VR-VIII之位點處。在一些實施例中，包括HAD肽之rAAV載體穿越血腦障壁且到達CNS。
在一些實施例中，使用來自小鼠軸絲動力蛋白(MAD)重鏈尾部之肽。MAD重鏈尾部亦提供神經組織歸巢結構域，該等結構域可衍生用於插入AAV衣殼蛋白中且用於再引導rAAV穿越血腦障壁並靶向CNS組織之肽(亦參見Deverman等人，2016, 「Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain」Nat Biotechnology , 34(2):204-209)。
在一些實施例中，神經組織歸巢結構域包括胺基酸序列TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)；且自其衍生之肽插入物包括TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)序列或由其組成。在一些實施例中，肽插入物包括來自TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)之4、5或6個連續胺基酸或由其組成。在特定實施例中，衣殼蛋白係AAV9衣殼蛋白且TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)插入物出現於緊接在胺基酸殘基451至461中之至少一者之後。在特定實施例中，TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)插入物出現於AAV9衣殼(SEQ ID NO: 118)之胺基酸殘基I451、N452、G453、S454、G455、Q456、N457、Q458、Q459、T460或L461之後，且在某些實施例中係在AAV9衣殼之S454之後。在其他實施例中，衣殼蛋白係來自至少一種選自以下之AAV類型：AAV血清型1 (AAV1)、血清型2 (AAV2)、血清型3 (AAV3)、血清型4 (AAV4)、血清型5 (AAV5)、血清型6 (AAV6)、血清型7 (AAV7)、血清型8 (AAV8)、血清型rh8 (AAVrh8、血清型9e (AAV9e)、血清型rh10 (AAVrh10)、血清型rh20 (AAVrh20)、血清型rh39 (AAVrh39)、血清型hu.37 (AAVhu.37)及血清型rh74 (AAVrh74，形式1及2) (參見圖 8 )，且TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)肽插入物出現於緊接在AAV衣殼中對應於AAV9衣殼之胺基酸殘基451至461中之一者之胺基酸殘基之後。該等不同AAV血清型之比對(如圖 8 中所展示)指示不同胺基酸序列中之相應胺基酸殘基。在一些特定實施例中，在圖 8 中所繪示之序列中，TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)肽插入物出現於緊接在以下各項內之胺基酸殘基中之一者之後：AAV1衣殼之450至459；AAV2衣殼之449至458；AAV3衣殼之449至459；AAV4衣殼之443至453；AAV5衣殼之442至445；AAV6衣殼之450至459；AAV7衣殼之451至461；AAV8衣殼之451至461；AAV9衣殼之451至461；AAV9e衣殼之452至461；AAVrh10衣殼之452至461；AAVrh20衣殼之452至461；或AAVhu.37之452至461。在一些實施例中，TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)肽插入物出現於緊接在對應於AAV9衣殼蛋白之588之胺基酸殘基之後(參見圖 8 )，其中在衣殼蛋白包裝為AAV顆粒時該肽插入物表面暴露。
在一些實施例中，TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)肽插入物不出現於頒予Deverman等人之US 2015/0079038中所闡述之任一位點中，尤其(但不限於)不插入AAV衣殼蛋白之VR-VIII中，更尤其地不插入AAV衣殼蛋白中對應於AAV9 (SEQ ID NO: 118)之胺基酸588至589之間之位置處，或不插入對應於AAV9之胺基酸586至592 (包含587、588、589或590)之胺基酸中之一者之後(如圖 8 中所繪示)。在其他實施例中，衣殼蛋白中之任一位點處之肽插入物不包括肽TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)或肽QAVRTSL (SEQ ID NO: 23)或肽TLAGPFK (SEQ ID NO: 53)或由其組成。在其他實施例中，肽插入物不包括插入AAV衣殼蛋白之VR-VIII環中之肽TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)或肽QAVRTSL (SEQ ID NO: 23)或肽TLAGPFK (SEQ ID NO: 53)或由其組成，更尤其地不插入AAV衣殼蛋白中對應於AAV9之胺基酸588至589之間之位置處，或不插入對應於AAV9之胺基酸586至592 (包含587、588、589或590)之胺基酸中之一者之後(如圖 8 中所繪示)。 5.2.2.2    rAAV-EPO載體
在某些實施例中，肽插入物係衍生自促紅血球生成素(EPO)之區域之肽。在本文中稱為「EPO肽」之肽可為來自EPO結構域(其結合IRR但並非紅血球生成性)或經設計以模擬該結構域之三維結構之構形類似物之連續胺基酸的序列。包括一或多個(例如)插入AAV衣殼外殼之表面暴露之環中之EPO肽的重組AAV載體在本文中稱為「rAAV-EPO載體」。
促紅血球生成素(EPO)主要產生於腎中且幫助增加因應於低氧之紅血球產生。已發現，EPO亦(例如)藉由受體調介之細胞攝入來穿越血腦障壁，且在全身性投與高劑量後可檢測於腦脊髓液中。亦發現，EPO對CNS施加保護效應，亦即減少發炎、防止神經元損害且促進修復(例如參見 Cerami, 2001, 「Beyond erythropoiesis: novel applications for 重組human erythropoietin,」Semin Hematol . 38(3-增刊7): 33-39)。然而，為減小紅血球生成之有害副效應及血栓形成風險，研發非紅血球生成形式(包含ARA290)。ARA290係EPO (一種11胺基酸合成肽)之非紅血球生成類似物，其結合先天性修復受體(IRR) (區別於因應於低氧、損傷、發炎或腦損害而表現之紅血球生成性受體之EPO受體)，且在保護腦組織中施加治療效應(例如參見 Chen等人，2013, 「Therapeutic effects of nonerythropoietic erythropoietin analog ARA290 in experimental autoimmune encephalomyelitis rat,」J of Neuroimmunology , 268:64-70；Collino等人，2015, 「Flipping the molecular switch for innate protection and repair of tissues: Long-lasting effects of a non-erythropoietic small peptide engineered from erythropoietin,」Pharmacology & Therapeutics , 151:32-40；及Liu等人，2014, 「Erythropoietin-derived non-erythropoietic ameliorates experimental autoimmune neuritis by inflammation suppression and tissue protection,」PLOS One , 9(3):1-10)。
在本發明之一些實施例中，衍生自EPO之肽插入物包括至少4個且最多20個鄰接胺基酸及在某些實施例不超過12個鄰接胺基酸，該等鄰接胺基酸係來自並非紅血球生成性且結合先天性修復受體(IRR)之促紅血球生成素胺基酸序列或模型於4至20個非鄰接胺基酸上之合成肽，該等非鄰接胺基酸形成並非紅血球生成性且結合先天性修復受體(IRR)之促紅血球生成素構形類似物。在具體實施例中，肽插入物包括來自具有胺基酸序列QEQLERALNSS (SEQ ID NO: 8)之合成肽「ARA290」之至少4個且最多11個鄰接胺基酸及較佳地7個鄰接胺基酸。在某些實施例中，肽插入物包括ARA290序列QEQLERALNSS (SEQ ID NO: 8)或由其組成。在一些實施例中，EPO肽包括低唾液酸化EPO (hsEPO)或具有一或多個胺基酸修飾以增加其血清半衰期之hsEPO或由其組成。
EPO肽可插入AAV衣殼中(例如)容許表面暴露肽之位點處(例如在可變表面暴露環內及在其他實例中AAV衣殼蛋白中之本文所闡述對應於AAV9之VR-I、VR-IV或VR-VIII之位點)，或可插入VP2之第一胺基酸之後，例如緊接在胺基酸137之後(AAV4、AAV4-4及AAV5)或緊接在胺基酸138之後(AAV1、AAV2、AAV3、AAV3-3、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9e、rh.10、rh.20、rh.39、rh.74v1、rh.74v2及hu.37) (圖 8 )。在一些實施例中，包括EPO肽之rAAV載體穿越血腦障壁且到達CNS。在rAAV中使用EPO肽可提供以至少兩種方式減少發炎之額外優點。首先，藉由結合IRR，rAAV-EPO載體觸發個體之抗發炎性反應，由此抵消可源自向個體引入外來藥劑(rAAV載體)之發炎。其次，ARA290已知具有相對較短半衰期，此有利於快速清除且由此減小觸發發炎之時間。 5.2.2.3    rAAV-SRL載體
在某些實施例中，肽插入物係衍生自具有SRL (絲胺酸-精胺酸-離胺酸)基序之腦歸巢結構域區域之肽。在本文中稱為「SRL肽」之肽可為來自以下二者之連續胺基酸的序列：具有靶向腦組織之SRL基序之結構域；或經設計以模擬該結構域之三維結構之構形類似物。包括一或多個(例如)插入AAV衣殼外殼之表面暴露之環中之SRL肽的重組AAV載體在本文中稱為「rAAV-SRL載體」。
已報導腦歸巢肽家族，其中該家族中之每一肽含有公共胺基酸基序SRL (絲胺酸-精胺酸-白胺酸)，但含有不同側接胺基酸序列(例如參見US 5,622,699)。在一些實施例中，來自該腦歸巢結構域之肽插入物包括來自序列CLSSRLDAC (SEQ ID NO: 11)之至少4、5、6、7、8或所有9個胺基酸，尤其包含SRL基序。在一些實施例中，肽插入物包括序列CLSSRLDAC (SEQ ID NO: 11)或由其組成。
已發現，某些歸巢肽中之兩個半胱胺酸殘基可皆缺失，此並不顯著影響肽之器官歸巢活性。舉例而言，具有序列LSSRLDA (SEQ ID NO: 10)之肽亦可為腦歸巢肽。測定半胱胺酸殘基或半胱胺酸殘基之N-末端或C-末端胺基酸殘基對於肽之器官歸巢活性之必要性的方法係常規方法且在業內已眾所周知。因此，在一些實施例中，肽插入物包括來自序列LSSRLDA (SEQ ID NO: 10)之至少4、5、6或所有7個胺基酸。在一些實施例中，肽插入物包括序列LSSRLDA (SEQ ID NO: 10)或由其組成。
SRL肽可插入AAV衣殼中(例如)容許表面暴露肽之位點處(例如在可變表面暴露環內及在其他實例中本文所闡述對應於AAV9之VR-I、VR-IV或VR-VIII之位點)，或可插入VP2之第一胺基酸之後，例如緊接在胺基酸137之後(AAV4、AAV4-4及AAV5)或緊接在胺基酸138之後(AAV1、AAV2、AAV3、AAV3-3、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9e、rh.10、rh.20、rh.39、rh.74v1、rh.74v2及hu.37) (圖 8 )。在一些實施例中，包括SRL肽之rAAV載體穿越血腦障壁且到達CNS。 5.2.3   細胞質動力蛋白歸巢肽
本發明之另一態樣係關於包括經設計以賦予或增強細胞質動力蛋白歸巢之肽插入物之衣殼蛋白。實例包含衍生自細胞質動力蛋白歸巢結構域(例如動力蛋白輕鏈歸巢結構域)之區域之肽(例如參見 Midoux等人，2017, 「Peptides mediating DNA transport on microtubules and their impact on non-viral gene transfer efficiency,」Bioscience Reports (綜述文章)，37 BSR20170995)。在本文中稱為「細胞質動力蛋白歸巢肽」之肽可為來自蛋白質中細胞質動力蛋白歸巢區域或經設計以模擬其三維結構之構形類似物之連續胺基酸的序列。該等肽包含SITLVKSTQTV (SEQ ID NO: 21) (或者CITLVKSTQTV (SEQ ID NO: 54))、TILSRSTQTG (SEQ ID NO: 22)、VVMVGEKPITITQHSVETEG (SEQ ID NO: 25)、RSSEEDKSTQTT (SEQ ID NO: 26)、KSTEDKSTQTP (SEQ ID NO: 46)、LGHFTRSTQTS (SEQ ID NO: 47)、GVQMAKSTQTF (SEQ ID NO: 48)、PKTRNSQTQTD (SEQ ID NO: 49)、VTTQNTASQTM (SEQ ID NO: 50)及KSSQDKSTQTTGD (SEQ ID NO: 51)。蛋白質中與細胞質動力蛋白之輕鏈締合之肽或結構域可具有基序TQT (蘇胺酸-麩醯胺酸-蘇胺酸)或STQT (絲胺酸-蘇胺酸-麩醯胺酸-蘇胺酸) (SEQ ID NO: 55)或甚至KSTQT (離胺酸-絲胺酸-蘇胺酸-麩醯胺酸-蘇胺酸) (SEQ ID NO: 56)。因此，在某些實施例中，細胞質動力蛋白歸巢肽係含有TQT、STQT (SEQ ID NO: 55)或KSTQT (SEQ ID NO: 56)基序且具有細胞質動力蛋白歸巢活性之肽之一部分。
在一些實施例中，來自該動力蛋白輕鏈歸巢結構域之肽插入物包括序列SITLVKSTQTV (SEQ ID NO: 21)之至少4、5、6、7、8、9、10或所有11個連續胺基酸，較佳地含有TQT、STQT (SEQ ID NO: 55)或KSTQT (SEQ ID NO: 56)基序及/或具有細胞質動力蛋白歸巢活性。在一些實施例中，肽插入物由序列SITLVKSTQTV (SEQ ID NO: 21)之至少4、5、6、7、8、9、10或所有11個連續胺基酸組成，較佳地含有TQT、STQT (SEQ ID NO: 55)或KSTQT (SEQ ID NO: 56)基序及/或具有細胞質動力蛋白歸巢活性。
在一些實施例中，來自該動力蛋白輕鏈歸巢結構域之肽插入物包括序列TILSRSTQTG (SEQ ID NO: 22)之至少4、5、6、7、8、9或所有10個連續胺基酸，較佳地含有TQT或STQT (SEQ ID NO: 55)基序及/或具有細胞質動力蛋白歸巢活性。在一些實施例中，肽插入物由序列TILSRSTQTG (SEQ ID NO: 22)之至少4、5、6、7、8、9或所有10個連續胺基酸組成，較佳地含有TQT或STQT (SEQ ID NO: 55)基序及/或具有細胞質動力蛋白歸巢活性。
在一些實施例中，來自該動力蛋白輕鏈歸巢結構域之肽插入物包括序列VVMVGEKPITITQHSVETEG (SEQ ID NO: 25)之至少4個且最多所有20個連續胺基酸。在一些實施例中，肽插入物由序列VVMVGEKPITITQHSVETEG (SEQ ID NO: 25)之至少4個且最多所有20個連續胺基酸組成。在一些實施例中，肽插入物包括序列VVMVGEKPITITQHSVETEG (SEQ ID NO: 25)之7、8、9、10、11、12、13或14或15個連續胺基酸或由其組成。
在一些實施例中，來自該動力蛋白輕鏈歸巢結構域之肽插入物包括序列RSSEEDKSTQTT (SEQ ID NO: 26)之至少4、5、6、7、8、9、10、11或所有12個連續胺基酸，較佳地含有TQT、STQT (SEQ ID NO: 55)或KSTQT (SEQ ID NO: 56)基序及/或具有細胞質動力蛋白歸巢活性。在一些實施例中，肽插入物由序列RSSEEDKSTQTT (SEQ ID NO: 26)之至少4、5、6、7、8、9、10、11或12個連續胺基酸組成，較佳地含有TQT、STQT (SEQ ID NO: 55)或KSTQT (SEQ ID NO: 56)基序及/或具有細胞質動力蛋白歸巢活性。
在一些實施例中，來自該動力蛋白輕鏈歸巢結構域之肽插入物包括具有序列KSTEDKSTQTP (SEQ ID NO: 46)、LGHFTRSTQTS (SEQ ID NO: 47)、GVQMAKSTQTF (SEQ ID NO: 48)、PKTRNSQTQTD (SEQ ID NO: 49)、VTTQNTASQTM (SEQ ID NO: 50)或KSSQDKSTQTTGD (SEQ ID NO: 51)之肽中之一者之至少4、5、6、7、8、9、10、11或12個連續胺基酸，較佳地含有TQT、STQT (SEQ ID NO: 55)或KSTQT (SEQ ID NO: 56)基序及/或具有細胞質動力蛋白歸巢活性。在一些實施例中，肽插入物由具有序列KSTEDKSTQTP (SEQ ID NO: 46)、LGHFTRSTQTS (SEQ ID NO: 47)、GVQMAKSTQTF (SEQ ID NO: 48)、PKTRNSQTQTD (SEQ ID NO: 49)、VTTQNTASQTM (SEQ ID NO: 50)或KSSQDKSTQTTGD (SEQ ID NO: 51)之肽中之一者之至少4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個連續胺基酸組成，較佳地含有TQT、STQT (SEQ ID NO: 55)或KSTQT (SEQ ID NO: 56)基序及/或具有細胞質動力蛋白歸巢活性。
細胞質動力蛋白歸巢肽可插入AAV衣殼中(例如)容許表面暴露肽之位點處(例如在可變表面暴露環內及在其他實例中本文所闡述對應於AAV9之VR-IV或VR-VIII之位點)，或可插入VP2之第一胺基酸之後，例如緊接在胺基酸137之後(AAV4、AAV4-4及AAV5)或緊接在胺基酸138之後(AAV1、AAV2、AAV3、AAV3-3、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9e、rh.10、rh.20、rh.39、rh.74v1、rh.74v2及hu.37) (圖 8 )。 5.2.4   骨歸巢肽
本發明之另一態樣係關於包括經設計以賦予或增強骨歸巢性質之肽插入物之衣殼蛋白。實例包含來自蛋白質之骨結合結構域或該結構域之構形類似物之肽。來自骨結合或骨歸巢結構域之肽稱為骨歸巢肽(骨組織歸巢或骨細胞或細胞基質歸巢)。
在某些實施例中，肽插入物可為來自靶向骨組織之HA結合結構域或經設計以模擬該結構域之三維結構之構形類似物之連續胺基酸的序列。舉例而言， L-Asp之6至8殘基片段已展示可增強酶至羥磷灰石之靶向(例如參見 Nishioka等人，2006, 「Enhancement of drug delivery to bone: Characterization of human tissue-nonspecific alkaline phosphatase tagged with an acidic oligopeptide,」Mol Genet Metab .88(3):244-255；及Kasugai等人，2000, 「Selective drug delivery system to bone: small peptide (Asp)6 (SEQ ID NO: 57) conjugation,」J Bone Miner Res. 15(5):936-943)。
在特定實施例中，來自該HA結合結構域之肽插入物包括來自序列DDDDDDDD (SEQ ID NO: 9)之至少4、5、6、7或所有8個胺基酸。在一些實施例中，肽插入物由來自序列DDDDDDDD (SEQ ID NO: 9)之至少4、5、6、7或所有8個胺基酸組成。在一特定實施例中，肽插入物包括DDDDDDDD (SEQ ID NO: 9)序列或由其組成。
骨歸巢肽可插入AAV衣殼中(例如)容許表面暴露肽之位點處(例如在可變表面暴露環內及在其他實例中AAV衣殼蛋白中之本文所闡述對應於AAV9之VR-I、VR-IV或VR-VIII之位點)，或可插入VP2之第一胺基酸之後，亦即緊接在胺基酸137之後(AAV4、AAV4-4及AAV5)或緊接在胺基酸138之後(AAV1、AAV3、AAV3-3、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9e、rh.10、rh.20、rh.39、rh.74v1、rh.74v2及hu.37) (圖 8 )。包括一或多個(例如)插入AAV衣殼外殼之表面暴露之環中之骨歸巢肽的重組AAV載體在本文中稱為「rAAV骨歸巢載體」。在特定實施例中，衣殼蛋白係AAV9衣殼蛋白且骨歸巢插入物出現於緊接在AAV9衣殼之胺基酸殘基451至461中之至少一者之後或緊接在胺基酸138之後。在其他實施例中，衣殼蛋白係來自至少一種選自AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV9e、AAVrh10、AAVrh20、AAVhu.37、AAVrh39及AAVrh74 (形式1及2) (參見圖 8 )之AAV類型，且骨歸巢肽插入物出現於緊接在對應於AAV9之胺基酸殘基451至461中之至少一者之胺基酸殘基之後。該等不同AAV血清型之比對(如圖 8 中所展示)指示不同胺基酸序列中之相應胺基酸殘基。 5.2.5   腎歸巢肽
本發明之另一態樣係關於包括經設計以賦予或增強腎歸巢性質(包含歸巢至腎組織、腎細胞或腎細胞基質)之衣殼蛋白之肽插入物。實例包含來自蛋白質之腎結合結構域或該結構域之構形類似物之肽。來自腎結合或腎歸巢結構域之肽稱為腎歸巢肽。在某些實施例中，與肝相比及相對於未經工程改造以含有腎歸巢肽之AAV，腎歸巢肽優先地靶向腎。
在某些實施例中，肽插入物可為來自靶向腎組織之結構域或經設計以模擬該結構域之三維結構之構形類似物之連續胺基酸的序列。在一些實施例中，腎歸巢結構域包括序列CLPVASC (SEQ ID NO: 12) (例如參見 US 5,622,699)。在一些實施例中，來自該腎歸巢結構域之肽插入物包括來自序列CLPVASC (SEQ ID NO: 12)之至少4、5、6或所有7個胺基酸。在一些實施例中，肽插入物包括序列CLPVASC (SEQ ID NO: 12)或由其組成。
已發現，某些歸巢肽中之兩個半胱胺酸殘基可皆缺失，此並不顯著影響肽之器官歸巢活性。舉例而言，具有序列LPVAS (SEQ ID NO: 13)之肽亦可為腎歸巢肽。測定半胱胺酸殘基或半胱胺酸殘基之N-末端或C-末端胺基酸殘基對於肽之器官歸巢活性之必要性的方法係常規方法且在業內已眾所周知。因此，在一些實施例中，肽插入物包括來自序列LPVAS (SEQ ID NO: 13)之至少4或所有5個胺基酸。在一些實施例中，肽插入物包括序列LPVAS (SEQ ID NO: 13)或由其組成。
腎歸巢肽可插入AAV衣殼中(例如)容許表面暴露肽之位點處(例如在可變表面暴露環內及在其他實例中本文所闡述對應於AAV9之VR-I、VR-IV或VR-VIII之位點)，或可插入VP2之第一胺基酸之後，例如緊接在胺基酸137之後(AAV4、AAV4-4及AAV5)或緊接在胺基酸138之後(AAV1、AAV2、AAV3、AAV3-3、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9e、rh.10、rh.20、rh.39、rh.74v1、rh.74v2及hu.37) (圖 8 )。包括一或多個(例如)插入AAV衣殼外殼之表面暴露之環中之腎歸巢肽的重組AAV載體在本文中稱為「rAAV腎歸巢載體」。在特定實施例中，衣殼蛋白係AAV9衣殼蛋白且腎歸巢肽插入物出現於緊接在AAV9衣殼之胺基酸殘基451至461中之至少一者之後。在其他實施例中，衣殼蛋白係來自至少一種選自AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV9e、AAVrh10、AAVrh20、AAVrh39、AAVhu.37及AAVrh74 (形式1及2) (參見圖 8 )之AAV類型，且腎歸巢肽插入物出現於緊接在對應於AAV9之胺基酸殘基451至461中之至少一者之胺基酸殘基之後。該等不同AAV血清型之比對(如圖 8 中所展示)指示不同胺基酸序列中之相應胺基酸殘基。 5.2.6   肌肉歸巢肽
