UA121200C2

UA121200C2 - Ад'ювант на основі олії

Info

Publication number: UA121200C2
Application number: UAA201602745A
Authority: UA
Inventors: Пол Джозеф Доміновскі; Пол Джозэф Доминовски; Лорен Уілмес; Лорэн Уилмес; Денніс Л. Фосс; Дэннис Л. ФОСС; Каорі Мор; Каори МОР; Гуіллермо Галло; Гуиллермо Галло; Джон Морган ХАРДХАМ; Річард Лі Кребс; Ричард Ли Крэбс; Сандра Енн Марі Лайтл; Сандра Энн Мари Лайтл; Суман МАХАН; Сангіта Медіратта; Сангита Медиратта; Дункан Мвангі; Дункан МВАНГИ
Original assignee: Зоетіс Сервісіз Ллс; Зоетис Сервисиз Ллс
Priority date: 2013-09-19
Filing date: 2014-09-19
Publication date: 2020-04-27
Also published as: US11701415B2; JP2021073191A; RU2730011C2; JP2019167356A; EP3049105A2; RU2019128165A; EP3049105B1; AU2020202147A1; JP6667704B2; US20240000913A1; JP2022001581A; AU2014321369B2; CL2018000319A1; BR112016005948A2; KR101943171B1; CA3174897A1; AU2014321369A1; US10744192B2; EP3046580A2; ZA201903401B

Abstract

Винахід належить до вакцинної композиції, яка містить ефективну кількість антигену та ад'ювантну композицію, яка містить олійну фазу та водну фазу. Причому заявлена вакцинна композиція являє собою емульсію вода-в-олії, де олійна фаза складає щонайменше 36 % об./об. композиції і де вказана композиція містить монофосфорильний ліпід A (MPL-A) або його аналог та імуностимулюючий олігонуклеотид, а також антиген вибирають з групи, яка складається з антигену Eimeria maxima, антигену Clostridium perfringens, антигену Neospora, та антигену Chlamydophila abortis.

Description

Винахід належить до вакцинної композиції, яка містить ефективну кількість антигену та ад'ювантну композицію, яка містить олійну фазу та водну фазу.

Причому заявлена вакцинна композиція являє собою емульсію вода-в-олії, де олійна фаза складає щонайменше 36 95 об./о6. композиції і де вказана композиція містить монофосфорильний ліпід А (МРІ -А) або його аналог та імуностимулюючий олігонуклеотид, а також антиген вибирають з групи, яка складається з антигену Еітегіа тахіта, антигену Сіозігідішт регігіпдеп5, антигену Меозрога, та антигену Спіатуаорпійа абогіїв5.

Галузь техніки, до якої відноситься винахід

ІО00О1)| Даний винахід, в цілому, стосується нових препаратів ад'ювантів для посилення імунної відповіді на антигени для застосування в імуногенних та вакцинних композиціях. Даний винахід також стосується способів отримання та застосування композицій ад'юванту, імуногенних та вакцинних композицій.

Передумови створення винаходу 0002) Бактеріальні, вірусні та паразитарні інфекції є широко поширеними в організмі людини та тварин. Захворювання, викликані даними інфекційними агентами, часто є резистентними до протимікробної фармацевтичної терапії, не залишаючи ніяких ефективних засобів лікування. Як наслідок, вакцинологічний підхід все більше і більше застосовують для контролю за інфекційним захворюванням. Цілісний інфекційний збудник може бути прийнятним для застосування в вакцинному препараті після хімічної інактивації або відповідної генетичної маніпуляції. Альтернативно, протеїнова субодиниця збудника може бути експресована в рекомбінантній експресійній системі та очищена для застосування в вакцинному препараті.

Вакцини можуть бути зроблені більш ефективними за рахунок включення відповідного ад'юванта в композицію. 0003) Термін "ад'ювант", в цілому, стосується будь-якої речовини, що підвищує гуморальну або клітинну імунну відповідь на антиген. Ад'юванти використовують для досягнення двох цілей:

Вони сповільнюють вивільнення антигенів з місця ін'єкції та вони посилюють стимуляцію імунної системи. Традиційні вакцини, в цілому, складаються з неочищеного препарату інактивованих, або вбитих, або модифікованих живих патогенних мікроорганізмів. Домішки, пов'язані з даними культурами патологічних мікроорганізмів, можуть діяти як ад'ювант для посилення імунної відповіді. Однак, імунітет, який викликається вакцинами, які використовують гомогенні препарати патологічних мікроорганізмів або очищені протеїнові субодиниці, як антигени, часто є слабким. Тому, додавання деяких екзогенних речовин, таких як ад'ювант, стає необхідним. Крім того, в деяких випадках, синтетичні та субодиничні вакцини можуть бути дорогими у виробництві. Крім того, в деяких випадках, збудник може не бути вирощеним в промисловому масштабі, та, таким чином, синтетичні/субодиничні вакцини представляють собою єдиний прийнятний варіант. Додавання ад'юванта може дозволити застосування менших

Зо доз антигену, щоб стимулювати подібну імунну відповідь, тим самим, знижуючи вартість виробництва вакцини. Таким чином, ефективність деяких ін'єкційних лікарських засобів може бути значно збільшена, коли агент поєднують з ад'ювантом.

І0004| Багато чинників повинні бути прийняті до уваги при виборі ад'юванта. Ад'ювант повинен спричиняти відносно низьку швидкість вивільнення та абсорбцію антигену ефективним способом з мінімальним токсичним, алергенним, подразливим та іншими небажаними ефектами для господаря. Для того, щоб бути прийнятним, ад'ювант повинен бути невіруліцидним, здатним до біорозкладання, здатним послідовно створювати високий рівень імунітету, здатним стимулювати перехресний захист, сумісним з багатьма антигенами, ефективним в багатьох видах, нетоксичним та безпечним для господаря (наприклад, не викликати ніяких реакцій в місці ін'єкці). Іншими бажаними характеристиками ад'юванта є те, що він є здатним до мікродозування, є помірною дозою, має чудову стабільність при зберіганні, піддається сушінню, може бути зробленим без олії, може існувати або у вигляді твердої, або рідкої речовини, є ізотонічним, легким у виробництві, та є недорогим в отриманні. Нарешті, дуже необхідним для ад'юванта є те, щоб він є здатним до налаштування, таким чином, індукуючи або гуморальну, або клітинну імунну відповідь або обидві, в залежності від вимог сценарію вакцинації. Однак, кількість ад'ювантів, які можуть задовольнити вказані вище вимоги є обмеженою. 0005) Вибір ад'юванта залежить від потреб для вакцини, будь то збільшення величини або функції відповіді антитіла, збільшення клітинно-опосередкованої імунної відповіді, індукування мукозального імунітету, або зменшення дози антигену. Запропоновано було ряд ад'ювантів, однак, жоден, як показано, не є ідеально прийнятним для всіх вакцин. Першим ад'ювантом, про який повідомлялось в літературі, був повний ад'ювант Фрейнда (ЕСА), який містить емульсію вода-в-олії та екстракти мікобактерії. На жаль, ЕСА погано переноситься та це може спричинити неконтрольоване запалення. Оскільки з моменту відкриття ЕСА минуло понад 80 років були зроблені зусилля зменшити небажані побічні ефекти ад'ювантів.

ІО006) Деякі інші матеріали, які використовуються як ад'юванти, включають оксиди металів (наприклад, гідроксид алюмінію), алюмокалієвий галун, неорганічні хелати солей, желатини, різні парафінового типу олії, синтезовані смоли, альгінати, мукоїдні та полісахаридні сполуки, казеїнати, та речовини, похідні крові, такі як фібринові згустки. В той час як, дані матеріали, в цілому, є ефективними щодо стимулювання імунної системи, жоден, як було виявлено, не був бо повністю задовільняючим через побічні ефекти в господаря (наприклад, виникнення стерильного абсцесу, пошкодження органів, канцерогенність або алергічні реакції) або небажані фармацевтичні властивості (наприклад, швидка розсмоктування або поганий контроль за розсмоктуванням з місця ін'єкції, або набряк матеріалу).

Суть винаходу

Ї0007| Представлений винахід передбачає нові вакцинні композиції та композиції ад'юванта корисні для вакцин.

І0008| В першому аспекті, винахід передбачає композицію ад'юванта яка містить олійну фазу та водну фазу, де олійна фаза містить, щонайменше, 50 95 препарату об./об., де зазначений препарат містить, щонайменше, один монофосфорильний ліпід А (МРІ--А) або його аналог та імуностимулюючий олігонуклеотид, за умови, що а) якщо зазначений імуностимулюючий олігонуклеотид відсутній, то препарат містить полі ІС, гліколіпід, та, необов'язково, четвертинний амін; або полікатіонний носій; та б) якщо зазначений монофосфорильний ліпід А (МРІ-А), або його аналог, відсутній, то препарат містить джерело алюмінію, та, необов'язково, полікатіонний носій.

І0009| В різних варіантах здійснення, олійна фаза може містити олію та, необов'язково, розчинний в олії емульгатор.

І0010) В деяких варіантах здійснення, також зазначений монофосфорильний ліпід А (МРІ--А) або його аналог є присутнім в композиції ад'юванта. В даних варіантах здійснення, композиція додатково містить стерин (наприклад, холестерин), полі І:С, або їх комбінацію.

І0011| В певному наборі варіантів здійснення, на додаток до олії та необов'язкового(их) емульгатора(ів), композиції ад'юванта включають комбінацію монофосфорильного ліпіду А (МРІ-А) або його аналога, стерину та імуностимулюючого олігонуклеотида (ТСМО").

Композиція ад'юванта також може необов'язково містити полі С ("ТОММО") та/або сапонін (СОТСМО" або "ОТСМУО", відповідно).

І0012| В ще наступних альтернативних варіантах здійснення, на додаток до олії та необов'язкового(их) емульгатора(ів), композиції ад'юванта також включають комбінацію четвертинного аміну, гліколіпіду, МРІ--А або його аналога, та полі С ("ООМЕМ").

ЇО013| В ще наступному наборі варіантів здійснення, на додаток до олії та необов'язкового(их) емульгатора(ів), композиції ад'юванта також включають комбінацію

Зо сапоніну, стерину, четвертинного аміну, полікатіонного носія, за умови, що, якщо зазначений полікатіонний носій представляє собою декстран ОЕАЕ, то антиген не є бактерином Е соїї 9-5 (ОСОоХОо"). 0014 В наступних варіантах здійснення, на додаток до олії та необов'язкового(их) емульгатора(ів), ад'ювант може включати імуностимулюючий олігонуклеотид, джерело алюмінію, та, необов'язково, полікатіонний носій ("ТОА" та "ТХО-А", відповідно).

ІЇ0015| В другому аспекті, композиція ад'юванта відповідно до будь-якого з варіантів здійснення, зазначена вище, може включати антигенний компонент, таким чином, утворюючи вакцинну композицію, за умови, що антиген не є протеїном Е. Соїї 9-5, якщо композиція ад'юванта складається з (або в основному складається з) ОЕАЕ декстрану, ОціїЇ А, холестерину та ОБА, або якщо композиція ад'юванта складається з (або в основному складається з) ОЕАЕ декстрану та імуностимулюючого олігонуклеотиду. В деяких варіантах здійснення, вакцини даного аспекту містять антигени), які походять від збудників, що діють на велику рогату худобу, овець, коней, або свиней. В інших варіантах здійснення, вакцини даного аспекту містять антигени), які походять від збудників, що діють на птицю або котячих тварин. 0016) В додаткових аспектах винаходу, передбаченими є різні комбінації антигенної сполуки та композиції ад'юванта.

І0017| Більш конкретно, в третьому аспекті, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить Еітегіа тахіта та/або Сіовігідічт регііпдеп5 антиген та композицію ад'юванта. В різних варіантах здійснення третього аспекту, композиція ад'юванта може включати олійну фазу, де зазначена олійна фаза присутня в кількості щонайменше, 5095 о0об./06б. композиції; полікатіонний носій, та, необов'язково, імуностимулюючий олігонуклеотид. В інших варіантах здійснення даного аспекту винаходу, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить ад'ювантний компонент, який містить олійну фазу, де зазначена олійна фаза присутня в кількості, щонайменше, 50 95 об./0б. композиції; імуностимулюючий олігонуклеотид, стерин, та монофосфорильний ліпід А (МРІ -А) або його аналог. 0018) В четвертому аспекті, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить Меозрога антиген та композицію ад'юванта. В різних варіантах здійснення винаходу відповідно до даного аспекту, композиція ад'юванта містить олійну фазу, де зазначена олійна фаза присутня в кількості, щонайменше, 50 95 об./0б. композиції; та монофосфорильний ліпід А (МРІ-А) або його 60 аналог. В інших варіантах здійснення, композиція ад'юванта містить олійну фазу, де зазначена олійна фаза присутня в кількості, щонайменше, 50 95 об./06б. композиції, імуностимулюючий олігонуклеотид та полікатіонний носій.

ЇО019| В п'ятому аспекті, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить

Спіатуаорпйа абогпі5х антиген та композицію ад'юванта, яка містить олійну фазу, де зазначена олійна фаза присутня в кількості, щонайменше, 5095 об./06б. композиції; стерин; імуностимулюючий олігонуклеотид; монофосфорильний ліпід А (МРІ--А) або його аналог; та полі

ГО.

