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WO2010035769A1 - 改良された抗体分子 - Google Patents

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WO2010035769A1
WO2010035769A1 PCT/JP2009/066590 JP2009066590W WO2010035769A1 WO 2010035769 A1 WO2010035769 A1 WO 2010035769A1 JP 2009066590 W JP2009066590 W JP 2009066590W WO 2010035769 A1 WO2010035769 A1 WO 2010035769A1
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WO
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seq
sequence
antibody
tocilizumab
variable region
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/066590
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English (en)
French (fr)
Inventor
智之 井川
慎也 石井
敦彦 前田
実香 櫻井
哲郎 小嶋
橘　達彦
宙丈 白岩
角田　浩行
義信 樋口
Original Assignee
中外製薬株式会社
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Filing date
Publication date
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing an anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient, a method for producing the same, and the like.
  • Non-patent Documents 1 and 2 IL-6 is a cytokine involved in various autoimmune diseases, inflammatory diseases, malignant tumors, etc.
  • Non-patent Document 3 humanized anti-IL-6 receptor IgG1 antibody TOCILIZUMAB (tocilizumab) is an IL-6 receptor Bind specifically.
  • TOCILIZUMAB is considered to be usable as a therapeutic agent for diseases associated with IL-6 such as rheumatoid arthritis by neutralizing the biological action of IL-6 (Patent Documents 1, 2, 3, Non-patent document 4), approved in Japan for the treatment of Castleman's disease and rheumatoid arthritis (non-patent document 5).
  • Non-patent Document 7 an affinity maturation technique (Non-patent Document 7) has been reported as a technique for enhancing antigen-binding ability and antigen-neutralizing ability, and includes amino acids such as variable region complementarity-determining regions (CDRs). It is possible to enhance the binding activity to the antigen by introducing a mutation. By enhancing the antigen binding ability, it is possible to improve the biological activity of in vitro, or reduce the dose, and further improve the efficacy in in vivo (Non-patent Document 8). Currently, a clinical trial of Motavizumab (produced by affinity maturation), which is said to exhibit an effect superior to Palivizumab, which is a first generation drug of an anti-RSV antibody, is being conducted (Non-patent Document 9).
  • CDRs variable region complementarity-determining regions
  • an antibody having an affinity of about 0.05 nM which is considered to have stronger affinity than TOCILIZUMAB has been reported (Patent Document 4), but a human antibody or humanized antibody having an affinity greater than 0.05 nM There are no reports of chimeric antibodies.
  • Non-patent Document 4 As for the dosage form, a subcutaneous preparation is desirable in the case of chronic autoimmune diseases. In general, it is necessary that the preparation for subcutaneous administration be a high-concentration preparation. In the case of an IgG type antibody preparation, it is generally considered that the limit is about 100 mg / mL in terms of stability. (Non-Patent Document 10).
  • the amount of protein administered is reduced, and by providing high stability, subcutaneous administration at a long administration interval is possible, and the cost is low. It is possible to provide a highly convenient second-generation antibody drug.
  • Non-Patent Document 11 As a method for further improving the plasma half-life of IgG1 and IgG2 antibodies having excellent plasma half-life, amino acid substitution in the constant region that enhances binding to FcRn has been reported (Non-patent Documents 12 and 13). From the viewpoint of immunogenicity, it is preferable to further improve the plasma half-life by amino acid substitution of the variable region rather than the constant region (Patent Document 5). By modifying the variable region so far, IL-6 receptor antibody There is no report that improved the plasma half-life.
  • Non-patent Document 14 Another important issue in developing biopharmaceuticals is immunogenicity.
  • mouse antibodies are reduced in immunogenicity by humanization. It is said that the risk of immunogenicity can be further reduced by using a germline sequence as a template framework for humanization (Non-patent Document 14).
  • Adalimumab which is a fully human anti-TNF antibody
  • immunogenicity appears at a high frequency of 13 to 17%, and the therapeutic effect has been reduced in patients with immunogenicity (non-patented) References 15 and 16).
  • Even a human antibody may have a T-cell epitope in the CDR, and the T-cell epitope on the CDR may cause immunogenicity.
  • Non-patent Documents 17 and 18 Methods for predicting T-cell epitopes in in silico or in in vitro have been reported (Non-patent Documents 17 and 18). By removing the predicted T-cell epitope using these methods, immunogens can be obtained. It is considered possible to reduce sex risk (Non-patent Document 19).
  • TOCILIZUMAB which is a humanized anti-IL-6 receptor IgG1 antibody, is an IgG1 antibody obtained by humanizing a mouse PM1 antibody.
  • CDR grafting has been carried out using human sequences of NEW and REI as H and L chains, respectively, as template frameworks, but 5 amino acids remain as mouse sequences in the framework as important amino acids for maintaining activity ( Non-patent document 20). To date, there has been no report of complete humanization without reducing the activity of the mouse sequence remaining in the framework of TOCILIZUMAB, which is a humanized antibody.
  • the CDR sequence of TOCILIZUMAB is a mouse sequence, and like Adalimumab, there is a possibility that a T-cell epitope exists in CDR, and the risk of immunogenicity cannot be denied.
  • TOCILIZUMAB clinical trials no anti-TOCILIZUMAB antibody has been observed at a therapeutic dose of 8 mg / kg, but the antibody has been observed at 4 mg / kg and 2 mg / kg (Patent Document 6). . From these facts, there is room for improvement in the immunogenicity of TOCILIZUMAB. However, there is no report on TOCILIZUMAB that has improved the immunogenicity risk by amino acid substitution.
  • the isotype of TOCILIZUMAB is IgG1, but the difference in isotype is the difference in the sequence of the constant region, and the sequence of the constant region is thought to greatly affect effector function, pharmacokinetics, physical properties, etc.
  • the selection of the constant region sequence is extremely important for the development of medicines (Non-patent Document 11).
  • the safety of antibody drugs has become very important, and one of the causes of serious side effects seen in Phase I clinical trials of TGN1412 is the interaction (effector function) of the Fc part of the antibody with the Fc ⁇ receptor. It is considered (Non-Patent Document 21).
  • Non-patent Document 22 There is a method of changing the isotype of IgG antibody from IgG1 to IgG2 or IgG4 (Non-patent Document 22). From the viewpoint of binding to Fc ⁇ receptor I and pharmacokinetics, IgG4 It is considered that IgG2 is desirable (Non-patent Document 11). Since the isotype of TOCILIZUMAB is IgG1 and is an IL-6 receptor neutralizing antibody, it is possible that an effector function such as ADCC is not necessary, and when considering the possibility of side effects, the isotype may be IgG2.
  • Non-patent Document 23 It is not easy to manufacture a large amount as a pharmaceutical product while maintaining the heterogeneity of the target substance / related substance derived from this, and it is not easy and leads to an increase in cost.
  • Non-patent Document 24 In developing an IgG2 isotype antibody as a pharmaceutical, it is desirable that these heterogeneities be reduced while maintaining high stability. In order to produce a stable high-concentration subcutaneous preparation excellent in convenience, it is desirable that not only the stability is high, but also the half-life in plasma is superior to IgG1, which is an isotype of TOCILIZUMAB. However, so far the heterogeneity of IgG2 isotype constant region antibodies has been reduced, the stability of the sequence has been improved, and the half-life in plasma is superior to IgG1 isotype constant region antibodies. There is no.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and its purpose is to modify the amino acid sequences of the variable region and the constant region of TOCILIZUMAB, which is a humanized anti-IL-6 receptor IgG1, antibody to Enhances pharmacokinetics while improving the pharmacokinetics, reducing the frequency of administration and demonstrating continuous therapeutic effects, and improving immunogenicity, safety and physical properties (stability and uniformity), TOCILIZUMAB It is to provide a pharmaceutical composition (hereinafter also referred to as “drug” or “preparation”) comprising a superior second-generation molecule, and a method for producing these pharmaceutical compositions. .
  • the present inventors have improved the pharmacokinetics while enhancing the drug efficacy by modifying the amino acid sequences of the variable region and constant region of TOCILIZUMAB, which is the first generation humanized anti-IL-6 receptor IgG1 antibody.
  • TOCILIZUMAB which is the first generation humanized anti-IL-6 receptor IgG1 antibody.
  • We conducted intensive research As a result, the present inventors found a plurality of CDR mutations that improve the antigen binding ability (affinity) in the variable region of TOCILIZUMAB, and succeeded in greatly improving the affinity by combining them.
  • the present inventors have also succeeded in improving pharmacokinetics by introducing a modification that reduces the isoelectric point of the variable region sequence.
  • the present inventors have made it possible to neutralize an antigen multiple times with one molecule of antibody by imparting pH dependency to the binding to the IL-6 receptor, which is an antigen, and to improve pharmacokinetics.
  • the present inventors have fully humanized the mouse-derived sequences remaining in the TOCILIZUMAB framework and reduced the number of T-cell epitope peptides predicted in in silico in the variable region, thereby reducing the immunogenicity risk. We succeeded in reducing it.
  • the present inventors reduced the binding to the Fc ⁇ receptor to enhance safety, improved pharmacokinetics than IgG1, and further reduced the stability of IgG2 without reducing stability.
  • the present invention has a superior ability to bind to an antigen (IL-6 receptor) by altering the amino acid sequences of the variable region and constant region of TOCILIZUMAB, which is a humanized anti-IL-6 receptor IgG1 antibody.
  • Pharmaceutical compositions comprising humanized anti-IL-6 receptor IgG antibodies having pharmacokinetics and superior safety, immunogenicity risk, physical properties (stability, uniformity), and pharmaceutical compositions thereof It relates to a manufacturing method. More specifically, the following [1] to [11] are provided.
  • polypeptide according to any one of the following (a) to (f): (a) CDR1 having the sequence of SEQ ID NO: 1 (CDR1 of VH4-M73), CDR2 having the sequence of SEQ ID NO: 2 (CDR2 of VH4-M73), and SEQ ID NO: 3 (CDR3 of VH4-M73) A polypeptide comprising CDR3 having the sequence, (b) CDR1 having the sequence of SEQ ID NO: 4 (CDR1 of VH3-M73), CDR2 having the sequence of SEQ ID NO: 5 (CDR2 of VH3-M73), and SEQ ID NO: 6 (CDR3 of VH3-M73) A polypeptide comprising CDR3 having the sequence, (c) CDR1 having the sequence of SEQ ID NO: 7 (CDR1 of VH5-M83), CDR2 having the sequence of SEQ ID NO: 8 (CDR2 of VH5-M83), and SEQ ID NO: 9 (CDR
  • the antibody according to any one of the following (a) to (c): (a) CDR1 having the sequence of SEQ ID NO: 1 (CDR1 of VH4-M73), CDR2 having the sequence of SEQ ID NO: 2 (CDR2 of VH4-M73), and SEQ ID NO: 3 (CDR3 of VH4-M73) A heavy chain variable region comprising CDR3 having a sequence, and a CDR1 having a sequence of SEQ ID NO: 10 (CDR1 of VL1), a CDR2 having a sequence of SEQ ID NO: 11 (CDR2 of VL1), and SEQ ID NO: 12 (of VL1 An antibody comprising a light chain variable region comprising CDR3 having the sequence of CDR3), (b) CDR1 having the sequence of SEQ ID NO: 4 (CDR1 of VH3-M73), CDR2 having the sequence of SEQ ID NO: 5 (CDR2 of VH3-M73), and SEQ ID NO: 6 (C
  • variable region described in any of (a) to (f) below: (a) a heavy chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 19 (variable region of VH4-M73), (b) a heavy chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 20 (variable region of VH3-M73), (c) a heavy chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 21 (variable region of VH5-M83), (d) a light chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 22 (variable region of VL1), (e) a light chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 23 (variable region of VL3), (f) A light chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 24 (variable region of VL5).
  • the antibody according to any one of the following (a) to (c); (a) an antibody comprising a heavy chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 19 (variable region of VH4-M73) and a light chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 22 (variable region of VL1); (b) an antibody comprising a heavy chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 20 (variable region of VH3-M73) and a light chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 23 (variable region of VL3); (c) An antibody comprising a heavy chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 21 (variable region of VH5-M83) and a light chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 24 (variable region of VL5).
  • the heavy chain or light chain according to any one of the following (a) to (f): (a) a heavy chain having the sequence of SEQ ID NO: 25 (VH4-M73), (b) a heavy chain having the sequence of SEQ ID NO: 26 (VH3-M73), (c) a heavy chain having the sequence of SEQ ID NO: 27 (VH5-M83), (d) a light chain having the sequence of SEQ ID NO: 28 (VL1), (e) a light chain having the sequence of SEQ ID NO: 29 (VL3), (f) A light chain having the sequence of SEQ ID NO: 30 (VL5).
  • [8] A vector comprising the gene according to [7].
  • [9] A host cell carrying the vector according to [8].
  • [10] A method for producing the polypeptide of any one of [1] to [6] by culturing the host cell of [9].
  • [11] A pharmaceutical composition comprising the polypeptide according to any one of [1] to [6] or the polypeptide produced by the method according to [10].
  • the humanized anti-IL-6 receptor IgG antibody obtained by the present invention has enhanced drug efficacy and improved pharmacokinetics, so that the administration frequency can be reduced and a therapeutic effect can be exerted continuously.
  • the TOCDRIZUMAB sequence of HCDR2 is SEQ ID NO: 81
  • the post-mutation sequence of HCDR2 (upper row) is SEQ ID NO: 82
  • the post-mutation sequence of HCDR2 (lower row) is SEQ ID NO: 83
  • the TOCILIZUMAB sequence of HCDR3 is SEQ ID NO: 84.
  • the sequence after mutation (upper row) is SEQ ID NO: 85
  • the sequence after mutation of HCDR3 (lower row) is SEQ ID NO: 86
  • the TOCILIZUMAB sequence of LCDR1 is SEQ ID NO: 87
  • the sequence after mutation of LCDR1 (upper row) is SEQ ID NO: 88
  • the LCDR1 post-mutation sequence (bottom) is SEQ ID NO: 89
  • LCDR3 TOCILIZUMAB sequence is SEQ ID NO: 90
  • LCDR3 post-mutation sequence top
  • LCDR3 post-mutation sequence (bottom) is SEQ ID NO: 92. It is a figure which shows neutralizing activity in BaF / gp130 of TOCILIZUMAB and RDC-23.
  • the HFR1 TOCILIZUMAB sequence is SEQ ID NO: 93
  • the HFR1 mutant sequence is SEQ ID NO: 94
  • the HCDR1 TOCILIZUMAB sequence is SEQ ID NO: 95
  • the HCDR1 mutant sequence is SEQ ID NO: 96
  • the HFR2 TOCILIZUMAB sequence is SEQ ID NO: 97
  • the sequence after mutation of HFR2 is SEQ ID NO: 98
  • the sequence of TOCILIZUMAB of HCDR2 is SEQ ID NO: 81
  • the sequence of HCDR2 is SEQ ID NO: 99
  • the sequence of TOCILIZUMAB of HFR4 is SEQ ID NO: 100
  • the sequence of HFR4 is SEQ ID NO: 101
  • LFR1 TOCILIZUMAB sequence SEQ ID NO: 102, LFR1 post-mutation sequence SEQ ID NO: 103
  • LCDR1 TOCILIZUMAB sequence SEQ ID NO: 87, LCDR1 post-mutation sequence SEQ
  • the HFR1 TOCILIZUMAB sequence is SEQ ID NO: 93
  • the HFR1 mutant sequence is SEQ ID NO: 114
  • the HCDR1 TOCILIZUMAB sequence is SEQ ID NO: 95
  • the HCDR1 mutant sequence is SEQ ID NO: 115
  • the LCDR1 TOCILIZUMAB sequence is SEQ ID NO: 87
  • the sequence after mutation of LCDR1 is represented by SEQ ID NO: 116
  • the sequence of TOCILIZUMAB of LCDR2 is represented by SEQ ID NO: 107
  • the sequence after mutation of LCDR2 is represented by SEQ ID NO: 117.
  • FIG. 3 is a graph showing changes in plasma concentration after intravenous administration of TOCILIZUMAB-IgG1, TOCILIZUMAB-M44, TOCILIZUMAB-M58, and TOCILIZUMAB-M73 to human FcRn transgenic mice. It is a figure which shows the neutralization activity in BaF / gp130 of TOCILIZUMAB, control, and Fv5-M83. It is a figure which shows the neutralization activity in BaF / gp130 of TOCILIZUMAB, Fv3-M73, and Fv4-M73.
  • FIG. 5 is a graph showing changes in plasma concentration after intravenous administration of TOCILIZUMAB, control, Fv3-M73, Fv4-M73, and Fv5-M83 to cynomolgus monkeys. It is the graph which showed the CRP density
  • the present invention provides the polypeptide according to any one of the following (a) to (f).
  • a polypeptide comprising CDR3 having the sequence (b) CDR1 having the sequence of SEQ ID NO: 4 (CDR1 of VH3-M73), CDR2 having the sequence of SEQ ID NO: 5 (CDR2 of VH3-M73), and SEQ ID NO: 6 (CDR3 of VH3-M73)
  • a polypeptide comprising CDR3 having the sequence (c) CDR1 having the sequence of SEQ ID NO: 7 (CDR1 of VH5-M83), CDR2 having the sequence of SEQ ID NO: 8 (CDR2 of VH5-M83), and SEQ ID NO:
  • the polypeptide is not particularly limited, but is preferably an antigen-binding substance having binding activity to human IL-6 receptor.
  • Preferred examples of the antigen-binding substance include an antibody heavy chain variable region (VH), an antibody light chain variable region (VL), an antibody heavy chain, an antibody light chain, and an antibody.
  • polypeptides (a) to (f) described above preferred examples include the heavy chain variable region of an antibody, and the polypeptides (d) to (f) As a preferable example, the light chain variable region of an antibody can be mentioned.
  • variable regions can be used as part of an anti-human IL-6 receptor antibody.
  • the anti-human IL-6 receptor antibody using these variable regions has excellent binding activity, excellent pharmacokinetics, excellent safety / immunogenicity, and / or excellent physical properties.
  • excellent pharmacokinetics or improvement in pharmacokinetics is one of pharmacokinetic parameters calculated from changes in plasma concentration when an antibody is administered in vivo. “Clearance (CL)” "Decrease”, “Increase of area under concentration curve (Area Under Curve, AUC)", Increase of "Mean Residence Time”, Increase of "Plasma half-life (t1 / 2)” Means.
  • excellent physical properties or improved physical properties are not particularly limited, but mean improved stability, reduced heterogeneity, and the like.
  • the framework region (FR) of the human antibody to be linked to the CDR is selected so that the CDR forms a favorable antigen binding site.
  • the FR used in the variable region of the present invention is not particularly limited, and any FR may be used, but human-derived FR is preferably used.
  • the human-derived FR may be a FR having a native sequence, and if necessary, one or more amino acids in the framework region having the native sequence are substituted so that the CDR forms an appropriate antigen-binding site. , Deletions, additions and / or insertions, etc.
  • a mutant FR sequence having a desired property can be selected by measuring and evaluating the antigen-binding activity of an antibody using an FR with amino acid substitution (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993)). 53, 851-856).
  • one or more amino acids may be substituted, deleted, added and / or inserted in the CDR sequence described above.
  • CDR sequence after substitution, deletion, addition and / or insertion of one or more amino acids is equivalent to CDR sequence before modification in binding activity, neutralizing activity, stability, immunogenicity and / or pharmacokinetics It is preferable to have.
  • the number of amino acids to be substituted, deleted, added and / or inserted is not particularly limited, but is preferably within 3 amino acids, more preferably within 2 amino acids, more preferably 1 amino acid per CDR.
  • site-directed mutagenesis As a method for substituting one or more amino acid residues with other desired amino acids, for example, site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995 ) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.
  • the desired amino acid of the antibody can be substituted with another amino acid of interest.
  • library technology such as framework shuffling (Mol Immunol. 2007 Apr; 44 (11): 3049-60) and CDR repair (US2006 / 0122377) Amino acid substitution is also possible.
  • the present invention provides the antibody described in any of the following (a) to (c).
  • a heavy chain variable region comprising CDR3 having a sequence, and a CDR1 having a sequence of SEQ ID NO: 10 (CDR1 of VL1), a CDR2 having a sequence of SEQ ID NO: 11 (CDR2 of VL1), and SEQ ID NO: 12 (of VL1
  • An antibody comprising a light chain variable region comprising CDR3 having the sequence of CDR3)
  • the above-described antibody can be used as an anti-human IL-6 receptor antibody having excellent binding activity, excellent pharmacokinetics, excellent safety / immunogenicity, and / or excellent physical properties.
  • the framework region of the human antibody to be linked to the CDR of the present invention is selected so that the CDR forms a favorable antigen binding site.
  • the FR used in the variable region of the present invention is not particularly limited, and any FR may be used, but human-derived FR is preferably used.
  • the human-derived FR may be a FR having a native sequence, and if necessary, one or more amino acids in the framework region having the native sequence are substituted so that the CDR forms an appropriate antigen-binding site. , Deletions, additions and / or insertions, etc.
  • a mutant FR sequence having a desired property can be selected by measuring and evaluating the antigen-binding activity of an antibody using an FR with amino acid substitution (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993)). 53, 851-856).
  • constant region used in the antibody of the present invention is not particularly limited, and any constant region may be used.
  • Preferable examples of constant regions used in the antibodies of the present invention include human-derived constant regions (such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, C ⁇ , and C ⁇ -derived constant regions).
  • One or more amino acids may be substituted, deleted, added and / or inserted in the constant region derived from human.
  • a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 (VH4-M73 constant region), SEQ ID NO: 32 (VH3-M73 constant region) A constant region having the amino acid sequence of (region), and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 (constant region of VH5-M83).
  • SEQ ID NO: 34 (VL1) A constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 (VL3), and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 (VL5).
  • one or more amino acids may be substituted, deleted, added and / or inserted in the CDR sequence described above.
  • CDR sequence after substitution, deletion, addition and / or insertion of one or more amino acids is equivalent to CDR sequence before modification in binding activity, neutralizing activity, stability, immunogenicity and / or pharmacokinetics It is preferable to have.
  • the number of amino acids to be substituted, deleted, added and / or inserted is not particularly limited, but is preferably within 3 amino acids, more preferably within 2 amino acids, more preferably 1 amino acid per CDR.
  • Amino acid substitution, deletion, addition and / or insertion can also be performed by the above-described method.
  • the present invention provides the variable region described in any of the following (a) to (f).
  • a light chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 22 variable region of VL1
  • (f) A light chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 24 (variable region of VL5) A light chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 24 (variable region of VL5).
  • variable region described above can be used as part of an anti-human IL-6 receptor antibody.
