ES2270458T3

ES2270458T3 - Procedimiento de biosintesis que permite la preparacion de o-fosfo-l-treonina.

Info

Publication number: ES2270458T3
Application number: ES97921933T
Authority: ES
Inventors: Francis Blanche; Beatrice Cameron; Joel Crouzet; Laurent Debussche; Denis Thibaut; Elisabeth Remy
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1996-05-13
Filing date: 1997-05-05
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2017-05-05
Also published as: CN1218508A; CA2254717A1; JP4293637B2; HUP9902730A3; EP0906430A1; US6156545A; WO1997043421A1; ATE334204T1; DE69736387T2; JP2000509992A; EA199801007A1; FR2748492A1; FR2748492B1; EP0906430B1; HUP9902730A2; EA002588B1; AU2781297A; CN1148451C; DK0906430T3; CA2254717C

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE BIOSINTESIS QUE PERMITE LA PREPARACION DE COBALAMINAS. LA INVENCION SE REFIERE MAS CONCRETAMENTE A UN PROCEDIMIENTO DE AMPLIFICACION DE LA PRODUCCION DE COBALAMINA Y MAS CONCRETAMENTE DE LA COENZIMA B 12 POR TECNICAS DE ADN RECOMBINANTE Y/O POR ADICION DE UN NUEVO PRECURSOR DE COBALAMINA.

Description

Procedimiento de biosíntesis que permite la preparación de O-fosfo-L-treonina.

La presente invención se refiere a un procedimiento para mejorar la síntesis in situ de O-fosfo-L-treonina de un microorganismo productor de cobalaminas.

La vitamina B_{12} forma parte de una clase de moléculas denominadas cobalaminas cuya estructura se presenta principalmente en WO91/11518.

Las cobalaminas son sintetizadas casi exclusivamente por bacterias según un proceso complejo que también se describe en WO91/11518. A nivel industrial, debido a la gran complejidad de los mecanismos de biosíntesis, la producción de cobalaminas y, en particular, de la vitamina B_{12} se realiza principalmente mediante cultivos de gran volumen de bacterias Pseudomonas denitrificans, Propionobacterium shermanii y Propionobacterium freudenreichii.

También se sabe que las cobalaminas son sintetizadas por determinados microorganismos a partir de los sustratos siguientes: ácido aminolaevulínico, S-adenosil-L-metionina, cobalto, glutamina, R1-amino-2-propanol y 5,6-dimetilbencimidazol.

Entre los precursores citados anteriormente, el 5,6-dimetilbencimidazol es sintetizado por los microorganismos productores de cobalaminas. Parece que existen dos vías de biosíntesis para el 5,6-dimetilbencimidazol: una es característica de los microorganismos aerobios e interviene el oxígeno molecular, la otra es utilizada por los microorganismos anaerobios. Sólo se ha aislado un gen que interviene en la vía anaerobia y se trata del gen cobT de Salmonella thyphimurium (Trzebiatowski et al., 1994). En los microorganismos aerobios no se ha identificado hasta el momento ningún gen de la síntesis del 5,6-dimetilbencimidazol. La cantidad de 5,6-dimetilbencimidazol sintetizada por los microorganismos es frecuentemente limitante.

Consecuentemente, el 5,6-dimetilbencimidazol se prepara químicamente y se añade a los medios de producción. La supresión de este aporte a los medios presentará, por lo tanto, una ventaja.

Hasta el momento, ningún procedimiento de preparación industrial de cobalaminas menciona la adición de precursores distintos del cobalto y el 5,6-dimetilbencimidazol. Recientemente, se han descrito determinadas cepas que producen cobalaminas sólo en medios que contienen R1-amino-2-propanol (Crouzet et al., 1990, Grabau et al., 1992). El R1-amino-2-propanol podría utilizarse, por lo tanto, para mejorar la producción de cobalaminas. Sin embargo, su utilización para una fermentación industrial eventual es delicada y costosa porque, por una parte, el R1-amino-2-propanol es un producto irritante y volátil y, por otra parte, puede inhibir el crecimiento del microorganismo. Por lo tanto, resultará especialmente ventajoso encontrar otro precursor del resto R1-amino-2-propanol de las cobalaminas que no presente estos inconvenientes. A este respecto, se describe una vía de biosíntesis del R1-amino-2-propanol a partir de la L-treonina a través de la aminoacetona en determinados microorganismos. Sin embargo, la L-treonina no permite la complementación de las cepas citadas anteriormente.