І0020| В шостому аспекті, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить зігеріососси5 ибрегіз (5. црегі5) антиген та композицію ад'юванта, яка містить олійну фазу, де зазначена олійна фаза присутня в кількості щонайменше 5095 об./06б. композиції; та полікатіонний носій. В різних варіантах здійснення даного шостого аспекту винаходу, композиція ад'юванта також включає імуностимулюючий олігонуклеотид. Альтернативно, або додатково, композиції ад'юванта можуть включати сапонін, стерин, та четвертинний амін. 0021) В сьомому аспекті, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить міостатин як антигенний компонент, та композицію ад'юванта, де зазначена композиція ад'юванта містить олійну фазу, де зазначена олійна фаза присутня в кількості, щонайменше, 50 95 об./06. композиції; імуностимулюючий олігонуклеотид та або: полікатіонний носій; або МРІ -А або його аналог. В наборі варіантів здійснення відповідно до даного аспекту винаходу, композиція ад'юванта містить МРІ-А або його аналог. В деяких варіантах здійснення даного набору, композиція ад'юванта містить менше, ніж 0,5 мкг стерину на 50 мкл зазначеної вакцинної композиції, та переважно не містить холестерин. Вибір міостатину залежить від виду суб'єкта. В одному вибраному варіанті здійснення, вибраним видом є курка, та джерелом міостатину є курячий міостатин.

І0022| У восьмому аспекті, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить А. руодепе5 (раніше відомий як Агсапобасіегішт руодепе5, Асііпотусе5 руодепе5 або

Согуперасіегішт руодепе5; зараз відомий як Тгиерегейа руодепе5) антиген та композицію ад'юванта, де композиція ад'юванта містить олійну фазу, де зазначена олійна фаза присутня в кількості, щонайменше, 5095 о0об./0б. композиції; імуностимулюючий олігонуклеотид та полікатіонний носій.

Зо І0023| В дев'ятому аспекті, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить Е соїї антиген, ВКМ антиген або ВСМ антиген, та композицію ад'юванта, де зазначена композиція ад'юванта містить олійну фазу, присутню в кількості, щонайменше, 50 95 об./06б. зазначеної вакцинної композиції, імуностимулюючий олігонуклеотид та, щонайменше, один з полікатіонного носій та джерело алюмінію.

І0024| В десятому аспекті, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить

КПірісерпа|н5 тісгоріи5 антиген та ад'ювант, де зазначений ад'ювант вибирають з групи, яка складається з: а) водного ад'юванта, який містить імуностимулюючий олігонуклеотид, сапонін, стерин, четвертинний амін, поліакриловий полімер, та гліколіпід; та Б) на олійній основі ад'ювант, який містить олійну фазу, присутню в кількості, щонайменше, 50 95 об./0б. вакцинної композиції, та який містить імуностимулюючий олігонуклеотид та полікатіонний носій.

І0025| В одинадцятому аспекті, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить антиген вірусу ящура (ЕМОМ) та композицію ад'юванта, де зазначена композиція ад'юванта містить олійну фазу, присутню в кількості, щонайменше, 50 95 об./06б. зазначеної вакцинної композиції, імуностимулюючий олігонуклеотид та полікатіонний носій. В різних варіантах здійснення, антиген вірусу ящура може представляти собою або немутантний тип ЕМОМ, генетично модифіковані та/або ослаблені штами ЕМОМ, або рекомбінантно експресовані структурні протеїни ЕМОМ, такі як вірусоподібні частинки (МІ Р) серотипів А, С, 0, Авіа!1, ЗАТ,

ЗАТ2 або ЗАТЗ. 0026) В дванадцятому аспекті, винахід передбачає спосіб генерування діагностичних або терапевтичних антитіл, де спосіб включає імунізацію тварини-джерела композицією ад'юванта, відповідно до будь-якого з варіантів здійснення, відповідно до першого аспекту винаходу, та антигеном, з подальшим екстрагуванням джерела антитіл з тварини-джерела, та, якщо необхідно, очищення антитіл.

І0027| В деяких варіантах здійснення, тварина-джерело є щуром, мишею, морською свинкою, хом'яком, великою рогатою худобою, козою, кроликом, конем, свинею або бараном. В деяких інших варіантах здійснення, тварина-джерело є кішкою або собакою. 0028) В деяких варіантах здійснення, особливо прийнятним для поліклональних антитіл, джерелом антитіл є сироватка або молоко. В варіантах здійснення прийнятним для моноклональних антитіл, придатним джерелом антитіл є клітина селезінки.

І0029| В деяких варіантах здійснення, композиція ад'юванта містить імуностимулюючий олігонуклеотид та полікатіонний носій. Ад'ювант необов'язково може містити джерело алюмінію, що включає джерело алюмінію, яке може представляти собою гель гідроксиду алюмінію. В деяких варіантах здійснення, імуностимулюючий олігонуклеотид представляє собою Сро, та полікатіонний носій представляє собою ОЕАЕ декстран. 0030) В деяких варіантах здійснення, антиген може бути вибраний з Ре Мор70, Бичачого парагриповірусу-З3 ВРІ-3 (НМ протеїн), Нізіорпйи5 зотпі р31, Вогдес(ейа ЕНА, Рагарох, ВМОМ1 9др53, ВМОМ2 др53, токсинів клостридії, собачого цирковірусу, антигенів Вгаспузріга

Ппуодузепіегіає (види свиней); інактивованих цільних клітин та інактивованого пепсинового гідролізату. 0031) Винахід, крім того, передбачає способи застосування вакцин відповідно до від третього до дванадцятого аспектів представленого винаходу.

Детальний опис вибраних варіантів здійснення 00321 "Близько" або "приблизно", коли використовується в зв'язку з вимірюваною числовою змінною, стосується зазначеного значення змінної та всіх значень змінної, які знаходяться в межах експериментальної похибки зазначеного значення (наприклад, в межах 95 95 довірчого інтервалу для середнього значення) або в межах 10 відсотків від зазначеного значення, в залежності від того, що є більшим, крім тих випадків, коли приблизно використовується для посилання на часові інтервали в тижнях, де "приблизно З тижні ", становить від 17 до 25 днів, та від приблизно 2 до приблизно 4 тижнів становить від 10 до 40 днів. (0033) "Ад'ювант" означає будь-яку речовину, яка підсилює гуморальну або клітинну імунну відповідь на антиген. Ад'юванти в цілому використовують для досягнення двох цілей: контрольоване вивільнення антигенів з місця ін'єкції, та стимулювання імунної системи.

І0034| "Композиція ад'юванта" стосується композицій, які мають властивості підвищуючі антигенність антитіл.

І0035| "Алкіл" стосується як лінійних, так і розгалужених насичених вуглеводневих фрагментів. (0036) "Амін" стосується хімічної сполуки, яка містить азот. Аміни представляють собою групу сполук, які походять з аміаку за рахунок заміщення атомів водню на вуглеводневі групи.

Зо "Четвертинний амін" стосується сполуки на основі амонію з чотирма вуглеводневими групами.

І0037| "Антитіло" стосується молекули імуноглобуліну, що може зв'язуватися зі специфічним антигеном в результаті імунної відповіді на даний антиген. Імуноглобуліни представляють собою сироваткові протеїни, які складаються з "легких" та "важких" поліпептидних ланцюгів, які мають "константну" та "варіабельну" ділянки та діляться на класи (наприклад, ІдА, дО, ЧЕ, до та І9ЗМ) грунтуючись на складі константних ділянок. (0038) "Антиген" або "імуноген" стосується будь-якої речовини, яка розпізнається імунною системою тварини та генерує імунну відповідь. Термін включає вбиті, інактивовані, ослаблені або модифіковані живі бактерії, віруси або паразити. Термін "антиген" також включає полінуклеотиди, поліпептиди, рекомбінантні протеїни, синтетичні пептиди, протеїнові екстракти, клітини (включаючи клітини пухлини), тканини, полісахариди або ліпіди, або їх фрагменти, індивідуально або в будь-якій їх комбінації. Термін антиген також включає антитіла, такі як антиіїдіопатичні антитіла або їх фрагменти, та синтетичні пептидні міме отопи, які можуть імітувати антиген або антигенний детермінант (епітоп). 0039) "Бактерин" означає суспензію з одного або декількох вбитий бактерій, яка може бути використана як компонент вакцини або імуногенної композиції.

І0040| "Буфер" означає хімічну систему, яка запобігає зміні концентрації іншої хімічної речовини, наприклад, системи донора та акцептора протона служать як буфери, які запобігають помітним змінам в концентрації іонів водню (рН). Додатковий приклад буферу представляє собою розчин, який містить суміш слабкої кислоти та її солі (кон'югатна основа) або слабкої основи та її солі (кон'югатна кислота).

І0041| "Клітинна імунна відповідь" або "клітинно-опосередкована імунна відповідь" є відповіддю, опосередкованою Т-лімфоцитами або іншими білими клітинами крові або обома, та включає продукування цитокінів, хемокінів та подібних молекул, які продукуються активованими

Т-клітинами, білими клітинами крові, або обома; або Т лімфоцитом, або іншою імунною клітинною відповіддю, що вбиває інфіковану клітину. (0042) "Домашні тварини" стосуються собак, котів та коней. (0043) "Що фактично складається", як застосовується до композицій ад'юванта, стосується композиції, яка не містить неописаних додаткових агентів, що підвищують імуногенність антитіл, або імуномодулюючих агентів в кількостях, при яких зазначений агент здійснює значні бо підвищуючі імуногенність антитіл або імуномодулюючі ефекти.

І0044| "Гіперчутливість уповільненого типу (ОТН)" стосується запальної відповіді, яка розвивається через від 24 до 72 годин після дії на антиген, який імунна система розпізнає як чужерідний. Даний тип імунної відповіді включає, головним чином, Т клітини, а не антитіла (які продукуються В-клітинами).

І0045| "Доза" стосується вакцинної або імуногенної композиції, яка надається суб'єкту. "Перша доза" або "примірування вакцинні" стосується дози такої композиція, яка надається в день 0. "Друга доза" або "третя доза", або "щорічна доза" стосується кількості такої композиції, яка надається після першої дози, яка може або не може бути такою самою вакцинною або імуногенною композицією, як перша доза.

І0046| Термін "емульгатор" використовується в широкому сенсі в представленному розкритті. Він включає речовини, в цілому, загальноприйняті як емульгатори, наприклад, різні продукти ТУУМЕЕМЕ! або ЗРАМФ лінії продуктів (складні ефіри жирних кислот поліетоксильованого сорбіту та поверхнево-активні речовини заміщеного жирними кислотами сорбітану, відповідно), та різні підвищуючі розчинність речовини, такі як ПЕГ-40 рицинова олія або інша ПЕГильована гідрогенізована олія.

І0047| "Гуморальна імунна відповідь" стосується відповіді, яка опосередковується антитілами. (0048) "Імунна відповідь" у суб'єкта стосується розвитку гуморальної імунної відповіді, клітинної імунної відповіді, або гуморальної та клітинної імунної відповіді на антиген. Імунні відповіді, як правило, можуть бути визначені з використанням стандартних імунологічних аналізів та аналізів на нейтралізацію, які є відомими в даній галузі з рівня техніки.

І0049| "Імунологічно захисна кількість" або "імунологічно ефективна кількість" або "ефективна кількість щодо продукування імунної відповіді" антигена є кількістю ефективною для індукування імуногенної відповіді у реципієнта. Імуногенна відповідь може бути достатньою для діагностичних цілей або іншого дослідження, або може бути достатньою для попередження проявів або симптомів захворювання, в тому числі несприятливі наслідки для здоров'я або їх ускладнення, викликані інфекцією патогенного чинника захворювання. Індукованими можуть бути або гуморальний імунітет, або клітинно-опосередкований імунітет, або обидва. Імуногенна відповідь тварини на імуногенну композиція може бути оцінена, наприклад, опосередковано

Зо через вимірювання титрів антитіл, за аналізами проліферації лімфоцитів, або безпосередньо шляхом моніторингу проявів та симптомів після зараження штамом дикого типу, в той час як захисний імунітет, який надається вакциною, може бути оцінений вимірюванням, наприклад, зменшення клінічних ознак, таких як смертність, захворюваність, температурний показник, загальний фізичний стан, та загальний стан здоров'я та активність суб'єкта. Імунна відповідь може містити, без обмеження, індукування клітинного та/або гуморального імунітету. 00501) "Імуногенні" означає такі, які викликають імунну або антигенну відповідь. Таким чином, імуногенна композиція буде будь-якою композицією, що викликає імунну відповідь.

ЇОО51| "Імуностимулююча молекула" стосується молекули, яка стимулює неантиген- специфічну імунну відповідь. 00521 "Ліпіди" стосуються будь-якої з груп органічних сполук, яка включає жири, олії, воски, стерини та тригліцериди, які є нерозчинними у воді, але розчинними в неполярних органічних розчинниках, є маслянистими на дотик, та разом з вуглеводами та протеїнами становлять основний структурний матеріал живих клітин. 0053) "Фармацевтично прийнятний" стосується речовин, які знаходяться в межах обсягу, з медичної точки зору, прийнятних для застосування в контакті з тканинами суб'єктів без надмірної токсичності, подразнення, алергічної реакції, тощо, що відповідають раціональному співвідношенню вигоду-до-ризику, та ефективна для їх використання за призначенням.

