KR101223663B1

KR101223663B1 - 나이트릴레이즈 ｖｍｎ１을 이용한 카르복실산의 제조방법

Info

Publication number: KR101223663B1
Application number: KR1020110007942A
Authority: KR
Inventors: 우정희; 강성균; 이정현; 김상진; 박상이; 김준태; 김충곤
Original assignee: 재단법인 경북해양바이오산업연구원; 한국해양과학기술원
Priority date: 2011-01-26
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2013-01-21
Also published as: KR20120086602A

Abstract

본 발명은 신규한 나이트릴레이즈 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 나타내는 나이트릴레이즈를 나이트릴 기질과 반응시키는 단계를 포함하는 카르복실산을 제조하는 방법, 및 상기 나이트릴레이즈를 포함하는 카르복실산 제조용 생촉매 조성물에 관한 것이다.

Description

나이트릴레이즈 ＶＭＮ１을 이용한 카르복실산의 제조방법 {Method for preparing a carboxylic acid using nitrilase VMN1}

본 발명은 신규한 나이트릴레이즈 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 나타내는 나이트릴레이즈를 나이트릴 기질과 반응시키는 단계를 포함하는 카르복실산을 제조하는 방법, 및 상기 나이트릴레이즈를 포함하는 카르복실산 제조용 생촉매 조성물에 관한 것이다.

최근 의약 및 약학분야에서 광학활성 카르복실산 및 그의 유도체의 사용이 크게 증가하고 있다. 특히, 광학활성 카르복실산은 고지혈증 치료제, 항바이러스제(에이즈 치료제), 항암제, 항응혈제, 심장병 치료제 및 알쯔하이머 치료제 등 의약품의 제조 원료로서 유용성이 높은 것으로 알려지면서 최근에 더욱 주목되고 있어 카르복실산의 고효율 생물학적 제조방법의 확립이 요구되고 있다.

카르복실산의 생산을 위한 화학 공정법은 여러 단계의 반응과 고온 및 고압으로 라세믹 혼합물을 생성한다는 단점을 가지고 있는데 비해, 나이트릴레이즈(nitrilase)를 사용한 효소 반응 공정법은 원-스텝으로 이루어지고 기질인 독성물질(나이트릴 화합물)로부터 광학선택적으로 광학활성 의약품 중간체(카이랄 의약품)를 생산하기 때문에 환경적인 면뿐만 아니라 경제적인 면에서도 상당한 잠재성을 보이고 있다. 따라서, 미생물 및 그의 효소를 사용하여 나이트릴로부터 광학활성 카르복실산을 생화학적으로 생산하는 방법이 시도되고 있다 (Banerjee et al., (2006) Appl. Microbiol. Biotechnol. 72: 77-87; Robertson et al., (2004) Appl. Environ. Microbiol. 70: 2429-2436; Rustler et al., (2008) Appl. Microbiol. Biotechnol. 80: 87-97). 대부분의 나이트릴레이즈는 보존된 3개의 촉매성 잔기가 있는데, 이것을 촉매성 3가 원소(catalytic traid motifs)라고 부른다. 촉매성 3가 원소는 글루타메이트(Glutamate, E), 라이신(Lysine, K) 및 시스테인(Cysteine, C) 잔기들로 되어 있으며 항상 보존된 잔기이다.

본 발명자들은 다양한 나이트릴 기질로부터 고효율로 카르복실산을 제조할 수 있는 신규한 나이트릴레이즈를 개발하고자 노력한 결과, 해양 유래 미생물들로부터 촉매성 3가 원소를 보존하고 있는 단백질들을 분리 및 정제할 수 있었다. 나아가, 본 발명자들은 상기 단백질들이 다양한 나이트릴 기질들로부터 카르복실산을 생산할 수 있는 나이트릴레이즈 활성을 가진다는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 나타내는 나이트릴레이즈를 나이트릴 기질과 반응시키는 단계를 포함하는 카르복실산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 나타내는 나이트릴레이즈를 포함하는 카르복실산 제조용 생촉매 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 나타내는 나이트릴레이즈 또는 이를 포함하는 생촉매 조성물을 나이트릴 기질과 반응시키는 단계를 포함하는 카르복실산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 나타내는 나이트릴레이즈 또는 상기 나이트릴레이즈를 포함하는 생촉매 조성물을 준비하는 단계; 및 상기 나이트릴레이즈 또는 생촉매 조성물을 나이트릴 기질과 반응시키는 단계를 포함하는 카르복실산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 나타내는 나이트릴레이즈를 포함하는 카르복실산 제조용 생촉매 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 용어, "나이트릴레이즈(nitrilase)" 란 나이트릴 화합물을 카르복실산으로 변환하는 반응을 촉매하는 효소를 말하며, 나이트릴레이즈 활성을 가지는 한, 부분 정제된 효소 또는 정제된 효소의 형태일 수 있다.

본 발명에서 용어, "나이트릴레이즈를 포함하는 생촉매 조성물"이란 나이트릴레이즈 효소를 포함하면서 나이트릴레이즈 활성을 나타내는 모든 형태의 조성물을 포함하는 개념이며, 바람직하게는 나이트릴레이즈 활성을 가지는 완전 미생물 세포 또는 상기 나이트릴레이즈가 형질전환된 미생물 세포일 수 있다. 또한, 상기 미생물 세포를 포함하는 세포 배양물 또는 세포 파쇄물일 수 있다.

바람직한 양태로서, 본 발명에서 사용되는 나이트릴레이즈는 서열번호 1의 아미노산 서열로 나타내는 나이트릴레이즈 RMN1 단백질이다.

또 하나의 바람직한 양태로서, 본 발명에서 사용되는 나이트릴레이즈는 서열번호 3의 아미노산 서열로 나타내는 나이트릴레이즈 RMN2 단백질이다.

또 하나의 바람직한 양태로서, 본 발명에서 사용되는 나이트릴레이즈는 서열번호 5의 아미노산 서열로 나타내는 나이트릴레이즈 ORN 단백질이다.

또 하나의 바람직한 양태로서, 본 발명에서 사용되는 나이트릴레이즈는 서열번호 7의 아미노산 서열로 나타내는 나이트릴레이즈 VMN1 단백질이다.

또한, 본 발명의 나이트릴레이즈 단백질은 이의 정상형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라, 상기한 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내며 동시에 나이트릴레이즈 활성을 유지하는 범위 내에서의 아미노산 서열을 포함한다. 상기의 실질적인 동일성은 정상형의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지나 천연 단백질과 동등한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).

또한, 본 발명의 나이트릴레이즈 단백질은 나이트릴레이즈 활성을 유지하면서 이의 단백질의 특성을 변형시킨 변이체 또는 수식체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열상의 변이와 수식(modification)에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질일 수 있다. 예컨대, 본 발명의 나이트릴레이즈 단백질은 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation) 또는 파네실화(farnesylation) 등으로 수식될 수 있다.

본 발명의 나이트릴레이즈 단백질은 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 천연에서 추출 및 정제하여 얻을 수 있다. 예컨대, 본 발명의 RMN1 및 RMN2 단백질은 Reinekea sp. MED297 균주로부터 추출 및 정제할 수 있고, ORN 단백질은 Oceanobacter sp. RED65 균주로부터 추출 및 정제할 수 있으며, VMN1 단백질은 Vibrio sp. MED222 균주로부터 추출 및 정제할 수 있다.

또한, 본 발명의 나이트릴레이즈 단백질은 서열번호 1, 3, 5 및 7의 아미노산 서열 정보를 바탕으로 화학적으로 합성(Merrifleld, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156, 1963)하거나 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당 분야에 널리 공지된 폴리펩타이드 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, 나이트릴레이즈 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 나이트릴레이즈 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 나이트릴레이즈 단백질을 회수하는 과정으로 수득할 수 있다.

본 발명에서 나이트릴레이즈 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 나타내는 나이트릴레이즈 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서, 상기한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA) 또는 RNA 분자일 수 있다.

본 발명에서 용어, "핵산 분자" 또는 "핵산" 은 DNA 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 개념으로, 핵산 분자의 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)).

바람직한 양태로서, 나이트릴레이즈 RMN1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다. 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서 예시할 수 있다.

또 하나의 바람직한 양태로서, 나이트릴레이즈 RMN2 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다. 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서 예시할 수 있다.

또 하나의 바람직한 양태로서, 나이트릴레이즈 ORN 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다. 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서 예시할 수 있다.

또 하나의 바람직한 양태로서, 나이트릴레이즈 VMN1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다. 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서 예시할 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 천연에서 분리하거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 나이트릴레이즈 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem Int Ed Engl. 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스페이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.

보다 바람직한 양태로서, 본 발명의 나이트릴레이즈 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산은 재조합 벡터에 삽입되어 발현된다.

본 발명에서 용어,“벡터”란 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포로 도입되기 위한 수단을 의미한다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 통합될 수 있다.

