WO2005095331A1

WO2005095331A1 - 糖鎖－ペプチド結合剤

Info

Publication number: WO2005095331A1
Application number: PCT/JP2005/005810
Authority: WO
Inventors: Shinichiro Nishimura; Akio Takimoto
Original assignee: Shionogi & Co., Ltd.
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2005-03-29
Publication date: 2005-10-13
Also published as: JPWO2005095331A1

Abstract

一般式（Ｉ）：　　Ｘ－Ｙ－Ｚ　　　（Ｉ）［式中、ＸはＨ２Ｎ－またはＨＳ－；Ｙは－Ａ１－、－Ａ１－Ｏ－Ａ２－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ａ１－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ａ１－Ｏ－Ａ２－、－Ａ１－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－Ａ２－、－Ａ１－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－Ａ２－、－Ａ１－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－Ａ２－、－Ａ１－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－Ａ２－等；および、Ｚは－Ｏ－ＮＨ（Ｒ４）、－ＮＨ－ＯＲ４、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＮＨ－Ｒ４、または－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－ＮＨ－Ｒ４（式中、Ｒ４は水素原子、低級アルキル、またはアリール］で表される化合物を含む糖鎖－ペプチド結合剤、および該糖鎖－ペプチド結合剤を用いた糖ペプチドの製造方法。

Description

糖鎖一ペプチド結合剤

技術分野

[0001] 本発明は、均一な組成を有する糖ペプチドおよび糖タンパク質 (特記しない限り、本明細書において、これらを総称して「糖ペプチド」と呼ぶ）を簡便に製造するために用、る糖鎖ペプチド結合剤、および該糖鎖ペプチド結合剤を用、た糖ペプチドの製造方法に関する。

背景技術

[0002] ペプチドおよびタンパク質は、生理活性物質の典型としてこれまで研究が進められている。生物 (特に、真核生物）は、遺伝子の転写および翻訳という機構を通じてべプチドおよびタンパク質を生産にした後に、翻訳後修飾することが多ぐ多くのぺプチドおよびタンパク質は、翻訳後修飾により機能を発揮し、調節 (例えば、増強または低減)される。翻訳後修飾としては、例えば、アミノ酸レベル (すなわち、シグナルぺプチド切断など）のもののほか、例えば、糖鎖、脂質などの他の生体分子による修飾が挙げられる。この中で、糖鎖による修飾は代表的なものであり、真核生物において非常に多くのペプチドおよびタンパク質は、糖鎖を有すると言われている。

このような糖鎖修飾を模倣して、近年、機能を調節した人工的複合ペプチドを生産する試みがなされており（特許文献 1〜4)、バイオ医薬にも利用されている。

しかし、ペプチドまたはタンパク質の特定の部位に特定の糖鎖をィ匕学的に導入する方法、とりわけペプチドまたはタンパク質の複数の箇所に複数本の糖鎖を均一に導入する方法は限られている。例えば、非特許文献 1には、数段階の合成反応を経て得られる糖修飾体をインスリンに導入する方法が記載されており、非特許文献 2には、非天然のペプチドを合成した後に糖鎖を導入する方法が記載されている。しかし、いずれも簡便さや大量生産の観点から適した製造方法とは言い難ぐ、組成が一定して、るバイオ医薬を生産することは困難な状況である。

特許文献 1：特開 2000 - 300287

特許文献 2：欄 2001— 278899 9

非特許文献 l:Angw. Chem, 2004, 43, 1516

非特許文献 2: Am. Chem. Soc, 2003, 125, 1702

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0003] 本発明の課題は、組成が一定した糖ペプチドを簡便に生産するために用いる糖鎖ペプチド結合剤、および該糖鎖ペプチド結合剤を用 Vヽて糖ペプチドを製造する方法、を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0004] すなわち、本発明は、（1)一般式 (I)：

X-Y-Z (I)

[式中、 Xは H N—または式：

2

[化 1]

で表される基；

Yは—A¹ -A'-O-A²-, -(CH CH O) —A¹ -(CH CH O) A¹—

2 2 n 2 2 n

O - A² - A¹ - NH - C( = 0) - A² - A¹ - C( = 0) - NH - A² - A¹ -（ CH CH O) NH— C( = 0)— A² A¹—（CH CH O) — C( = 0)— NH—

2 2 n 2 2 n

A²—、式：

[化 2]

で表される基、または式

[化 3]

で表される基 (式中、 A¹および A²はそれぞれ独立して、置換されていてもよい C1— 1 5アルキレン、置換されて!、てもよ、C2— 15ァルケ-レンまたは置換されて!、てもよい C2— 15アルキ-レン； nは 1〜 5の整数； R¹はヒドロキシまたは NH (R²) (式中、 R²は水素原子、低級アルキル、ァリールまたはァラルキル）； R³は水素原子または— C ( = 0)— R⁵ (式中、 R⁵は低級アルキル、ァリールまたはァラルキル））；および、 Zは O— NH (R⁴)、一 NH— OR⁴、一 C ( = 0)— NH— NH— R⁴、または C ( = S )— NH— NH— R⁴ (式中、 R⁴は水素原子、低級アルキル、またはァリール）] で表される化合物を含む糖鎖ペプチド結合剤、に関する。

ここで、式 (I)で表される化合物に存在するァミノ基、イミノ基等は、適切な保護基により保護されていてもよい。

詳しくは、以下の（2)〜（11)に関する。

(2) Xが— NHおよび Zが— O— NH (R⁴) (式中、 R⁴は水素原子、低級アルキル、

2

またはァリール)である（1)の糖鎖ペプチド結合剤。

(3) Xが式：

[化 4]

で表される基および Zが— O— NH (R⁴) (式中、 R⁴は水素原子、低級アルキル、またはァリール)である（1)記載の糖鎖ペプチド結合剤。

(4)一般式 (Π) : H N— A¹— O— NH(R⁴) (II)

2

(式中、 A¹は置換されていてもよい CI— 15アルキレン; R⁴は水素原子、低級アルキル、またはァリール)で表わされる化合物またはその塩。

(5)—般式 (III):

[化 5]

(式中、 A¹は置換されていてもよい C 1—15アルキレン; R⁴は水素原子、低級アルキル、またはァリール)で表わされる化合物またはその塩。

(6)以下の工程：

1)一般式 (IV):

H N-Y-Z (IV)

2

[式中、 Yは— A¹—、— A¹— O— A²—、 - (CH CH O) — A¹—、 - (CH CH O)

2 2 η 2 2 : Α¹ - Ο - Α² - A¹ - NH - C( = 0) - A² - A¹ - C( = 0) - NH - A² -、 A¹—（CH CH O) — NH— C( = 0)— A² A¹—（CH CH O) — C( = 0)

2 2 η 2 2 η NH - Α² -、式：

[化 6]

で表される基、または式:

[化 7]

で表される基 (式中、 A¹および A²はそれぞれ独立して、置換されていてもよい C1— 1

5アルキレン、置換されて!、てもよ、C2— 15ァルケ-レンまたは置換されて!、てもよい C2— 15アルキ-レン； nは 1〜 5の整数； R¹はヒドロキシまたは NH (R²) (式中、

R²は水素原子、低級アルキル、ァリールまたはァラルキル）； R³は水素原子または—

C ( = 0)— R⁵ (式中、 R⁵は低級アルキル、ァリールまたはァラルキル））；および、

Zは O— NH (R⁴)、一 NH— OR⁴、一 C ( = 0)— NH— NH— R⁴、または C ( = S

)— NH— NH— R⁴ (式中、 R⁴は水素原子、低級アルキル、またはァリール）] で表される化合物と、

グルタミン残基を有するペプチドを、

トランスダルタミナーゼの存在下で反応させる工程、および

2) 1)工程で得られたペプチドと、糖鎖を反応させる工程を包含する、

糖ペプチドの製造方法。

該製造方法に関連して、 1)一般式 (IV)で表される化合物と糖鎖を反応させる工程、および 2) 1)工程で得られたペプチドと、グルタミン残基を有するペプチドを、トランスグルタミナーゼの存在下で反応させる工程を包含する、糖ペプチドの製造方法についても行うことができる。

(7)以下の工程：

1)一般式 (V) :

[化 8]

2 2 η 2 2 一 Α¹ - Ο - Α² -、一 A¹ - NH - C ( = 0) - A² -、一 A¹ - C ( = 0) - NH - A² -、一 A¹—（CH CH O) — NH— C ( = 0)— A²—、一 A¹—（CH CH O) — C ( = 0)

2 2 η 2 2 η NH - Α² -、式：

[化 9]

で表される基 (式中、 A¹および A²はそれぞれ独立して、置換されていてもよい C1— 1 5アルキレン、置換されて!、てもよ、C2— 15ァルケ-レンまたは置換されて!、てもよい C2— 15アルキ-レン； nは 1〜 5の整数； R¹はヒドロキシまたは NH (R²) (式中、 R²は水素原子、低級アルキル、ァリールまたはァラルキル）； R³は水素原子または— C ( = 0)— R⁵ (式中、 R⁵は低級アルキル、ァリールまたはァラルキル））；および、 Zは O— NH (R⁴)、一 NH— OR⁴、一 C ( = 0)— NH— NH— R⁴、または C ( = S )— NH— NH— R⁴ (式中、 R⁴は水素原子、低級アルキル、またはァリール）] で表される化合物と、

システィン残基を含有するペプチドを反応させる工程、および

2) 1)工程で得られたペプチドと糖鎖を反応させる工程を包含する、

糖ペプチドの製造方法。

該製造方法に関連して、 1)一般式 (V)で表される化合物と糖鎖を反応させる工程、および 2) 1)工程で得られたペプチドと、システィン残基を有するペプチドを反応させる工程、を包含する糖ペプチドの製造方法にっヽても行うことができる。

(⁸) Zが— O— NH (R⁴) (式中、 R⁴は水素原子、低級アルキル、またはァリール)である（6)または（7)記載の製造方法。

(⁹) Yが— A¹— (式中、 A¹は置換されていてもよい CI— I⁵アルキレン）である（⁶) または（7)記載の製造方法。

(10) (6)〜（9)の、ずれかに記載の製造方法で製造されうる糖ペプチド。 ( 11) (6)〜（9)のヽずれかに記載の製造方法で製造されうる糖ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物。

発明の効果

[0009] 本発明は、天然または非天然のタンパク質と保護されていない糖鎖を利用して、均一な組成を有する糖ペプチドを簡便に製造するために用いる糖鎖—ペプチド結合剤、および該糖鎖—ペプチド結合剤を用いて糖ペプチドを製造する方法に関する。本発明により、組成が一定している糖ペプチドを提供することが可能となるので、より高品質なノィォ医薬を提供することができる。

発明を実施するための最良の形態

[0010] 以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。

(用語）

以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。

[0011] 本明細書において「糖鎖」とは、単位糖 (単糖および Zまたはその誘導体)が 1っ以上連なってできたィ匕合物をいう。単位糖が 2つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類 (グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、 N—ァセチルダルコサミン、 N—ァセチルガラタトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体)の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテォグリカン、グリコサミノダリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「多糖 (ポリサッカリド)」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含する。

本明細書において「単糖」とは、これより簡単な分子に加水分解されず、一般式 C H Oで表される化合物をいう。ここで、 n= 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9および 10であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、へキソース、ヘプトース、オタトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース，後者をケトースという。

[0012] 本明細書にぉ、て「単糖の誘導体」とは、単糖上の一つ以上の水酸基が別の置換基に置換され、結果生じる物質が単糖の範囲内にないものをいう。そのような単糖の誘導体としては、カルボキシル基を有する糖 (例えば、 C 1位が酸ィ匕されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、 D—グルコースが酸化された D ダルコン酸）、末端の C原子がカルボン酸となったゥロン酸（D—グルコースが酸化された D グルクロン酸）、アミノ基またはァミノ基の誘導体 (例えば、ァセチルイ匕されたァミノ基)を有する糖 (例えば、 N ァセチル— D—ダルコサミン、 N ァセチル— D ガラクトサミンなど )、アミノ基およびカルボキシル基を両方とも有する糖 (例えば、 N ァセチルノイラミン酸 (シアル酸）、 N ァセチルムラミン酸など）、デォキシィ匕された糖 (例えば、 2— デォキシ—D リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などがあるがそれらに限定されない。あるいは、へミアセタール構造を形成した糖において、アルコールと反応してァセタール構造のグリコシドもまた、単糖の誘導体の範囲内にある。

