WO1994006914A1 - Bacterial dna fragment containing gene which codes for ethylene-producing enzyme, and use thereof - Google Patents
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Definitions
- DNA fragment containing a gene encoding bacterial ethylene-forming enzyme and its use
- the present invention relates to a DNA fragment containing a gene encoding a bacterial ethylene-forming enzyme, a vector containing the DNA fragment, a transformant transformed with the vector, and ethylene production using the transformant.
- a DNA fragment containing a gene encoding a bacterial ethylene-forming enzyme a vector containing the DNA fragment, a transformant transformed with the vector, and ethylene production using the transformant.
- Ethylene is produced from crude oil and natural gas, but it has long been known that it is also produced by plants and microorganisms.
- the present inventors first purified the enzyme involved in ethylene production by electrophoresis to a single protein in order to clarify the etylene biosynthetic pathway and the ethylene reaction involved in the microorganism.
- the reaction to produce ethylene via KMBA is actually a radical reaction with active oxygen (Fukuda et al., FEMS Micrbiol. Lett., 60, 107, 1989) ⁇ Penicillium.
- Ethylene synthase via ⁇ -KG of Digitatum (Penicillium digitatum) IF0932 and its enzymatic reaction Fukuda et al., FEMS Microbiol.
- the present inventors have clarified the enzymes involved in the ethylene production pathway by microorganisms, and the properties thereof, but the ethylene production ability of these ethylene-producing bacteria was not necessarily sufficient.
- Pseudomonas syringae pv. Phaseolicola PK 2 3 ⁇ 4r was selected as the target, DNA containing the gene region encoding the ethylene-forming enzyme was identified, and the present invention was clarified. It was completed. sAq nsq dsy sAq usy ⁇ S y U TD
- the DNA encoding the ethylene-forming enzyme of the present invention can be prepared, for example, by purifying an ethylene-forming enzyme of Pseudomonas syringae to prepare a probe, and using this probe to hybridize the endogenous plasmid with the Southern method.
- the endogenous plasmid DNA was found to contain an ethylene-forming enzyme gene, and the restriction enzyme HindII fragment of the endogenous plasmid DNA was used to construct psC19 as a vector, and Escherichia coli
- a gene library can be prepared, and a positive clone E. coli JM109 (pEFEOl) can be screened from the gene library by hybridization using the Southern method.
- the plasmid pEFEOl of the cells of this positive clone E. coli JM109 (pEFE01) has inserted a Hind IE fragment of about 2.5 kbp derived from Pseudomonas syringae plasmid.
- JM109 (pEFE01) showed ethylene production activity.
- Fig. 1 shows the base sequence of the cloned ethylene synthase gene and the first half of the amino acid sequence translated therefrom
- Fig. 2 shows the base sequence of the cloned ethylen synthase gene and its translation. 2 shows the latter half of the amino acid sequence.
- the cell wall was first lysed with lysozyme and sodium dodecyl sulfate (SDS), the protein was denatured and removed by phenol extraction, and the DNA was recovered by ethanol precipitation.
- SDS sodium dodecyl sulfate
- the extraction of Plasmid DNA of Pseudomonas syringae was carried out by the extraction method.
- the extracted DNA was cut with the restriction enzyme Hind m, subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis, and the DNA in the gel after electrophoresis was transferred to a nylon membrane by the Kumble method, and then dried and heat-treated on the membrane. And subjected to Southern hybridization. Since the structural gene for ethylene-forming enzyme (EFE) appears to be present on plasmid by hybridization, The fragment of the plasmid DNA cut with m is ligated to Escherichia coli vector (pl) C19) which has been cut with BI and then treated with allyl phosphatase to obtain a chimeric plasmid. This chimeric plasmid is mixed with competent cells of Escherichia coli (E.
- EFE ethylene-forming enzyme
- E. coli JM109 prepared by the calcium chloride method, left on ice for 1 hour, heat shocked, centrifuged, Incorporate the chimeric plasmid into the cells and transform E. coli JM109.