바람직하게는 벡터 내로 삽입되어 전달된 유전자가 숙주세포의 게놈 내로 비가역적으로 융합되어 세포 내에서 유전자 발현이 장기간 안정적으로 지속되도록 하는 벡터이다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, DNA의 도입효율이 높고 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주가 통상 사용될 수 있다. 구체적으로 세균, 예를 들어 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)과 같은 곤충 세포, CHO, COS1, COS7, BSC1, BSC40, BMT10 등의 동물 세포 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 대장균이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 DH5α 및 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 세포(Stratagene, LaJolla, CA)를 각각 플라스미드 증식 및 유전자 발현용 균주로서 사용하였다.

벡터를 숙주세포에 도입하는 것은 공지의 방법, 예를 들면 염화칼슘법(Journal of Molecular Biology, 53권, 159페이지, 1970), 염화루비듐법(Methods in Enzymology, 68권, 253페이지, 1979), 일렉트로포레이션법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 184페이지, 1994), 및 인비트로패키징법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 571페이지, 1994) 등을 이용할 수 있다.

나이트릴레이즈는 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용하여 분리 및 정제할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 나이트릴레이즈를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 균주를 배양한 뒤, 상기 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한 뒤 세포를 파쇄시켜, 파쇄된 용액을 원심분리하여 형성된 침전물을 제거하여 재조합 나이트릴레이즈 조효소액을 분리하였으며, 이렇게 분리된 조효소액을 공지의 컬럼 크로마토그래피법으로 정제하여 본 발명의 신규 나이트릴라제 효소를 수득하였다(실시예 5).

상기와 같이 수득된 나이트릴레이즈 단백질은 나이트릴 기질과 반응하여 카르복실산을 제조하는데 사용될 수 있다.

카르복실산 제조에 사용하기 위하여, 본 발명에서는 나이트릴레이즈 활성을 가지는 한, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 나타내는 나이트릴레이즈 단백질을 사용하거나, 상기 나이트릴레이즈 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 사용하거나, 상기 핵산 분자 및 조절 신호 서열이 연결된 핵산 구성체 또는 벡터를 사용할 수 있다. 또는, 나이트릴레이즈 활성을 가지는 완전 미생물 세포 또는 상기 나이트릴레이즈가 형질전환된 미생물 세포, 상기 세포를 포함하는 세포 배양물 또는 그 파쇄물의 형태로 사용할 수 있다.

바람직한 하나의 양태로서, 1) 본 발명의 나이트릴레이즈 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계, 2) 상기 형질전환체로부터 나이트릴레이즈를 정제하는 단계, 및 3) 상기 정제된 나이트릴레이즈를 나이트릴 기질과 반응시키는 단계를 포함하여 카르복실산을 제조할 수 있다.

본 발명의 나이트릴레이즈는 다양한 나이트릴 기질과 반응을 일으킨다.

본 발명에서 용어, "나이트릴" 은 시아노기(-C≡N)가 탄화수소기(R)의 탄소원자에 직접 결합한 유기화합물(R-CN) 을 총칭한다. 시아노기를 포함한 유기화합물이라면 본 발명의 나이트릴레이즈의 기질로 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 아세토나이트릴(acetonitrile, ACN), 아크릴로나이트릴(acrylonitrile, ACRN), 아디포나이트릴(adiponitrile, ADN), 벤조나이트릴(benzonitrile, BEN), 부틸로나이트릴(butyronitrile, BUTN), 4-클로로벤조나이트릴(4-chlorobenzonitrile, CBEN) 및 만델로나이트릴(mandelonitrile, MAN)을 예시할 수 있다.

본 발명에서 용어, "카르복실산(carboxylic acid)"은 카복시기(－COOH)를 가지는 화합물을 총칭한다.

본 발명에 따른 방법은 pH4 내지 pH11, 바람직하게는 pH4 내지 pH9의 조건에서 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 0 ℃ 내지 80 ℃, 바람직하게는 10 ℃ 내지 60 ℃, 보다 바람직하게는 15 ℃ 내지 50 ℃의 온도에서 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법으로 제조된 카르복실산은 추출 또는 결정화에 의해 수성 반응 용액으로부터 단리될 수 있다. 수성 반응 용액은 무기산 또는 유기산에 의해 산성화시킨 후에 유기 용매로 추출할 수 있다. 추출은 수율을 증가시키기 위해 수차례 반복시킬 수 있다. 상기 유기 용매는 염 첨가 후에 물과 상 경계를 나타내는 모든 용매를 사용할 수 있으며, 예컨대 톨루엔, 벤젠, 헥산, 메틸 3차 부틸 에티르 또는 에틸 아세테이트와 같은 용매를 사용할 수 있다.

생성물 카르복실산을 포함하는 유기상을 결정화하여 분리하는 경우, 용액을 0℃ 내지 10℃의 온도로 냉각시키는 것이 바람직하다. 결정화는 유기 용액으로부터 직접 일어날 수 있다. 결정화를 반복하기 위해 결정화된 생성물을 동일하거나 상이한 용매에 재차 용해하여 다시 한 번 결정화시킬 수 있으며, 후속 결정화는 생성물의 거울상 이성질체 순도를 더욱 증가시킬 수 있다. 또한, 카르복실산을 산에 의해 산성화시킨 후 즉시 수성 반응 용액으로부터 결정화시킬 수 있다. 이 경우 수용액을 가열하여 그 부피가 10 내지 90%, 바람직하게는 20 내지 80%, 특히 바람직하게는 30 내지 70% 정도로 감소되도록 농축시키는 것이 바람직하며, 결정화는 0℃ 내지 10℃의 온도에서 냉각에 의해 행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 단백질 RMN1(서열번호 1), RMN2(서열번호 3), ORN(서열번호 5), 및 VMN1(서열번호 7)이 실제로 나이트릴레이즈 활성을 나타내는지 확인하기 위하여, 상기 단백질을 다양한 나이트릴 기질과 반응시킨 후 pH 민감성에 의한 비색분석법을 이용하여 색깔의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 만델로나이트릴(MAN) 기질에 대해서는 사용한 모든 효소가 2시간 만에 모두 노란색으로 바뀌어 나이트릴레이즈 효소 활성을 보임을 알 수 있었고, RMN2를 제외한 모든 효소들은 다른 기질(ACN, ACRN, AND, BEN, BUTN 및 CBEN)들에 대해서도 4시간째에 노란색에 가까워지는 것을 관찰할 수 있었다(도 6).

따라서, 본 발명의 단백질들은 만델로나이트릴 기질에 대해 높은 나이트릴레이즈 활성을 갖고 있으며 넓은 범위의 기질특이성을 보이는 효소들임을 확인할 수 있다. 본 발명의 효소들은 앞으로 다양한 범위의 카르복실산 제조 및 생산에 기여할 것으로 기대된다.

본 발명의 나이트릴레이즈 단백질은 다양한 기질특이성을 가지므로 카르복실산을 고효율로 생합성하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 나이트릴레이즈에 의해 제조된 카르복실산은 산업적으로 고부가가치를 가지는 의약품 합성의 재료로 사용될 수 있다.

도 1은 나이트릴레이즈의 촉매 반응의 모식도와, pH의 민감성을 이용한 비색분석법에 의하여 나이트릴레이즈의 반응 여부를 측정한 결과를 나타낸 것이다. Pi 버퍼는 포스페이트 버퍼를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 사용된 나이트릴 기질들의 화학구조식을 나타낸 것이다. A는 아세토나이트릴(acetonitrile, ACN), B는 아크릴로나이트릴(acrylonitrile, ACRN), C는 아디포나이트릴(adiponitrile, ADN), D는 벤조나이트릴(benzonitrile, BEN), E는 부틸로나이트릴(butyronitrile, BUTN), F는 4-클로로벤조나이트릴(4-chlorobenzonitrile, CBEN), 및 G는 만델로나이트릴(mandelonitrile, MAN)을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 나이트릴레이즈 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현벡터의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에서 분리 및 정제한 나이트릴레이즈 RMN1, RMN2, VMN1, VMN2, ORN 및 LBN 의 아미노산 서열을 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다. 박스친 부분은 촉매성 3가 원소인 글루타메이트(Glutamate, E), 라이신(Lysine, K) 및 시스테인(Cysteine, C)을 나타낸다.
도 5는 본 발명에서 분리 및 정제한 나이트릴레이즈 RMN1, RMN2, VMN1, VMN2, ORN 및 LBN 을 SDS-PAGE로 나타낸 사진이다. (A)는 각각 효소의 발현 패턴을 나타낸다. M은 분자량 표준 마커, BL 은 대장균 BL-21 세포 추출물을 나타낸다. 레인 1, 3, 5, 7, 9 및 11는 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside)를 넣지 않아 과발현을 유도하지 않은 대장균 BL-21 세포 추출물이고, 레인 2, 4, 6, 8, 10 및 12 는 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside)를 넣어 과발현을 유도시킨 대장균 BL-21 세포 추출물이다. (B)는 각각 효소의 정제 패턴을 나타낸다.
도 6은 본 발명에서 분리 및 정제한 나이트릴레이즈 RMN1, RMN2, VMN1, VMN2, ORN 및 LBN 에 대하여 비색분석법을 통해 나이트릴레이즈 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다. EB(enzyme blank)는 효소 비처리군, SB(substrate blank)는 기질 비처리군, 및 DB(dye blank)는 염색약 비처리군을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재료 및 시약

균주 배양에 사용된 기본 배지는 디프코사(USA)의 제품을 사용하였다. 본 연구에 사용된 다양한 나이트릴 기질인 아세토나이트릴(acetonitrile, ACN), 아크릴로나이트릴(acrylonitrile, ACRN), 아디포나이트릴(adiponitrile, ADN), 벤조나이트릴(benzonitrile, BEN), 부틸로나이트릴(butyronitrile, BUTN), 4-클로로벤조나이트릴(4-chlorobenzonitrile, CBEN) 및 만델로나이트릴(mandelonitrile, MAN)은 알드리치사(USA)에서 구입하였다. 도 2는 본 발명에 사용된 나이트릴 기질들의 화학구조식을 나타낸 것이다. 그리고 본 연구에 사용된 모든 제품은 HPLC Grade로서 알드리치사에서 구입하였다.