本明細書にぉヽて「糖鎖含有物質」とは、糖鎖および糖鎖以外の物質を含む物質をいう。このような糖鎖含有物質は、生体内に多く見出され、例えば、生体中に含有される多糖類の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオダリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子力も分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。

[0013] 本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよぐ環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよぐ改変されたァミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとァセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたァミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフイド結合形成、ダリコシル化、脂質化、ァセチル化、リン酸ィ匕または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化)。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の 1または 2以上のアナログを含むポリペプチド (例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ぺプトイド）および当該分野にお!、て公知の他の改変が包含される。本発明の遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとる。このようなポリペプチド形態の本発明の遺伝子産物は、本発明の診断、予防、治療または予後のための組成物として有用である。特に、生理活性を有するペプチドが好ましい。例えば、インスリン、エリスロポエチン、トロンボポェチン、インターロイキン 1、インターロイキン 2、インターロイキン 3、インターロイキン 4、インターロイキン 5、インターロイキン 6、インターロイキン 7、インターロイキン 8、インターロイキン 9、インターロイキン 10、インターロイキン 11、インターロイキン 12、インターロイキン 13、インターロイキン一 14、インターロイキン一 15、インターフェロン a、インターフェロン一 13、インターフェロン γ、 G— CSF、 GM— CSF、 M— CSF、 GLP—1、ステムセノレファクタ一、 mpl—リガンド、ソマトスタチン、バソプレツシン、グノレ力ゴン、成長ホノレモン、レプチン、コレシストキ-ン、サブスタンス P、アドレナリン、 ADF、副腎皮質刺激ホルモン、 j8エンドルフィン、ネオエンドルフィンなど人体中で生理的に働いているべプチドおよびこれらを改変したペプチド、動物由来のペプチド、微生物由来のペプチド、植物由来のペプチドなどが挙げられる。

本明細書において「糖タンパク質」としては、例えば、酵素、ホルモン、サイト力イン、抗体、ワクチン、レセプター、血清タンパク質などが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において「糖鎖—ペプチド結合剤」とは、糖ペプチドを形成する際に、糖鎖とペプチドの間に介在する「リンカ一」として働く基のことをいう。例えば、一般式 (I)

X-Y-Z (I)

[式中、 Xは H N—または式：

2

[化 11]

で表される基；

Yは—A¹—、 -A' -O-A²- , - (CH CH O) —A¹—、 - (CH CH O) A¹—

2 2 n 2 2 n

O - A² -、一 A¹ - NH - C ( = 0) - A² -、一 A¹ - C ( = 0) - NH - A² -、一 A¹ -（

CH CH O) NH— C ( = 0)— A² 、一 A¹— (CH CH O) 一 C ( = 0)— NH—

2 2

A²—、式：

[化 12]

⁰丫

、Α¹

Η で表される基、または式：

[化 13]

で表される基 (式中、 Α¹および Α²はそれぞれ独立して、置換されていてもよい C1— 1 5アルキレン、置換されて!、てもよ、C2— 15ァルケ-レンまたは置換されて!、てもよい C2— 15アルキ-レン； nは 1〜 5の整数； R¹はヒドロキシまたは NH (R²) (式中、 R²は水素原子、低級アルキル、ァリールまたはァラルキル）； R³は水素原子または— C ( = 0)— R⁵ (式中、 R⁵は低級アルキル、ァリールまたはァラルキル））；および、 Zは一 O— NH (R⁴)、一 NH— OR⁴、一 C ( = 0)— NH— NH— R⁴、または一 C ( = S )— NH— NH— R⁴ (式中、 R⁴は水素原子、低級アルキル、またはァリール）] で表される化合物を含む糖鎖ペプチド結合剤、が例示される。特に、

1)式： H N— A¹— O— NH (R⁴) (式中、 A¹は置換されていてもよい CI— 15アルキレ

2

ン; R⁴は水素原子または低級アルキル）、

2)式： H N-A¹-NH-C ( = 0)— A²— O— NH (R⁴) (式中、 A¹および A²はそれ

2

ぞれ独立して置換されていてもよい C1— 15アルキレン; R⁴は水素原子または低級ァノレキノレ）、

3)式： H N— A¹— C ( = 0)— NH— A²— O— NH (R⁴) OLE LINK3 (式中、 A¹およ

2

び A²はそれぞれ独立して置換されていてもよい C1— 15アルキレン; R⁴は水素原子または低級アルキル） OLE丄 INK3

4)式： H N— (CH CH O) — A¹— O— NH (R⁴) (式中、 A¹は置換されていてもよい

2 2 2 η

C1— 15アルキレン; R⁴は水素原子または低級アルキル）、

5)式： H N— (CH CH Ο) — A¹— O— A²— O— NH (R⁴) (式中、 A¹および A²はそ

2 2 2 η

れぞれ独立して置換されていてもよい C1— 15アルキレン; R⁴は水素原子または低級アルキル）、

6)式： H N— (CH CH O) -A¹-NH-C ( = 0)— A²— O— NH (R⁴) (式中、 A¹

2 2 2 η

および Α²はそれぞれ独立して置換されて!、てもよ!/、C1— 15アルキレン; R⁴は水素原子または低級アルキル）、

7)式： H N— (CH CH O) -A¹-C ( = 0)— NH— A²— O— NH (R⁴) (式中、 A¹

2 2 2 η

8)式：

[化 14]

(式中、 A¹は C1— 5アルキレン; R⁴は水素原子、低級アルキル、またはァリール；および R¹は— NH (R²) (式中、 R²は水素原子、低級アルキル、ァリールまたはァラルキル ) )、および 9)一般式 (ΠΙ) :

[化 15]

(式中、 A¹は置換されていてもよい CI— 15アルキレン; R⁴は水素原子、低級アルキル、またはァリール）、で表される化合物を含む糖鎖—ペプチド結合剤好ましい。上記 1)〜7)および 9)において、 A¹は、 C3— 8アルキレンが好ましい。また、上記 1)〜9)において、 R⁴は水素原子または低級アルキルが好ましい。

[0016] 本明細書において「流体」は、本発明糖鎖ペプチド結合剤が、糖鎖と相互作用をする環境を提供することができる流体であればどのようなものでも使用することができる。好ましくは、そのような流体はケト基を含む物質は実質的に含まない。なぜなら、ケト基を含む物質が有意に含有されている場合、流体中のアルデヒド基と本発明の物質との反応が充分に進まないからである。したがって、ケト基を含む物質を含まな Vヽ形態は必須ではな、が、好ま、実施形態である。

したがって、本明細書において使用される流体は、糖を環状のへミアセタール型と非環状のアルデヒド型との平衡にもたらすようなものであることが好まし、。そのような流体としては、例えば、水溶液、有機溶媒およびこれらの混合物などが挙げられるがそれに限定されない。好ましくは、流体は水溶液である。

[0017] 本明細書において「トランスグルタミナーゼ」（時に、 TGaseと略す）とは、タンパク質およびペプチド鎖の中のグルタミン残基 (Gin)における γ カルボキシアミド基と、リジン残基 (Lys)における εーァミノ基またはアルキルァミンとの間のァシル転位反応を触媒する酵素をいう。トランスダルタミナーゼは、動物 (種々の組織、血球および血漿)および微生物などに広く分布する。従って、トランスダルタミナーゼは、種々の分子形態をとつているが、その分子形態は多岐にわたる。トランスダルタミナーゼは、生体内においてペプチド鎖間または内の _ε （γ ダルタミル）リジンイソペプチド結合による架橋形成反応を触媒する。トランスダルタミナーゼは Gin残基に対する基質特異性が極めて高いことから、アルキルァミンなどの分子を用いることにより、タンパク質中の特定の Gin残基のみを改変することができる。トランスダルタミナーゼは、フィブリン分子架橋、表皮細胞の角質化、精液凝固および創傷組織の治癒などに関与するといわれている。

トランスダルタミナーゼの存在下、グルタミン含有ペプチドに糖鎖—ペプチド結合剤を作用させることにより、ペプチドのグルタミン残基に糖鎖ペプチド結合剤が容易に導入される。

トランスダルタミナーゼの存在下、システィン含有ペプチドに糖鎖—ペプチド結合剤を作用させることにより、ペプチドのシスティン残基に糖鎖ペプチド結合剤が容易に導入される。

本明細書において「転移酵素」とは、基転移反応を触媒する酵素をいう。本明細書において使用される代表的な転移酵素としては、糖転移酵素があり、糖転移酵素は、糖の転移を触媒する。例示的な糖転移酵素としては、例えば、 β 1, 4—ガラタト— ス転移酵素、 α— 1, 3—ガラタト—ス転移酵素， |81, 4—ガラタト—ス転移酵素， β ΐ , 3—ガラクトース転移酵素， β ΐ, 6—ガラクトース転移酵素、ひ 2, 6 シアル酸転移酵素、ひ1, 4 ガラクトース転移酵素、セラミドガラタトース転移酵素、ひ1, 2 フコース転移酵素、 αΐ, 3 フコース転移酵素、《1, 4 フコース転移酵素、《1, 6— フコース転移酵素、ひ1, 3— Ν ァセチルガラタトサミン転移酵素、ひ1, 6— Ν ァセチルガラタトサミン転移酵素、 j81, 4— N ァセチルガラタトサミン転移酵素、ポリペプチド N ァセチルガラタトサミン転移酵素、 β ΐ, 4 Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β ΐ, 2— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β ΐ, 3—Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β ΐ, 6— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 αΐ, 4— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β ΐ, 4 マンノース転移酵素、《1, 2 マンノース転移酵素、《1 , 3—マンノース転移酵素、 αΐ, 4—マンノース転移酵素、 αΐ, 6—マンノース転移酵素、 αΐ, 2 グルコース転移酵素、 αΐ, 3 グルコース転移酵素、 α 2, 3 シァル酸転移酵素、 α2, 8 シアル酸転移酵素、《1, 6—ダルコサミン転移酵素、《1, 6—キシロース転移酵素、 /3キシロース転移酵素（プロテオダリカンコア構造合成酵素）、 j81, 3 グルクロン酸転移酵素およびヒアルロン酸合成酵素が挙げられるがそれらに限定されない。

[0019] 本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものを、う。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸の L—異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、ァラニン、ノリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチォニン、トレオニン、フエニノレアラニン、チロシン、トリプトファン、システィン、プロリン、ヒスチジン、ァスパラギン酸、ァスノラギン、グルタミン酸、グルタミン、 —カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オル二チン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸は L 体であるが、 D体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラー-トロフエ-ルァラニン、ホモフエ-ルァラニン、パラ一フルオロフェ-ルァラニン、 3—アミノー 2—ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンの D体または L体および D—フエ-ルァラニンが挙げられる。「アミノ酸ァナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および Zまたは機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、ェチォニン、カナバニン、 2—メチルダルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいうアミノ酸は、その一般に公知の 3文字記号力、または IUPAC— IUB Biochemica 1 Nomenclature Commissionにより推奨される 1文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。

[0020] 本明細書において「生物学的活性」および「生理活性」は、本明細書において互換的に使用され、ある因子 (例えば、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能 (例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、 2つの因子が相互作用する（例えば、インスリンが肝臓などにおけるインスリンレセプターに作用する）場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによつて生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、 2分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。また、神経突起の伸展を指標にしてある分子と他の分子とが機能的に関連していると関連付けることができる。具体的には、インスリンの血糖低下作用を確認することなどを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。

本明細書において「生理活性物質」は、上述のような生物学的活性を有する任意の物質をいう。そのような物質としては、例えば、酵素、抗体、ワクチン、血清タンパク質、ホルモン、サイト力イン、増殖因子、細胞接着分子、レセプター、シグナル伝達因子などが挙げられるがそれに限定されない。

本明細書にぉ、て「活性」は、結合 (直接的または間接的の、ずれか)を示すかまたは明らかにする力 ;応答に影響する (すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。このような活性は、競合阻害のようなアツセィによつて測定され得る。