Ї0054| Термін "Полі ІС" стосується полімерів, які зустрічаються в природі, поліїнозінової:поліцитадилової кислот, а також їх синтетичні форми, наприклад, зі стабілізованим скелетом та переважно, які мають ТІ К-3 агоністичну активність. 0055) "Реактогенність" стосується побічних ефектів, які викликають у суб'єкта відповідь на введення ад'юванта, імуногенної або вакцинної композиції. Це може відбуватися в місці введення, та, як правило, оцінюється з точки зору розвитку цілого ряду симптомів. Дані симптоми можуть включати запалення, почервоніння та абсцес. Крім того, вона оцінюється з точки зору виникнення, тривалості та тяжкості. "Низька" реакція буде, наприклад, включати набряк, який можна виявити тільки при пальпації та не на око, або повинен бути короткотривалим. Більш тяжка реакція була б, наприклад, реакцією, яка є видимою оком або є довготривалою. (0056) "Кімнатна температура" означає температуру від 18 до 25 76.

І0057| "Сапонін" стосується групи поверхнево-активних глікозидів рослинного походження, яка складається з гідрофільної ділянки (як правило, декілька цукрових ланцюгів) в поєднанні з гідрофобною ділянкою, або стероїдної, або тритерпеноїдної структури.

І0058| "Стероїди" стосується будь-якої групи органічних сполук, які відносяться до біохімічного класу ліпідів, які легко розчиняються в органічних розчинниках та в незначній мірі у воді. Стероїди містять чотирьохкільцеву анельовану систему з трьох анельованих циклогексанових (шестивуглецевих) кілець плюс четверте циклопентанове (п'ятивуглецеве) кільце. 0059) "Стерини" стосуються сполук в тварин, які біологічно продукуються з терпеноїдних попередників. Вони містять стероїдну кільцеву структуру, яка має гідроксильну (ОН) групу, як правило, приєднану до вуглецю-3. Вуглеводневий ланцюг жирнокислотного замісника варіює за довжиною, як правило, від 16 до 20 атомів вуглецю, та може бути насиченим або ненасиченим.

Стерини, як правило, містять одну або більше подвійних зв'язків в кільцевій структурі та також різноманітні замісники, приєднані до кілець. Стерини та їх складні ефіри з жирними кислотами є фактично нерозчинними у воді. 0060 "Суб'єкт" стосується будь-якої тварини, для якої введення ад'ювантної композиції є бажаним. Вона включає ссавців та не ссавців, включаючи приматів, свійських тварин, домашніх тварин, лабораторних піддослідних тварин, диких тварин, які живуть у неволі, пернатих (в тому числі в яйцях), рептилій та риб. Таким чином, даний термін включає, але не обмежується цим мавп, людей, свиней; велику рогату худобу, вівців, кіз, коней, мишей, щурів, морських свинок, хом'яків, кроликів, кішок, собак, курей, індичок, качок, інших птахів, жаб та ящірок. 00611 "ТСІОво" стосується "інфекційної дози для тканинної культури" та визначається як таке розбавлення вірусу, яке необхідне для інфікування 50 95 даної партії інокульованих клітинних культур. Різні способи можуть бути використані для розрахунку ТСІЮвхо, в тому числі спосіб

Спірмена-Карбера, який використовується по всьому даному описі. Для опису способу

Спірмена-Карбера, дивись В. МУ. Мапйу 48. Н. 0. Каподго, Мігоїосду Меїподз Мапциаї, р. 25-46 (1996). (0062) "Терапевтично ефективна кількість" стосується кількості антигена або вакцини, яка буде індукувати імунну відповідь у суб'єкта, який отримує антиген або вакцину, яка є достатньою для попередження або зниження проявів або симптомів захворювань, включаючи несприятливі наслідки для здоров'я або їх ускладнення, викликаних інфекцією з патогеном, таким як вірус або бактерії. Індукованим може бути гуморальний імунітет або клітинно- опосередкований імунітет, або як гуморальний, так і клітинно-опосередкований імунітет.

Імуногенна відповідь тварини на вакцину може бути оцінена, наприклад, опосередковано шляхом вимірювання титрів антитіл, за аналізами проліферації лімфоцитів, або безпосередньо шляхом моніторингу проявів та симптомів після зараження штамом дикого типу. Захисний імунітет, який надається вакциною, може бути оцінений вимірюванням, наприклад, зменшення клінічних ознак, таких як смертність, захворюваність, температурний показник, загальний фізичний стан, та загальний стан здоров'я та активність суб'єкта. Кількість вакцини, яка є терапевтично ефективною, може варіювати в залежності від конкретного ад'юванта, що застосовується, конкретного антигена, що застосовується, або стану суб'єкта, та може бути визначена кваліфікованим фахівцем в даній галузі. 0063) "Лікування" стосується попередження розладу, стану або захворювання, до якого цей термін застосовується, або для попередження або зменшення одного або більше симптомів такого розладу, стану або захворювання. 0064) "Лікування" стосується дія "лікування" як це визначено вище. (0065) "Тритерпеноїди" стосується великого та різноманітного класу органічних молекул, які зустрічаються в природі, що отримують з шести п'ятивуглецевих ізопренових (2-метил-1,3- бутадієнових) одиниць, які можуть бути зібрані та модифіковані тисячами способів. Більшість з них є багатоциклічними структурами, які відрізняються одна від одної функціональними групами, та своїми основними вуглецевими скелетами. Дані молекули можуть бути знайдені в усіх класах живих істот.

І006б6| "Вакцина" стосується композиції, яка включає антиген, як визначено в даному документі. Введення вакцини суб'єкту в результаті призводить до імунної відповіді, як правило, проти одного або декількох конкретних захворювань. Кількість вакцини, яка є терапевтично ефективною, може варіювати в залежності від конкретного антигена, який застосовують, або стану суб'єкта, та може бути визначеною кваліфікованим фахівцем в даній галузі.

Композиції ад'ювантів та способи отримання

І0067| Заявка, яка розглядається, розкриває декілька композицій ад'ювантів, прийнятних для представленого винаходу. Загальною ознакою даних ад'ювантів є присутність олії та одного або більше емульгаторів, де олійна фаза містить більше, ніж 50 95 вакцинної композиції, що включає композиції ад'ювантів, розкриті в даному документі. 0068) Різноманітні олії та їх комбінації є прийнятними для застосування за представленим винаходом. Дані олії включають, без обмеження, тваринні жири, рослинні олії, а також олії, які не метаболізуються. Необмежуючими прикладами рослинних олій, прийнятних в представленому винаході є кукурудзяна олія, арахісова олія, соєва олія, кокосова олія та оливкова олія. Необмежуючим прикладом тваринних жирів є сквален. Прийнятні необмежуючі приклади олій, які не метаболізуються, включають легку мінеральну олію, насичені олії з лінійним або розгалуженим ланцюгом, тощо. 0069) В наборі варіантів здійснення, олія, яку використовують в композиціях ад'ювантів за представленим винаходом представляє собою легку мінеральну олію. Як використовується в даному документі, термін "мінеральна олія" стосується суміші рідких вуглеводнів, отриманих з вазеліну, застосовуючи методики дистиляції. Термін є синонімом "рідкому парафіну", "рідкому вазелину" та "білій мінеральній олії." Термін також передбачає включення "легкої мінеральної олії, " тобто, олії, яку отримують аналогічним чином шляхом дистиляції вазелину, але який має трохи нижчу питому густину, ніж біла мінеральна олія. Дивись, наприклад, Кептіподоп'є

Рпаптасешііса!в Зсіепсез, 181п Едйіоп (Еазіоп, Ра.: Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, 1990, сторінки 788 та 1323). Мінеральну олію можуть отримувати з різних комерційних джерел, наприклад, .. Т.

ВаКег (РпШірзригдо, Ра.), ОВ Согрогайоп (СіІемеїапа, ОПіо). Переважна мінеральна олія представляє собою легку мінеральну олію, комерційно доступну під назвою ОКАКЕОЇ Ф). 0070) Як правило, олійна фаза є присутньою в кількостях від 50 956 до 95 95 за об'ємом; переважно, в кількостях від більше, ніж 50 95 до 85 95; більш переважно, в кількостях від більше, ніж 5095 до 6095, та більш переважно в кількості більше, ніж 50-52 95 об./06б. вакцинної композиції. Олійна фаза включає олію та емульгатори (наприклад, 5РАМЕ 80, ТМ/ЕЕМФ 80, тощо), якщо будь-які такі емульгатори є присутніми. Об'єм олійної фази розраховують як суму об'ємів олії та емульгатора(ів). Таким чином, наприклад, якщо об'єм олії становить 40 95 та об'єм емульгаторай(ів) становить 12 95 композиції, то олійна фаза повинна бути присутньою в кількості 52 95 об./06. композиції. Аналогічним чином, якщо олія присутня в кількості приблизно 4595 та емульгатор(и) присутній(ї) в кількості приблизно 6 95 композиції, то олійна фаза є

Зо присутньою в кількості приблизно 51 95 об./06. композиції.

ІЇ0071| До того ж, слід розуміти, що оскільки ад'юванти за представленим винаходом утворюють тільки частину вакцини за представленим винаходом, олійна фаза є присутньою в кількостях від 50 95 до 95 95 за об'ємом; переважно, в кількостях від більше, ніж 50 95 до 85 95; більш переважно, в кількостях від 50 95 до 60 95, та більш переважно в кількості 50-52 95 об./06б. кожного з ад'ювантів за представленим винаходом.

І0072| В підгрупі варіантів здійснення, які застосовуються до всіх ад'ювантів/вакцин за представленим винаходом, об'ємний відсоток олії та розчинного в олії емульгатора разом становить щонайменше 50 95, наприклад, від 50 95 до 95 95 за об'ємом; переважно, в кількостях від більше, ніж 50 95 до 85 95; більш переважно, в кількостях від 5095 до 6095, та більш переважно в кількості 50-52 95 об./06б. вакцинної композиції. Таким чином, наприклад, та без обмеження, олія може бути присутньою в кількості 45 95, та розчинний в ліпідах емульгатор має бути присутнім в кількості більше, ніж 595 об./06б. Таким чином, об'ємний відсоток олії та розчинного в олії емульгатора разом повинен становити, щонайменше, 50 Об. 0073) В ще іншій підгрупі, яка застосовується до всіх вакцин винаходу, об'ємний відсоток олії становить понад 40 95, наприклад, від 40 95 до 90 95 за об'ємом; від 40 95 до 85 95; від 43 95 до 60 95, 44-50 95 об./0б. вакцинної композиції.

І0074| Емульгатори, прийнятні для застосування в представлених емульсіях, включають природні біологічно сумісні емульгатори та неприродні синтетичні поверхнево-активні речовини.

Біологічно сумісні емульгатори включають фосфоліпідні сполуки або суміш фосфоліпідів.

Переважні фосфоліпіди представляють собою фосфатидилхоліни (лецитин), такий як соєвий або яєчний лецитин. Лецитин можуть отримувати як суміш фосфатидів та тригліцеридів шляхом промивання водою сирих рослинних олій, та розділення та сушки одержаних в результаті гідратованих смол. Очищений продукт можуть отримувати шляхом фракціонування суміші на нерозчинні в ацетоні фосфоліпіди та гліколіпіди, які залишаються після видалення тригліцеридів та рослинної олія за рахунок промивання ацетоном. Альтернативно, лецитин можуть отримувати з різних комерційних джерел. Інші прийнятні фосфоліпіди включають фосфотидилгліцерин, фосфотидилінозитол, фосфотидилсерин, фосфатидну кислоту, кардіоліпін, та фосфотидилетаноламін. Фосфоліпіди можуть бути виділені з природних джерел або синтезовані за традиційним способом.

І0075| В додаткових варіантах здійснення, емульгатори, які використовують в даному документі, не включають лецитин, або використовують лецитин в кількостях, які не є імунологічно ефективними.

І0076)| Неприродні, синтетичні емульгатори, прийнятні для застосування в композиціях ад'ювантів за представленим винаходом включають на основі сорбітану неіонні поверхнево- активні речовини, наприклад, заміщені жирними кислотами на основі сорбітану поверхнево- активні речовини (комерційно доступну під назвою 5РАМФ або АКІГАСЕЇФ), складні ефіри жирних кислот з поліетоксильованим сорбітом (ТМУЕЕМФ)), складні ефіри поліетиленгліколю та жирних кислот з джерел, таких як рицинова олія (ЕМО РОКФ); поліетоксильованої жирної кислоти (наприклад, стеаринової кислоти, доступної під назвою БІМИО!5ОЦФ М-53), поліетоксильований ізооктилфенол/формальдегідний полімер (ТМ ОХАРОЇ Ф), прості ефіри поліоксіетилен жирного спирту (ВКІОУФ); поліоксіетилен-нефенільні прості ефіри (ТКІТОМФ М), поліоксіетилен ізооктилфенілові прості ефіри (ТКІТОМО Х). Переважні синтетичні поверхнево- активні речовини представляють собою поверхнево-активні речовини доступні під назвою

ЗРАМФ та ТУУЕЕМО,, такі як ТУМЕЕМФО-80 (поліоксіетилен (20) сорбітану моноолеат) та ЗРАМО- 80 (сорбітану моноолеат).