실시예 2. 미생물 균주 및 배양 조건

본 연구에서는 Leeuwenhoekiella blandensis MED217, Oceanobacter sp. RED65, Reinekea sp. MED297 및 Vibrio sp. MED222 균주를 사용하였다. 상기 네 균주들은 스웨덴 칼마르 대학(University of Kalmar)의 제론 피나시(Jarone Pinhassi) 박사에게 분양 받았으며, Leeuwenhoekiella blandensis MED217 균주의 게놈 서열은 유전자은행 등록번호 NZ_AANC00000000, Oceanobacter sp. RED65 균주의 게놈 서열은 유전자은행 등록번호 NZ_AAQH00000000, Reinekea sp. MED297 균주의 게놈 서열은 유전자은행 등록번호 NZ_AAOE00000000, 및 Vibrio sp. MED222 균주의 게놈 서열은 유전자은행 등록번호 NZ_AAND00000000 에 공개되어 있다.

본 발명에서는 상기 균주들을 해양 미생물 배양 배지(marine broth)에서 균 접종한 후 진탕 배양기를 이용하여 교반속도 180 rpm 으로, 온도 30 ℃에서 3-4 일간 배양하였다.

DH5α 및 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 세포(Stratagene, LaJolla, CA, USA)를 각각 플라스미드 증식 및 유전자 발현용 균주로서 사용하였고, 적합한 항생제가 첨가된 LB(Luria-Bertani) 배지에서 37 ℃ 에서 배양하였다.

실시예 3. 해양 미생물 유래의 나이트릴레이즈 유전자의 ORF 서열 분석

Leeuwenhoekiella blandensis MED217, Oceanobacter sp. RED65, Reinekea sp. MED297 및 Vibrio sp. MED222 균주들로부터 나이트릴레이즈 유전자를 동정하기 위하여, Moore foundation (www.moore.org)으로 분석한 상기 균주들의 각 게놈 DNA 서열 중에서 개방해독틀(open reading frame, ORF)에 상응하는 서열(catalytic traid motifs)을 Ensoltek의 ProteinFinder(www.ensoltek.com) 및 BLAST 프로그램을 이용하여 분석하였다. 또한, 후보 나이트릴레이즈 아미노산 서열을 CLUSTAL W 프로그램(Thompson, et al., (1994) Nucleic. Acids. 22: 4673-4680)으로 분석하였다.

한편, 상기 균주들에 있어서 본질적인 나이트릴레이즈 활성-부위가 존재하는지 통상적인 방법으로 측정하였다. 이를 위해, 촉매성 3가 원소(catalytic traid motifs)가 포함된 서열을 선택하여 분석하였다.

실시예 4. 나이트릴레이즈 유전자 클로닝

Leeuwenhoekiella blandensis MED217, Oceanobacter sp. RED65, Reinekea sp. MED297 및 Vibrio sp. MED222 균주들의 ORF 서열 내에 있는 나이트릴레이즈 유전자를 클로닝하기 위하여, 우선 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 PCR 방법으로 상기 균주의 게놈 DNA를 증폭시켰다. 이때, 제한효소인 NdeI 과 XhoI 을 각각 프라이머 양끝에 붙였으며, lbn , orn , rmn1 , rmn2 , vmn1 및 vmn2 유전자의 정방향 및 역방향 프라이머 서열과 PCR 조건은 각각 표 1과 같다.

유전자	프라이머 종류	서열	서열번호	어닐링(℃)
lbn	정방향(lbnF)	5'-CGACCCGGCATATGAAAGAAGTAGATCACATAGAT-3'	13	63, 45
	역방향(lbnRH)	5'-CTCCACATCTCGAGTTTTTTCTTCCACTTAAGCTGAAA-3'	14	63, 49
	역방향(lbnRX)	5'-CTCCACATCTCGAGCTATTTTTTCTTCCACTTAAGCTG-3'	15	64, 51
orn	정방향(ornF)	5'-CGACCCGGCATATGACGCAAACTGTGATTACCGT-3'	16	57, 50
	역방향(ornRH)	5'-CTCCACATCTCGAGTAATCGTTTATGCTTCAACAATGG-3'	17	64, 51
	역방향(ornRX)	5'-CTCCACATCTCGAGTCATAATCGTTTATGCTTCAACAA-3'	18	63, 49
rmn1	정방향(rmn1F)	5'-CGACCCGGCATATGAGAGAAGTTACCGTAGCGG-3'	19	68, 51
	역방향(rmn1RH)	5'-CTCCACATCTCGAGAGCGCGTCCGTCTTTGGTCATT-3'	20	69, 57
	역방향(rmn1RX)	5'-CTCCACATCTCGAGCTAAGCGCGTCCGTCTTTGGTC-3'	21	70, 59
rmn2	정방향(rmn2F)	5'-CGACCCGGCATATGAAGTTAGCATTGGCCCAGC-3'	22	68, 51
	역방향(rmn2RH)	5'-CTCCACATCTCGAGGACCCCCGGCGCCCAGCCAT-3'	23	74, 64
	역방향(rmn2RX)	5'-CTCCACATCTCGAGTCAGACCCCCGGCGCCCAGC-3'	24	74, 64
vmn1	정방향(vmn1F)	5'-CGACCCGGCATATGCTTCAACCATTGGCGCTCG-3'	25	69, 57
	역방향(vmn1RH)	5'-CTCCACATCTCGAGACGATTCAACGCAGACGCTATC-3'	26	68, 55
	역방향(vmn1RX)	5'-CTCCACATCTCGAGTTAACGATTCAACGCAGACGCTA-3'	27	67, 53
vmn2	정방향(vmn2F)	5'-CGACCCGGCCATGGCTAAGAAAGACATCAAAGTAGCG-3'	28	69, 49
	역방향(vmn2RH)	5'-CTCCACATCTCGAGTTTCTCAGCAAAACGCGCTTGG-3'	29	68, 55
	역방향(vmn2RX)	5'-CTCCACATCTCGAGTTATTTCTCAGCAAAACGCGCTT-3'	30	66, 52

표 1에서 정방향 및 역방향 프라이머의 밑줄친 부분은 각각 NdeI 및 XhoI 부위를 가리키며, 히스티딘-태그가 없는 lbn , orn , rmn1 , rmn2 , vmn1 및 vmn2 유전자의 발현을 위하여, 표 1에 기재한 lbnRX, ornRX, rmn1RX, rmn2RX, vmn1RX 및 vmn2RX 역방향 프라이머를 추가로 제작하였다. PCR 반응조건은 표준 조건을 사용해서 (1) 95 ℃ 에서 1분간 초기 변성, (2) 94 ℃ 에서 20초간 변성, 45~74 ℃(통상 50~55 ℃) 에서 30초간 어닐링, 72 ℃ 에서 1분간 신장 (30 사이클), 및 (3) 72 ℃ 에서 10분간 최종 신장 조건으로 수행하였다. 각유전자 증폭에 있어서 정확한 어닐링(annealing) 온도는 표 1에 나타낸 바와 같다. PCR 반응 후, NdeI 및 XhoI 제한효소 부위를 가진 증폭된 단편을 NdeI/XhoI 부위를 가진 pET-24a (+) 벡터에 연결한 후, 이 재조합 발현벡터를 DH5α에 형질전환시켰고, 상기 재조합 발현벡터를 BL21-CodonPlus(DE3)-RP (Novagen) 균주에 도입하여 발현 유무를 확인하였다.