本明細書中で使用される用語「結合」は、 2つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介する力または起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。 [0022] 本明細書においては、特に言及がない限り、「置換」は、ある有機化合物または置換基中の 1または 2以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を 1つ除去して 1価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を 2つ除去して 2価の置換基に置換することも可能である。

本明細書において「アルキル」とは、メタン、ェタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（アルカン)力も水素原子が一つ失われて生ずる 1価の基をいい、一般に C H

n 2n+ l 一で表される（ここで、 nは正の整数である)。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってアルキルの Hが置換されたアルキルをいう。これらの具体例は、 C1〜C2アルキル、 C1〜C3アルキル、 C1〜C4アルキル、 C1〜C5アルキル、 C1〜C6アルキル、 C1 〜C7アルキル、 C1〜C8アルキル、 C1〜C9アルキル、 C1〜C10アルキル、 Cl〜 C11アルキルまたは C1〜C12アルキル、 C1〜C2置換されたアルキル、 C1〜C3置換されたアルキル、 C1〜C4置換されたアルキル、 C1〜C5置換されたアルキル、 C 1〜C6置換されたアルキル、 C1〜C7置換されたアルキル、 C1〜C8置換されたァルキル、 C1〜C9置換されたアルキル、 C1〜C10置換されたアルキル、 C1〜C11 置換されたアルキルまたは C1〜C 12置換されたアルキルであり得る。ここで、例えば C 1〜C 10アルキルとは、炭素原子を 1〜 10個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味し、メチル（CH—）、ェチル（C H一）、 n—プロピル（CH CH CH—）、イソ

3 2 5 3 2 2 プロピル（（CH ) CH―)、 n—ブチル（CH CH CH CH―)、 n—ペンチル（CH C

3 2 3 2 2 2 3

H CH CH CH一）、 n—へキシル（CH CH CH CH CH CH一）、 n—ヘプチル

2 2 2 2 3 2 2 2 2 2

(CH CH CH CH CH CH CH― )、 n—ォクチル（CH CH CH CH CH CH C

3 2 2 2 2 2 2 3 2 2 2 2 2

H CH ―)、 n—ノニル（CH CH CH CH CH CH CH CH CH ―)、 n—デシル

2 2 3 2 2 2 2 2 2 2 2

(CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH一）、 C (CH ) CH CH CH (C

3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2 2 2

H ) 、— CH CH (CH ) などが例示される。また、例えば、 C1〜C10置換されたァ

3 2 2 3 2

ルキルとは、 C1〜C10アルキルであって、そのうち 1または複数の水素原子が置換基により置換されて、るものを、う。

[0023] 本明細書において、「低級アルキル」は、好ましくは、 C1〜C6アルキルであり、より好ましくは、 C1〜C3アルキルである。本明細書中、「アルキレン」とは、「アルキル」から導かれる 2価の基であって、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、へキサメチレン、ヘプタメチレン、才クタメチレン、ノナンメチレン、デカンメチレン、ゥンデカメチレン、ドデカメチレン等が挙げられる。

本明細書において「ァルケ-ル」とは、エチレン、プロピレンのような、分子内に二重結合を一つ有する脂肪族炭化水素力水素原子が一つ失われて生ずる 1価の基をいい、一般に C H 一で表される（ここで、 nは 2以上の正の整数である）。「置換さ

n 2n_ l

れたァルケ-ル」とは、以下に規定する置換基によってァルケ-ルの Hが置換されたァルケ-ルをいう。具体例としては、 C2〜C3アルケ-ル、 C2〜C4アルケ-ル、 C2 〜C5アルケニル、 C2〜C6ァルケ-ル、 C2〜C7ァルケ-ル、 C2〜C8アルケ -ル、 C2〜C9ァルケ-ル、 C2〜C10ァルケ-ル、じ2〜じ11ァルケ-ルまたはじ2〜じ12 ァルケ-ル、 C2〜C3置換されたァルケ-ル、 C2〜C4置換されたァルケ-ル、 C2 〜C5置換されたァルケ-ル、 C2〜C6置換されたァルケ-ル、 C2〜C7置換されたァルケ-ル、 C2〜C8置換されたァルケ-ル、 C2〜C9置換されたァルケ-ル、 C2 〜C 10置換されたァルケ-ル、じ2〜じ11置換されたァルケ-ルまたはじ2〜じ12置換されたァルケ-ルであり得る。ここで、例えば C2〜C10アルキルとは、炭素原子を 2〜： L0個含む直鎖または分枝状のァルケ-ルを意味し、ビュル (CH =CH— )、ァリ

2

ル（CH =CHCH―)、 CH CH = CH—などが例示される。また、例えば、 C2〜C

2 2 3

10置換されたァルケ-ルとは、 C2〜C10ァルケ-ルであって、そのうち 1または複数の水素原子が置換基により置換されて、るものを、う。

本明細書中、「ァルケ-レン」とは、「ァルケ-ル」から導かれる 2価の基であって、例えば、ビ-レン、プロべ-レン、ブテ-レン等が挙げられる。

本明細書において「アルキニル」とは、アセチレンのような、分子内に三重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる 1価の基を、い、一般に C H 一で表される（ここで、 nは 2以上の正の整数である）。「置換されたアル n 2n_3

キ -ル」とは、以下に規定する置換基によってアルキ-ルの Hが置換されたアルキ- ルをいう。具体例としては、 C2〜C3アルキ-ル、 C2〜C4アルキ-ル、 C2〜C5アルキ -ル、 C2〜C6アルキ-ル、 C2〜C7アルキ-ル、 C2〜C8アルキ-ル、 C2〜C9 アルキ -ル、 C2〜C10アルキ-ル、 C2〜C11アルキ-ル、 C2〜C12アルキニル、 C2〜C3置換されたアルキ-ル、 C2〜C4置換されたアルキ-ル、 C2〜C5置換されたアルキ-ル、 C2〜C6置換されたアルキ-ル、 C2〜C7置換されたアルキ-ル、 C 2〜C8置換されたアルキ-ル、 C2〜C9置換されたアルキ-ル、 C2〜C10置換されたアルキ-ル、 C2〜C11置換されたアルキ-ルまたは C2〜C12置換されたアルキ -ルであり得る。ここで、例えば、 C2〜C10アルキ-ルとは、例えば炭素原子を 2〜1 0個含む直鎖または分枝状のアルキ-ルを意味し、ェチュル（CH≡C—）、 1 プロピニル（CH C≡C )などが例示される。また、例えば、 C2〜C10置換されたアルキ

3

ニルとは、 C2〜C10アルキ-ルであって、そのうち 1または複数の水素原子が置換基により置換されて、るものを、う。

本明細書にぉ、て「アルキ-レン」とは、「アルキ -ル」から導かれる 2価の基であつて、例えば、プロピ-レン、プチ-レン等が挙げられる。

本明細書において、「置換されていてもよい C1 15アルキレン」、「置換されていてもよい C2— 15ァルケ-レン」または「置換されて!、てもよ!/ヽ C2— 15アルキ-レンの置換基としては、置換基群 Aから選択される置換基により置換されて、てもよ、ァリール、置換基群 Aから選択される置換基により置換されていてもよいへテロアリール、置換基群 Aカゝら選択される置換基により置換されていてもよい非芳香族炭素環式基、置換基群 Aから選択される置換基により置換されていてもよい非芳香族複素環式基、ヒドロキシ、アルキルォキシ、メルカプト、アルキルチオ、ハロゲン、ニトロ、シァ入力ルボキシ、アルキルォキシカルボ-ル、ハロアルキル、ハロアルキルォキシ、置換されていてもよいアミ入置換されていてもよいアミノカルボ-ル、ァシル、ァシルォキシ、ァリールォキシ（例えば、フエ-ルォキシ）、ァラルキルォキシ（例えば、ベンジルォキシ）、低級アルキルスルホニル、グァ-ジノ、ァゾ基等が挙げられる。これらは、全ての可能な位置で 1個以上置換しうる。

本明細書にぉヽて、「置換基群 Aから選択される置換基により置換されて、てもよ V、」とは、以下の置換基群 Aにより 1またはそれ以上置換されて、てもよ、ことを意味する。

置換基群 A：アルキル、ヒドロキシ、アルキルォキシ、メルカプト、アルキルチオ、ハロゲン、ニトロ、シァ入カルボキシ、アルキルォキシカルボ-ル、ハロアルキル、ハロアルキルォキシ、置換されていてもよいアミ入置換されていてもよいアミノカルボ-ル、ァシル、ァシルォキシ、ァリールォキシ（例えば、フエ-ルォキシ）、ァラルキルォキシ (例えば、ベンジルォキシ）、低級アルキルスルホニル、グァ-ジノ、ァゾ基、置換基群 B力選択される置換基により置換されて、てもよ、ァリール、置換基群 Bから選択される置換基により置換されて、てもよ、ヘテロァリール、置換基群 Bから選択される置換基により置換されてヽてもよヽ非芳香族炭素環式基、および置換基群 Bから選択される置換基により置換されてヽてもよヽ非芳香族複素環式基。

本明細書において、「置換基群 B力選択される置換基により置換されていてもよい」とは、以下の置換基群 Bにより 1またはそれ以上置換されて、てもよ、ことを意味する。

置換基群 B :アルキル、ヒドロキシ、アルキルォキシ、メルカプト、アルキルチオ、ハロゲン、ニトロ、シァ入カルボキシ、アルキルォキシカルボ-ル、ハロアルキル、ハロアルキルォキシ、置換されていてもよいアミ入置換されていてもよいアミノカルボ-ル、ァシル、ァシルォキシ、ァリールォキシ（例えば、フエ-ルォキシ）、ァラルキルォキシ (例えば、ベンジルォキシ）、低級アルキルスルホニル、グァ-ジノ、ァゾ基、ァリール、ヘテロァリール、非芳香族炭素環式基、および非芳香族複素環式基。

本明細書において「ァリール」とは、芳香族炭化水素の環に結合する水素原子が 1 個離脱して生ずる基をいい、本明細書において、「炭素環基」に包含される。例えば、フエ-ル、 a—ナフチル、 13—ナフチル、アンス-ル、インデュル、フエナンスリル等が挙げられる。「置換されたァリール」とは、下記において選択される置換基で置換されて、るァリールを意味する。

本明細書において、「保護基」は、アミノ基およびィミノ基の保護基である場合、ベンジル、ベンゾィル、ァセチル、 t ブトキシカルボニル、ベンジルォキシカルボニルが挙げられる。ァセチルが好ましい。保護反応および脱保護反応は、 Protective uroups in Organic Synthesis, Theodora W ureen (John Wiley & Sons)等【こ ci載の方法に従って行うことができる。

本明細書において、 Cl、 C2、、、 Cnは、炭素数を表す。従って、 C1は炭素数 1個の置換基を表すために使用される。

[0027] 本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の 1または 2以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を 1つ除去して 1価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を 2つ除去して 2価の置換基に置換することも可能である。

置換基としては、アルキル、シクロアルキル、ァルケ-ル、シクロアルケ-ル、アルキ -ル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、シァノ、ニトロ、ァミノ、カルボキシ、力ルバモイル、ァシル、ァシルァミノ、チォカルボキシ、アミド、カルボ-ル、チォカルボ-ル、スルホ-ルまたはスルフィエルが挙げられるがそれらに限定されない。置換基が置換された場合は、アルキル、シクロアルキル、ァルケ -ル、シクロアルケ-ル、アルキ -ル、アルコキシ、ァルケ-ルォキシ、アルキ -ルォキシ、アルコキシアルキル、ハロゲノアルキル、ハロゲン、ニトロ、シァ入ァシル、ァシルォキシ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、チォカルボキシ、アルコキシカルボ- ル、ァリールォキシカルボ-ル、力ルバモイル、置換されていてもよいァミノで置換され得る。この「置換されていてもよいァミノ」は、アルキル、ァルケ-ル、ァリールまたはァリールアルキルで 1または 2ケ所置換されて、てもよ、ァミノを意味する。

[0028] (有機化学）

有機化学については、例えば、モリソンボイド有機化学 (上）（中）（下)第 5版 (東京化学同人発行（1989年））、 March, Advanced Organic Chemstry 第 4版（ Wiley Intersience, JOHN WILEY & SONS, 1992)などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。