І0077| Загалом кажучи, емульгатор(и) можуть бути присутніми в вакцинній композиції в кількостях від 0,01 95 до 40 95 за об'ємом, переважно, від 0,1 95 до 15 95, більш переважно від 2 Чо до 10 9. 0078) Додаткові інгредієнти, присутні в представлених композиціях ад'ювантів включають катіонні носії, імуностимулюючі олігонуклеотиди, монофосфоліпід А та їх аналоги (МРІ-А), поліінозинову:поліцитидилову кислоту (полі ІС), сапоніни, четвертинний амоній, стерини, гліколіпіди, джерело алюмінію (наприклад, КЕНУХОКАСЕЇ Ф або МАС 20Ф вологий гель) та їх комбінації.

І0079| Прийнятні катіонні носії включають, без обмеження, декстран, декстран ОЕАЕ (та їх похідні), ПЕГ, гуарові смоли, похідні хітозану, похідні полі целюлози, такі як гідроксіетилцелюлоза (НЕС) поліетиленімін, поліаміни, такі як полілізин, тощо.

І0080)| Прийнятні імуностимулюючі олігонуклеотиди включають ОМ (на основі ДНК), ОКМ (на основі РНК) олігонуклеотиди або химерні О0М-ОРБМ стуктури, які можуть мати модифікований скелет, включаючи, без обмеження, фосфоротіоатні модифікації, галогенування, алкілування (наприклад, етил- або метил- модифікації), та фосфодискладноефірні модифікації. В деяких варіантах здійснення, використаною може бути полі-інозинова -цитидилова кислота або її похідна (полі І:С).

Ї0081| Сра олігонуклеотиди представляє собою недавно описаний клас фармакотерапевтичних агентів, які характеризуються присутністю неметильованого Со динуклеотиду в специфічних контекстах базової послідовності (Сро мотив). (Напзеї ТТ, Вате5

РУ (вдв): Мем Огидв тог Азіпта, АПегду та СОРО. Ргод Кезріг Кез. Вазеї, Кагдег, 2001, мої 31, рр 229-232, яка включена в даний документ у вигляді посилання). Дані Сро мотиви не виявлені в еукаріотичній ДНК, в якій супресуються СО динуклеотиди, та, коли присутні, як правило, метильовані, але присутні в бактеріальній ДНК, яким вони надають імуностимулюючі властивості.

І(0082| В вибраних варіантах здійснення, ад'юванти за представленим винаходом використовують так званий імуностимулюючий олігонуклеотид Р-класу, більш переважно, модифіковані імуностимулюючі олігонуклеотиди Р-класу, ще більш переважно, Е-модифіковані олігонуклеотиди Р-класу. Імуностимулюючі олігонуклеотиди Р-класу є Сро олігонуклеотидами, які характеризуються присутністю паліндромів, в цілому довжиною в 6-20 нуклеотидів.

Олігонуклеотиди Р-класу мають здатність спонтанно самоорганізуються в конкатемери або іп мійго та/або іп мімо. Дані олігонуклеотиди є, в вузькому розумінні, одноланцюговими, але присутність паліндромів дозволяє утворення конкатемерів або, можливо, стовбурових-та- петельних структур. Загальна довжина імуностимулюючих олігонуклеотидів Р-класу становить від 19 до 100 нуклеотидів, наприклад, 19-30 нуклеотидів, 30-40 нуклеотидів, 40-50 нуклеотидів, 50-60 нуклеотидів, 60-70 нуклеотидів, 70-80 нуклеотидів, 80-90 нуклеотидів, 90-100 нуклеотидів.

І0083| В одному аспекті винаходу імуностимулюючий олігонуклеотид містить 5 ТІК активаційний домен та, щонайменше, два паліндромних ділянок, де одна паліндромна ділянка є 5 паліндромною ділянкою з, щонайменше, б нуклеотидів в довжину та приєднаною до 3' паліндромної ділянки з, щонайменше, 8 нуклеотидів в довжину або безпосередньо або через спейсер. (0084) Імуностимулюючі олігонуклеотиди Р-класу можуть бути модифіковані відповідно до способів, відомих в даній галузі з рівня техніки. Наприклад, У-модифікація стосується йод- бо модифікованих нуклеотидів. Е-модифікація стосується етил-модифікованого(их) нуклеотиду(ів).

Таким чином, Е-модифіковані імуностимулюючі олігонуклеотиди Р-класу представляють собою імуностимулюючі олігонуклеотиди Р-класу, в яких, щонайменше, один нуклеотид (переважно 5' нуклеотид) є етильованим. Додаткові модифікації включають приєднання б-нітро-бензімідазолу,

О-метилювання, модифікацію з проїнін-4), інозинову модифікацію, 2-бромвінілове приєднання (переважно до уридину). (0085) Імуностимулюючі олігонуклеотиди Р-класу, крім того, можуть містити модифікований міжнуклеотидний зв'язок, включаючи, без обмеження, фосфодискладноефірні зв'язки та фосфоротіоатні зв'язки. Олігонуклеотиди за представленим винаходом можуть бути синтезовані або отримані з комерційних джерел.

І0086б| Олігонуклеотиди Р-класу та модифіковані олігонуклеотиди Р-класу додатково розкриті в опублікованій заявці РСТ Мо УУО2008/068638, опублікована 12 червня 2008.

Прийнятні необмежуючі приклади модифікованих імуностимулюючих олігонуклеотидів Р-класу представлені нижче (в 5ЕО 10 МО 1-10, "7" стосується фосфоротіоатного зв'язку та " " стосується фосфодискладноефірного зв'язку). В 5ЕО ІЮО МО 11-14, всі зв'язки представляють собою фосфодискладноефірні зв'язки.

ЗЕОІЮМО:15 То сел ст сто са сеча з

ЗзЕОІ МО: 25 стало з

ЗзЕОІМОо: ЗБ гост стос тссаТ,сссассаса са в

ЗЕОІЮ МО:45 ЧО спил'чесалесе Ал ос са сао з

ЗЕ МО:55 Є счтд'чсал'сс Алло саса сао ат

ЗЕОЮ МО: 6 5 ОСА тала Осс са сс ат

ЗЕОІОМО:7 ЕС слнд' сало ост саса а ста з

ЗзЕОІЮМО:85О сота ла са сса с ат з віхедвик он: и носимо си чонси шмонсиснонсиснононснонош си с

ЗЕОІОМО:т05 Тс сл ст ст сич себе З" зЗЕОЮ МО: 11 У-ООСООоСООСООВООСЮСОО-3"

ЗЕО ПО МО: 12 5-ШШАООАООАдООДООАООдО-З"

ЗЕО ІО МО: 13 5-АААСОЯСИОСАаССААДасда-з

ЗЕО ІЮ МО: 14 5-дтаСасатаСасататататиаєиОгОгат"ОстОатататат-з

Зо ІЇ0087| Кількість імуностимулюючого олігонуклеотиду Р-класу для застосування в композиціях ад'ювантів залежить від природи імуностимулюючого олігонуклеотиду Р-класу, який використовується, та передбачуваних видів. (0088) Прийнятні аналоги МРІ -А включають, без обмеження, природні І Р5, які можуть бути бактеріального походження, зміненої або незміненої структури, або синтетичні, глюкопіранозильний ліпідний ад'ювант (СІ А), пертактин, варіюючи замісниками в 3-О-положенні відновлюючого цукру, синтетичні форми аналога ліпіду А з низькою ендотоксічності.

І0089| Стерини мають спільне загальне хімічне ядро, яке представляє собою стероїдну кільцеву структуруи!|, які мають гідроксильну (ОН) групу, як правило, приєднана до вуглецю-3.

Вуглеводневий ланцюг жирнокислотного замісника варіює в довжину, як правило, від 16 до 20 атомів вуглецю, та може бути насиченим або ненасиченим. Стерини, як правило, містять один або більше подвійних зв'язків в кільцевій структурі та також ряд замісників, приєднаних до кілець. Стерини та їх складні ефіри з жирними кислотами є фактично нерозчинними у воді. З точки зору даних хімічних подібностей, таким чином, є можливим, що стерини, які мають спільне дане хімічне ядро, будуть мати подібні властивості, коли їх застосовують в вакцинних композиціях за представленим винаходом. Стерини є добре відомими в даній галузі з рівня техніки та можуть бути придбані на комерційній основі. Наприклад, холестерин розкритий в

МегсК Іпдех, 121йп Еа., р. 369. Прийнятні стерини включають, без обмеження, В-ситостерин, стигмастерин, ергостерин, ергокальциферол та холестерин.

ІЇ0090| Прийнятні сапоніни включають тритерпеноїдні сапоніни. Дані тритерпеноїди представляють собою групу поверхнево-активних глікозидів рослинного походження та мають спільне загальне хімічне ядро, яке складається з гідрофільної ділянки (як правило декілька цукрових ланцюгів) в поєднанні з гідрофобною ділянкою або стероїдної, або тритерпеноїдної структури. Через це подібності, сапоніни, які мають спільне дане хімічне ядро, є ймовірно такими, що мають аналогічні підвищуючі імуногенність антитіл властивості. Тритерпеноїди, прийнятні для застосування в ад'ювантній композиції, можуть надходити з різних джерел, або рослинного походження або синтетичні еквіваленти, включаючи, але не обмежуючись цим, екстракт кори панама дерева, томатин, екстракти женьшені, гриби та алкалоїдний глікозид структурно подібний до стероїдних сапонінів.

ІЇ0091| Якщо використовується сапонін, ад'ювантні композиції в цілому містять фракцію бо імунологічно активного сапоніну з кори панама дерева. Сапонін може бути, наприклад, Оці А або інший очищений або частково очищений препарат сапоніну, який може бути отриманий на комерційній основі. Таким чином, екстракти сапоніну можуть використовуватись як суміші або очищені індивідуальні компоненти, такі як 05-7, 05-17, 05-18, та 05-21. В одному варіанті здійснення ОціЇ А має, щонайменше, 85 95 чистоти. В інших варіантах здійснення, Оси А має, щонайменше, 90 9, 91 Фо, 92 9», 93 9», 94 Уо, 95 У, 96 9», 97 У», 98 95 або 99 95 чистоти. (0092) Четвертинні амінні сполуки представляють собою сполуки на основі амонію з чотирма вуглеводневими групами. На практиці, вуглеводневі групи в цілому обмежуються алкільними або арильними групами. В наборі варіантів здійснення, четвертинні амінні сполуки складаються з чотирьох алкільних ланцюгів, два з яких є С10-С20 алкілами, та останні два є С1-С4 алкілами.

В одному наборі варіантів здійснення, четвертинний амін є диметилдіоктадециламонію бромідом, хлоридом або фармацевтично прийнятним протиїоном (ОБА). 0093) Прийнятні гліколіпіди, в цілому, є такими, які активують Тп2 відповідь. Гліколіпіди включають, без обмеження, ті, які охоплюються формулою І та та які, в цілому, є описаними в публікації 05 20070196384 (Катазату еї аї).

В- 0--СН, о; ух - о М хи - о Мн-- 55

Формула

І0094| В структурі формули І, К' та Кг незалежно є воднем або насиченим алкільним радикалом, який має аж до 20 атомів вуглецю; Х є -СН2-, -0О- або -МН-; В? є воднем, або насиченим або ненасиченим алкільним радикалом, який має аж до 20 атомів вуглецю; ЕКЗ, В", та

В? незалежно є воднем, -50427, -РО2, -СОС.-1о алкілом; Б є І -аланіном, І -альфа-амінобутилом,

І -аргінілом, І -аспаргінілом, І -аспартилом, І -цистеїнілом, І -глутамілом, І-гліцилом, І -гістиділом,

І -гідроксипропілом, ГІ -ізолейцилом, І-лейцилом, І-лізилом, ГІ -метіонілом, І-орнітилом, І- фенілаланілом, І-пролілом, І-серилом, І-треонілом, Г-тирозилом, І-триптофанілом та І1- валілом або їх О-ізомерами. 00951 В наборі варіантів здійснення, прийнятний гліколіпід представляє собою М-(2-дезокси- 2-І-лейциламіно-б-Ю-глюкопіранозил)-М-октадецилдодеканоїламід або його ацетат.

ІЇ0096| Алюміній є відомим ад'ювантом або компонентом композиції ад'ювантів та є комерційно доступним в таких формах як КепПеїв5, Іпс, Вгепіад алюмогідрогель КЕНУОКАСЕЇ Ф або МАС 20Ф вологий гель. КЕНУОКАСЕЇ! Ф є кристалічним оксигідроксидом алюмінію, відомим з мінералогії як беміт. Він є ефективним в вакцинах, коли існує необхідність пов'язувати негативно заряджені протеїни. Вміст АЇ2Оз знаходиться в діапазоні від 2 95 до 10 95 в залежності від сорту, та його в'язкість становить 1000-1300 СП. В цілому, він може бути описаний як адсорбент гельгідрат оксиду алюмінію. МАСФ 20 вологий гель представляє собою білий або майже білий, прозорий, в'язкий колоїдний гель. В деяких варіантах здійснення, вміст АІ2Оз становить приблизно 2 95 мас./об.