실시예 5. 나이트릴레이즈 유전자 발현 및 정제

상기 실시예 4에서 제조한 나이트릴레이즈 유전자 발현벡터가 실질적으로 세포에서 발현되는지 확인하기 위하여, 상기 형질전환체를 37 ℃에서 배양한 후 600 nm에서 O.D 값이 0.4 내지 0.6이 됐을 때 1 mM의 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside)를 첨가하여 발현을 유도하였다. 3 시간 배양한 후, 상기 세포를 5,000g에서 20분간 원심분리하여 수득하였고, 수득한 세포를 50 mM 포스페이트(pH 7.0), 0.5M KCl 및 10% 글리세롤을 포함한 용액에 현탁시켜 분쇄기로 균질화하였다. 세포 분쇄물은 HisㆍBind Purification Kit(Novagen)을 이용하여 15,000 g에서 30 분간 원심분리시켜 제거하였다.

용해성 단편은 500 mM NaCl, 20 mM 포스페이트(pH 7.0) 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 결합용액으로 평형상태를 유지한 Ni-NTA(Ni-nitrilotriacetic) 컬럼에 적재한 후, 500 mM NaCl, 20 mM 포스페이트(pH 7.0) 및 60 mM 이미다졸을 포함한 세척용액으로 세척하였다. 다음으로, 결합된 효소를 500 mM NaCl, 20 mM 포스페이트(pH 7.0) 및 1 M 이미다졸을 포함하는 용출용액으로 용출하였고, 50 mM 인산화용액(pH 7.0)으로 투석하였다. 단백질 정제는 Laemmli(1970)에 기재된 방법으로 SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 단백질 농도는 표준 단백질인 BSA와 함께 Bio-Rad 단백질 분석 키트를 이용한 Bradford 방법으로 측정하였다(Bradford (1976) Anal. Biochem 72: 248-254).

실시예 6. 나이트릴레이즈 활성 측정

상기 실시예 5에서 수득한 단백질의 나이트릴레이즈 활성을 확인하기 위하여 본 발명자들은 pH 민감성에 의한 비색분석법(colorimetric assay)을 이용하였다(Banerjee et al., (2003) J. Biomol. Screen. 8: 559-565). 96-웰 마이크로플레이트에 총 반응양 230 μl에 201 μl의 인산용액[10 mM 포스페이트(pH 7.2)]을 넣고, 0.01%가 되도록 브로모티몰 블루를 넣고, 5.75 μl의 나이트릴 기질들(500 mM stock in ethanol)을 넣고 마지막으로 23.25 μl의 나이트릴레이즈 첨가하여 30 내지 50 ℃에서 2 내지 4시간 반응시켰다. 나이트릴레이즈 활성을 보이게 되면 나이트릴 기질들이 카르복실산을 생성하기에 pH가 산성화되기에 파란색에서 노란색으로 변하게 된다(도 1). 위와 같은 방법으로 다양한 나이트릴레이즈를 사용하여 다양한 나이트릴 기질들에 대한 활성을 측정하였다.

실험결과

1. 해양미생물유래의 나이트릴레이즈 유전자의 ORF 서열 분석 결과

Leeuwenhoekiella blandensis MED217, Oceanobacter sp. RED65, Reinekea sp. MED297 및 Vibrio sp. MED222 균주로부터 나이트릴레이즈 유전자의 ORF 서열을 비교 분석한 결과를 도 4에 나타냈다. 즉, 도 4는 분리 및 정제된 나이트릴레이즈들의 아미노산 서열을 비교 분석한 것으로서, 비교 분석된 단백질의 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 등록번호 및 서열번호는 하기와 같다:

RMN1 (Reinekea sp. MED297), ZP_01112744, 서열번호 1;

RMN2 (Reinekea sp. MED297), ZP_01116337, 서열번호 3;

ORN (Oceanobacter sp. RED65), ZP_01308306, 서열번호 5;

VMN1 (Vibrio sp. MED222), ZP_01063455, 서열번호 7;

VMN2 (Vibrio sp. MED222), ZP_01063485, 서열번호 9; 및

LBN (Leeuwenhoekiella blandensis MED217), ZP_01060838, 서열번호 11.

상기와 같이 Reinekea sp. MED297 와 Vibrio sp. MED222 균주로부터 각각 두 개의 유전자를 선별할 수 있었고, Oceanobacter sp. RED65 와 Leeuwenhoekiella blandensis MED217 균주로부터 각각 한 개의 유전자를 선별할 수 있었다. 또한, 상기 선별된 나이트릴레이즈 효소는 모두 보존된 촉매성 3가 원소 (catalytic traid motifs)를 가지고 있었다(도 4).

구체적으로 보면, Reinekea sp. MED297 균주 유래의 RMN1는 ORF가 289개의 아미노산으로 구성되어 있으며 촉매성 3가 원소(E43, K116, 및 C153)가 존재하였고, 동 균주 유래의 RMN2은 ORF가 589개의 아미노산으로 구성되어 있으며 촉매성 3가 원소 (E41, K108, 및 C144)가 존재하였다. Vibrio sp. MED222 균주 유래의 VMN1 은 ORF가 297개의 아미노산으로 구성되어 있으며 촉매성 3가 원소(E77, K148 및 C180)가 존재하였고, 동 균주 유래의 VMN2 은 ORF가 320개의 아미노산으로 구성되어 있으며 촉매성 3가 원소(E45, K120 및 C151)가 존재하였다. 또한, Oceanobacter sp. RED65 균주 유래의 ORN는 ORF가 274개의 아미노산으로 구성되어 있으며 촉매성 3가 원소(E45, K118, 및 C160)가 존재하였고, Leeuwenhoekiella blandensis MED217 균주의 LBN은 ORF가 523개의 아미노산으로 구성되어 있으며 촉매성 3가 원소(E279, K354, 및 C388)가 존재하였다(도 4 및 표 2).

균주	길이 (아미노산)	분자량 (kDa)	촉매성 3가 원소			서열번호	효소명
균주	길이 (아미노산)	분자량 (kDa)	글루타메이트	라이신	시스테인	서열번호	효소명
Reinekea sp. MED297	289	32.1	E43	K116	C153	1	RMN1
Reinekea sp. MED297	538	60.2	E41	K108	C144	3	RMN2
Oceanobacter sp. RED65	274	30.0	E45	K118	C160	5	ORN
Vibrio sp. MED222	297	32.8	E77	K148	C180	7	VMN1
Vibrio sp. MED222	320	35.7	E45	K120	C151	9	VMN2
Leeuwenhoekiella blandensis MED217	523	60.5	E279	K354	C388	11	LBN

2. 나이트릴레이즈 유전자 클로닝 , 발현 및 정제 결과

Leeuwenhoekiella blandensis MED217, Oceanobacter sp. RED65, Reinekea sp. MED297 및 Vibrio sp. MED222 균주로부터 나이트릴레이즈를 클로닝, 발현 및 정제한 결과, Reinekea sp. MED297 유래의 재조합 나이트릴레이즈 RMN1와 RMN2의 분자량은 각각 32.1 kDa 과 60.2 kDa 이었고, Vibrio sp. MED222 유래의 재조합 나이트릴레이즈 VMN1와 VMN2의 분자량은 각각 32.8 kDa 과 35.7 kDa 이었으며, Leeuwenhoekiella blandensis MED217 과 Oceanobacter sp. RED65 유래의 재조합 나이트릴레이즈 LBN 과 ORN의 분자량은 각각 60.5 kDa 과 30.0 kDa 이었다(표 2).

도 5는 상기 나이트릴레이즈 효소들의 발현 패턴과 정제도를 잘 보여주고 있다.

3. 나이트릴레이즈 활성 측정 결과

pH 민감성에 의한 비색분석법을 이용하여, 96-웰 마이크로플레이트에 총 반응양 230 μl에 201 μl의 인산용액[10 mM 포스페이트(pH 7.2)]을 넣고, 0.01%가 되도록 브로모티몰 블루를 넣고, 5.75 μl의 다양한 나이트릴 기질들(도 2; 500 mM stock in ethanol)을 넣고 마지막으로 23.25 μl의 다양한 효소들(표 2 및 도 5)을 첨가하여 30 내지 50 ℃에서 2 내지 4시간 반응시켰다.

그 결과 만델로나이트릴(MAN) 기질에 대해서는 사용한 모든 효소가 2시간 만에 모두 노란색으로 바뀌어 나이트릴레이즈 효소 활성을 보임을 알 수 있었고, RMN2를 제외한 모든 효소들은 다른 기질(ACN, ACRN, AND, BEN, BUTN 및 CBEN)들에 대해서도 4시간째에 노란색에 가까워지는 것을 관찰할 수 있었다(도 6).

이 결과들을 종합해 보면, 본 발명자들이 분리한 효소들은 만델로나이트릴 기질에 대해 높은 나이트릴레이즈 활성을 갖고 있으며 넓은 범위의 기질특이성을 보이는 효소들임을 확인할 수 있다.