Más generalmente, para mejorar la producción de las cobalaminas puede resultar ventajoso incrementar la cantidad de sus precursores en el medio, en particular, si éstos son limitantes. Este método puede realizarse añadiendo directamente el precursor limitante o uno de sus derivados o análogos al medio, o amplificando la síntesis in situ de este precursor en la cepa productora utilizando las técnicas de genética y, en particular, la tecnología de ADN recombinante.

El conocimiento de las vías de biosíntesis de las cobalaminas y de sus precursores es, a este respecto, una etapa clave para mejorar la producción de las cobalaminas.

De esta manera, la mayoría de las etapas de la vía de biosíntesis de la vitamina B12 se ha caracterizado recientemente en Pseudomonas denitrificans (Blanche et al., 1995). No menos de 22 genes cob implicados en la biosíntesis de las cobalaminas se han aislado y se ha identificado la función de la mayoría de los polipéptidos codificados por estos genes.

Otros genes probablemente implicados en la biosíntesis de las cobalaminas o de sus precursores se han aislado en otros microorganismos. Algunas veces la función de estos genes no se conoce. Solamente la determinación precisa de su función o de su efecto permitirá encontrarles una aplicación. De esta manera, en una bacteria fotosintética facultativa, Rhodobacter capsulatus, se ha secuenciado recientemente un fragmento de ADN que contiene al menos un gen necesario para la formación del aparato fotosintético (Pollich et al., 1993, Pollich et al., 1995a). Se ha sugerido que 5 de los 8 genes aislados son genes de la biosíntesis de las cobalaminas debido a su fuerte homología con 5 de los 22 genes cob de P. denitrificans descritos anteriormente. Por el contrario, no puede asignarse directamente ninguna función precisa a los 3 genes restantes, los genes bluB, bluE y bluF. Los genes bluB, bluE y bluF incluyendo sus secuencias promotoras se han secuenciado y se describen en Pollich et al.,
1995a.

Según la presente invención, se ha descubierto un precursor nuevo de la cobalamina. La presente invención ha permitido, en efecto, obtener una mejora de la producción de la cobalamina con medios que contienen O-fosfo-L-treonina. Este precursor de las cobalaminas, que no se ha descrito hasta el momento, tiene una función comparable a la del otro precursor conocido, el R1-amino-2-propanol. Sin embargo, la O-fosfo-L-treonina posee la ventaja respecto al R1-amino-2-propanol de no ser tóxica y de ser un producto fácilmente manipulable. Además, su eficacia para mejorar la producción de cobalaminas puede ser más de 1.000 veces superior a la del R1-amino-2-propanol.

La presente invención también tiene por objeto la utilización de un fragmento de ADN de Rhodobacter capsulatus para mejorar o para obtener o incrementar la síntesis in situ de O-fosfo-L-treonina o de 5,6-dimetilbencimidazol de una célula dada.

La presente invención ha permitido obtener una mejora de la producción de cobalaminas con medios que no contienen R1-amino-2-propanol ni O-fosfo-L-treonina mediante la utilización de un fragmento de ADN que contiene principalmente los genes bluE y bluF de Rhodobacter capsulatus.

Finalmente, la presente invención ha permitido obtener una mejora de la producción de cobalaminas en medios que no contienen 5,6-dimetilbencimidazol mediante la introducción de un fragmento de ADN que contiene principalmente el gen bluB de Rhodobacter capsulatus.

La presente invención tiene por objeto un procedimiento para mejorar la síntesis in situ de O-fosfo-L-treonina de un microorganismo procariota productor de cobalamina, caracterizado porque se utiliza un microorganismo transformado con al menos un fragmento de ADN que comprende los genes bluE y bluF de Rhodobacter capsulatus y se cultiva dicho microorganismo en condiciones que permiten la expresión de dichos genes. La invención también tiene por objeto un procedimiento tal como el mencionado anteriormente en el que el microorganismo transformado con al menos un fragmento de ADN que comprende los genes bluE y bluF de Rhodobacter capsulatus, está transformado además con al menos un fragmento de ADN que codifica una enzima implicada en una vía de biosíntesis del 5,6-dimetilbencimidazol y que comprende el gen bluB de Rhodobacter capsulatus.

El microorganismo puede contener de forma endógena un gen tal como el caracterizado anteriormente. En este caso, el procedimiento según la invención permite la sobreexpresión de la enzima. Sin embargo, dicho microorganismo puede no contener este tipo de gen de manera endógena.

Por "fragmento de ADN que codifica una enzima implicada en una vía de biosíntesis de la O-fosfo-L-treonina o del 5,6-dimetilbencimidazol", se entiende que la expresión de dicho fragmento de ADN se traduce en una síntesis de la O-fosfo-L-treonina o del 5,6-dimetilbencimidazol en la célula, seguida opcionalmente de una liberación en el medio de cultivo.