  • the anti-human IL-6 receptor antibody using these variable regions has excellent binding activity, excellent pharmacokinetics, excellent safety / immunogenicity, and / or excellent physical properties.
  • one or a plurality of amino acids may be substituted, deleted, added and / or inserted.
  • Examples of the method for substituting one or a plurality of amino acid residues with other amino acids of interest include the methods described above.
  • the present invention also provides a polypeptide comprising the variable region described above.
  • the present invention provides the antibody described in any of (a) to (c) below.
  • variable region described above can be used as part of an anti-human IL-6 receptor antibody.
  • the anti-human IL-6 receptor antibody using these variable regions has excellent binding activity, excellent pharmacokinetics, excellent safety / immunogenicity, and / or excellent physical properties.
  • one or a plurality of amino acids may be substituted, deleted, added and / or inserted.
  • Examples of the method for substituting one or a plurality of amino acid residues with other amino acids of interest include the methods described above.
  • constant region used in the antibody of the present invention is not particularly limited, and any constant region may be used.
  • Preferable examples of constant regions used in the antibody of the present invention include human-derived constant regions (such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, ⁇ chain, and ⁇ chain-derived constant regions).
  • One or more amino acids may be substituted, deleted, added and / or inserted in the constant region derived from human.
  • a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 (VH4-M73 constant region), SEQ ID NO: 32 (VH3-M73 constant region) A constant region having the amino acid sequence of (region), and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 (constant region of VH5-M83).
  • SEQ ID NO: 34 (VL1) A constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 (VL3), and a constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 (VL5).
  • the present invention provides the heavy chain or light chain described in any of the following (a) to (f).
  • (f) A light chain having the sequence of SEQ ID NO: 30 (VL5) A light chain having the sequence of SEQ ID NO: 5 (VL5).
  • the above heavy chain or light chain can be used as part of an anti-human IL-6 receptor antibody.
  • Anti-human IL-6 receptor antibodies using these heavy or light chains have excellent binding activity, excellent pharmacokinetics, excellent safety / immunogenicity, and / or excellent physical properties.
  • one or a plurality of amino acids may be substituted, deleted, added and / or inserted.
  • a method for substituting one or a plurality of amino acid residues with another amino acid of interest for example, the above-described method can be used.
  • One or more amino acid substitutions, deletions, additions and / or insertions may be made in the variable region, in the constant region, or in both the variable and constant regions. Good.
  • the present invention provides the antibody described in any of (a) to (c) below.
  • An antibody comprising a heavy chain having the sequence of SEQ ID NO: 27 (VH5-M83) and a light chain having the sequence of SEQ ID NO: 30 (VL5) an antibody comprising a heavy chain having the sequence of SEQ ID NO: 25 (VH4-M73) and a light chain having the sequence of SEQ ID NO: 28 (VL1)
  • the above-mentioned antibody is an anti-human IL-6 receptor antibody having excellent binding activity, excellent pharmacokinetics, excellent safety / immunogenicity, and / or excellent physical properties.
  • one or a plurality of amino acids may be substituted, deleted, added and / or inserted.
  • Examples of the method for substituting one or a plurality of amino acid residues with other amino acids of interest include the methods described above.
  • One or more amino acid substitutions, deletions, additions and / or insertions may be made in the variable region, in the constant region, or in both the variable and constant regions. Good.
  • the antibody of the present invention is preferably a humanized antibody.
  • a humanized antibody is also called a reshaped human antibody, which is a CDR derived from a mammal other than a human being transplanted to a human antibody CDR, and its general genetic recombination technique is also known. (See European Patent Application Publication No. EP-125023, WO96 / 02576/02).
  • oligonucleotide is synthesized as a primer by PCR (see the method described in WO98 / 13388).
  • the obtained DNA is obtained by ligating with a DNA encoding a human antibody constant region or a human antibody constant region variant, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European Patent Application Publication No. EP 239400, see International Patent Application Publication Number WO 96/02576).
  • the framework region of the human antibody to be linked to the CDR is selected so that the CDR forms a favorable antigen binding site. If necessary, amino acid in the framework region in the variable region of the antibody may be substituted, deleted, added and / or inserted.
  • a human antibody constant region or a human antibody constant region variant in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the human antibody constant region can be used.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4, C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ 1, C ⁇ 2, and C ⁇ can be used for the H chain
  • C ⁇ and C ⁇ can be used for the L chain.
  • the amino acid sequence of C ⁇ is shown in SEQ ID NO: 38, and the base sequence encoding the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 37.
  • the amino acid sequence of C ⁇ 1 is shown in SEQ ID NO: 40, and the base sequence encoding the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 39.
  • the amino acid sequence of C ⁇ 2 is shown in SEQ ID NO: 42
  • the base sequence encoding the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 41.
  • the amino acid sequence of C ⁇ 4 is shown in SEQ ID NO: 44, and the base sequence encoding the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 43.
  • human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • Human antibodies used for humanization may be human antibodies of any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, but IgG is preferably used in the present invention. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc. can be used as IgG.
  • amino acids in the variable region eg, CDR, FR
  • constant region e.g., CDR, FR
  • the humanized antibody also includes a humanized antibody having such amino acid substitution.
  • the antibody of the present invention includes not only a bivalent antibody typified by IgG but also a monovalent antibody or a multivalent antibody typified by IgM as long as it has binding activity and / or neutralizing activity to IL-6 receptor. Is also included.
  • the multivalent antibodies of the present invention include multivalent antibodies that all have the same antigen-binding site, or multivalent antibodies that have some or all different antigen-binding sites.
  • the antibody of the present invention is not limited to the full-length molecule of the antibody, and may be a low molecular weight antibody or a modified product thereof as long as it binds to IL-6 receptor protein.
  • a low molecular weight antibody is an antibody comprising an antibody fragment in which a part of a full-length antibody (whole antibody, such as whole IgG) is deleted, and particularly has the ability to bind to and / or neutralize IL-6 receptor. It is not limited.
  • the low molecular weight antibody is not particularly limited as long as it includes a part of the full-length antibody, but preferably includes VH or VL, and particularly preferably is a low molecular weight antibody including both VH and VL.
  • Another preferred example of the low molecular weight antibody of the present invention is a low molecular weight antibody containing the CDR of the antibody.
  • the CDR included in the low molecular weight antibody may include all six CDRs of the antibody or may include a part of the CDRs.
  • the low molecular weight antibody in the present invention preferably has a smaller molecular weight than the full-length antibody.
  • it may form a multimer such as a dimer, trimer or tetramer, and the molecular weight is larger than that of the full-length antibody. There is also.
  • antibody fragments include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, and Fv.
  • specific examples of the low molecular weight antibody include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, Fv, scFv (single chain Fv), Diabody, sc (Fv) 2 (single chain (Fv) 2) And so on. Multimers of these antibodies (eg, dimer, trimer, tetramer, polymer) are also included in the low molecular weight antibody of the present invention.
  • Antibody fragments can be obtained, for example, by treating an antibody with an enzyme to generate antibody fragments.
  • enzymes that produce antibody fragments include, for example, papain, pepsin, and plasmin.
  • genes encoding these antibody fragments can be constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell (for example, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152). , 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Pluckthun, A. & Skerra, A.
  • the digestive enzyme cleaves a specific position of the antibody fragment to give an antibody fragment having the following specific structure. If a genetic engineering technique is used for such an enzymatically obtained antibody fragment, any part of the antibody can be deleted.
  • the antibody fragments obtained when the above digestive enzymes are used are as follows. Papain digestion: F (ab) 2 or Fab Pepsin digestion: F (ab ') 2 or Fab' Plasmin digestion: Facb
  • the low molecular weight antibody in the present invention can include an antibody fragment lacking an arbitrary region as long as it has binding activity to IL-6 receptor and / or neutralizing activity.
  • Diabody refers to a bivalent antibody fragment constructed by gene fusion (Holliger Pet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), EP 404,097, WO93 / 11161 etc.).
  • Diabodies are dimers composed of two polypeptide chains. Usually, in the polypeptide chain constituting the dimer, VL and VH are connected by a linker in the same chain. The linker in the diabody is generally so short that VL and VH cannot bind to each other. Specifically, the amino acid residues constituting the linker are, for example, about 5 residues. Therefore, VL and VH encoded on the same polypeptide chain cannot form a single chain variable region fragment but form a dimer with another single chain variable region fragment. As a result, the diabody has two antigen binding sites.
  • the scFv antibody is an antibody in which VH and VL are combined with a linker or the like to form a single chain polypeptide (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879 -5883, Pluckthun “The Pharmacology MonoclonallonAntibodies” Vol.113, Resenburg and Moore, ⁇ Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994)).
  • the H chain V region and L chain V region in scFv may be derived from any of the antibodies described herein.
  • any single chain peptide consisting of about 3 to 25 residues can be used as a linker.
  • V regions of both strands can be linked by, for example, the PCR method as described above.
  • the DNA encoding the desired partial amino acid sequence is used as a template.
  • the DNAs encoding the V region of the H chain and the L chain are each amplified by PCR using a pair of primers having sequences corresponding to the sequences at both ends of the DNA to be amplified.
  • DNA encoding a peptide linker portion is prepared.
  • DNA encoding a peptide linker can also be synthesized using PCR.
  • a base sequence that can be linked to the amplification product of each V region synthesized separately is added to the 5 ′ side of the primer to be used.
  • PCR reaction is performed using each DNA of [H chain V region DNA]-[peptide linker DNA]-[L chain V region DNA] and assembly PCR primers.
  • the primer for assembly PCR consists of a combination of a primer that anneals to the 5 ′ side of [H chain V region DNA] and a primer that anneals to the 3 ′ side of [L chain V region DNA]. That is, the assembly PCR primer is a primer set that can amplify DNA encoding the full-length sequence of scFv to be synthesized. On the other hand, a base sequence that can be linked to each V region DNA is added to [peptide linker DNA]. As a result, these DNAs are ligated, and the full length of scFv is finally produced as an amplification product by the primers for assembly PCR.
  • an expression vector containing them and a recombinant cell transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method. Further, the scFv can be obtained by culturing the resulting recombinant cells and expressing the DNA encoding the scFv.
  • VH and VL to be combined are not particularly limited, and may be arranged in any order.
  • the following arrangement can be given.
  • Sc (Fv) 2 is a low molecular weight antibody in which two VHs and two VLs are combined with a linker or the like to form a single chain (Hudson et al., J Immunol. Methods Methods 1999; 231: 177-189).
  • sc (Fv) 2 can be prepared, for example, by linking scFv with a linker.
  • VHs and two VLs are arranged in the order of VH, VL, VH, and VL ([VH] linker [VL] linker [VH] linker [VL]) starting from the N-terminal side of the single-chain polypeptide.
  • the order of the two VHs and the two VLs is not particularly limited to the above arrangement, and may be arranged in any order. For example, the following arrangements can also be mentioned.
  • VH or VL in the low molecular antibody may be substituted, deleted, added and / or inserted. Furthermore, when VH and VL are associated, as long as they have antigen-binding activity, a part of them may be deleted, or another polypeptide may be added.
  • the variable region may be chimerized or humanized.
  • the linker that binds the variable region of the antibody is any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or a synthetic compound linker, for example, a linker disclosed in Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996 Can be used.
  • a preferred linker in the present invention is a peptide linker.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose, but is usually 1 to 100 amino acids, preferably 3 to 50 amino acids, more preferably 5 to 30 amino acids, Particularly preferred is 12 to 18 amino acids (for example, 15 amino acids).
  • amino acid sequence of the peptide linker examples include the following sequences. Ser Gly ⁇ Ser Gly ⁇ Gly ⁇ Ser Ser ⁇ Gly ⁇ Gly Gly, Gly, Gly, Ser (SEQ ID NO: 45) Ser, Gly, Gly, Gly (SEQ ID NO: 46) Gly, Gly, Gly, Gly, Ser (SEQ ID NO: 47) Ser, Gly, Gly, Gly, Gly (SEQ ID NO: 48) Gly, Gly, Gly, Gly, Gly, Ser (SEQ ID NO: 49) Ser, Gly, Gly, Gly, Gly, Gly (SEQ ID NO: 50) Gly, Gly, Gly, Gly, Gly, Gly, Ser (SEQ ID NO: 51) Ser, Gly, Gly, Gly, Gly, Gly, Gly, Gly (SEQ ID NO: 52) (Gly, Gly, Gly, Gly, Ser (SEQ ID NO: 47)) n (Ser, G
  • n which determines the length of the above peptide linker is usually 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2.
  • Synthetic compound linkers are commonly used for cross-linking peptides such as N-hydroxysuccinimide (NHS) disuccinimidyl suberate (DSS) and bis (sulfosuccinimidyl) suberate.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • DSS disuccinimidyl suberate
  • SSS bis (sulfosuccinimidyl) suberate
  • BS3 dithiobis (succinimidylpropionate) (DSP), dithiobis (sulfosuccinimidylpropionate) (DTSSP), ethylene glycol bis (succinimidyl succinate) (EGS), ethylene glycol Bis (sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo-EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate (sulfo-DST), bis [2- (succinimideoxycarbonyloxy) Ethyl] sulfone (BSOCOES), bis [2- (sulfosuccinimidooxycarbonyloxy) ethyl ] And the like sulfone (sulfo-BSOCOES), These crosslinking agents are commercially available.
  • linkers When linking 4 antibody variable regions, usually 3 linkers are required. A plurality of linkers may be the same or different linkers may be used.
  • the antibody of the present invention includes an antibody in which one or more amino acid residues are added to the amino acid sequence of the antibody of the present invention. Also included are fusion proteins in which these antibodies are fused with other peptides or proteins. In the method for producing a fusion protein, a polynucleotide encoding the antibody of the present invention and a polynucleotide encoding another peptide or polypeptide are linked so that the frames coincide with each other, introduced into an expression vector, and expressed in a host. Any technique known to those skilled in the art can be used. Other peptides or polypeptides to be subjected to fusion with the antibody of the present invention include, for example, FLAG (Hopp, T. P.
  • polypeptides to be subjected to fusion with the antibody of the present invention examples include GST (glutathione-S-transferase), HA (influenza agglutinin), immunoglobulin constant region, ⁇ -galactosidase, MBP (maltose). Binding protein) and the like. Preparing a fusion polypeptide by fusing a commercially available polynucleotide encoding the peptide or polypeptide with a polynucleotide encoding the antibody of the present invention and expressing the fusion polynucleotide prepared thereby. Can do.
  • the antibody of the present invention may be a conjugated antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), hyaluronic acid and other high molecular substances, radioactive substances, fluorescent substances, luminescent substances, enzymes, and toxins.
  • PEG polyethylene glycol
  • hyaluronic acid and other high molecular substances
  • radioactive substances such as radioactive substances, fluorescent substances, luminescent substances, enzymes, and toxins.
  • fluorescent substances such as fluorescent substances, luminescent substances, enzymes, and toxins.
  • enzymes such as enzymes, and toxins.
  • a conjugated antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody.
  • the modification method of an antibody has already been established in this field (for example, US5057313, US5156840).
  • the “antibody” in the present invention includes these conjugated antibodies.
  • the antibodies of the present invention also include antibodies with modified sugar chains.
  • the antibody used in the present invention may be a bispecific antibody.
  • Bispecific antibodies refer to antibodies that have variable regions that recognize different epitopes within the same antibody molecule.
  • the bispecific antibody may be a bispecific antibody that recognizes different epitopes on the IL-6 receptor molecule, or one antigen binding site recognizes the IL-6 receptor and the other Bispecific antibodies whose antigen-binding sites recognize other substances can also be used.
  • Antigens to which the other antigen-binding site of the bispecific antibody comprising the antibody of the present invention that recognizes the IL-6 receptor binds include, for example, IL-6, TNF ⁇ , TNFR1, TNFR2, CD80, CD86, CD28, CD20 , CD19, IL-1 ⁇ , IL- ⁇ , IL-1R, RANKL, RANK, IL-17, IL-17R, IL-23, IL-23R, IL-15, IL-15R, BlyS, lymphotoxin ⁇ , lymphotoxin ⁇ , LIGHT ligand, LIGHT, VLA-4, CD25, IL-12, IL-12R, CD40, CD40L, BAFF, CD52, CD22, IL-32, IL-21, IL-21R, GM-CSF, GM-CSFR, M- Examples include CSF, M-CSFR, IFN-alpha, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, CCR5, APRIL, and A
  • bispecific antibodies can be produced by combining two types of antibodies with different recognition antigens.
  • the antibody to be bound may be a 1 ⁇ 2 molecule each having an H chain and an L chain, or may be a 1 ⁇ 4 molecule consisting only of an H chain.
  • bispecific antibody-producing fused cells can be prepared by fusing hybridomas that produce different monoclonal antibodies.
  • bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques.
  • the antibody of the present invention may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence of sugar chain, form, etc., depending on the antibody-producing cell, host or purification method described below. However, as long as the obtained antibody has a function equivalent to the antibody of the present invention, it is included in the present invention. For example, when the antibody of the present invention is expressed in prokaryotic cells such as E. coli, a methionine residue is added to the N-terminus of the original antibody amino acid sequence. The antibody of the present invention also includes such an antibody.
  • a polypeptide such as the anti-IL-6 receptor antibody of the present invention can be produced by methods known to those skilled in the art.
  • an anti-IL-6 receptor antibody using a gene recombination technique known to those skilled in the art.
  • a polynucleotide encoding the antibody is constructed based on the sequence of the antibody recognizing the IL-6 receptor, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell (for example, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, etterM. And Horwitz, itzA. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A . And Skerra, A., Methods Enzymol.
  • the present invention is encoded by a polypeptide of the present invention or a gene encoding a polypeptide of the present invention, comprising the step of culturing a host cell containing a vector into which a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention has been introduced.
  • a method for producing a polypeptide is provided.
  • a method for producing the polypeptide of the present invention comprising the following steps is provided. (a) culturing a host cell containing a vector into which a gene encoding the polypeptide of the present invention has been introduced, (b) A step of obtaining a polypeptide encoded by the gene.
  • vectors examples include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, and pCR-Script.
  • pGEM-T for the purpose of subcloning and excision of cDNA, in addition to the above vector, for example, pGEM-T, pDIRECT, pT7 and the like can be mentioned.
  • An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing the antibody of the present invention.
  • the host is J. coli such as JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1-Blue. Promoters that can be expressed efficiently in E.
  • coli such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB promoter (Better et al., Science (1988) (240), (1041-1043), or having a T7 promoter or the like is essential.
  • lacZ promoter Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427
  • araB promoter Better et al., Science (1988) (240), (1041-1043
  • T7 promoter or the like is essential.
  • examples of such vectors include pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress system” (Qiagen), pEGFP, or pET (in this case, the host expresses T7 RNA polymerase BL21). are preferred).
  • the expression plasmid vector may contain a signal sequence for antibody secretion.
  • a signal sequence for antibody secretion a pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when the periplasm of E. coli is produced.
  • Introduction of a vector into a host cell can be performed using, for example, a calcium chloride method or an electroporation method.
  • vectors for producing the antibody of the present invention include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen)), pEF-BOS® (Nucleic® Acids.® Res.
  • insect cell-derived expression vectors eg, “Bac-to-BAC baculovairus expression system” (manufactured by Gibco BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, pMH1, pMH2) Animal virus-derived expression vectors (for example, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (for example, pZIPneo), yeast-derived expression vectors (for example, “Pichia® Expression® Kit” (manufactured by Invitrogen), pNV11, SP-Q01), and an expression vector derived from Bacillus subtilis (for example, pPL608, pKTH50).
  • Bacillus subtilis for example, pPL608, pKTH50.
  • a promoter required for expression of the expression plasmid vector in the cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. 1990 (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc. are indispensable to select for transformation into cells (For example, drug resistance genes that can be discriminated by drugs (neomycin, G418, etc.)).
  • Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • a vector having a DHFR gene complementary to the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway for example, , PSV2-dhfr ("Molecular Cloning 2nd edition” Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989))
  • MTX methotrexate
  • a method of transforming with a vector having SV40 replication origin (such as pcD) using COS cells having a gene expressing SV40 ⁇ ⁇ T antigen on the chromosome can be mentioned.
  • the expression vectors are selectable markers: aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase ( dhfr) gene and the like.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • the antibody of the present invention thus obtained can be isolated from the inside of the host cell or outside the cell (medium etc.) and purified as a substantially pure and homogeneous antibody. Separation and purification of antibodies may be carried out using separation and purification methods used in normal antibody purification, and are not limited in any way. For example, chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected, When combined, antibodies can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • the column used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column. Examples of the column using protein A include Hyper D, POROS, Sepharose F (GE Amersham Biosciences), and the like.
  • the present invention also encompasses antibodies highly purified using these purification methods.
  • Measurement of the binding activity of the obtained antibody to IL-6 receptor can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescent antibody method can be used as a method for measuring the antigen-binding activity of an antibody.
  • an enzyme immunoassay a sample containing an antibody, for example, a culture supernatant of an antibody-producing cell or a purified antibody is added to a plate coated with an antigen.
  • the pharmaceutical composition and the present invention also provide a pharmaceutical composition containing the above-mentioned polypeptide as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for diseases such as rheumatoid arthritis associated with IL-6. That is, the present invention also provides a therapeutic agent for diseases such as rheumatoid arthritis, which comprises the above-mentioned antibody as an active ingredient.
  • Preferred examples of the disease to be the subject of the present invention include rheumatoid arthritis, juvenile idiopathic arthritis, systemic juvenile idiopathic arthritis, Castleman's disease, systemic lupus erythematosus (SLE), lupus nephritis, Crohn's disease, lymphoma, ulcerative Colitis, anemia, vasculitis, Kawasaki disease, Still's disease, amyloidosis, multiple sclerosis, transplantation, age-related macular degeneration, ankylosing spondylitis, psoriasis, psoriatic arthritis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), IgA Nephropathy, osteoarthritis, asthma, diabetic nephropathy, GVHD, endometriosis, hepatitis (NASH), myocardial infarction, arteriosclerosis, sepsis, osteoporosis, diabetes, multiple myeloma, prostate cancer, kidney Cancer
  • composition of the present invention means that the anti-IL-6 receptor antibody is contained as at least one active ingredient, and does not limit the content.
  • pharmaceutical composition of the present invention may contain other active ingredients in combination with the above-described polypeptides.
  • composition of the present invention may be used not only for therapeutic purposes but also for preventive purposes.