<110> GYEONGBUK INSTITUTE FOR MARINE BIOINDUSTRY KOREA OCEAN RESEARCH AND DEVELOPMENT INSTITUTE <120> Method for preparing a carboxylic acid using nitrilase VMN1 <130> DPP20107267KR <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 289 <212> PRT <213> Reinekea sp. MED297 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(289) <223> amnino acid sequences of nitrilase RMN1 <400> 1 Met Arg Glu Val Thr Val Ala Ala Thr Gln Met Pro Cys Gly Trp Asp 1 5 10 15 Val Ser Glu Asn Leu Lys Thr Ala Glu Arg Leu Val Arg Glu Ala Ala 20 25 30 Ala Ser Gly Ala Gln Val Ile Leu Leu Gln Glu Leu Phe Glu Arg Pro 35 40 45 Tyr Phe Cys Gln His Gln Lys Glu Glu Phe Arg Arg Phe Ala Thr Ala 50 55 60 Ile Asp Asp Asn Pro Ala Ile Ala His Phe Ala Pro Ile Ala Arg Glu 65 70 75 80 Leu Gly Val Val Leu Pro Ile Ser Phe Phe Glu Gln Cys Gly Pro Val 85 90 95 Ala Tyr Asn Ser Val Val Val Leu Asp Ala Asp Gly Glu Asn Leu Gly 100 105 110 Leu Tyr Arg Lys Thr His Ile Pro Asp Gly Pro Gly Tyr Cys Glu Lys 115 120 125 Phe Tyr Phe Thr Pro Gly Asp Thr Gly Phe Gln Val Phe Ser Thr Arg 130 135 140 Phe Gly Arg Ile Gly Val Gly Ile Cys Trp Asp Gln Trp Phe Pro Glu 145 150 155 160 Thr Ala Arg Ala Met Thr Leu Met Gly Ala Glu Leu Leu Phe Tyr Pro 165 170 175 Thr Ala Ile Gly Ser Glu Pro Tyr Asn Pro Asp Ile Asp Ser Ser Gly 180 185 190 His Trp Gln Arg Thr Gln Gln Gly His Ala Ala Ala Asn Val Ile Pro 195 200 205 Leu Ile Ala Ser Asn Arg Ile Gly Thr Glu Val Ile Asp Asp Thr Gln 210 215 220 Ile Thr Phe Tyr Gly Ser Ser Phe Ile Ala Asp Asn Thr Gly Ala Leu 225 230 235 240 Val Thr Ser Met Asp Arg Thr Ser Thr Gly Phe Ile Gln Ala Thr Phe 245 250 255 Asp Leu Asp Ala Leu Asn Ala Gln Arg Ser Glu Trp Gly Leu Phe Arg 260 265 270 Asp Arg Arg Pro Ser Gln Tyr Gly Thr Leu Met Thr Lys Asp Gly Arg 275 280 285 Ala <210> 2 <211> 870 <212> DNA <213> Reinekea sp. MED297 <220> <221> gene <222> (1)..(870) <223> nucleotide sequences of nitrilase RMN1 <400> 2 atgagagaag ttaccgtagc ggccacacag atgccctgtg gttgggacgt cagtgaaaat 60 ctcaagacgg cggaaaggct ggtacgcgaa gccgcggcca gcggggctca ggtcattctt 120 ttgcaggagc tgtttgaacg gccttacttc tgtcagcatc agaaagaaga atttcggcgc 180 tttgccaccg ccatcgatga taacccggcc attgcgcatt ttgcccccat cgcccgggaa 240 ctgggcgtgg tcttacccat cagctttttt gagcaatgcg gtccggtggc ctacaactcc 300 gtcgttgtgc tggatgcgga tggcgaaaac ctgggtctgt atcggaaaac gcacattccg 360 gacggtcccg gctactgcga gaagttttat ttcaccccgg gagataccgg ttttcaggtg 420 ttttcgacgc gcttcgggcg catcggcgtc gggatctgct gggatcaatg gtttccggaa 480 actgcgcggg cgatgacact gatgggggcg gaactgctgt tttacccgac cgccatcggc 540 agtgaaccct acaatccgga catcgattct tccggtcatt ggcagcgtac ccaacagggt 600 cacgcggcgg ccaatgtgat accgctgatt gccagcaacc gtatagggac agaggtcatc 660 gacgacactc agatcacctt ttacggttct tcgttcatcg ccgataacac gggcgcactg 720 gtgacgtcga tggatcgcac aagtaccggg tttatccagg caacgtttga tctggatgcc 780 ctgaacgctc agcgcagtga atgggggctg ttccgtgatc gccggcccag tcagtatggc 840 acgttaatga ccaaagacgg acgcgcttag 870 <210> 3 <211> 538 <212> PRT <213> Reinekea sp. MED297 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(538) <223> amnino acid sequences of nitrilase RMN2 <400> 3 Met Lys Leu Ala Leu Ala Gln Gln Arg Phe Pro Val Gly Asp Ile Asp 1 5 10 15 Gly Asn Val Asp Lys Ile Leu Thr Leu Ser Arg Glu Ala Met Ala Gln 20 25 30 Gly Ala Asp Met Ile Val Phe Pro Glu Leu Thr Leu Thr Gly Tyr Pro 35 40 45 Pro Glu Asp Leu Leu Leu Arg Pro Ser Leu Ala Lys Arg Val Ser Gln 50 55 60 Ala Met His Arg Leu Phe Asp Ala Arg Leu Pro Ile Ala Met Val Val 65 70 75 80 Gly Tyr Pro Gln Arg Glu Asp Gly Lys Leu Tyr Asn Lys Val Met Val 85 90 95 Ile Ser Glu Gly Gln Val Ile Ala Asp Tyr Arg Lys Gln His Leu Pro 100 105 110 Asn Tyr Gln Val Phe Asp Glu Lys Arg Tyr Phe Gln Lys Gly Asp Gln 115 120 125 Thr Cys Val Phe Asp Phe Met Gly Ala Arg Ile Gly Leu Ser Ile Cys 130 135 140 Glu Asp Ile Trp Tyr Asp Gly Pro Ala Arg Arg Ala Tyr Glu Ala Gly 145 150 155 160 Ala Gln Ile Asn Leu Asn Ile Asn Gly Ser Pro Tyr Ser Ile Asn Arg 165 170 175 Thr Ala Glu Arg His Glu Gln Val Thr Arg Val Val Ser Gln Trp Pro 180 185 190 Met Ala Thr Val Tyr Val Asn His Val Gly Gly Gln Asp Glu Leu Val 195 200 205 Phe Asp Gly Gly Ser Phe Val Val Gly Ala Asp Ala Thr Val Gln Ala 210 215 220 Ser Leu Pro Glu Phe Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Val Glu Leu Thr Gln 225 230 235 240 Glu Ala Asn Gly Trp Gln Val Lys Ser Gly Glu Val Thr Pro Pro Met 245 250 255 Ser Val Glu Ala Ala Leu Tyr Glu Ala Leu Lys Thr Gly Leu Ala Asp 260 265 270 Tyr Val Asn Arg Asn Arg Phe Pro Gly Val Val Leu Gly Met Ser Gly 275 280 285 Gly Ile Asp Ser Ala Leu Ser Ala Ala Ile Ala Val Asp Ala Leu Gly 290 295 300 Pro Asp Arg Val Met Gly Val Met Met Pro Tyr His Tyr Thr Ala Lys 305 310 315 320 Ile Ser Leu Glu Asp Ala Glu Asp Glu Ala Arg Arg Leu Gly Ile Arg 325 330 335 Tyr Glu Val Leu Pro Ile Gly Glu Ala Phe Glu Ala Ala Leu Thr Thr 340 345 350 Leu Gln Pro Gln Phe Gly Asp Arg Pro Ala Asp Val Thr Glu Gln Asn 355 360 365 Met Gln Ser Arg Met Arg Gly Leu Phe Leu Met Ala Leu Ser Asn Lys 370 375 380 Thr Gly Asn Met Val Leu Thr Thr Gly Asn Lys Ser Glu Met Ala Val 385 390 395 400 Gly Tyr Ala Thr Leu Tyr Gly Asp Met Cys Gly Gly Tyr Asn Cys Leu 405 410 415 Lys Asp Val Pro Lys Leu Trp Val Tyr Arg Leu Ser Arg Trp Arg Asn 420 425 430 Ser Phe Gly Glu Val Ile Pro Glu Arg Val Ile Thr Arg Pro Pro Ser 435 440 445 Ala Glu Leu Ala Pro Asp Gln Leu Asp Glu Asp Ser Leu Pro Pro Tyr 450 455 460 Glu Val Leu Asp Ala Ile Ile Glu Arg Tyr Val Glu His Asp Glu Ser 465 470 475 480 Gln Gln Thr Ile Ile Glu Ser Gly Phe Asn Glu Asp Asp Val Lys Arg 485 490 495 Val Ile Arg Leu Ile Asp Leu Asn Glu Tyr Lys Arg Arg Gln Ala Pro 500 505 510 Glu Gly Val Arg Val Thr Lys Arg Gly Phe Gly Arg Asp Arg Arg Tyr 515 520 525 Pro Ile Thr His Gly Trp Ala Pro Gly Val 530 535 <210> 4 <211> 1617 <212> DNA <213> Reinekea sp. MED297 <220> <221> gene <222> (1)..(1617) <223> nucleotide sequences of nitrilase RMN2 <400> 4 tcagaccccc ggcgcccagc catgtgtaat cgggtagcgc cggtcacgac caaaaccccg 60 cttggtgaca cgaacaccct caggtgcctg acggcgctta tactcattca gatcaatcaa 120 ccggatgaca cgtttgacat cgtcttcatt gaaaccggac tcgataatgg tttgctgact 180 ttcatcatgc tcgacatagc gttcaatgat ggcatccagc acttcatagg gcggcaagct 240 gtcttcgtcc agctgatccg gagccagctc ggccgatggc ggtcgggtaa tgacccgttc 300 agggattacc tctccgaagg agttgcgcca gcgagacaag cgatacaccc agagtttcgg 360 cacgtctttc aaacagttat agcccccaca catatcgccg tacaaggtgg cgtatccgac 420 cgccatctca ctcttattgc cggtggtcag caccatattg ccggttttgt tcgacaacgc 480 catcaaaaac aacccgcgca tacgcgattg catgttctgc tcggtaacat ccgccggccg 540 gtcaccaaac tgaggctgaa gcgtggttaa cgcggcttca aatgcctcac cgatgggcag 600 cacttcgtat cggataccga gacgacgagc ttcgtcttct gcatcctcca gagaaatttt 660 cgcggtgtag tgatagggca tcatcacgcc catcacccga tcaggtccca gggcatccac 720 agcaatggcg gcacttaacg ccgagtcgat tccgcctgac atacccagaa ctacgccggg 780 gaagcggttt cgattgacat agtcggccag ccccgtcttg agcgcttcat agagcgctgc 840 ctcgaccgac atcggcggtg ttacctcgcc tgatttcacc tgccagccat ttgcttcctg 900 cgtcagctca acgtactgca atgcctcctg aaactcaggc aacgaagcct gcacggtggc 960 gtcagctccg acaacaaagg agccaccatc aaaaaccagt tcgtcctgac cacctacatg 1020 gtttacgtag acggtcgcca tcggccattg agacaccacc cgagtcacct gttcgtgacg 1080 ctctgctgtt cgattaatgg agtaagggct gccgttaata ttcagattga tctgcgcacc 1140 ggcctcatag gcacgacgcg ccgggccgtc ataccagatg tcttcgcaaa tactcaatcc 1200 gatacgtgca cccatgaaat