El cultivo puede realizarse en discontinuo o bien en continuo, y la purificación de las cobalaminas puede realizarse mediante los métodos utilizados a nivel industrial (Florent, 1986).

En un modo de realización, se utiliza un microorganismo transformado con un fragmento de ADN que codifica un polipéptido implicado en una vía de biosíntesis de la O-fosfo-L-treonina que comprende los genes bluE y bluF de Rhodobacter capsulatus.

En otro modo de realización, se utiliza un microorganismo transformado con un fragmento de ADN que codifica una enzima implicada en una vía de biosíntesis del 5,6-dimetilbencimidazol que comprende el gen bluB de Rhodobacter capsulatus.

La invención implica la utilización de un fragmento de ADN de origen natural, sintético o recombinante y homólogo. Por fragmento, se entiende un fragmento resultante de la degeneración del código genético.

De manera apropiada, se utiliza un microorganismo cultivado en aerobiosis y dicho fragmento de ADN codifica una enzima implicada en una vía de biosíntesis en aerobiosis del 5,6-dimetilbencimidazol.

La presente invención también tiene por objeto un procedimiento para la preparación de cepas recombinantes del microorganismo procariota productor de cobalamina, caracterizado porque se transforma dicho microorganismo mediante técnicas de ingeniería genética con al menos un fragmento de ADN que codifica una enzima implicada en una vía de biosíntesis de la O-fosfo-L-treonina o del 5,6-dimetilbencimidazol tal como se ha definido
anteriormente.

La presente invención también tiene por objeto las cepas recombinantes obtenidas mediante el procedimiento de preparación de cepas según la presente invención.

La presente invención implica la utilización, en los procedimientos según la invención, de un ADN recombinante que contiene al menos una secuencia de ADN que codifica un polipéptido mencionado y en el que la o las secuencias mencionadas se sitúan bajo el control de señales de expresión.

A este respecto, se puede situar en posición 5' de la secuencia de ADN de las regiones promotoras. Dichas regiones pueden ser homólogas o heterólogas de la secuencia de ADN. En particular, podrían utilizarse promotores bacterianos fuertes, tales como el promotor del operón triptófano Ptrp o del operón lactosa Plac de E. coli, el promotor izquierdo o derecho del bacteriófago lambda, los promotores fuertes de fagos de bacterias, tales como corinebacterias, los promotores funcionales de las bacterias gram-negativas, tal como el promotor Ptac de E. coli, el promotor PxylS de los genes del catabolismo del xileno del plásmido TOL o el promotor de la amilasa de Bacillus subtilis Pamy. También se pueden citar los promotores obtenidos de genes glicolíticos de levadura, tales como los promotores de los genes que codifican la fosfoglicerato quinasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, lactasa o enolasa, que podrían utilizarse cuando el ADN recombinante se introduzca en un anfitrión eucariota. En posición 5' de la secuencia de ADN también se situará un sitio de fijación a los ribosomas y podrá ser homólogo o heterólogo, tal como el sitio de fijación a los ribosomas del gen cII del bacteriófago lambda.

Las señales necesarias para la terminación de la transcripción podrán situarse en posición 3' de la secuencia de ADN.

El ADN recombinante utilizado en los procedimientos según la presente invención puede introducirse directamente en una célula anfitriona compatible con las señales de expresión elegidas o puede clonarse en un vector plasmídico para permitir introducir de manera estable la secuencia de ADN en cuestión en la célula anfitriona.

La invención implica de manera conocida la utilización de plásmidos que contienen una secuencia de ADN que codifica un polipéptido mencionado. De manera conocida, estos plásmidos también contienen un sistema de replicación funcional y un marcador de selección.

Pueden utilizarse diferentes tipos de vectores. En el marco de la invención se prefiere utilizar vectores del tipo RK2, es decir, vectores que tienen un origen de replicación RK2. Como ejemplo particular se puede citar el vector RK2 (Saurugger et al., 1986), el vector pXL435 (Cameron et al., 1989), el vector pRK290 (EEUU 4.590.163; Ditta et al., 1985) y el vector pXL1635 (WO 91/16439). Un vector especialmente ventajoso es el vector pXL1635. En la solicitud WO 91/16439 se describen otros vectores.

Según una variante de realización, se utiliza un microorganismo transformado con un fragmento de ADN que comprende un fragmento BamHI de 6,8 kb del plásmido pER1 (figura 1), descrito en los ejemplos siguientes y que codifica la síntesis de dos precursores, O-fosfo-L-treonina y 5,6-dimetilbencimidazol.