  • the polypeptide of the present invention can be formulated according to a conventional method (for example, Remington's Pharmaceutical Science, Latest Edition, Mark Publishing Company, Easton, USA). Further, if necessary, a pharmaceutically acceptable carrier and / or additive may be included. For example, surfactants (PEG, Tween, etc.), excipients, antioxidants (ascorbic acid, etc.), coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents (phosphoric acid, citric acid, other organic acids) Etc.), chelating agents (EDTA, etc.), suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrants, lubricants, fluidity promoters, flavoring agents, and the like.
  • a pharmaceutically acceptable carrier and / or additive may be included.
  • surfactants PEG, Tween, etc.
  • excipients for example, excipients, antioxidants (ascorbic acid, etc.), coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering
  • the preventive or therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention is not limited to these, and may contain other conventional carriers as appropriate.
  • the anti-IL-6 receptor antibody is dissolved in an isotonic solution containing, for example, physiological saline, glucose or other adjuvants.
  • adjuvants include D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and further suitable solubilizers such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), A nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50) may be used in combination.
  • polypeptides can be encapsulated in microcapsules (microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid]) or colloid drug delivery systems (liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanoparticles). Capsules, etc. (see Remington's Pharmaceutical Science 16th edition & Oslo Ed. (1980), etc.).
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to a polypeptide (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12: 98-105; U.S.
  • Patent 3,773,919 European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers (1983) 22: 547-56; EP 133,988). Furthermore, it is also possible to increase the amount of liquid administered subcutaneously by adding or mixing hyaluronidase to this agent (for example, WO2004 / 078140).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered either orally or parenterally, but is preferably administered parenterally. Specifically, it is administered to a patient by injection and transdermal administration.
  • the injection form it can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection or subcutaneous injection. Local injections, particularly intramuscular injections, may be made at or around the treatment site.
  • transdermal dosage forms include ointments, gels, creams, poultices, patches, and the like, which can be administered systemically or locally.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dose can be selected, for example, from the range of 0.0001 mg to 100 mg of active ingredient per kg of body weight per time.
  • the active ingredient when administered to a human patient, can be selected within a range of 0.001 to 1000 mg / kg ⁇ body ⁇ weight per patient.
  • the antibody of the present invention is 0.01
  • An amount of about 50 mg / kg ⁇ body ⁇ weight is preferably included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not limited to these doses.
  • amino acids contained in the amino acid sequences described in the present invention are modified after translation (for example, modification to pyroglutamic acid by pyroglutamylation of N-terminal glutamine is a modification well known to those skilled in the art). In some cases, even if the amino acid is post-translationally modified as such, it is naturally included in the amino acid sequence described in the present invention.
  • the structure of the sugar chain to be bonded may be any structure.
  • the 297th sugar chain of EU numbering may have any sugar chain structure (preferably fucosylated sugar chain), and sugar chains may not be bound (for example, produced in E. coli, or EU numbering) It is possible to modify the sugar chain so that it does not bind to the 297th position).
  • Example 1 Identification of variable region mutation site that improves affinity of TOCILIZUMAB to IL-6 receptor IL of TOCILIZUMAB (H chain WT-IgG1 / SEQ ID NO: 53, L chain WT-kappa / SEQ ID NO: 54)
  • a library in which mutations were introduced into the CDR sequence was prepared and examined.
  • mutations that improved affinity for IL-6 receptor were found, and these were summarized in FIG.
  • TOCILIZUMAB An example of high affinity TOCILIZUMAB combining these mutations is RDC-23 (H chain RDC23H-IgG1 / SEQ ID NO: 55, L chain RDC-23L-kappa / SEQ ID NO: 56).
  • the affinity of RDC-23 to soluble IL-6 receptor and the biological activity by BaF / gp130 were compared with TOCILIZUMAB (see Reference Example for method).
  • Example 2 Identification of alterations that improve pharmacokinetics by lowering the isoelectric point of TOCILIZUMAB
  • the isoelectric point of the variable region was determined without greatly reducing the binding to IL-6 receptor.
  • mutation sites that can reduce the isoelectric point of the variable region without significantly reducing the binding to IL-6 receptor was summarized in 3.
  • TOCILIZUMAB with reduced isoelectric point combining these mutations include H53 / L28 (H chain H53-IgG1 / SEQ ID NO: 57, L chain L28-kappa / SEQ ID NO: 58).
  • H53 / L28 H chain H53-IgG1 / SEQ ID NO: 57, L chain L28-kappa / SEQ ID NO: 58.
  • the affinity of H53 / L28 for soluble IL-6 receptor, biological activity by BaF / gp130, isoelectric point, and pharmacokinetics in mice were compared with TOCILIZUMAB (see Reference Example for method).
  • the isoelectric point of TOCILIZUMAB is about 9.3
  • the isoelectric point of H53 / L28 is about 6.5 to 6.7
  • H53 / L28 is TOCILIZUMAB.
  • the isoelectric point decreased by about 2.7.
  • the theoretical isoelectric point of the variable region VH / VL was calculated by GENETYX (GENETYXRATIONCORPORATION)
  • the theoretical isoelectric point of TOCILIZUMAB was 9.20
  • the theoretical isoelectric point of H53 / L28 was 4.52
  • H53 / L28 Compared with TOCILIZUMAB
  • the isoelectric point decreased by about 4.7.
  • TOCILIZUMAB and H53 / L28 were administered to mice (C57BL / 6J, Nihon Charles River) at a dose of 1 mg / kg intravenously (IV) and subcutaneously (SC) and the plasma concentration was evaluated.
  • Fig. 5 shows the change in plasma concentration after intravenous administration of TOCILIZUMAB and H53 / L28
  • Fig. 6 shows the change in plasma concentration after subcutaneous administration.
  • the pharmacokinetic parameters obtained by WinNonlin (Pharsight) Clearance (CL) and half-life (T1 / 2)) are shown in Table 3.
  • the plasma half-life (T1 / 2) after intravenous administration of H53 / L28 was about 1.3 times that of TOCILIZUMAB, and the clearance was reduced about 1.7 times.
  • T1 / 2 after subcutaneous administration of H53 / L28 was extended to about twice that of TOCILIZUMAB, and the clearance was reduced about 2.1 times.
  • pharmacokinetics can be greatly improved by lowering the isoelectric point of TOCILIZUMAB by amino acid substitution.
  • Example 3 Identification of mutation sites that reduce the immunogenicity of TOCILIZUMAB Identification of mutation sites that reduce the risk of immunogenicity due to T-cell epitopes present in the variable region TPIcell epitopes present in the variable region sequence of TOCILIZUMAB (Methods. 2004 Dec; 34 (4): 468-75) The analysis was performed using. As a result, it was predicted that there are many T-cell epitopes that bind to HLA in the light chain CDR2 (a sequence with a high immunogenicity risk exists). Therefore, we examined amino acid substitutions that did not reduce stability, binding activity, and neutralization activity while reducing the immunogenicity risk of L chain CDR2 in TEPITOPE analysis.
  • the threonine of L51 (Kabat numbering, Kabat EA et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest.NIH) of LCI CDR2 (SEQ ID NO: 59) of TOCILIZUMAB was used as follows. It was found that by substituting for glutamic acid (SEQ ID NO: 60), the immunogenicity risk can be reduced without reducing stability, binding activity, and neutralization activity.
  • TOCILIZUMAB L chain CDR2 (SEQ ID NO: 59) T-cell epitope removed TOCILIZUMAB L chain CDR2 (SEQ ID NO: 60)
  • TOCILIZUMAB H chain FR1 (SEQ ID NO: 61) Humanized H chain FR1-A (SEQ ID NO: 62) (derived from Germline IMGT hVH_4_) TOCILIZUMAB H chain FR3 (SEQ ID NO: 63) Humanized H chain FR3 (SEQ ID NO: 64) (derived from Mol. Immunol. 2007, 44 (4): 412-422)
  • TOCILIZUMAB Identification of mutation site for improving pharmacokinetics by pH-dependent binding of TOCILIZUMAB to IL-6 receptor
  • one molecule of TOCILIZUMAB is composed of a plurality of ILs. A method of improving the molecule to repeatedly bind and neutralize the -6 receptor was considered.
  • TOCILIZUMAB binds to membrane-type IL-6 receptor and is taken into endosomes by intracellularization while bound to membrane-type IL-6 receptor, and then TOCILIZUMAB moves to lysosome while bound to membrane-type IL-6 receptor. Both are thought to be degraded by lysosomes.
  • TOCILIZUMAB usually binds to one or two membrane-type IL-6 receptors (monovalent or divalent), and is considered to be degraded by lysosomes after internalization.
  • TOCILIZUMAB can bind and neutralize only one or two membrane-type IL-6 receptors.
  • the pH-dependent bond TOCILIZUMAB Dissociates from the membrane-type IL-6 receptor, which is an antigen in endosomes, and can return to plasma by binding to FcRn present in endosomes, and the pH-dependent binding TOCILIZUMAB that has returned to plasma is again membrane-type We thought it was possible to bind to IL-6 receptor.
  • TOCILIZUMAB By repeating this binding in plasma and dissociation in endosomes, it is considered that one molecule of TOCILIZUMAB can repeatedly bind and neutralize multiple molecules of IL-6 receptor, which makes it more pH-dependent than TOCILIZUMAB. Bound TOCILIZUMAB was thought to improve pharmacokinetics.
  • TOCILIZUMAB In order for TOCILIZUMAB to dissociate from the IL-6 receptor under acidic conditions in endosomes, the binding under acidic conditions must be significantly weaker than under neutral conditions. Since it is necessary to bind strongly to the IL-6 receptor and neutralize it on the cell surface, it must bind to the IL-6 receptor at pH 7.4, which is the cell surface pH, at least as much as TOCILIZUMAB. It is reported that the pH in endosome is generally pH 5.5 to pH 6.0 (NatNRev Mol Cell Biol. 2004 Feb; 5 (2): 121-32.) A pH-dependent binding TOCILIZUMAB modified to bind weakly to the IL-6 receptor at pH 6.0 would dissociate from the IL-6 receptor under acidic conditions within the endosome.
  • the pH of the cell surface has been improved so that it binds strongly to the IL-6 receptor at pH 7.4 and weakly binds to the IL-6 receptor at pH 5.5 to pH 6.0 within the endosome. If it is dependent binding TOCILIZUMAB, it was thought that it is possible to bind to and neutralize multiple IL-6 receptors with one molecule and improve pharmacokinetics.
  • pH-dependent binding TOCILIZUMAB examples include H3pI / L73 (H chain H3pI-IgG1 / SEQ ID NO: 66, L chain L73-kappa / SEQ ID NO: 67). Affinity of H3pI / L73 to soluble IL-6 receptor at pH 7.4, dissociation rate from membrane IL-6 receptor at pH 7.4 and pH 5.8, biological activity by BaF / gp130, and cynomolgus monkey and human Pharmacokinetics in IL-6 receptor transgenic mice was compared with TOCILIZUMAB (see Reference Examples for methods).
  • the results of measuring the affinity for soluble IL-6 receptor at pH 7.4 are shown in Table 4.
  • the results of measuring the biological activity by BaF / gp130 (final concentration of IL-6: 30 ng / mL) are shown in FIG. H3pI / L73 was shown to have an affinity for soluble IL-6 receptor and an activity of BaF / gp130 at approximately pH 7.4 compared to TOCILIZUMAB.
  • Table 5 shows the results of measuring the dissociation rate of TOCILIZUMAB and H3pI / L73 to membrane-type IL-6 receptor at pH 7.4 and pH 5.8.
  • H3pI / L73 showed a faster dissociation rate at pH 5.8, indicating that the pH dependence of the dissociation rate from membrane-type IL-6 receptor was improved by about 2.6 times compared to TOCILIZUMAB.
  • TOCILIZUMAB and H3pI / L73 were administered to cynomolgus monkeys at a dose of 1 mg / kg intravenously, and changes in plasma concentrations were evaluated.
  • FIG. 10 shows changes in plasma concentration after intravenous administration of TOCILIZUMAB and H3pI / L73.
  • H3pI / L73 significantly improved pharmacokinetics in cynomolgus monkeys compared to TOCILIZUMAB.
  • TOCILIZUMAB and H3pI / L73 were intravenously administered to human IL-6 receptor transgenic mice (hIL-6R tg mice, Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 May 23; 92 (11): 4862-6) at 25 mg / kg Was administered once, and the plasma concentration transition was evaluated.
  • FIG. 11 shows changes in plasma concentration after intravenous administration of TOCILIZUMAB and H3pI / L73.
  • H3pI / L73 significantly improved pharmacokinetics in human IL-6 receptor transgenic mice compared to TOCILIZUMAB.
  • the pH-dependent binding TOCILIZUMAB H3pI / L73, binds to antigen at pH 7.4 and has a pH of 5.8 due to the greatly improved pharmacokinetics compared to TOCILIZUMAB in cynomolgus monkeys and human IL-6 receptor transgenic mice. It was thought that it was possible to bind to and neutralize multiple IL-6 receptors with a single molecule by imparting the property of dissociating from the antigen. In addition, it was considered that the pharmacokinetics could be further improved by imparting a stronger pH dependency to the binding to IL-6 receptor than H3pI / L73.
  • the main component is a sequence in which the lysine of the C-terminal amino acid present on the base sequence is deleted by post-translational modification, but the C-terminal carboxyl group due to the loss of both glycine and lysine as a secondary component in which lysine remains
  • the amidated subcomponent of is also present as a heterogeneity. It is not easy to manufacture a large amount as a pharmaceutical product while maintaining the heterogeneity of the target substance / related substance, leading to increased costs, and it is desirable that it be a single substance as much as possible. For development, it is desirable that these heterogeneities are reduced. Therefore, it is desirable that there is no H chain C-terminal heterogeneity when developing as a pharmaceutical product.
  • the C-terminal amino acid was modified for the purpose of reducing heterogeneity of the C-terminal amino acid. As a result, it was found that heterogeneity derived from the C-terminus can be avoided by deleting the lysine and glycine at the C-terminus of the H chain constant region of TOCILIZUMAB in advance.
  • TOCILIZUMAB C-terminal lysine deficient TOCILIZUMAB (TOCILIZUMAB ⁇ K, H chain WT-IgG1 ⁇ K / SEQ ID NO: 68, L chain WT-kappa / SEQ ID NO: 54), and C-terminal lysine and glycine deficient TOCILIZUMAB (TOCILIZUMAB ⁇ GK, H chain WT Evaluation of heterogeneity of -IgG1 ⁇ GK / SEQ ID NO: 69, light chain WT-kappa / SEQ ID NO: 54) was performed by cation exchange chromatography.
  • TOCILIZUMAB Reduction of heterogeneity derived from the disulfide bond of the IgG2 isotype of TOCILIZUMAB
  • the isotype of TOCILIZUMAB is IgG1
  • TOCILIZUMAB is a neutralizing antibody
  • binding to Fc ⁇ receptor is preferable when considering immunogenicity and side effects There may be no possibility.
  • a method for reducing the binding to the Fc ⁇ receptor a method of changing the IgG isotype from IgG1 to IgG2 or IgG4 (Ann Hematol. 1998 Jun; 76 (6): 231-48.) Is considered. From the viewpoint of binding and pharmacokinetics, IgG2 was considered preferable to IgG4 (Nat Biotechnol.
  • TOCILIZUMAB-IgG1 H chain WT-IgG1 / SEQ ID NO: 53, L chain WT-kappa / SEQ ID NO: 54
  • TOCILIZUMAB-IgG2 H chain WT-IgG2 / SEQ ID NO: 71, L chain WT-kappa / SEQ ID NO: : 54
  • TOCILIZUMAB-SKSC H chain WT-SKSC / SEQ ID NO: 70, L chain WT-kappa / SEQ ID NO: 54
  • TOCILIZUMAB-IgG2 markedly increased heterogeneity compared to TOCILIZUMAB-IgG1, but it was found that the use of TOCILIZUMAB-SKSC can significantly reduce heterogeneity.
  • TOCILIZUMAB-IgG2 has a low stability Tm shoulder peak (Fab *) component, which is considered to be due to a hetero component in the heat denaturation peak of the Fab domain in DSC,
  • Tm * Tm shoulder peak
  • the shoulder peak with a low Tm value which seems to be due to the hetero component, disappeared, and the Tm value of about 94 ° C equivalent to the Fab domain of TOCILIZUMAB-IgG1 and TOCILIZUMAB-IgG2 was shown, so TOCILIZUMAB- SKSC was found to have high stability.
  • TOCILIZUMAB-SKSC with high stability and reduced heterogeneity for IgG2 isotype constant region antibodies to find a constant region with better plasma half-life than IgG1 isotype constant region antibodies
  • EU numbering 137th glutamic acid was glycine
  • 138th serine was glycine
  • 268 histidine was glutamine
  • WT-M58 in which 355th arginine was replaced with glutamine and 419th glutamine was replaced with glutamic acid, and in addition to this, 446th glycine and 447th lysine were deleted in order to reduce heterogeneity at the C-terminal of the H chain.
  • WT-M44 SEQ ID NO: 73 (amino acid sequence) in which 434th asparagine was substituted with alanine was prepared for IgG1.
  • WT-M83 SEQ ID NO: 74 (amino acid sequence) lacking the 446th glycine and the 447th lysine was prepared in order to reduce the heterogeneity of the H chain C terminal relative to M44.
  • WT-M73 SEQ ID NO: 75 (amino acid sequence) in which 434th asparagine was substituted with alanine was prepared for WT-M58.
  • TOCILIZUMAB-M44 H chain WT-M44 / SEQ ID NO: 73, L chain WT-kappa / SEQ ID NO: 54
  • TOCILIZUMAB-M58 H chain WT-M58 / SEQ ID NO: 72, L chain WT-kappa / SEQ ID NO: : 54
  • TOCILIZUMAB-M73 H chain WT-M73 / SEQ ID NO: 75, L chain WT-kappa / SEQ ID NO: 54
  • FIG. 15 shows the results of pharmacokinetic evaluation of TOCILIZUMAB-IgG1, TOCILIZUMAB-M44, TOCILIZUMAB-M58 and TOCILIZUMAB-M73 in human FcRn transgenic mice.
  • TOCILIZUMAB-M44, TOCILIZUMAB-M58, and TOCILIZUMAB-M73 all had improved pharmacokinetics compared to TOCILIZUMAB-IgG1. Its pharmacokinetic improvement effect correlated with the ability to bind to human FcRn.
  • Example 7 Preparation of fully humanized IL-6 receptor antibody with improved PK / PD TOCILIZUMAB variants were prepared by combining multiple mutations in the variable region and constant region of TOCILIZUMAB found in the above Example.
  • Fv3-M73 H chain VH4-M73 / SEQ ID NO: 25, L chain VL1-kappa / SEQ ID NO: 28
  • Fv4-M73 H chain VH3 -M73 / SEQ ID NO: 26, L chain VL3-kappa / SEQ ID NO: 29
  • Fv5-M83 H chain VH5-M83 / SEQ ID NO: 27, L chain VL5-kappa / SEQ ID NO: 30
  • the affinity of the prepared Fv3-M73, Fv4-M73, and Fv5-M83 for IL-6 receptor was compared with that of TOCILIZUMAB (refer to the reference example for the method).
  • Table 7 shows the results of measuring the affinity of these antibodies for soluble IL-6 receptor at pH 7.4.
  • the neutralizing activity of BaF / gp130 was compared with TOCILIZUMAB and control (a known high affinity high IL-6 receptor antibody of a reference example, VQ8F11-21 hIgG1 in US 2007/0280945) (refer to the reference example for the method).
  • the results of measuring the biological activity of these antibodies by BaF / gp130 are shown in FIG.
  • FIG. 16 (IL-6 final concentration 300 ⁇ ng / mL: TOCILIZUMAB, control, Fv5-M83) and FIG. 17 (IL-6 final concentration 30 ⁇ ng / mL: TOCILIZUMAB, Fv3-M73, Fv4-M73).
  • Fv3-M73 and Fv4-M73 had an affinity about 2 to 3 times stronger than TOCILIZUMAB, and Fv5-M83 showed an affinity about 100 times stronger than TOCILIZUMAB (Fv5 Since it was difficult to measure affinity with -M83, affinity was measured using Fv5-IgG1 (H chain VH5-IgG1 / SEQ ID NO: 76, L chain VL5-kappa / SEQ ID NO: 30) whose constant region was IgG1 Thus, the constant region is generally considered not to affect affinity).
  • Fv3-M73 and Fv4-M73 show a slightly stronger activity compared to TOCILIZUMAB, and as shown in FIG.
  • Fv5-M83 has a 50% inhibitory concentration of 100 times or more as compared with TOCILIZUMAB. It had a strong activity and showed a neutralization activity about 10 times higher as a 50% inhibitory concentration compared to a control which is a known high affinity high IL-6 receptor antibody.
  • the isoelectric point of TOCILIZUMAB, control, Fv3-M73, Fv4-M73, and Fv5-M83 was measured by isoelectric focusing by a method known to those skilled in the art, and as a result, the isoelectric point of TOCILIZUMAB was about 9.3, and the control was about 8.4. ⁇ 8.5, Fv3-M73 is about 5.7-5.8, Fv4-M73 is about 5.6-5.7, Fv5-M83 is 5.4-5.5, and the isoelectric point of each antibody was significantly lower than TOCILIZUMAB and control .
  • T-cell epitopes present in the variable region sequences of TOCILIZUMAB, Fv3-M73, Fv4-M73, and Fv5-M83 were analyzed using TEPITOPE (Methods. 2004 Dec; 34 (4): 468-75).
  • TOCILIZUMAB was predicted to have a T-cell epitope in which many sequences bind to HLA, but Fv3-M73, Fv4-M73, and Fv5-M83 are T-cell epitopes.
  • the sequence predicted to bind to was significantly reduced.
  • Fv3-M73, Fv4-M73, and Fv5-M83 are fully humanized with no mouse sequence remaining in the framework.
  • Example 8 Monkey PK / PD test of fully humanized IL-6 receptor antibody TOCILIZUMAB, control, Fv3-M73, Fv4-M73, and Fv5-M83 were administered to cynomolgus monkeys intravenously at 1 mg / kg. The change in plasma concentration was evaluated (refer to the reference example for the method).
  • FIG. 18 shows changes in plasma concentrations after intravenous administration of TOCILIZUMAB, Fv3-M73, Fv4-M73, and Fv5-M83.
  • Fv3-M73, Fv4-M73, and Fv5-M83 all significantly improved pharmacokinetics in cynomolgus monkeys compared to TOCILIZUMAB and controls.
  • the pharmacokinetics of Fv3-M73 and Fv4-M73 were significantly improved compared to TOCILIZUMAB.