本明細書において「保護反応」とは、 Boc (t—ブトキシカルボ-ル）、ァセチル、ベンジル、 Cbz (ベンジルォキシカルボ-ル）、 Fmoc (9—フルォレ -ルメトキシカルボニル)のような保護基を、保護が所望される官能基に付加する反応をいう。保護基により官能基を保護することによって、より反応性の高い官能基の反応を抑制し、より反応性の低、官能基のみを反応させることができる。

本明細書にぉ、て「脱保護反応」とは、上で列挙したような保護基を脱離させる反応をいう。脱保護反応としては、 Boc (t—ブトキシカルボ-ル）に対してはトリフルォロ酢酸 (TF A)による反応およびべンジルエーテルに対しては H、 PdZCを用いる還

2

元反応のような反応が挙げられる。「保護反応」および「脱保護反応」については、例えば、 T. W. Greeneおよび P. G. M. Wuts、 PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS、第 3版 (JOHN WILE Y& SONS, Inc. (1999) )に詳細に記載され、その内容は、本明細書中に参考として援用される。

(本明細書にぉ、て用いられる一般技術）

本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、分析化学、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。

本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、 Maniatis, T. e t al. (,1989) . Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring

Harborおよびその 3rd Ed. (2001)； Ausubel, F. M. , et al. eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. , NY, 101 58 (2000) ;Innis, M. A. (1990) . PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Academic Press ;Innis, M. A. et al. (1995) . PCR St rategies, Academic Press ; Sninsky, J. J. et al. "999) . PCR Application s : Protocols for Functional Genomics, Academic Press ; Gait, M. J. ( 1985) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, IRL Press ; G ait, M. J. (1990) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, IR L Press ; Eckstein, F. (1991) . Oligonucleotides and Analogues : A Prac tical Approac , IRL Press ; Adams, R. L. et al. (1992) . The Biochemis try of the Nucleic Acids, Chapman & Hall； Shabarova, Z. et al. (19 94) . Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim ; Blac kburn, G. M. et al. (1996) . Nucleic Acids in Chemistry and Biology , Oxford University Press； Hermanson, G. T. (1996) . Bioconjugate Te chniques, Academic Press ; Method in Enzymology 230、 242、 247、 Ac ademic Press, 1994 ;別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1 997 ;畑中、西村ら、糖質の科学と工学、講談社サイェンティフイク、 1997 ;糖鎖分子の設計と生理機能日本化学会編、学会出版センター、 2001などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分 (全部であり得る）が参考として援用される (遺伝子、タンパク質分子などの改変）

あるタンパク質分子 (例えば、インスリンなど）において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはその DNAコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変力本明細書にぉ、て開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応する DNAにお!/、て行われ得る。

上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Kyte. Jおよび Doolittle, R. F. J. Mol. Bi ol. 157 (1) : 105 - 132, 1982)。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子 (例えば、酵素、基質、レセプター、 DNA、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは:イソロイシン（ +4. 5)；バリン（+4. 2)；ロイシン（ + 3. 8)；フエ-ルァラニン（ + 2. 8)；システィン Zシスチン（ + 2. 5)；メチォニン（ + 1. 9)；ァラニン（ + 1. 8)；グリシン（一0. 4)；スレォニン（一 0. 7) ;セリン（一0. 8)；トリプトファン（一0. 9) ;チロシン（一1. 3) ;プロリン (— 1. 6) ;ヒスチジン（一3. 2)；グノレタミン酸（一 3. 5)；グノレタミン（一3. 5) ;ァスパラギン酸（一3. 5)；ァスパラギン（一3. 5) ;リジン（一3. 9)；およびアルギニン（一4. 5) )である。

あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質 (例えば、酵素活性において等価なタンパク質)を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがより好ましぐおよび ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなァミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第 4, 554, 101号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられて!/、る：アルギニン（ + 3. 0)；リジン（ + 3. 0)；ァスパラギン酸（ + 3. 0± 1)；グルタミン酸（+ 3. 0± 1)；セリン（ + 0. 3)；ァスパラギン（ + 0. 2)；グルタミン（ + 0. 2)；グリシン（0)；スレオニン（一0. 4)；プロリン（一0. 5± 1)；ァラニン（一0. 5)；ヒスチジン（一0. 5)；システィン（一1. 0)；メチォニン（一1. 3)；バリン（一 1. 5)；ロイシン（一1. 8)；ィソロイシン（一 1. 8) ;チロシン（一2. 3)；フエ-ルァラニン（一2. 5)；およびトリプトファン（ 3. 4)。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがより好ましぐおよび ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。

本明細書にぉ、て、「保存的置換」とは、アミノ酸置換にぉ、て、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または Zおよび疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数力 ± 2以内のもの同士、好ましくは ± 1以内のもの同士、より好ましくは ±0. 5以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換:アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびァスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびァスパラギン；ならびにパリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書において、「改変体」とは、もとのペプチドまたはポリペプチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮 (truncated)改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはペプチドに対して、 1または数個の置換、付加および Zまたは欠失、あるいは 1つ以上の置換、付加および Zまたは欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。対立遺伝子 (all ele)とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従つて、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ (homol og)」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性 (好ましくは、 60%以上の相同性、より好ましくは、 80%以上、 85%以上、 90 %以上、 95%以上の相同性）を有するものをいう。 BLASTなるソフトを用いて相同性を計算することが出来る。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ortholog)」とは、オルソロガス遺伝子（orthologous gene)ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先力の種分ィ匕に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスの αヘモグロビン遺伝子はオルソログである力ヒトの αヘモグロビン遺伝子および j8ヘモグロビン遺伝子はパラログ (遺伝子重複で生じた遺伝子)である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種において、もとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。

本明細書にぉ、て「保存的（に改変された)改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がァミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドン GCA、 GCC、 GCG、および GCUはすべて、アミノ酸ァラニンをコードする。したがって、ァラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなぐ記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の 1つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチォニンのための唯一のコドンである AUG、および通常トリプトフアンのための唯一のコドンである TGGを除く） 1S 機能的に同一な分子を産生するため〖こ改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、 DNAポリメラーゼ、 Klenowフラグメント、 DNAリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法； Mark Zoller and Michael Smith, Me thods in Enzymology, 100, 468— 500 (1983) )力挙げ、られる力この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。

本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを 1つ以上、例えば、 1〜： L0個、好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に 1つ以上、例えば、 1〜10個、好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから 1つ以上、例えば、 1〜 10個、好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸を欠失させることをいう。ァミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、短縮化、脂質化 (lipi dation)、ホスホリル化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、ァシル化（例えば、ァセチル化)などを含む力これらに限定されない。置換、または付加されるァミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよぐ非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。

本明細書において使用される用語「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも 1つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、 1つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる

。ペプチドアナログは、その機能力もとのペプチドの機能 (例えば、 _PKa値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。

本明細書において使用される核酸分子は、発現されるペプチドが天然型のぺプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよぐあるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、 5'末端および Zまたは 3'末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ペプチドをコードする遺伝子をストリンジヱントな条件下でノ、イブリダィズし、そのペプチドと実質的に同一の機能を有するペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。

このような核酸は、周知の PCR法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダィゼーシヨン法などを組み合わせてもよい。

本明細書にぉ、て、ペプチドまたはポリペプチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのペプチドまたはポリペプチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物力置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、 1つ以上であれば任意の数でよぐそのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体にぉ、て目的とする機能 (例えば、ホルモン、サイト力インの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、 1または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの 20%以内、 10%以内、または 100個以下、 50個以下、 25個以下などであり得る。

(遺伝子工学）

本発明におヽて用いられる生理活性ペプチドなどならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。

本明細書にぉ、て遺伝子にっ、て言及する場合、「ベクター」または「組み換えべクタ一」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるべクタ一をいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への糸且込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クロー-ングベクター」という。そのようなクロー-ングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローユング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローユング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献 (例えば、 Sambrookら、前出）に記載されている。好ましいベクタ一としては、プラスミド、ファージ、コスミド、ェピソ一ム、ウィルス粒子またはウィルスおよび組み込み可能な DNAフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられる力これらに限定されない。好ましいウィルス粒子としては、アデノウイルス、バキュロウィルス、パルボウイルス、ヘルぺスウィルス、ボックスウィルス、アデノ随伴ウィルス、セムリキ森林ウィルス、ワクシニアウィルスおよびレトロウイルスが挙げられる力これらに限定されない。

ベクターの 1つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなる DNAセグメントが連結され得る環状二重鎖 DNAループをいう。別の型のベクターは、ウィルスベクターであり、ここで、さらなる DNAセグメントは、ウィルスゲノム中に連結され得る。特定のベタター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびェピソ一ム哺乳動物べクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非ェピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクタ一は、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクタ一は、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。

従って、本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターにカ卩えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネータ一、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、ェンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類力宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。

本発明において用いられ得る原核細胞に対する「組み換えベクター」としては、 pc DNA3 ( + )、 pBluescript— SK( + Z一）、 pGEM— T、 pEF— BOS、 pEGFP、 p HAT、 pUC18、 pFT— DESTTM42GATEWAY(Invitrogen)などが例示される本発明において用いられ得る動物細胞に対する「組み換えベクター」としては、 pc DNAI/Amp, pcDNAI、 pCDM8 (いずれもフナコシより巿販）、 pAGE107 [特開平 3— 229 (Invitrogen)、 pAGE103 Q[. Biochem. , 101, 1307 (1987) ]、 ρΑΜ o、pAMoAQ[. Biol. Chem. , 268, 22782— 22787 (1993) ]、マウス幹細胞ウイルス（Murine Stem Cell Virus) (MSCV)に基づいたレトロウイルス型発現べクター、 pEF— BOS、 pEGFPなどが例示される。

本明細書において「ターミネータ一」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、 DNAが mRNAに転写される際の転写の終結、ポリ A配列の付加に関与する配列である。ターミネータ一は、 mRNAの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られて、る。

本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節する DNA上の領域をいい、通常 RNAポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」と、う。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第 1ェキソンの上流約 2kbp以内の領域であることが多いので、 DNA解析用ソフトウェアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一ェキソン翻訳開始点力も上流約 2kbp以内に存在する。

本明細書において「複製起点」とは、 DNA複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウィルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明の DNAとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素 (DHFR) またはチミジンキナーゼである（米国特許第 4, 399, 216号を参照)。

例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現することによって、組換え哺乳動物発現ベクターでは、特定の細胞型において核酸の発現を優先的に指向し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、発生的に調節されたプロモーター（例えば、マウス hoxプロモーター（Kesselおよび Gruss ( 1990) Science 249, 374— 379)および α—フエトプロテインプロモーター（Campesおよび Tilghman ( 1989) Genes De v. 3, 537— 546) )、アルブミンプロモーター（肝臓特異的； Pinkertら（1987) Gene s Dev. 1, 268— 277)、リンパ特異的プロモーター（Calameおよび Eaton(1988) Adv. Immunol. 43, 235— 275)、特に T細胞レセプター（Winotoおよび Baltimo re (1989) EMBO J. 8, 729— 733)および免疫グロブリン（Banerjiら（1983) Cell

33, 729— 740 ; Queenおよび Baltimore (1983) Cell 33, 741— 748)のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経線維プロモーター； Byrne および Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5473— 5477)、脾臓特異的プロモーター（Edlundら（1985) Science 230, 912— 916)、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第 4, 873, 316号および欧州出願公開番号 264, 166)が挙げられるがそれらに限定されない。

[0038] 本明細書にぉ、て「ェンノヽンサ一」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなェンノ、ンサ一は当該分野において周知である。ェンハンサ一は複数個用いられ得るが 1個用いられてもよ!/、し、用いなくともよ!/、。

本明細書にぉ、て「作動可能に連結された (る）」とは、所望の配列の発現 (作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、ェンノ、ンサ一など)または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置される力必ずしも隣接して配置される必要はな、。

本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよぐ例えば、形質転換、形質導入、トランスフエクシヨンなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、 Ausubel F. A.ら編 (1988)、 Current Protocols in Molecular Biol ogy、 Wiley、 New York、 NY; Sambrook Jら（1987) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed.およびその第三版， Cold Spring Harbor La boratory Press, Cold Spring Harbor, NY、別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンプロット、ウェスタンプロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。