- the transformed E. coli JM109 is spread on 2 XYT medium consisting of 16 liters of Bacto-tryptone, 10 gs of Bacterial yeast extract and 5 g of sodium chloride, and 1.5 hours. Leave it to stand for culture, centrifuge the cultured E. coli JM109, and inoculate the selective medium.
- E. coli JM109 (pEFE01), and the ethylene production rate was 23 OnlZml culture solution / hr.
- E. coli JM109 (a generally well-known open strain) used as a negative host did not show any ethylene-forming activity, and the ethylene-producing rate was that of the OnlZml culture solution Zhr.
- ethylene production activity refers to in vitro ethylene production using a cell-free extract prepared from cultured cells.
- Ethylene production rate refers to the ability to produce ethylene in vivo by the culture solution, and these characteristics are described in the literature (Nagahama; Fukuda et al .: J. Gen. Microbiol., 137, 2281, 1991). It can be measured according to the standard method described in.
- the transformant Escherichia coli JM109 (pEFE01) used here was sent to the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology at 1-3 1-3 Tsukuba East, on September 16, 1992. It has been deposited as Bacterial Deposit No. 1316-1 (FERMP-1316-1).
- a bacterium such as Escherichia coli which is harmless and easy to handle can be transformed to obtain a bacterium having a high ability to produce ethylene. Further, n which can be produced efficiently Echiren utilizing bacteria making this transformation
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Description
明 細 書
細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を含む D N A断片、 及びそ の用途 技術分野
本発明は、 細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を含む D N A 断片、 その D N A断片を含有するべクタ一、 そのベクターで形質転換さ せた形質転換体、 ならびに、 その形質転換体を用いるエチレン製造方法 に関する。 背景技術
エチレンは原油や天然ガスから生成されているのであるが、 植物ゃ微 生物によっても造られることが古くから知られていた。
そして、 Chouらは、 かびの一種であるぺニシリウム · ジギタツム (Penicillium digitatum)では CLーケ卜グルタール酸（α— K G )又は L 一グルタミ ン酸（Glu)がエチレンの前駆物質であると報告し（Arch.
Biochem. Biophys, 157, 73, 1973)、 Gotoらは植物病原菌の一種であるシュ 一ドモナス · シリンゲ（Pseudomonas syringae)の無細胞抽出液でのェチ レン生成系で、 α— K Gが基質であると報告（Plant Cell Physiol. 28, 405, 1987)している。