En un modo de realización más especialmente apropiado para la expresión de un polipéptido implicado en la síntesis de la O-fosfo-L-treonina, se utiliza un fragmento de ADN que comprende el fragmento EcoRI/CIaI de 2,1 kb del plásmido pER2 (figura 2), descrito en los ejemplos que aparecen a continuación.

En un modo de realización más especialmente apropiado para la expresión de un polipéptido implicado en la síntesis de la O-fosfo-L-treonina, se utiliza un fragmento de ADN que comprende el fragmento EcoRI/EcoRV de 1,6 kb del plásmido pER2 (figura 2), descrito en los ejemplos que aparecen a continuación.

En otro modo de realización, más especialmente apropiado para la expresión de un polipéptido implicado en la síntesis del 5,6-dimetilbencimidazol, se utiliza un fragmento de ADN que comprende el fragmento BamHI de 6,8 kb del plásmido pER1, descrito en los ejemplos que aparecen a continuación.

Los microorganismos procariotas anfitriones que pueden utilizarse según la invención son más particularmente las bacterias de los géneros E. coli, Pseudomonas denitrificans, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium tumefaciens, o Rhizobium melitoti o también Rhodobacter capsulatus. En WO91/11518 se describen otras bacterias.

Sin embargo, se utilizará ventajosamente una bacteria P. denitrificans o A. radiobacter.

Otras ventajas y características de la presente invención aparecerán a la vista de la descripción detallada que aparece a continuación.

Los ejemplos 1 y 2 describen como es posible obtener una producción de cobalaminas añadiendo O-fosfo-L-treonina al medio de cultivo de una cepa de Pseudomonas denitrificans o de Rhodobacter capsulatus. El ejemplo 2 muestra como la O-fosfo-L-treonina puede reemplazar ventajosamente al R1-amino-2-propanol en el medio de producción, ya que son necesarias concentraciones al menos 1.000 veces más altas de R1-amino-2-propanol para obtener una producción de cobalaminas.

El ejemplo 2 también muestra que la región del cromosoma de Rhodobacter capsulatus que contiene los genes bluE y bluF está implicada en la síntesis de la O-fosfo-L-treonina. El ejemplo 3 describe la construcción de plásmidos que contienen los genes bluE y bluF a partir de un fragmento de ADN de Rhodobacter capsulatus. Este ejemplo 3 muestra sobre todo como estos plásmidos, una vez introducidos en las cepas en las que la producción de cobalaminas es dependiente de la adición de R1-amino-2-propanol o de O-fosfo-L-treonina, permiten obtener una producción de cobalaminas en medios que no contienen R1-amino-2-propanol ni O-fosfo-L-treonina. El ejemplo 4 muestra que la región del cromosoma de Rhodobacter capsulatus que contiene el gen bluB está implicada en la síntesis de 5,6-dimetilbencimidazol.

Lista de las figuras

Figura 1: mapa de restricción del plásmido pER1

Figura 2: mapa de restricción del plásmido pER2

Figura 3: mapa de restricción del plásmido pER3

Las figuras 1 a 3 representan los plásmidos pER1, pER2 y pER3 respectivamente.

1. Cepas y plásmidos

Las cepas AH2 y BB1 de Rhodobacter capsulatus (Pollich et al., 1995a) se construyeron a partir de la cepa 37b4 (DSM 938). La cepa G2650 de Pseudomonas denitrificans se construyó a partir de la cepa SBL 27 Rif^{r} por inserción del transposón Tn^{5} (Crouzet et al., 1990). En primer lugar, se construyó una cepa G2650[Tet] utilizando un transposón Tn^{5} que contiene el gen de resistencia a la tetraciclina. Después, se construyó una cepa G2650[Sp] a partir de la cepa G2650[Tet] por intercambio del gen de resistencia a la tetraciclina del transposón Tn^{5} por el gen de resistencia a la espectinomicina. La cepa SBL 27 Rif^{r} se obtiene de la cepa MB 580 (Patente de EEUU, 3.018.225).

El plásmido pBBW1 se construyó a partir de un fragmento de ADN de Rhodobacter capsulatus (Pollich et al., 1995a). El plásmido pAHW25 (Pollich y Klug, 1995a) se construyó a partir del plásmido pBBW1.

2. Técnicas moleculares

Las técnicas generales de manipulación de ADN utilizan como referencia el manual de laboratorio (Sambrook et al., 1989).

Las enzimas se utilizan como recomienda el fabricante y provienen de los laboratorios New England Biolabs y Boehringer Mannheim.