また、ベクターの導入方法としては、細胞に DNAを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフエクシヨン、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 DEAEデキストラン法、エレクトロボレーシヨン法、パーティクルガン (遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。

[0039] 本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。本発明にお！ヽて遺伝子操作などにお！ヽて原核生物細胞が使用される場合、原核生物糸田胞としては、 Escherichia属、 Serratia属、 Bacillus属、 Brevibacterium属、 Corynebacterium,禺、 Microbacterium晨、 Pseudomonas厲などに属す原核生物細胞、例えば、 Escherichia coli XL 1— Blueゝ Escherichia coli XL2— B lueゝ Escherichia coli DH1、 BL— 21、 JM109が例示される。

本明細書において使用される場合、動物細胞としては、マウス'ミエローマ細胞、ラット.ミエローマ細胞、マウス'ノ、イブリドーマ細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞である CHO細胞、 BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、 HBT563 7 (特開昭 63— 299)、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス'ミエローマ細胞としては、 ps20、 NSOなど、ラット 'ミエローマ細胞としては YB2Z0など、ヒト胎児腎臓細胞としては HEK293 (ATCC : CRL— 1573)など、ヒト白血病細胞としては BALL— 1など、アフリカミドリザル腎臓細胞としては COS— 1、 COS— 7、ヒト結腸癌細胞株としては HCT— 15、ヒト神経芽細胞腫 SK—N— SH、 SK—N— SH— 5Y、マウス神経芽細胞腫 Neuro2Aなどが例示される。

本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、 DNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレタトロポレーシヨン法 [Methods. Enzymol. , 194, 182 (1990) ]、リポフエクシヨン法、スフエロプラスト法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978) ]、酢酸リチウム法 Q[. Bacteriol. , 153, 163 (1983) ]、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 5, 1929 (1978)記載の方法などが例示される。

本明細書において、レトロウイルスの感染方法は、例えば、 Current Protocols i n Molecular Biology 前出（特に Units 9. 9— 9. 14)などに記載されるように、当該分野において周知であり、例えば、トリプシナイズして胚性幹細胞を単一細胞懸淘物 ^single— cell suspension)【こした後、ウイノレス産生糸田胞 (virus― producing cells) (パッケージング細胞株 = packaging cell lines)の培養上清と一緒に 1〜 2時間共培養 (co— culture)することにより、十分量の感染細胞を得ることができる。本明細書において使用されるゲノムまたは遺伝子座などを除去する方法において用いられる、 Cre酵素の一過的発現、染色体上での DNAマッピングなどは、細胞ェ学別冊実験プロトコールシリーズ「FISH実験プロトコールヒト 'ゲノム解析力染色体 ·遺伝子診断まで」松原謙一、吉川寛監修秀潤社 (東京)などに記載されるように、当該分野において周知である。

本明細書において遺伝子発現 (たとえば、 mRNA発現、ポリペプチド発現)の「検出」または「定量」は、例えば、 mRNAの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットプロット法または PCR法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いる ELISA法、 RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、 ELISA法または RIA法などが例示される。アレイ（例えば、 DNAアレイ、プロティンアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。 DNAアレイにっ、ては、（秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新 PCR法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、 Nat Genet. 2002 Dec ; 32 Suppl: 526 —32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述にカ卩えて、 RT— PCR、 RACE法、 SSCP法、免疫沈降法、 two— hybridシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法 · 中村祐輔ラボ'マ-ユアル、編集'中村祐輔羊土社 (2002)などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。本明細書において「発現量」とは、対象となる細胞などにおいて、ポリペプチドまたは mRNAが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いて ELISA法、 RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、 PCR法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリべプチドの mRNAレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変ィ匕」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたは mRNAレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。本明細書にぉ、て「上流」と、う用語は、特定の基準点力ポリヌクレオチドの 5 '末端に向カゝぅ位置を示す。

本明細書にぉ、て「下流」と、う用語は、特定の基準点力もポリヌクレオチドの 3 '末端に向カゝぅ位置を示す。

[0042] 本明細書において「塩基対の」および「Watson & Crick塩基対の」という表現は、本明細書では同義に用いられ、二重らせん状の DNAにおいて見られるものと同様に、アデニン残基が 2つの水素結合によってチミン残基またはゥラシル残基と結合し、 3つの水素結合によってシトシン残基とグァニン残基とが結合するという配列の正体に基づいて互いに水素結合可能なヌクレオチドを示す（Stryer, L. , Biochemistry, 4t h edition, 1995を参照）。

本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドと Watson & Crick塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第 1のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第 1のポリヌクレオチドは第 2のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、 Aと T (あるいは Aと U )、または Cと Gである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、 2つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。

[0043] (ペプチドの製造方法）

本発明で使用するペプチド (例えば、インスリンまたはその改変体もしくはフラグメントなど）をコードする DNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞などに由来する形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明のポリべプチドを生成蓄積させ、本発明の培養物より本発明のペプチドを採取することにより、本発明に係るペプチドを製造することができる。

本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原核生物ある、は酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地の!/、ずれを用いてもょ、。

[0044] 炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラタトース、スクロース、グリセロール、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の各種無機酸または有機酸のアンモ-ゥム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼィン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。

無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシゥム等を用いることができる。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。

[0045] 培養温度は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 5時間〜 7日間である。培養中 pH は、 3. 0〜9. 0に保持する。 pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、 lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル一 β—D—チォガラタトピラノシド等を、 trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した細胞または器官は、ジャーフアーメンターを用 V、て大量培養することができる。

例えば、動物細胞を用いる場合、本発明の細胞を培養する培地は、一般に使用されている RPMI 1640培地（The Journal of the American Medical Associ ation, 199, 519 (1967) )、 Eagleの MEM培地（Science, 122, 501 (1952) )、 DMEM培地（Virology, 8, 396 (1959) )、 199培地（Proceedings of the So ciety for the Biological Medicine, 73, 1 (1950) )またはこれら培地にゥシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。

培養は、通常 pH6〜8、 25〜40°C、 5%C02存在下等の条件下で 1〜7日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

本発明に使用するペプチドをコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物から、本発明に使用するペプチドを単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の通常の酵素の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明に使用するペプチドが本発明のペプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明に使用するペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジェチルアミノエチル (DEAE) - Sepharose 、 DIAION HPA— 75 (三菱ィ匕学)等榭脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S— Sepharose FF (Pharmacia)等の榭脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィ一法、ブチルセファロース、フエ-ルセファロース等の榭脂を用いた疎水性クロマトグラフィ一法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。

本発明に使用するペプチド (例えば、インスリンなど）が本発明に使用するペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジェチルァミノェチル（DEAE) - Sepharose, DIAION HPA— 75 (三菱化学）等榭脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S— Sepharose FF (Pharmacia)等の榭脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フエ-ルセファロース等の榭脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィ-ティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。

[0047] 本発明に使用するペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本発明のポリペプチドを回収後、そのポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。この可溶ィ匕液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリぺプチド変性剤の濃度がペプチドが変性しな、程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明に使用するペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。

また、通常のタンパク質の精製方法 Q[. Evan. Sadlerら： Methods in Enzymol ogy, 83, 458]に準じて精製できる。また、本発明に使用するペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用 Vヽたァフィ-ティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる [山川彰夫，実験医学（Experimental Medicine) , 13, 469— 474 (1995) ]。例えば、 Loweらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 86, 8227— 8231 (1989)、 GenesDev elop. , 4, 1288 (1990) ]に記載の方法に準じて、本発明に使用するペプチドをプ口ティン Aとの融合タンパク質として生産し、ィムノグロブリン Gを用いるァフィユティークロマトグラフィーにより精製することができる。

[0048] また、本発明に使用するペプチドを FLAGペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗 FLAG抗体を用いるァフィユティークロマトグラフィーにより精製することができる [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop. , 4, 1288 (1990) ]。このような融合タンパク質では、発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位は、融合タンパク質の精製に続いて、融合部分力ゝらの組換えタンパク質の分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入される。このような酵素およびこれらの同族の認識配列は、第 Xa因子、トロンビン、およびェンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、ダルタチオン一 S トランスフェラーゼ（GST)、マルトース E結合タンパク質、またはプロテイン Aを標的組換えタンパク質に融合する、 pGEX (Pharmacia Biotech; Smithおよび Johnson (1988) Gene 67, 31〜40)、 pMAL (New England Biolabs, Bev erly, Mass. )および pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N. J. )が挙げられる。さらに、本発明に使用するペプチド自身に対する抗体を用、たァフィ-ティークロマトグラフィ一で精製することもできる。本発明に使用するペプチドは、公知の方法 ϋ. Biomolecular NMR, 6, 129— 134、 Science, 242, 1162— 1164、 Bioche m. , 110, 166— 168 (1991) ]に準じて、 in vitro転写 ·翻訳系を用いてを生産することがでさる。

本発明に使用するペプチドは、そのアミノ酸情報を基に、 Fmoc法 (フルォレニルメチルォキシカルボ-ル法）、 tBoc法（t ブチルォキシカルボ-ル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、 Advanced ChemTech, Applied Bios ystems、 Pharmacia Biotech、 Protein echnology Instrument^ Synthec ell-Vega, PerSeptive,島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することちでさる。

精製した本発明に使用するペプチドの構造解析は、タンパク質ィ匕学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローユングのためのタンパク質構造解析 (平野久著、東京化学同人発行、 1993年）に記載の方法により実施可能である。本発明に使用するぺプチドの生理活性は、公知の測定法に準じて測定することができる。

本発明にお、て有用な可溶性ペプチドの産生もまた、当該分野で公知の種々の方法によって達成され得る。例えば、ペプチドは、ェキソぺプチダーゼ、エドマン分解またはその両方と組み合わせて特定のエンドべプチダーゼを使用することによるタンパク質分解によって、インタタトな膜貫通 P75ポリペプチド分子力も誘導され得る。このィンタタトな P75ペプチド分子は、従来の方法を使用して、その天然の供給源から精製され得る。あるいは、インタタトな p75ペプチドは、 cDNA、発現ベクターおよび組換え遺伝子発現のための周知技術を利用する組換え DNA技術によって生成され得る好ましくは、本発明において有用な可溶性ペプチドは、直接的に産生され、従って、出発材料としての p75ペプチド全体の必要性を排除する。これは、従来の化学合成技術によって達成され得る力、または周知の組換え DNA技術 (ここで、所望のぺプチドをコードする DNA配列のみが形質転換された宿主で発現される）によって達成され得る。例えば、所望の可溶性 p75ペプチドをコードする遺伝子は、オリゴヌタレォチド合成機を使用する化学的手段によって合成され得る。このようなオリゴヌクレオチドは、所望の可溶性 p75ペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計される。所望のぺプチドをコードする特定の DNA配列はまた、特定の制限エンドヌクレアーゼフラグメントの単離によって力、または cDNAからの特定の領域の PCR合成によって、全長 D NA配列から誘導され得る。

[0050] (改変体ペプチドの製造方法）

本発明に使用するペプチド (例えば、インスリンなど）のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加 (融合を含む）は、周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。力かる 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付カ卩は、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor

Laboratory Press (1989)、 Current Protocols in Molecular Biology, S upplement 1〜38, JohnWiley & Sons (1987— 1997)、 Nucleic Acids R esearch, 10, 6487 (1982) , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 79, 6409 (1982 ) , Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Pr oc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. , USA , 81, 5662 (1984)、 Science, 224, 1431 (1984)、 PCT WO85/00817 (19 85)、 Nature, 316, 601 (1985)等に記載の方法に準じて調製することができる。

[0051] (医薬組成物）

別の局面において、本発明は、医薬 (例えば、ワクチン等の医薬品、健康食品、タンパク質または脂質は抗原性を低減した医薬品）およびィ匕粧品に関する。この医薬およびィ匕粧品は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。

そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および/または薬学的アジュバント挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、化合物、またはその改変体もしくは誘導体を、 1つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。