І0097| В інших варіантах здійснення, джерело алюмінію також може бути отримане за рахунок процесів осадженого гідроксиду алюмінію. 0098) В певному наборі варіантів здійснення, на додаток до олії та необов'язкового одного або більше емульгаторів, композиції ад'ювантів також містять (або фактично складаються, або складаються) комбінацію з монофосфорильного ліпіду А (МРІ--А) або його аналога, стерину та імуностимулюючого олігонуклеотида. Ад'юванти, які містять дані інгредієнти згадуються як "ТСМО". ТОМО композиція ад'юванта, крім того, може необов'язково включати полі ІС ("ТСМУО") та/або сапонін. Таким чином, композиції ад'ювантів, які містять, або що фактично складаються з, або складаються з комбінації монофосфорильного ліпіду А (МРІ-А) або його аналога, стерину та імуностимулюючого олігонуклеотиду та сапоніну називаються як "ОТСМО".

Крім того, композиції ад'ювантів також можуть включати полі І:С. Такі ад'юванти називаються як "ОТСМмО".

І0099| В наборі варіантів здійснення, ТСМО ад'юванти містять легку мінеральну олію в кількості від 40 95 до 50 95 об./06б. від загального об'єму вакцинної композиції. Емульгатори включають ТМ/ЕЕМ-80 та 5РАМ-80, загальною кількістю від 0,1 90 до 40 95 об./06. від загального об'єму вакцинної композиції, за умови, що сорбітану моноолеат та олія разом складають від приблизно 50,5 95 до 52 95 об./об. композиції. Імуностимулюючий олігонуклеотид представляє собою ОМ, переважно, паліндром, який містить ОМ, необов'язково, з модифікованим скелетом. 00100) В деяких варіантах здійснення, одна доза ТСМО містить від приблизно 1 мкг до приблизно 400 мкг імуностимулюючого олігонуклеотида, від приблизно 1 мкг до приблизно 1000 мкг стерину, від приблизно 0,1 мкг до 500 мкг МРІ--А або його аналога. 00101) Кількості інших сполук на дозу вибирають на основі видів суб'єктів. 00102) Наприклад, в деяких варіантах здійснення прийнятна для великої рогатої худоби, овець, або дорослих свиней одна доза ТСМО буде містити від приблизно 50 до 400 мкг (наприклад, 50-300, або 100-250 мкг, або від приблизно 50 до приблизно 100 мкг для дорослих свиней та від приблизно 100 до приблизно 250 мкг для великої рогатої худоби) імуностимулюючого олігонуклеотида, від приблизно 100 до приблизно 1000 мкг (наприклад, 200-1000, 250-700 мкг, або приблизно 400-500 мкг) стерину, такого як холестерин, та від приблизно 5 до приблизно 500 мкг (наприклад, 5-100 мкг, або 5-50 мкг, або 10-25 мкг) МРІ-А або його аналога. 00103) В деяких варіантах здійснення прийнятна для домашніх тварин або поросят одна доза ТСОМО буде містити від приблизно 5 до 100 мкг (наприклад, 10-80, або 20-50 мкг) імуностимулюючого олігонуклеотида, від приблизно 5 до 100 мкг (наприклад, 10-80, або 20-50 мкг) стерину, такого як холестерин, та від приблизно 0,5 до приблизно 200 мкг (наприклад, 1- 100 мкг, або 5-50 мкг, або 5-20 мкг) МРІ-А або його аналога. 00104) В деяких варіантах здійснення прийнятна для домашньої птиці одна доза ТСМО ад'юванта буде містити від приблизно 0,1 до приблизно 5 мкг (наприклад, 0,5-3 мкг, або 0,9-1,1 мкг) імуностимулюючого олігонуклеотида, від приблизно 0,5 до приблизно 50 мкг (наприклад, 1- 20 мкг, або 1-10 мкг) стерину, такого як холестерин, та від приблизно 0,1 до 10 мкг (наприклад, 0,5 - 5 мкг, або 1-5 мкг) МРГ А або його аналога.). МРІ--А є присутнім в кількості від 0,1 мкг/доза до 2 000 мкг/доза. 00105) В деяких варіантах здійснення, ТСМО ад'юванти одержують за наступним способом: а) Сорбітану моноолеат, МРІ-А та холестерин розчиняють в легкій мінеральній олії.

Отриманий в результаті розчин олії піддають стерильній фільтрації;

Б) імуностимулюючий олігонуклеотид та поліоксієтилен (20) сорбітану моноолеат

Зо розчиняють у водній фазі, таким чином, утворюючи водний розчин; с) Водний розчин додають до розчину олії при безперервній гомогенізації, таким чином, утворюючи композицію ад'юванта ТСМО.

Ї00106| В ТСОММУО ад'ювантах холестерин, олія, необов'язкові емульгатори, МРІ-А та імуностимулюючі олігонуклеотиди присутні як в ТСМО композиції ад'юванта для відповідних видів. Полі ІС можуть бути присутніми, в цілому, в кількості від приблизно 1 мкг до приблизно 100 мкг на дозу.

І00107| Більш конкретно, полі С може бути присутнім в кількості 5-100 мкг на дозу (наприклад, 5-50 мкг, або 10-30 мкг) в деяких варіантах здійснення прийнятні для великої рогатої худоби, дорослих свиней, або овець. В деяких варіантах здійснення прийнятна для домашніх тварин або поросят одна доза ТСМУО містить від приблизно 1 до приблизно 50 мкг (наприклад, 5-50 мкг, або 10-20 мкг) полі І:С. В деяких варіантах здійснення прийнятні для вакцин для домашньої птиці одна доза ТСММУО містить від приблизно 1 до приблизно 10 мкг (наприклад, 1-5 мкг, або 3-5 мкг) полі І:С. 00108) В деяких варіантах здійснення, ТОМУО ад'юванти отримують аналогічно до ТСМО ад'ювантів, та полі І:С додають до водного розчину. 00109) В наборі варіантів здійснення, в ОТСМО ад'ювантах холестерин, олія, необов'язкові емульгатори, МРІ-А, та імуностимулюючі олігонуклеотиди присутні як в ТСМО композиції ад'юванта для відповідних видів. Сапонін переважно представляє собою Си А або його очищену очищену фракцію, та може бути присутнім в кількостях від приблизно 0,1 мкг до приблизно 1000 мкг на дозу.

ІЇ00110| Більш конкретно, в деяких варіантах здійснення в прийнятних вакцинах для домашньої птиці сапонін може бути присутнім в кількості від 0,1 до 5 мкг на 50 мкл вакцинної композиції (наприклад, 0,5 - 30 мкг на 50 мкл композиції, або більш переважно 1-10 мкг) на дозу.

В деяких варіантах здійснення прийнятних для застосування у домашніх тварин та поросят, сапонін, наприклад, ОціЇ А або його очищена фракція, присутній в кількостях від приблизно 10 до приблизно 100 мкг на дозу (наприклад, 10-50 мкг або 20-50 мкг на дозу). В деяких варіантах здійснення прийнятний для великої рогатої худоби, дорослих свиней або овець, сапонін, такий як ОціЇ А або його очищена фракція, присутній в кількості від приблизно 100 до приблизно 1000 мкг на дозу (наприклад, 200-800 мкг, або 250-500 мкг на дозу).

00111) В деяких варіантах здійснення, ОТСМО ад'юванти отримують аналогічно до ТСМО ад'ювантів, та сапонін додають до водного розчину. 00112) В наборі варіантів здійснення, в ОТСМУО ад'ювантах, сапонін є присутнім як в

ОТСМО ад'юванті, та останні з інгредієнтів є присутніми як в ТСМУО, для відповідних видів.

І00113| В деяких варіантах здійснення, ОТСОМУО ад'юванти отримують аналогічно до

ТСМТУО ад'ювантів, та сапонін додають до водного розчину. 00114) В альтернативних варіантах здійснення, на додаток до олії та необов'язкового(их) емульгатора(ів), композиції ад'ювантів також містять (або фактично складаються з, або складаються 3з) комбінацію з монофосфорильного ліпіду А (МРІ-А) або його аналога та полікатіонного носія. Дані ад'юванти називаються як "ХОМ". 00115) В наборі варіантів здійснення, в ХОМ ад'ювантах для домашніх тварин або поросят, полікатіонний носій присутній в кількості 1-50 мг на дозу (наприклад, 1-25 мг на дозу, або 10-25 мг на дозу), та МРІ-А або його аналог присутній в кількості приблизно 1-50 мкг на дозу (наприклад, 1-25 мкг на дозу, або 10-25 мкг на дозу). 00116) В деяких варіантах здійснення прийнятний для великої рогатої худоби, овець та дорослих свиней, полікатіонний носій присутній в кількості від приблизно 5 до приблизно 500 мг на дозу (наприклад, 10-500 мг, або 10-300 мг, або 50-200 мг на дозу), та МРІ--А або його аналог присутній в кількості від приблизно 1 до приблизно 100 мкг на дозу (наприклад, 5-100 мкг, або 5- 50 мкг, або 10-30 мкг).

ІЇ00117| В деяких варіантах здійснення прийнятний для домашніх тварин та поросят, полікатіонний носій присутній в кількості від приблизно 1 до приблизно 50 мг на дозу (наприклад, 1-25 мг на дозу, або 10-25 мг на дозу), та МРІ-А або його аналог присутній в кількості від приблизно 0,5 до приблизно 200 мкг (наприклад, 1-100 мкг, або 5-50 мкг, або 5-20 мкг) на дозу.

ІЇ00118| В деяких варіантах здійснення в прийнятних вакцинах для домашньої птиці, полікатіонний носій є присутнім в кількості від 0,5 до 25 мг на дозу (наприклад, 1-20 мг, або 1-10 мг або 5-10 мг), та МРІ--А або його аналог є присутнім в кількості від приблизно 0,5 та 10 мкг на дозу (наприклад, 1-10 мкг, або 1-5 мкг, або 2-5 мкг). 00119) В деяких варіантах здійснення, ХОМ ад'юванти отримують за наступним способом:

Зо а) Сорбітану моноолеат, МРІ-А та холестерин розчиняють в легкій мінеральній олії.

Отриманий в результаті розчин олії піддають стерильній фільтрації; р) Декстран ОЕАЕ та поліоксіетилен (20) сорбітану моноолеат розчиняють у водній фазі, таким чином утворюючи водний розчин; с) Водний розчин додають до розчину олії при безперервній гомогенізації, таким чином, утворюючи композицію ад'юванта ХОМ.

І00120| В додаткових альтернативних варіантах здійснення, на додаток до олії та емульгатора(ів), композиції ад'ювантів також містять (або фактично складаються з, або складаються з) комбінацію з імуностимулюючого олігонуклеотида та полікатіонного носія, за умови, що якщо зазначений полікатіонний носій є декстраном ОЕАЕ, то антиген не є бактерином

Е сої 9-5. Дані ад'юванти називаються як "ТХО". В деяких варіантах здійснення, вакцини, в які додають ад'ювант з ТХО, містять антиген(и), який(ї) містить збудники, які інфікують велику рогату худобу, овець, коней або свиней. В інших варіантах здійснення, антигени отримують із зазначених збудників. В інших варіантах здійснення, вакцини, в які додають ад'ювант з ТХО містять антигени), який(ї) містить збудники, які інфікують птицю або кішок, або антигени можуть отримувати з таких збудників. В наборі варіантів здійснення, ТХО ад'юванти також можуть включати джерело алюмінію, таке як гель АКОН)»з. ТХО ад'юванти з алюмінієм називаються як "ТХО-А".

І00121| В наборі варіантів здійснення, в ТХО ад'ювантах, імуностимулюючий олігонуклеотид, переважно ОМ, який переважно містить паліндромну послідовність, та необов'язково з модифікованим скелетом, може бути присутнім в кількості 0,5-400 мкг на дозу, та полікатіонний носій може бути присутнім в кількості 0,5-400 мг на дозу. Дозування варіюють в залежності від виду суб'єкта. 00122) Наприклад, в деяких варіантах здійснення прийнятна для великої рогатої худоби, овець або дорослих свиней одна доза ТХО буде містити від приблизно 50 до 400 мкг (наприклад, 50-300, або 100-250 мкг, або від приблизно 50 до приблизно 100 мкг для дорослих свиней та від приблизно 100 до приблизно 250 мкг для великої рогатої худоби) імуностимулюючого олігонуклеотида, та полікатіонний носій може бути присутнім в кількості від приблизно 5 до приблизно 500 мг на дозу (наприклад, 10-500 мг, або 10-300 мг, або 50-200 мг на дозу).

00123) В деяких варіантах здійснення прийнятна для домашніх тварин або поросят одна доза ТХО буде містити від приблизно 5 до 100 мкг (наприклад, 10-80 мкг, або 20-50 мкг) імуностимулюючого олігонуклеотида, тоді як полікатіонний носій може бути присутнім в кількості 1-50 мг на дозу (наприклад, 1-25 мг на дозу, або 10-25 мг на дозу).