  • Cynomolgus monkey IL-6 5 ⁇ g from 6th to 18th day of antibody administration (from 3rd to 10th day for TOCILIZUMAB) to evaluate the efficacy of neutralizing cynomolgus membrane IL-6 receptor / kg was subcutaneously administered daily to the back of the lumbar region, and the CRP concentration of each individual was measured 24 hours later (see Reference Examples for methods). The change in CRP concentration at the time of administration of each antibody is shown in FIG.
  • Fv3-M73, Fv4-M73, and Fv5-M83 all neutralize cynomolgus monkey membrane IL-6 receptor more persistently than TOCILIZUMAB and the known high affinity anti-IL-6 receptor antibody control. , The increase of CRP was suppressed for a long time. In addition, Fv3-M73, Fv4-M73, and Fv5-M83 all neutralize cynomolgus monkey soluble IL-6 receptor more persistently than TOCILIZUMAB and control, and non-binding cynomolgus monkey soluble IL -6 receptors increased for a long time.
  • Fv3-M73, Fv4-M73, and Fv5-M83 are all superior to TOCILIZUMAB and controls in terms of the persistence of neutralization of membrane-type IL-6 receptor and soluble IL-6 receptor. It was found. In particular, the sustainability of neutralization of Fv3-M73 and Fv4-M73 was extremely excellent.
  • Fv5-M83 suppresses CRP and non-binding cynomolgus monkey soluble IL-6 receptor lower than Fv3-M73 and Fv4-M73.
  • Type 6 IL-6 receptor was thought to be more strongly neutralized than Fv3-M73 and Fv4-M73 and the known high affinity anti-IL-6 receptor antibody control. This is probably because Fv5-M83 has a stronger affinity for the IL-6 receptor than the control, and the biological activity of BaF / gp130 is reflected in cynomolgus monkeys in vivo.
  • Fv3-M73 and Fv4-M73 have extremely long-lasting effects as anti-IL-6 receptor neutralizing antibodies, greatly reducing the frequency and dose of administration. Further, it was found that Fv5-M83 is extremely excellent in the strength of action as an anti-IL-6 receptor neutralizing antibody, and also has excellent durability of action. Therefore, Fv3-M73, Fv4-M73, and Fv5-M83 are considered useful as pharmaceutical agents as IL-6 antagonists.
  • MCP-1 Monocyte chemoattractant protein (MCP) -1 is known to be involved in cell infiltration of monocytes, T cells, NK cells, and basophil. MCP-1 has been reported to be highly expressed in the synovial tissue and synovial fluid of RA patients (J Clin Invest. 1992 Sep; 90 (3): 772-9) and is involved in the pathology of RA (Inflamm Allergy Drug Targets. 2008 Mar; 7 (1): 53-66.).
  • VEGF is a potent angiogenic factor and is known to be produced from macrophages, fibroblasts, synovial cells, etc. in the synovium of RA patients (J Rheumatol. 1995 Sep; 22 (9) : 1624-30.)
  • VEGF levels in RA patients' sera correlated with disease activity and radiographic progression (Arthritis Rheum. 2003 Jun; 48 (6): 1521-9., Arthritis Rheum.
  • Treatment of RA patients with anti-IL-6R antibody TOCILIZUMAB reduces serum VEGF levels, and VEGF is also considered to play an important role in the pathology of RA (Mod Rheumatol 2009; 19 (1): 12-9, Mediators Inflamm. 2008; 2008: 129873).
  • TOCILIZUMAB and Fv4-M73 can suppress MCP-1 and VEGF production from human RA patient-derived synovial cells by sIL-6R and IL-6 stimulation.
  • Human RA patient-derived synoviocytes (TOYOBO) were seeded in 2 ⁇ 10 4 /0.05 mL / well in 96% plate in IMDM medium containing 5% FCS, and in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) Left for 90 minutes.
  • Fv4-M73 has a long-lasting effect as an anti-IL-6 receptor neutralizing antibody (binding to IL-6 receptor and blocking membrane IL-6 receptor and soluble IL-6 receptor signals). Is superior to TOCILIZUMAB, and can significantly reduce the administration frequency and dosage compared to TOCILIZUMAB, and Fv4-M73 is an MCP-1 from human RA patient-derived synoviocytes And suppression of VEGF production, Fv4-M73 was shown to be a very useful therapeutic agent for RA.
  • a soluble type was obtained by three column chromatography: Blue Sepharose 6 FF column chromatography, affinity chromatography with a column immobilized with a specific antibody against SR344, and gel filtration column chromatography. Human IL-6 receptor was purified. The fraction eluted as the main peak was used as the final purified product.
  • the obtained DNA fragment was inserted into a mammalian cell expression vector, and a CHO constant expression strain (cyno.sIL-6R-producing CHO cell) was produced using this.
  • a CHO constant expression strain cyno.sIL-6R-producing CHO cell
  • HisTrap column GE Healthcare Bioscience
  • Amicon Ultra-15 Ultracel-10k Millipore
  • Superdex200pg16 / 60 gel filtration column GE Health
  • the product was further purified by Care Bioscience, and used as a final purified product of soluble cynomolgus monkey IL-6 receptor (hereinafter cIL-6R).
  • Cynomolgus monkey IL-6 was prepared as follows. A base sequence encoding 212 amino acids registered in SWISSPROT Accession No.P79341 was created, cloned into a mammalian cell expression vector, and introduced into CHO cells to produce a constant expression cell line (cyno.IL-6 Producing CHO cells).
  • VQ8F11-21 hIgG1 which is a high-affinity anti-IL-6 receptor antibody described in US 2007/0280945 A1
  • H chain amino acid sequence: SEQ ID NO: 77 H chain amino acid sequence: SEQ ID NO: 78
  • SEQ ID NO: 78 L chain amino acid sequence: SEQ ID NO: 78
  • the antibody variable region was prepared by a PCR method (assembly PCR) combined with a synthetic oligo DNA, and IgG1 was used for the constant region.
  • the antibody variable region and the constant region were combined by Assembly PCR method and inserted into a mammalian expression vector to prepare the target H chain expression vector and L chain expression vector.
  • the base sequence of the obtained expression vector was determined by a method known to those skilled in the art.
  • Expression and purification were performed using the prepared expression vector. Expression and purification were performed by the method described in Example 1 to obtain a high affinity anti-IL-6 receptor antibody (hereinafter referred to as control).
  • TOCILIZUMAB mutants were prepared using the QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) using the method described in the attached instructions, and the resulting plasmid fragment was transformed into mammalian cells.
  • the target H chain expression vector and L chain expression vector were prepared by inserting into an expression vector.
  • the base sequence of the obtained expression vector was determined by a method known to those skilled in the art.
  • Antibody expression was carried out using the following method.
  • HEK293H derived from human fetal kidney cancer cells is suspended in DMEM medium (Invitrogen) containing 10% Fetal Bovine Serum (Invitrogen), and the dish (diameter) is 5-6 x 10 5 cells / mL. 10 mL to each dish of 10 cm, CORNING) After culturing overnight in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ), the medium is removed by suction and CHO-S-SFM-II (Invitrogen) medium 6.9 mL was added. The prepared plasmid was introduced into cells by the lipofection method.
  • the cells are removed by centrifugation (approximately 2000 g, 5 minutes, room temperature), and further sterilized through a 0.22 ⁇ m filter MILLEX (R) -GV (Millipore). Got.
  • the antibody was purified from the obtained culture supernatant using rProtein A Sepharose TM Fast Flow (Amersham Biosciences) by a method known to those skilled in the art.
  • the purified antibody concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm using a spectrophotometer.
  • the antibody concentration was calculated from the obtained value using the extinction coefficient calculated by the PACE method (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).
  • a BaF3 cell line expressing human gp130 was established as described below.
  • Full-length human gp130 cDNA (Hibi et al., Cell 1990; 63: 1149-1157 (GenBank # NM_002184)) was amplified by PCR to remove the DHFR gene expression site of pCHOI (Hirata et al., FEBS Letter 1994; 356: 244-248) Then, it was cloned into an expression vector pCOS2Zeo into which a Zeocin resistance gene expression site was inserted to construct pCOS2Zeo / gp130.
  • Full-length human IL-6R cDNA was amplified by PCR and cloned into pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) to construct hIL-6R / pcDNA3.1 (+).
  • the purified antibody was diluted with RPMI1640 containing 10% FBS, and 50 ⁇ L was mixed with each well.
  • WST-8 reagent Cell Counting Kit-8, Dojindo Laboratories, Inc.
  • Absorbance at 450 nm was measured using SUNRISE CLASSIC (TECAN). After culturing for 2 hours, the absorbance at 450 nm (reference wavelength: 620 nm) was measured again, and IL-6 receptor neutralizing activity was evaluated using the change in absorbance during 2 hours as an index.
  • Biacore Biacore T100 (GE Healthcare) was used to analyze the kinetics of antigen-antibody reaction.
  • An appropriate amount of protein A, protein A / G or anti-IgG ( ⁇ -chain specific) F (ab ') 2 is immobilized on the sensor chip by the amine coupling method, and then the target antibody is bound at pH 7.4.
  • soluble IL-6 receptor prepared at various concentrations at pH 7.4 was run as an analyte, and the interaction between the antibody and soluble human IL-6 receptor was measured. All measurements were performed at 37 ° C.
  • association rate constant k a (1 / Ms) and dissociation rate constant k d (1 / s), which are kinetic parameters, are calculated, and K D (M ) was calculated.
  • Biacore T100 Evaluation Software (GE Healthcare) was used for calculation of each parameter.
  • PH 5.8 when the sample concentration is 0.25 ⁇ g / mL, bound with 10 mM MES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, and dissociated with 10 mM MES pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20.
  • the dissociation rate constant (k d (1 / s)) at pH 5.8 was calculated by fitting only the dissociation phase in Biacore T100 Evaluation Software (GE Healthcare).
  • FcRn is a complex of FcRn and ⁇ 2-microglobulin. Oligo DNA primers were prepared based on the published human FcRn gene sequence (J. Exp. Med. 180 (6), 2377-2381 (1994)). A human cDNA (Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech) was used as a template, and a DNA fragment encoding the entire gene length was prepared by PCR using the prepared primer.
  • a DNA fragment encoding an extracellular region including a signal region was amplified by PCR and inserted into a mammalian cell expression vector (human FcRn amino acid sequence / SEQ ID NO: 79).
  • oligo DNA primers were prepared based on the published human ⁇ 2-microglobulin gene sequence (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (26), 16899-16903 (2002)).
  • a human cDNA Human-Placenta Marathon-Ready cDNA, CLONTECH
  • a DNA fragment encoding the full length of the gene was prepared by PCR using the prepared primer.
  • a DNA fragment encoding ⁇ 2-microglobulin full length (Met1-Met119) including a signal region was amplified by PCR and inserted into a mammalian cell expression vector (human ⁇ 2-microglobulin amino acid sequence / SEQ ID NO: 80).
  • Soluble human FcRn was expressed by the following procedure.
  • the prepared human FcRn and human ⁇ 2-microglobulin plasmids were introduced into cells of the human fetal kidney cancer cell-derived HEK293H strain (Invitrogen) by the lipofection method using 10% Fetal Bovine Serum (Invitrogen).
  • purification was performed using IgG ⁇ Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Biosciences) according to the method of (J Immunol. 2002 Nov 1; 169 (9): 5171-80.). Thereafter, purification was performed using HiTrap Q HP (GE Healthcare).
  • Cynomolgus monkey plasma concentration was measured by ELISA using a method known to those skilled in the art.
  • CRP concentration was measured with Sias R CRP (Kanto Chemical Co., Inc.) using an automatic analyzer (TBA-120FR, Toshiba Medical Systems Co., Ltd.).
  • the concentration of unbound soluble cynomolgus monkey IL-6 receptor in cynomolgus monkey plasma was measured as follows. By adding 30 ⁇ L of cynomolgus monkey plasma to an appropriate amount of rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) resin dried in a 0.22 ⁇ m filter cup (Millipore), all IgG-type antibodies present in the plasma (cynomolgus IgG, anti-human) IL-6 receptor antibody and anti-human IL-6 receptor antibody-soluble cynomolgus monkey IL-6 receptor complex) were adsorbed to Protein A. Then, it spin-down with the high-speed centrifuge and collect
  • the path solution does not contain protein A-bound anti-human IL-6 receptor antibody-soluble cynomolgus monkey IL-6 receptor complex
  • the soluble cynomolgus monkey IL-6 receptor concentration is measured by a method known to those skilled in the art of measuring the human IL-6 receptor concentration using the soluble cynomolgus monkey IL-6 receptor (cIL-6R) prepared above as a standard. did.
  • the non-binding soluble IL-6 receptor ratio was calculated by the following formula.

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Abstract

ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABの可変領域および定常領域のアミノ酸配列を改変することで、抗原中和能を増強させつつ、薬物動態を向上させることで投与頻度を少なくし持続的に治療効果を発揮し、且つ、免疫原性、安全性、物性（安定性および均一性）を改善させ、TOCILIZUMABより優れた第2世代の分子からなる医薬組成物、並びに、それらの医薬組成物の製造方法を提供する。

Description

改良された抗体分子
　本発明は、抗IL-6レセプター抗体を有効成分として含有する医薬組成物、および、その製造法等に関する。
　抗体は血漿中での安定性が高く、副作用も少ないことから医薬品として注目されている。中でもIgG型の抗体医薬は多数上市されており、現在も数多くの抗体医薬が開発されている（非特許文献１、非特許文献２）。IL-6は様々な自己免疫疾患・炎症性疾患・悪性腫瘍等に関与するサイトカインであり（非特許文献３）、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMAB（トシリズマブ）はIL-6レセプターに特異的に結合する。TOCILIZUMABはIL-6の生物学的作用を中和することで、関節リウマチ等のIL-6が関連する疾患の治療薬として利用可能であると考えられており（特許文献１、２、３、非特許文献４）、日本においてはキャッスルマン病および関節リウマチの治療薬として承認されている（非特許文献５）。
　TOCILIZUMABのようなヒト化抗体は第１世代の抗体医薬であり、第１世代の抗体医薬を改良して薬効・利便性・コストを改善させた第2世代の抗体医薬が現在開発されている。第2世代の抗体医薬に適用可能な技術として様々な技術が開発されており、エフェクター機能、抗原結合能、薬物動態、安定性を向上させる、あるいは、免疫原性リスクを低減させる技術等が報告されている。薬効を増強させる、あるいは、投与量を低減させる方法として、IgG抗体のFc領域のアミノ酸置換により抗体依存性細胞障害活性（ADCC活性）や補体依存性細胞障害活性（CDC活性）を増強させる技術が報告されている（非特許文献６）。また、抗原結合能、抗原中和能を増強させる技術として、アフィニティーマチュレーション技術（非特許文献７）が報告されており、可変領域の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）などのアミノ酸に変異を導入することで抗原への結合活性を増強することが可能である。抗原結合能の増強によりin vitroの生物活性を向上させる、あるいは投与量を低減することが可能であり、さらにin vivoでの薬効を向上させることも可能である（非特許文献８）。現在、抗RSV抗体の第一世代薬であるPalivizumabより優れた効果を発揮するとされるMotavizumab（アフィニティーマチュレーションにより作製）の臨床試験が行われている（非特許文献９）。抗IL-6レセプター抗体においては、TOCILIZUMABよりアフィニティーが強いとされるアフィニティーが約0.05 nMの抗体が報告されているが（特許文献４）、0.05 nMより強いアフィニティーを有するヒト抗体あるいはヒト化抗体あるいはキメラ抗体の報告は無い。
　現在の抗体医薬が抱える問題として、投与タンパク量が非常に多いことによる高い製造コストが挙げられる。ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABにおいても投与量は8 mg/kg/month程度の静脈内注射が想定されている（非特許文献４）。また投与形態については、慢性的な自己免疫疾患の場合は皮下投与製剤が望ましいとされている。一般的に皮下投与製剤は高濃度製剤であることが必要であり、IgGタイプの抗体製剤の場合、安定性等の点から一般的には100 mg/mL程度の製剤が限度であると考えられる（非特許文献１０）。持続的な治療効果を発揮できるよう抗体の血漿中半減期を長くすることで投与タンパク量を小さくし、高い安定性を付与することによって、長い投与間隔での皮下投与を可能にし、低コスト且つ利便性の高い第２世代の抗体医薬を提供することが可能である。
　抗体の薬物動態にはFcRnが大きく関与しており、抗体のアイソタイプ間の血漿中半減期の違いに関しては、IgG1およびIgG2が最も血漿中半減期に優れ、IgG3およびIgG4がそれより劣ることが知られている（非特許文献１１）。血漿中半減期に優れるIgG1およびIgG2の抗体の血漿中半減期をさらに向上させる方法として、FcRnへの結合を増強する定常領域のアミノ酸置換が報告されている（非特許文献１２、１３）。また、免疫原性の観点からは定常領域よりも可変領域のアミノ酸置換により血漿中半減期をさらに向上させるほうが望ましいが（特許文献５）、これまで可変領域を改変することによりIL-6レセプター抗体の血漿中半減期を向上させた報告は無い。
　バイオ医薬品を開発するにあたってもうひとつの重要な問題は免疫原性である。一般的にマウス抗体はヒト化することによって免疫原性が低減される。ヒト化する際のテンプレートフレームワークにジャームライン配列を用いることにより、免疫原性のリスクはさらに軽減できるとされている（非特許文献１４）。しかしながら、完全ヒト抗TNF抗体であるAdalimumabであっても13～17％と高頻度で免疫原性が出現し、免疫原性が出現した患者においては治療効果の低減が見られている（非特許文献１５、１６）。ヒト抗体であってもCDRにT-cellエピトープが存在する可能性があり、CDR上のT-cellエピトープが免疫原性の原因となっている可能性がある。T-cellエピトープをin silicoあるいはin vitroで予測する方法が報告されているが（非特許文献１７、１８）、これらの方法を用いて予測されるT-cellエピトープを除去することで、免疫原性リスクを低減することが可能であると考えられる（非特許文献１９）。
　ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABは、マウスPM1抗体をヒト化したIgG1抗体である。H鎖、L鎖それぞれNEW、REIのヒト配列をテンプレートフレームワークとして用いてCDRグラフティングが行われているが、活性保持に重要なアミノ酸として５アミノ酸がマウス配列としてフレームワークに残存している（非特許文献２０）。これまでヒト化抗体であるTOCILIZUMABのフレームワークに残存するマウス配列の活性を低下させること無く完全ヒト化した報告は無い。また、TOCILIZUMABのCDR配列はマウス配列であり、Adalimumab同様、CDRにT-cellエピトープが存在する可能性があり、免疫原性のリスクは否定できない。TOCILIZUMABの臨床試験において、薬効用量である8 mg/kgにおいて抗TOCILIZUMAB抗体の出現は認められていないが、4 mg/kgおよび2 mg/kgにおいては該抗体が認められている（特許文献６）。これらのことから、TOCILIZUMABの免疫原性については改善の余地があると考えられる。しかしながら、これまでにアミノ酸置換により免疫原性リスクを改善させたTOCILIZUMABに関する報告は無い。
　TOCILIZUMABのアイソタイプはIgG1であるが、アイソタイプの違いはすなわち定常領域の配列の違いであり、定常領域の配列はエフェクター機能、薬物動態、物性等に大きく影響を与えると考えられていることから、抗体医薬の開発にとって定常領域の配列の選択は極めて重要である（非特許文献１１）。近年、抗体医薬の安全性が非常に重要視されており、TGN1412のPhaseI臨床試験で見られた重大な副作用の原因の一つとして、抗体のFc部分とFcγレセプターの相互作用（エフェクター機能）が考えられている（非特許文献２１）。抗原の生物学的作用を中和することが目的の抗体医薬においては、ADCC等のエフェクター機能に重要なFcγレセプターへの結合は不必要であり、副作用の点から考えるとFcγレセプターへの結合はむしろ好ましくない可能性も考えられる。Fcγレセプターへの結合を低下させる方法としては、IgG抗体のアイソタイプをIgG1からIgG2あるいはIgG4に変える方法があるが（非特許文献２２）、FcγレセプターIへの結合および薬物動態の観点からはIgG4よりはIgG2が望ましいと考えられる（非特許文献１１）。TOCILIZUMABのアイソタイプはIgG1であり、IL-6レセプター中和抗体であることから、ADCC等のエフェクター機能は必要とせず副作用の可能性を考えた場合、アイソタイプはIgG2が望ましい可能性も考えられる。
　一方、抗体を医薬品として開発するにあたり、そのタンパク質の物性、中でも均一性と安定性は極めて重要であり、IgG2アイソタイプは、ヒンジ領域のジスルフィド結合に由来するヘテロジェニティーが極めて多いことが報告されている（非特許文献２３）。これに由来する目的物質/関連物質のヘテロジェニティーの製造間差を維持しつつ医薬品として大量に製造することは容易ではなくコスト増につながり、可能な限り単一物質であることが望まれる。さらに抗体のH鎖C末端配列のヘテロジェニティーとして、C末端アミノ酸のリジン残基の欠損、および、C末端の２アミノ酸のグリシン、リジンの欠損によるC末端カルボキシル基のアミド化が報告されており（非特許文献２４）、IgG2アイソタイプの抗体を医薬品として開発する上には高い安定性を維持しつつこれらのヘテロジェニティーが低減されていることが望ましい。利便性に優れた安定な高濃度の皮下投与製剤を作製するためには、安定性が高いだけでなく、血漿中半減期に関してもTOCILIZUMABのアイソタイプであるIgG1よりも優れていることが望ましい。しかしながら、これまでにIgG2アイソタイプの定常領域の抗体に関するヘテロジェニティーが低減され、高い安定性を有し、IgG1アイソタイプの定常領域の抗体よりも優れた血漿中半減期を有する定常領域の配列の報告はない。
　なお、本発明の先行技術文献を以下に示す。
WO 92/19759 WO 96/11020 WO 96/12503 WO 2007/143168 WO 2007/114319 WO 2004/096273
Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nature Biotechnology 23, 1073 - 1078 (2005) Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr;59(3):389-96. Nishimoto N, Kishimoto T., Interleukin 6: from bench to bedside., Nat Clin Pract Rheumatol. 2006 Nov;2(11):619-26. Maini RN, Taylor PC, Szechinski J, Pavelka K, Broll J, Balint G, Emery P, Raemen F, Petersen J, Smolen J, Thomson D, Kishimoto T; CHARISMA Study Group., Double-blind randomized controlled clinical trial of the interleukin-6 receptor antagonist, Tocilizumab, in European patients with rheumatoid arthritis who had an incomplete response to methotrexate., Arthritis Rheum. 2006 Sep;54(9):2817-29 Nishimoto N, Kanakura Y, Aozasa K, Johkoh T, Nakamura M, Nakano S, Nakano N, Ikeda Y, Sasaki T, Nishioka K, Hara M, Taguchi H, Kimura Y, Kato Y, Asaoku H, Kumagai S, Kodama F, Nakahara H, Hagihara K, Yoshizaki K, Kishimoto T. Humanized anti-interleukin-6 receptor antibody treatment of multicentric Castleman disease. Blood. 2005 Oct 15;106(8):2627-32. Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review. Rothe A, Hosse RJ, Power BE. Ribosome display for improved biotherapeutic molecules. Expert Opin Biol Ther. 2006 Feb;6(2):177-87. Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71. Epub 2005 Jun 6. Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007, 368, 652-665 Shire SJ, Shahrokh Z, Liu J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. J Pharm Sci. 2004 Jun;93(6):1390-402. Salfeld JG. Isotype selection in antibody engineering.Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72. Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56 Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40 Hwang WY, Almagro JC, Buss TN, Tan P, Foote J. Use of human germline genes in a CDR homology-based approach to antibody humanization.Methods. 2005 May;36(1):35-42 Bartelds GM, Wijbrandts CA, Nurmohamed MT, Stapel S, Lems WF, Aarden L, Dijkmans BA, Tak P, Wolbink GJ. Clinical response to adalimumab: The relationship with anti-adalimumab antibodies and serum adalimumab concentrations in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2007 Mar 9; [Epub ahead of print] Bender NK, Heilig CE, Droll B, Wohlgemuth J, Armbruster FP, Heilig B. Immunogenicity, efficacy and adverse events of adalimumab in RA patients. Rheumatol Int. 2007 Jan;27(3):269-74. Van Walle I, Gansemans Y, Parren PW, Stas P, Lasters I. Immunogenicity screening in protein drug development.Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18. Jones TD, Phillips WJ, Smith BJ, Bamford CA, Nayee PD, Baglin TP, Gaston JS, Baker MP. Identification and removal of a promiscuous CD4+ T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J Thromb Haemost. 2005 May;3(5):991-1000. Chirino AJ, Ary ML, Marshall SA. Minimizing the immunogenicity of protein therapeutics. Drug Discov Today. 2004 Jan 15;9(2):82-90. Sato K, Tsuchiya M, Saldanha J, Koishihara Y, Ohsugi Y, Kishimoto T, Bendig MM. Reshaping a human antibody to inhibit the interleukin 6-dependent tumor cell growth. Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6. Strand V, Kimberly R, Isaacs JD. Biologic therapies in rheumatology: lessons learned future directions. Nat Rev Drug Discov. 2007 Jan;6(1):75-92. Gessner JE, Heiken H, Tamm A, Schmidt RE. The IgG Fc receptor family. Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48. Dillon TM, Ricci MS, Vezina C, Flynn GC, Liu YD, Rehder DS, Plant M, Henkle B, Li Y, Deechongkit S, Varnum B, Wypych J, Balland A, Bondarenko PV. Structural and functional characterization of disulfide isoforms of the human IgG2 subclass. J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15. Johnson KA, Paisley-Flango K, Tangarone BS, Porter TJ, Rouse JC. Cation exchange-HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain. Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.