本發明之另一態樣係關於包括經設計以賦予或增強肌肉歸巢性質(包含歸巢至肌肉組織、肌肉細胞或肌肉細胞基質)之肽插入物之衣殼蛋白。實例包含來自蛋白質之肌肉結合結構域或該結構域之構形類似物之肽。來自肌肉結合或肌肉歸巢結構域之肽稱為肌肉歸巢肽。
在某些實施例中，肽插入物可為來自靶向肌肉之結構域或經設計以模擬該結構域之三維結構之構形類似物之連續胺基酸的序列。在一些實施例中，肌肉歸巢結構域包括序列ASSLNIA (SEQ ID NO: 14) (例如參見 Samoylov等人，2002, 「Recognition of cell-specific binding of phage display derived peptides using an acoustic wave sensor,」Biomol Eng , 18(6):269-272)。在一些實施例中，來自該肌肉歸巢結構域之肽插入物包括來自序列ASSLNIA (SEQ ID NO: 14)之至少4、5、6或所有7個胺基酸。在一些實施例中，肽插入物包括序列ASSLNIA (SEQ ID NO: 14)或由其組成。
肌肉歸巢肽可插入AAV衣殼中(例如)容許表面暴露肽之位點處(例如在可變表面暴露環內及在其他實例中本文所闡述對應於AAV9之VR-I、VR-IV或VR-VIII之位點)，或可插入VP2之第一胺基酸之後，例如在胺基酸137之後(AAV4、AAV4-4及AAV5)或在胺基酸138處(AAV1、AAV2、AAV3、AAV3-3、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9e、rh.10、rh.20、rh.39、rh.74v1、rh.74v2及hu.37) (圖 8 )。包括一或多個(例如)插入AAV衣殼外殼之表面暴露之環中之肌肉歸巢肽的重組AAV載體在本文中稱為「rAAV肌肉歸巢載體」。在特定實施例中，衣殼蛋白係AAV9衣殼蛋白且肌肉歸巢肽插入物出現於緊接在AAV9衣殼之胺基酸殘基451至461中之至少一者之後。在其他實施例中，衣殼蛋白係來自至少一種選自AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV9e、AAVrh10、AAVrh20、AAVhu.37、AAVrh39及AAVrh74 (形式1及2) (參見圖 8 )之AAV類型，且肌肉歸巢肽插入物出現於緊接在對應於AAV9 (SEQ ID NO: 118)之胺基酸殘基451至461中之至少一者之胺基酸殘基之後。該等不同AAV血清型之比對(如圖 8 中所展示)指示不同胺基酸序列中之相應胺基酸殘基。 5.2.7   TfR歸巢肽
本發明之另一態樣係關於包括經設計以賦予或增強轉鐵蛋白受體歸巢性質之肽插入物之衣殼蛋白。實例包含來自蛋白質之轉鐵蛋白受體結合結構域或該結構域之構形類似物之肽。來自轉鐵蛋白受體結合或轉鐵蛋白受體歸巢結構域之肽稱為轉鐵蛋白受體歸巢肽。
人類轉鐵蛋白受體(hTfR)已作為受體調介之胞吞作用之模型且作為細胞增殖之標記物加以研究。hTfR通常高度表現於增殖性細胞(例如腫瘤細胞)中，且在口腔癌、肝癌、胰臟癌及前列腺癌中過度表現至少100倍。此使得hTfR成為有用診斷標記物以及癌症療法靶。TfR亦表現於血腦障壁上。TfR係由兩個相同95 kDa亞單元構成之二聚體且負責藉由細胞之鐵攝取。鐵在血液中由80 kDa轉鐵蛋白(Tf)攜載，該轉鐵蛋白結合TfR以形成經由網格蛋白包被小窩內化之複合物。鐵自轉鐵蛋白釋放於胞內體之酸性區域中，從而留下去鐵轉鐵蛋白-受體複合物，該複合物再循環回細胞表面且去鐵轉鐵蛋白(不結合鐵之轉鐵蛋白)亦發生再循環。例如參見Cheng等人，2004, 「Structure of the human transferrin receptor-transferrin complex,」Cell 116(4): 565-576。
因轉鐵蛋白受體涉及受體調介之穿胞作用，故其可用作「特洛伊木馬(Trojan horse)」以遞送負荷跨越血腦障壁，例如遞送小分子藥物、酶或核酸分子。舉例而言，小鼠研究已展示，經工程改造TfR結合肽由表現TfR之CEF細胞攝取，從而有利於隨時間經由腦微血管進入腦實質中(參見Lee等人，The FEBS Journal , 2001；及Staquicini等人，2011, 「Systemic combinatorial peptide selection yields a non-canonical iron-mimicry mechanism for targeting tumors in a mouse model of human glioblastoma,」J. of Clinical Investigation , 121(1):161-173)。
在一些實施例中，TfR肽插入物可增強衣殼化轉基因之AAV顆粒在內皮細胞基質中之傳輸。
在某些實施例中，肽插入物可為來自結合TfR之Tf結構域或經設計以模擬該結構域之三維結構之構形類似物或鐵模擬物之連續胺基酸的序列。在一些實施例中，來自TfR歸巢結構域之肽插入物包括來自序列HAIYPRH (SEQ ID NO: 17)之4、5、6或所有7個胺基酸，或由序列HAIYPRH (SEQ ID NO: 17)組成。在一些實施例中，來自TfR歸巢結構域之肽插入物包括來自序列THRPPMWSPVWP (SEQ ID NO: 18)之4、5、6、7、8、9、10、11或所有12個胺基酸或由序列THRPPMWSPVWP (SEQ ID NO: 18) (亦參見US 2006/0193778)組成。
在一些實施例中，來自TfR歸巢結構域之肽插入物包括來自序列CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)之4、5、6、7、8或所有9個胺基酸。在一些實施例中，肽插入物包括序列CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)或由其組成。已發現，某些歸巢肽中之兩個半胱胺酸殘基可皆缺失，此並不顯著影響肽之器官歸巢活性，且測定半胱胺酸殘基或半胱胺酸殘基之N-末端或C-末端胺基酸殘基對於肽之器官歸巢活性之必要性的方法係常規方法且在業內已眾所周知。在一些實施例中，肽插入物包括來自序列RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)之至少4、5、6或所有7個胺基酸。在一些實施例中，肽插入物包括序列RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)或由其組成。
TfR歸巢肽可插入AAV衣殼中(例如)容許表面暴露肽之位點處(例如在可變表面暴露環內及在其他實例中本文所闡述對應於AAV9之VR-I、VR-IV或VR-VIII之位點)，或可插入VP2之第一胺基酸之後，例如在胺基酸137之後(AAV4、AAV4-4及AAV5)或在胺基酸138處(AAV1、AAV2、AAV3、AAV3-3、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9e、rh.10、rh.20、rh.39、rh.74v1、rh.74v2及hu.37) (圖 8 )。包括一或多個(例如)插入AAV衣殼外殼之表面暴露之環中之TfR歸巢肽的重組AAV載體在本文中稱為「rAAV TfR歸巢載體」。
在一些實施例中，TfR歸巢結構域包括胺基酸序列RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)；且自其衍生之肽插入物包括RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)或CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)序列或由其組成。在一些實施例中，肽插入物包括來自RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)之4、5、6或所有7個連續胺基酸或由其組成；或包括來自CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)之4、5、6、7、8或所有9個胺基酸或由其組成。在特定實施例中，衣殼蛋白係AAV9衣殼蛋白且RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)或CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)插入物出現於緊接在胺基酸殘基451至461中之至少一者之後。在特定實施例中，RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)或CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)插入物出現於AAV9衣殼中選自由以下組成之群之胺基酸殘基之後：I451、N452、G453、S454、G455、Q456、N457、Q458、Q459、T460及L461。在其他實施例中，衣殼蛋白係來自至少一種選自AAV血清型1 (AAV1)、血清型2 (AAV2)、血清型3 (AAV3)、血清型4 (AAV4)、血清型5 (AAV5)、血清型6 (AAV6)、血清型7 (AAV7)、血清型8 (AAV8)、血清型rh8 (AAVrh8、血清型9e (AAV9e)、血清型rh10 (AAVrh10)、血清型rh20 (AAVrh20)、血清型hu37(AAVhu.37)、血清型rh39 (AAVrh39)及血清型rh74 (AAVrh74，形式1及2) (參見圖 8 )之AAV類型，且RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)或CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)肽插入物出現於緊接在對應於胺基酸殘基451至461中之至少一者之胺基酸殘基之後。該等不同AAV血清型之比對(如圖 8 中所展示)指示不同胺基酸序列中之相應胺基酸殘基。在一些特定實施例中，在圖 8 中所繪示之序列中，RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)或CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)肽插入物出現於緊接在以下各項內之胺基酸殘基中之一者之後：AAV1衣殼(SEQ ID NO: 110)之450至459；AAV2衣殼(SEQ ID NO: 111)之449至458；AAV3衣殼(SEQ ID NO: 112)之449至459；AAV4衣殼(SEQ ID NO: 113)之443至453；AAV5衣殼(SEQ ID NO: 114)之442至445；AAV6衣殼(SEQ ID NO: 115)之450至459；AAV7衣殼(SEQ ID NO: 116)之451至461；AAV8衣殼(SEQ ID NO: 117)之451至461；AAV9衣殼(SEQ ID NO: 118)之451至461；AAV9e衣殼(SEQ ID NO: 119)之452至461；AAVrh10衣殼(SEQ ID NO: 120)之452至461；AAVrh20衣殼(SEQ ID NO: 121)之452至461；AAVhu.37 (SEQ ID NO: 122)之452至461；AAVrh74衣殼(SEQ ID NO: 123或SEQ ID NO: 154)之452至461；或AAVrh39衣殼(SEQ ID NO: 124)之452至461。在一些實施例中，RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)或CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)肽插入物出現於緊接在對應於AAV9衣殼蛋白之588之胺基酸殘基之後(參見圖 8 )，其中在衣殼蛋白包裝為AAV顆粒時該肽插入物表面暴露。 5.2.8   視網膜細胞歸巢肽
另一態樣係關於包括經設計以賦予或增強視網膜細胞歸巢性質之肽插入物之衣殼蛋白。實例包含來自蛋白質之視網膜細胞結合結構域或該結構域之構形類似物之肽。來自視網膜細胞結合或視網膜細胞歸巢結構域之肽稱為視網膜細胞歸巢肽。術語「視網膜細胞」係指發現於視網膜中或其附近之一或多種細胞類型，包含無長突細胞、雙極細胞、水平細胞、米勒神經膠質細胞(Muller glial cell)、光感受器細胞(例如視桿及視錐細胞)、視網膜神經節細胞、視網膜色素上皮細胞及諸如此類，且尤其係人類光感受器細胞(例如人類視錐細胞及/或人類視桿細胞)、人類水平細胞、人類雙極細胞、人類無長突細胞以及人類視網膜神經節細胞(例如侏儒細胞、陽傘細胞、雙層細胞、巨視網膜神經節細胞、光敏性神經節細胞及/或米勒神經膠質細胞)、內限界膜中之內皮細胞及/或外限界膜中之人類視網膜色素上皮細胞。
在某些實施例中，肽插入物可來自靶向視網膜組織之視網膜細胞結合結構域或經設計以模擬該結構域之構形類似物之三維結構之連續胺基酸的序列。
在特定實施例中，肽插入物係衍生自人類軸絲動力蛋白(HAD)重鏈尾部之區域之肽。如上所述，在本文中稱為「HAD肽」之肽可為來自HAD重鏈尾部區域或經設計以模擬其三維結構之構形類似物之連續胺基酸的序列。上文所提供之表 2 鑑別人類軸絲動力蛋白之尾部及二聚合結構域以及用作本文所闡述經工程改造衣殼蛋白中之肽插入物(包含用作視網膜細胞歸巢肽)的肽。在一些實施例中，使用具有來自莖部/尾部區域及/或二聚合結構域(NDD)之軸絲動力蛋白序列之至少4個且最多15個鄰接胺基酸及較佳地7個鄰接胺基酸之插入物作為用於靶向視網膜細胞的肽插入物。
在一些實施例中，用於插入AAV衣殼中之肽係自HAD重鏈尾部區域之二聚合結構域(NDD)所設計。在替代實施例中，可使用對應於HAD重鏈尾部之其他部分(亦即排除動力蛋白馬達結構域)之胺基酸序列之肽。在一些實施例中，肽插入物包括來自HAD重鏈尾部之二聚合結構域之至少4個(在一實施例中7個)鄰接胺基酸且最多12或15個鄰接胺基酸。在特定實施例中，肽插入物包括來自由以下(繪示於圖 7A 至 7M 中)組成之群之至少4個(係7個)鄰接胺基酸且最多12或15個鄰接胺基酸：DYH1_HUMAN UniProtKB - Q9P2D7 (SEQ ID NO: 97)之胺基酸(「aa」) 1至1542；DYH2_HUMAN UniProtKB - Q9P225 (SEQ ID NO: 98)之aa 1至1764；DYH3_HUMAN UniProtKB - Q8TD57 (SEQ ID NO: 99)之aa 1至1390；DYH5_HUMAN UniProtKB - Q8TE73 (SEQ ID NO: 100)之aa 1至1941；DYH6_HUMAN UniProtKB - Q9C0G6 (SEQ ID NO: 101)之aa 1至1433；DYH7_HUMAN UniProtKB - Q8WXX0 (SEQ ID NO: 102)之aa 1至1289；DYH8_HUMAN UniProtKB - Q96JB1 (SEQ ID NO: 3)之aa 1至1807；DYH9_HUMAN UniProtKB - Q9NYC9 (SEQ ID NO: 104)之aa 1至1831；DYH10_HUMAN UniProtKB - Q8IVF4 (SEQ ID NO: 105)之aa 1至1793；DYH11_HUMAN UniProtKB - Q96DT5 (SEQ ID NO: 106)之aa 1至1854；DYH12_HUMAN UniProtKB - Q6ZR08 (SEQ ID NO: 107)之aa 1至1214；DYH14_HUMAN UniProtKB - Q0VDD8 (SEQ ID NO: 108)之aa 1至200；及DYH17¬_HUMAN UniProtKB - Q9UFH2 (SEQ ID NO: 109)之aa 1至1794)，且用於使經工程改造AAV靶向視網膜細胞。在更佳實施例中，肽插入物包括來自上文所列舉任一動力蛋白重鏈序列、任一來自由以下組成之群者之殘基1至200之至少4個鄰接胺基酸、係7個鄰接胺基酸且最多12或15個鄰接胺基酸：DYH1_HUMAN UniProtKB - Q9P2D7 (SEQ ID NO: 97)之胺基酸(「aa」) 1至1542；DYH2_HUMAN UniProtKB - Q9P225 (SEQ ID NO: 98)之aa 1至1764；DYH3_HUMAN UniProtKB - Q8TD57 (SEQ ID NO: 99)之aa 1至1390；DYH5_HUMAN UniProtKB - Q8TE73 (SEQ ID NO: 100)之aa 1至1941；DYH6_HUMAN UniProtKB - Q9C0G6 (SEQ ID NO: 101)之aa 1至1433；DYH7_HUMAN UniProtKB - Q8WXX0 (SEQ ID NO: 102)之aa 1至1289；DYH8_HUMAN UniProtKB - Q96JB1 (SEQ ID NO: 3)之aa 1至1807；DYH9_HUMAN UniProtKB - Q9NYC9 (SEQ ID NO: 104)之aa 1至1831；DYH10_HUMAN UniProtKB - Q8IVF4 (SEQ ID NO: 105)之aa 1至1793；DYH11_HUMAN UniProtKB - Q96DT5 (SEQ ID NO: 106)之aa 1至1854；DYH12_HUMAN UniProtKB - Q6ZR08 (SEQ ID NO: 107)之aa 1至1214；DYH14_HUMAN UniProtKB - Q0VDD8 (SEQ ID NO: 108)之aa 1至200；及DYH17¬_HUMAN UniProtKB - Q9UFH2 (SEQ ID NO: 109)之aa 1至1794))，該肽插入物係用於靶向視網膜細胞。在更佳實施例中，肽插入物係來自圖 7A 至 7M 之任一動力蛋白重鏈序列之7個鄰接胺基酸；或係來自任一動力蛋白重鏈序列(圖 7A 至 7M )之殘基1至200之7個鄰接胺基酸且用於使經工程改造AAV靶向視網膜細胞。
在特定實施例中，用於靶向視網膜細胞之肽插入物係來自由以下組成之群之至少4、5、6或7個鄰接胺基酸或由其組成：KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)；TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)；QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)；RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)；LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)；PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)；及TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)。在更特定實施例中，用於靶向視網膜細胞之肽插入物由來自由以下組成之群之肽組成：KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)；TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)；QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)；RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)；LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)；PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)；及TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)。在尤其關注之一實施例中，肽插入物包括胺基酸序列TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)或由其組成。
HAD肽可插入AAV衣殼中(例如)容許表面暴露肽之位點處(例如在可變表面暴露環內及在其他實例中本文所闡述對應於AAV9之VR-I、VR-IV或VR-VIII之位點)，或可插入VP2之第一胺基酸之後，例如緊接在胺基酸137之後(AAV4、AAV4-4及AAV5)或緊接在胺基酸138之後(AAV1、AAV2、AAV3、AAV3-3、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9e、rh.10、rh.20、rh.39、rh.74v1、rh.74v2及hu.37) (圖 8 )。在一些實施例中，使用包括HAD肽之rAAV載體來靶向視網膜細胞。在一特定實施例中，使用在胺基酸588至589 (SEQ ID NO: 118)之間具有TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)之AAV9衣殼蛋白來靶向視網膜細胞(例如參見圖 10 、圖 22A 至 22H 及圖 23A 至 23C 中所使用之載體)。在一些實施例中，使用不同AAV之衣殼蛋白來靶向視網膜細胞，其中載體在對應於AAV9 (亦參見圖 8 )之胺基酸588至589之胺基酸之間包含TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)。
在較佳實施例中，在局部投與(例如玻璃體內注射)後，視網膜細胞歸巢肽使得AAV轉導視網膜細胞。在更佳實施例中，在全身性投與(例如靜脈內注射)後，視網膜細胞歸巢肽使得AAV轉導視網膜細胞。在最佳實施例中，用於靶向及轉導視網膜細胞之經工程改造AAV包括在SEQ ID NO: 118之胺基酸588至589之間具有TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)的AAV9衣殼蛋白。
在一些實施例中，來自視網膜細胞結合結構域之肽插入物包括來自序列LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)之至少4、5、6、7、8或所有9個胺基酸。在一些實施例中，肽插入物由來自序列LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)之至少4、5、6、7、8或所有9個胺基酸組成。在一些實施例中，肽插入物包括來自序列LGETTRP (SEQ ID NO: 15)之至少4、5、6或所有7個胺基酸。在特定實施例中，肽插入由來自序列LGETTRP (SEQ ID NO: 15)之至少4、5、6或所有7個胺基酸組成。在一特定實施例中，肽插入物由LGETTRP (SEQ ID NO: 15)序列組成。
可將視網膜細胞歸巢肽插入AAV衣殼中(較佳地)容許表面暴露肽之位點處(例如在可變表面暴露環內)，且更佳地插入本文所闡述對應於AAV9之VR-I、VR-IV或VR-VIII之位點處或AAV8之相應位置中。在特定實施例中，衣殼蛋白係AAV8衣殼蛋白且LGETTRP (SEQ ID NO: 15)或LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)插入物出現於緊接在AAV8衣殼(SEQ ID NO: 117之胺基酸序列)之胺基酸殘基451至461中之至少一者之後。在特定實施例中，衣殼蛋白係AAV9衣殼蛋白且LGETTRP (SEQ ID NO: 15)或LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)插入物出現於緊接在AAV9衣殼之胺基酸殘基451至461中之至少一者之後，且在特定實施例中緊接在AAV9衣殼蛋白之殘基454之後。在其他實施例中，衣殼蛋白係來自至少一種選自AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV9e、AAVrh10、AAVrh20、AAVhu.37、AAVrh39及AAVrh74(形式1及形式2) (參見圖 8 )之AAV類型，且LGETTRP (SEQ ID NO: 15)或LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)肽插入物出現於緊接在對應於AAV9衣殼之胺基酸殘基451至461中之至少一者之胺基酸殘基之後，或在某些實施例中對應於在對應於AAV9衣殼序列之殘基454之殘基之後。該等不同AAV血清型之比對(如圖 8 中所展示)指示不同AAV衣殼胺基酸序列中之相應胺基酸殘基。