caaagacaca ggtctgatcc cccttctgaa aataccgctt 1260 ttcatcaaag acctgatagt ttggcaaatg ctgtttgcgg tagtcggcaa tcacctgccc 1320 ttcgctgatc accatgacct tgttgtaaag cttgccgtct tcacgttgag gatagccaac 1380 gaccatggca attggtaagc gcgcatcaaa caagcgatgc atggcctgac taacacgttt 1440 cgccagactc gggcgcagca aaagatcttc tggcgggtac ccggtcaagg tcagttccgg 1500 aaagacgatc atatctgcgc cctgcgccat ggcctcacgg ctcagggtga gaattttatc 1560 cacattgccg tcaatatctc cgactggaaa acgctgctgg gccaatgcta acttcat 1617 <210> 5 <211> 274 <212> PRT <213> Oceanobacter sp. RED65 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(274) <223> amnino acid sequences of nitrilase ORN <400> 5 Met Thr Gln Thr Val Ile Thr Val Gly Leu Val Gln Met Thr Ser Gly 1 5 10 15 Lys Ala Val Gln Pro Asn Leu Arg Ala Ala Glu Ala Ala Ile Lys Arg 20 25 30 Cys Val Glu Gln Gly Ala Thr Thr Val Leu Leu Pro Glu Met Phe Val 35 40 45 Cys Leu Gly Val Lys Asn Gln Val Glu Ile Ala Gln Thr Gln Cys Gln 50 55 60 Lys Gly Gly Pro Val Arg Ser Gln Leu Ser Ala Leu Ala Lys Asp Phe 65 70 75 80 Lys Val Asn Ile Ile Ala Gly Ser Met Pro Leu Met Ser Ser Val Glu 85 90 95 Asp Lys Val Leu Ala Ala Cys Leu Val Phe Ala Ala Asp Gly Ser Glu 100 105 110 Val Cys Gln Tyr Asp Lys Val His Leu Phe Asp Val Asp Val Ser Asp 115 120 125 Asn Lys Gly Arg Tyr Arg Glu Ser Asp Thr Phe Ile Ala Gly Thr Gln 130 135 140 Ser Lys Thr Val Ser Leu Asp Gly Thr Leu Tyr Gly Leu Ser Val Cys 145 150 155 160 Tyr Asp Leu Arg Phe Pro Glu Leu Tyr Gln Gln Tyr Gln Lys Gln Ser 165 170 175 Cys Gln Val Val Thr Val Pro Ser Ala Phe Thr Tyr Thr Thr Gly Gln 180 185 190 Lys His Trp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Arg Ala Ile Glu Thr Gln Ser 195 200 205 Phe Val Met Ala Ala Asn Gln Val Gly Thr His Glu Asp Gly Arg Ile 210 215 220 Thr Trp Gly Gln Ser Ile Val Ile Asn Pro Asp Gly Glu Ile Val Gly 225 230 235 240 Glu Leu Asp Ser Glu Lys Ala Gly Glu Leu Val Val Glu Leu Asp Leu 245 250 255 Glu Leu Cys Gln Lys Ile Arg Gln Ser Met Pro Leu Leu Lys His Lys 260 265 270 Arg Leu <210> 6 <211> 825 <212> DNA <213> Oceanobacter sp. RED65 <220> <221> gene <222> (1)..(825) <223> nucleotide sequences of nitrilase ORN <400> 6 tcataatcgt ttatgcttca acaatggcat agactgacga atcttttgac agagttcaag 60 atcaagttca acaaccaact cacctgcttt ttcgctgtct aactcgccca ctatttctcc 120 gtctggattg atgacaatag attgccccca ggtgatgcgt ccatcctcgt gggtgcccac 180 ctgattcgcg gccataacaa aactttgagt ttcaatagct cttgccttta ataaggtcaa 240 ccaatgcttt tgacctgtgg tataggtaaa cgcagagggt acggtcacga cctgacatga 300 ctgcttttga tactgttgat acaattcggg aaaacgcaaa tcatagcaaa cacttaaacc 360 atacagagta ccgtcaaggc taaccgtctt actttgagtc ccagctatga aagtatcaga 420 ttcacgataa cgacccttat tatcgcttac gtctacatca aacaaatgga ctttatcgta 480 ctggcaaacc tcgcttccat ctgcagcaaa aactaaacag gcagccaaca ccttatcttc 540 aacgctggac atcaacggca tagaacctgc gataatattt accttaaaat cctttgcaag 600 agcagataat tgagagcgga caggcccccc tttctgacat tgagtttgtg cgatctccac 660 ttgattcttt actcccaagc aaacaaacat ttcaggaagt aaaacggtag tggcgccttg 720 ttctacacag cgctttatcg cagcctctgc tgctcgtaaa ttaggttgga ctgctttgcc 780 actggtcatc tgtaccaagc cgacggtaat cacagtttgc gtcat 825 <210> 7 <211> 297 <212> PRT <213> Vibrio sp. MED222 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(297) <223> amnino acid sequences of nitrilase VMN1 <400> 7 Met Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Ser Ala Ser Asp Gly Gly Leu Ser 1 5 10 15 Tyr Pro Val Val Leu Ser Leu Lys Phe Glu Val Leu Pro Ser Lys Asp 20 25 30 Ser Ile Leu Asn Ser Val Ser Val Thr Leu Val Gln Leu Glu Val Glu 35 40 45 Tyr Lys Asn Lys Gln Met Asn Ile Ser Arg Val Ser Glu Leu Leu Glu 50 55 60 Ala Glu Thr Ala Val Gly Asp Ile Thr Leu Leu Pro Glu Leu Phe Ser 65 70 75 80 Thr Gly Tyr Ile Phe Asn Asp Ala Ala Glu Ile His Glu Leu Cys Glu 85 90 95 Asp Phe Asn Asn Ser Pro Thr Ile Asp Ser Leu Thr Ala Leu Ala Thr 100 105 110 Lys His Gln Thr Leu Ile Val Ala Gly Val Ala Glu Glu Asp Asn Gly 115 120 125 Gln Tyr Tyr Asn Ser Val Val Val Val Asp Gly Ser Gly Leu Arg His 130 135 140 Lys Tyr Arg Lys Val Ser Gln Thr Lys Phe Asp Lys Glu Tyr Phe Ser 145 150 155 160 Arg Gly Asn Glu Leu Leu Thr Phe Glu Tyr Lys Gly Leu Lys Phe Gly 165 170 175 Val Ala Ile Cys Phe Asp Ile Trp Phe Pro Glu Ile Met Arg Pro Tyr 180 185 190 Gln Ser Val Asp Val Ile Leu His Pro Ala Asn Phe Gly Gly His His 195 200 205 Ser Phe Ala Ile Ala Gln Ala Arg Ala Leu Glu Glu Gly Cys His Ile 210 215 220 Val Thr Cys Asn Arg Val Gly Gln Asp Val Val Asp Ala Phe Thr Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Cys Gly Gly Ser Arg Thr Tyr Ser Pro Lys Gly Asp Leu Met 245 250 255 Leu Gln Leu Ser Glu His Gln Ser Val Glu Thr Ile Asn Ile Gln Asp 260 265 270 Leu Ser Ile Ala Pro Gln Tyr Asn Gly Val Asp Val Leu Asp Glu Ile 275 280 285 Gln Gln Ile Ala Ser Ala Leu Asn Arg 290 295 <210> 8 <211> 894 <212> DNA <213> Vibrio sp. MED222 <220> <221> gene <222> (1)..(894) <223> nucleotide sequences of nitrilase VMN1 <400> 8 ttgcttcaac cattggcgct cgagtcagca agcgatgggg gattatctta ccctgtcgtt 60 cttagtctca agtttgaagt gttaccgagt aaggattcga ttttgaatag tgtcagcgtc 120 actcttgtcc agcttgaagt tgaatacaaa aataaacaaa tgaacatctc gcgagtctct 180 gagcttttgg aagctgagac ggcagtgggt gatatcacgt tgctgcctga actgttctct 240 actggatata tctttaacga tgccgcagaa attcatgaac tgtgtgaaga cttcaataac 300 agcccgacca ttgattcatt aactgcgctt gccacgaaac atcagacgtt aatcgttgcg 360 ggtgtcgctg aggaagataa tggtcagtat tacaatagcg ttgtggtggt tgatggttca 420 ggtttgcgtc ataaatacag aaaagtcagt caaacgaaat tcgacaaaga gtacttttct 480 agaggaaatg aacttcttac ttttgaatac aaaggcttga agttcggtgt cgcgatttgc 540 tttgatatat ggttcccgga gatcatgaga ccgtatcagt cggtagacgt tattctccat 600 cctgcgaatt ttggtggtca tcatagcttt gccattgcac aagcaagagc gttagaagaa 660 gggtgtcata tcgtgacctg taatcgcgtc gggcaagatg tggttgatgc ctttaccgcg 720 acatattgtg gcggcagtag aacctattca ccgaagggag acttaatgct tcaactcagt 780 gagcatcagt ctgttgaaac gattaatatt caagacttgt ctattgcgcc tcaatacaat 840 ggtgttgatg tgttagatga aatacaacag atagcgtctg cgttgaatcg ttaa 894 <210> 9 <211> 320 <212> PRT <213> Vibrio sp. MED222 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(320) <223> amnino acid sequences of nitrilase VMN2 <400> 9 Met Lys Lys Asp Ile Lys Val Ala Ser Val Gln Phe Asn His His Ala 1 5 10 15 Gly Asp Lys Ala Tyr Asn Leu Ser Val Ile Glu Gln Tyr Val Gln Lys 20 25 30 Ala Ala Asp Ser Asp Val Gln Ile Val Ser Phe Pro Glu Met Cys Ile 35 40 45 Thr Gly Tyr Trp His Val Ser Ala Leu Ser Arg Asp Glu Ile Glu Ala 50 55 60 Leu Ala Glu Pro Val Pro Gly Gly Glu Ser Thr Gln Lys Leu Ile Ala 65 70 75 80 Leu Ala Thr Gln Phe Gly Ile Ser Val Gly Ala Gly Leu Ile Glu Gln 85 90 95 Gly Ile Asp Gly Glu Leu Tyr Asn Thr Tyr Val Phe Ala Met Pro Asn 100 105 110 Gly Glu Val Gln Lys His Arg Lys Leu His Thr Phe Val Ser Pro His 115 120 125 Met Ser Ser Gly Asp Gln Tyr Thr Val Phe Asp Thr Pro His Gly Cys 130 135 140 Lys Val Gly Ile Leu Ile Cys Trp Asp Asn Asn Leu Val Glu Asn Val 145 150 155 160 Arg Ile Thr Val Leu Lys Gly Ala Asp Ile Leu Ile Ala Pro His Gln 165 170 175 Thr Gly Gly Cys His Ser Arg Ser Pro Asn Ala Met Lys Arg Ile Asp 180 185 190 Pro Glu Leu Trp Phe Asn Arg Asp Glu Asn Pro Asp Ala Ile Arg Ala 195 200 205 Glu Met Gln Gly Lys Asn Gly Arg Glu Trp Leu Met Arg Trp Leu Pro 210 215 220 Ala Arg Ala His Asp Asn Gly Leu Phe Val Val Phe Ser Asn Gly Val 225 230 235 240 Gly Val Asp Met Asp Glu Val Arg Thr Gly Asn Ala Met Ile Leu Ser 245 250 255 Pro Tyr Gly Glu Ile Ile Ala Glu Thr Asp Ser Val Asp Asn Asp Met 260 265 270 Val Ile Ala Glu Leu Lys Ala Glu Glu Leu Asp Met Cys Thr Gly Arg 275 280 285 Arg Trp Ile Arg Gly Arg Lys Pro Glu Leu Tyr His Ser Leu Thr Gln 290 295 300 Pro Leu Gly His Glu Leu Asp Pro His Gln Ala Arg Phe Ala Glu Lys 305 310 315 320 <210> 10 <211> 963 <212> DNA <213> Vibrio sp. MED222 <220> <221> gene <222> (1)..