Las técnicas utilizadas contienen esencialmente las etapas siguientes:

-: digestión con enzimas de restricción;

-: unión de moléculas de ADN por la ligasa del bacteriófago T4.

3. Técnicas de transformación

La transformación de las cepas de E. coli se realiza por electroporación (Dower et al., 1988).

4. Técnicas de conjugación

Las conjugaciones entre la cepa S17-1 de E. coli y las diferentes cepas de P. denitrificans se realizan según un protocolo adaptado del descrito por Simon y sus colaboradores (Simon et al., 1986). La transformación de las cepas de Pseudomonas puede realizarse mediante cualquier técnica de ingeniería genética.

5. Preparación de los medios de producción de cobalaminas

El medio utilizado para la producción de cobalaminas por las cepas de P. denitrificans es el medio PS4 descrito por Cameron et al., 1989.

El medio utilizado para la producción de cobalaminas por las cepas de Rhodobacter capsulatus es el medio RA descrito por Pollich, 1995b.

6. Dosificación de las cobalaminas producidas

La cantidad de cobalaminas producida se determina por dosificación microbiológica o por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Dosificación microbiológica

La cantidad de cobalaminas producida se determina por un método semi-cuantitativo utilizando la cepa indicadora 113-3 de E. coli, auxótrofa para la vitamina B12 (Davis y Mingioli, 1950).

Esta cepa indicadora es un mutante metE de E. coli que no posee, por lo tanto, más que una única homocisteína metiltransferasa (EC 2.1.1.13) que es dependiente de B12. En medio mínimo, ésta no requiere más que la presencia de la vitamina B12 para crecer. Cuando esta cepa se incluye en una sobrecapa de medio mínimo M9 (Miller, 1972) gelosado (aquel al que sólo falta la vitamina B12 para permitir el crecimiento de la cepa), es posible dosificar la vitamina B12. En efecto, si se deposita en la superficie de la sobrecapa una muestra de una disolución que contiene vitamina B12, es visible una aureola de crecimiento alrededor del depósito después de 16 h de incubación a 37ºC. La vitamina B12 contenida en la muestra difunde y permite el crecimiento de las bacterias incluidas en el agar. El diámetro de la aureola de crecimiento es proporcional a la concentración de B12 en la muestra.

Las muestras se obtienen mediante lisis de las células según el protocolo siguiente:

Se mezcla 0,1 ml de una disolución de (Tris-HCI pH = 8 100 mM, EDTA 20 mM, sacarosa 200 g/l) que contiene 24 mg/ml de lisozima (Boehringer Mannheim) con 0,5 ml del cultivo celular que se va a dosificar. Después de 30 min de incubación a 37ºC, se añaden 60 \mul de una disolución de sodio dodecilsulfato a 30 g/l y la mezcla se agita con agitador algunos segundos. Se depositan en la superficie de la sobrecapa 10 \mul del lisado celular obtenido u opcionalmente una dilución 1/50.

Dosificación por HPLC

Los métodos utilizados para la dosificación de las cobalaminas por cromatografía líquida de alta resolución son los descritos por Blanche et al.; 1990.

Ejemplo 1 Efecto de la O-fosfo-L-treonina en la producción de cobalaminas por una cepa de Pseudomonas denitrificans

La cepa G2650 [Tet] de Pseudomonas denitrificans se cultiva en 25 ml de medio PS4 que contiene 2 \mug/ml de tetraciclina, en Erlenmeyer de 100 ml. Después de 24 h de fermentación a 30ºC con agitación (250 rpm), se añaden al medio 0,16 ó 0,32 ó 1,5 ml de una disolución de O-fosfo-L-treonina a 10 g/l, que corresponde a una concentración final de 66, 132 y respectivamente 600 mg/l. Las cantidades de cobalaminas producidas en cada una de estas condiciones se dosifican por HPLC al cabo de 148 h de fermentación. Los resultados (tabla 1) muestran que la cepa G2650 [Tet] no produce vitamina B12 en medio PS4. Por el contrario, la presencia de O-fosfo-L-treonina en el medio, permite la producción de B12 por esta misma cepa. La cantidad de vitamina B12 producida es tanto más importante cuanto mayor es la cantidad de O-fosfo-L-treonina añadida.