　本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABの可変領域および定常領域のアミノ酸配列を改変することで、抗原中和能を増強させつつ、薬物動態を向上させることで投与頻度を少なくし持続的に治療効果を発揮し、且つ、免疫原性、安全性、物性（安定性および均一性）を改善させ、TOCILIZUMABより優れた第2世代の分子からなる医薬組成物（以下本明細書では「薬剤」あるいは「製剤」と記載する場合もある）、並びに、それらの医薬組成物の製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、第１世代のヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABの可変領域および定常領域のアミノ酸配列を改変することで、薬効を増強させつつ、薬物動態を向上させることで投与頻度を少なくし持続的に治療効果を発揮し、且つ、免疫原性、安全性、物性（安定性および均一性）を改善させ、TOCILIZUMABより優れた第2世代の分子の創製に向けて、鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、TOCILIZUMABの可変領域において、抗原への結合能（アフィニティー）を向上させるCDR変異を複数見出し、その組み合わせにより大幅にアフィニティーを向上させることに成功した。また本発明者らは、可変領域配列の等電点を低下させる改変を導入することで薬物動態を向上させることに成功した。また本発明者らは、抗原であるIL-6レセプターへの結合にpH依存性を付与することで１分子の抗体で複数回抗原を中和することを可能にし、薬物動態を向上させることに成功した。また本発明者らは、TOCILIZUMABのフレームワークに残存するマウス由来の配列を完全ヒト化し、可変領域においてin silicoで予測されたT-cellエピトープペプチドの数を低減させることで、免疫原性リスクを低減させることに成功した。さらに本発明者らは、TOCILIZUMABの定常領域において、安全性を高めるためにFcγレセプターへの結合をIgG1よりも低下させ、IgG1よりも薬物動態を改善させ、さらに安定性を低下させることなくIgG2のヒンジ領域のジスルフィド結合に由来するヘテロジェニティーおよびH鎖C末端に由来するヘテロジェニティーを低減させた新規な定常領域配列を見出すことに成功した。これらCDR領域アミノ酸配列の改変、可変領域アミノ酸配列の改変、定常領域アミノ酸配列の改変を適切に組み合わせることでTOCILIZUMABより優れた第2世代の分子の創製に成功した。
　本発明は、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABの可変領域および定常領域のアミノ酸配列の改変により、より優れた抗原（IL-6レセプター）への結合能を有し、より優れた薬物動態を有し、より優れた安全性・免疫原性リスク・物性（安定性、均一性）を有するヒト化抗IL-6レセプターIgG抗体からなる医薬組成物、並びに、それらの医薬組成物の製造方法に関する。より具体的には、下記〔１〕～〔１１〕を提供するものである。
〔１〕　以下の(a)～(f)いずれかに記載のポリペプチド；
(a)　配列番号：１（VH4-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：２（VH4-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：３（VH4-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド、
(b)　配列番号：４（VH3-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：５（VH3-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：６（VH3-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド、
(c)　配列番号：７（VH5-M83のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：８（VH5-M83のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：９（VH5-M83のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド、
(d)　配列番号：１０（VL1のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１１（VL1のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１２（VL1のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド、
(e)　配列番号：１３（VL3のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１４（VL3のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１５（VL3のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド、
(f)　配列番号：１６（VL5のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１７（VL5のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１８（VL5のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド。
〔２〕　以下の(a)～(c)いずれかに記載の抗体；
(a)　配列番号：１（VH4-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：２（VH4-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：３（VH4-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号：１０（VL1のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１１（VL1のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１２（VL1のCDR3）の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
(b)　配列番号：４（VH3-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：５（VH3-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：６（VH3-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号：１３（VL3のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１４（VL3のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１５（VL3のCDR3）の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
(c)　配列番号：７（VH5-M83のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：８（VH5-M83のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：９（VH5-M83のCDR3）の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号：１６（VL5のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１７（VL5のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１８（VL5のCDR3）の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
〔３〕　以下の(a)～(f)いずれかに記載の可変領域；
(a)　配列番号：１９（VH4-M73の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域、
(b)　配列番号：２０（VH3-M73の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域、
(c)　配列番号：２１（VH5-M83の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域、
(d)　配列番号：２２（VL1の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域、
(e)　配列番号：２３（VL3の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域、
(f)　配列番号：２４（VL5の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域。
〔４〕　以下の(a)～(c)いずれかに記載の抗体；
(a)　配列番号：１９（VH4-M73の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域および配列番号：２２（VL1の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(b)　配列番号：２０（VH3-M73の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域および配列番号：２３（VL3の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(c)　配列番号：２１（VH5-M83の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域および配列番号：２４（VL5の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
〔５〕　以下の(a)～(f)いずれかに記載の重鎖又は軽鎖；
(a)　配列番号：２５（VH4-M73）の配列を有する重鎖、
(b)　配列番号：２６（VH3-M73）の配列を有する重鎖、
(c)　配列番号：２７（VH5-M83）の配列を有する重鎖、
(d)　配列番号：２８（VL1）の配列を有する軽鎖、
(e)　配列番号：２９（VL3）の配列を有する軽鎖、
(f)　配列番号：３０（VL5）の配列を有する軽鎖。
〔６〕　以下の(a)～(c)いずれかに記載の抗体；
(a)　配列番号：２５（VH4-M73）の配列を有する重鎖および配列番号：２８（VL1）の配列を有する軽鎖を含む抗体、
(b)　配列番号：２６（VH3-M73）の配列を有する重鎖および配列番号：２９（VL3）の配列を有する軽鎖を含む抗体、
(c)　配列番号：２７（VH5-M83）の配列を有する重鎖および配列番号：３０（VL5）の配列を有する軽鎖を含む抗体。
〔７〕　〔１〕～〔６〕いずれかに記載のポリペプチドをコードする遺伝子。
〔８〕　〔７〕に記載の遺伝子を含むベクター。
〔９〕　〔８〕に記載のベクターを保持する宿主細胞。
〔１０〕　〔９〕の宿主細胞を培養することにより、〔１〕～〔６〕いずれかに記載のポリペプチドを製造する方法。
〔１１〕　〔１〕～〔６〕いずれかに記載のポリペプチド、または〔１０〕に記載の方法によって製造されるポリペプチドを含む医薬組成物。
　本発明によって得られたヒト化抗IL-6レセプターIgG抗体は、薬効が増強し、薬物動態が向上したことで投与頻度を少なくすることができ、持続的に治療効果を発揮することができる。
TOCILIZUMABのIL-6レセプターへの親和性を向上させる変異箇所をまとめたリストを示す図である。HCDR2のTOCILIZUMAB配列を配列番号：８１、HCDR2の変異後配列（上段）を配列番号：８２、HCDR2の変異後配列（下段）を配列番号：８３、HCDR3のTOCILIZUMAB配列を配列番号：８４、HCDR3の変異後配列（上段）を配列番号：８５、HCDR3の変異後配列（下段）を配列番号：８６、LCDR1のTOCILIZUMAB配列を配列番号：８７、LCDR1の変異後配列（上段）を配列番号：８８、LCDR1の変異後配列（下段）を配列番号：８９、LCDR3のTOCILIZUMAB配列を配列番号：９０、LCDR3の変異後配列（上段）を配列番号：９１、LCDR3の変異後配列（下段）を配列番号：９２に示す。 TOCILIZUMABとRDC-23のBaF/gp130における中和活性を示す図である。 TOCILIZUMABのIL-6レセプターへのIL-6レセプターへの結合を大きく低下させることなく可変領域の等電点を低下することできる変異箇所をまとめたリストを示す図である。図中の星印はヒト配列にするために等電点には影響しないが変異した箇所である。HFR1のTOCILIZUMAB配列を配列番号：９３、HFR1の変異後配列を配列番号：９４、HCDR1のTOCILIZUMAB配列を配列番号：９５、HCDR1の変異後配列を配列番号：９６、HFR2のTOCILIZUMAB配列を配列番号：９７、HFR2の変異後配列を配列番号：９８、HCDR2のTOCILIZUMAB配列を配列番号：８１、HCDR2の変異後配列を配列番号：９９、HFR4のTOCILIZUMAB配列を配列番号：１００、HFR4の変異後配列を配列番号：１０１、LFR1のTOCILIZUMAB配列を配列番号：１０２、LFR1の変異後配列を配列番号：１０３、LCDR1のTOCILIZUMAB配列を配列番号：８７、LCDR1の変異後配列を配列番号：１０４、LFR2のTOCILIZUMAB配列を配列番号：１０５、LFR2の変異後配列を配列番号：１０６、LCDR2のTOCILIZUMAB配列を配列番号：１０７、LCDR2の変異後配列を配列番号：１０８、１０９、LFR3のTOCILIZUMAB配列を配列番号：１１０、LFR3の変異後配列を配列番号：１１１、LFR4のTOCILIZUMAB配列を配列番号：１１２、LFR4の変異後配列を配列番号：１１３に示す。 TOCILIZUMABとH53/L28のBaF/gp130における中和活性を示す図である。 TOCILIZUMABとH53/L28をマウスに静脈内投与後の血漿中濃度推移を示したグラフである。 TOCILIZUMABとH53/L28をマウスに皮下投与後の血漿中濃度推移を示したグラフである。 IgG分子がエンドソーム内で膜型抗原から解離することで再度新たな抗原に結合することを示す模式図である。 TOCILIZUMABのIL-6レセプターへの結合にpH依存性（pH7.4で結合し、pH5.8で解離する）を付与することのできる変異箇所をまとめたリストを示す図である。HFR1のTOCILIZUMAB配列を配列番号：９３、HFR１の変異後配列を配列番号：１１４、HCDR1のTOCILIZUMAB配列を配列番号：９５、HCDR1の変異後配列を配列番号：１１５、LCDR1のTOCILIZUMAB配列を配列番号：８７、LCDR1の変異後配列を配列番号：１１６、LCDR2のTOCILIZUMAB配列を配列番号：１０７、LCDR2の変異後配列を配列番号：１１７に示す。 TOCILIZUMABとH3pI/L73のBaF/gp130における中和活性を示す図である。 TOCILIZUMABとH3pI/L73をカニクイザルに静脈内投与後の血漿中濃度推移を示したグラフである。 TOCILIZUMABとH3pI/L73をヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスに静脈内投与後の血漿中濃度推移を示したグラフである。 TOCILIZUMAB、TOCILIZUMABΔK、およびTOCILIZUMABΔGKを陽イオン交換クロマトグラフィーによりC末端に由来するヘテロジェニティーの評価を行った結果を示した図である。 TOCILIZUMAB-IgG1、TOCILIZUMAB-IgG2、およびTOCILIZUMAB-SKSCを陽イオン交換クロマトグラフィーによりジスルフィド結合に由来するヘテロジェニティーの評価を行った結果を示した図である。 TOCILIZUMAB-IgG1、TOCILIZUMAB-IgG2、およびTOCILIZUMAB-SKSCを示差走査型熱量測定（DSC）により測定した変性曲線および各FabドメインのTm値を示した図である。 TOCILIZUMAB-IgG1、TOCILIZUMAB-M44、TOCILIZUMAB-M58およびTOCILIZUMAB-M73をヒトFcRnトランスジェニックマウスに静脈内投与後の血漿中濃度推移を示したグラフである。 TOCILIZUMAB、コントロールおよびFv5-M83のBaF/gp130における中和活性を示す図である。 TOCILIZUMAB、Fv3-M73およびFv4-M73のBaF/gp130における中和活性を示す図である。 TOCILIZUMAB、コントロール、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83をカニクイザルに静脈内投与後の血漿中濃度推移を示したグラフである。 TOCILIZUMAB、コントロール、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83をカニクイザルに静脈内投与後のCRP濃度推移を示したグラフである。 TOCILIZUMAB、コントロール、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83をカニクイザルに静脈内投与後の非結合型可溶型IL-6レセプター率の推移を示したグラフである。 TOCILIZUMABとFv4-M73によるヒトRA患者由来滑膜細胞からのMCP-1産生抑制作用を示す図である。 TOCILIZUMABとFv4-M73によるヒトRA患者由来滑膜細胞からのVEGF産生抑制作用を示す図である。
　本発明は以下の(a)～(f)いずれかに記載のポリペプチドを提供する。
(a)　配列番号：１（VH4-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：２（VH4-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：３（VH4-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド、
(b)　配列番号：４（VH3-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：５（VH3-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：６（VH3-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド、
(c)　配列番号：７（VH5-M83のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：８（VH5-M83のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：９（VH5-M83のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド、
(d)　配列番号：１０（VL1のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１１（VL1のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１２（VL1のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド、
(e)　配列番号：１３（VL3のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１４（VL3のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１５（VL3のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド、
(f)　配列番号：１６（VL5のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１７（VL5のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１８（VL5のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド。
　本発明においてポリペプチドは特に限定されないが、ヒトIL-6レセプターへの結合活性を有する抗原結合物質であることが好ましい。抗原結合物質の好ましい例として、抗体の重鎖可変領域（VH）、抗体の軽鎖可変領域（VL）、抗体の重鎖、抗体の軽鎖、抗体などを挙げることができる。
　上述の(a)～(f)のポリペプチドにおいて、(a)～(c)のポリペプチドの好ましい例として抗体の重鎖可変領域を挙げることができ、(d)～(f)のポリペプチドの好ましい例として抗体の軽鎖可変領域を挙げることができる。
　これらの可変領域は抗ヒトIL-6レセプター抗体の一部として使用され得る。これらの可変領域が用いられた抗ヒトIL-6レセプター抗体は優れた結合活性、優れた薬物動態、優れた安全性・免疫原性、および／または優れた物性を有する。本発明において、優れた薬物動態、あるいは、薬物動態の向上とは、抗体を生体内に投与した際の血漿中濃度推移から算出される薬物動態パラメーターの一つである"クリアランス（Clearance、CL）"の減少、"濃度曲線下面積（Area Under Curve、AUC）"の増大、"平均滞留時間（Mean Residence Time）"の増大、"血漿中半減期（t1/2）"の増大、のいずれかを意味する。本発明において、優れた物性あるいは物性の向上とは、特に限定されないが、安定性の向上、ヘテロジェニティーの低減などを意味する。
　CDRと連結されるヒト抗体のフレームワーク領域(framework region；FR)は、CDRが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。本発明の可変領域に用いられるFRは特に限定されず、如何なるFRが用いられていてもよいが、ヒト由来のFRが用いられることが好ましい。ヒト由来のFRは天然配列を有するFRが用いられてもよいし、必要に応じ、CDRが適切な抗原結合部位を形成するように、天然配列を有するフレームワーク領域の１又は複数のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。たとえば、アミノ酸を置換したFRを用いた抗体の抗原への結合活性を測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato, K. et al., Cancer Res.（1993）53, 851-856）。
　又、上述のCDR配列において１又は複数のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入後のCDR配列は、結合活性、中和活性、安定性、免疫原性および／または薬物動態において改変前のCDR配列と同等の活性を有していることが好ましい。置換、欠失、付加および／または挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１つのCDRにつき３アミノ酸以内、さらに好ましくは２アミノ酸以内、より好ましくは１アミノ酸である。
　１又は複数のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492）が挙げられる。該方法を用いて、抗体の所望のアミノ酸を目的の他のアミノ酸に置換することができる。又、フレームワークシャッフリング（Mol Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-60）およびCDR repair（US2006/0122377）等のライブラリー技術を用いることにより、フレームワークおよびCDRにおけるアミノ酸を適切な他のアミノ酸置換することも可能である。
　さらに、本発明は以下の(a)～(c)いずれかに記載の抗体を提供する。
(a)　配列番号：１（VH4-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：２（VH4-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：３（VH4-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：１０（VL1のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１１（VL1のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１２（VL1のCDR3）の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
(b)　配列番号：４（VH3-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：５（VH3-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：６（VH3-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：１３（VL3のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１４（VL3のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１５（VL3のCDR3）の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
(c)　配列番号：７（VH5-M83のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：８（VH5-M83のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：９（VH5-M83のCDR3）の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：１６（VL5のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１７（VL5のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１８（VL5のCDR3）の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
　上述の抗体は優れた結合活性、優れた薬物動態、優れた安全性・免疫原性、および／または優れた物性を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体として使用され得る。
　本発明のCDRと連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、CDRが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。本発明の可変領域に用いられるFRは特に限定されず、如何なるFRが用いられていてもよいが、ヒト由来のFRが用いられることが好ましい。ヒト由来のFRは天然配列を有するFRが用いられてもよいし、必要に応じ、CDRが適切な抗原結合部位を形成するように、天然配列を有するフレームワーク領域の１又は複数のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。たとえば、アミノ酸を置換したFRを用いた抗体の抗原への結合活性を測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato, K. et al., Cancer Res.（1993）53, 851-856）。
　又、本発明の抗体で用いられる定常領域は特に限定されず、如何なる定常領域が用いられてもよい。本発明の抗体で用いられる定常領域の好ましい例としては、ヒト由来の定常領域（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、Cκ、Cλ由来の定常領域など）を挙げることができる。ヒト由来の定常領域は１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されていてもよい。例えば、ヒト由来の定常領域の好ましい例として、重鎖定常領域の場合には配列番号：３１（VH4-M73の定常領域）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：３２（VH3-M73の定常領域）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：３３（VH5-M83の定常領域）のアミノ酸配列を有する定常領域を挙げることができ、軽鎖定常領域の場合には配列番号：３４（VL1）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：３５（VL3）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：３６（VL5）のアミノ酸配列を有する定常領域を挙げることができる。
　又、上述のCDR配列において１又は複数のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入後のCDR配列は、結合活性、中和活性、安定性、免疫原性および／または薬物動態において改変前のCDR配列と同等の活性を有していることが好ましい。置換、欠失、付加および／または挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１つのCDRにつき３アミノ酸以内、さらに好ましくは２アミノ酸以内、より好ましくは１アミノ酸である。
　アミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入などは上述の方法により行うことも可能である。
　さらに本発明は以下の(a)～(f)いずれかに記載の可変領域を提供する。
(a)　配列番号：１９（VH4-M73の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域、
(b)　配列番号：２０（VH3-M73の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域、
(c)　配列番号：２１（VH5-M83の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域、
(d)　配列番号：２２（VL1の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域、
(e)　配列番号：２３（VL3の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域、
(f)　配列番号：２４（VL5の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域。
　上述の可変領域は抗ヒトIL-6レセプター抗体の一部として使用され得る。これらの可変領域が用いられた抗ヒトIL-6レセプター抗体は優れた結合活性、優れた薬物動態、優れた安全性・免疫原性、および／または優れた物性を有する。
　上述の可変領域は１又は複数（例えば５アミノ酸以内、好ましくは３アミノ酸以内）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入していてもよい。１又は複数のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法としては、例えば、上述の方法を挙げることができる。
　また本発明は、上述の可変領域を含むポリペプチドを提供する。
　さらに本発明は以下の(a)～(c)いずれかに記載の抗体を提供する。
(a)　配列番号：１９（VH4-M73の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域および配列番号：２２（VL1の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(b)　配列番号：２０（VH3-M73の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域および配列番号：２３（VL3の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(c)　配列番号：２１（VH5-M83の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域および配列番号：２４（VL5の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