本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クェン酸塩、または他の有機酸;ァスコルビン酸、 a トコフエロール;低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清ァルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビュルピロリドン）；アミノ酸 (例えば、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、 EDTA)；糖アルコール (例えば、マン-トールまたはソルビトール）；塩形成対イオン (例えば、ナトリウム）；ならびに Zあるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、 Tween、プル口ニック (pluronic)またはポリエチレングリコール（PEG) )。

例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤 (例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、 pH7. 0— 8. 5の Tris緩衝剤または pH4. 0— 5. 5の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さら〖こ、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。

以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物およびィヒ粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができる。

本発明の糖鎖が導入されたペプチドなどは、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、座剤等の固形製剤、またはシロップ剤、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として経口または非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアとしては、上述のように、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、溶解補助剤、安定化剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドなど以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内注射、筋肉内注射、経鼻、直腸、膣および経皮等が挙げられるがそれらに限定されない。

固形製剤における賦形剤としては、例えば、グルコース、ラタトース、スクロース、 D マン-トール、結晶セルロース、デンプン、炭酸カルシウム、軽質無水ケィ酸、塩化ナトリウム、カオリンおよび尿素等が挙げられる。

固形製剤における滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ホウ酸末、コロイド状ケィ酸、タルクおよびポリエチレングリコール等が挙げられるがそれらに限定されない。

固形製剤における結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、白糖、 D マン-トール、結晶セルロース、デキストリン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、カノレボキシメチノレセノレロース、デンプン溶液、ゼラチン溶液、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、およびシェラック等が挙げられる。

固形製剤における崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カンテン末、ラミナラン末、クロスカルメロ一スナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、アルギン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、ステアリン酸モノグリセリド、ラタトースおよび繊維素グリコール酸カルシウム等が挙げられるがそれらに限定されない。

固形製剤における崩壊阻害剤の好適な例としては、水素添加油、白糖、ステアリン、カカオ脂および硬化油等が挙げられるがそれらに限定されない。

固形製剤における吸収促進剤としては、例えば、第四級アンモニゥム塩基類およびラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。

固形製剤における吸着剤としては、例えば、デンプン、ラタトース、カオリン、ベントナイトおよびコロイド状ケィ酸等が挙げられるがそれらに限定されない。

固形製剤における保湿剤としては、例えば、グリセリン、デンプン等が挙げられるがそれらに限定されない。

固形製剤における溶解補助剤としては、例えば、アルギニン、グルタミン酸、ァスパギン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。

固形製剤における安定化剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、ラタトース等が挙げられるがそれらに限定されない。

固形製剤として錠剤、丸剤等を調製する際には、必要により胃溶性または腸溶性物質（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセル口ースフタレート等）のフィルムで被覆していてもよい。錠剤には、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠が含まれる。カプセル剤にはハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。座剤の形態に成形する際には、上記に列挙した添加物以外に、例えば、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、半合成グリセライド等を添加することができるがそれらに限定されない。

液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射用水、アルコール、プロピレンダリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。

液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、 D—マン-トール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスァミノメタン、コレステロール、トリエタノールァミン、炭酸ナトリウムおよびクェン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。

液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールァミン、ラゥリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコ-ゥム、塩ィ匕べンゼトニゥム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられるがそれらに限定されない。

液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩ィ匕ナトリウム、グリセリン、 D- マン-トール等が挙げられるがそれらに限定されない。

液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクェン酸塩等の緩衝液等が挙げられるがそれらに限定されない。

液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコ -ゥムおよび塩酸プロ力イン等が挙げられるがそれらに限定されない。

液状製剤における防腐剤の好適な例としては、ノラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、 2—フエ-ルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。

液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、ァスコルビン酸、 a - トコフエロールおよびシスティン等が挙げられるがそれらに限定されない。

注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かっ血液と等張であることが好ましい。通常、これらは、ノクテリア保留フィルタ一等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤 (塩酸リドカイン水溶液、生理食塩

水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。さらに、必要ならば、医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。

本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、 pH、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与 (例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など)であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。

本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤 (日本薬局方第 14版またはその最新版、 Remington' s Pharmaceutical sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed. , MacK Publishing Compan y, 1990などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合すること〖こよって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。

様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リボソーム、微粒子、マイクロカプセルなど)。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など)を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路 (脳室内注射および髄腔内注射を包含し;脳室内注射は、例えば、 Ommayaリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。

特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を、処置の必要な領域 (例えば、中枢神経、脳など）に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、シァラスティック（sialastic)膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されな!/ヽ材料を使用するために注意が払われなければならな！/ヽ。

別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リボソーム中に封入された状態で送達され得る（Langer, Science 249 : 1527- 1533 (1990)； Treat ら, Liposomes m the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lo pez— Beresteinおよび Fidler (編）， Liss, New York, 353〜365頁（1989) ;Lo pez— Berestein,同書 317〜327頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。

さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、制御された徐放系中で送達され得る。 1つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Langer (前出）； Seft on, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 : 201 (1987)； Buchwaldら， Surgery 88 : 507 (1980) ; Saudekら， N. Engl. J. Med. 321 : 574 (1989)を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Medical Applications of

Controlled

Release, Langerおよび Wise (編)， CRC Pres. , Boca

Raton, Florida (1974)； Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolenおよび Ball (編)， Wiley, New York (19

84)； Rangerおよび Peppas, J.、 MacromoL Sci. Rev. MacromoL Chem. 23 :

61 (1983)を参照のこと； Levyら， Science 228： 190 (1985) ; Duringら， Ann.

Neurol. 25 : 351 (1989)； Howard^, J. Neurosurg. 71 : 105 (1989)もまた参照のこと)。

さらに別の実施形態において、制御された徐放系は、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、 Goodson, Medical

Applications of Controlled Release, (前出），第 2卷， 115〜138頁（1984 )を参照のこと)。

他の制御された徐放系は、 Langerにより総説において議論される（Science 249 : 1527—1533 (1990) )。

本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患 (種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体 (または患者)に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患 (種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日数ケ月に 1回（例えば、 1週間に 1回 1ヶ月に 1回）の投与が挙げられる。 1週間ー1ヶ月に 1回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。

本発明の糖鎖が導入されたペプチドなどの投与量は、被験体の年齢、体重、症状または投与方法などにより異なり、特に限定されないが、通常成人 1日あたり、経口投与の場合、 0. Olmg〜： LOgであり、好ましくは、 0. lmg〜： Lg、 lmg〜： L00mg、 0. 1 mg〜： LOmgなどであり得る。非経口投与の場合、 0. Olmg〜： Lgであり、好ましくは、 0. 01mg〜100mg、 0. lmg〜100mg、 lmg〜100mg、 0. lmg〜10mgなどでめり得る。

本明細書中、「投与する」とは、本発明の糖鎖が導入されたペプチドなどまたはそれを含む医薬組成物を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、生物の細胞または組織に化合物を取り込むことを意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に (例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合)投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第 1に与えられ、続いて第 2に与えられる化合物または薬剤のうちの 1つを別々に投与することをさらに含む。

異常な状態はまた、生物へのシグナル伝達経路に異常を有する細胞の群に化合物を投与することによって予防または処置され得る。次いで、化合物を投与することの生物機能に対する効果力モニターされ得る。この生物は、好ましくは、マウス、ラット、ゥサギ、モルモット、またはャギ、より好ましくは、サル（monkeyまたは ape)、および最も好ましくは、ヒトである。

本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人 (患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局 (FDA)など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書 (package insert)であり、通常は紙媒体で提供される力それに限定されず、例えば、電子媒体 (例えば、インターネットで提供されるホームページ (ウェブサイト）、電子メール)のような形態でも提供され得る。

本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用できるアツセィもしくは機器使用による標準的な臨床検査室の結果またはインスリンなどに関連する疾患 (例えば、神経疾患）に特徴的な臨床症状の消滅によって支持され得る。治療は、インスリンなどに関連する疾患 (例えば、神経疾患）の再発により再開することができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の 1つ以上の成分を満たした 1つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、

: p I

使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。

本発明が化粧品として使用されるときもまた、当局の規定する規制を遵守しながら化粧品を調製することができる。

[0058] 以下に、本発明の好ましい実施形態について説明する。

本発明糖鎖ペプチド結合剤は以下の方法で得ることができる。

[0059] (方法 1)

[化 16]

_A1 A¹ CHal₄/Ph₃P _A1

H₂N OH HN OH H Hal

Pro

(式中、 A¹は（1)と同意義、 Proは保護基、 Halはハロゲン、 Ph Pはトリフフィンおよび Alkはアルキル)

(方法 2)

[化 17]

(式中、 A¹は（1)と同意義、 Proは保護基、 DEADはジェチルァゾジカルボキシレート）

(方法 3)

[化 18]

(式中、 Proは保護基)

(方法 4)

[化 19]

(式中、 A¹および R⁴は（1)と同意義、 Proは保護基) [0063] (ペプチドと該糖鎖ペプチド結合剤の反応）

1つの局面において、本発明は、グルタミンが糖鎖で修飾された糖ペプチドを提供する。この糖ペプチドでは、生物学的活性を有する形態のペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも 1つのアミノ酸残基にグルタミンを有することが特徴であり、そのグルタミンが糖鎖で修飾されている。ここで、修飾は、直接的または間接的な結合を意味する。糖鎖で修飾されるグルタミンは、ペプチドに含まれる少なくとも 1つのダルタミンであればよぐ好ましくは、複数 (例えば、 2つ、 3つ）、あるいは、存在するグルタミンのすべてが糖鎖で修飾されていてもよい。結合は、通常共有結合であるが、それに限定されず、糖鎖が、結合したペプチドと同一の存在物 (entity)を構成することができる限り、他の相互作用（例えば、疎水結合、水素結合など）を介していてもよい。

[0064] 1つの実施形態において、使用される生物学的活性を有する形態のペプチドは、トランスダルタミナーゼの酵素活性が発揮される少なくとも 1つの条件において水溶性であることが好ましい。そのような条件は、使用されるトランスダルタミナーゼおよび基質などによって変動するが、当業者は、そのような条件を適宜設定することができる。例示的な条件としては、例えば、 pH4〜pH9、塩濃度 OmM〜： LM、 0°C〜42°Cの温度などが挙げられるがそれらに限定されない。使用される緩衝塩もまた、任意のものが使用され得る。そのような緩衝塩としては、用いられる緩衝液としては pH4〜pH9 のものであればいずれの種類の緩衝液でもよぐ例えば、 Hepes緩衝液、 Tris 塩酸緩衝液 (PH8. 0)、リン酸緩衝液 (pH6. 4〜7. 4)等が挙げられる。また、動物由来のトランスダルタミナーゼはカルシウム依存性のタンパク質であることが多いことから、酵素活性を発現させるために、塩ィ匕カルシウム、炭酸カルシウム等のカルシウム塩を反応系に添加するのが好ましぐその添加量は通常 0. 1〜： LOOミリモル濃度が好ましい。なお、微生物由来のトランスダルタミナーゼはカルシウム依存性ではないため、力ルシゥム塩の添カ卩は必要でない。トランスダルタミナーゼとしては、ストレブトべルティシリウム属（例えば、 Streptoverticillium sp. Strain s— 8112)等の微生物の産生するもの、モルモット、ヒト等の動物由来のもの、さらに魚類由来のものなどいずれも用い得る。また汎用食品の増貼剤として市販もされており、本発明ではかかる巿販のトランスダルタミナーゼでも用いられる。より好ましくは、そのような条件は、「穏和な条件」であり得る。そのような穏和な条件とは、分子内ジスルフイド結合が切れない条件、立体構造に変化を与えない条件などが挙げられるがそれらに限定されない。このような穏和な条件を決定する条件としては、例えば、ペプチドまたはタンパク質濃度、基質濃度、カルシウムイオン濃度、 P H、温度、共存する塩の種類および濃度、 GSHの存否、還元剤の存否などが挙げられるがそれらに限定されない。必要に応じて、これらの因子は複数考慮してもよい。そのような条件の具体的な例としては、例えば、インスリン（0. lmM)、 Lac. Amino Hex(0. 9mM)ゝ CaC12 (5mM)ゝ Tris— HCl(20mM、 pH7. 5)、トランスグルタミナーゼ（3. 5U/ml) ; 37°Cおよび 30分間反応などが挙げられるがそれに限定されない。 GSHを加えると、野生型のインスリンでトランスダルタミナーゼの反応が進むが、そのような添カ卩はペプチドの生物学的活性に悪影響があることから、好ましくない。他の穏和な条件の具体例としては、例えば、ペプチドまたはタンパク質 (例えば、リジン残基を含むタンパク質 (例えば、インスリン)）の濃度を 0. 2mM以下 (好ましくは、 0 . ImM以下）にすること、カルシウム濃度を 2mM以上 (好ましくは、 5mM以上、より好ましくは lOmM)とすること、 GSHをカ卩えた場合に 37°Cでの反応を短く（例えば、 3 時間以下、好ましくは 1時間以下)すること、市販のトランスダルタミナーゼを使用する場合、還元剤の影響がな、程度の量または緩衝液交換を行、還元剤を減少させて用いることなどが挙げられるがそれに限定されない。