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TABLA 1

O-fosfo-L-treonina añadida al medio (mg/l)	0	66	132	600	600
					(añadida a t = 0)
B12 (mg/l) producida	0	1,8	2,5	4,2	3,8

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Ejemplo 2

Efectos comparados de la O-fosfo-L-treonina y del R1-amino-2-propanol en la producción de cobalaminas por una cepa Rhodobacter capsulatus

La cepa AH2 de Rhodobacter capsulatus se cultiva en Erlenmeyer de 100 ml en 70 ml de medio RA en presencia de 10 \mug/ml de kanamicina y de diferentes concentraciones de O-fosfo-L-treonina y de R1-amino-2-propanol. Después de 24 a 48 h de fermentación a 30ºC con agitación (100 rpm), se determina la cantidad de cobalaminas producida en las diferentes condiciones mediante dosificación microbiológica.

Los resultados se muestran en la Tabla 2, en la que "-" significa ausencia de halo de crecimiento de la cepa indicadora y "+", presencia de un halo de crecimiento de un diámetro tanto más importante cuantas más "+" haya. Estos resultados muestran que la cepa AH2 de R. capsulatus, cultivada en medio RA no produce vitamina B12. Por el contrario, en presencia de O-fosfo-L-treonina o de R1-amino-2-propanol, esta cepa es capaz de producir vitamina B12. Los resultados muestran también que hace falta añadir del orden de 6.10^{3} veces más R1-amino-2-propanol para tener el mismo resultado que con O-fosfo-L-treonina.

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TABLA 2

Concentración de O-fosfo-L-treonina en el medio	10 nM	25 nM	50 nM	100 nM	250 nM
Producción de B12	-	+	++	+++	++++

Concentración de R1-amino-2-propanol en el medio	6 \muM	30 \muM	150 \muM	1,2 mM
Producción de B12	-	-	-	+

Ejemplo 3 Efecto de la presencia de un fragmento de ADN obtenido del plásmido pBBW1 en la cepa G2650, no productora de cobalaminas 3.1. Construcción del plásmido pER1 (figura 1)

El plásmido pER1 de 17,4 kb se construyó por clonación en el sitio BamHI del vector pXL435 (Cameron et al., 1989) del fragmento de ADN BamHI de 6,8 kb purificado a partir del plásmido pBBW1 (Pollich y Klug, 1995).

3.2. Introducción del plásmido pER1 en la cepa G2650 de P. denitrificans

El plásmido pER1 se introdujo en primer lugar por electroporación en la cepa S17-1 de E. coli y, en segundo lugar, se introdujo en la cepa G2650 [Tet] de P. denitrificans por conjugación con la cepa S17-1 de E. coli que contiene el plásmido pER1. Se seleccionaron los transconjugantes resistentes a 50 \mug/ml de rifampicina y a 100 \mug/ml de lividomicina. 9 clones analizados contenían el plásmido pER1.

De la misma manera, se construyó una cepa control G2650 [Tet] que contiene sólo el vector pXL435.

3.3. Producción de cobalaminas por la cepa G2650 que contiene el plásmido pER1

Los clones G2650 [Tet] que contienen el plásmido pER1 así como 2 clones que contienen el plásmido pXL435 se cultivaron en el medio PS4 en presencia de rifampicina, tetraciclina y lividomicina. Después de 140 h de fermentación a 30ºC con agitación (250 rpm), se determinó la cantidad de cobalaminas producida por dosificación microbiológica y por HPLC. Los resultados se presentan en la Tabla 3.

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TABLA 3

		B12 dosificación microbiológica	B12 HPLC (mg/l)
	1	++	3
	2	++	3,5
	3	++	3,4
Cepas G2650 [Tet]	4	++	3,2
que contienen el	5	++	2,9
plásmido pER1	6	++	3,9
	7	++	3,6
	8	++	3,3
	9	++	3,9
Cepas G 2650 [Tet]	1	-	0
que contienen el	2	-	0
plásmido pXLA35
Cepa G2650 [Tet]		-	0

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Cuando ni la cepa G2650 [Tet] ni esta cepa con el plásmido pXL435 producen vitamina B12 en medio PS4, esta misma cepa con el plásmido pER1 es capaz de producir B12 a una concentración del orden de 3,5 mg/l. La cepa G2650 [Tet] que contiene el plásmido pXL435, es decir, únicamente el vector de clonación que ha servido para la construcción del plásmido pER1, no produce B12: por lo tanto, es la presencia del fragmento de ADN de 6,8 kb obtenido del plásmido pBBW1 la responsable de la producción de B12.

Este fragmento de ADN BamHI de 6,8 kb purificado a partir del plásmido pBBW1 confiere, por lo tanto, a la cepa G2650 [Tet] de P. denitrificans la capacidad de producir vitamina B12 en medio PS4.