また、 Primroseらは大腸菌であるェシ工リ ヒア · コリイ (Escherichia coli)の無細胞抽出液でのエチレン生成系では、 L一メチォニン（Met) の代謝中間物質である 2—ケトー 4ーメチルチオ酪酸（K M B A )がェチ
レン生合成の前駆物質であると報告（J. Gen. Microbiol. 98, 519, 1977)し ている。
これらの報告では、 いずれも、 微生物の培養菌体、 又はその無細胞抽 出液など、 不純物を多量に含有している材料を使って実験しているため に、 ェチレン生成反応の真の基質や生合成経路が確定されなかったもの と考えられる。
そこで本発明者らは、 まず微生物によるェチレン生合成経路とェチレ ン生成酵素反応を明確にするために、 エチレン生成に関与する酵素を電 気泳動的に単一タンパク質まで精製した。 その結果、 K M B A経由のェ チレン生成反応は、 実は活性酸素によるラジカル反応であること（福田 ら、 FEMS Micrbiol. Lett. , 60, 107, 1989) ^ ぺニシリウム。 ジギタツム (Penicillium digitatum) I F 0 9 3 7 2の α— K G経由のエチレン生 成酵素とその酵素反応（福田ら、 FEMS Microbiol. Lett. , 591, 1989) さ りに、 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola P K 2の α— K G経由 のエチレン生成酵素とその性質（長浜 ·福田ら、 J. Gen. Microbiol. , , 2281. 1991)をそれぞれ明らかにした。
上記のように、 本発明者らによって、 微生物によるエチレン生成経路 と関与する酵素、 並びにそれらの性質などが明らかになつたが、 これら ェチレン生産菌のェチレン生成能力は必ずしも十分なものではなかった そこで、 エチレン生産菌の遺伝子操作による抜本的な育種改良を目的 として、 その対象に Pseudomonas syringae pv. phaseolicola P K 2 ¾r 選び、 そのエチレン生成酵素をコードする遺伝子領域を含む D N Aを解 明し、 本発明を完成するに至った。
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-δ-£lO/£6df/JDd W690 6 O
Lys Tyr Ser Asp Thr Arg Ala Thr Gly Ser で表されるァミノ酸配列を コードした遺伝子を導入することを特徴とする。
本発明のエチレン生成酵素をコードする D N Aは、 例えば、 シユード モナス · シリンゲのエチレン生成酵素を精製してプローブを作成し、 こ のプローブを用いて内在性プラスミ ドとサザン法でハイブリダィゼーシ ョンさせて内在性プラスミ ド D N Aにエチレン生成酵素遺伝子がコ一ド されていることを見出し、 この内在性プラスミ ド D N Aの制限酵素 Hind ΠΙ断片を用い、 pUC19をベクターとして、 ェシエリヒア♦ コリイ
(E. coli)を形質転換後、 遺伝子ライブラリーを作成し、 その中からサザ ン法によるハイブリダィゼ一シヨンにより、 ポジティブクローン E. coli JM109 (pEFEOl)をスクリーニングすることによりうることができる。 そして、 このポジティブクローン E. coli JM109(pEFE01)の細胞のプラ スミ ド pEFEOlにはシユードモナス · シリンゲプラスミ ド由来の約 2. 5kbp の Hind IE断片が挿入されており、 このポジティブクローン E. coJJ^
JM109 (pEFE01)にはエチレン生成活性が見られた。 また、 エチレン生成 酵素の抗体を用いたウェス夕ンブロッテイ ングによっても、 ポジティブ クローン E. coli JM109(pEFE01)はシユードモナス · シリ ンゲのエチレン 生成酵素蛋白質と区別できない蛋白質を発現していた。
挿入された 2. 5kbp Hind m断片を切断して、種々の大きさの欠失変異 株を作成した。 その中で、 エチレン生成活性を保持しつつ、 最も小さい pEFEOl誘導体を得た。 その大きさは約 1. 5kbPであつた。
図面の簡単な説明
第 1図はクローニングされたエチレン生成酵素遺伝子の塩基配列及び これから翻訳されたァミノ酸配列の前半部分を示すものであり、 第 2図 はクローニングされたェチレン生成酵素遺伝子の塩基配列及びこれから 翻訳されたァミノ酸配列の後半部分を示すものである。 発明を実施するための最良の形態
シュ一ドモナス · シリ ンゲの染色体 D N Aの抽出は、 まずリゾチーム とドデシル硫酸ナトリゥム（S D S )を用いて細胞壁を溶解させた後、 フ ヱノール抽出によって蛋白質を変性除去し、 エタノール沈殿によって D N Aを回収した。 また、 シユードモナス · シリンゲのプラスミ ド D N A の抽出はアル力リ抽出法で行った。