在一些實施例中，視網膜細胞歸巢肽並不插入AAV2衣殼蛋白中，而係所用衣殼蛋白係來自至少一種選自AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV9e、AAVrh10、AAVrh20、AAVhu37、AAVrh39及AAVrh74之AAV類型。在一些實施例中，視網膜細胞歸巢肽並不插入AAV2衣殼蛋白(SEQ ID NO: 111)之胺基酸587至588之間。在一些實施例中，視網膜細胞歸巢肽並不插入不同AAV血清型中對應於AAV2衣殼蛋白之胺基酸587至588之胺基酸殘基之間。包括一或多個(例如)插入AAV衣殼外殼之表面暴露之環中之視網膜細胞歸巢肽的重組AAV載體在本文中稱為「rAAV視網膜細胞歸巢載體」。 5.2.9   其他AAV衣殼插入位點
下文匯總本文所闡述之肽(包表 1A 及 1B 含中之肽及表 2 中之動力蛋白肽)之插入位點，其緊接在如下文所陳述AAV衣殼之胺基酸殘基之後(亦參見圖 8 )： AAV1：138；262至272；450至459；595至593；及在一特定實施例中在453至454之間(SEQ ID NO: 110)。 AAV2：138；262至272；449至458；584至592；及在特定實施例中在452至453之間(SEQ ID NO: 111)。 AAV3：138；262至272；449至459；585至593；及在特定實施例中在452至453之間(SEQ ID NO: 112)。 AAV4：137；256至262；443至453；583至591；及在特定實施例中在446至447之間(SEQ ID NO: 113)。 AAV5：137；252至262；442至445；574至582；及在特定實施例中在445至446之間(SEQ ID NO: 114)。 AAV6：138；262至272；450至459；585至593；及在特定實施例中在452至453之間(SEQ ID NO: 115)。 AAV7：138；263至273；451至461；586至594；及在特定實施例中在453至454之間(SEQ ID NO: 116)。 AAV8：138；263至274；451至461；587至595；及在特定實施例中在453至454之間(SEQ ID NO: 117)。 AAV9：138；262至273；452至461；585至593；及在特定實施例中在454至455之間(SEQ ID NO: 118)。 AAV9e：138；262至273；452至461；585至593；及在特定實施例中在454至455之間(SEQ ID NO: 119)。 AAVrh10：138；263至274；452至461；587至595；及在特定實施例中在454至455之間(SEQ ID NO: 120)。 AAVrh20：138；263至274；452至461；587至595；及在特定實施例中在454至455之間(SEQ ID NO: 121)。 AAVrh39：138；263至274；452至461；587至595；及在特定實施例中在454至455之間(SEQ ID NO: 124)。 AAVrh74：138；263至274；452至461；587至595；及在特定實施例中在454至455之間(SEQ ID NO: 123或SEQ ID NO: 154)。 AAVhu.37：138；263至274；452至461；587至595；及在特定實施例中在454至455之間(SEQ ID NO: 122)
在特定實施例中，肽插入物出現於AAV9衣殼之胺基酸殘基588至589之間或另一AAV類型衣殼之相應殘基之間，如藉由胺基酸序列比對所測定(例如如圖 8 中)。在特定實施例中，肽插入物出現於緊接在AAV9衣殼序列之胺基酸殘基I451至L461、S268及Q588之後，或緊接在另一AAV衣殼序列之相應殘基之後(圖 8 )。
在一些實施例中，來自一或多個歸巢結構域之一或多個肽插入物可用於單一系統中。在一些實施例中，選擇及/或進一步修飾衣殼以減小AAV顆粒由個體免疫系統之識別，從而(例如)避免個體中之預存在抗體。在一些實施例中。在一些實施例中，選擇及/或進一步修飾衣殼以增強期望嗜性/靶向。 5.2.10    經修飾衣殼
在一些實施例中，藉由引入所選單一至多個胺基酸取代來修飾AAV衣殼，該等胺基酸修飾可增加至CNS之有效基因遞送、使肝脫靶及/或減小中和抗體之免疫反應。
藉由經靜脈內投與之rAAV載體將基因有效遞送至CNS需要穿越血腦障壁。最近已報導AAVrh.10衣殼上使得能夠在小鼠之腦血管系統中傳輸且進行廣泛神經元轉導之關鍵殘基簇。具體而言，將AAVrh.10源胺基酸N262、G263、T264、S265、G267、S268、T269及T273鑑別為促進穿越BBB之關鍵殘基(Albright等人，2018, Mapping the Structural Determinants Required for AAVrh.10 Transport across the Blood-Brain Barrier)。已鑑別衣殼(例如AAV8及AAV9衣殼)中促進rAAV血腦障壁穿越、轉導、肝脫靶及/或免疫反應減小之胺基酸取代。
在一些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之衣殼，該等胺基酸取代促進了具有經修飾衣殼之rAAV之轉導及/或組織嗜性。在特定實施例中，提供在AAV8衣殼之胺基酸269處具有單一突變(使用絲胺酸代替丙胺酸，A269S) (參見表 7 ，本文中稱為AAV8.BBB)及在其他AAV類型中於相應位置處具有胺基酸取代之衣殼。在一些實施例中，提供在AAV9衣殼之胺基酸263、269及273處具有多個取代(產生下列取代：S263G、S269T及A273T) (在本文中稱為AAV9.BBB)或在其他AAV類型中對應於該等位置之取代之衣殼。
暴露於AAV衣殼可生成中和抗體之免疫反應。一種克服此反應之方式係定位AAV特異性中和表位且合理設計能夠逃避中和之AAV衣殼。最近已闡述具有高中和效價之完整AAV9衣殼之特異性單株抗體(Giles等人，2018, Mapping an Adeno-associated Virus 9-Specific Neutralizing Epitope To Develop Next-Generation Gene Delivery Vectors)。表位定位至衣殼上之3次對稱軸，具體而言定位至殘基496-NNN-498及588-QAQAQT-592 (SEQ ID NO: 58)。衣殼誘變證實，此表位內之單一胺基酸取代顯著減小結合及中和。另外，活體內研究展示，表位中之突變賦予突變載體「肝脫靶」表型，從而表明相同殘基亦負責AAV9嗜性。肝脫靶亦與在胺基酸503處使用精胺酸代替色胺酸之取代有關。AAV9衣殼中之W503R突變之存在與低聚醣結合親合力有關(Shen等人，2012, Glycan Binding Avidity Determines the Systemic Fate of Adeno-Associated Virus Type 9)。
在一些實施例中，提供衣殼，其中藉由在胺基酸位置498、499及500 (在本文中稱為AAV8.BBB.LD)或496、497及498 (在本文中稱為AAV9.BBB.LD)使用丙胺酸取代天門冬醯胺酸來進一步修飾AAV8.BBB及AAV9.BBB衣殼。在一些實施例中，藉由在胺基酸位置498、499及500處使用丙胺酸取代三個天門冬醯胺酸來修飾AAVrh10衣殼(AAVrh10.LD) (表 7 )。
在一些實施例中，提供在AAV9衣殼之胺基酸位置496、497及498處使用丙胺酸代替三個天門冬醯胺酸且亦在AAV9衣殼之胺基酸503處使用精胺酸代替色胺酸之衣殼或在其他AAV類型中具有對應於該等位置之取代的衣殼。在一些實施例中，提供在AAV9衣殼之胺基酸位置474麩醯胺酸經丙胺酸取代之衣殼或在其他AAV類型中具有對應於此位置之取代的衣殼。
在一些實施例中，與不包括肽插入物之rAAV相比，本文所闡述之rAAV增加了個體(人類、非人類靈長類動物或小鼠個體)或細胞培養物中之組織特異性(例如但不限於CNS)細胞轉導。在一些實施例中，與無肽插入物之情形相比，組織特異性細胞轉導增加至少2、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍。舉例而言，在一些實施例中，與使用無肽插入物之相同AAV類型之轉導相比，組織特異性細胞轉導增加50至80倍。可使用本文實例中所闡述及業內已知之方法來評價轉導增加。
在一些實施例中，與不包括肽插入物之rAAV相比，本文所闡述之rAAV增加了rAAV基因體在個體(人類、非人類靈長類動物或小鼠個體)中之一定類型細胞或組織或細胞培養物中之納入。在一些實施例中，與具有無肽插入物衣殼之AAV相比，基因體整合增加至少2、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍。舉例而言，在一些實施例中，與使用無肽插入物之相同AAV類型之基因體整合相比，基因體整合增加50至80倍。 5.3.  製備rAAV分子之方法
本發明之另一態樣涉及製備本文所揭示之分子。在一些實施例中，藉由以下方式來製備本發明分子：提供包括編碼本文之任一衣殼蛋白分子之核酸序列之核苷酸；及使用包裝細胞系統製備具有由衣殼蛋白構成之衣殼外殼之相應rAAV顆粒。在一些實施例中，核酸序列編碼與本文所闡述衣殼蛋白分子之序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致性之序列，且保留(或實質上保留)衣殼蛋白及來自異源蛋白或其結構域之所插入肽之生物功能。在一些實施例中，核酸編碼與AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO:118且參見圖 8 )之序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致性之序列，同時保留(或實質上保留) AAV9衣殼蛋白及所插入肽之生物功能。
衣殼蛋白、外殼及rAAV顆粒可藉由業內已知技術產生。在一些實施例中，病毒基因體包括至少一個反向末端重複以容許包裝至載體中。在一些實施例中，病毒基因體進一步包括cap基因及/或用於表現及剪接cap基因之rep基因。在其他實施例中，cap及rep基因係由包裝細胞提供且不存在於病毒基因體中。
在一些實施例中，將編碼經工程改造衣殼蛋白之核酸選殖至AAV Rep-Cap輔助質體中以代替現有衣殼基因。在一起引入宿主細胞中時，此質體會幫助將rAAV基因體包裝至呈衣殼外殼形式之經工程改造衣殼蛋白中。包裝細胞可為任一擁有促進AAV基因體複製、衣殼組裝及包裝所需之基因之細胞類型。非限制性實例包含293細胞或其衍生物、HELA細胞或昆蟲細胞。
對於重組DNA、寡核苷酸合成以及組織培養及轉化，可使用標準技術(例如電穿孔、脂質轉染)。酶促反應及純化技術可根據製造商說明書來實施，或以本技術領域內習用方法來實施，或如本文所闡述來實施。通常可根據本技術領域內熟知之習用方法且如各種一般且更具體參考文獻中所闡述實施下列技術及程序，遍及本說明書引用且論述該等參考文獻。例如參見Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))，其出於任何目的以引用方式併入本文中。除非提供具體定義，否則結合本文所闡述分析化學、合成有機化學以及醫學及醫藥化學所利用之術語及其中之實驗室程序以及技術係本技術領域內熟知且常用者。化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及遞送以及患者之治療可使用標準技術。基於AAV之病毒載體之核酸序列以及製備重組AAV及AAV衣殼之方法教示於(例如) US 7,282,199、US 7,790,449、US 8,318,480、US 8,962,332及PCT/EP2014/076466中，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，rAAV提供可用於治療及防治應用中之轉基因遞送載體，如下文更詳細地論述。在一些實施例中，rAAV載體亦包含熟習此項技術者已知之調控控制元件，該等調控控制元件會影響由核酸(轉基因)編碼之RNA及/或蛋白質產物在個體之靶細胞內之表現。調控控制元件可為組織特異性，亦即僅在靶細胞/組織中具有活性(或實質上更大活性或顯著更大活性)。在具體實施例中，AAV載體包括可操作地連接至容許表現於靶組織中之轉基因之調控序列(例如啟動子)。啟動子可為組成型啟動子，例如CB7啟動子。其他啟動子包含：巨細胞病毒(CMV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)啟動子、MMT啟動子、EF-1 α啟動子、UB6啟動子、雞β-肌動蛋白啟動子、CAG啟動子、RPE65啟動子、視蛋白啟動子、TBG (甲狀腺素結合球蛋白)啟動子、APOA2啟動子、SERPINA1 (hAAT)啟動子或MIR122啟動子。在一些實施例中，尤其在可期望關閉轉基因表現之情形下，使用可誘導啟動子(例如低氧可誘導或雷帕黴素(rapamycin)可誘導啟動子)。
在特定實施例中提供包括病毒基因體(包括用於在調控元件之控制下表現轉基因之表現盒且側接有ITR)及經工程改造病毒衣殼之AAV9載體，該經工程改造病毒衣殼係如本文所闡述或與AAV9衣殼蛋白(參見圖 8 )之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致，同時保留經工程改造 AAV9衣殼之生物功能。在某些實施例中，所編碼AAV9衣殼具有野生型AAV9之序列以及如本文所闡述之肽插入物，且另外相對於野生型AAV序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸取代並保留AAV9衣殼之生物功能。亦提供經除AAV9載體外之經工程改造AAV載體(例如經工程改造AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9e、AAVrh10、AAVrh20、AAVhu.37、AAVrh39或AAVrh74載體)，相對於野生型或該AAV類型之未工程改造序列，該等經工程改造AAV載體具有如本文所闡述之肽插入物及1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸取代且保留其生物功能。
重組腺病毒可為第一代載體，其具有E1缺失、具有或不具有E3缺失且具有插入任一缺失區域中之表現盒。重組腺病毒可為第二代載體，其含有E2及E4區域之全部或部分缺失。輔助依賴性腺病毒僅保留腺病毒反向末端重複及包裝信號(phi)。通常將轉基因插入包裝信號與3’ITR之間，其中含有或不含用以使基因體保持於接近大約36 kb之野生型大小之填充序列。用於產生腺病毒載體之實例性方案可參見Alba等人，2005, 「Gutless adenovirus:  last generation adenovirus for gene therapy,」Gene Therapy 12:S18-S27，其全部內容以引用方式併入本文中。
用於將轉基因遞送至靶組織之rAAV載體、細胞或器官具有針對該特定靶組織、細胞或器官之嗜性。亦可使用組織特異性啟動子。構築體可進一步包含增強由載體驅動之轉基因表現之表現控制元件(例如內含子，例如雞β-肌動蛋白內含子、小鼠微小病毒(MVM)內含子、人類因子IX內含子(例如FIX截短內含子1)、β-球蛋白剪接供體/免疫球蛋白重鏈剪接受體內含子、腺病毒剪接供體/免疫球蛋白剪接受體內含子、SV40晚期剪接供體/剪接受體(19S/16S)內含子及雜合腺病毒剪接供體/IgG剪接受體內含子；及聚A信號，例如兔β-球蛋白聚A信號、人類生長激素(hGH)聚A信號、SV40晚期聚A信號、合成聚A (SPA)信號及牛生長激素(bGH)聚A信號。例如參見 Powell及Rivera-Soto, 2015,Discov. Med ., 19(102):49-57。
在某些實施例中，可(例如)經由熟習此項技術者已知之任一密碼子最佳化技術將本文所揭示之核酸序列密碼子最佳化(例如參見 Quax等人，2015, Mol Cell 59:149-161之綜述)。
在一具體實施例中，本文所闡述之構築體包括下列組分：(1) AAV9反向末端重複，其側接於表現盒；(2)控制元件，其包含a) CB7啟動子(包括CMV增強子/雞β-肌動蛋白啟動子)、b)雞β-肌動蛋白內含子及c)兔β-球蛋白聚A信號；及(3)轉基因，其提供(例如編碼)所關注核酸或蛋白質產物。在一具體實施例中，本文所闡述構築體之包括下列組分：(1) AAV9反向末端重複，其側接於表現盒；(2)控制元件，其包含a)低氧可誘導啟動子、b)雞β-肌動蛋白內含子及c)兔β-球蛋白聚A信號；及(3)轉基因，其提供(例如編碼)所關注核酸或蛋白質產物。
本文所提供之病毒載體可使用宿主細胞(例如哺乳動物宿主細胞，包含來自人類、猴、小鼠、大鼠、兔或倉鼠之宿主細胞)製得。非限制性實例包含：A549、WEHI、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、293、Saos、C2C12、L、HT1080、HepG2、原代纖維母細胞、肝細胞及肌母細胞。通常，使用編碼轉基因及相關元件之序列(亦即載體基因體)及用於在宿主細胞中產生病毒之遺傳組分(例如複製及衣殼基因，例如AAV之rep及cap基因)來穩定轉化宿主細胞。關於產生具有AAV8衣殼之重組AAV載體之方法，參見美國專利第7,282,199 B2號之實施方式之部分IV，該專利之全部內容以引用方式併入本文中。可(例如)藉由TAQMAN®分析來測定該等載體之基因體拷貝效價。可(例如)藉由CsCl2 沉降來回收病毒體。或者，可使用昆蟲細胞中之桿狀病毒表現系統來產生AAV載體。綜述可參見Aponte-Ubillus等人，2018,Appl. Microbiol. Biotechnol . 102:1045-1054，其關於製造技術之全部內容以引用方式併入本文中。
可使用活體外分析(例如細胞培養分析)來量測來自本文所闡述載體之轉基因表現，由此指示(例如)載體功效。舉例而言，可使用PER.C6® 細胞系(Lonza) (衍生自人類胚胎視網膜細胞之細胞系)或視網膜色素上皮細胞(例如視網膜色素上皮細胞系hTERT RPE-1 (可自ATCC®獲得))來評價轉基因表現。或者，可使用衍生自肝或其他細胞類型之細胞系，例如(但不限於) HuH-7、HEK293、纖維肉瘤HT-1080、HKB-11及CAP細胞。一旦得以表現，即可使用業內已知之分析來測定表現產物(亦即轉基因產物)之特性，包含測定醣基化及酪胺酸硫酸化模式。 5.4.  治療及防治用途
另一態樣係關於涉及經由本發明rAAV載體向有需要之個體投與轉基因之療法，其用於延遲、預防、治療及/或管控疾病或病症及/或改善一或多種其相關症狀。有需要之個體包含患有疾病或病症之個體或易患該疾病或病症之個體(例如處於發生或復發該疾病或病症之風險下之個體)。通常，攜載特定轉基因之rAAV可用於個體之既定疾病或病症，其中個體之對應於 轉基因之天然基因在提供正確基因產物或正確量之基因產物方面具有缺陷。轉基因然後可提供個體中之缺陷性基因之拷貝。
通常，轉基因包括恢復在相應天然基因中具有基因突變之個體中之蛋白質功能之cDNA。在一些實施例中，cDNA包括用於實施基因體工程改造(例如經由同源重組之基因體編輯)之相關RNA。在一些實施例中，轉基因編碼治療性RNA (例如shRNA)、人工miRNA或影響剪接之元件。
下文之表 3A 至 3B 提供可用於本文所闡述任一rAAV載體中、尤其用於本文所闡述新穎插入位點中以治療或預防與轉基因有關之疾病(亦列示於表 3A 至 3B 中)之轉基因的列表。 如本文所闡述，可如本文所闡述工程改造AAV載體以靶向適當組織，從而遞送轉基因以實現治療或防治用途。可選擇工程改造適當AAV血清型以最佳化載體之組織嗜性及轉導。 表3A
疾病 轉基因 用於遞送轉基因之可能 AAV 血清型
MPS I α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)    AAV9
MPS II (亨特氏症候群(Hunter Syndrome)) 艾杜糖2-硫酸酯酶(IDS)    AAV9
蠟樣脂褐質沈積症(巴登氏病(Batten disease)) (CLN1、CLN2、CLN10、CLN13)、可溶性溶酶體蛋白(CLN5)、分泌路徑中之蛋白質(CLN11)、亦與膜周邊締合之兩種細胞質蛋白(CLN4、CLN14)及許多具有不同亞細胞位置之跨膜蛋白(CLN3、CLN6、CLN7、CLN8、CLN12) AAV9
MPS IIIa (桑菲利波類型A症候群(Sanfilippo type A Syndrome)) 硫酸乙醯肝素硫酸酯酶(亦稱為N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH))    AAV9, Rh10   
MPS IIIB (桑菲利波類型B症候群) N-乙醯基-α-D-胺基葡萄糖苷酶(NAGLU) AAV9
MPS VI (馬洛特-拉米症候群(Maroteaux-Lamy Syndrome)) 芳基硫酸酯酶B AAV8
莫爾基奧氏症候群(Morquio syndrome) (MPS IV) β半乳糖苷酶或半乳糖胺-6-硫酸酯酶    AAV9
高雪氏病(Gaucher disease) (類型1、II及III) 葡萄糖腦苷脂酶，GBA1    AAV9   
帕金森氏病(Parkinson’s Disease) 葡萄糖腦苷脂酶；GBA1    AAV9   
帕金森氏病 多巴胺(dopamine)去羧酶    AAV2
龐貝氏病(Pompe) 酸性麥芽糖酶；GAA    AAV9   
異染性腦白質營養不良 芳基硫酸酯酶A Rh10
MPS VII (斯萊症候群(Sly syndrome)) β-葡萄糖醛酸苷酶   
MPS VIII 葡萄糖胺-6-硫酸鹽硫酸酯酶   
MPS IX 玻璃尿酸   
尼曼匹克氏病(Niemann-Pick disease) 鞘磷脂酶   
無鞘磷脂酶缺陷之尼曼匹克氏病 編碼膽固醇代謝酶之npc1基因      
戴薩克斯氏病(Tay-Sachs disease) β-己糖胺酶之α亞單元      
山德霍夫氏病(Sandhoff disease) β-己糖胺酶之α及β亞單元      
法布裡氏病(Fabry Disease) α-半乳糖苷酶      
岩藻糖苷累積病 岩藻糖苷酶(FUCA1基因)   
α-甘露糖苷病 α-甘露糖苷酶   
β-甘露糖苷病 β-甘露糖苷酶   
伍爾曼氏病(Wolman disease) 膽固醇酯水解酶   
帕金森氏病 神經生長因子   
帕金森氏病 神經膠質源生長因子(GDGF)   
帕金森氏病 酪胺酸羥基酶   
帕金森氏病 麩胺酸去羧酶。   
未列示疾病 纖維母細胞生長因子-2 (FGF-2)   
未列示疾病 腦源生長因子(BDGF)   
未列示疾病(半乳糖唾液酸貯積症(戈德堡症候群(Goldberg syndrome))) 神經胺酸酶缺陷伴β半乳糖苷酶缺陷      
脊髓性肌萎縮(SMA) SMN AAV9   
弗裡德賴希共濟失調(Friedreich's ataxia) 共濟蛋白(Frataxin) AAV9 PHP.B   
肌萎縮性側向硬化(ALS) SOD1 Rh10
糖原貯積病1a 葡萄糖-6-磷酸酶 AAV8
XLMTM MTM1 AAV8或AAV9
克裡格勒-納賈爾病(Crigler Najjar) UGT1A1 AAV8
CPVT CASQ2 AAV9
蕾特氏症候群(Rett syndrome) MECP2 AAV9
色盲 CNGB3, CNGA3, GNAT2, PDE6C AAV8