　上述の可変領域は抗ヒトIL-6レセプター抗体の一部として使用され得る。これらの可変領域が用いられた抗ヒトIL-6レセプター抗体は優れた結合活性、優れた薬物動態、優れた安全性・免疫原性、および／または優れた物性を有する。
　上述の可変領域は１又は複数（例えば５アミノ酸以内、好ましくは３アミノ酸以内）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入していてもよい。１又は複数のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法としては、例えば、上述の方法を挙げることができる。
　又、本発明の抗体で用いられる定常領域は特に限定されず、如何なる定常領域が用いられてもよい。本発明の抗体で用いられる定常領域の好ましい例としては、ヒト由来の定常領域（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、κ鎖、λ鎖由来の定常領域など）を挙げることができる。ヒト由来の定常領域は１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されていてもよい。例えば、ヒト由来の定常領域の好ましい例として、重鎖定常領域の場合には配列番号：３１（VH4-M73の定常領域）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：３２（VH3-M73の定常領域）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：３３（VH5-M83の定常領域）のアミノ酸配列を有する定常領域を挙げることができ、軽鎖定常領域の場合には配列番号：３４（VL1）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：３５（VL3）のアミノ酸配列を有する定常領域、配列番号：３６（VL5）のアミノ酸配列を有する定常領域を挙げることができる。
　さらに本発明は以下の(a)～(f)いずれかに記載の重鎖又は軽鎖を提供する。
(a)　配列番号：２５（VH4-M73）の配列を有する重鎖、
(b)　配列番号：２６（VH3-M73）の配列を有する重鎖、
(c)　配列番号：２７（VH5-M83）の配列を有する重鎖、
(d)　配列番号：２８（VL1）の配列を有する軽鎖、
(e)　配列番号：２９（VL3）の配列を有する軽鎖、
(f)　配列番号：３０（VL5）の配列を有する軽鎖。
　上述の重鎖又は軽鎖は抗ヒトIL-6レセプター抗体の一部として使用され得る。これらの重鎖又は軽鎖が用いられた抗ヒトIL-6レセプター抗体は、優れた結合活性、優れた薬物動態、優れた安全性・免疫原性、および／または優れた物性を有する。
　上述の重鎖又は軽鎖は、１又は複数（例えば１０アミノ酸以内、好ましくは５アミノ酸以内、さらに好ましくは３アミノ酸以内）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入していてもよい。１又は複数のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法としては、例えば、上述の方法を用いることが可能である。
　１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入は可変領域において行われてもよいし、定常領域において行われてもよいし、又は可変領域と定常領域の両方において行われてもよい。
　さらに本発明は以下の(a)～(c)いずれかに記載の抗体を提供する。
(a)　配列番号：２５（VH4-M73）の配列を有する重鎖および配列番号：２８（VL1）の配列を有する軽鎖を含む抗体、
(b)　配列番号：２６（VH3-M73）の配列を有する重鎖および配列番号：２９（VL3）の配列を有する軽鎖を含む抗体、
(c)　配列番号：２７（VH5-M83）の配列を有する重鎖および配列番号：３０（VL5）の配列を有する軽鎖を含む抗体。
　上述の抗体は優れた結合活性、優れた薬物動態、優れた安全性・免疫原性、および／または優れた物性を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体である。
　上述の抗体は、１又は複数（例えば２０アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、さらに好ましくは５アミノ酸以内）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入していてもよい。１又は複数のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法としては、例えば、上述の方法をあげることができる。
　１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入は可変領域において行われてもよいし、定常領域において行われてもよいし、又は可変領域と定常領域の両方において行われてもよい。
　本発明の抗体は、ヒト化（humanized）抗体であることが好ましい。
　ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物由来のCDRをヒト抗体のCDRへ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576 号公報参照）。
　具体的には、例えば目的のCDRと目的のフレームワーク領域（FR）とを連結するように設計したDNA配列を、CDRおよびFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する（WO98/13388号公報に記載の方法を参照）。得られたDNAをヒト抗体定常領域もしくはヒト抗体定常領域改変体をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 96/02576参照）。
　CDRと連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、CDRが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。
　ヒト化抗体の定常領域には、ヒト抗体定常領域又はヒト抗体定常領域において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入したヒト抗体定常領域改変体を用いることができる。
　例えばH鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cεを、L鎖ではCκ、Cλを使用することができる。Cκのアミノ酸配列を配列番号：３８に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号：３７に示す。Cγ1のアミノ酸配列を配列番号：４０に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号：３９に示す。Cγ2のアミノ酸配列を配列番号：４２に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号：４１に示す。Cγ4のアミノ酸配列を配列番号：４４に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号：４３に示す。
　また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。ヒト化の際に用いられるヒト抗体は、IgG、IgM、IgA、IgE、IgDなど如何なるアイソタイプのヒト抗体でもよいが、本発明においてはIgGを用いることが好ましい。IgGとしては、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などを用いることが可能である。
　なお、ヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、CDR、FR）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換、欠失、付加および／または挿入等してもよく、本発明のヒト化抗体には、そのようなアミノ酸置換等されたヒト化抗体も含まれる。
　本発明の抗体には、IL-6レセプターへの結合活性および／または中和活性を有する限り、IgGに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限らず、IL-6レセプタータンパク質に結合する限り、低分子化抗体またはその修飾物であってもよい。
　低分子化抗体は、全長抗体（whole antibody、例えばwhole IgG等）の一部分が欠損している抗体断片を含む抗体であり、IL-6レセプターへの結合活性および／または中和活性を有する限り特に限定されない。本発明において低分子化抗体は、全長抗体の一部分を含む限り特に限定されないが、VH又はVLを含んでいることが好ましく、特に好ましくはVHとVLの両方を含む低分子化抗体である。又、本発明の低分子化抗体の他の好ましい例として、抗体のCDRを含む低分子化抗体を挙げることができる。低分子化抗体に含まれるCDRは抗体の６つのCDR全てが含まれいてもよいし、一部のCDRが含まれていてもよい。
　本発明における低分子化抗体は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好ましいが、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなどの多量体を形成すること等もあり、全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
　抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single chain Fv）、Diabody、sc(Fv)2（single chain (Fv)2）などを挙げることができる。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。
　抗体断片は、例えば、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Pluckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。
　消化酵素は、抗体断片の特定の位置を切断し、次のような特定の構造の抗体断片を与える。このような酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる。
　上述の消化酵素を用いた場合に得られる抗体断片は以下のとおりである。
　パパイン消化：F(ab)2またはFab
　ペプシン消化：F(ab')2またはFab'
　プラスミン消化：Facb
　本発明における低分子化抗体は、IL-6レセプターへの結合活性および／または中和活性を有する限り、任意の領域を欠失した抗体断片を含むことができる。
　ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価（bivalent）の抗体断片を指す（Holliger P et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等）。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中でVL及びVHがリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおけるリンカーは、一般に、VLとVHが互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有することとなる。
　scFv抗体は、VH及びVLをリンカー等で結合して一本鎖ポリペプチドにした抗体である(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883、 Pluckthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol.113, Resenburg 及び Moore編, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994))。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に記載されたいずれの抗体由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から２５残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。具体的には、たとえば後述のペプチドリンカー等を用いることができる。
　両鎖のV領域は、例えば上記のようなPCR法によって連結することができる。PCR法によるV領域の連結のために、まず次のDNAのうち、全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される。
抗体のH鎖またはH鎖Ｖ領域をコードするDNA配列、および
抗体のL鎖またはL鎖Ｖ領域をコードするDNA配列
　増幅すべきDNAの両端の配列に対応する配列を有するプライマーの一対を用いたPCR法によって、H鎖とL鎖のV領域をコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAを用意する。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの5'側に、別に合成された各V領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［H鎖V領域DNA］－［ペプチドリンカーDNA］－［L鎖V領域DNA］の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCR反応を行う。
　アセンブリーPCR用のプライマーは、［H鎖V領域DNA］の5'側にアニールするプライマーと、［L鎖V領域DNA］の3'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーPCR用プライマーとは、合成すべきscFvの全長配列をコードするDNAを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーDNA］には各V領域DNAと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該scFvをコードするDNAを発現させることにより、該scFvが取得できる。
　結合されるVHとVLの順序は特に限定されず、どのような順序で並べられていてもよく、例えば、以下のような配置を挙げることができる。
［VH］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VH］
　sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson et al、J Immunol. Methods 1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。
　また２つのVH及び２つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましいが、2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］
　低分子抗体中のVH又はVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。さらに、VHとVLを会合させた場合に、抗原結合活性を有する限り、一部を欠損させてもよいし、他のポリペプチドを付加してもよい。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。
　本発明において、抗体の可変領域を結合するリンカーは、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー、例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996に開示されるリンカーを用いることができる。
　本発明において好ましいリンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、1～100アミノ酸、好ましくは3～50アミノ酸、更に好ましくは5～30アミノ酸、特に好ましくは12～18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。
　ペプチドリンカーのアミノ酸配列としては、例えば、以下のような配列を挙げることができる。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：４５）
Ser・Gly・Gly・Gly（配列番号：４６）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：４７）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：４８）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：４９）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：５０）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：５１）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：５２）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：４７）)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：４８）)n
　［nは1以上の整数である］等を挙げることができる。
　ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。たとえば上記のペプチドリンカーの長さを決定するnは、通常１～５、好ましくは１～３、より好ましくは１または２である。
　合成化合物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ－DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ－BSOCOES）などであり、これらの架橋剤は市販されている。
　4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。複数のリンカーは、同じでもよいし、異なるリンカーを用いることもできる。
　本発明の抗体には、本発明の抗体のアミノ酸配列に１又は複数個のアミノ酸残基が付加された抗体も含まれる。また、これら抗体と他のペプチド又はタンパク質とが融合した融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein Cの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、GST（グルタチオン－S－トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β－ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
　また本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）やヒアルロン酸などの高分子物質、放射性物質、蛍光物質、発光物質、酵素、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている（例えば、US5057313、US5156840）。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
　また本発明の抗体には、糖鎖が改変された抗体も包含される。
　さらに、本発明で使用される抗体は二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体を言う。本発明において、二重特異性抗体はIL-6レセプター分子上の異なるエピトープを認識する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がIL-6レセプターを認識し、他方の抗原結合部位が他の物質を認識する二重特異性抗体とすることもできる。IL-6レセプターを認識する本発明の抗体からなる二重特異性抗体の他方の抗原結合部位が結合する抗原としては、例えば、IL-6, TNFα, TNFR1, TNFR2, CD80, CD86, CD28, CD20, CD19, IL-1α, IL-β, IL-1R, RANKL, RANK, IL-17, IL-17R, IL-23, IL-23R, IL-15, IL-15R, BlyS, lymphotoxinα, lymphotoxinβ, LIGHT ligand, LIGHT, VLA-4, CD25, IL-12, IL-12R, CD40, CD40L, BAFF, CD52, CD22, IL-32, IL-21, IL-21R, GM-CSF, GM-CSFR, M-CSF, M-CSFR, IFN-alpha, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, CCR5, APRIL, APRILRなどが挙げられる。
　二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがH鎖とL鎖を有する１／２分子であっても良いし、H鎖のみからなる１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。
　本発明の抗体は、後述する抗体を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、本発明の抗体と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明の抗体はこのような抗体も包含する。
　本発明の抗IL-6レセプター抗体などのポリペプチドは当業者に公知の方法により製造することが可能である。
　例えば、得られた抗IL-6レセプター抗体の配列を基に、当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて抗IL-6レセプター抗体を作製することが可能である。具体的には、IL-6レセプターを認識する抗体の配列を基に抗体をコードするポリヌクレオチドを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。
　従って、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されたベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含む、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドをコードする遺伝子によりコードされるポリペプチドを製造する方法を提供する。
　より具体的には、以下の工程を含む本発明のポリペプチドの製造方法を提供する。
(a)本発明のポリペプチドをコードする遺伝子が導入されたベクターを含む宿主細胞を培養する工程、
(b)当該遺伝子によりコードされるポリペプチドを取得する工程。
　ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。本発明の抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア製）、「QIAexpress system」（キアゲン製）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
　また、発現プラスミドのベクターには、抗体分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
　大腸菌以外にも、例えば、本発明の抗体を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（インビトロゲン社製）や、pEF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
　CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、発現プラスミドのベクターが細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
　さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pSV2-dhfr（「Molecular Cloning 2nd edition」 Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)）など）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
　これにより得られた本発明の抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。
　クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose FF（GE Amersham Biosciences）等が挙げられる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された抗体も包含する。
　得られた抗体のIL-6レセプターに対する結合活性の測定は、当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、抗原をコーティングしたプレートに、抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、p-ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
医薬組成物
　また本発明は、上述のポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物はIL-6が関連する関節リウマチなどの疾患に用いることが可能である。即ち本発明は、上述の抗体を有効成分とする関節リウマチなどの疾患の治療剤も提供する。本発明の対象となる疾患の好ましい例として、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、全身型若年性特発性関節炎、キャッスルマン病、全身性エリテマトーデス（SLE）、ループス腎炎、クローン病、lymphoma、潰瘍性大腸炎、貧血、血管炎、川崎病、Still病、アミロイドーシス、多発性硬化症、移植、加齢黄斑変性症、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、IgA 腎症、変形性関節症、喘息、糖尿病性腎症、GVHD、子宮内膜症、肝炎(NASH)、心筋梗塞、動脈硬化、セプシス、骨粗しょう症、糖尿病、多発性骨髄腫、前立腺癌、腎癌、B-cell non-Hodgkin's、膵癌、肺癌、食道癌、大腸癌、癌カケクシア、癌神経浸潤、心筋梗塞、近視性脈絡膜血管新生、特発性脈絡膜血管新生、ぶどう膜炎、慢性甲状腺炎、遅延性過敏症、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、中皮腫、多発性筋炎、皮膚筋炎、汎ぶどう膜炎、前部ぶどう膜炎、中間部ぶどう膜炎、強膜炎、角膜炎、眼窩炎症、視神経炎、糖尿病網膜症、増殖硝子体網膜症、ドライアイ、術後炎症等が挙げられるが、これらに限定されることはない。
　抗IL-6レセプター抗体を「有効成分として含有する」とは、抗IL-6レセプター抗体を活性成分の少なくとも１つとして含むという意味であり、その含有率を制限するものではない。また、本発明の医薬組成物は、上述のポリペプチドと合わせて他の有効成分を含有してもよい。
　なお、本発明の医薬組成物は治療目的だけでなく、予防目的で用いられてもよい。
　本発明のポリペプチドは、常法に従って製剤化することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）。さらに、必要に応じ、医薬的に許容される担体及び/または添加物を供に含んでもよい。例えば、界面活性剤（PEG、Tween等）、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、キレート剤（EDTA等）、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含むことができる。しかしながら、本発明の炎症性疾患の予防または治療剤は、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜含んでいてもよい。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン及び免疫グロブリン等の蛋白質、並びに、アミノ酸を含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、抗IL-6レセプター抗体を、例えば、生理食塩水、ブドウ糖またはその他の補助薬を含む等張液に溶解する。補助薬としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、さらに、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、PEG等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80、HCO-50）等と併用してもよい。
　また、必要に応じポリペプチドをマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等)とすることもできる（Remington's Pharmaceutical Science 16th edition &, Oslo Ed. (1980)等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、ポリペプチドに適用し得る（Langer et al., J.Biomed.Mater.Res.(1981) 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982)12: 98-105;米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers(1983)22:547-56;EP第133,988号）。さらに、本剤にヒアルロニダーゼを添加あるいは混合することで皮下に投与する液量を増加させることも可能である（例えば、WO2004/078140等）。
　本発明の医薬組成物は、経口または非経口のいずれでも投与可能であるが、好ましくは非経口投与される。具体的には、注射及び経皮投与により患者に投与される。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射または皮下注射等により全身又は局所的に投与することができる。治療部位またはその周辺に局所注入、特に筋肉内注射してもよい。経皮投与剤型の例としては、例えば、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、および貼付剤等があげられ、全身又は局所的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、1回につき体重1 kgあたり活性成分が0.0001 mg～100 mgの範囲で選ぶことが可能である。または、例えば、ヒト患者に投与する場合、患者あたり活性成分が0.001～1000 mg/kg・body・weightの範囲を選ぶことができ、1回当たり投与量としては、例えば、本発明の抗体が0.01～50mg/kg・body・weight程度の量が含まれることが好ましい。しかしながら、本発明の医薬組成物は、これらの投与量に制限されるものではない。
　なお、本発明で記載されているアミノ酸配列に含まれるアミノ酸は翻訳後に修飾（例えば、N末端のグルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾は当業者によく知られた修飾である）を受ける場合もあるが、そのようにアミノ酸が翻訳後修飾された場合であっても当然のことながら本発明で記載されているアミノ酸配列に含まれる。
　また結合する糖鎖の構造は如何なる構造でもよい。EUナンバリングの297番目の糖鎖は如何なる糖鎖構造であってもよく（好ましくはフコシル化された糖鎖）、また糖鎖が結合していなくてもよい（例えば大腸菌で生産する、あるいはEUナンバリングの297番目に糖鎖が結合しないように改変することで可能）。
　なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕TOCILIZUMABのIL-6レセプターへの親和性を向上する可変領域変異箇所の同定
　TOCILIZUMAB（H鎖 WT-IgG1／配列番号：５３、L鎖 WT-kappa／配列番号：５４）のIL-6レセプターへの親和性を向上させるために、CDR配列に変異を導入したライブラリーを作製し検討した。CDRに変異を導入したライブラリーをスクリーニングした結果、IL-6レセプターへの親和性を向上する変異を見出し、それらを図１にまとめた。これらの変異を組み合わせた高親和性TOCILIZUMABの例として、RDC-23（H鎖RDC23H-IgG1／配列番号：５５、L鎖 RDC-23L-kappa／配列番号：５６）が挙げられる。RDC-23の可溶型IL-6レセプターへのアフィニティーおよびBaF/gp130による生物活性をTOCILIZUMABと比較した（方法は参考例参照）。
　アフィニティーを測定した結果を表１に示した。BaF/gp130による生物活性（IL-6終濃度 30 ng/mL）を測定した結果を図２に示した。RDC-23は、TOCILIZUMABと比較して約60倍アフィニティーが向上しており、BaF/gp130の100％阻害濃度として約100倍活性が向上していることが見出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
〔実施例２〕TOCILIZUMABの等電点低下による薬物動態を向上する改変の同定
　TOCILIZUMABの薬物動態を向上させるために、IL-6レセプターへの結合を大きく低下させることなく可変領域の等電点を低下することができる変異箇所の検討を行った。TOCILIZUMABの立体構造モデルから推察された可変領域変異箇所をスクリーニングした結果、IL-6レセプターへの結合を大きく低下させることなく可変領域の等電点を低下することできる変異箇所を見出し、それらを図３にまとめた。これらの変異を組み合わせた等電点低下TOCILIZUMABの例として、H53/L28（H鎖 H53-IgG1／配列番号：５７、L鎖 L28-kappa／配列番号：５８）が挙げられる。H53/L28の可溶型IL-6レセプターへのアフィニティー、BaF/gp130による生物活性、等電点、および、マウスにおける薬物動態をTOCILIZUMABと比較した（方法は参考例参照）。
　アフィニティーを測定した結果を表２に示した。BaF/gp130による生物活性（IL-6終濃度 30 ng/mL）を測定した結果を図４に示した。H53/L28は、TOCILIZUMABと比較して約6倍アフィニティーが向上しており、BaF/gp130の100％阻害濃度として数倍程度活性が向上していることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　当業者公知の等電点電気泳動により等電点を測定した結果、TOCILIZUMABの等電点は約9.3であり、H53/L28の等電点は約6.5～6.7であり、H53/L28はTOCILIZUMABと比較して等電点が約2.7低下した。また、可変領域VH/VLの理論等電点をGENETYX(GENETYX CORPORATION)により計算したところ、TOCILIZUMABの理論等電点は9.20であり、H53/L28の理論等電点は4.52であり、H53/L28はTOCILIZUMABと比較して等電点が約4.7低下した。
　等電点を低下させた改変抗体H53/L28の薬物動態を評価するために、TOCILIZUMABとH53/L28の正常マウスにおける薬物動態の比較を行った。TOCILIZUMABおよびH53/L28をマウス（C57BL/6J、日本チャールズリバー）に1 mg/kgで静脈内（IV）および皮下（SC）に単回投与し血漿中濃度推移を評価した。TOCILIZUMABおよびH53/L28の静脈内投与後の血漿中濃度推移を図５に、皮下投与後の血漿中濃度推移を図６に示し、WinNonlin（Pharsight社製）により得られた薬物動態学的パラメーター（クリアランス（CL）、半減期(T1/2)）を表３に示した。H53/L28の静脈内投与後の血漿中半減期(T1/2)はTOCILIZUMABの約1.3倍に延長し、クリアランスが約1.7倍低下した。H53/L28の皮下投与後のT1/2はTOCILIZUMABの約2倍に延長し、クリアランスが約2.1倍低下した。このようにアミノ酸置換によりTOCILIZUMABの等電点を低下させることによって薬物動態を大幅に向上させることが可能であることが見出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
〔実施例３〕TOCILIZUMABの免疫原性を低下する変異箇所の同定
可変領域に存在するT-cellエピトープによる免疫原性リスクを低減する変異箇所の同定
　TOCILIZUMABの可変領域配列に存在するT-cellエピトープをTEPITOPE（Methods. 2004 Dec;34(4):468-75）を用いて解析を行った。その結果、L鎖CDR2に多くのHLAに結合するT-cellエピトープが存在する（免疫原性リスクが高い配列が存在する）ことが予測された。そこで、TEPITOPE解析においてL鎖CDR2の免疫原性リスクを低減させつつ、安定性、結合活性、中和活性を低下させないアミノ酸置換を検討した。
　スクリーニングの結果、以下のようにTOCILIZUMABのL鎖CDR2（配列番号：５９）のL51（Kabatナンバリング、Kabat EA et al． 1991． Sequences of Proteins of Immunological Interest．NIH）のスレオニンをグリシンに、L53のアルギニンをグルタミン酸に置換する（配列番号：６０）ことで、安定性、結合活性、中和活性を低下させずに免疫原性リスクを低減できることを見出した。
　TOCILIZUMAB L鎖CDR2（配列番号：５９）
　T-cellエピトープ除去TOCILIZUMAB L鎖CDR2（配列番号：６０）
〔実施例４〕TOCILIZUMABの可変領域フレームワーク配列の完全ヒト化による免疫原性リスクの低減
　TOCILIZUMABの可変領域配列において、H鎖FR1のH27, H28, H29, H30およびH鎖FR3のH71（Kabatナンバリング、Kabat EA et al． 1991． Sequences of Proteins of Immunological Interest．NIH）は、ヒト化の過程において結合活性を維持するためにフレームワーク配列でマウス配列が残存している（Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6）。残存するマウス配列は免疫原性リスクを高める原因となりうるため、TOCILIZUMABの免疫原性リスクをより低下するためにフレームワーク配列を完全ヒト化する検討を行った。
　その結果、TOCILIZUMABのH鎖FR1（配列番号：６１）を以下のヒト化 H鎖FR1-A（配列番号：６２）に置換することで、また、TOCILIZUMABのH鎖FR3（配列番号：６３）を以下のヒト化 H鎖FR3（配列番号：６４）に置換することで、安定性、結合活性、中和活性を低下させずにTOCILIZUMABの全フレームワークを完全ヒト化できることを見出した。
　TOCILIZUMAB H鎖FR1（配列番号：６１）
　ヒト化 H鎖FR1-A（配列番号：６２）（Germline IMGT hVH_4_由来）
　TOCILIZUMAB H鎖FR3（配列番号：６３）
　ヒト化 H鎖FR3（配列番号：６４）（Mol. Immunol. 2007, 44(4):412-422由来）
〔実施例５〕TOCILIZUMABのIL-6レセプターへのpH依存的結合による薬物動態向上のための変異箇所の同定
　TOCILIZUMABの薬物動態を向上させる方法の一つとして、１分子のTOCILIZUMABが複数個のIL-6レセプターを繰り返し結合・中和させるように分子を改良する方法が考えられた。TOCILIZUMABは膜型IL-6レセプターに結合後、膜型IL-6レセプターに結合したままインターナライゼーションによって細胞内のエンドソームに取り込まれ、その後、TOCILIZUMABは膜型IL-6レセプターに結合したままライソソームへ移行し共にライソソームにより分解されると考えられている。すなわち、通常、１分子のTOCILIZUMABは１分子ないしは２分子の膜型IL-6レセプターに（１価ないしは２価で）結合し、インターナライズ後、ライソソームで分解されると考えられるため、１分子のTOCILIZUMABは１分子ないしは２分子の膜型IL-6レセプターしか結合・中和できない。
　そこで、TOCILIZUMABの中性条件下での結合を維持しつつ酸性条件下での結合のみを大きく低下させるpH依存的結合TOCILIZUMABを作製することが出来れば、図７に示すとおり、pH依存的結合TOCILIZUMABはエンドソーム内で抗原である膜型IL-6レセプターから解離し、エンドソーム内に存在するFcRnに結合することによって血漿中に戻ることができ、血漿中に戻ったpH依存的結合TOCILIZUMABは再度膜型IL-6レセプターに結合することが可能であると考えた。この血漿中での結合とエンドソーム内での解離を繰り返すことで、１分子のTOCILIZUMABが複数分子のIL-6レセプターを繰り返し結合・中和できると考えられ、これによりTOCILIZUMABと比較してpH依存的結合TOCILIZUMABは薬物動態が向上すると考えた。
　エンドソーム内の酸性条件下においてTOCILIZUMABがIL-6レセプターから解離するためには、酸性条件下における結合が中性条件下と比較して大幅に弱くなる必要がある。細胞表面ではIL-6レセプターに強く結合して中和する必要があるため、細胞表面のpHであるpH7.4においてはTOCILIZUMABと同等以上にIL-6レセプターに結合する必要がある。エンドソーム内のpHは一般的にpH5.5～pH6.0であることが報告されている（Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Feb;5(2):121-32.）ことから、pH5.5～pH6.0においてIL-6レセプターに弱く結合するように改良されたpH依存的結合TOCILIZUMABであれば、エンドソーム内の酸性条件下においてIL-6レセプターから解離すると考えられる。すなわち、細胞表面のpHであるpH7.4においてはIL-6レセプターに強く結合し、エンドソーム内のpHであるpH5.5～pH6.0においてIL-6レセプターに弱く結合するように改良されたpH依存的結合TOCILIZUMABであれば、１分子で複数個のIL-6レセプターに結合・中和し、薬物動態を向上することが可能であると考えられた。
　TOCILIZUMABのIL-6レセプターへの結合にpH依存性を付与するには、pKaが6.0～6.5付近に存在し、中性条件下（pH7.4）と酸性条件下（pH5.5～pH6.0）との間でプロトンの解離状態が変化するヒスチジン残基をTOCILIZUMABの可変領域に導入する方法が考えられた。そこで、TOCILIZUMABの立体構造モデルから推察された可変領域のヒスチジン導入箇所のスクリーニングを実施した。また、TOCILIZUMABの選択された可変領域配列がヒスチジンにランダムに置き換わるように設計されたライブラリーを作製しスクリーニングを実施した。スクリーニングは、pH7.4においてIL-6レセプターに結合し、pH5.5ないしはpH5.8でIL-6レセプターから解離する、あるいは、アフィニティーが低下することを指標に実施した。
　その結果、TOCILIZUMABのIL-6レセプターへの結合にpH依存性（pH7.4で結合し、pH5.8で解離する性質）を付与することができる変異箇所を見出し、それらを図８にまとめた。図８のH27のチロシンからヒスチジンへの置換はCDRではなくH鎖のFR1の変異であるが、H27がヒスチジンの配列はEur. J. Immunol. 1992. 22: 1719-1728に記されているとおり、ヒト配列（配列番号：６５）として存在するため、以下のフレームワークを用いることで実施例４と合わせて完全ヒト化することが可能である。
　ヒト化H鎖FR1-B（配列番号：６５）
　これらの変異を組み合わせたpH依存的結合TOCILIZUMABの例として、H3pI/L73（H鎖 H3pI-IgG1／配列番号：６６、L鎖 L73-kappa／配列番号：６７）が挙げられる。H3pI/L73のpH7.4における可溶型IL-6レセプターへのアフィニティー、pH7.4とpH5.8における膜型IL-6レセプターからの解離速度、BaF/gp130による生物活性、および、カニクイザルおよびヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスにおける薬物動態をTOCILIZUMABと比較した（方法は参考例参照）。
　pH7.4における可溶型IL-6レセプターへのアフィニティーを測定した結果を表４に示した。BaF/gp130による生物活性（IL-6終濃度30 ng/mL）を測定した結果を図９に示した。H3pI/L73は、TOCILIZUMABと比較してほぼ同等のpH7.4における可溶型IL-6レセプターへのアフィニティーおよびBaF/gp130の活性を有していることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　TOCILIZUMABおよびH3pI/L73のpH7.4とpH5.8における膜型IL-6レセプターへ解離速度を測定した結果を表５に示した。H3pI/L73は、pH5.8における解離速度が速くなり、TOCILIZUMABと比較して膜型IL-6レセプターからの解離速度のpH依存性が約2.6倍向上していることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　TOCILIZUMABおよびH3pI/L73をカニクイザルに1 mg/kgで静脈内に単回投与し血漿中濃度推移を評価した。TOCILIZUMABおよびH3pI/L73の静脈内投与後の血漿中濃度推移を図１０に示した。その結果、H3pI/L73はTOCILIZUMABと比較してカニクイザルにおいて大幅に薬物動態が改善した。
　TOCILIZUMABおよびH3pI/L73をヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウス（hIL-6R tgマウス、Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 May 23;92(11):4862-6）に25 mg/kgで静脈内に単回投与し血漿中濃度推移を評価した。TOCILIZUMABおよびH3pI/L73の静脈内投与後の血漿中濃度推移を図１１に示した。その結果、H3pI/L73はTOCILIZUMABと比較してヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスにおいて大幅に薬物動態が改善した。
　pH依存的結合TOCILIZUMABであるH3pI/L73は、カニクイザルおよびヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスにおいてTOCILIZUMABと比較して薬物動態が大幅に改善したことから、pH7.4で抗原に結合し、pH5.8で抗原から解離する性質を付与することにより、１分子で複数のIL-6レセプターに結合・中和することが可能であると考えられた。また、IL-6レセプターへの結合にH3pI/L73よりもさらに強いpH依存性を付与することに薬物動態がさらに改善することが可能であると考えられた。
〔実施例６〕TOCILIZUMABの定常領域の最適化
TOCILIZUMABのH鎖C末端のヘテロジェニティーの低減
　IgG抗体のH鎖C末端配列のヘテロジェニティーとして、C末端アミノ酸のリジン残基の欠損、および、C末端の２アミノ酸のグリシン、リジン両方の欠損によるC末端カルボキシル基のアミド化が報告されている（Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.）。TOCILIZUMABにおいても、その主成分は塩基配列上存在するC末端アミノ酸のリジンが翻訳後修飾により欠損した配列であるが、リジンが残存している副成分およびグリシン、リジン両方の欠損によるC末端カルボキシル基のアミド化された副成分もヘテロジェニティーとして存在する。目的物質/関連物質のヘテロジェニティーの製造間差を維持しつつ医薬品として大量に製造することは容易ではなくコスト増につながり、可能な限り単一物質であることが望まれ、抗体を医薬品として開発する上にはこれらのヘテロジェニティーが低減されていることが望ましい。よって医薬品として開発する上ではH鎖C末端のヘテロジェニティーは存在しないことが望ましい。
　C末端アミノ酸のヘテロジェニティーを低減させることを目的にC末端アミノ酸の改変を行った。その結果、TOCILIZUMABのH鎖定常領域のC末端のリジンおよびグリシンを塩基配列上あらかじめ欠損させることで、C末端に由来するヘテロジェニティーを回避することが可能であることが見出された。TOCILIZUMAB、C末端のリジン欠損TOCILIZUMAB（TOCILIZUMABΔK、H鎖 WT-IgG1ΔK／配列番号：６８、L鎖 WT-kappa／配列番号：５４）、および、C末端のリジンおよびグリシン欠損TOCILIZUMAB（TOCILIZUMABΔGK、H鎖 WT-IgG1ΔGK／配列番号：６９、L鎖 WT-kappa／配列番号：５４）のヘテロジェニティーの評価を陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施した。カラムとしてはProPac WCX-10, 4×250 mm (Dionex) を使用し、移動相Aは25 mmol/L MES/NaOH, pH 6.1、移動相Bは25 mmol/L MES/NaOH, 250 mmol/L NaCl, pH 6.1を使用し、適切な流量およびグラジエントを用いて実施した。陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った結果を図１２に示した。その結果、H鎖定常領域のC末端のリジンだけでなく、H鎖定常領域のC末端のリジンおよびグリシンの両方を塩基配列上あらかじめ欠損させることで初めてC末アミノ酸のヘテロジェニティーを低減可能であることが見出された。ヒト抗体定常領域IgG1、IgG2、IgG4において、C末端配列はいずれもEUナンバリング（Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242 を参照）447番目がリジン、446番目がグリシンになっていることから、本検討で見出されたC末アミノ酸のヘテロジェニティーを低減させる方法はIgG2定常領域とIgG4定常領域、あるいはそれらの改変体にも適用可能であると考えられた。
TOCILIZUMABのIgG2アイソタイプのジスルフィド結合由来のヘテロジェニティーの低減
　TOCILIZUMABのアイソタイプはIgG1であるが、TOCILIZUMABは中和抗体であることから、免疫原性や副作用を考慮した場合、Fcγレセプターへの結合は好ましくない可能性が考えられる。Fcγレセプターへの結合を低下させる方法としては、IgG抗体のアイソタイプをIgG1からIgG2あるいはIgG4に変える方法が考えられ（Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48.）、FcγレセプターIへの結合および薬物動態の観点からはIgG4よりはIgG2が望ましいと考えられた（Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72）。一方、抗体を医薬品として開発するにあたり、そのタンパク質の物性、中でも均一性と安定性は極めて重要であり、IgG2アイソタイプは、ヒンジ領域のジスルフィド結合に由来するヘテロジェニティーが極めて多いことが報告されている（J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15.）。これに由来する目的物質/関連物質のヘテロジェニティーの製造間差を維持しつつ医薬品として大量に製造することは容易ではなくコスト増につながり、可能な限り単一物質であることが望まれる。よってIgG2アイソタイプの抗体を医薬品として開発する上では安定性を低下させることなくジスルフィド結合由来のヘテロジェニティーが低減されていることが望ましい。
　IgG2アイソタイプのヘテロジェニティーを低減することを目的に各種改変体を検討した結果、IgG2定常領域配列のうち、H鎖のCH1ドメインに存在するEUナンバリング131番目のシステインと133番目のアルギニンをそれぞれセリンとリジンに置換し、さらにH鎖のupper hingeに存在するEUナンバリング219番目のシステインをセリンに置換した定常領域であるWT-SKSC（配列番号：７０）によって、安定性を低下させることなくヘテロジェニティーを低減できることが見出された。TOCILIZUMAB-IgG1（H鎖 WT-IgG1／配列番号：５３、L鎖 WT-kappa／配列番号：５４）、TOCILIZUMAB-IgG2（H鎖 WT-IgG2／配列番号：７１、L鎖 WT-kappa／配列番号：５４）、および、TOCILIZUMAB-SKSC（H鎖 WT-SKSC／配列番号：７０、L鎖 WT-kappa／配列番号：５４）を調製し、ヘテロジェニティーおよび安定性の評価を行った。ヘテロジェニティーの評価は陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施した。カラムとしてProPac WCX-10 (Dionex)を用い、移動相Ａとして20 mM Sodium Acetate, pH5.0、移動相Ｂとして20 mM Sodium Acetate, 1 M NaCl, pH5.0を使用し、適切な流量およびグラジエントを用いて実施した。陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った結果を図１３に示した。安定性の評価は、示差走査型熱量測定（DSC）（VP-DSC、Microcal社製）による熱変性中間温度（Tm値）の評価により実施した。20 mM sodium acetate, 150 mM NaCl, pH6.0におけるDSC測定結果とFabドメインのTm値を図１４に示した。
　その結果、TOCILIZUMAB-IgG1と比較してTOCILIZUMAB-IgG2は著しくヘテロジェニティーが増大するが、TOCILIZUMAB-SKSCにすることによってヘテロジェニティーは大幅に低減できることが見出された。また、TOCILIZUMAB-IgG1と比較してTOCILIZUMAB-IgG2はDSCにおけるFabドメインの熱変性ピークにおいてヘテロ成分によると考えられる安定性の低い、すなわちTmの低いショルダーピーク（Fab*）の成分が認められるが、TOCILIZUMAB-SKSCにすることによってヘテロ成分によると考えられるTm値の低いショルダーピークは消失し、TOCILIZUMAB-IgG1およびTOCILIZUMAB-IgG2のFabドメインと同等の約94℃のTm値を示したことから、TOCILIZUMAB-SKSCは高い安定性を有していることが見出された。
TOCILIZUMABの薬物動態を向上するする定常領域変異箇所の同定
　上述のとおり、TOCILIZUMABのアイソタイプであるIgG1から、C末端のヘテロジェニティーを低減し、Fcγレセプターへの結合性を低減させ、高い安定性を維持したままIgG2アイソタイプの定常領域の抗体のヘテロジェニティーを低減することが可能であることが見出されたが、薬物動態に関してもTOCILIZUMABのアイソタイプであるIgG1よりも優れた定常領域であることが望ましい。
　IgG1アイソタイプの定常領域の抗体よりも優れた血漿中半減期を有する定常領域を見出すために、高い安定性を有しIgG2アイソタイプの定常領域の抗体に関する上述のヘテロジェニティーが低減されたTOCILIZUMAB-SKSCに対して、薬物動態を向上させることを目的に変異箇所をスクリーニングした結果、WT-SKSCに対して、EUナンバリング137番目のグルタミン酸をグリシンに138番目のセリンをグリシンに、268番ヒスチジンをグルタミンに、355番アルギニンをグルタミンに、419番グルタミンをグルタミン酸に置換し、これに加えてH鎖C末端のヘテロジェニティーを低減するために446番目のグリシンおよび447番目のリジンを欠損させたWT-M58（配列番号：７２（アミノ酸配列））を見出した。さらに、一方、IgG1に対して、434番目のアスパラギンをアラニンに置換したWT-M44（配列番号：７３（アミノ酸配列））を作製した。さらにM44に対してH鎖C末端のヘテロジェニティーを低減するために446番目のグリシンおよび447番目のリジンを欠損させたWT-M83（配列番号：７４（アミノ酸配列））を作製した。また、WT-M58に対して、434番目のアスパラギンをアラニンに置換したWT-M73（配列番号：７５（アミノ酸配列））を作製した。
　TOCILIZUMAB-M44（H鎖 WT-M44／配列番号：７３、L鎖 WT-kappa／配列番号：５４）、TOCILIZUMAB-M58（H鎖 WT-M58／配列番号：７２、L鎖 WT-kappa／配列番号：５４）およびTOCILIZUMAB-M73（H鎖 WT-M73／配列番号：７５、L鎖 WT-kappa／配列番号：５４）を調製し、ヒトFcRnへのアフィニティーおよびヒトFcRnトランスジェニックマウスによる薬物動態の評価を行った（方法は参考例参照）。
　TOCILIZUMAB-IgG1、TOCILIZUMAB-M44、TOCILIZUMAB-M58およびTOCILIZUMAB-M73のヒトFcRnへの結合性の評価をBiacoreにより行った結果、表６に示すとおり、TOCILIZUMAB-M44、TOCILIZUMAB-M58およびTOCILIZUMAB-M73の結合性はTOCILIZUMAB-IgG1よりもそれぞれ約2.7倍、約1.4倍および約3.8倍程度優れていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　TOCILIZUMAB-IgG1、TOCILIZUMAB-M44、TOCILIZUMAB-M58およびTOCILIZUMAB-M73のヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける薬物動態の評価を行った結果を図１５に示した。図１５に示すとおり、TOCILIZUMAB-M44、TOCILIZUMAB-M58およびTOCILIZUMAB-M73はいずれもTOCILIZUMAB-IgG1と比較して薬物動態が向上することが見出された。その薬物動態の向上効果はヒトFcRnへの結合能と相関した。なかでもTOCILIZUMAB-M73に関しては、TOCILIZUMAB-IgG1と比較して28日後の血漿中濃度が約16倍改善していたことから、ヒトにおいてもM73の定常領域を有する抗体はIgG1の定常領域を有する抗体と比較して大幅に薬物動態が向上すると考えられた。
〔実施例７〕PK/PDが改善した完全ヒト化IL-6レセプター抗体の作製
　上記実施例で見出されたTOCILIZUMABの可変領域および定常領域の変異を複数組み合わせたTOCILIZUMAB改変体を作製し、各種スクリーニングを実施した結果、完全ヒト化IL-6レセプター抗体として、Fv3-M73（H鎖 VH4-M73／配列番号：２５、L鎖 VL1-kappa／配列番号：２８）、Fv4-M73（H鎖 VH3-M73／配列番号：２６、L鎖 VL3-kappa／配列番号：２９）、Fv5-M83（H鎖 VH5-M83／配列番号：２７、L鎖 VL5-kappa／配列番号：３０）を見出した。
　作製したFv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83のIL-6レセプターへのアフィニティーをTOCILIZUMABと比較した（方法は参考例参照）。これらの抗体のpH7.4における可溶型IL-6レセプターへのアフィニティーを測定した結果を表７に示した。また、BaF/gp130の中和活性をTOCILIZUMABおよびコントロール（参考例の公知の高親和性高IL-6レセプター抗体、US 2007/0280945におけるVQ8F11-21 hIgG1）と比較した（方法は参考例参照）。これらの抗体のBaF/gp130による生物活性を測定した結果を図１６（IL-6終濃度300 ng/mL：TOCILIZUMAB、コントロール、Fv5-M83）および図１７（IL-6終濃度30 ng/mL：TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73）に示した。表７に示すとおり、Fv3-M73、Fv4-M73は、TOCILIZUMABと比較して2～3倍程度強いアフィニティーを有し、Fv5-M83はTOCILIZUMABと比較して100倍程度強いアフィニティーを示した（Fv5-M83ではアフィニティーの測定が困難であったため、定常領域をIgG1にしたFv5-IgG1（H鎖 VH5-IgG1／配列番号：７６、L鎖 VL5-kappa／配列番号：３０）を用いてアフィニティーを測定した、定常領域は一般にアフィニティーに影響しないと考えられる）。また、図１７に示すとおりFv3-M73、Fv4-M73は、TOCILIZUMABと比較してやや強い活性を示し、図１６に示すとおりFv5-M83はTOCILIZUMABと比較して50％阻害濃度として100倍以上の極めて強い活性を有し、且つ、公知の高親和性高IL-6レセプター抗体であるコントロールと比較しても50％阻害濃度として約10倍程度高い中和活性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　TOCILIZUMAB、Fv3-M73、および、Fv4-M73のpH7.4とpH5.8における膜型IL-6レセプターからの解離速度を測定した結果を表８に示した（方法は参考例参照）。Fv3-M73およびFv4-M73は、TOCILIZUMABと比較して膜型IL-6レセプターからの解離速度のpH依存性がそれぞれ約11倍および10倍向上していることが示された。実施例５におけるH3pI/L73と比較して、大幅に解離速度のpH依存性が向上していることから、Fv3-M73とFv4-M73の薬物動態はH3pI/L73と比較して大幅に向上していると考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　TOCILIZUMAB、コントロール、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の等電点を当業者公知の方法により等電点電気泳動により測定した結果、TOCILIZUMABの等電点は約9.3、コントロールは約8.4～8.5、Fv3-M73は約5.7～5.8、Fv4-M73は約5.6～5.7、Fv5-M83は5.4～5.5であり、いずれの抗体もTOCILIZUMABおよびコントロールと比較して等電点が大幅に低下した。また、可変領域VH/VLの理論等電点をGENETYX(GENETYX CORPORATION)により計算したところ、TOCILIZUMABの理論等電点は9.20、コントロールは7.79、Fv3-M73は5.49、Fv4-M73は5.01、Fv5-M83は4.27であり、いずれの抗体もTOCILIZUMABおよびコントロールと比較して等電点が大幅に低下した。実施例２において等電点の低下により薬物動態が改善することが示されていることから、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はTOCILIZUMABおよびコントロールと比較して薬物動態が向上していると考えられた。
　TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の可変領域配列に存在するT-cellエピトープをTEPITOPE（Methods. 2004 Dec;34(4):468-75）を用いて解析を行った。その結果、実施例３に示したとおり、TOCILIZUMABは多くの配列がHLAに結合するT-cellエピトープが存在すると予測されたが、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はT-cellエピトープに結合すると予測された配列が大幅に減少した。また、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はフレームワークにマウス配列が残存せず完全ヒト化されている。これらのことから、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はTOCILIZUMABと比較して大幅に免疫原性リスクが低減されている可能性が示唆された。
〔実施例８〕完全ヒト化IL-6レセプター抗体のサルPK/PD試験