І00124)| В деяких варіантах здійснення прийнятна для домашньої птиці одна доза ТХО ад'юванта буде містити від приблизно 0,1 до приблизно 5 мкг (наприклад, 0,5-3 мкг, або 0,9-1,1 мкг) імуностимулюючого олігонуклеотида, та полікатіонний носій може бути присутнім в кількості від 0,5 до 25 мг на дозу (наприклад, 1-20 мг, або 1-10 мг, або 5-10 мг). 00125) В деяких варіантах здійснення, ТХО ад'юванти отримують за наступним способом: а) Сорбітану моноолеат розчиняють в легкій мінеральній олії. Отриманий в результаті розчин олії піддають стерильній фільтрації;

Б) Імуностимулюючий олігонуклеотид, декстран ЮЕАЄЕ та поліоксіетилен (20) сорбітану моноолеат розчиняють у водній фазі, таким чином, утворюючи водний розчин; та с) Водний розчин додають до розчину олії при безперервній гомогенізації, таким чином, утворюючи композицію ад'юванта ТХО.

Ї00126| В наборі варіантів здійснення, в ТХО-А ад'ювантах, імуностимулюючий олігонуклеотид є присутнім як ТХО ад'ювант, джерело алюмінію є присутнім в кількості аж до 40 95 об./06б. (наприклад, 35 95, З0 95, 25905, 20905, 1595, 10 96, 5 У, 1 965). В наборі варіантів здійснення, джерело алюмінію є присутньою в кількості 2 95-20 95 о0б./0б. від вакцинної композиції, більш переважно від приблизно 5 95 до приблизно 17 95 об./об.

І00127| В деяких варіантах здійснення, ТХО-А ад'юванти отримують аналогічно до ТХО ад'ювантів, та джерело алюмінію додають до водного розчину. 00128) В додаткових варіантах здійснення, ад'юванти за представленим винаходом містять олію, необов'язковий(і) емульгатор(и), імуностимулюючий олігонуклеотид та джерело алюмінію.

Дані сполуки є присутніми в діапазонах, розкритих для ТХО-А ад'юванта, за винятком того, що полікатіонний носій відсутній в ТОА. ТОА ад'ювант отримують аналогічно до ТХО ад'юванта, за винятком того, що водна фаза містить джерело алюмінію, а не ОЕАЕ декстран. 00129) В деяких варіантах здійснення, на додаток до олії та емульгаторак(ів), композиції ад'ювантів також містять (або фактично складаються з, або складаються з) комбінацію з полікатіонного носія та джерела алюмінію. Даний ад'ювант називається як АХО. Дані сполуки можуть бути присутніми в кількостях аналогічних до тих, що присутні в ад'юванті ТХО-А для відповідних видів, та ад'ювант АХО можуть отримати аналогічно до ТХО-А, але без додавання імуностимулюючого олігонуклеотида.

І00130| В деяких інших варіантах здійснення, на додаток до олії та емульгаторакбів), композиції ад'ювантів також містять (або фактично складаються з, або складаються 3) комбінацію сапоніну та стерину. Даний ад'ювант називається як ОСО. Природа та кількості інгредієнтів ОСО є аналогічними до кількостей сапоніну, стерину, олії та емульгатора(ів) в ад'юванті ОТОМО. ОСО можуть отримати шляхом додавання водного розчину, який містить сапонін, стерин та, переважно, розчинний у воді емульгатор в олійній фазі, яка містить олію та, переважно, розчинний в олії емульгатор при безперервній гомогенізації.

І00131| В ще наступних альтернативних варіантах здійснення, на додаток до олії та емульгатора(ів), композиції ад'ювантів також містять (або фактично складаються з, або складаються з) комбінацію з четвертинного аміну, гліколіпіду, МРІ -А або його аналога, та полі

ІС. Дані ад'юванти називаються як "ООУКМ". (00132) В ОЮМЕМ ад'ювантів, олія, в цілому, представляє собою суміш фосфоліпідів, таких як фосфотидилхоліни. АМРНІСЕМЕ представляє собою прийнятний приклад такої олії, та повинна бути присутньою в кількості аналогічній до кількості олії, як описано вище. 00133) В наборі варіантів здійснення, в ОЮУКМ ад'ювантах, четвертинний амін, наприклад, рОА, є присутнім в кількості від приблизно 1 мкг до приблизно 200 мкг на дозу, полі І:С є присутнім в кількості від приблизно 0,5 мкг до 100 мкг на дозу, гліколіпід є присутнім в кількості від приблизно 0,5 мкг до приблизно 2000 мкг на дозу, та МРІ--А або його аналог є присутнім в кількості від приблизно 0,5 мкг до 100 мкг на дозу.

І00134| Більш конкретно, в деяких варіантах здійснення прийнятний для введення великій рогатій худобі, дорослим свиням, або вівцям, четвертинний амін може бути присутнім в кількості від приблизно 50 мкг до приблизно 200 мкг на дозу (наприклад, 50-150 мкг, або приблизно 100 мкг), полі Ї:С може бути присутнім в кількостях від приблизно 1 мкг до приблизно 100 мкг на дозу (наприклад, 1-50 мкг або 5-50 мкг), гліколіпід може бути присутнім в кількості від приблизно 500 мкг до приблизно 2000 мкг на дозу (наприклад, 500-100 мкг або приблизно 1000 мкг), та МРІГА або його аналог може бути присутнім в кількості від приблизно 5 мкг до приблизно 100 мкг на 60 дозу (наприклад, 5-50 мкг, або 10-50 мкг).

00135) В деяких варіантах здійснення прийнятний для введення домашнім тваринам та поросятам, четвертинний амін може бути присутнім в кількості від приблизно 5 до приблизно 500 мкг на дозу (наприклад, 10-100 мкг на дозу, або 20-50 мкг на дозу), полі С може бути присутнім в кількості від приблизно 5 мкг до приблизно 25 мкг на дозу (наприклад, 50-20 мкг, або приблизно 10 мкг), гліколіпід може бути присутнім в кількості від приблизно 10 до приблизно 100 мкг на дозу (наприклад, 20-100 мкг або 25-50 мкг), та МРІ-А або його аналог може бути присутнім в кількості від приблизно 5 до приблизно 50 мкг на дозу (наприклад, 5-20 мкг, або 10- 20 мкг). 00136) В деяких інших варіантах здійснення, в прийнятних вакцинах для домашньої птиці, одна доза буде містити від приблизно 1 мкг до приблизно 10 мкг четвертинної амінної сполуки (наприклад, 5-10 мкг, або приблизно 5 мкг), від приблизно 0,5 до приблизно 10 мкг полі І:С (наприклад, 1-10 мкг або 1-5 мкг), від приблизно 0,5 та 10 мкг гліколіпіду (наприклад, 1-10 мкг, або 5-10 мкг, або 1-5 мкг), та від приблизно 0,5 мкг до приблизно 5 мкг МРІ- -А або його аналога (наприклад, 0,5-5 мкг або 1-5 мкг).

І00137| В деяких варіантах здійснення, ОЮМКМ ад'юванти отримують за наступним способом: а) Сорбітану моноолеат, МРІ-А розчиняють в легкій мінеральній олії. Отриманий в результаті розчин олії піддають стерильній фільтрації та диспергують у воді з деякою кількістю поверхнево-активної речовини, етанолу та оцтової кислоти;

Б) Поліоксіетилен (20) сорбітану моноолеат, четвертинний амін, наприклад, ЮБА, та полі І:С розчиняють у водній фазі, таким чином, утворюючи водний розчин; та с) Водний розчин додають до розчину олії при безперервній гомогенізації, таким чином, утворюючи композицію ад'юванта ОЮУЕМ. (00138) В ще наступному наборі варіантів здійснення, на додаток до олії та емульгатора(ів), композиції ад'ювантів також містять (або фактично складаються з, або складаються 3) комбінацію з сапоніну, стерину, четвертинного аміну, полікатіонного носія, за умови, що, якщо зазначений полікатіонний носій є декстраном ОЕАЕ, то антиген не є бактерином Е соїї 9-5. Дані ад'юванти називаються як "ОСОХО".

І00139| В ОСОХО ад'ювантах, в деяких варіантах здійснення, сапонін, наприклад, Оиї А,

Зо може бути присутнім в кількостях від приблизно 0,1 мкг до приблизно 1000 мкг на дозу, стерин, наприклад, холестерин, є присутнім від приблизно 1 мкг до приблизно 1000 мкг на дозу, четвертинний амін, наприклад, ОА, є присутнім в кількості від приблизно 1 мкг до приблизно 200 мкг на дозу, та полікатіонний носій може бути присутнім в кількості 0,5-400 мг на дозу.

Дозування варіюють в залежності від виду суб'єкта. 35 00140) В деяких варіантах здійснення прийнятний для великої рогатої худоби, овець, та дорослих свиней сапонін є присутнім в кількості від приблизно 100 до приблизно 1000 мкг на дозу (наприклад, 200-800 мкг, або 250-500 мкг на дозу), стерин є присутнім в кількостях від приблизно 100 до приблизно 1000 мкг (наприклад, 200-1000, 250-700 мкг, або приблизно 400- 500 мкг), четвертинний амін може бути присутнім в кількості від приблизно 50 мкг до приблизно 40 200 мкг на дозу (наприклад, 50-150 мкг, або приблизно 100 мкг), та полікатіонний носій може бути присутнім в кількості від приблизно 5 до приблизно 500 мг на дозу (наприклад, 10-500 мг, або 10-300 мг, або 50-200 мг на дозу). 00141) В деяких варіантах здійснення прийнятні для застосування у домашніх тварин та поросят, сапонін, наприклад, Оці А або його очищена фракція, є присутнім в кількостях від 45 приблизно 10 до приблизно 100 мкг на дозу (наприклад, 10-50 мкг або 20-50 мкг на дозу), стерин є присутнім в кількостях від приблизно 5 до 100 мкг (наприклад, 10-80, або 20-50 мкг), четвертинний амін може бути присутнім в кількості від приблизно 5 до приблизно 500 мкг на дозу (наприклад, 10-100 мкг на дозу, або 20-50 мкг на дозу), та полікатіонний носій може бути присутнім в кількості 1-50 мг на дозу (наприклад, 1-25 мг на дозу, або 10-25 мг на дозу. 50 (00142) В деяких варіантах здійснення в прийнятних вакцинах для домашньої птиці, сапонін може бути присутнім в кількості від 0,1 до 5 мкг на 50 мкл вакцинної композиції (наприклад, 0,5 - мкг на 50 мкл композиції, або більш переважно 1-10 мкг) на дозу, стерин може бути присутнім в кількостях від приблизно 0,5 до приблизно 50 мкг (наприклад, 1-20 мкг, або 1-10 мкг), четвертинний амін може бути присутнім в кількості від приблизно 5 до приблизно 500 мкг на дозу (наприклад, 10-100 мкг на дозу, або 20-50 мкг на дозу), та полікатіонний носій може бути присутнім в кількості від 0,5 до 25 мг на дозу (наприклад, 1-20 мг, або 1-10 мг або 5-10 мгГг).

І00143| В деяких варіантах здійснення, ОСОХО ад'юванти отримують за наступним способом: а) Сорбітану моноолеат розчиняють в олії. Отриманий в результаті розчин олії піддають бо стерильній фільтрації;

Б) Поліоксіеєтилен (20) сорбітану моноолеат, четвертинний амін, наприклад, ЮОБА, полікатіонний носій, стерин та сапонін розчиняють у водній фазі, таким чином, утворюючи водний розчин; та с) Водний розчин додають до розчину олії при безперервній гомогенізації, таким чином, утворюючи композицію ад'юванта ОСОХО. (00144) В деяких випадках, неможливим або недоцільним є концентрувати антиген, зокрема, в масштабах комерційних застосувань, та повинні використовуватись низькі концентрації антигенових розчинів. Таким чином, в деяких варіантах здійснення, вакцинні композиції за представленим винаходом містять композиції ад'ювантів, як описано вище, де розбавляють вміст олійної фази в даних композиціях ад'ювантів, та де вакцинна композиція представляє собою емульсію вода-в-олії.

ІЇ00145| На практиці, можливим є створити емульсію вода-в-олії, в якій олійна фаза становить менше, ніж 50 905 об./об.

І00146| Коротко кажучи, по-перше, композицію ад'юванта за представленим винаходом отримують, як описано вище. В зазначеному ад'ювантному препараті олійна фаза містить понад 5095 об./06. композиції ад'юванта. Кількості інгредієнтів інших, ніж олія та емульгатори), збільшують, відповідно, грунтуючись на кінцевій цільовій концентрації та необхідному розбавленні. Наприклад, якщо один націлюється на отриманні вакцинної композиції, де композиція ад'юванта містить 80 95 об./0б., кількості інгредієнтів інших, ніж олія збільшують за показником 1,25 (1/0,8). Кількості емульгаторів, якщо будь-яка (наприклад, ТУМЕЕМФОВ8О та/або

ЗРАМФОВО) не обов'язково повинні бути збільшені, але переважно, об'ємне співвідношення між олією та емульгатором(ами) зберігається таким самим в композиції ад'юванта та в кінцевій вакцинній композиції.