(963) <223> nucleotide sequences of nitrilase VMN2 <400> 10 atgaagaaag acatcaaagt agcgtcggtt caatttaacc accacgcagg tgataaggcg 60 tataacttat cggttataga gcaatacgtt caaaaggctg cggacagtga cgtgcagatc 120 gtcagtttcc cggagatgtg catcactggc tactggcatg tgtctgcttt gtcgcgagat 180 gagattgaag cgttagcgga acctgtaccg ggtggtgaat cgactcaaaa gctgattgca 240 ctggcaacac agtttggaat cagtgttggc gcgggcttga tagagcaggg catcgatggc 300 gaattataca acacctacgt attcgccatg cccaatggtg aggtacaaaa gcaccgtaaa 360 ctgcacacct tcgttagccc acatatgagc agtggcgacc aatacacagt gtttgatacg 420 cctcatggtt gcaaagtcgg tatcttgatt tgttgggata acaacttggt tgagaacgtc 480 aggatcactg ttttgaaagg cgccgatata ttgattgcgc cacaccaaac gggcggttgt 540 cattcacgaa gcccgaacgc gatgaagcga attgaccctg agttatggtt taaccgagat 600 gaaaacccag atgcgattcg tgcagaaatg cagggcaaga atggccgcga gtggctaatg 660 cgttggctgc ctgcaagagc gcacgataac ggcctctttg tggtgttcag taatggtgta 720 ggtgttgata tggacgaagt gaggacaggc aacgcgatga tcttgagccc ttacggtgaa 780 atcattgctg agaccgatag tgttgataac gatatggtga ttgcagagct aaaagcagaa 840 gagttagata tgtgtacggg cagacgttgg attcgtggtc gtaagccaga gctttatcat 900 tcactcacac aacctcttgg tcatgaactt gatccgcacc aagcgcgttt tgctgagaaa 960 taa 963 <210> 11 <211> 523 <212> PRT <213> Leeuwenhoekiella blandensis MED217 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(523) <223> amnino acid sequences of nitrilase LBN <400> 11 Met Lys Glu Val Asp His Ile Asp Asn Ser Asp Ser Ala Glu Lys Arg 1 5 10 15 Glu Arg Ile Asp Thr Ile Asn Leu Glu Tyr Leu Lys Val Lys Asp Phe 20 25 30 Glu Glu Leu Lys Glu Ile Met Ile Ala Val Tyr Pro Asn Ile Pro Asp 35 40 45 Pro Tyr Trp Lys Lys Lys Glu Leu Gln Lys Leu Val Ser Ile Phe Pro 50 55 60 Glu Gly Gln Val Val Val Lys Val Asn Gly Glu Ile Ala Gly Cys Ala 65 70 75 80 Leu Ser Ile Val Val Asp Tyr Glu Lys Phe Ser Asp Ser His Thr Tyr 85 90 95 Met Glu Ile Thr Gly Asp Glu Thr Phe Ser Thr His Thr Pro Lys Gly 100 105 110 Asn Val Leu Tyr Gly Ile Asp Ile Phe Ile Ser His Lys Tyr Arg Gly 115 120 125 Met Arg Ile Gly Arg Arg Leu Tyr Asp Tyr Arg Lys Glu Leu Cys Glu 130 135 140 Asn Leu Asn Leu Glu Arg Ile Val Phe Gly Gly Arg Leu Pro Asn Tyr 145 150 155 160 His Gln Tyr Ala Lys Glu Leu Ser Pro Lys Ala Tyr Ile Glu Lys Val 165 170 175 Arg Ala Arg Glu Ile Asn Asp Pro Val Leu Asp Phe Gln Leu Ser Asn 180 185 190 Asp Phe His Val Lys Arg Ile Ile Thr Asn Tyr Leu Glu Gly Asp Lys 195 200 205 Gln Ser Lys Glu Tyr Ala Ala Leu Leu Glu Trp Asp Asn Ile Tyr Tyr 210 215 220 Gln Lys Pro Ala Lys Lys Pro Asn Ala Ile Lys Thr Val Val Arg Leu 225 230 235 240 Gly Leu Val Gln Trp Gln Met Arg Thr Tyr Lys Asn Phe Glu Glu Leu 245 250 255 Phe Glu Gln Ala Glu Tyr Phe Ile Asp Thr Ile Ser Gly Tyr Arg Ser 260 265 270 Asp Phe Ala Leu Phe Pro Glu Phe Phe Asn Ala Pro Leu Met Ala Ala 275 280 285 Tyr Asn His Leu Ser Glu Pro Asp Ala Ile Arg Glu Leu Ala Lys Tyr 290 295 300 Thr Glu Arg Ile Arg Asp Arg Phe Ser Glu Leu Ser Val Ser Tyr Asn 305 310 315 320 Ile Asn Ile Ile Thr Gly Ser Met Pro Tyr Met Glu Asp Gly Thr Leu 325 330 335 Tyr Asn Val Gly Phe Leu Cys Lys Arg Asp Gly Thr Ile Glu Lys Phe 340 345 350 Tyr Lys Leu His Val Thr Pro Asp Glu Ala Lys Ala Trp Gly Met Ser 355 360 365 Gly Gly Glu Lys Leu Lys Thr Phe Asn Thr Asp Cys Gly Lys Ile Gly 370 375 380 Ile Leu Ile Cys Tyr Asp Val Glu Phe Pro Glu Leu Gly Arg Leu Leu 385 390 395 400 Ala Asp Glu Gly Met Asp Ile Leu Phe Val Pro Phe Leu Thr Asp Thr 405 410 415 Gln Asn Gly Tyr Ser Arg Val Arg His Cys Ala Gln Ala Arg Ala Ile 420 425 430 Glu Asn Glu Cys Tyr Val Ala Ile Ala Gly Ser Val Gly Asn Ile Pro 435 440 445 Lys Val His Asn Met Asp Met Gln Phe Ala Gln Ser Met Val Leu Thr 450 455 460 Pro Cys Asp Phe Gln Phe Pro Thr Asn Gly Val Lys Ala Glu Ala Thr 465 470 475 480 Pro Asn Ala Glu Met Ile Leu Val Ala Asp Val Asp Leu Asp Leu Leu 485 490 495 Lys Glu Leu Asn Gln Phe Gly Ser Val His Asn Leu Val Asp Arg Arg 500 505 510 Lys Asp Leu Phe Gln Leu Lys Trp Lys Lys Lys 515 520 <210> 12 <211> 1572 <212> DNA <213> Leeuwenhoekiella blandensis MED217 <220> <221> gene <222> (1)..(1572) <223> nucleotide sequences of nitrilase LBN <400> 12 ctattttttc ttccacttaa gctgaaataa atcttttctt cggtctacca aattatgaac 60 actaccaaat tgatttagtt ctttcaatag atcaagatct acatctgcaa cgagaatcat 120 ctcagcattt ggcgtcgctt ccgccttaac gccgtttgta ggaaactgaa agtcacaggg 180 tgttaacacc atactttgtg caaattgcat atccatatta tgtacttttg ggatgttccc 240 cacgcttccg gcgatagcca cataacattc gttctcaata gcccgtgcct gcgcacaatg 300 acgcacacgg ctgtatccat tttgcgtatc ggttaagaag ggaacgaaga gaatatccat 360 tccttcatct gctagtaaac gacccaattc tggaaactca acatcataac aaatgaggat 420 tccaatctta ccgcaatcgg tattgaaggt tttcagtttt tcgccaccgc tcatccccca 480 ggctttggct tcgtccggtg ttacgtgcag tttataaaac ttttctatcg taccgtcacg 540 tttacataag aatcccacgt tatacaacgt accgtcttcc atatacggca tactccctgt 600 aatgatattg atattatagc tcaccgaaag ctcactaaac cgatctctta tgcgctcggt 660 atattttgct aattctcgta tcgcatcagg ttctgataag tgattgtacg ctgccataag 720 cggagcatta aagaactctg gaaacaatgc aaagtctgaa cgatacccag aaatggtgtc 780 gataaaatat tcggcctgct caaaaagttc ttcaaaattt ttataggtac gcatctgcca 840 ttgcaccaag cctaaacgta caacggtttt gatcgcattt ggcttttttg ccggcttttg 900 ataatagata ttgtcccatt ctaaaagcgc cgcatactct tttgattgct tatctccttc 960 taggtaattt gtaataatcc gttttacgtg aaaatcatta ctcaactgaa agtcaagcac 1020 gggatcgtta atctcacgcg cacgcacttt ctctatgtag gcttttggag aaagttcttt 1080 ggcatactga tgatagttgg gtaatcttcc gccaaaaaca atgcgttcta aattaagatt 1140 ctcacacaat tctttacgat aatcataaag acgtcgacca atgcgcatgc cacggtactt 1200 atgagaaata aagatatcta taccgtacaa tacatttccc ttgggcgtat gcgtactaaa 1260 agtttcatcg cctgtgattt ccatataggt atgcgaatca gaaaacttct cgtaatctac 1320 cacgatagaa agggcacaac cagcgatctc cccgtttacc ttgaccacta cttgaccttc 1380 cggaaaaatg gaaaccagtt tttgcagctc ctttttcttc caataaggat ctggaatatt 1440 gggataaaca gcgatcatga tctccttgag ttcttcaaag tcttttactt ttaaatactc 1500 aagattgatg gtgtctatgc gttcgcgctt ttctgcactg tctgaattat ctatgtgatc 1560 tacttctttc at 1572 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer lbnF <400> 13 cgacccggca tatgaaagaa gtagatcaca tagat 35 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer lbnRH <400> 14 ctccacatct cgagtttttt cttccactta agctgaaa 38 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer lbnRX <400> 15 ctccacatct cgagctattt tttcttccac ttaagctg 38 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer ornF <400> 16 cgacccggca tatgacgcaa actgtgatta ccgt 34 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer ornRH <400> 17 ctccacatct cgagtaatcg tttatgcttc aacaatgg 38 <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer ornRX <400> 18 ctccacatct cgagtcataa tcgtttatgc ttcaacaa 38 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer rmn1F <400> 19 cgacccggca tatgagagaa gttaccgtag cgg 33 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer rmn1RH <400> 20 ctccacatct cgagagcgcg tccgtctttg gtcatt 36 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Claims