それぞれ抽出した D N Aを制限酵素 Hind mで切断し、 0 . 7 %ァーガ ロースゲル電気泳動を行い、 電気泳動後のゲル中の D N Aをキヤビラリ 一法によりナイロンメンブレンに卜ランスファーさせ、 乾熱処理により メンブレン上に結合させて、 サザンハイプリダイゼ一ションを行った。 ハイプリダイゼーションによりエチレン生成酵素（E F E )の構造遺伝 子はプラスミ ド上に存在すると思われるので、
mで切断したプ ラスミ ド D N Aのフラグメ ントを、 BIで切断したのちアル力リホ スファターゼ処理を施した大腸菌べクタ一（pl)C19)にライゲ一シヨンし、 キメラプラスミ ドを得る。 このキメラプラスミ ドを塩化カルシウム法に より調整したェシェリ ヒア · コリイ (E. coli JM109)のコンピテントセル と混合し、 1時間氷中放置後、 ヒートショックを与え、 遠心分離して、
細胞内にキメラプラスミ ドを取り込ませ、 E. coli JM109を形質転換さ せる。 この形質転換後の E. coli JM109を、 バク ト トリプトン 1 6 リ ッ トル、 バク ト酵母エキス 1 0 g Zリッ トル、 塩化ナトリウム 5 gノリ ッ トルからなる 2 X Y T培地にまき、 1 . 5時間放置して培養し、 培養 した E. coli JM109を遠心分離し、 選択培地に植菌する。
選択培地に発現したキメラプラスミ ドをもつコロニーをスクリーニン グし、 これらコロニーをパク ト トリプトン 1 0 g /リッ トル、 パク ト酵 母エキス 5 リツ トル、 塩化ナトリウム 1 0 g /リツ トルからなる L B培地にチアミ ン塩酸塩 5 β g /mU 了ンピシリンナトリウム 5 0 g /mlを添加して培養し、 その中からプラスミ ド D N A (キメラ pUC19)を アルカリ抽出し、 R N Aを除去してプラスミ ド D N Aを精製し、 Ηϊί^ mで処理後、 1 %ァガロースゲル電気泳動を行う。 この電気泳動したも のをアル力リ変性させて中和し、 ナイロンメ ンブレン上にブロッティ ン グし、 ハイブリダィゼーションによりエチレン生成酵素遺伝子を保持す る E. coliをスクリ一二ングする n
ハイプリダイゼ一ションした E. coliを、 前記 L B培地に L —グルタミ ン酸ソーダ 5 /mU チアミ ン塩酸塩 5 β g /mU アンピシリンナトリ ゥム 5 0 〃 g /mlを添加して培養したところ E. coli JM109(pEFE01)にェ チレン生成活性が認められ、 そのエチレン生成速度は 2 3 O nlZml培養 液/ hrであった。 —方ホス卜として使用した前記 E. coli JM109(—般に よく知られた公開の菌株）には、 エチレン生成活性が認められず、 また、 エチレン生成速度も O nlZml培養液 Zhrであった。 ここにエチレン生成 活性とは、 培養菌体から調整した無細胞抽出液による in vitroエチレン
生成能を示し、 エチレン生成速度とは培養液による in vivoエチレン生 成能を示すもので、 これらの特性は前記文献（長浜。福田ら ： J. Gen. Microbiol.， 137, 2281, 1991)などに記載されている常法に従つて測定す ることができる。
ここに使用した形質転換体 Escherichia coli JM109(pEFE01)は、 つく ば巿東 1丁目 1番 3号所在の工業技術院生命工学工業技術研究所に平成 4年 9月 1 6日付けで微ェ研菌寄第 1 3 1 6 1号 （F E R M P - 1 3 1 6 1 ) として寄託されている。
また、 ウエスタンブロッテイ ングにより、 シユードモナス * シリ ンゲ のェチレン生成酵素蛋白質と同じものが E. coli JM109(pEFE01)中にも存 在することが解った。 そして、 挿入された 2. 5kbp Hind Π断片を末端か ら欠損させ、 種々の大きさの欠失変異株を作成した。 その中で、 ェチレ ン生成活性を保持しつつ、 最も小さい pEFEOl誘 体を検索したところ、 その大きさは約 1. 5kbpであった。 なお、 この断片中には別の^ ΠΙ切 断部位や他の制限酵素 I、 EcoR I、 BamH Iの切断部位も存在 しなかった。
そして、 2 . 5 kbp Hind ΠΙ断片内に含まれているエチレン生成酵素遺 伝子をジデォキシ法でシーケンスして決定した塩基配列とァミノ酸配列 を第 1図及び第 2図に示す。 産業上の利用可能性
以上のように、 本発明では、 無害で取り扱いの容易な大腸菌等の細菌 類を形質転換してェチレン生成能力の高い細菌を得ることができる。
また、 この形質転換を行った細菌を利用してェチレンを効率よく製造 することができる n
Claims