І00147| Розчин антигена потім додають до композиції ад'юванта. (00148) Цілісність емульсії вода-в-олії може бути збережена до тих пір, доки дисперговані сферичні краплі води не присутні в більш концентрованій формі, ніж максимальна фракція упаковки для випадкової упаковки монодисперсних крапель, тобто: 0,64. Дивись Таайгов,

Етиївіоп Роптаїіоп, єїаріїйу апа АНпеоіоду, 15ї ва. 2013, УІеу-МСН Отьн 5 Со КоаА. До тих пір, доки загальний об'єм фракції, який займається водяними краплями не перевищує 0,64, тобто:

Зо 64 95 об./о6. З іншого боку це означає, що олійна фаза не повинна падати нижче 36 95 об./об. (001491 Відповідно, в різних варіантах здійснення даного аспекту винаходу передбаченими є вакцинні препарати, які містять антигенну сполуку, та розбавлену композицію ад'юванта відповідно до раніше описаних варіантів здійснення, де олійна фаза складає понад 36 95 вакцинної композиції, об./06б., та де вакцинна композиція представляє собою емульсію вода-в- олії. Без обмеження, композиції ад'ювантів, прийнятні для даного аспекту винаходу, включають

ТоМО, ТоММО, ОТСМО, ОТОММО, ХОМ, ТХО, ТХО-А, ТАО, АХО, 0ОСО, ОБУВМ, ОСОХО.

Об'єм олійної фази становить, в різних варіантах здійснення, 37 95 об./о06., 38 9Уо об./о06б., 39 95 об./0б., 40 95 об./06., 41 95 об./06., 42 95 об./о0б6., 43 95 об./06., 44 95 об./06., 45 95 о0б./о06б., 46 95 об./об., 47 Фо об./об., 48 95 об./об., 49 95 об./06. або 50 95 об./06. вакцинної композиції. 00150) Концентрація олійної фази повинна бути досить високою, щоб створити ефект депо та захистити антиген та імуномодулятор(и) від швидкого розкладання імунною системою господаря, переважно 20 95 або більше об./06. вакцинної композиції.

І00151) Відповідно, в іншому аспекті, в вакцинних композиціях за представленим винаходом, кількості олійної фази в композиціях ад'ювантів розбавляють таким чином, що вакцинний препарат представляє собою емульсію олія-в-воді або емульсію вода-в-олії-в-воді, 3 олійною фазою, яка складає 20 95 або більше об./об. вакцинної композиції. Кількості інгредієнтів інших, ніж олія та емульгатори, збільшуються, відповідно, грунтуючись на кінцевій цільовій концентрації та необхідному розбавленні. Наприклад, для отримання вакцинної композиції, де композиція ад'юванта складає 33,3 95 об./об., кількості інгредієнтів інших, ніж олія та емульгатор(и) збільшуються за показником З (1/0,333). Кількості емульгаторів, якщо такі є (наприклад, ТМ/ЕЕМО8О та/або 5РАМФВО), не повинні збільшуватися, але переважно, об'ємне співвідношення між олією та емульгатором(ами) зберігається таким самим в композиції ад'юванта та в кінцевій вакцинній композиції. 00152) В різних варіантах здійснення, вакцинна композиція представляє собою емульсію олія-в-воді або емульсію вода-в-олії-в-воді, де олійна фаза становить 21 95 об./об., 22 95 об./об., 23 95 об./об., 24 95 об./06., 25 95 об./06., 26 95 об./06., 27 95 об./06., 28 95 об./06., 29 95 об./об.,

ЗО бо об./о0б., 31 965 об./06., 32 95 о0б./06., 33 95 об./06., 34 95 об./06., 35 95 об./00., 36 95 об./об., 37 95 об./06., 38 95 об./00., 39 95 об./06., 40 95 об./06., 41 95 об./о0б., 42 95 об./06., 43 95 об./об., 44 95 об./об., 45 95 об./об., 46 95 об./06., 47 95 об./06., 48 95 об./об., 49 95 об./0б., або 50 95 об./о06. бо вакцинної композиції.

00153) Композиції ад'ювантів, прийнятні для даного аспекту винаходу, включають ТСМО, тТОоММО, ОТСМО, ОТСММО, ХОМ, ТХО, ТХО-А, ТАО, АХО, ОСО, ОБУКМ, ОСОХО, за умови, що олійна фаза в композиції ад'юванта може становити менше 50 95 об./06б., але більше 20 95 об./об. від кінцевої вакцинної композиції.

Антигени та захворювання 00154) Композиції можуть містити один або більше антигенів. Антиген може представляти собою будь-яку з широкого спектру речовин, здатних продукувати потрібну імунну відповідь у суб'єкті, включаючи, без обмеження, один або декілька з вірусів (інактивованих, ослаблених та модифікованих живих), бактерій, паразитів, нуклеотидів (включаючи, без обмеження, антигени на основі нуклеїнової кислоти, наприклад, ДНК вакцини), полінуклеотидів, пептидів, поліпептидів, рекомбінантних протеїнів, синтетичних пептидів, протеїнових екстрактів, клітин (включаючи клітини пухлини), тканин, полісахаридів, вуглеводів, жирних кислот, тейхоєвої кислоти, пептидогліканів, ліпідів або гліколіпідів, індивідуально або в будь-яких їх комбінації. 00155) Антигени, які використовуються з ад'ювантами за винаходом, також включають імуногенні фрагменти нуклеотидів, полінуклеотидів, пептидів, поліпептидів, які можуть бути виділені з організмів, які зазначені в даному документі.

Ї00156| Живі, модифіковані живі, та ослаблені вірусні штами, які не викликають захворювання у суб'єкта, виділяли в невірулентній формі або ослаблювали, застосовуючи способи, добре відомі в даній галузі з рівня техніки, включаючи серійний пасаж в прийнятній клітинній лінії або піддавання дії ультрафіолетового світла або хімічного мутагену. Інактивовані або вбиті вірусні штами є такими, які були інактивовані за способами, відомими кваліфікованому фахівцю в даній галузі, включаючи обробку формаліном, бетапропріолактоном (ВР), бінарним етиленіміном (ВЕЇ), стерилізуючим опроміненням, нагріванням, або іншими такими способами.

І00157| Два або більше антигенів можуть бути об'єднані для отримання полівалентної композиції, яка може захистити суб'єкта проти широкого спектру захворювань, викликаних патогенними мікроорганізмами. В даний час, комерційні виробники вакцин, а також кінцеві користувачі, надають перевагу полівалентним вакцинним продуктам. Тоді як традиційні ад'юванти часто є обмеженими в різноманітних антигенах, з якими вони можуть бути ефективно використані (або моновалентно, або полівалентно), ад'юванти, описані в даному документі,

Зо можуть бути ефективно використані з широким спектром антигенів, як моновалентно, так і полівалентно. Таким чином, антигени, описані в даному документі, можуть бути поєднані в одній композиції, яка містить ад'юванти, описані в даному документі. 00158) Деякі приклади бактерій, які можуть використовувати як антигени з ад'ювантними композиціями включають, але не обмежуються цим, Асеїіпеїобасіег саЇІсоасеїїси5, Асефорасіег

З5 разегціапиб5, Асіїпобасійнє рівигорпеитопіає, Аеєготопаб5 Пуайгорпіа, Аїїсусіораснив5 асідосаІдатіив, Агаедіоризх їшцїдідив5, Васійи5 ритіїшв5, Васпив5 5івагоїпегторпіи5, Васійив5 5,ИБів,

Васіїйн5 Шегптосаїепиіатшв, ВогаєїейПНа ргопспізеріїса, Ви"КпоїЇдегіа серасіа, Ви"КпоїЇдегіа діитає,

Сатруобасієг соїї, Сатруорасієї їТеїш5, Сатруіобасієг |вішпі, Сатруобасієг Нуоіпієвііпаїв,

СНіатуайа рвзінасі, СНіатуадіа іШаспотаїйх, СНіатудорніа 5рр., Спготобасієтішт мівсо5ит,

Егузіре!оїйгіїх пизіораїпіває, І ісїепа топосуїодепев, ЕНпісніа сапіб5, ЕвсПегісніа соїї, Наеторніи5 іпїнепгає, Наеторнйй5 5отпиб5, Неїїсорасіег 5иці5, Іамзопіа іпігаклітиннийі5, І едіопеїа рпешторпйа, Могахеїза 5р., Мусобрасіййт бБомі5, Мусоріаєта Нуорпештопіає, Мусоріазта тусоіїдез зибБ5р. тусоїде5 ІС, Сіовтіаішт репгіпдеп5, Оадогірасієї аепіїсапі5, РавзіешгеїЇа (Маппіиєїтіа) паєтоїуїїса, РазівштеНа тиПосіда, Рпоютабваиз Ітіпезсепо, Ротрпуготопаз ашаєвє,

Рогрпуготопав діпдімаїї5, Рогрпуготопах5 бзаїїмоза, Ргоріопірасієгцт аспев5, Ргоїєи5 миїдагїів,

Реємдотопавз мізсопвзіпепвзіз, Реецдотопаб5 аєгидіпоза, Рвбецпдотопаз Пиогезсепбе С9,

Реєндотопаз Пиогезсеп5 5ІКМУ1, Реєпдотопавз аді, Рзепдотопаб5 Ішеоїа, Рзейдотопав5 оІеомогап5, Рзепдотопа5 5р В11-1, АЇІсаїїде5 ешпторпив5, Рбуспгобрасієг ітторбіїв, ВісКенвіа ргоуга7екКії, КісКейвіа гіскенвіа, ЗаІтопеїйа епіегіса всі серовари, включаючи наприклад:

БО ЗаіІтопеЇйа епієгіса Турпітигішт, ЗаІтопеЇа епіегса Вопдогі, ЗаІтопейа епієгіса Оибійп, , заІтопеїйа епіегіса СпоЇІегазеці5, та ЗаІтопейПа епіегіса Меугрогі, Зеггаца тагсезсеп5, Зрігіпа ріаїепвіх, еїтарпіуоссоси5 ацгеиб5, еїарнуоссоссив ерідептідії, еарнуіососсив / Нуїсив, зігеріотусев абриб5, бігеріотусе5 сіппатопеив, бйгМеріососсиб5 Шбрегіх, Зпмнеріососсив 5ців, зігеріотусе5 ехіоїйасцев5, Зігеріотусе5 5сабріе5, З!ИиМоЇоБри5 кислотаосаїдагіи5, Зуеспосубіїв 5р.,

Мібпо сПоїіегає, Воітеїйа Бигддопепй, Тгтеропета аепіїсоїа, Ттеропета тіпшшит, Теропета рпадедепіх, Тгтеропета гепіпдеп5, Тгтеропета міпсепії, Тгтеропета раїЇадіит, ТииерегеїЇа руодепе5 та Іеріозріга з5ресіех5, такі як відомі збудники Іеріовріга сапісоїа, Іеріозріга агірроїуроза, І еріозріга Нагдіо, І еріозріга рогореїегзепії пага|о-ромів5, І еріозріга рогареїегзепії

Нагад|о-рга)ййно, Іеріозріга іпівтодап5, Геріозріга ісіегопаеєетоггпадіає, Геріозріга ротопа та бо І еріозріга ЬгаїізіІама, та їх комбінації.

00159) Як інактивовані віруси, так і ослаблені живі віруси можуть використовуватись в ад'ювантних композиціях. Деякі приклади вірусів, які можуть бути використані як антигени включають, але не обмежуються цим, пташині герпесвіруси, бичачі герпесвіруси, собачі герпесвіруси, кінські герпесвіруси, вірус котячого вірусного ринотрахеїту, вірус хвороби Марека, овечі герпесвіруси, свинячі герпесвіруси, свинячий вірус епідемічної діареї (РЕОм), вірус псевдосказу, пташині параміксовіруси, бичачий респіраторно-синцитіальний вірус, собачий вірус чумки, собачий парагриповірус, собачий аденовірус, собачий парвовірус, бичачий парагриповірус 3, овечий парагриповірус З, вірус чуми великої рогатої худоби, вірус пограничного захворювання овець, вірус бичачої вірусної діареї (ВМОМ), ВМОМ типу І, ВМОМ типу ІЇ, вірус класичної чуми свиней, пташиний лейкозний вірус, вірус імунодефіциту великої рогатої, вірус лейкемії великої рогатої, туберкульоз великої рогатої худоби, вірус інфекційної анемії коней, вірус імунодефіциту котячих, котячий вірус лейкемії (Бе!М), вірус хвороби

Ньюкасла, овечий вірус прогресивної пневмонії, овечий вірус легеневої аденокарциноми, собачий коронавірус (ССМ), пантропний ССУМУ, собачий респіраторний коронавірус, бичачий коронавірус, котячий каліцивірус, котячий кишковий коронавірус, котячий вірус інфекційного перитоніту, свинячий вірус епідемічної діареї, свинячий гемагглютинуючий енцефаломієліто- вірус, свинячий парвовірус, свинячий цирковірус (РСМ) типу І, РСМ типу ІІ, свинячий вірус репродуктивного та респіраторного синдрому (РКК5), Вірус трансмісивного гастроентериту, індюшачий коронавірус, бичачий вірус ефемерної лихоманки, сказ, ротовірус, вірус везикулярного стоматиту, лентивірус, пташиний грип, риновіруси, вірус грипу коней, вірус грипу свиней, собачий вірус грипу, котячий вірус грипу, вірус грипу людини, вірус східного кінського енцефаліту (ЕЕЕ), вірус венесуельського кінського енцефаліту, вірус Західного Нілу, Західний вірус кінського енцефаліту, вірус імунодефіциту людини, вірус папіломи людини, вірус вітряної віспи, вірус гепатиту В, риновірус та вірус кору, а також їх комбінації.