脈絡膜缺損 CDM AAV8
唐尼氏病(Danon Disease) LAMP2 AAV9
表3B
疾病 轉基因 用於遞送轉基因之可能 AAV 血清型
囊性纖維化 CFTR AAV2
杜興氏肌肉失養症(Duchenne Muscular Dystrophy) 微小肌肉萎縮蛋白基因 AAV2
2C型肢帶型肌肉營養不良症|γ-肌聚醣病 人類-α-肌聚醣 AAV1
晚期心臟衰竭 SERCA2a AAV6
類風濕性關節炎 TNFR:Fc融合基因 AAV2
萊伯氏先天性黑蒙(Leber Congenital Amaurosis) GAA AAV1
2C型肢帶型肌肉營養不良症|γ-肌聚醣病 γ-肌聚醣 AAV1
色素性視網膜炎 hMERTK AAV2
老年性黃斑退化 sFLT01 AAV2
貝克氏肌肉營養不良症(Becker Muscular Dystrophy)及偶發性包涵體肌炎 人類濾泡抑素344 AAV1
帕金森氏病 GDNF AAV2
異染性腦白質營養不良(MLD) cuARSA AAVrh.10
C型肝炎 抗HCV shRNA AAV8
2D型肢帶型肌肉營養不良症 hSGCA AAVrh74*
人類免疫缺陷病毒感染；HIV感染(HIV-1) PG9DP AAV1
急性間歇性卟啉病 PBGD AAV5
萊伯氏遺傳性視神經病變(Leber's Hereditary Optical Neuropathy) P1ND4v2 AAV2
α-1抗胰蛋白酶缺陷 α1AT AAVrh10
龐貝氏病 hGAA AAV9
X連鎖視網膜劈裂症 RS1 AAV8
無脈絡膜 hCHM AAV2
巨軸索神經病變 JeT-GAN AAV9
杜興氏肌肉失養症 微肌肉萎縮蛋白 AAVrh74*
X連鎖視網膜劈裂症 hRS1 AAV2
鱗狀細胞頭頸癌；輻射誘導性口乾燥症 hAQP1 AAV2
血友病B 因子IX AAVrh10/ Rh74
純合FH hLDLR AAV8
遠端型肌病 rAAVrh74.MHCK7.DYSF.DV AAVrh74
血友病B AAV6 ZFP核酸酶 AAV6
MPS I AAV6 ZFP核酸酶 AAV6
類風濕性關節炎 NF-kB.IFN-β AAV5
巴登氏病/ CLN6 CLN6 AAV9
A型桑菲利波氏病(Sanfilippo Disease) hSGSH AAV9
骨關節炎 5IL-1Ra AAV2.5
色盲 CNGA3 AAV2tYF
色盲 CNGB3 AAV8
鳥胺酸轉胺甲醯酶(OTC)缺陷 OTC scAAV8
血友病A 因子VIII LK03/AAV3B
黏多糖累積病II ZFP核酸酶 AAV6
血友病A ZFP核酸酶 AAV6
濕型AMD 抗VEGF AAV8
X連鎖色素性視網膜炎 PGR AAV2
VI型黏多糖累積病 hARSB AAV8
萊伯氏遺傳性視神經病變 ND4 AAV2
X連鎖肌管性肌病 MTM1 AAV8
克裡格勒-納賈爾症候群(Crigler-Najjar Syndrome) UGT1A1 AAV8
色盲 CNGB3 AAV8
色素性視網膜炎 hPDE6B AAV5
X連鎖色素性視網膜炎 RPGR AAV2tYF
3 B型黏多糖累積病 hNAGLU AAV9
杜興氏肌肉失養症 GALGT2 AAVrh74
類風濕性關節炎；牛皮癬性關節炎；關節黏連性脊椎炎 TNFR:Fc融合基因 AAV2
特發性帕金森氏病 神經生長因子 AAV2
阿茲海默氏病(Alzheimer's Disease) NGF AAV2
人類免疫缺陷病毒感染；HIV感染(HIV-1) tgAAC09 AAV2
家族性脂蛋白脂肪酶缺陷 LPL AAV1
特發性帕金森氏病 神經生長因子 AAV2
α-1抗胰蛋白酶缺陷 hAAT AAV1
萊伯氏先天性黑蒙(LCA) 2 hRPE65v2 AAV2
巴登氏病；嬰兒晚期神經元脂褐質沈積症 CLN2 AAVrh.10
帕金森氏病 GAD AAV2
A型桑菲利波氏病/IIIA型黏多糖累積病 N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)基因 AAVrh.10
充血性心臟衰竭 SERC2a AAV1
貝克氏肌肉營養不良症及偶發性包涵體肌炎 rAAV1.CMV.huFollistatin344 AAV1
帕金森氏病 hAADC-2 AAV2
無脈絡膜 REP1 AAV2
階段IV胃癌中之CEA特異性AAV-DC-CTL治療 CEA AAV2
胃癌 MUC1-肽-DC-CTL   
萊伯氏遺傳性視神經病變 scAAV2-P1ND4v2 scAAV2
芳香族胺基酸去羧酶缺陷 hAADC AAV2
血友病B 因子IX AAVrh10
帕金森氏病 AADC AAV2
萊伯氏遺傳性視神經病變 基因：GS010|藥物：安慰劑 AAV2
SMA -脊髓性肌萎縮|基因療法 SMN AAV9
血友病A B-結構域缺失因子VIII AAV8
MPS I IDUA AAV9
MPS II IDS AAV9
CLN3相關神經元蠟樣脂褐質沈積症(巴登氏病) CLN3 AAV9
2E型肢帶型肌肉營養不良症 hSGCB rh74
阿茲海默氏病 APOE2 rh10
色素性視網膜炎 hMERKTK AAV2
色素性視網膜炎 RLBP1 AAV8
濕型AMD 抗VEGF抗體 AAV2.7m8
舉例而言，包括編碼神經膠質源生長因子(GDGF)之轉基因之rAAV載體可用於治療/預防/管控帕金森氏病。通常，全身性投與rAAV載體。舉例而言，可藉由靜脈內、鞘內、鼻內及/或腹膜腔內投與來提供rAAV載體。
在特定態樣中，本發明rAAV可用於遞送至與擬治療/預防之病症或疾病有關之靶組織或靶細胞類型(包含與靶細胞類型有關之細胞基質)。與特定組織或細胞類型有關之疾病或病症係與身體之其他組織或細胞類型相比在很大程度上影響特定組織或細胞類型者，或係其中病症之效應或症狀出現於特定組織或細胞類型中者。將轉基因遞送至有需要之個體之靶組織之方法涉及向個體投與rAAV，其中肽插入物係歸巢肽。在帕金森氏病之情形下，舉例而言，可使用包括將rAAV引導至神經組織之肽插入物之rAAV載體，特定而言，其中肽插入物可促進rAAV穿越血腦障壁並到達CNS。該等肽插入物包含衍生自神經組織歸巢結構域者，例如本文所闡述之「EPO肽」或「HAD肽」。
舉例而言，包括EPO肽之衣殼蛋白可用於使AAV再靶向CNS並穿越血腦障壁。包括EPO肽之衣殼蛋白可進一步對CNS組織具有保護效應，舉例而言，其中EPO插入物結合先天性修復受體，從而激活IRR生物開關並抑制發炎及/或引發CNS修復。在一些實施例中，本發明之包括EPO肽之rAAV可用於下列病症中之一或多者：器官缺血性損傷、中風、心肌梗塞、腎損傷、腎病、腦損傷、腎缺血、肢體缺血、自體免疫腦脊髓炎、自體免疫神經炎、多發性硬化、格林-巴利症候群(Guillain-Barre Syndrome)、神經病變性疼痛、糖尿病併發症(例如糖尿病性視網膜病變及糖尿病性自主神經病變)及類肉瘤病。
對於與神經組織有關之疾病或病症，可使用包括來自神經組織歸巢結構域之肽插入物(例如本文所闡述之任一者)之rAAV載體。與神經組織有關之疾病/病症包含阿茲海默氏病、肌肉萎縮性側向硬化(ALS)、肌肉萎縮性側向硬化(ALS)、巴登氏病、巴登氏幼年型NCL形式、卡納萬氏病(Canavan disease)、慢性疼痛、弗裡德賴希共濟失調、多形性神經膠母細胞瘤、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、嬰兒晚期神經元蠟樣脂褐質沈積症(LINCL)、溶酶體貯積症、萊伯氏先天性黑蒙、多發性硬化、帕金森氏病、龐貝氏病、蕾特氏症候群、脊髓損傷、脊髓性肌萎縮(SMA)、中風及創傷性腦損傷。載體可進一步含有對患有疾病或病症或處於發生疾病或病症之風險下之個體具有治療/防治益處之轉基因(參見表3A至3B)。
對於與骨有關之疾病或病症而言，可使用包括來自骨歸巢結構域之肽插入物(例如本文所闡述者)之rAAV載體。
對於與腎有關之疾病或病症而言，可使用包括來自腎歸巢結構域之肽插入物(例如本文所闡述者)之rAAV載體。
對於與肌肉有關之疾病或病症而言，可使用包括來自肌肉歸巢結構域之肽插入物(例如本文所闡述者)之rAAV載體。
對於與內皮細胞有關之疾病或病症而言，可使用包括來自內皮細胞歸巢結構域之肽插入物(例如本文所闡述者)之rAAV載體。
對於與整聯蛋白受體或表現特定整聯蛋白受體之細胞有關之疾病或病症而言，可使用包括來自整聯蛋白受體結合結構域之肽插入物(例如本文所闡述者)之rAAV載體。
對於與轉鐵蛋白受體或表現轉鐵蛋白受體之細胞有關之疾病或病症(例如高度表現轉鐵蛋白受體之腫瘤)而言，可使用包括來自轉鐵蛋白受體結合結構域之肽插入物(例如本文所闡述者)之rAAV載體。
對於與腫瘤有關之疾病或病症而言，可使用包括來自該腫瘤細胞靶向結構域之肽插入物之rAAV載體。
對於與視網膜或眼睛有關之疾病或病症而言，可使用包括來自該視網膜細胞歸巢結構域(包含HAD肽)之肽插入物之rAAV載體。肽插入物增加了視網膜嗜性，從而引導rAAV靶向個體之眼睛或視網膜並穿越血眼障壁。術語「視網膜細胞」係指發現於視網膜中或其附近之細胞類型中之一或多者，包含無長突細胞、雙極細胞、水平細胞、米勒神經膠質細胞、光感受器細胞(例如視桿及視錐)、視網膜神經節細胞(例如侏儒細胞、陽傘細胞、雙層細胞、巨視網膜神經節細胞及光敏性神經節細胞)、視網膜色素上皮、內限界膜之內皮細胞及諸如此類。
通常，在rAAV載體包括用於視網膜細胞歸巢之肽插入物之情形下，藉由活體內注射(例如直接注射至眼睛中)來投與載體。舉例而言，包括用於增加視網膜嗜性之肽插入物之rAAV可經玻璃體內注射。在一些實施例中，藉由眼內注射(例如穿過平坦部進入眼睛之玻璃體或房水中)來投與用於增加視網膜嗜性之rAAV。在一些實施例中，用於增加視網膜嗜性之rAAV係藉由眼球周注射或結膜下注射來投與。具有用於視網膜細胞歸巢之肽插入物之rAAV載體之一個優點在於，個體可避免手術(例如避免用以植入代之以藉由注射遞送之治療劑之手術)。在某些實施例中，藉由本文所闡述之rAAV載體經由玻璃體內注射來遞送治療劑，從而提供治療有效量以治療與眼睛有關之疾病或病症、尤其與個體視網膜有關之疾病或病症。在其他實施例中，在以下情形後達成治療：單一玻璃體內注射、不超過兩個玻璃體內注射、不超過三個玻璃體內注射、不超過四個玻璃體內注射、不超過五個玻璃體內注射或不超過六個玻璃體內注射。
與眼睛或視網膜有關之疾病/病症稱為「眼部疾病」。眼部疾病之非限制性實例包含前部缺血性視神經病變；急性黃斑性視神經視網膜病變；巴德-畢德氏症候群(Bardet-Biedl syndrome)；貝切特氏病(Behcet's disease)；視網膜分支靜脈阻塞；視網膜中央靜脈阻塞；無脈絡膜；脈絡膜新生血管形成；脈絡膜視網膜退化；視錐細胞與錐桿細胞營養不良；色覺病症(例如色盲、紅色盲、綠色盲及藍色盲)；先天性靜止性夜盲；糖尿病性眼色素層炎；視網膜前膜病症；遺傳性黃斑退化；組織胞漿菌病；黃斑退化(例如急性黃斑退化、非滲出性老年性黃斑退化、滲出性老年性黃斑退化)；糖尿病性視網膜病變；水腫(例如黃斑水腫、囊樣黃斑水腫、糖尿病性黃斑水腫)；青光眼；萊伯氏先天性黑蒙；萊伯氏遺傳性視神經病變；黃斑毛細血管擴張；多灶性脈絡膜炎；非視網膜病變性糖尿病性視網膜功能障礙；眼部創傷；眼部腫瘤；增殖性玻璃體視網膜病變(PVR)；早產兒視網膜病變；視網膜劈裂症；色素性視網膜炎；視網膜動脈阻塞性疾病、視網膜脫離、斯塔加特氏疾病(Stargardt disease) (眼底黃色斑點症)；交感性眼炎；葡萄膜擴散；葡萄膜炎性視網膜疾病；烏斯赫爾氏症候群(Usher syndrome)；伏格特-小柳-原田(Vogt Koyanagi-Harada，VKH)症候群；或與眼部雷射或光動力學療法有關之後眼病狀。
本發明rAAV載體亦可促進寡核苷酸、藥物、成像劑、無機奈米顆粒、脂質體、抗體至靶細胞或組織之遞送、尤其靶向遞送。rAAV載體亦可促進非編碼性DNA、RNA或寡核苷酸至靶組織之遞送、尤其靶向遞送。
該等藥劑可提供為如業內已知及/或如本文所闡述之醫藥上可接受之組合物。同樣，本發明rAAV分子可單獨投與或與其他防治劑及/或治療劑組合投與。
本文所提供投與之劑量含量及頻率係被術語治療有效及防治有效涵蓋。劑量及頻率通常根據每一患者之特定因素端視所投與特定治療或防治劑、疾病之嚴重程度及類型、投與途徑以及患者之年齡、體重、反應及過往醫學史而有所變化，且應根據從業人員之判斷及每一患者之情況來決定。適宜方案可由熟習此項技術者藉由考慮該等因素且藉由遵循(例如)文獻中所報導及Physician 's Desk Reference (第56版，2002)中所推薦之劑量來選擇。防治及/或治療劑可重複投與。若干程序態樣可有所變化，例如投與防治或治療劑之暫時方案及該等藥劑係單獨投與抑或以混合物形式投與。
可藉由標準臨床技術來確定本發明藥劑之有效量。可根據自活體外或動物模型測試系統獲得之劑量反應曲線來推斷有效劑量。對於本發明方法中所使用之任一藥劑而言，可首先自細胞培養分析估計治療有效劑量。可在動物模型中調配劑量以達成循環血漿濃度範圍(包含IC50 ，亦即達成症狀之半最大抑制之測試化合物之濃度)，如在細胞培養物中所測定。該資訊可用於更準確地確定人類可用之劑量。可藉由(例如)高效液相層析來量測血漿中之含量。
在用於人類中之前，可在適宜動物模型系統中測試防治及/或治療劑以及其組合。該等動物模型系統包含(但不限於)大鼠、小鼠、雞、牛、猴、豬、狗、兔等。可使用業內熟知之任一動物系統。該等模型系統廣泛使用且為熟習此項技術者所熟知。在一些實施例中，使用基於大鼠、小鼠或除靈長類動物外之其他小型哺乳動物之CNS病狀之動物模型系統。
一旦本發明之防治及/或治療劑已測試於動物模型中，其即可測試於臨床試驗中以確立其效能。根據熟習此項技術者已知之常用方法來進行確立性臨床試驗，且可確立本發明藥劑之最佳劑量及投與途徑以及毒性特徵。舉例而言，可設計臨床試驗以測試本發明rAAV分子在人類患者中之效能及毒性。
本發明之防治及/或治療劑之毒性及功效可在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥程序來測定，例如用於測定LD50 (群體之50%死亡的劑量)及ED50 (對群體之50%具有治療效應的劑量)的程序。毒性效應與治療效應間之劑量比係治療指數且可表示為比率LD50 /ED50 。展現較大治療指數之防治及/或治療劑較佳。儘管可使用展現毒性副效應之防治及/或治療劑，但應小心設計使該等藥劑靶向受影響組織之位點之遞送系統以最小化對未感染細胞之潛在損害且由此減少副效應。
本發明rAAV分子之投與時間及投與量通常可有效獲得期望治療及/或防治益處。可使用自細胞培養分析及動物研究獲得之數據來確定用於人類中之防治及/或治療劑之劑量範圍及/或時間表。該等藥劑之劑量在具有較少毒性或沒有毒性之循環濃度(包含ED50 )範圍內。該劑量可端視所用劑型及所用投與途徑在此範圍內有所變化。
用於患者之rAAV載體之治療有效劑量通常為約0.1 ml至約100 ml含有約1×109 至約1×1016 基因體rAAV載體或約1×1010 至約1×1015 、約1×1012 至約1×1016 或約1×1014 至約1×1016 AAV基因體之濃度的溶液。可監測轉基因之表現含量以測定/調節劑量含量、頻率、時間安排及諸如此類。
使用治療或防治有效量之本發明藥劑治療個體可包含單一治療或可包含一系列治療。舉例而言，包括本發明藥劑之醫藥組合物可每天一次、每天兩次或每天三次來投與。在一些實施例中，可以以下頻率投與藥劑：每天一次、每隔一天、每週一次、每週兩次、每兩週一次、每月一次、每6週一次、每兩個月一次、每年兩次或每年一次。亦應瞭解，某些藥劑之有效劑量(例如包括本發明之雙重抗原結合分子之藥劑之有效劑量)可在治療過程中有所增加或降低。
在一些實施例中，指示持續治療(例如長期)，例如持續治療及/或管控慢性疾病或病症。舉例而言，在特定實施例中，在一定時間段內投與本發明藥劑，例如持續至少6個月、至少一年、至少兩年、至少5年、至少10年、至少15年、至少20年或持續於有需要之個體之餘生中。
本發明rAAV分子可單獨投與或與其他防治劑及/或治療劑組合投與。每一防治或治療劑可在相同時間或以任一順序在不同時間點依序投與；然而，若不在相同時間投與，則其應在時間上充分靠近投與以提供期望治療或防治效應。每一治療劑可以任一適當形式且藉由任一適宜途徑單獨投與。
在各個實施例中，不同防治及/或治療劑係以以下間隔投與：小於1小時間隔、約1小時間隔、約1小時至約2小時間隔、約2小時至約3小時間隔、約3小時至約4小時間隔、約4小時至約5小時間隔、約5小時至約6小時間隔、約6小時至約7小時間隔、約7小時至約8小時間隔、約8小時至約9小時間隔、約9小時至約10小時間隔、約10小時至約11小時間隔、約11小時至約12小時間隔、不超過24小時間隔或不超過48小時間隔。在某些實施例中，兩種或更多種藥劑係在同一患者訪視內投與。
投與本發明藥劑之方法包含(但不限於)非經腸投與(例如真皮內、肌內、腹膜腔內、靜脈內及皮下，包含輸注或濃注)、硬膜外及藉由吸收穿過上皮或皮膚黏膜或黏膜襯裡(例如鼻內、口腔黏膜、直腸及腸黏膜等)。在特定實施例中，例如在轉基因意欲表現於CNS中之情形下，經由腰部穿刺或經由小腦延髓池投與載體。
在某些實施例中，本發明藥劑係經靜脈內投與且可與其他生物活性劑一起投與。
在另一具體實施例中，本發明藥劑可以持續釋放調配物形式來遞送，舉例而言，調配物提供延遲釋放且由此延長所投與藥劑之半衰期。適用之受控釋放系統包含(但不限於)擴散控制系統、溶劑控制系統及化學控制系統。擴散控制系統包含(例如)儲槽裝置，其中將本發明分子包封於裝置內，從而藉由穿過擴散障壁之滲透來控制分子釋放。常用儲槽裝置包含(例如)膜、膠囊、微膠囊、脂質體及空心纖維。單體式(基質)裝置係第二類擴散控制系統，其中雙重抗原結合分子分散或溶於速率控制基質(例如聚合物基質)中。本發明藥劑可均勻分散於整個速率控制基質中且釋放速率由穿過基質之擴散來控制。適用於單體式基質裝置中之聚合物包含天然聚合物、合成聚合物及以合成方式改質之天然聚合物以及聚合物衍生物。
可使用熟習此項技術者已知之任一技術來產生包括本文所闡述之一或多種藥劑之持續釋放調配物。例如參見美國專利第4,526,938號；PCT公開案WO 91/05548；PCT公開案WO 96/20698；Ning等人，「Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel,」Radiotherapy & Oncology , 39:179 189, 1996；Song等人，「Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,」 PDAJournal of Pharmaceutical Science & Technology , 50:372 397, 1995；Cleek等人，「Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,」Pro. Intl. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater ., 24:853 854, 1997；及Lam等人，「Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,」Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater ., 24:759 760, 1997，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。在一實施例中，可在受控釋放系統中使用幫浦(參見Langer之上文文獻；Sefton,CRC Crit. Ref. Biomed. Eng ., 14:20, 1987；Buchwald等人，Surgery , 88:507, 1980；及Saudek等人，N. Engl. J. Med ., 321:574, 1989)。在另一實施例中，可使用聚合材料來受控釋放包括雙重抗原結合分子或其抗原結合片段之藥劑(例如參見Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, N.Y. (1984)；Ranger及Peppas, J.,Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem ., 23:61, 1983；亦參見Levy等人，Science , 228:190, 1985；During等人，Ann. Neurol ., 25:351, 1989；Howard等人，J.Neurosurg ., 7 1:105, 1989)；美國專利第5,679,377號；美國專利第5,916,597號；美國專利第5,912,015號；美國專利第5,989,463號；美國專利第5,128,326號；PCT公開案第WO 99/15154號；及PCT公開案第WO 99/20253號)。在又一實施例中，受控釋放系統可置於治療靶(例如受影響關節)附近，由此僅需要全身性劑量之一部分(例如參見Goodson, Medical Applications of Controlled Release (見上文)，第2卷，pp.115 138 (1984))。其他受控釋放系統論述於Langer之綜述中(Science , 249:1527 1533, 1990)。
另外，可使用rAAV來活體內遞送用於諸如以下等科學研究之轉基因：光遺傳學、使用miRNA之基因敲低、用於條件性基因缺失之重組酶遞送、使用CRISPR之基因編輯及諸如此類。 5.5.  醫藥組合物及套組
本發明進一步提供包括醫藥上可接受之載劑及本發明藥劑之醫藥組合物，該藥劑包括本發明rAAV分子。在一些實施例中，醫藥組合物包括用於投與個體之與醫藥上可接受之載劑組合之rAAV。在一實施例中，術語「醫藥上可接受」意指已獲得聯邦或州政府管理機構批準或已列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他公認藥典中可用於動物(且更特定而言用於人類)中。術語「載劑」係指與藥劑一起投與之稀釋劑、佐劑(例如弗羅因德氏完全及不完全佐劑(Freund's complete and incomplete adjuvant))、賦形劑或媒劑。該等醫藥載劑可為無菌液體，例如水及油，包含石油、動物、植物或合成來源之彼等，包含(例如)花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及諸如此類。在經靜脈內投與醫藥組合物時，水係常用載劑。亦可採用鹽水溶液及水性右旋糖及甘油溶液作為液體載劑、尤其用於可注射溶液。適宜醫藥賦形劑包含澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、水稻、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇及諸如此類。醫藥上可接受之載劑、賦形劑及穩定劑之其他實例包含(但不限於)業內已知之緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包含抗壞血酸；低分子量多肽；蛋白質，例如血清白蛋白及明膠；親水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成鹽相對離子，例如鈉；及/或非離子型表面活性劑，例如TWEENTM 、聚乙二醇(PEG)及PLURONICSTM 。除上述成分外，本發明之醫藥組合物亦可包含潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、矯味劑、乳化劑、懸浮劑及防腐劑。該等組合物可採用溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、粉劑、持續釋放調配物及諸如此類之形式。
在本發明之某些實施例中，提供用於本發明方法中之醫藥組合物，該等醫藥組合物包括治療及/或防治有效量之本發明藥劑以及醫藥上可接受之載劑。
在某些實施例中，本發明藥劑係實質上純化的(亦即實質上不含限制其效應或產生不期副效應之物質)。在一具體實施例中，宿主或個體係動物，例如哺乳動物，例如非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)及靈長類動物(例如猴(例如食蟹猴)及人類)。在某一實施例中，宿主係人類。
本發明進一步提供可用於上述方法中之套組。在一實施例中，套組在(例如)一或多個容器中包括一或多種本發明藥劑。在另一實施例中，套組進一步在一或多個容器中包括一或多種可用於治療病狀之其他防治或治療劑。