서열번호 7의 아미노산 서열로 나타내는 나이트릴레이즈 VMN1 또는 상기 나이트릴레이즈 VMN1을 포함하는 생촉매 조성물을 준비하는 단계; 및
상기 나이트릴레이즈 VMN1 또는 생촉매 조성물을 나이트릴 기질과 반응시키는 단계를 포함하는 카르복실산을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 나이트릴레이즈 VMN1을 포함하는 생촉매 조성물은 나이트릴레이즈 VMN1을 포함하는 세포, 상기 세포를 포함하는 세포 배양물 또는 세포 파쇄물을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 나이트릴 기질은 아세토나이트릴(acetonitrile), 아크릴로나이트릴(acrylonitrile), 아디포나이트릴(adiponitrile), 벤조나이트릴(benzonitrile), 부틸로나이트릴(butyronitrile), 4-클로로벤조나이트릴(4-chlorobenzonitrile) 및 만델로나이트릴(mandelonitrile)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 나이트릴레이즈 VMN1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체로부터 얻어진 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것인 방법.
서열번호 7의 아미노산 서열로 나타내는 나이트릴레이즈 VMN1을 포함하는 카르복실산 제조용 생촉매 조성물.
제6항에 있어서, 상기 생촉매 조성물은 나이트릴레이즈 VMN1을 포함하는 세포, 상기 세포를 포함하는 세포 배양물 또는 세포 파쇄물을 포함하는 것인 조성물.
제6항에 있어서, 상기 나이트릴레이즈 VMN1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체로부터 얻어진 것인 조성물.
제8항에 있어서, 상기 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것인 조성물.
제6항에 있어서, 상기 나이트릴레이즈 VMN1은 아세토나이트릴(acetonitrile), 아크릴로나이트릴(acrylonitrile), 아디포나이트릴(adiponitrile), 벤조나이트릴(benzonitrile), 부틸로나이트릴(butyronitrile), 4-클로로벤조나이트릴(4-chlorobenzonitrile) 및 만델로나이트릴(mandelonitrile)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상에 대하여 분해 활성을 갖는 것인 조성물.