3.4. Sub clonaciones

Las regiones del fragmento de ADN BamHI de 6,8 kb que contiene los genes bluE y bluF se subclonaron en el vector de clonación pXL435, dando lugar a los plásmidos denominados pER2 y pER3, gracias a las construcciones intermedias.

El plásmido pER2 de 12,9 kb (figura 2) contiene el fragmento EcoRI/CIaI de 2,1 kb purificado a partir del plásmido pBBW1 y clonado en el vector pXL435. Este fragmento de ADN se clonó previamente en los sitios EcoRI/CIaI del plásmido pBluescript II SK+ (Stratagene) y se purificó a partir de este plásmido recombinante en forma de un fragmento de ADN BamHI/SalI para clonación en el vector pXL435.

El plásmido pER3 de 11,9 kb (figura 3) contiene el fragmento PstI de 1,2 kb purificado a partir del plásmido pBBW1 y clonado en el vector pXL435. Éste se clonó previamente en el sitio PstI del plásmido pBluescript II SK+ y se purificó a partir de este plásmido recombinante en forma de un fragmento de restricción BarnHI/SalI para clonación en el vector pXL435.

El plásmido pAHW25 (Pollich y Klug, 1995a) contiene el fragmento EcoRI/EcoRV de 1,6 kb purificado a partir del plásmido pBBW1 y clonado en el vector pRK415 (Keen et al., 1988): el gen bluE se transcribe a partir del promotor lac del vector.

Los plásmidos pER2 o pER3 se introdujeron en la cepa G2650 [Tet] de P. denitrificans por conjugación con la cepa S17-1 de E. coli que contiene estos mismos plásmidos. Los clones de G2650 [Tet] que contienen los plásmidos pER2, pER3 o pXL435 se cultivaron en 5 ml de medio PS4 en presencia de rifampicina, tetraciclina y lividomicina. Los plásmidos pAHW25 y pRK415 se introdujeron en las cepas G2650[Sp] de P. denitrificans por conjugación con la cepa S17-1 de E. coli que contiene estos mismos plásmidos. Los clones de las cepas G2650[Sp] que contienen los plásmidos pAHW25 o pRK415 se cultivaron en 25 ml de medio PS4, en presencia de rifampicina, lividomicina y espectinomicina. Después de 140 h de fermentación a 30ºC con agitación (250 rpm), se determina la cantidad de cobalaminas producida por dosificación microbiológica y por HPLC.

Los resultados, presentados en la tabla 4, muestran que sólo los clones de las cepas G2650 que contienen los plásmidos pER2 o pAHW25 son capaces de producir vitamina B12 en medio PS4.

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TABLA 4

		B12 dosificación microbiológica	B12 en HPLC (mg/l)
Cepa G2650 [Tet]		-	0
Cepa G2650[Sp]		-	0
Cepas G2650[Tet]	1	-	0
que contienen el	2	-	0
plásmido pXL435	3	-	0
	1	++	7,4
	2	++	5,3
Cepas G2650[Tet]	3	++	7,9
que contienen el	4	++	3,5
plásmido pER2	5	++	5,2
	6	++	6,8
	7	++	7,2
	1	-	0
	2	-	0
	3	-	0
Cepas G2650[Tet]	4	-	0
que contienen el	5	-	0
plásmido pER3	6	-	0
	7	-	0
	8	-	0

TABLA 4 (continuación)

		B12 dosificación microbiológica	B12 en HPLC (mg/l)
	1	-	0
Cepas G2650[Sp]	2	-	0
que contienen el	3	-	0
plásmido pRK415	4	-	0
	1	++	3,0
	2	++	2,2
Cepas G2650[Sp]	3	++	3,0
que contienen el	4	++	2,9
plásmido pAHW25	5	++	2,9
	6	++	3,3
	7	++	3,1
	8	++	2,4

Ejemplo 4 El gen bluB está implicado en la biosíntesis de 5,6-dimetilbencimidazol (DBI), un precursor conocido de B12

La cepa BB1 de Rhodobacter capsulatus es una cepa mutante que se ha obtenido por inserción de un interposón en el gen bluB: es una cepa bluB^{-} (Pollich et al., 1995). La cepa BB1 se cultiva en 70 ml de medio RA en Erlenmeyer de 100 ml en presencia de 10 \mug/ml de kanamicina y de diferentes concentraciones de DBI. Las cantidades de cobalaminas producidas por esta cepa en las diferentes condiciones se determinan por dosificación microbiológica después de 24 a 48 h de fermentación a 30ºC con agitación (100 rpm). Los resultados, resumidos en la Tabla 5, muestran que la cepa mutante BB1, no productora de B12 en medio RA solo, sintetiza esta molécula cuando está presente en el medio al menos 14 nM de DBI. El gen bluB está implicado, por lo tanto, en la biosíntesis de 5,6-dimetilbencimidazol.