本發明亦提供包裝於指示藥劑或活性劑之量之氣密性密封容器(例如安瓿或藥袋)中之本發明藥劑。在一實施例中，藥劑係以乾燥滅菌凍乾粉劑或無水濃縮物形式供應於氣密性密封容器中且可(例如)使用水或鹽水重構至用於投與個體之適當濃度。通常，藥劑係作為乾燥無菌凍乾粉劑以至少5 mg、更通常至少10 mg、至少15 mg、至少25 mg、至少35 mg、至少45 mg、至少50 mg或至少75 mg之單位劑量供應於氣密性密封容器中。凍乾藥劑應在其原始容器中儲存於2℃與8℃之間且藥劑應在重構之後12小時內、通常6小時內、5小時內、3小時內或1小時內投與。在一替代實施例中，本發明藥劑係以液體形式供應於指示藥劑或活性劑之量及濃度之氣密性密封容器中。通常，液體形式之藥劑以至少1 mg/ml、至少2.5 mg/ml、至少5 mg/ml、至少8 mg/ml、至少10 mg/ml、至少15 mg/kg或至少25 mg/ml供應於氣密性密封容器中。
本發明組合物包含可用於製造醫藥組合物之原料藥物組合物(例如不純或有菌組合物)以及醫藥組合物(亦即適於投與個體或患者之組合物)。原料藥物組合物可用於製備單位劑型，該等單位劑型(例如)包括防治或治療有效量之本文所揭示之藥劑或彼等藥劑及醫藥上可接受之載劑的組合。
本發明進一步提供醫藥包裝或套組，其包括一或多個填充有本發明藥劑之容器。另外，一或多種可用於治療靶疾病或病症之其他防治或治療劑亦可包含於醫藥包裝或套組中。本發明進一步提供醫藥包裝或套組，其包括一或多個填充有本發明醫藥組合物之成分之容器。視情況，該(等)容器可附帶有監管醫藥或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之公告，該公告顯示政府機構已批準用於人類投與之製造、使用或銷售。
通常，本發明組合物之成分可單獨供應或以單位劑型混合在一起，例如作為於指示藥劑或活性劑之量之氣密性密封容器(例如安瓿或藥袋)中之乾燥凍乾粉劑或無水濃縮物。倘若組合物擬藉由輸注來投與，則可使用含有無菌醫藥級水或鹽水之輸注瓶來分配該組合物。倘若組合物係藉由注射來投與，則可提供含有注射用無菌水或鹽水之安瓿，從而可在投與之前混合各成分。 6.     實例
下列實例報告AAV9衣殼上之表面暴露之環之分析以鑑別用於經由插入誘變進行衣殼工程改造的候選者。藉由實例方式來闡釋本發明，該等實例闡述經工程改造以含有基於人類軸絲動力蛋白重鏈尾部所設計之7聚體肽之rAAV9衣殼之構築。簡言之，使用三個準則來選擇可適用於短肽插入物之表面環：1)與毗鄰環具有最小側鏈相互作用；2)各血清型之間具有可變序列及結構(缺乏保守序列)；及3)可能中斷通常靶向之中和抗體表位。構築一組肽插入突變體且針對可行衣殼組裝、肽表面暴露及功效來篩選個別突變體。然後使用主要候選者作為用於插入歸巢肽之模板以測試該等肽插入點是否可用於使rAAV載體再靶向所關注組織。其他實例證實了本文所闡述之某些經修飾AAV衣殼之增加之轉導及組織嗜性。 6.1. 實例1 -AAV9衣殼之分析
圖 1 及 2 繪示9型腺相關病毒之可變區4 (AAV9 VR-IV)之分析(藉由與其他AAV VR-IV進行胺基酸序列對比) (圖 1) 及蛋白質模型(圖 2 )。如所看到，AAV9 VR-IV暴露於3重棘蛋白之尖端或外表面上。進一步之分析指示，在VR-IV與VR-V之間存在較少側鏈相互作用且VR-IV之序列及結構在各AAV血清型中可變，且另外可能中斷通常靶向之中和抗體表位且由此減小經修飾衣殼之免疫原性。 6.2.  實例2 -AAV9突變體之構築
構築8種AAV9突變體，其各自包含位於VR-IV環中之不同插入點處之異源肽。異源肽係FLAG標籤，其插入緊接在鑑別為pRGNX1090-1097之載體中之下列殘基之後，如表 4 中所展示。 表4
載體名稱 FLAG 標籤之 AAV9 VR-IV 插入位點
pRGNX1090 I451
pRGNX1091 N452
pRGNX1092 G453
pRGNX1093 S454
pRGNX1094 G455
pRGNX1095 Q456
pRGNX1096 N457
pRGNX1097 Q458
6.3.  實例3 -包裝效率之分析
圖 3 繪示野生型AAV9及八(8)種候選rAAV9載體(1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096及1097)之高包裝效率(以基因體拷貝/mL (GC/mL)形式)，其中候選載體各自在AAV9 VR-IV內之不同位點處含有FLAG插入物。所有載體皆與螢光素酶轉基因一起包裝於10 mL培養物中依賴於測定哪些插入點不中斷衣殼包裝；誤差槓代表平均值之標準誤差。
如所看到，所有候選者皆高效包裝。 6.4.  實例4 -表面FLAG暴露之分析
圖 4 繪示八(8)種候選rAAV9載體(1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096及1097)中之每一者中之FLAG插入物之表面暴露，如藉由經由結合至抗FLAG樹脂來免疫沈澱經轉導載體所證實。抗FLAG結合指示容許形成上表面上顯示肽插入物之衣殼之插入點。
將經轉導細胞裂解且離心。將500 µL細胞培養上清液加載於20 µL瓊脂糖-FLAG珠粒上且使用亦直接加載於凝膠上之SDS-PAGE加載緩衝液進行洗脫。對於陰性對照而言，使用不含FLAG插入物之293-ssc上清液。
如所看到，1090具有候選載體中之最低效價，從而指示最少蛋白質發生下拉。極低效價亦可見於陽性對照中。可能並未加載足夠量之陽性對照以用於在SDS-PAGE上進行觀察。 6.5.  實例5 -轉導效率之分析
圖 5A-5B 繪示經攜載螢光素酶基因(作為轉基因)之衣殼載體轉導之Lec2細胞中之轉導效率，該等衣殼載體係包裝成野生型AAV9 (9-luc)或八(8)種候選rAAV9載體(1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096及1097)中之每一者；活性表示為螢光素酶活性百分比(將9-luc之活性視為100%) (圖 5A )或表示為相對光單位(RLU)/微克蛋白質(圖 5B )。
在αMEM及10% FBS中生長CHO源Lec2細胞。以約2×108 GC載體之MOI (MOI為約10,000)來轉導Lec2細胞且使用ViraDuctin試劑進行處理(在以約10,000 GC/細胞之MOI轉導Lec2細胞但使用40 µg/mL氯化鋅(ZnCl2 )處理時觀察到類似結果；結果未展示)。Lec2細胞係來自CHO之脯胺酸營養缺陷物。
如所看到，活體外轉導效率低於使用野生型AAV9 (9-luc)所獲得者。然而，先前研究已展示，引入歸巢肽可降低非靶細胞(例如293、Lec2或HeLa)中之活體外基因轉移，而顯著增加靶細胞中之活體外基因轉移(例如參見 Nicklin等人，2001；及Grifman等人，2001)。 6.6.  實例6 -包裝效率作為插入肽組成及長度之因子的分析
圖 6A 繪示圖解說明緊接在AAV9衣殼(SEQ ID NO:118)之S454之後且具有不同肽長度及組成之插入物可影響AAV顆粒在包裝細胞系中之產生效率的條形圖。10種具有不同組成及長度之肽在S454之後(在殘基454與455之間)插入AAV9 VR-IV內。在轉染後5天對經轉染懸浮HEK293細胞之所收穫上清液實施qPCR。條形圖中所繪示之結果證實，插入物之性質及長度可影響以高效價產生AAV顆粒且包裝於293細胞中之能力。(誤差槓代表平均肽長度之標準誤差，其在Y軸上以括號註明。)
研究具有衣殼蛋白之AAV9載體，該衣殼蛋白在S454插入位點處含有具有下列肽序列之歸巢肽(表 5 )。在轉導於10mL培養基中之前一天，以1×106 個細胞/mL接種懸浮適應性HEK293細胞。使用PEIpro® (Polypus transfection)以1:1.75之DNA:PEI比率進行三重質體DNA轉染。下旋細胞且在轉染後5天上清液收穫，並儲存於-80℃下。表 5.
肽編號 組織或靶名稱 肽序列 SEQ ID NO:
P1 骨1 (D8) DDDDDDDD 9
P2 腦1 LSSRLDA 10
P3 腦2 CLSSRLDAC 11
P4 腎1 LPVAS 13
P5 腎2 CLPVASC 12
P6 肌肉1 ASSLNIA 14
P7 TfR1 HAIYPRH 17
P8 TfR2 THRPPMWSPVWP 18
P9 TfR3 RTIGPSV 19
P10 TfR4 CRTIGPSVC 20
在轉染後5天，對經轉染懸浮HEK293細胞之所收穫上清液實施qPCR。對試樣實施DNase I處理以去除殘餘質體或細胞DNA且然後熱處理以不活化DNase I並使衣殼變性。經由qPCR使用TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpEraseUNG (ThermoFisherScientific)及針對包裝於轉基因構築體中之聚A序列之引子/探針來滴定試樣。使用RGX-501載體BDS來建立標準曲線。
緊接在S454之後且長度介於5至10個胺基酸之間之肽插入物產生具有適當效價的AAV顆粒，而可能具有大小上限，其中針對具有12個胺基酸長度之肽插入物觀察到顯著包裝缺陷。 6.7.  實例7 -歸巢肽在插入S454之後時會改變AAV9之活體外轉導性質。
圖 6B-E 繪示(圖 6B ) Lec2細胞系(唾液酸缺陷性上皮細胞系)、(圖 6C ) HT-22細胞系(神經元細胞系)、(圖 6D ) hCMEC/D3細胞系(腦內皮細胞系)及(圖 6E ) C2C12細胞系(肌肉細胞系)之細胞培養物之螢光影像。使用含有GFP轉基因之AAV9野生型及表 5 中S454插入歸巢肽衣殼來轉導所述細胞系。
在轉導之前24小時，以5-20×103 個細胞/孔(端視細胞系)將細胞系平鋪於96孔中。使用AAV9-GFP載體(含有或不含插入物)以1×1010 個顆粒/孔轉導細胞且在轉導之後48至96小時(端視每一細胞系中之表現速率差異)經由Cytation5 (BioTek)進行分析。如實例5中一般來培養Lec2細胞，根據製造商方案來培養血腦障壁hCMEC/D3 (EMD Millipore)細胞，在DMEM及10% FBS中培養HT-22及HUH7細胞，且將C2C12肌母細胞平鋪於DMEM及10% FBS中並分化三天，然後在補充有2%馬血清及0.1%胰島素之DMEM中進行轉染。在所測試之每一細胞類型中，AAV9.S454.FLAG展示低轉導程度。
影像展示，在插入AAV9衣殼蛋白中之S454之後時，與未修飾AAV9衣殼相比，歸巢肽可改變AAV9之活體外轉導性質。用於所有細胞系之P7 (TfR1肽，HAIYPRH (SEQ ID NO: 17))展示最高轉導速率，隨後係P9 (TfR3肽，RTIGPSV (SEQ ID NO: 19))。在所有細胞類型中，P4 (腎1肽，LPVAS (SEQ ID NO: 13))所展示之轉導速率略高於AAV9野生型。與Lec2及HT-22細胞系培養物相比，在腦內皮hCMEC/D3細胞系及C2C12肌肉細胞系培養物中針對P6 (肌肉1肽，ASSLNIA (SEQ ID NO: 14))觀察到較高轉導速率。P1載體因極低轉導效率而未包含於影像中，且P8載體因低效價而未包含。 6.8.  實例8 -人類軸絲動力蛋白(HAD)之分析
圖 7A 至 7M 分別繪示人類軸絲動力蛋白1-12、14及17之重鏈尾部結構域之胺基酸序列。 6.9.  實例9 -AAV衣殼之肽插入點分析
圖 8 繪示具有用於人類軸絲動力蛋白肽之插入位點之AAV 1-9e、rh10、rh20、rh39、rh74及hu.37之衣殼序列之比對，該等插入位點位於VP2之起始密碼子、可變區1 (VR-I)、可變區4 (VR-IV)及可變區8 (VR-VIII)內或其附近且以灰色突出顯示；每一衣殼蛋白之可變區8 (VR-VIII)內之特定插入位點由符號「#」展示(在根據AAV9之胺基酸編號之胺基酸殘基588之後)。 6.10. 實例10 -含有ARA290之rAAV衣殼之構築
圖 9 繪示在AAV9衣殼胺基酸序列之Q588與A589之間包含肽插入物ARA290之重組AAV9載體衣殼之胺基酸序列(SEQ ID NO: 153)。 6.11.  實例11 -各種載體之AAV基因體拷貝/µg基因體DNA之對比
圖 10 繪示在投與下列AAV載體後表現於小鼠腦細胞中之GFP (綠色螢光蛋白)轉基因拷貝：AAV9；AAV.PHP.eB；AAV.hDyn (在588-589之間具有TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)且衣殼序列並無其他胺基酸修飾之AAV9)；AAV.PHP.S；及AAV.PHP.SH (參見表 10 )。
AAV.PHP.B係在AAV9衣殼中具有TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)插入物之衣殼，其中衣殼序列並無其他胺基酸修飾。AAV.PHP.eB係在AAV9衣殼中具有TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)插入物之衣殼，其中衣殼序列在PHP.B插入物上游具有兩個胺基酸修飾(亦參見表 10 )。表 6A 匯總研究中所用之衣殼。表 6A
名稱 母體衣殼 突變 插入物 2 位置 肽 2 SEQ ID NO:
AAV9 AAV9 - - -   
PHP.B AAV9 - 588_589 TLAVPFK 27
PHP.eB AAV9 586A_587Q delinsDG 588_589 TLAVPFK 27
AAV.hDyn AAV9 - 588_589 TLAAPFK 2
AAV.PHP.S AAV9 - 588_589 QAVRTSL 23
AAV.PHP.SH AAV9 - 588_589 QAVRTSH 24
材料及方法
製備編碼GFP轉基因之AAV9、AAV.PHPeB、AAV.hDyn、AAV.PHP.S及AAV.PHP.SH之構築體且調配於1xPBS + 0.001%普羅尼克(Pluronic)中。基於第1天體重將雌性C57BL/6小鼠隨機化至治療組中。根據下文表 6B ，向5組雌性C57BL/6小鼠各自經靜脈內投與AAV9.GFP、AAV.PHPeB.GFP、AAV.hDyn.GFP、AAV.PHP.S.GFP或AAV.PHP.SH.GFP。投藥體積為10 mL/kg (0.200 mL/20 g小鼠)。小鼠在開始日期時為8-12週齡。在投與後第15天，對動物實施安樂死，且收集周邊組織(包含腦組織、肝、前肢二頭肌、心臟、腎、肺、卵巢及坐骨神經)。 表6B
組 N 藥劑 調配物劑量 途徑 時間表
1 9 AAV9 2.5E12 GC/kg iv 第1天  
2 5 PHPeB 2.5E12 GC/kg iv 第1天  
3 5 hDyn 2.5E12 GC/kg iv 第1天  
4 5 PHP.S 2.5E12 GC/kg iv 第1天  
5 5 PHP.SH 2.5E12 GC/kg iv 第1天  
使用定量PCR (qPCR)來測定每µg腦基因體DNA中之載體基因體數量。處理來自經注射小鼠之腦試樣且使用來自Qiagen之血液及組織基因體DNA套組來分離基因體DNA。在QuantStudio 5儀器(Life Technologies Inc)上使用對eGFP具有特異性之引子-探針組合遵循標準曲線方法來運行qPCR分析。
投與AAV.hDyn之小鼠中之AAV載體基因體拷貝/µg腦基因體DNA至少高於所有其他AAV血清型：AAV9、AAV.PHPeB、PHP.S及PHP.SH一個對數(參見圖 10 )。如可在此研究中看到，AAV.hDyn之GC/µg基因體DNA最高，AAV.hDyn係在AAV9衣殼之殘基588至589之間含有「TLAAPFK」 (SEQ ID NO: 2)肽插入物(來自人類軸絲動力蛋白之肽)之AAV9衣殼。研究證實，在全身性投與攜載eGFP之AAV.hDyn之5隻小鼠中，小鼠腦中之平均轉導大於1E04 GC/µg轉基因。然而，其他經修飾AAV9衣殼(包含載體AAV.PHPeB，其含有「TLAVPFK」 (SEQ ID NO: 27)序列(來自小鼠動力蛋白之肽))在全身性治療後顯示，小鼠腦中之轉導小於1E03 GC/µg轉基因。 6.12.  實例12 -組織歸巢rAAV載體在治療方法中之應用
鑑別可藉由提供核酸(轉基因)來治療/預防之病症(參見表3A至3B)。鑑別患有與靶組織有關之病症之個體。向個體投與第一量之本發明rAAV載體，其中該載體包括具有歸巢至靶組織之肽插入物且攜載擬遞送之轉基因之衣殼蛋白。若需要，則向個體投與第二或第三劑量之載體，直至將治療有效量之轉基因遞送至靶組織以向個體提供治療或防治益處為止。
在一些實施例中，提供向視網膜投與轉基因之方法，其中經靜脈內、全身性或經玻璃體內投與衣殼化轉基因之AAV.hDyn衣殼。 6.13.  實例13 -含有TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)之rAAV衣殼之構築
圖 11A 繪示在VR-IIIV之Q588與A589之間包含具有胺基酸序列TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 11B 繪示在VR-III之S268與S269之間包含具有胺基酸序列TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列。所插入肽以粗體表示。
圖 11C 繪示在VR-IV之S454與G455之間包含具有胺基酸序列TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。 6.14.  實例14 -含有KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)之rAAV衣殼之構築
圖 12A 繪示在VR-IIIV之Q588與A589之間包含具有胺基酸序列KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 12B 繪示在VR-III之S268與S269之間包含具有胺基酸序列KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 12C 繪示在VR-IV之S454與G455之間包含具有胺基酸序列KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。 6.15.  實例15 -含有QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)之rAAV衣殼之構築
圖 13A 繪示在VR-IIIV之Q588與A589之間包含具有胺基酸序列QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 13B 繪示在VR-III之S268與S269之間包含具有胺基酸序列QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 13C 繪示在VR-IV之S454與G455之間包含具有胺基酸序列QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。 6.16.  實例16 -含有RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)之rAAV衣殼之構築
圖 14A 繪示在VR-IIIV之Q588與A589之間包含具有胺基酸序列RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 14B 繪示在VR-III之S268與S269之間包含具有胺基酸序列RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 14C 繪示在VR-IV之S454與G455之間包含具有胺基酸序列RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。 6.17.  實例17 -含有LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)之rAAV衣殼之構築
圖 15A 繪示在VR-IIIV之Q588與A589之間包含具有胺基酸序列LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 15B 繪示在VR-III之S268與S269之間包含具有胺基酸序列LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 15C 繪示在VR-IV之S454與G455之間包含具有胺基酸序列LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。 6.18.  實例18 -含有PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)之rAAV衣殼之構築
圖 16A 繪示在VR-IIIV之Q588與A589之間包含具有胺基酸序列PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 16B 繪示在VR-III之S268與S269之間包含具有胺基酸序列PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 16C 繪示在VR-IV之S454與G455之間包含具有胺基酸序列PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。 6.19.  實例19 -含有TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)之rAAV衣殼之構築
圖 17A 繪示在VR-IIIV之Q588與A589之間包含具有胺基酸序列TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 17B 繪示在VR-III之S268與S269之間包含具有胺基酸序列TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 17C 繪示在VR-IV之S454與G455之間包含具有胺基酸序列TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。 6.20.  實例20 -含有LGETTRP (SEQ ID NO: 15)之rAAV衣殼之構築
圖 18A 繪示在VR-IIIV之N590與T591之間包含具有胺基酸序列LGETTRP (SEQ ID NO: 15)之肽插入物之重組AAV8載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 18B 繪示在VR-III之A269與T270之間包含具有胺基酸序列LGETTRP (SEQ ID NO: 15)之肽插入物之重組AAV8載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 18C 繪示在VR-IV之T453與T454之間包含具有胺基酸序列LGETTRP (SEQ ID NO: 15)之肽插入物之重組AAV8載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。 6.21.  實例21 -含有LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)之rAAV衣殼之構築
圖 19A 繪示在VR-IIIV之N590與T591之間包含具有胺基酸序列LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)之肽插入物之重組AAV8載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 19B 繪示在VR-III之A269與T270之間包含具有胺基酸序列LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)之肽插入物之重組AAV8載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。
圖 19C 繪示在VR-IV之T453與T454之間包含具有胺基酸序列LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)之肽插入物之重組AAV8載體衣殼的胺基酸序列 。所插入肽以粗體表示。 6.22.  實例22：經修飾衣殼之活體外及活體內評價