本発明の方法において使用されるトランスダルタミナーゼは、どのような由来のものであってもよぐ動物由来のもの (種々の組織、血漿成分由来など)または微生物由来のもの、あるいは人工的に作製したものであってもよ、。

トランスダルタミナーゼを用いて糖鎖を導入した場合、反応生成物は、遠心分離法、クロマトグラフィー（例えば、逆相系 HPLC、レクチンカラムによるァフィ二ティーク口マトグラフィー、ゲル濾過等)の当該分野において周知の方法により反応混合物から単離精製することができる。あるいは、得られた糖鎖結合型インスリンは、複数種の混合物として単離することができる。また、複数の異なる糖鎖または他の置換基で改変されたものを含んで、てもよ、。

反応生成物の分析は、高速液体クロマトグラフィ、核磁気共鳴スペクトル、質量分析 (MALDI TOFマススペクトル分析など）などの各種分光分析法により行なうことができる。

好ま、実施形態にぉ、て、本発明にお、て生物学的活性を有する形態のぺプチドにおいてグルタミンに置換されるアミノ酸残基は、そのペプチドの表面に存在するものであることが好ましい。表面上にあるアミノ酸残基をグルタミンに変化させ、糖鎖を結合させることによって、従来達成できな力つた外的な攻撃力もペプチド分子を保護することができる。そのような表面上にあるアミノ酸残基の同定は、当該分野において周知の結晶構造分析によって行うことができる。ペプチドの空間的コンフオメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、 X線結晶学、および 2次元核磁気共鳴分光法を含む。表面上に存在する部分を同定する方法には、ェピトープを同定する方法が含まれる。所定のタンパク質におけるそのようなェピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、 Geysenら（1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 3998 (所定の抗原における免疫原性ェピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第 4, 708, 871号 (抗原のェピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；および Geysenら（1986) Molecular Immunology 23 : 709 (所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術)を参照されたい。

別の実施形態において、グルタミンは、生物学的活性を有するペプチドの野生型形態に存在していてもよいし、野生型において存在していない場合、グルタミンを置換または付加してもよい。あるいは、このような付加または置換型のペプチドの生産は、合成または遺伝子工学的に行うことができる。そのような生産方法は、本明細書におヽて上述し、実施例にお!ヽて例示されるように当業者に周知なぎ術を用いて実施することができる。グルタミンが置換または付加される位置は、プロテアーゼ消化を受けやす、部位にあることが好ま U、。プロテアーゼ消化を受けやす!/、部分をグルタミンとし、糖鎖で「マスク」することによって、プロテアーゼ消化を受けに《することができる力である。そのようなプロテアーゼ消化を受けやす、部位であるかどうかは、ペプチドを任意のプロテアーゼとインキュベートして消化した部分ペプチドの配列を決定することによって判定することができる。糖鎖が導入されるグルタミン残基の個数は少なくとも 1つであり、 2つ以上、 3つ以上のグルタミン残基に糖鎖が導入されていても力まわない。また、複数のグルタミン残基に糖鎖が導入される場合、導入される糖鎖は同一であっても異なっていてもよい。あるいは、 1つのグルタミン残基に糖鎖が導入される場合であっても、導入される糖鎖は均一であっても混合物であってもよ、。均一であるものが好まし！/、。

遊離のシスティン残基 (チオール基)を持つペプチドと一般式 (V)で表される化合物を含む糖鎖—ペプチド結合剤を緩衝溶液中、混ぜるだけで反応がおこり、目的とするペプチドに糖鎖ペプチド結合剤が導入された誘導体が得られる。

[0067] (ペプチドの製造方法）

本発明の糖ペプチドにおいて、ペプチド部分は、当該分野に周知の技術を用いて合成または遺伝子工学的に製造することができ、そのような合成および遺伝子工学的製造の方法は、本明細書において他の場所に詳述されている。また、少なくとも 1 つのアミノ酸残基にグルタミンを有するようなペプチドの製造もまた、当該分野にぉヽて周知の合成および Zまたは遺伝子工学の技術を用いて製造することができる。このような場合、野生型のペプチドにおいて、少なくとも 1つのアミノ酸残基にグルタミンを有しな、場合、その範囲内にグルタミンを有するようにアミノ酸配列を改変することができる。そのような改変方法もまた、当該分野において周知であり、本明細書にお

V、て他の場所に記載されて、る。グルタミンの導入位置はどのような位置でもよ!/、。別の実施形態において、本発明の糖ペプチドは、 1または数個のアミノ酸残基の置換、付加および Zもしくは欠失、ならびに Zまたは糖鎖および脂質力なる群より選択される少なくとも 1つの生体分子をさらに含むことが有利であり得る。このような糖べプチドのさらなる改変は、所望の機能を付与または消失または調節したい場合に、行うことができる。そのような改変を行うことは、当業者により実施され得る。

[0068] 別の局面において、本発明は糖鎖—ペプチド結合剤を介した機能的糖ペプチドを調製する方法を提供する。このような方法は、 A)少なくとも 1つのアミノ酸残基にダルタミンを含む、目的とするペプチドを提供する工程;および B)該グルタミンに糖鎖一ペプチド結合剤を導入する工程、を包含する。ここで、目的とするペプチドは、野生型形態のペプチドにお、て、少なくとも 1つのグルタミン以外のアミノ酸残基をグルタミンに置換することにより提供されてもよぐあるいは、そのような位置にグルタミンを有する野生型形態のペプチドを直接提供してもよい。このようなグルタミン残基は、上記ペプチドの C末端または N末端から 12アミノ酸以内に存在してもよいがそれに限定されない。

好ましい実施形態では、本発明の方法では、目的とするペプチドのアミノ酸配列において、グルタミンに変化させても目的とするペプチドの生物学的活性を喪失しない残基を同定する工程をさらに包含する。このような工程を有することによって、本発明において、着実に機能的糖ペプチドを生産することができる。ここで、グルタミンが置換される少なくとも 1つのアミノ酸残基は、このような方法によって同定された残基である力このような残基以外の残基が改変されていてもよい。このような同定工程は、例えば、糖ペプチドの表面上のアミノ酸残基を同定することを包含してもよい。目的とするペプチドは、目的とするペプチドの野生型形態においてプロテアーゼ消化を受けやすい部位を同定し、その部位にグルタミンが存在しない場合、プロテアーゼ消化を受けやすい部位をグルタミンに置換することによって提供され得る。

改変されるペプチドは、野生型ペプチドであっても、合成された人工改変ペプチドであってもよい。

グルタミンへの糖鎖の導入は、通常、トランスダルタミナーゼを利用し、前記糖鎖はアミノ基を含むが、それに限定されない。トランスダルタミナーゼは、グルタミンに特異性が高!ヽことから、グルタミン残基のみに糖鎖を導入するために有利に用いられる。ァミノ基と糖鎖とは直接結合されて、てもよ、が、スぺーサーを介して結合されてヽてもよい。

(糖鎖）

本発明において使用される糖鎖としては、任意のものが使用され得る。好ましくは、使用される糖鎖は、ラタトースまたはシアル酸を含むことが有利である。より好ましくは、使用される糖鎖は、シアル酸を含むことがさらに有利である。

従って、本発明において使用される糖鎖の例示としては、例えば、 Lac, Sia a 2, 3 — Lac、 Sia a 2, o— Lac、 uc α丄, 2— Lac、 Sia a 2, 8— ¾ia a 2, 3— Lac、 ¾ia 2, 8— ¾ia 2, 6— Lac、 Sia 2, 8— Sia a 2, 3— (Fuc 1, 2— ) Lac、 ¾ia 2 , 8-Sia- a ~2, 6— (Fuc— a— 1, 2— )Lacなど、これらを含む 3糖、 4糖、 5糖、 6糖、または n糖 (ここで、 nは 7以上の任意の整数)などが挙げられるがそれらに限定されない。これらの例示される糖鎖は、直鎖状であっても分枝状であっても榭状であつてもよい。糖鎖が分枝状である場合、その糖鎖の形態が、二本鎖型、三本鎖型または四本鎖型であることが好ましい。

導入される糖鎖の大きさもまた、どのようなものであってもよい。好ましくは、使用される糖鎖は、少なくとも 2糖の大きさであり、より好ましくは少なくとも 3糖の大きさである。このような糖鎖は、直鎖であっても、分岐していてもよぐあるいは環化されていてちょい。

好ましい実施形態において、本発明の糖鎖—ペプチド結合剤を介した糖ペプチド生産法では、糖鎖をさらに伸長する工程をさらに包含してもよい。伸長工程を有することによって、原理的には、無限に糖鎖を付加することができる。また、トランスグルタミナーゼを用いる場合に、限界となる導入される糖鎖の大きさの限度を事実上なくすことにちなる。

そのような糖鎖伸長は、 β ΐ, 4—ガラタト一ス転移酵素、ひ1, 3—ガラタト一ス転移酵素、 β ΐ, 4 ガラクトース転移酵素、 /31, 3—ガラクトース転移酵素、 /31, 6— ガラクトース転移酵素、 a 2, 6 シアル酸転移酵素、ひ1, 4 ガラクトース転移酵素、セラミドガラタトース転移酵素、ひ1, 2 フコース転移酵素、ひ1, 3 フコース転移酵素、 al, 4 フコース転移酵素、 al, 6 フコース転移酵素、 a 1, 3— N ァセチルガラタトサミン転移酵素、 al, 6— N ァセチルガラタトサミン転移酵素、 β ΐ, 4 Ν ァセチルガラタトサミン転移酵素、ポリペプチド Ν ァセチルガラタトサミン転移酵素、 /31, 4 Νァセチルダルコサミン転移酵素、 131, 2—Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β ΐ, 3— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β ΐ, 6—Νァセチルダルコサミン転移酵素、ひ1, 4— Nァセチルダルコサミン転移酵素、 β ΐ, 4 マンノース転移酵素、 _al, 2 マンノース転移酵素、 _al, 3 マンノース転移酵素、 a 1, 4 マンノース転移酵素、 al, 6 マンノース転移酵素、 al, 2 グルコース転移酵素、 al, 3 グルコース転移酵素、《2, 3 シアル酸転移酵素、《2, 8 シアル酸転移酵素、 al, 6—ダルコサミン転移酵素、 al, 6—キシロース転移酵素、 βキシロース転移酵素 (プロテオダリカンコア構造合成酵素）、 β ΐ , 3—グルクロン酸転移酵素およびヒアルロン酸合成酵素からなる群より選択される酵素を利用してもよいが、それに限定されない。糖鎖伸長に使用する酵素は、それぞれの適切な条件下で用いることが好ましい。

[0071] 以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従つて、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

実施例

[0072] 次に、実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例中、以下の略号を使用する。

Boc： t—ブトキシカノレボニノレ

Me :メチル

Et:ェチル

Ph:フエ-ル

DMF：ジメチルホルムアミド

THF:テトラヒドロフラン

TFA:トリフルォロ酢酸

TGase：トランスグルタミナーゼ

DTT：ジチオスレィトール

Ac :ァセチノレ

[0073] (実施例 1)化合物（1)の合成

[化 20]