請求の範囲
下記のァミノ酸配列
Met Thr Asn Leu Gin Thr Phe Glu Leu Pro Thr Glu Val Thr Gly Cys Ala Ala Asp lie Ser Leu Gly Arg Ala Leu lie Gin Ala Trp Gin Lys Asp Gly lie Phe Gin lie Lys Thr Asp Ser Glu Gin Asp Arg Lys Thr Gin Glu Ala Met Ala Ala Ser Lys Gin Phe Cys Lys Glu Pro Leu Thr Phe Lys Ser Ser Cys Val Ser Asp Leu Thr Tyr Ser Gly Tyr Val Ala Ser Gly Glu Glu Val Thr Ala Gly Lys Pro Asp Phe Pro Glu lie Phe Thr Val Cys Lys Asp Leu Ser Val Gly Asp Gin Arg Val Lys Ala Gly Trp Pro Cys His Gly Pro Val Pro Trp Pro Asn Asn Thr Tyr Gin Lys Ser Met Lys Thr Phe Met Glu Glu Leu Gly Leu Ala Gly Glu Arg Leu Leu Lys Leu Thr Ala Leu Gly Phe Glu Leu Pro lie Asn Thr Phe Thr Asp Leu Thr Arg Asp Gly Trp His His Met Arg Val Leu Arg Phe Pro Pro Gin Thr Ser Thr Leu Ser Arg Gly lie Gly Ala His Thr Asp Tyr Gly Leu Leu Val lie Ala Ala Gin Asp Asp Val Gly Gly Leu Tyr lie Arg Pro Pro Val Glu Gly Glu Lys Arg Asn Arg Asn Trp Leu Pro Gly Glu Ser Ser Ala Gly Met Phe Glu His Asp Glu Pro Trp Thr Phe Val Thr Pro Thr Pro Gly Val Trp Thr Val Phe Pro Gly Asp lie Leu Gin Phe Met Thr Gly Gly Gin Leu Leu Ser Thr Pro His Lys Val Lys Leu Asn Thr Arg Glu Arg Phe Ala Cys Ala Tyr Phe His Glu Pro Asn Phe Glu Ala Ser Ala Tyr Pro Leu Phe Glu Pro Ser Ala Asn Glu Arg lie His Tyr Gly Glu His Phe Thr Asn Met Phe Met
Arg Cys Tyr Pro Asp Arg lie Thr Thr Gin Arg lie Asn Lys Glu Asn Arg Leu Ala His Leu Glu Asp Leu Lys Lys Tyr Ser Asp Thr Arg Ala Thr Gly Ser で表わされる細菌のエチレン生成酵素をコ一 ドする遺伝子を含む D N A断片。
2 . 細菌がシユードモナス属菌である特許請求の範囲第 1項に記載のェ チレン生成酵素をコードする遺伝子を含む D N A断片。
3 . 下記の塩基配列、
ATG ACC AAC CTA CAG ACT TTC GAG TTG CCT ACC GAG GTA ACC GGC TGC GCC GCC GAT ATC TCA TTG GGA AGG GCG CTG ATC CAA GCC TGG CAA AAA GAT GGC ATT TTT CAG ATC AAG ACC GAT AGT GAG CAG GAT
CGC AAA ACG CAG GAA GCA ATG GCT GCT AGC AAG CAG TTT TGC AAG GAA CCG CTG ACT TTT AAG AGT AGC TGC GTT AGC GAT CTG ACC TAC AGC GGC TAT GTT GCG TCA GGC GAG GAA GTC ACA GCT GGT AAA CCT GAT TTC CCT GAA ATC TTC ACT GTC TGC AAG GAC TTG TCG GTA GGC GAT CAG CGT GTA AAA GCC GGC TGG CCT TGC CAT GGT CCG GTG CCA