藉由肽插入或引導誘變來修飾AAV衣殼序列且加以彙集以得到與GFP表現盒包裝至一起之條碼化庫。然後在活體外分析中評估經修飾載體，且在小鼠中使用次世代測序(NGS)及定量PCR來評價活體內生物分佈。將AAV.hDyn鑑別為此池中之高腦轉導載體且在小鼠中於個別遞送研究中進一步評估以表徵其轉導特徵。另外，對腦切片實施免疫組織化學分析以理解此載體之細胞嗜性。 6.22.1    實例22A -穿越血腦障壁之轉導之活體外測試
在活體外transwell分析中使用hCMEC/D3 BBB細胞(SCC066, Millipore-Sigma)來測試經修飾衣殼穿越血腦障壁之能力(參見圖 20A-20B )。更具體而言，該分析基本上係改編自Sade, H.等人(2014 PLoS ONE 9(4): e96340) A human Blood-Brain Barrier transcytosis assay reveals Antibody Transcytosis influenced by pH-dependent Receptor Binding，2014年4月，第9卷，第4期；及Zhang, X., Blood-brain barrier shuttle peptides enhance AAV transduction in the brain after systemic administration, 2018Biomaterials 176: 71-83。簡言之，將5×104 個hCMEC/D3細胞/cm2 接種於12孔板中之經膠原塗覆之transwell插件中。每一插件含有500 µL培養基且下室含有1 mL培養基。每隔一天更換培養基。在接種後10天(零(0)時間點)去除上清液。在此0時間點下，藉由將1×109 GC載體添加至上插入室培養基中來轉導細胞。在轉導後以間隔0.5、3、6及23小時取出10µL下室上清液試樣以供測試。一式兩份測試每一條件(載體)，且經由qPCR針對聚A一式三份量測效價。
圖 20A 至 20B 繪示AAV.hDyn (在胺基酸殘基588至589之間具有TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)之AAV9)穿越血腦障壁(BBB)細胞層之活體外transwell分析(圖 20A )；且結果展示，AAV.hDyn (由圖中之倒三角形指示)穿越分析之BBB細胞層之速度快於AAV9 (正方形)且在更大程度上快於AAV2 (圓) (圖 20B )。所研發活體外分析預測了增強之BBB穿越輸送且亦可使用類似分析來預測至其他器官之靶向。 6.22.2    實例22B -經修飾衣殼之轉導及生物分佈  6.22.2.1   材料及方法
藉由在以下位置插入各種肽序列來對廣泛使用之AAV衣殼(包含AAV8、AAV9及AAVrh.10)實施衣殼修飾：在VR-IV之位置S454之後(表 7 )，或在AAV衣殼之VR-VIII表面暴露環之位置Q588之後，以及插入VP2之起始密碼子(其始於胺基酸137 (AAV4、AAV4-4及AAV5)或胺基酸138 (AAV1、AAV2、AAV3、AAV3-3、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9e、rh.10、rh.20、rh.39、rh.74及hu.37))之後(圖 8 ) (某些衣殼序列亦參見表 10 )。亦使用所選單一至多個胺基酸突變來修飾衣殼。亦參見Yost等人，Structure-guided engineering of surface exposed loops on AAV Capsids. 2019 ASGCT Annual Meeting；及Wu等人，2000J. Virology (見上文)。 據證實，在小規模進行該等衣殼修飾中之任一者後，包裝效率並無負面影響。
在活體外於Lec2細胞中測試具有某些經修飾衣殼之rAAV之轉導，如上文在實例5中所闡述。在Lec2細胞中測試轉導之經修飾AAV如下：eB 588 Ad、eB 588 Hep、eB 588 p79、eB 588 Rab、AAV9 588 Ad、AAV9 588 Hep、AAV9 588 p79、AAV9 588 Rab、eB VP2 Ad、eB VP2 Hep、eB VP2 p79、eB VP2 Rab、AAV9 VP2 Ad、AAV9 VP2 Hep、AAV9 VP2 p79、AAV9 VP2 Rab (與AAV9相比)。關於AAV衣殼之一致性，參見下文表 7B 。
為測試生物分佈，將經修飾AAV與含有對應於每一個別衣殼之特定條碼之eGFP轉基因盒包裝至一起。彙集新穎條碼化載體且注射至小鼠中以增加篩選效率。
為分析基因改變之AAV載體之生物分佈，製備各種編碼GFP之載體且調配於1×PBS + 0.0001%普羅尼克酸中。使用含有十(10)個bp條碼之順式質體製備所有載體以使得能夠獲得次世代測序(NGS)庫(池)製劑。根據表 7A 至 C ，將三(3)個載體池(研究1、研究2及研究3載體) 經靜脈內注射至5隻雌性C57Bl/6小鼠之小組中。每一研究之投藥體積為10 mL/kg (0.2mL/20g小鼠)。
基於第1天體重將小鼠隨機化至治療組中且其在開始日期之年齡為8至12週。在投與後第15天，對動物實施安樂死且收集周邊組織(包含腦、腎、肝、坐骨神經、肺、心臟及肌肉組織)。在個別地注射來自池之所選衣殼之研究中，遵循相同方案。
使用來自Qiagen之DNeasy Blood and Tissue套組(69506)自組織試樣分離基因體DNA (gDNA)。使用如由製造商(Illumina)所推薦含有用於NGS以及獨特雙重索引(UDI)及多重測序策略之重疊之引子來擴增每一載體之條碼區域。使用利用試劑nano and micro套組v2 (MS-103-1001/1002)之Illumina MiSeq來測定自小鼠收集之每一試樣中每一條碼化AAV載體之相對豐度。因此，如上所述將下文表 7A 至 C 中之每一載體試樣條碼化以容許鑑別每一讀數且在最終數據分析之前加以分選。基於原始注射池中之AAV組成將數據正規化，且使用自qPCR分析獲得之總基因體拷貝數利用條碼化試樣之特異性引子-探針組合加以量化。表 7A
研究 1 名稱 衣殼 插入點 肽 註解
BC01 AAV9 AAV9 - - 藍色條，圖 21
BC02 PHP.eB PHP.eB 588_589 TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)
BC03 AAV8.BBB 經修飾AAV8 - - A269S
BC04 AAV9.BBB 經修飾AAV9 - - S263G/S269T/A273T
BC05 AAV8.BBB.LD 經修飾AAV8 - - A269S, 498-NNN/AAA-500
BC06 AAV9.BBB.LD 經修飾AAV9 - - S263G/S269T/A273T, 496-NNN/AAA-498
BC07 rh.10 rh.10 - -
BC08 rh.10.LD 經修飾rh.10 - - 498-NNN/AAA-500
BC09 AAV.hDyn 經修飾AAV9 588_589 TLAAPFK (SEQ ID NO: 2) 橙色條，圖 21
BC10 PHP.S PHP.S 588_589 QAVRTSL (SEQ ID NO: 23) -
BC11 PHP.SH PHP.SH 588_589 QAVRTSH (SEQ ID NO: 24) -
BC13 rh39 rh.39 - - -
表 7B
研究 2 名稱 衣殼 插入點 肽 註解
BC20 eB 588 Ad PHP.eB 588_589 SITLVKSTQTV (SEQ ID NO: 21) 代替TLAVPFK肽(SEQ ID NO: 27)
BC21 eB 588 Hep PHP.eB 588_589 TILSRSTQTG (SEQ ID NO: 22) 代替TLAVPFK肽(SEQ ID NO: 27)
BC22 eB 588 p79 PHP.eB 588_589 VVMVGEKPITITQHSVETEG (SEQ ID NO: 25) 代替TLAVPFK肽(SEQ ID NO: 27)
BC23 eB 588 Rab PHP.eB 588_589 RSSEEDKSTQTT (SEQ ID NO: 26) 代替TLAVPFK肽(SEQ ID NO: 27)
BC24 9 588 Ad AAV9 588_589 SITLVKSTQTV (SEQ ID NO: 21)
BC25 9 588 Hep AAV9 588_589 TILSRSTQTG (SEQ ID NO: 22)
BC26 9 588 p79 AAV9 588_589 VVMVGEKPITITQHSVETEG (SEQ ID NO: 25)
BC27 9 588 Rab AAV9 588_589 RSSEEDKSTQTT (SEQ ID NO: 26)
BC28 eB VP2 Ad PHP.eB 138_139 SITLVKSTQTV (SEQ ID NO: 21) 亦具有插入殘基588之後之TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)
BC29 eB VP2 Hep PHP.eB 138_139 TILSRSTQTG (SEQ ID NO: 22) 亦具有插入殘基588之後之TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)
BC30 eB VP2 p79 PHP.eB 138_139 VVMVGEKPITITQHSVETEG (SEQ ID NO: 25) 亦具有插入殘基588之後之TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)
BC31 AAV9 AAV9 - -
BC32 eB VP2 Rab PHP.eB 138_139 RSSEEDKSTQTT (SEQ ID NO: 26) 亦具有插入殘基588之後之TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)
BC33 9 VP2 Ad AAV9 138_139 SITLVKSTQTV (SEQ ID NO: 21)
BC34 9 VP2 Hep AAV9 138_139 TILSRSTQTG (SEQ ID NO: 22)
BC35 9 VP2 p79 AAV9 138_139 VVMVGEKPITITQHSVETEG (SEQ ID NO: 25)
BC36 9 VP2 Rab AAV9 138_139 RSSEEDKSTQTT (SEQ ID NO: 26)
表 7C
研究 3 名稱 衣殼 插入點 肽 註解
BC01 AAV9 AAV9 - -
BC03 AAV8-BBB AAV8 - - A269S
BC07 rh10 rh.10 - -
BC09 AAV.hDyn AAV.hDyn 588_589 TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)
BC12 PHP.B PHP.B 588_589 TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)
BC20 AAV9 S454-D8 AAV9 454_455 DDDDDDDD (SEQ ID NO: 9)
BC22 AAV9 S454-腦1 AAV9 454_455 LSSRLDA (SEQ ID NO: 10)
BC23 AAV9 S454-腦1C AAV9 454_455 CLSSRLDAC (SEQ ID NO: 11)
BC24 AAV9 S454-腎1 AAV9 454_455 LPVAS (SEQ ID NO: 13)
BC25 AAV9 S454-腎1C AAV9 454_455 CLPVASC (SEQ ID NO: 12)
BC26 AAV9 S454-肌肉1 AAV9 454_455 ASSLNIA (SEQ ID NO: 14)
BC27 AAV9 S454-TfR1 AAV9 454_455 HAIYPRH (SEQ ID NO: 17)
BC29 AAV9 S454-TfR3 AAV9 454_455 RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)
BC30 AAV9 S454-TfR4 AAV9 454_455 CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)
BC31 AAV9 S454-FLAG AAV9 454_455 DYKDDDDK (SEQ ID NO: 52)
BC37 pRGX1005-PHP.eB (no BC) PHP.eB 588_589 TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)
在個別地注射來自池之所選衣殼之研究中，使用qPCR測定每µg組織基因體DNA中之載體基因體數量。在QuantStudio 5 (Life Technologies, Inc.)使用eGFP之特異性引子-探針組合遵循標準曲線方法來進行qPCR (圖 22 )。
在將個別載體注射至小鼠中以供表徵之研究中，將福爾馬林(formalin)固定之小鼠腦在振動刀片切片機(VT1000S, Leica)上以40µm厚度切片且使用針對GFP之抗體探測浮動切片以查看所遞送載體之細胞分佈。
更具體而言，使用Vibratome (Leica, VT-1000)將來自注射AAV.hDyn之小鼠之固定腦切片，且使用抗GFP抗體(AB3080, Millipore Sigma)、Vectastain ABC套組(PK-6100, Vector Labs)及DAB過氧化物酶套組(SK-4100, Vector Labs)評估GFP表現。GFP表現細胞廣泛分佈於注射AAV.hDyn之小鼠之整個腦中，包含分佈於腦之皮質、紋狀體及海馬體中。圖 23A 至 23C 展示來自該等區域之影像且比例尺為400um (論述於下文中)。 6.22.2.2   結果
結果展示於圖 21 、圖 22A 至 22H 及圖 23A 至 23C 中。
未展示Lec2細胞轉導分析之數據。AAV9 588 Hep (在位置588之後插入肽TILSRSTQTG (SEQ ID NO: 22) (表1b中之DLC-AS2)之AAV9)所展現之轉導顯著大於(4倍)野生型AAV9，且AAV9 VP2 Ad (在位置138之後插入肽SITLVKSTQTV (SEQ ID NO: 21) (表1b中之DLC-AS1)之AAV9)、AAV9 VP2 Hep (在位置138之後插入肽TILSRSTQTG (SEQ ID NO: 22) (表1b中之DLC-AS2)之AAV9)及AAV9 VP2 Rab (在位置138之後插入肽RSSEEDKSTQTT (SEQ ID NO: 26) (表1b中之DLC-AS4)之AAV9)所展現之Lec2細胞轉導略大於AAV9。所分析其他AAV展現低於AAV9之轉導程度。
圖 21 繪示腦gDNA之次世代測序(NGS)分析之結果，其揭示在靜脈內注射後遞送至小鼠腦之衣殼池之相對豐度(組成百分比)。基於原始注射池中之AAV組成將數據正規化，且使用自qPCR分析獲得之總基因體拷貝數利用eGFP序列之特異性引子-探針組合加以量化。所展示數據係來自三個不同實驗。虛線指示彙集至一起之載體。使用親代AAV9作為標準品且包含於每一池中。「BC」識別符係如上文表7A、7B及7C中所指示。
圖 22A 至 22H 繪示雌性C57Bl/6小鼠中之AAV.hDyn之活體內轉導特徵，其展示幼稚小鼠或在腦(圖 22A )、肝(圖 22B )、心臟(圖 22C )、肺(圖 22D )、腎(圖 22E )、骨骼肌(圖 22F )、坐骨神經(圖 22G )及卵巢(圖 22H )中注射AAV9或AAV.hDyn之小鼠中之拷貝數/微克gDNA，其中AAV.hDyn與AAV9相比展示增加之腦生物分佈。在投與AAV.hDyn之小鼠中，每µg腦基因體DNA中之AAV載體基因體拷貝至少高於親代AAV9載體一個對數。
圖 23A 至 23C 展示上述免疫組織化學分析中所分析之區域之影像；比例尺為400 µm。圖 23A 至 23C 繪示整個腦中來自AAV.hDyn之GFP分佈，其中來自紋狀體(圖 23A )、海馬體(圖 23B )及皮質(圖 23C )之腦切片之免疫組織化學染色之影像揭示了藉由經修飾載體達成的整體性腦轉導。 6.22.2.3   結論
藉由VR-IV及VR-VIII之表面暴露環中之插入物或藉由特定胺基酸突變所實施之AAV衣殼修飾並不影響其包裝效率且能夠在本文所闡述之產生系統中產生類似效價。
與所測試之其他經修飾AAV載體及AAV9相比，向小鼠經靜脈內投與AAV.hDyn會產生較高之病毒基因體相對豐度及較大腦細胞轉導。 6.23.   實例23 -歸巢肽腎1C在全身性遞送後顯示增強之轉導
藉由肽插入來修飾AAV衣殼序列且加以彙集以得到與GFP表現盒包裝至一起之條碼化庫。然後在小鼠中使用次世代測序(NGS)及定量PCR活體內評估經修飾AAV9載體之生物分佈特徵。在VR-IV之S454與G455之間包含具有胺基酸序列CLPVASC (SEQ ID NO: 12) (腎1C)或ASSLNIA (SEQ ID NO: 14) (肌肉 1)之肽插入物的重組AAV9載體展示增加之腎轉導效率(與肝相比)(圖 24 )。 6.23.1   材料及方法
藉由將各種歸巢肽序列插入AAV衣殼之VR-IV表面暴露環之位置S454之後來對AAV9實施衣殼修飾。據證實，在小規模進行該等衣殼修飾中之任一者後，包裝效率並無負面影響。肽序列展示於下文之表 8 中。將所有經修飾AAV與含有對應於每一個別衣殼之特定條形碼之eGFP轉基因盒包裝至一起。彙集該等新穎條碼化載體以增加篩選效率(如上文在實例22B中所闡釋；參見研究3，表 7C )。
將經基因改變之AAV載體經靜脈內注射至小鼠中，如上文在實例22B中針對研究3之經改變載體所闡釋。基於原始注射池中之AAV組成將數據正規化並使用自qPCR分析獲得之總基因體拷貝數利用eGFP序列之特異性引子-探針組合加以量化，且更仔細地檢驗腎至肝組織靶向。 6.23.2   結果及結論
圖 24 繪示具有不同歸巢肽插入物(表 8 )之AAV9 S454載體在雌性C57Bl/6小鼠中之腎/肝活體內轉導比。使用腎/肝轉導與經修飾衣殼池之總腎轉導進行計算。AAV9 S454腎1及AAV9 S454腎2 (腎1C)所展示之腎生物分佈大於親代AAV9。儘管親代AAV9載體所展示之肝轉導大於腎(比率為約0.25)，但插入腎歸巢肽1C (亦及肌肉1)使得此比率增至約1.0。在投與AAV9 S454腎1或AAV9 S454肌肉1之小鼠中，每µg腎gDNA中之AAV載體基因體拷貝高於所有其他AAV9 S454載體至少5倍(參見圖 24 )。表 8. 生物分佈研究中所使用之歸巢肽
名稱 衣殼 肽插入位置 肽名稱 肽序列 SEQ ID NO:
AAV9 AAV9 454_455 - -   
AAV9 S454-P2 AAV9 454_455 腦1 LSSRLDA 10
AAV9 S454-P3 AAV9 454_455 腦2 (腦1C) CLSSRLDAC 11
AAV9 S454-P4 AAV9 454_455 腎1 LPVAS 13
AAV9 S454-P5 AAV9 454_455 腎2 (腎1C) CLPVASC 12
AAV9 S454-P6 AAV9 454_455 肌肉1 ASSLNIA 14
AAV9 S454-P7 AAV9 454_455 Tfr1 HAIYPRH 17
AAV9 S454-P9 AAV9 454_455 Tfr3 RTIGPSV 19
AAV9 S454-P10 AAV9 454_455 Tfr4 CRTIGPSVC 20
藉由在VR-IV表面暴露環中插入不同歸巢肽來實施之AAV衣殼修飾並不影響其包裝效率且能夠在本文所闡述之產生系統中產生類似效價。
較其他經修飾AAV9載體及所測試親代AAV9載體，向小鼠經靜脈內投與AAV9 S454腎1及AAV9 S454腎1C會產生較高之病毒基因體相對豐度及較大腎細胞轉導。向小鼠經靜脈內投與AAV9 S454腎1或AAV9 S454肌肉1載體亦產生較低肝細胞轉導。 6.24.  實例24-含有TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)之rAAV衣殼之構築
圖 25 繪示在VR-IV之S454與G455之間包含具有胺基酸序列TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)之肽插入物之重組AAV9載體衣殼的胺基酸序列 。 6.25.  實例25 - rAAV載體池在食蟹猴中之生物分佈
在食蟹猴中進行單一靜脈內、大腦心室內或玻璃體內注射後，評估具有經工程改造衣殼及GFP轉基因之重組AAV之池之投與、活體內及死亡後觀察以及生物分佈(表 9 )。該池含有多個衣殼，每一衣殼含有容許在投與食蟹猴後使用次世代測序(NGS)分析進行鑑別之獨特條碼識別符。選擇食蟹猴作為測試系統，此乃因已確立其可用於且可接受作為用於大型動物物種中之AAV生物分佈研究並進一步轉用於人類之模型。此研究中之所有動物皆未使用先前治療進行治療。該池可至少包括表 9 中所列示之具有經工程改造衣殼之下列重組AAV。表 9. 用於食蟹猴研究之重組 AAV
名稱 衣殼 衣殼修飾 插入位置 肽 肽 SEQ ID NO:
AAV8 AAV8 - - -   
AAV8.BBB 經修飾AAV8 A269S - -   
AAV8.BBB.LD 經修飾AAV8 A269S, 498-NNN/AAA-500 - -   
AAV9 AAV9 - - -   
AAV9 S454-腦1 AAV9 - 454_455 LSSRLDA 10
AAV9 S454-腦1C AAV9 - 454_455 CLSSRLDAC 11
AAV9 S454-D8 AAV9 - 454_455 DDDDDDDD 9
AAV9 S454-腎1 AAV9 - 454_455 LPVAS 13
AAV9 S454-腎1C AAV9 - 454_455 CLPVASC 12
AAV9 S454-肌肉1 AAV9 - 454_455 ASSLNIA 14
AAV9 S454-Tfr1 AAV9 - 454_455 HAIYPRH 17
AAV9 S454-Tfr3 AAV9 - 454_455 RTIGPSV 19
AAV9 S454-TfR3C AAV9 - 454_455 CRTIGPSVC 20
AAV9.496NNN/AAA498 經修飾AAV9 498-NNN/AAA-500 - -   
AAV9.496NNN/AAA498。W503R 經修飾AAV9 498-NNN/AAA-500, W503R - -   
AAV9.588Ad AAV9 - 588_589 SITLVKSTQTV 21
AAV9.588Herp AAV9 - 588_589 TILSRSTQTG 22
AAV9.BBB 經修飾AAV9 S263G/S269T/A273T - -   
AAV9.BBB.LD 經修飾AAV9 S263G/S269T/A273T, 496-NNN/AAA-498 - -   
AAV9.Q474A 經修飾AAV9 Q474A - -   
AAV9.W503R 經修飾AAV9 W503R - -   
AAVPHPeB.VP2Ad PHP.eB - 138_139 SITLVKSTQTV 21
AAVPHPeB.VP2Herp PHP.eB - 138_139 TILSRSTQTG 22
PHP.B AAV9 - 588_589 TLAVPFK 27
PHP.eB 經修飾PHP.B A587D, Q588G 588_589 TLAVPFK 27
PHP.hB   
PHP.S AAV9 - 588_589 QAVRTSL 23
PHP.SH AAV9 - 588_589 QAVRTSH 24
6.25.1. 研究設計
使用9隻雌性食蟹猴動物。根據體重使用電腦生成之隨機數將基於臨床體徵數據及預篩選抗體效價判斷為適用於實驗之動物置於研究組中。使用三個不同投與途徑且收集相關組織以評估與不同途徑有關之生物分佈(藉由NGS及PCR量測)。向三隻動物之左側心室中植入導管以供大腦心室內(ICV)劑量投與(組1)，三隻動物接受單一靜脈內輸注(組2)且三隻動物接受單一玻璃體內注射(組3)。兩隻動物用作代替動物且視需要實施植入。組1中之動物將進行MRI掃描以確定適當放置ICV導管之坐標。