　TOCILIZUMAB、コントロール、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83をカニクイザルに1 mg/kgで静脈内に単回投与し血漿中濃度推移を評価した（方法は参考例参照）。TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の静脈内投与後の血漿中濃度推移を図１８に示した。その結果、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもTOCILIZUMABおよびコントロールと比較してカニクイザルにおいて大幅に薬物動態が改善した。なかでも、Fv3-M73とFv4-M73の薬物動態はTOCILIZUMABと比較して大幅に改善した。
　カニクイザル膜型IL-6レセプターがどの程度中和されているかの薬効を評価するために、抗体投与6日目から18日目(TOCILIZUMABに関しては3日目から10日目)までカニクイザルIL-6 5μg/kgを腰背部に連日皮下投与し、24時間後の各個体のCRP濃度を測定した（方法は参考例参照）。各抗体投与時のCRP濃度推移を図１９に示した。カニクイザル可溶型IL-6レセプターがどの程度中和されているかの薬効を評価するために、カニクイザル血漿中の非結合型のカニクイザル可溶型IL-6レセプター濃度を測定し、非結合型の可溶型IL-6レセプター率を計算した（方法は参考例参照）。各抗体投与時の非結合型の可溶型IL-6レセプター率の推移を図２０に示した。
　Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもTOCILIZUMABおよび公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体であるコントロールと比較してカニクイザル膜型IL-6レセプターをより持続的に中和し、CRPの増加を長期間抑制した。また、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもTOCILIZUMABおよびコントロールと比較してカニクイザル可溶型IL-6レセプターをより持続的に中和し、非結合型のカニクイザル可溶型IL-6レセプターの増加を長期間抑制した。これより膜型IL-6レセプターおよび可溶型IL-6レセプターの中和の持続性に関しては、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもTOCILIZUMABおよびコントロールよりも優れていることが見出された。なかでもFv3-M73とFv4-M73の中和の持続性は極めて優れていた。一方、Fv5-M83のほうがFv3-M73とFv4-M73よりCRPおよび非結合型カニクイザル可溶型IL-6レセプターを低く抑制していることから、Fv5-M83は膜型IL-6レセプターおよび可溶型IL-6レセプターをFv3-M73とFv4-M73および公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体であるコントロールよりも強力に中和していると考えられた。これはFv5-M83がコントロールよりもIL-6レセプターへのアフィニティーが強く、且つ、BaF/gp130における生物活性が強いことがカニクイザルのin vivoにおいて反映された結果であると考えられる。
　これらのことから、TOCILIZUMABおよびコントロールと比較して、Fv3-M73とFv4-M73は抗IL-6レセプター中和抗体として作用の持続性が極めて優れており、投与頻度および投与量を大幅に低減することが可能であり、また、Fv5-M83は抗IL-6レセプター中和抗体として作用の強さに極めて優れており、また作用の持続性にも優れていることが見出された。よってFv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はIL-6アンタゴニストとしての医薬品として有用であると考えられる。
〔実施例９〕
　Monocyte chemoattractant protein (MCP)-1は、単球・T細胞・NK細胞・basophilの細胞浸潤に関与することが知られている。MCP-1は、RA患者の滑膜組織・滑液中で高発現していることが報告されており（J Clin Invest. 1992 Sep;90(3):772-9）、RAの病態に関与していると考えられている（Inflamm Allergy Drug Targets. 2008 Mar;7(1):53-66.）。
　また、VEGFは強力な血管新生因子であり、RA患者の滑膜中のマクロファージ・線維芽細胞・滑膜細胞等から産生されることが知られている（J Rheumatol. 1995 Sep;22(9):1624-30.）。また、RA患者血清中のVEGFレベルと疾患活動性やradiographic progressionが相関し（Arthritis Rheum. 2003 Jun;48(6):1521-9.、Arthritis Rheum. 2001 Sep;44(9):2055-64.）、RA患者を抗IL-6R抗体TOCILIZUMABで治療することにより、血清中のVEGFレベルが低下することから、VEGFもRAの病態に重要な役割を担っていると考えられている（Mod Rheumatol. 2009;19(1):12-9.、Mediators Inflamm. 2008;2008:129873）。
　そこで、TOCILIZUMABおよびFv4-M73はsIL-6R及びIL-6刺激によるヒトRA患者由来滑膜細胞からのMCP-1およびVEGF産生を抑制できるかどうかを以下の方法で検討した。
　ヒトRA患者由来滑膜細胞（TOYOBO）を5% FCS含有IMDM培地にて96 well plateに2×104/0.05 mL/wellにて播種し、CO2インキュベーター（37℃, 5%CO2）中で90分静置した。適宜希釈した濃度のTOCILIZUMAB及びFv4-M73を0.05 mL添加し、15分静置後に可溶型IL-6レセプター（SR344：参考例の方法に従って調製）を0.05 mL添加して更に30分静置し、更にIL-6（TORAY）を0.05 mL添加した（可溶型IL-6レセプター及びIL-6の終濃度は各50 ng/mL）。2日培養後、培養上清を回収し、培養上清中のMCP-1およびVEGF濃度をELISA kit （BiosourceおよびPierce Biotechnology）を用いて測定した。結果を図２１と図２２に示す。TOCILIZUMAB及びFv4-M73は、可溶型IL-6レセプター及びIL-6刺激によるヒトRA患者由来滑膜細胞からのMCP-1およびVEGF産生を濃度依存的に抑制した。
　これらのことから、Fv4-M73は、抗IL-6レセプター中和抗体として作用（IL-6レセプターに結合し膜型IL-6レセプターおよび可溶型IL-6レセプターのシグナルを遮断）の持続性がTOCILIZUMABと比較して極めて優れており、TOCILIZUMABと比較して投与頻度および投与量を大幅に低減することが可能であり、さらにFv4-M73は、ヒトRA患者由来滑膜細胞からのMCP-1およびVEGF産生を抑制することから、Fv4-M73はRAに極めて有用な治療薬であることが示された。
〔参考例〕
組み換え可溶型ヒトIL-6レセプターの調製
　抗原であるヒトIL-6レセプターの組み換え可溶型ヒトIL-6レセプターは以下のように調製した。J.Biochem. 108, 673-676 (1990)で報告されているN末端側１番目から344番目のアミノ酸配列からなる可溶型ヒトIL-6レセプター（Yamasakiら、Science 1988；241：825-828 (GenBank # X12830)）のCHO細胞定常発現株を作製した。SR344発現CHO細胞から得られた培養上清から、Blue Sepharose 6 FFカラムクロマトグラフィー、SR344に対する特異抗体を固定したカラムによるアフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの3つのカラムクロマトグラフィーにより、可溶型ヒトIL-6レセプターを精製した。メインピークとして溶出した画分を最終精製品とした。
組み換え可溶型カニクイザルIL-6レセプター（cIL-6R）の調製
　公開されているアカゲザルIL-6レセプター遺伝子配列 (Birney et al, Ensembl 2006, Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1;34(Database issue):D556-61.) を元にオリゴDNAプライマーを作製し、カニクイザル膵臓から調製されたcDNAを鋳型とし、プライマーを用いて、PCR法によりカニクイザルIL-6レセプター遺伝子全長をコードするDNA断片を調製した。得られたDNA断片を哺乳動物細胞発現ベクターへ挿入し、これを用いてCHO定常発現株（cyno.sIL-6R産生CHO細胞）を作製した。cyno.sIL-6R産生CHO細胞の培養液をHisTrapカラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）で精製後、Amicon Ultra-15 Ultracel-10k（Millipore）を用いて濃縮し、Superdex200pg16/60ゲルろ過カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）でさらに精製を行い、可溶型カニクイザルIL-6レセプター（以下、cIL-6R）の最終精製品とした。
組み換えカニクイザルIL-6(cIL-6)の調製
　カニクイザルIL-6は以下のように調製した。SWISSPROT Accession No.P79341に登録されている212アミノ酸をコードする塩基配列を作成し、哺乳動物細胞発現ベクターにクローニングし、CHO細胞に導入することで定常発現細胞株を作製した（cyno.IL-6産生CHO細胞）。cyno.IL-6産生CHO細胞の培養液をSP-Sepharose/FFカラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）で精製後、Amicon Ultra-15 Ultracel-5k（Millipore）を用いて濃縮し、Superdex75pg26/60ゲルろ過カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）でさらに精製を行い、Amicon Ultra-15 Ultracel-5k（Millipore）を用いて濃縮し、カニクイザルIL-6（以下、cIL-6）の最終精製品とした。
公知高親和性抗IL-6レセプター抗体の作製
　公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体として、US 2007/0280945 A1に記載されている高親和性抗IL-6レセプター抗体であるVQ8F11-21 hIgG1（US 2007/0280945 A1, H鎖アミノ酸配列：配列番号：７７、L鎖アミノ酸配列：配列番号：７８）を発現させるため、哺乳動物細胞発現用ベクターを構築した。抗体可変領域については、合成オリゴDNAを組み合わせたPCR法（assembly PCR）により作製し、定常領域についてはIgG1を使用した。Assembly PCR法により抗体可変領域と定常領域を結合させ、哺乳動物発現用ベクターへ挿入し、目的のH鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。作製した発現ベクターを用い、発現・精製を行った。発現・精製は実施例１に記載した方法で行い、高親和性抗IL-6レセプター抗体（以降、コントロール、と記す）を得た。
TOCILIZUMABの変異体の作製・発現・精製
　TOCILIZUMABの変異体はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を用いて、添付説明書記載の方法で変異体を作製し、得られたプラスミド断片を哺乳動物細胞発現ベクターに挿入し、目的のH鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。抗体の発現は以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株（Invitrogen）を10 % Fetal Bovine Serum (Invitrogen)を含むDMEM培地(Invitrogen)へ懸濁し、5～6 × 105個/mLの細胞密度で接着細胞用ディッシュ（直径10 cm, CORNING）の各ディッシュへ10 mLずつ蒔きこみCO2インキュベーター（37℃、5% CO2）内で一昼夜培養した後に、培地を吸引除去し、CHO-S-SFM-II（Invitrogen）培地6.9 mLを添加した。調製したプラスミドをlipofection法により細胞へ導入した。得られた培養上清を回収した後、遠心分離（約2000 g、5分間、室温）して細胞を除去し、さらに0.22μmフィルターMILLEX(R)-GV（Millipore）を通して滅菌して培養上清を得た。得られた培養上清からrProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）を用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定した。得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
ヒトgp130発現BaF3細胞株の樹立
　IL-6依存増殖性を示す細胞株を得るために、以下に示すとおり、ヒトgp130を発現したBaF3細胞株の樹立を行った。
　全長ヒトgp130 cDNA（Hibiら、Cell 1990；63：1149-1157（GenBank # NM_002184））をPCRにより増幅し、pCHOI（Hirataら、FEBS Letter 1994；356：244-248）のDHFR遺伝子発現部位を除去し、Zeocin耐性遺伝子発現部位を挿入した発現ベクターpCOS2Zeoにクローニングし、pCOS2Zeo/gp130を構築した。全長ヒトIL-6R cDNAをPCRにより増幅し、pcDNA3.1(+)（Invitrogen）にクローニングし、hIL-6R/pcDNA3.1(+)を構築した。
　10μgのpCOS2Zeo/gp130をPBSに懸濁したBaF3細胞（0.8 x 107 cells）に混合し、Gene Pulser（Bio-Rad）を用いて0.33 kV, 950μFDの容量でパルスを加えた。エレクトロポーレーション処理により遺伝子導入したBaF3細胞を0.2 ng/mLのmouse interleukin-3（Peprotech）、10% Fetal Bovine Serum（以下FBS、HyClone）を含むRPMI1640培地（Invitrogen）で一昼夜培養し、100 ng/mLのhuman interleukin-6（R&D systems）、100 ng/mLのhuman interleukin-6 soluble receptor（R&D systems）および10％ FBSを含むRPMI1640培地を加えて選抜し、ヒトgp130発現BaF3細胞株（以下、BaF3/gp130）を樹立した。このBaF/gp130は、human interleukin-6（R&D systems）および可溶型ヒトIL-6レセプター存在下で増殖することから、抗IL-6レセプター抗体の増殖阻害活性（すなわちIL-6レセプター中和活性）の評価に使用することが可能である。
ヒトgp130発現BaF3細胞（BaF/gp130）による生物活性評価
　IL-6/IL-6レセプター依存性増殖を示すBaF3/gp130を用いて、IL-6レセプター中和活性を評価した。BaF3/gp130を10% FBSを含むRPMI1640培地で3回洗浄した後に、5 x 104 cells/mLとなるように600 ng/mLないしは60 ng/mLのhuman interleukin-6（TORAY）（終濃度は300 ng/mLないしは30 ng/mL）、適当量の可溶型ヒトIL-6レセプターおよび10% FBSを含むRPMI1640培地に懸濁し、96 well-plate（CORNING）の各wellに50μLずつ分注した。次に、精製した抗体を10% FBSを含むRPMI1640に希釈して、各wellに50μLずつ混合した。37℃、5% CO2条件下で、3日間培養し、PBSで2倍に希釈したWST-8試薬（Cell Counting Kit-8、株式会社同仁化学研究所）を20μL/wellで加え、直後にSUNRISE CLASSIC（TECAN）を用いて450 nmの吸光度（参照波長620 nm）を測定した。2時間培養した後に、再度450 nmの吸光度（参照波長620 nm）を測定し、2時間の吸光度変化を指標にIL-6レセプター中和活性を評価した。
Biacoreによる可溶型ヒトIL-6レセプターへの結合評価
　Biacore T100（GE Healthcare）を用いて、抗原抗体反応の速度論的解析を行った。センサーチップ上にアミンカップリング法でprotein Aあるいはprotein A/Gあるいはanti-IgG（γ-chain specific）F(ab’)2を適当量固定化し、次にpH7.4において目的の抗体を結合させ、さらにpH7.4において種々の濃度に調製した可溶型IL-6レセプターをアナライトとして流し、抗体と可溶型ヒトIL-6レセプターの相互作用を測定した。測定は全て37℃で実施した。測定で得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーターである結合速度定数ka（1/Ms）、および解離速度定数kd（1/s）を算出し、その値をもとにKD（M）を算出した。各パラメーターの算出にはBiacore T100 Evaluation Software（GE Healthcare）を用いた。
Biacoreによる膜型IL-6レセプターへのpH依存的解離評価
　Biacore T100（GE Healthcare）を用いてpH5.8, pH7.4における膜型IL-6レセプターへの抗原抗体反応を観測した。センサーチップ上に固定化した可溶型ヒトIL-6レセプターへの結合を評価することで、膜型IL-6レセプターへの結合を評価した。SR344を当業者公知の方法に従ってビオチン化し、ストレプトアビジンとビオチンの親和性を利用し、ストレプトアビジンを介してビオチン化可溶型ヒトIL-6レセプターをセンサーチップ上に固定化した。測定は全て37℃で実施し、移動相のバッファーは10 mM MES pH5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20とし、そこにpH依存的結合クローンをpH7.4の条件下で注入して可溶型ヒトIL-6レセプターと結合させたのち（注入サンプルのバッファーは10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20）、移動相のpHである5.8で各クローンのpH依存的な解離を観測した。サンプル濃度を0.25μg/mLとし、10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05 % Tween20で結合させ、10 mM MES pH5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で解離させたときのpH5.8における解離相のみBiacore T100 Evaluation Software（GE Healthcare）を用いフィッティングすることにより、pH5.8における解離速度定数（kd(1/s)）を算出した。同様にまた、サンプル濃度を0.5μg/mLとし、10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で結合させ、10 mM MES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で解離させたときのpH7.4における解離相のみBiacore T100 Evaluation Software（GE Healthcare）を用いフィッティングすることにより、pH7.4における解離速度定数（kd(1/s)）を算出した。
ヒトFcRnへの結合評価
　FcRnはFcRnとβ2-microglobulinの複合体である。公開されているヒトFcRn遺伝子配列（J. Exp. Med. 180 (6), 2377-2381 (1994)）を元に、オリゴDNAプライマーを作製した。ヒトcDNA（Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech）を鋳型とし、作製したプライマーを用いPCR法により遺伝子全長をコードするDNA断片を調整した。得られたDNA断片を鋳型に、PCR法によりシグナル領域を含む細胞外領域（Met1-Leu290）をコードするDNA断片を増幅し、哺乳動物細胞発現ベクターへ挿入した（ヒトFcRnアミノ酸配列／配列番号：７９）。同様に、公開されているヒトβ2-microglobulin遺伝子配列（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002)）を元に、オリゴDNAプライマーを作製した。ヒトcDNA（Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA, CLONTECH）を鋳型とし、作製したプライマーを用いPCR法により遺伝子全長をコードするDNA断片を調製した。得られたDNA断片を鋳型に、PCR法によりシグナル領域を含むβ2-microglobulin全長（Met1-Met119）をコードするDNA断片を増幅し、哺乳動物細胞発現ベクターへ挿入した（ヒトβ2-microglobulinアミノ酸配列／配列番号：８０）。
　可溶型ヒトFcRnの発現は以下の手順で行った。調製したヒトFcRnおよびヒトβ2-microglobulinのプラスミドを、10 % Fetal Bovine Serum (Invitrogen)を用いたlipofection法により、ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株（Invitrogen）の細胞へ導入した。得られた培養上清を回収した後、IgG Sepharose 6 Fast Flow（Amersham Biosciences）を用い、（J Immunol. 2002 Nov 1;169(9):5171-80.）の方法に従い精製を行った。その後、HiTrap Q HP（GE Healthcare）により精製を行った。
マウスにおける抗体血漿中濃度の測定
　マウス血漿中抗体濃度測定はELISA法にて当業者公知の方法で測定した。
サルPK/PD試験による抗体血漿中濃度、CRP濃度、非結合型可溶型IL-6レセプターの測定
　カニクイザル血漿中濃度測定はELISA法にて当業者公知の方法で測定した。
　CRP濃度はサイアスR CRP（関東化学株式会社）にて、自動分析装置（TBA-120FR、東芝メディカルシステムズ株式会社）を用いて測定した。
　カニクイザル血漿中の非結合型の可溶型カニクイザルIL-6レセプター濃度を以下の通り測定した。カニクイザルの血漿30μLを0.22μmのフィルターカップ（Millipore）において乾燥させた適量のrProtein A Sepharose Fast Flow（GE Healthcare）樹脂に添加することで血漿中に存在する全てのIgG型抗体（カニクイザルIgG、抗ヒトIL-6レセプター抗体および抗ヒトIL-6レセプター抗体-可溶型カニクイザルIL-6レセプター複合体）をProteinAに吸着させた。その後、高速遠心機でスピンダウンし、パス溶液を回収した。パス溶液にはproteinAに結合した抗ヒトIL-6レセプター抗体-可溶型カニクイザルIL-6レセプター複合体は含まれないため、proteinAパス溶液中の可溶型カニクイザルIL-6レセプター濃度を測定することによって、非結合型の可溶型IL-6レセプター濃度を測定可能である。可溶型カニクイザルIL-6レセプター濃度は、上記で作製した可溶型カニクイザルIL-6レセプター（cIL-6R）をスタンダードに用いて、ヒトIL-6レセプター濃度を測定する当業者公知の方法で測定した。非結合型の可溶型IL-6レセプター率は以下の計算式によって計算した。
（抗体投与後の非結合型の可溶性IL-6レセプター濃度÷抗体投与前の可溶性IL-6レセプター濃度）×100

Claims (11)

  1. 　以下の(a)～(f)いずれかに記載のポリペプチド；
    (a)　配列番号：１（VH4-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：２（VH4-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：３（VH4-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド、
    (b)　配列番号：４（VH3-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：５（VH3-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：６（VH3-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド、
    (c)　配列番号：７（VH5-M83のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：８（VH5-M83のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：９（VH5-M83のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド、
    (d)　配列番号：１０（VL1のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１１（VL1のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１２（VL1のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド、
    (e)　配列番号：１３（VL3のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１４（VL3のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１５（VL3のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド、
    (f)　配列番号：１６（VL5のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１７（VL5のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１８（VL5のCDR3）の配列を有するCDR3を含むポリペプチド。
  2. 　以下の(a)～(c)いずれかに記載の抗体；
    (a)　配列番号：１（VH4-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：２（VH4-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：３（VH4-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号：１０（VL1のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１１（VL1のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１２（VL1のCDR3）の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
    (b)　配列番号：４（VH3-M73のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：５（VH3-M73のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：６（VH3-M73のCDR3）の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号：１３（VL3のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１４（VL3のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１５（VL3のCDR3）の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
    (c)　配列番号：７（VH5-M83のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：８（VH5-M83のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：９（VH5-M83のCDR3）の配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
    配列番号：１６（VL5のCDR1）の配列を有するCDR1、配列番号：１７（VL5のCDR2）の配列を有するCDR2、および配列番号：１８（VL5のCDR3）の配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
  3. 　以下の(a)～(f)いずれかに記載の可変領域；
    (a)　配列番号：１９（VH4-M73の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域、
    (b)　配列番号：２０（VH3-M73の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域、
    (c)　配列番号：２１（VH5-M83の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域、
    (d)　配列番号：２２（VL1の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域、
    (e)　配列番号：２３（VL3の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域、
    (f)　配列番号：２４（VL5の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域。
  4. 　以下の(a)～(c)いずれかに記載の抗体；
    (a)　配列番号：１９（VH4-M73の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域および配列番号：２２（VL1の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
    (b)　配列番号：２０（VH3-M73の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域および配列番号：２３（VL3の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
    (c)　配列番号：２１（VH5-M83の可変領域）の配列を有する重鎖可変領域および配列番号：２４（VL5の可変領域）の配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
  5. 　以下の(a)～(f)いずれかに記載の重鎖又は軽鎖；
    (a)　配列番号：２５（VH4-M73）の配列を有する重鎖、
    (b)　配列番号：２６（VH3-M73）の配列を有する重鎖、
    (c)　配列番号：２７（VH5-M83）の配列を有する重鎖、
    (d)　配列番号：２８（VL1）の配列を有する軽鎖、
    (e)　配列番号：２９（VL3）の配列を有する軽鎖、
    (f)　配列番号：３０（VL5）の配列を有する軽鎖。
  6. 　以下の(a)～(c)いずれかに記載の抗体；
    (a)　配列番号：２５（VH4-M73）の配列を有する重鎖および配列番号：２８（VL1）の配列を有する軽鎖を含む抗体、
    (b)　配列番号：２６（VH3-M73）の配列を有する重鎖および配列番号：２９（VL3）の配列を有する軽鎖を含む抗体、
    (c)　配列番号：２７（VH5-M83）の配列を有する重鎖および配列番号：３０（VL5）の配列を有する軽鎖を含む抗体。
  7. 　請求項１～６いずれかに記載のポリペプチドをコードする遺伝子。
  8. 　請求項７に記載の遺伝子を含むベクター。
  9. 　請求項８に記載のベクターを保持する宿主細胞。
  10. 　請求項９の宿主細胞を培養することにより、請求項１～６いずれかに記載のポリペプチドを製造する方法。
  11. 　請求項１～６いずれかに記載のポリペプチド、または請求項１０に記載の方法によって製造されるポリペプチドを含む医薬組成物。
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