TGG CCA AAT AAC ACC TAT CAG AAA AGC ATG AAG ACC TTC ATG GAA GAG CTG GGT TTA GCG GGC GAA CGG TTG CTC AAA CTG ACA GCG CTC GGC TTT GAA CTA CCC ATC AAC ACG TTC ACC GAC TTA ACT CGC GAT GGT TGG CAC CAC ATG CGT GTA TTA CGC TTC CCG CCC CAA ACA TCC ACG CTG TCC CGT GGA ATT GGT GCG CAC ACT GAC TAT GGG TTG TTG
GTA ATT GCC GCT CAG GAC GAT GTT GGT GGC TTA TAT ATT CGC CCT CCA GTC GAG GGA GAG AAG CGT AAT CGT AAC TGG TTG CCT GGT GAG AGC TCA GCA GGC ATG TTT GAG CAC GAT GAA CCT TGG ACC TTC GTG
ACG CCC ACC CCA GGC GTG TGG ACA GTT TTC CCA GGT GAT ATC TTG CAG TTC ATG ACC GGC GGC CAG CTG CTT TCC ACT CCG CAC AAG GTT AAG CTC AAT ACC CGC GAA CGT TTC GCC TGC GCT TAT TTT CAT GAG CCT AAT TTT GAA GCA TCC GCC TAT CCG TTG TTC GAG CCC AGC GCC AAT GAG CGT ATT CAT TAT GGT GAG CAC TTT ACC AAC ATG TTT ATG CGT TGC TAT CCA GAT CGG ATC ACC ACC CAG AGG ATC AAC AAG GAG AAT CGC CTG GCG CAC TTG GAG GAC TTG AAG AAG TAT TCG GAC ACC CGC GCG ACA GGC TCA で表わされる請求項 1又は請求項 2に記載し た細菌のエチレン生成酵素をコードする遺伝子を含む D N A断片。
4 . 下記の塩基配列
10 20 30 40 50
GCGACCGCGTGTCAGCAACGACAATCCTTACTCGGAGTCGCTGTTCAGGACACTGAAGT
60 70 80 90 100 110
ACTGCCCGCAATGGCCGCAGGATGGGTTTGCCAGTCTTGACGCGGCACGCTCTGGGTGAG
120 130 140 150 160 170
GGATTTCATGCGTTGGTACAACAATGATCACCGGCACAGCCGAATCCGCTTCGTGACACC
180 190 200 210 220 230
GGCTGAGCGGCATCGAGGGCTGGATCATCAGATCCTGGCCAAGCGACATGAGCTGTACGA
240 250 260 270 280 290
GCTAGCCAGAGAGAAAAGGCCGGAGCGGTGGTCGAGGGAGACACGCAACTGGGAACCGAT
300 310 320 330 340 350
CGGCACCGTGCTGTTAAACCCGGATCGAGAGCAAGACGTTGAGAAAAAAGCAGCATAGTT
360 370 380 390 400 410
AGACGGTTGACGCGACAACTACCTTGAAAAACGCCGGCAGGGACGCTCATGATTCATGCT
420 430 440 450 460 470
CCAAGCAGGTGGGGTGTTTTTCCGTCGCTTGGACTTTGTTCTCCCGACGTCGTTTGGAAT
480 490 500 510 520 530
GAGCATCCGTCCCTTTATATGGATAAAGAAGAGACTAGCATGACCAACCTACAGACTTTC
540 550 560 570 580 590
GAGTTGCCTACCGAGGTAACCGGCTGCGCCGCCGATATCTCATTGGGAAGGGCGCTGATC
600 610 620 630 640 650
CAAGCCTGGCAAAAAGATGGCATTTTTCAGATCAAGACCGATAGTGAGCAGGATCGCAAA
/£6f/dJcd 16/ OM -一
CD
06 09U ΐ 0 }}¾ J}38i3VVVJo 1JVVVV3
1800
CAAAAAGCTT
のうち、 少なくとも 5 1 9香から 1 5 6 8番の塩基配列を有する請求 項 1ないし請求項 3のいずれか 1項に記載の細菌のェチレン生成酵素 をコードする遺伝子を含む D N A断片。
. 請求項 1ないし請求項 4のいずれか 1項に記載の細菌のエチレン生 成酵素をコードする遺伝子を含む D N A断片を含有するべクタ一。. 請求項 5に記載のベクターで形質転換させた形質転換体。
. 請求項 6に記載のべクターで形質転換させた形質転換体を培養し、 エチレンを生成させることを特徴とするエチレンの製造方法。
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