以3 mL/min之速率投與靜脈內輸注，隨後投與0.2 mL媒劑以自靜脈內導管沖洗劑量。三隻靜脈內動物將以4 mL/kg之體積接受單一劑量之經彙集重組AAV。總劑量(vg)及劑量體積(mL/kg)記錄於原始數據中。基於文獻綜述及在非人類靈長類動物中之先前研究，經確定需要1×1013 GC/kg體重之IV劑量以自全身性遞送在CNS以及周邊組織(包含骨骼肌)中獲得期望分佈。
ICV植入動物將以1 mL之體積接受單一濃注劑量之AAV-NAV-GFPbc (藉由緩慢輸注，大約0.1 mL/min)，隨後投與0.1 mL媒劑以自導管系統沖洗劑量。ICV劑量係基於來自先前非人類靈長類動物研究之分佈數據以支持當前臨床程式。
在50 µL之劑量體積下以濃注形式雙側性投與玻璃體內(IVT)注射。6.25.2. 觀察及檢驗
自開始投藥之前大約兩週開始每天記錄臨床體徵至少一次且持續於整個研究期中。觀察動物之臨床效應、病況及/或死亡之體徵。可基於動物狀況在研究主管及/或技師之判斷下來記錄其他觀察。
在劑量投與之前及在第2、8、15及22天對第3組動物實施眼科檢驗。使用肌內氯胺酮(ketamine)鹽酸鹽使所有動物鎮靜以在第1天後實施眼科檢驗。為在第1天進行檢驗，使用可注射麻醉劑使動物鎮靜(參照部分15.3.3)。在檢驗之前，使用1%托吡卡胺(tropicamide)使眼睛放大。該檢驗將包含裂隙燈活組織檢視法及間接檢眼鏡檢查。另外，在投藥之前、在劑量投與後即刻(約10至15分鐘)及在第2及22天對第3組動物實施壓平眼壓量測法。
在劑量投與之前大約2至3週，自周邊靜脈收集血樣(約3 mL)以供中和抗體分析。6.25.3. 生物分析試樣收集
在劑量投與之前、在劑量投與後3 (±10分鐘)、6 (±10分鐘)及24 (±0.5小時)小時來，自僅第2組動物(IV)之周邊靜脈收集全血試樣(約0.5 mL)以供生物分析分析(AAV衣殼清除)。使用注射器及針收集試樣，轉移至兩個K2 EDTA管中並記錄時間。
在劑量投與之前(第1天)、在第8及15天及在驗屍之前(第22天)，自禁食動物之周邊靜脈收集血樣(約5 mL)以供PBMC分析。使用鋰肝素管獲得試樣且記錄時間。
在劑量投與(第1天，2 mL)及驗屍(第22天，5 mL)之前，自周邊靜脈收集血樣以供生物分析。將試樣收集於凝結管中且記錄時間。將管維持於室溫下直至完全凝結，然後在室溫下以大約2400 rpm離心15分鐘。收穫血清，置於經標記小瓶(將驗屍試樣分成1 mL等分試樣)中，冷凍於液氮中，且儲存於-60℃或更低溫度下。
在劑量投與之前自僅第1組動物之小腦延髓池脊髓穿刺物收集CSF (約1.5 mL)。在驗屍之前即刻自所有動物(組1至3)之小腦延髓池脊髓穿刺物收集CSF (約2 mL)。嘗試收集CSF，但因脊髓穿刺不成功，故可能無法在所有間隔下自動物收集試樣。在收集後，將試樣儲存於冰上直至處理。6.25.4. 驗屍
在治療至少21天後(第22天)，對發現死亡或垂死處死及排定驗屍之任一動物實施肉眼驗屍。使用8 mg/kg氯胺酮HCl (肌內)使所有動物(發現死亡者除外)鎮靜，維持於異氟醚/氧混合物上且提供200 IU/kg肝素鈉之靜脈內濃注。經由左心室向動物灌注於鹽水中之0.001%亞硝酸鈉。對發現死亡之動物進行驗屍，但並不實施灌注。
自所有動物(包含發現死亡者)保存下列組織：骨髓、腦、盲腸、結腸、背側神經根及神經節、十二指腸、食管、具有視神經之眼睛、肉眼病灶、心臟、回腸、空腸、腎、膝關節、肝、具有支氣管之肺、淋巴結、卵巢、胰臟、坐骨神經、骨骼肌、脊髓、脾、甲狀腺、氣管及迷走神經。6.25.5. 生物分析
藉由qPCR及次世代測序(NGS)評估自第2組(IV)動物收集之全血。
若需要，則藉由流式細胞術及酶聯免疫吸附斑點(ELISpot)評估自所有動物收集之PBMC試樣。
視需要，藉由ELISA及基於細胞之分析來評估血清及/或CSF中循環中和抗體以及游離載體之存在。
藉由定量PCR及NGS方法檢驗組織中之載體拷貝數及轉錄物數量。 6.26. 衣殼胺基酸序列
表10提供本文所闡述研究中所闡述及/或使用之某些經改造衣殼蛋白之胺基酸序列。以灰色陰影指示異源肽及胺基酸取代。表 10. 衣殼胺基酸序列
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7.  等效內容
儘管參考具體實施例詳細闡述了本發明，但應理解，功能等效之變化在本發明範圍內。實際上，除本文中所展示及闡述之修改外，熟習此項技術者依據前述說明及附圖亦將明瞭本發明之各種修改。該等修改意欲屬隨附申請專利範圍之範圍內。熟習此項技術者僅使用常規實驗將認識到或能確定本文所闡述本發明之具體實施例的許多等效形式。該等等效形式意欲涵蓋於下文申請專利範圍內。
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案皆以引用方式併入本文之說明書中，其併入程度如同明確地及單獨地指出將每一個別公開案、專利或專利申請案之全部內容以引用方式併入一般。
本文之論述提供該技術所面臨問題之本質的更佳理解且不應以任何方式解釋為對先前技術之承認，亦不應將本文任何參考文獻之引用解釋為承認該參考文獻構成本發明之「先前技術」。
本文所引用之所有參考文獻(包含專利申請案及公開案)之全部內容皆以引用方式併入本文中且出於所有目的，其併入程度如同出於所有目的特定地且個別地指示將每一個別公開案或專利或專利申請案之全部內容以引用方式併入一般。熟習此項技術者應明瞭，可在不背離本發明之精神及範圍之情況下對本發明作出多種修改及變化。本文所闡述之具體實施例僅以實例方式提供，且本發明僅受限於各項隨附申請專利範圍以及該等申請專利範圍所授權之等效物之全部範圍。
圖 1 繪示包含9型腺相關病毒之自殘基L447至R476 (其中殘基451至459加括號)之VR-IV環(AAV9 VR-IV)之衣殼胺基酸序列與其他AAV之相應區域的序列比較。該圖按出現順序分別揭示SEQ ID NO 87至92、88及93至96。
圖 2 繪示AAV衣殼結構之蛋白質模型，其展示衣殼可變區VR-IV、VR-V及VR-VIII。盒突出顯示VR-IV之環區，該環區提供如模型中所代表之表面暴露之胺基酸。
圖 3 繪示野生型AAV9及八(8)種候選經修飾rAAV9載體(1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096及1097)之高包裝效率(效價) (以基因體拷貝/mL (GC/mL)形式)，其中候選載體各自含有緊接在AAV9 VR-IV內之不同位點(分別係殘基I451至Q458)之後之FLAG插入物。所有載體皆與螢光素酶轉基因一起包裝於10 mL培養物中；誤差槓代表平均值之標準誤差。
圖 4 顯示八(8)種候選經修飾rAAV9載體(1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096及1097)中之每一者中之l VR-IV環FLAG插入物之表面暴露，如藉由經由結合至抗FLAG樹脂來免疫沈澱經包裝載體所證實。
圖 5A 至 5B 繪示經攜載螢光素酶基因(作為轉基因)之衣殼載體轉導之Lec2細胞中之轉導效率，該等衣殼載體係包裝成野生型AAV9 (9-luc)或八(8)種候選經修飾(插入FLAG肽) rAAV9載體(1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096及1097)中之每一者；轉導活性表示為螢光素酶活性百分比(將9-luc之活性視為100%) (圖 5A )或表示為相對光單位(RLU)/微克蛋白質(圖 5B )。
圖 6A 至 6E. 圖 6A 繪示圖解說明緊接在AAV9之S454之後且具有不同肽長度及組成之插入物可影響AAV顆粒在包裝細胞中之產生效率的條形圖。10種具有不同組成及長度之肽在S454之後插入AAV9 VR-IV內。在轉染後5天對經轉染懸浮HEK293細胞之所收穫上清液實施qPCR。條形圖中所繪示之結果證實，插入物性質影響了擬由HEK293細胞產生及分泌之AAV顆粒之能力，且由總產率(效價)指示。(誤差槓代表平均肽長度之標準誤差，其在Y軸上以括號註明。)圖 6B 至 6E 繪示下列細胞系之經轉導細胞培養物之螢光影像：(6B ) Lec2細胞系、(6C ) HT-22細胞系、(6D ) hCMEC/D3細胞系及(6E ) C2C12細胞系。使用含有GFP轉基因之AAV9野生型及S454插入歸巢肽衣殼來轉導所述細胞系。P1載體因極低轉導效率而未包含於影像中，且P8載體因低效價而未包含。在所測試之每一細胞類型中，AAV9.S454.FLAG展示低轉導程度。
圖 7A 至 7M 繪示人類軸絲動力蛋白1至12、14及17之重鏈尾部結構域之胺基酸序列。
圖 8 繪示具有用於異源肽之插入位點之AAV 1-9e、rh10、rh20、rh39及rh74形式1及形式2之衣殼序列之比對，該等插入位點位於VP2之起始密碼子之後且在可變區1 (VR-I)、可變區4 (VR-IV)及可變區8 (VR-VIII)內或其附近，皆以灰色突出顯示；每一衣殼蛋白之可變區8 (VR-VIII)內之特定插入位點由符號「#」展示(在根據AAV9之胺基酸編號之胺基酸殘基588之後)。
圖 9 繪示在Q588與A589之間包含肽插入物ARA290之重組AAV9載體之胺基酸序列(SEQ ID NO: 153)；ARA290插入物以粗體展示。
圖 10 繪示在投與以下AAV載體後小鼠腦細胞中之GFP (綠色螢光蛋白)轉基因之拷貝：AAV9；AAV.PHP.eB，亦在本文中稱為AAV9e (具有插入位置588與589之間之肽TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)及修飾A587D/A588G之AAV9)；AAV.hDyn (在588與589之間具有TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)之AAV9)；AAV.PHP.S (在位置588與589之間插入肽QAVRTSL (SEQ ID NO: 23)之AAV9)；及AAV.PHP.SH (在位置588與589之間插入肽QAVRTSH (SEQ ID NO: 24)之AAV9)。
圖 11A 至 11C 繪示在Q588與A589之間(圖 11A )、在VR-III之S268與S269之間(圖 11B )及在VR-IV之S454與G455之間(圖 11C )包含肽插入物TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)之重組AAV9載體的胺基酸序列，每一TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)插入物以粗體展示。
圖 12A 至 12C 繪示在Q588與A589之間(圖 12A )、在VR-III之S268與S269之間(圖 12B )及在VR-IV之S454與G455之間(圖 12C )包含肽插入物KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)之重組AAV9載體的胺基酸序列，每一KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)插入物以粗體展示。
圖 13A 至 13C 繪示在Q588與A589之間(圖 13A )、在VR-III之S268與S269之間(圖 13B )及在VR-IV之S454與G455之間(圖 13C )包含肽插入物QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)之重組AAV9載體的胺基酸序列，每一QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)插入物以粗體展示。
圖 14A 至 14C 繪示在Q588與A589之間(圖 14A )、在VR-III之S268與S269之間(圖 14B )及在VR-IV之S454與G455之間(圖 14C )包含肽插入物RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)之重組AAV9載體的胺基酸序列，每一RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)插入物以粗體展示。
圖 15A 至 15C 繪示在Q588與A589之間(圖 15A )、在VR-III之S268與S269之間(圖 15B )及在VR-IV之S454與G455之間(圖 15C )包含肽插入物LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)之重組AAV9載體的胺基酸序列，每一LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)插入物以粗體展示。
圖 16A 至 16C 繪示在Q588與A589之間(圖 16A )、在VR-III之S268與S269之間(圖 16B )及在VR-IV之S454與G455之間(圖 16C )包含肽插入物PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)之重組AAV9載體的胺基酸序列，每一PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)插入物以粗體展示。
圖 17A 至 17C 繪示在Q588與A589之間(圖 17A )、在VR-III之S268與S269之間(圖 17B )及在VR-IV之S454與G455之間(圖 17C )包含肽插入物TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)之重組AAV9載體的胺基酸序列，每一TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)插入物以粗體展示。
圖 18A 至 18C 繪示在N590與T591之間(圖 18A )、在VR-III之A269與T270之間(圖 18B )及在VR-IV之T453與T454之間(圖 18C )包含肽插入物LGETTRP (SEQ ID NO: 15)之重組AAV8載體的胺基酸序列，每一LGETTRP (SEQ ID NO: 15)插入物以粗體展示。
圖 19A 至 19C 繪示在N590與T591之間(圖 19A )、在VR-III之A269與T270之間(圖 19B )及在VR-IV之T453與T454之間(圖 19C )包含肽插入物LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)之重組AAV8載體的胺基酸序列，每一LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)插入物以粗體展示。
圖 20A 至 20B 繪示AAV載體穿越血腦障壁(BBB)細胞層之活體外transwell分析(圖 20A )；且結果展示，AAV.hDyn (由倒三角形指示)穿越分析之BBB細胞層之速度快於AAV9 (正方形)且在更大程度上快於AAV2 (圓) (圖 20B )。
圖 21 繪示來自經靜脈內投與經工程改造及天然衣殼之池之小鼠之腦gDNA的次世代測序(NGS)分析結果，其揭示池中之不同衣殼在小鼠組織中之相對豐度。將三種不同池注射至小鼠中。虛線指示彙集至一起之載體。非經腸AAV9包含於每一池中作為對照(池1：BC01，池2：BC31，池3：BC01)。池中之每一衣殼之條碼列示於表 8a 至 8c 中。
圖 22A 至 22H 繪示雌性C57Bl/6小鼠中之AAV.hDyn之活體內轉導特徵，其展示幼稚小鼠或在腦(圖 22A )、肝(圖 22B )、心臟(圖 22C )、肺(圖 22D )、腎(圖 22E )、骨骼肌(圖 22F )、坐骨神經(圖 22G )及卵巢(圖 22H )中注射AAV9或AAV.hDyn之小鼠中之拷貝數/微克gDNA，其中AAV.hDyn與AAV9相比展示增加之腦生物分佈。
圖 23A 至 23C 繪示整個腦中來自AAV.hDyn之GFP分佈，其中來自紋狀體(圖 23A )、海馬體(圖 23B )及皮質(圖 23C )之腦切片之免疫組織化學染色之影像揭示了藉由經修飾載體達成的廣泛性腦轉導。
圖 24 繪示緊接在胺基酸454之後含有歸巢肽插入物之經基因工程改造之AAV9載體的活體內腎/肝轉導效率比。此研究中所用歸巢肽之細節概述於表 8 中。
圖 25 繪示在VR-IV之S454與G455之間包含肽插入物TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)之重組AAV9載體之胺基酸序列，其中TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)插入物以粗體展示。
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Claims (73)

  1. 一種重組腺相關病毒(rAAV)衣殼蛋白，其包括來自非AAV蛋白之異源蛋白之具有至少4個且最多12個鄰接胺基酸之肽插入物，該肽插入物緊接在對應於圖8中AAV9衣殼蛋白之胺基酸138或胺基酸451至461中之一者的胺基酸殘基之後，其中當該衣殼蛋白包裝呈AAV顆粒時，該肽插入物係經表面暴露。
  2. 一種重組腺相關病毒(rAAV)衣殼蛋白，該衣殼蛋白包括具有至少4個且最多12個鄰接胺基酸的肽插入物，該插入物來自選自由以下組成之群之異源蛋白或結構域： (i)    神經組織歸巢蛋白或結構域，條件係該肽插入物不包括序列TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)； (ii)   軸絲或細胞質動力蛋白歸巢結構域； (iii)  骨歸巢結構域； (iv)   腎歸巢結構域； (v)    肌肉歸巢結構域； (vi)   內皮細胞歸巢結構域； (vii)  整聯蛋白受體結合結構域； (viii) 轉鐵蛋白受體結合結構域，條件係該肽插入物不包括序列RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)及CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)二者； (ix)   腫瘤細胞靶向結構域；或 (x)    視網膜細胞歸巢蛋白或結構域，條件係該肽插入物不包括序列LGETTRP (SEQ ID NO: 15)及LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)二者； 其中當該衣殼蛋白包裝呈AAV顆粒時，該肽插入物係經表面暴露。
  3. 如請求項1或2之rAAV衣殼蛋白，其中該衣殼蛋白係來自至少一種選自以下之AAV類型：AAV類型1 (AAV1)、血清型2 (AAV2)、血清型3 (AAV3)、血清型4 (AAV4)、血清型5 (AAV5)、血清型6 (AAV6)、血清型7 (AAV7)、血清型8 (AAV8)、血清型rh8 (AAVrh8)、血清型9 (AAV9)、血清型9e (AAV9e)、血清型rh10 (AAVrh10)、血清型rh20 (AAVrh20)、血清型hu.37 (AVVhu.37)、血清型rh39 (AAVrh39)及血清型rh74 (AAVrh74)。
  4. 如請求項1至3中任一項之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物出現於緊接在圖8中所繪示序列之以下位置內之胺基酸殘基中之一者之後： (a)    AAV1衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 110)之450至459； (b)    AAV2衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 111)之449至458； (c)    AAV3衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 112)之449至459； (d)    AAV4衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 113)之443至453； (e)    AAV5衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 114)之442至445； (f)    AAV6衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 115)之450至459； (g)    AAV7衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 116)之451至461； (h)    AAV8衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 117)之451至461； (i)    AAV9衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 118)之451至461； (j)    AAV9e衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 119)之452至461； (k)    AAVrh10衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 120)之452至461； (l)    AAVrh20衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 121)之452至461； (m)   AAVhu.37衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 122)之452至461； (n)    AAVrh74衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 123或SEQ ID NO: 154)之452至461；或 (o)    AAVrh39衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 124)之452至461。
  5. 如請求項4之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物出現於對應於該AAV9衣殼之胺基酸I451、N452、G453、S454、G455、Q456、N457、Q458、Q459、T460或L461中之一者之胺基酸殘基之後。
  6. 3至5中任一項之rAAV衣殼蛋白，其中該異源蛋白係歸巢結構域、中和抗體表位或純化標籤。
  7. 如請求項6之rAAV衣殼蛋白，其中該歸巢結構域係 (i)    神經組織歸巢結構域； (ii)   軸絲或細胞質動力蛋白歸巢結構域； (iii)  骨歸巢結構域； (iv)   腎歸巢結構域； (v)    肌肉歸巢結構域； (vi)   內皮細胞歸巢結構域； (vii)  整聯蛋白受體結合結構域； (viii) 轉鐵蛋白受體結合結構域； (ix)   腫瘤細胞靶向結構域；或 (x)    視網膜細胞歸巢結構域。
  8. 如請求項7之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括具有以下胺基酸序列之動力蛋白肽之至少4個鄰接胺基酸或由其組成或係7個鄰接胺基酸：SITLVKSTQTV (SEQ ID NO: 21)、TILSRSTQTG (SEQ ID NO: 22)、VVMVGEKPITITQHSVETEG (SEQ ID NO: 25)、RSSEEDKSTQTT (SEQ ID NO: 26)、KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)、LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)、PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)、TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)、QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)、RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)、TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)或TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)。