TABLA 5

concentración de DBI en el medio nM	0	7	14	35	70	140	350
producción de B12	-	-	+	++	+++	++++	+++++

Referencias

1. Davis B.D. y E. Mingioli (1950), J. Bacteriol. 60 : 17-28.

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3. Sambrook J., E.F. Fritsch y T. Maniatis (1989) Molecular cloning, a laboratory manual, segunda edición.

4. Simon R., M. O'Connell, M. Labes y A. Pühler (1986) Meth. In Enzymology 118 : 640-659.

5. Blanche F., D. Thibaut, M. Couder, y J.C. Muller (1990), Anal. Biochem., 189 : 24-29'.

6. Blanche F., B. Cameron, J. Crouzet, L. Debussche, D. Thibaut, M. Vuilhorgne, FJ. Leeper, y A. R. Battersby (1995) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 34 : 383-411.

7. Cameron B., K. Briggs, S. Pridmore, G. Brefort, y J. Crouzet (1989) J. Bacteriol., 171: 547-557.

8. Crouzet J., L. Cauchois, F. Blanche, L. Debussche, D. Thibaut, M.C. Rouyez, S. Rigault. J.F. Mayaux, y B. Cameron (1990) J. Bacteriol., 172 : 5968-5979.

9. Grabau C., y J. R. Roth (1992) J. Bacteriol., 174 : 2138-2144.

10. Pollich M., S. Jock, y G. Klug (1993) Mol. Microbiol.,10 : 749-757.

11. Pollich M., y G. Klug (1995a) J. Bacteriol., 177 : 4481-4487.

12. Pollich M. (1995b) Dissertation, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg.

13. Florent J., (1986), Vitamins, Biotechnology, vol. 4, VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, En H. -J. Rehm y G. Reed (ed.). 115-158.

14. Ditta G., Schmidhauser T., Yakobson E., Lu P., Liang X. W., Finlay D.R., Guiney D., y Helinski D., (1985), Plasmid, 13: 149-154.

15. Miller J. H., (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, N.Y.

16. Saurugger P.N., Hrabak O., Schwab H., y Lafferty R.N., (1986). J. Biotechnol. 4: 333-343.

17. Keen N. T., S. Tamaki, D. Kobayashi y D. Trollinger (1988) Gene 70 : 191-197.

Claims

1. Procedimiento para mejorar la síntesis in situ de O-fosfo-L-treonina de un microorganismo procariota productor de cobalamina, caracterizado porque se utiliza un microorganismo transformado con al menos un fragmento de ADN que comprende los genes bluE y bluF de Rhodobacter capsulatus y se cultiva dicho microorganismo en condiciones que permitan la expresión de dichos genes.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que el microorganismo transformado con al menos un fragmento de ADN que comprende los genes bluE y bluF de Rhodobacter capsulatus, está transformado además con al menos un fragmento de ADN que codifica una enzima implicada en una vía de biosíntesis del 5,6-dimetilbencimidazol y que comprende el gen bluB de Rhodobacter capsulatus.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el fragmento de ADN comprende un fragmento BamHI de 6,8 kb del plásmido pER1 representado en la figura 1 que contiene los genes bluE y bluF y bluB de Rhodobacter capsulatus.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento de ADN que comprende los genes bluE y bluF de Rhodobacter capsulatus comprende el fragmento EcoRI/CIaI de 2,1 kb del plásmido pER2 representado en la figura 2.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho fragmento de ADN que comprende los genes bluE y bluF de Rhodobacter capsulatus comprende el fragmento EcoRI/EcoRV de 1,6 kb del plásmido pAHW25 o del plásmido pER2 representado en la figura 2.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho microorganismo es una cepa de Pseudomonas denitrificans o de Aerobacterium radiobacter.

7. Procedimiento de preparación de cepas recombinantes mejoradas para la síntesis de O-fosfo-treonina caracterizado porque se transforma un microorganismo procariota productor de cobalamina mediante técnicas de ingeniería genética con al menos un fragmento de ADN que comprende los genes bluE y bluF de Rhodobacter capsulatus tal como se ha definido en las reivindicaciones 1 a 5.

8. Procedimiento de preparación de cepas recombinantes según la reivindicación 7, caracterizado porque el microorganismo procariota productor de cobalamina se transforma además con al menos un fragmento de ADN que codifica una enzima implicada en una vía de biosíntesis del 5,6-dimetilbencimidazol tal como se ha definido en la reivindicación 2.