Me、 ,ΟΗ (Boc)₂0 e. .OH

N H _HC, Et₃N I MeOH

Boc

1 [0074] N—メチルヒドロキシルァミン塩酸塩（lOg)を約 10倍容量のメタノール（100ml)へ溶解し、氷浴で冷却した。トリェチルァミンを 1等量（16. 7ml)添加後、 1. 1当量の二炭酸ジ -t-ブチル (28. 7g)を滴下した。約 1時間攪拌した後、室温まで昇温し、さらに 1時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、残渣に酢酸ェチルおよび水を添加して抽出を行い、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、酢酸ェチルを減圧留去した。シリ力ゲルカラムクロマトグラフィーによって精製を行い、目的物を得た (収率 63%)。 'H-NMR CCDCl ) , δ 3. 16 (s, 3H) , 1. 49 (s, 9H)

3

[0075] (実施例 2)化合物（2)の合成

[化 21]

[0076] 6 アミノー 1一へキサノール（17. 7g)を約 9倍量の 4. 4%水酸化ナトリウム水溶液

(164. 4g)へ溶解し、さらに約 6倍容量のァセトニトリル（100ml)をカ卩えた。氷浴で冷却後、 1. 2等量の二炭酸ジー t ブチル (39. 3g)を滴下した。約 1時間攪拌した後、 0. 2等量の二炭酸ジ— t—ブチル (6. 6g)を追加し、さらに 1時間攪拌した。反応液を室温まで昇温させ、ァセトニトリルを減圧留去した後に酢酸ェチルを加えた。有機層を水洗、抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥した後に酢酸ェチルを減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製を行って定量的に目的物を得た。

— NMR (CDC1 ) , 6 4. 54 (br, 1H) , 3. 63 (bt, 2H) , 3. 15, 3. 12, 3. 10

3

, 3. 07 (dd, 2H) , 1. 67—1. 20 (m, 17H)

[0077] (実施例 3)化合物（3)の合成

[化 22]

[0078] 化合物（2) (10. 9g)と 1. 2等量の四臭化炭素（19. 9g)を約 40倍溶量のジクロロメタン (400ml)に溶解した。氷浴で冷却後、 1. 2等量のトリフエ-ルホスフィン 15. 7g を添加し、約 1時間攪拌した。反応液を室温まで昇温して、さらに 2時間攪拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液へ注ぎ、有機層を水洗、抽出し、硫酸マグネシゥムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製を行って目的物を得た (収率 91%)。

— NMR (CDC1 ) , 6 4. 53 (br, 1H) , 3. 42, 3. 40, 3. 37 (t, 2H) , 3. 14

3

, 3. 12, 3. 10, 3. 07 (dd, 2H) , 1. 92- 1. 80 (m, 2H) , 1. 60— 1. 23 (m, 15H)

[0079] (実施例 4)化合物 (4)の合成

[化 23]

Me、.,OH ^NaH

M N

Boc DMF I THF Boc oc H

.· ,、^/\/-\/^ 、„

Me Ό 〜 Boc

4

[0080] 化合物（1) (3. lg)を約 32倍溶量の DMF (100ml)に溶解し、さらに約 32倍溶量の THF (lOOml)を添加後、約 1. 1等量の 60〜72%水素化ナトリウム油性（0. 9 6g)をカ卩ぇ攪拌した。 0. 95等量の化合物（3) (5. 58g)を加えて 50〜60°Cに加温して 1時間攪拌した。反応液を 0. ImolZLの塩酸へ注ぎ、さらに酢酸ェチルをカ卩えて有機層を水洗、抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥した後に溶媒を減圧留去した。シリ力ゲルカラムクロマトグラフィーによって精製を行い、目的物を得た (収率 93%)。 OLE丄 INK2

'H-NMR CCDCl ) , δ OLE LINK24. 52 (br, 1H) , 3. 84, 3. 82, 3. 79 (t, 2

3

H) , 3. 20- 3. 00 (s, m, 5H) , 1. 72—1. 24 (m, 26H)

[0081] (実施例 5)化合物（5)の合成

[化 24]

4

[0082] 化合物（4)(1. Og)を約 10倍容量の 90%トリフルォロ酢酸ジクロロメタン溶液（10m 1) 溶解し、室温で 1.5時間攪拌した。その後溶媒を減圧留去して目的物のトリフルォロ酢酸塩を得た。この溶液を水酸ィ匕ナトリウム水溶液によって pH6 8に調整して 2 OOmM水溶液とした。

— NMR(D O), 64.03, 4.01, 3.99 (t, 2H), 2.93— 2.85 (s, m, 5H),

2

1.65-1.50(m, 4H), 1.40-1.25 (m, 4H)

[0083] (実施例 6)化合物（5)誘導体のペプチドへの導入

[化 25]

ImMのマストパラン及び 20mMのォキシァミンリンカを含む反応液（lOOmMTr is-HCl pH7.5 lOmM CaCl 5mM DTT)に TGase (和光純薬社製） (5.6

2

U)を添加し、 37°C 4時間反応した。途中、 TGase (5.6U)を追加した。反応液と同溶量の 10% TFAを添加し、反応を停止した。逆相 HPLCにより精製して主生成物を単離し（Inertsil (登録商標） ODS- 3 20X 250mmカラム、移動層 A:0.1%TF A水溶液に対して移動層 B : 0. 1%TFA含有ァセトニトリルの 10%力も 40%のグラジェント）、 MALDI— TOF/MSによって [M(average) + H]+ = 1764. 3、 [M(avera ge) + Na] ⁺ = 1786. 3、 [M(average) +K]⁺ = 1802. 5のピーク (理論値 [M(averag e) + H]⁺ = 1765. 2、 [M(average) + Na]⁺ = 1787. 2、 [M(average) + K] ⁺ = 180 3. 3)を確認することによって目的物を確認した。

[0085] (実施例 7)糖の導入

[化 26]

[0086] ImMのォキシァミンリンカ一付カ卩マストパランおよび lOOmMのグルコースを含む反応液（50mM AcOH/Na buffer pH4. 5)を 37°Cで 24時間反応させた。反応液の逆相 HPLC (Inertsil (登録商標） ODS- 3 4. 6 X 250mmカラム、移動層 A: 0. 1%TFA水溶液に対する B: 0. 1%TFA含有ァセトニトリルの 20%力 40% のグラジェント）で分取後、 OLE丄 INK1MALDI—TOFZMSOLE丄 INK1で [M(ave rage) + H]⁺ = 1927. 3のピーク (理論値 [M(average) + H]+ = 1927. 3)を確認することによって目的物の生成を確認した。

[0087] 実施例 7と同様に N—ァセチルダルコサミン、ラタトース、マルトースに関してもマストノ《ランへの糖鎖導入を実施し、逆相 HPLC (実施例 7と同条件）および MALDI— T OF/MSによってそれぞれ [M(average) + H]+ = 1968. 0 (N—ァセチルダルコサミン：理論値 [M(avemge) + H] + = 1968. 4)、 [M(average) + H]+ = 2088. 3 (ラタトース：理論値 [M(avemge) + H]+ = 2089. 5)、 [M(average) + H]+ = 2089. 7 (マルトース：理論値 [M(avemge) + H]+ = 2089. 5)のピークを確認することによって目的物の生成を確認した。

産業上の利用可能性

本発明は、天然または非天然のタンパク質と保護されていない糖鎖を利用して、均一な組成を有する糖ペプチドを簡便に製造するために用いる糖鎖—ペプチド結合剤、および該糖鎖—ペプチド結合剤を用いて糖ペプチドを製造方法に関する。

本発明により、組成が一定している糖ペプチドを提供することが可能となるので、より高品質なノィォ医薬を提供することができる。

Claims

請求の範囲

[1] -般式 (I):

[式中、 Xは Η Ν—または式:

2

[化 1]

で表される基；

Υは一 Α¹—、一 Α¹— Ο— Α²—、一 (CH CH Ο) 一 Α¹—、一 (CH CH Ο)

2 2 η 2 2

Ο - Α² -、一 A¹ - NH - C( = 0) - A² -、一 A¹ - C( = 0) - NH - A² -、

CH CH O) 一 NH— C( = 0)— A²—、一 A¹—（CH CH O) — C( = 0)_

2 2 η 2 2 η

Α²-、式：

[化 2]

で表される基、または式:

[化 3]

で表される基 (式中、 A¹および A²はそれぞれ独立して、置換されていてもよい C1— 1 5アルキレン、置換されて!、てもよ！/、C2— 15ァルケ-レンまたは置換されて！、てもよい C2— 15アルキニレン； nは 1〜5の整数; R¹はヒドロキシまたは— NH(R²) (式中、 R²は水素原子、低級アルキル、ァリールまたはァラルキル）； R³は水素原子または— C ( = 0)— R⁵ (式中、 R⁵は低級アルキル、ァリールまたはァラルキル））；および、 Zは一 O— NH (R⁴)、一 NH— OR⁴、一 C ( = 0)— NH— NH— R⁴、または一 C ( = S )— NH— NH— R⁴ (式中、 R⁴は水素原子、低級アルキル、またはァリール）] で表される化合物を含む糖鎖ペプチド結合剤。

[2] Xが— NHおよび Zが— O— NH (R⁴) (式中、 R⁴は水素原子、低級アルキル、または

2

ァリール)である請求項 1記載の糖鎖ペプチド結合剤。

[3] Xが式：

[化 4]

で表される基および Zが— O— NH (R⁴) (式中、 R⁴は水素原子、低級アルキル、またはァリール)である請求項 1記載の糖鎖ペプチド結合剤。

[4] 一般式 (II) :

H N— A¹— O— NH (R⁴) (II)

2

[5] 一般式 (ΠΙ) :

[化 5]

(式中、 A¹は置換されていてもよい C 1—15アルキレン; R⁴は水素原子、低級アルキル、またはァリール)で表わされる化合物またはその塩。以下の工程：

1)一般式 (IV):

H N-Y-Z (IV)

2

2 2 η 2 2 一 Α¹ - Ο - Α² -、一 A¹ - NH - C( = 0) - A² -、一 A¹ - C( = 0) - NH - A² -、一 A¹—（CH CH O) — NH— C( = 0)— A²—、一 A¹—（CH CH O) — C( = 0)

2 2 η 2 2 η NH - Α² -、式：

[化 6]

C( = 0)— R⁵ (式中、 R⁵は低級アルキル、ァリールまたはァラルキル））；および、

Zは O— NH(R⁴)、一 NH— OR⁴、一 C ( = 0)— NH— NH— R⁴、または C( = S

グルタミン残基を有するペプチドを、

2) 1)工程で得られたペプチドと、糖鎖を反応させる工程を包含する、糖ペプチドの製造方法。

以下の工程：

1)一般式 (V) :

[化 8]

[式中、 Yは - A¹ O A²—、一（CH CH O) 一 A¹- (CH CH O)

2 2

2

A NH— C ( = 0)— A' C ( = 0)— NH— A²—、

-A NH-C ( = 0) -A²- (CH CH O) C ( = 0) 一而 A'

[化 9]

で表される基、または式:

[化 10]

で表される基 (式中、 A¹および A²はそれぞれ独立して、置換されていてもよい C1— 1 5アルキレン、置換されて!、てもよ、C2— 15ァルケ-レンまたは置換されて!、てもよい C2— 15アルキ-レン； nは 1〜 5の整数； R¹はヒドロキシまたは NH (R²) (式中、 R²は水素原子、低級アルキル、ァリールまたはァラルキル）； R³は水素原子または— C ( = 0)— R⁵ (式中、 R⁵は低級アルキル、ァリールまたはァラルキル））；および、 Zは一 O— NH (R⁴)、一 NH— OR⁴、一 C ( = 0)— NH— NH— R⁴、または一 C ( = S )— NH— NH— R⁴ (式中、 R⁴は水素原子、低級アルキル、またはァリール）] で表される化合物と、

糖ペプチドの製造方法。

[8] Zが— O— NH (R⁴) (式中、 R⁴は水素原子、低級アルキル、またはァリール)である請求項 6または 7記載の製造方法。

[9] Yが— A¹— (式中、 A¹は置換されていてもよい C1— 15アルキレン）である請求項 6または 7記載の製造方法。

[10] 請求項 6または 7に記載の製造方法で製造されうる糖ペプチド。

[11] 請求項 6または 7に記載の製造方法で製造されうる糖ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物。