  9. 如請求項7之rAAV衣殼蛋白，其中來自該轉鐵蛋白受體結合結構域之該肽插入物係胺基酸序列RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)或CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)之至少4個鄰接胺基酸或係7個胺基酸。
  10. 如請求項7之rAAV衣殼蛋白，其中來自該視網膜細胞歸巢結構域之該肽插入物係胺基酸序列TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)、LGETTRP (SEQ ID NO: 15)或LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)之至少4個鄰接胺基酸或係7個胺基酸。
  11. 如請求項10之rAAV衣殼蛋白，其中該AAV衣殼蛋白係AAV8衣殼蛋白或AAV9衣殼蛋白。
  12. 如請求項7之rAAV衣殼蛋白，其中來自該純化標籤之該肽插入物係具有胺基酸序列YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 86)之血球凝集素(HA)表位或具有胺基酸序列DYKDDDDK (SEQ ID NO: 52)之FLAG標籤的至少4個鄰接胺基酸或係7個鄰接胺基酸。
  13. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中該神經組織歸巢蛋白或該視網膜細胞歸巢蛋白係人類軸絲動力蛋白(HAD)重鏈尾部。
  14. 如請求項13之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括至少4個且最多15個來自該HAD重鏈尾部之二聚合結構域之鄰接胺基酸。
  15. 如請求項14之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括至少4個且最多15個來自由以下(繪示於圖 7 中)組成之群之鄰接胺基酸： (a)    (DYH1_HUMAN UniProtKB - Q9P2D7之aa 1至1542) (SEQ ID NO: 97)； (b)    (DYH2_HUMAN UniProtKB - Q9P225之aa 1至1764) (SEQ ID NO: 98)； (c)    (DYH3_HUMAN UniProtKB - Q8TD57之aa 1至1390) (SEQ ID NO: 99)； (d)    (DYH5_HUMAN UniProtKB - Q8TE73之aa 1至1941) (SEQ ID NO: 100)； (e)    (DYH6_HUMAN UniProtKB - Q9C0G6之aa 1至1433) (SEQ ID NO: 101)； (f)    (DYH7_HUMAN UniProtKB - Q8WXX0之aa 1至1289) (SEQ ID NO: 102)； (g)    (DYH8_HUMAN UniProtKB - Q96JB1之aa 1至1807) (SEQ ID NO: 103)； (h)    (DYH9_HUMAN UniProtKB - Q9NYC9之aa 1至1831) (SEQ ID NO: 104)； (i)    (DYH10_HUMAN UniProtKB - Q8IVF4之aa 1至1793) (SEQ ID NO: 105)； (j)    (DYH11_HUMAN UniProtKB - Q96DT5之aa 1至1854) (SEQ ID NO: 106)； (k)    (DYH12_HUMAN UniProtKB - Q6ZR08之aa 1至1214) (SEQ ID NO: 107)； (l)    (DYH14_HUMAN UniProtKB - Q0VDD8之aa 1至200) (SEQ ID NO: 108)；或 (m)   (DYH17_HUMAN UniProtKB - Q9UFH2之aa 1至1794) (SEQ ID NO: 109)。
  16. 如請求項15之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括至少4個且最多15個來自該等動力蛋白重鏈序列(圖7)中之任一者之殘基1至200之鄰接胺基酸。
  17. 如請求項15之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括7個來自圖 7 之該等動力蛋白重鏈序列中之任一者之鄰接胺基酸。
  18. 如請求項16之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括7個來自該等動力蛋白重鏈序列(圖 7 )中之任一者之殘基1至200之鄰接胺基酸。
  19. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括以下肽中之一者之至少4個鄰接胺基酸： (a)    KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)； (b)    TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)； (c)    QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)； (d)    RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)； (e)    LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)； (f)    PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)；或 (g)    TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)。
  20. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物由以下肽中之一者組成： (a)    KMQVPFQ (SEQ ID NO: 1)； (b)    TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)； (c)    QQAAPSF (SEQ ID NO: 3)； (d)    RYNAPFK (SEQ ID NO: 4)； (e)    LKLPPIV (SEQ ID NO: 5)； (f)    PFIKPFE (SEQ ID NO: 6)；或 (g)    TLSLPWK (SEQ ID NO: 7)。
  21. 如請求項20之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物係胺基酸序列TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)。
  22. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中該神經組織歸巢蛋白係小鼠軸絲動力蛋白(MAD)重鏈尾部。
  23. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中該神經組織歸巢結構域係結合先天性修復受體且並非紅血球生成性之EPO (促紅血球生成素)結構域或該結構域之構形類似物。
  24. 如請求項23之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物係至少4個且最多11個來自QEQLERALNSS (SEQ ID NO: 8)之鄰接胺基酸。
  25. 如請求項24之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物具有胺基酸序列QEQLERALNSS (SEQ ID NO: 8)。
  26. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中該神經組織歸巢蛋白係具有SRL (絲胺酸-精胺酸-離胺酸)基序之腦歸巢結構域。
  27. 如請求項26之rAAV衣殼蛋白，其中來自該腦歸巢結構域之該肽插入物具有胺基酸序列LSSRLDA (SEQ ID NO: 10)或CLSSRLDAC (SEQ ID NO: 11)之至少4個鄰接胺基酸或係該胺基酸序列。
  28. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中該軸絲或細胞質動力蛋白歸巢結構域係動力蛋白輕鏈歸巢結構域。
  29. 如請求項28之rAAV衣殼蛋白，其中來自該動力蛋白輕鏈歸巢結構域之該肽插入物係SITLVKSTQTV (SEQ ID NO: 21)、TILSRSTQTG (SEQ ID NO: 22)、VVMVGEKPITITQHSVETEG (SEQ ID NO: 25)或RSSEEDKSTQTT (SEQ ID NO: 26)中之一者之至少4個且最多12個鄰接胺基酸。
  30. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中該骨歸巢蛋白係羥磷灰石(HA)結合結構域。
  31. 如請求項30之rAAV衣殼蛋白，其中來自該羥磷灰石(HA)結合結構域之該肽插入物係序列DDDDDDDD (SEQ ID NO: 9)之至少6個胺基酸殘基。
  32. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中該腎歸巢結構域包括胺基酸序列CLPVASC (SEQ ID NO: 12)。
  33. 如請求項32之rAAV衣殼蛋白，其中來自該腎歸巢結構域肽之該肽插入物係胺基酸序列LPVAS (SEQ ID NO: 13)或CLPVASC (SEQ ID NO: 12)。
  34. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中來自該肌肉歸巢結構域之該肽插入物包括胺基酸序列ASSLNIA (SEQ ID NO: 14)或由其組成。
  35. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括胺基酸序列QAVRTSL (SEQ ID NO: 23)或QAVRTSH (SEQ ID NO: 24)或由其組成。
  36. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中來自該內皮細胞歸巢結構域之該肽插入物包括胺基酸序列SIGYPLP (SEQ ID NO: 28)或由其組成。
  37. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中來自該整聯蛋白結合結構域之該肽插入物具有胺基酸序列CDCRGDCFC (SEQ ID NO: 29)。
  38. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中該轉鐵蛋白受體結合結構域係轉鐵蛋白結構域或其構形類似物或鐵模擬物。
  39. 如請求項38之rAAV衣殼蛋白，其中來自該轉鐵蛋白結構域之該肽插入物係來自序列HAIYPRH (SEQ ID NO: 17)或THRPPMWSPVWP (SEQ ID NO: 18)之至少4個鄰接胺基酸或係7個鄰接胺基酸。
  40. 如請求項39之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括胺基酸序列HAIYPRH (SEQ ID NO: 17)或THRPPMWSPVWP (SEQ ID NO: 18)或由其組成。
  41. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中來自該腫瘤細胞靶向結構域之該肽插入物包括胺基酸序列NGRAHA (SEQ ID NO: 30)或由其組成。
  42. 如請求項2或3之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物係來自TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)、TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)、RTIGPSV (SEQ ID NO: 19)、CRTIGPSVC (SEQ ID NO: 20)、LGETTRP (SEQ ID NO: 15)及LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)中之一者之至少4個鄰接胺基酸或係7個鄰接胺基酸。
  43. 如請求項2或13至42中任一項之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物發生於緊接在以下胺基酸殘基(如圖8中所繪示)中之一者之後： (a)    AAV1衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 110)之138、262至272；450至459；或585至593； (b)    AAV2衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 111)之138、262至272；449至458；或584至592； (c)    AAV3衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 112)之138、262至272；449至459；或585至593； (d)    AAV4衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 113)之137、256至262；443至453；或583至591； (e)    AAV5衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 114)之137、252至262；442至445；或574至582； (f)    AAV6衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 115)之138、262至272；450至459；585至593； (g)    AAV7衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 116)之138、263至273；451至461；586至594； (h)    AAV8衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 117)之138、263至274；452至461；587至595； (i)    AAV9衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 118)之138、262至273；452至461；585至593； (j)    AAV9e衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 119)之138、262至273；452至461；585至593； (k)    AAVrh10衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 120)之138、263至274；452至461；587至595； (l)    AAVrh20衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 121) 之138、263至274；452至461；587至595； (m)   AAVhu37衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 122)之138、263至274；452至461；587至595； (n)    AAVrh74衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 123或SEQ ID NO: 154)之138、263至274；452至461；587至595；或 (o)    AAVrh39衣殼胺基酸序列(SEQ ID NO: 124)之138、263至274；452至461；587至595。
  44. 如請求項43之rAAV衣殼蛋白，其包括插入該AAV9衣殼之胺基酸殘基588至589之間或緊接在對應於AAV9衣殼之胺基酸138之胺基酸殘基之後的胺基酸序列TLAAPFK (SEQ ID NO: 2) (參見圖 8 )。
  45. 如請求項43之rAAV衣殼蛋白，其包括插入該AAV9衣殼之I451至L461、S268或Q588中之一者之後之胺基酸序列TLAAPFK (SEQ ID NO: 2) (圖 8 )。
  46. 如請求項43之rAAV衣殼蛋白，其包括介於該AAV9衣殼之胺基酸殘基588至589之間之胺基酸序列QEQLERALNSS (SEQ ID NO: 8) (圖 8 )。
  47. 如請求項43之rAAV衣殼蛋白，其包括插入一或多個選自該AAV9衣殼之I451至L461或S268之位置處之胺基酸序列QEQLERALNSS (SEQ ID NO: 8) (圖 8 )。
  48. 如請求項43之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括緊接在該AAV9衣殼蛋白之胺基酸殘基262至273中之一者之後之胺基酸序列TLAVPFK (SEQ ID NO: 27)。
  49. 如請求項43之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括介於該AAV8衣殼蛋白之胺基酸殘基269與270之間之胺基酸序列LGETTRP (SEQ ID NO: 15)。
  50. 如請求項49之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物具有胺基酸序列LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)。
  51. 如請求項43之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括介於該AAV8衣殼蛋白之胺基酸殘基590與591之間之胺基酸序列LGETTRP (SEQ ID NO: 15)。
  52. 如請求項51之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物具有胺基酸序列LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)。
  53. 如請求項43之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括緊接在該AAV8衣殼蛋白之胺基酸殘基453及454中之一者之後之胺基酸序列LGETTRP (SEQ ID NO: 15)。
  54. 如請求項53之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物包括胺基酸序列LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)。
  55. 如請求項2或13至43中任一項之rAAV衣殼蛋白，其中該衣殼係AAV9且該肽插入物出現於AAV9之胺基酸殘基454至455之間(圖 8 )。
  56. 如請求項2或13至43中任一項之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物出現於緊接在對應於該AAV9衣殼之I451至L461、S268或Q588中之一者之酸殘基之後(圖 8 )。
  57. 如請求項43之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物出現於緊接在AAV9衣殼蛋白之胺基酸451至461中之一者之後。
  58. 如請求項2或13至43中任一項之rAAV衣殼蛋白，其中該肽插入物出現於AAV衣殼第8可變區(VR-VIII)中。
  59. 如前述請求項中任一項之rAAV衣殼蛋白，條件係該衣殼蛋白並非該AAV2衣殼蛋白。
  60. 一種重組AAV衣殼蛋白，其相對於野生型或未改造衣殼蛋白包括一或多個胺基酸取代，其中該rAAV衣殼蛋白係具有A269S胺基酸取代之AAV8衣殼蛋白或係具有S263G/S269R/A273T取代或W503R或Q474A取代或另一AAV類型衣殼之衣殼蛋白中之相應取代的AAV9衣殼蛋白。
  61. 如請求項60之rAAV衣殼蛋白，其進一步包括用於AAV8衣殼蛋白之498-NNN/AAA-500或用於AAV9衣殼蛋白之496-NNN/AAA-498或另一AAV類型衣殼之衣殼蛋白中之相應取代。
  62. 一種核酸，其包括編碼如前述請求項中任一項之rAAV衣殼蛋白或編碼與其共有至少80%一致性之胺基酸序列之核苷酸序列。
  63. 如請求項62之核酸，其編碼如前述請求項中任一項之rAAV衣殼蛋白。
  64. 一種包裝細胞，其能夠表現如請求項62或63之核酸以產生包括由該核苷酸序列編碼之該衣殼蛋白之AAV載體。
  65. 一種rAAV載體，其包括如請求項1至61中任一項之衣殼蛋白。
  66. 如請求項65之rAAV載體，其進一步包括轉基因。
  67. 一種醫藥組合物，其包括如請求項65或66之rAAV載體及醫藥上可接受之載劑。
  68. 一種將轉基因遞送至細胞之方法，該方法包括使該細胞與如請求項65或66之rAAV載體接觸；或如請求項65或66之rAAV載體用於將轉基因遞送至細胞，其中使該細胞與該載體接觸。
  69. 一種將轉基因遞送至有需要之個體之靶組織之方法，該方法包括向該個體投與如請求項65或66之rAAV載體，其中該肽插入物係歸巢肽；或如請求項65或66之rAAV載體，其用於將轉基因遞送至有需要之個體之靶組織，其中將該載體投與該個體。
  70. 如請求項69之方法或使用之rAAV載體，其中該rAAV載體係全身性、經靜脈內、經鞘內、經鼻內、經腹膜腔內、經玻璃體內、經由腰部穿刺或經由小腦延髓池投與。
  71. 如請求項70之方法或使用之rAAV載體，其中該靶組織係： (i)    神經組織，且該載體包括來自該神經組織歸巢結構域之肽插入物； (ii)   骨，且該載體包括來自該骨歸巢結構域之肽插入物； (iii) 腎，且該載體包括來自該腎歸巢結構域之肽插入物； (iv)   肌肉，且該載體包括來自該肌肉歸巢結構域之肽插入物； (v)    內皮細胞，且該載體包括來自該內皮細胞歸巢結構域之肽插入物； (vi)   整聯蛋白受體，且該載體包括來自該整聯蛋白受體結合結構域之肽插入物； (vii) 腫瘤細胞上之轉鐵蛋白受體，且該載體包括來自該轉鐵蛋白受體結合結構域之肽插入物； (viii) 腫瘤細胞，且該載體包括來自該腫瘤細胞靶向結構域之肽插入物；或 (ix)   視網膜細胞，且該載體包括來自該視網膜細胞歸巢結構域之肽插入物。
  72. 如請求項71之方法或使用之rAAV載體，其中該靶組織係視網膜細胞且該肽插入物包括胺基酸序列TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)、LGETTRP (SEQ ID NO: 15)或LALGETTRP (SEQ ID NO: 16)。
  73. 如請求項72之方法或使用之rAAV載體，其中該靶組織係視網膜細胞且該肽插入物包括胺基酸序列TLAAPFK (SEQ ID NO: 2)。
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