І00160| Приклади пептидних антигенів включають ВогаеїейПа Бргопспізеріїса рб8, СспАН, ЧЕ пептиди, Бе! й1, та антигени раку, та їх комбінації. Приклади інших антигенів включають нуклеотиди, вуглеводи, ліпіди, гліколіпіди, пептиди, жирні кислоти, ліпотейхоєву та тейхоєву кислоту, та пептидоглікани, та їх комбінації. 00161) Деякі приклади паразитів, які можуть бути використані як антигени з ад'ювантними

Зо композиціями включають, але не обмежуються цим, Апаріазта, Разсіоїа Пераїйса (печінкова двоустка), Соссідіа, Еітегіа 5рр., Меозрога сапіпит, Тохоріазта допаїї, Сіагаїа, Оігойагіа (серцевий гельмінт), Апсуїоіота (анкилостоматиди), Соорегіа, Наетопспи5 сопіопи5 (Вагрег роїе гельмінт) О5іепадіа о5іенаді (шлунковий гельмінт), Оісіуосаціи5 мімірагои5 (легеневі гельмінти), Тгтурапозота зрр., Геізптапіа 5рр., Тгіспотопаз зрр., Стуріозрогідінт рагмит,

Вабебхіа, Зспібіозота, Таєпіа, Зігопдуоіде5, Азсагіб5, ТгіспіпеМПа, Загсосувзіїх, Наттопаїйа, та

Іворзога, та їх комбінації. Крім того, розглядаються зовнішні паразити включаючи, але не обмежуючись цим, кліщі, включаючи Іходев5, КПірісерпа!ю5, Оегтасепіог, Атріуотта, Воорнпішв,

НуаІтіиіта, та Наетарпузаїї» 5ресієв, та їх комбінації. 00162) Кількість антигену, який використовують для індукування імунної відповіді, буде варіювати в значній мірі в залежності від антигену, який використовують, суб'єкта, та рівня бажаної відповіді, та може бути визначена кваліфікованим фахівцем в даній галузі. Для вакцин, які містять модифіковані живі віруси або ослаблені віруси, терапевтично ефективна кількість антигену, в цілому, знаходиться в діапазоні від приблизно 102 інфекційної дози для тканинної культури (ТСІЮБ)»о до приблизно 10719 ТСІО5о, включно. Для багатьох таких вірусів, терапевтично ефективна доза, в цілому, знаходиться в діапазоні від приблизно 102 ТСІЮОзо до приблизно 108

ТСІЮО5о, включно. В деяких варіантах здійснення, діапазони терапевтично ефективних доз становлять від приблизно 103 ТСІЮво до приблизно 105 ТСІЮ5о, включно. В деяких інших варіантах здійснення, діапазони терапевтично ефективних доз становлять від приблизно 107

ТОСІЮ»о до приблизно 109 ТСІЮОзо, включно.

ІЇ00163| Для вакцин, які містять інактивований віруси, терапевтично ефективна кількість антигену, в цілому, становить, щонайменше, приблизно 100 відносних одиниць на дозу, та часто знаходиться в діапазоні від приблизно 1,000 до приблизно 4,500 відносних одиниць на дозу, включно. В інших варіантах здійснення, терапевтично ефективна кількість антигену знаходиться в діапазоні від приблизно 250 до приблизно 4 000 відносних одиниць на дозу, включно, від приблизно 500 до приблизно З 000 відносних одиниць на дозу, включно, від приблизно 750 до приблизно 2 000 відносних одиниць на дозу, включно, або від приблизно 1 000 до приблизно 1 500 відносних одиниць на дозу, включно.

І00164| Терапевтично ефективна кількість антигену в вакцинах, які містять інактивовані віруси, також можуть вимірювати з точки зору відносної активності (КР) на мл. Терапевтично 60 ефективна кількість часто знаходиться в діапазоні від приблизно 0,1 до приблизно 50 КР на мл,

включно. В інших варіантах здійснення, терапевтично ефективна кількість антигену знаходиться в діапазоні від приблизно 0,5 до приблизно 30 КР на мл, включно, від приблизно 1 до приблизно 25 КР на мл, включно, від приблизно 2 до приблизно 20 КР на мл, включно, від приблизно З до приблизно 15 КР на мл, включно, або від приблизно 5 до приблизно 10 КР на мл, включно. 00165) Кількість клітин для бактеріального антигену, яку вводять в вакцину, знаходиться в діапазоні від приблизно 1 х 109 до приблизно 5 х 109 колонієутворюючих одиниць (КУО) на дозу, включно. В інших варіантах здійснення, кількість клітини знаходиться в діапазоні від приблизно 1 х 107 до 5 х 10190 КУбО/доза, включно, або від приблизно 1 х 108 до 5 х 1019

КУО/доза, включно. В ще інших варіантах здійснення, кількість клітини знаходиться в діапазоні від приблизно 1 х 102 до 5 х 1019 КУО/доза, включно, або від приблизно 1 х 107 до 5 х 109

КУО/доза, включно, або від приблизно 1 х 105 до 5 х 109 КУО/доза, включно, або від приблизно 1 х 105 до 5 х 109 КУО/доза, включно, або від приблизно 1 х 105 до 5 х 108 КУО/доза, включно, або від приблизно 1 х 107 до 5 х 109 КУО/доза, включно. 00166) Кількість клітини для паразитарного антигена, яку вводять в вакцину, знаходиться в діапазоні від приблизно 1 х 102 до приблизно 1 х 1092 на дозу, включно. В інших варіантах здійснення, кількість клітини знаходиться в діапазоні від приблизно 1 х 103 до приблизно 1 х 109 на дозу, включно, або від приблизно 1 х 107 до приблизно 1 х 108 на дозу, включно, або від приблизно 1 х 105 до приблизно 1 х 107 на дозу, включно, або від приблизно 1 х 106 до приблизно 1 х 109 на дозу, включно.

І00167| Добре відомим в даній галузі з рівня техніки є те, що з загальноприйнятими ад'ювантами, фактично більша кількість інактивованих вірусів, ніж модифікованих живих або ослаблених вірусів є потрібною для стимулювання співставимого рівня серологічної відповіді.

Однак, несподівано виявлено, що з ад'ювантними композиціями, описаними в даному документі, приблизно однакові кількості інактивованого вірусу та модифікованого живого вірусу стимулюють аналогічні рівні серологічної відповіді. Крім того, менші кількості модифікованого живого, ослабленого та інактивованого вірусу є потрібними з ад'ювантами, описаними в даному документі, в порівнянні з загальноприйнятими ад'ювантами, щоб досягти однакового рівня серологічної відповіді. Дані несподівані результати демонструють збереження ресурсів та

Зо зниження витрат під час приготування імуногенних та вакцинних композицій. Для вакцин з широким застосуванням, необхідним є виробництво мільйонів доз на рік, тому дана економія може бути суттєвою.

Введення композицій 00168) Розміри дози композицій, як правило, знаходяться в діапазоні від приблизно 1 мл до приблизно 5 мл, включно, в залежності від суб'єкта та антигену. Наприклад, для собачих або котячих, як правило, використовують дозу приблизно 1 мл, тоді як для великої рогатої худоби, як правило, використовують дозу приблизно 2-5 мл. Однак, дані ад'юванти також можуть бути сформульовані як мікродози, де можуть використовувати дози приблизно 100 мкл.

Ї00169| Шляхи введення для ад'ювантних композицій включають парентеральне, пероральне, ороназальне, інтраназальне, інтратрахеальне, місцеве, підшкірне, внутрішньом'язове, транскутанне, інтрадермальне, внутрішньочеревне, внутріочне, внутрішньовенне введення та в яйця. Будь-який прийнятний пристрій можуть використовувати для введення композиції, включаючи шприци, крапельниці, безголкові ін'єкційні пристрої, пластирі, тощо. Шлях та пристрій, використаний для застосування, буде залежати від складу ад'юванта, антигену та суб'єкта, та вони є добре відомими кваліфікованому фахівцю в даній галузі.

Застосування композицій 001701) Однією з вимог для будь-якого препарату вакцинного ад'юванта для комерційного застосування є встановлення стабільності розчину ад'юванта протягом тривалого періоду зберігання. Передбаченими в даному документі є композиції ад'ювантів, які є простими у виробництві та стабільні протягом, щонайменше, 18 місяців. В одному варіанті здійснення, препарати є стабільними протягом приблизно 18 місяців. В іншому варіанті здійснення, препарати є стабільними протягом від приблизно 18 до приблизно 24 місяців. В іншому варіанті здійснення препарати є стабільними протягом приблизно 24 місяців. Прискорені процедури тестування також показують, що препарати, описані в даному документі, є стабільними.

Ї00171| Переважною відмітною ознакою представлених ад'ювантних композицій є те, що вони можуть бути безпечно та ефективно введеними в широкому діапазоні суб'єктів. З рівня техніки, слід очікувати, що комбінації ад'ювантів будуть демонструвати більшу реактогенність, ніж окремі компоненти. Однак, композиції, описані в даному документі, показують знижену бо реактогенність в порівнянні з композиціями, в яких використовують будь-який один або два з компонентів, тоді як ефект ад'юванта зберігається. Крім того, було несподівано виявлено, що ад'ювантні композиції, описані в даному документі, демонструють підвищення безпеки в порівнянні з іншими ад'ювантними композиціями. 00172) Ад'ювантні композиції, описані в даному документі, є корисними для індукування потрібної імунної відповіді у суб'єкта. Вони є ефективними для декількох видів. Прийнятним суб'єктом є будь-яка тварина, для якої є необхідним введення ад'ювантної композиції. Це включає ссавців та нессавців, включаючи приматів, свійську худобу, домашніх тварин, лабораторних піддослідних тварин, диких тварин, які утримуються в неволі, пернатих (включаючи в яйцях), рептилій та риб. Таким чином, даний термін включає, але не обмежується цим мавп, людей, свиней; велику рогату худобу, овець, кіз, коней, мишей, щурів, морських свинок, хом'яків, кроликів, кішок, собак, курей, індичок, качок, інші птахів, жаб та ящірок. 00173) Ад'юванти, описані в даному документі, можуть використовувати, щоб показати серологічну диференціацію між інфікованими та вакцинованими тваринами. Таким чином, вони можуть бути використані в маркерній вакцині, в якій антиген в вакцині викликає у вакцинованих тварин різні конфігурації антитіла від вірусу немутантного типу. Маркерні вакцини, в цілому, використовують в поєднанні з додатковим діагностичним тестом, який вимірює різницю в конфігураціях антитіл та демонструє, які тварини були вакцинованими, та які тварини є інфікованими вірусом немутантного типу. Така технологія є корисною в контролі та ліквідації вірусів в популяції суб'єктів.

І00174| Представлений винаходом також передбачає нові вакцинні композиції корисні для захисту проти інфекції та захворювання, викликаного вірусом Ніпах та/або вірусом Хендра, застосовуючи антиген, який забезпечується протеїном С віруса Хендра (та фрагментами, димерами, мультимерами та їх модифікованими формами), всі з яких є добавленими як ад'ювантами, як описано в даному документі. В деяких варіантах здійснення, ад'ювант вибирають з групи, що складається з ТХО, ТАО та ТХО-А. Такі вакцини можуть використовуватись в попередженні інфекції та захворювання у, наприклад, коней, собак, свиней та людей. В найбільш переважному варіанті здійснення, як свиней, так і собак захищають від вірусу Хендра та Ніпах. 00175) Періодичні спалахи МіМ, які в результаті призводять до значного числа смертельних випадків людей, останнім часом були проблематичними, дивись, наприклад, ВшйШег, Маїиге, мої. 429, ах раде 7 (2000); та Сипеу єї аІ., ЄЕтегдіпуд Іп'есбіои5 Оізеазев, мої. 13(7), рр. 1031-1037 (2007). Тематичні дослідження пов'язують захворювання у людей до зоонотичної передачі від свиней, дивись Рагазпйаг еї аї., У). Іптесії. бів. мої 181, рр. 1755-1759 (2000). Вірус Хендра, крім того, явно був пов'язаний з смертями у людей, через передачу від коней. На даний момент існує одна ліцензована вакцина для профілактики інфекції або захворювання, викликаного вірусом

Хендра (Едиїмасю Нем; 2оеїїзх) затверджена для використання у коней, хоча ліцензованої вакцини вакцини для профілактики вірусної інфекції Ніпах не існує. Тому, залишається потреба у вакцинах вірусу Ніпах або вірусу Хендра, які можуть бути клінічно ефективними.

І00176| Параміксовіруси, такі як вірус Хендра та вірус Ніпах мають два основних зафіксованих на мембрані глікопротеїни в оболонці вірусної частинки. Один глікопротеїн є необхідним для приєднання віріона до рецепторів на клітинах-господарях та позначається як або гемагглютинін-нейрамінідазний протеїн (НМ) або гемагглютиніновий протеїн (Н), та інший є глікопротеїном (0), який не має ні гемагглютинаційної, ні нейрамінідазної активностей.

Глікопротеїни приєднання представляють собою мембранні протеїни типу ІЇ, де аміно (М) кінець молекули є орієнтованим в напрямку цитоплазми, та карбокси (С) кінець протеїну є позаклітинним. Інший основний глікопротеїн є злитим (РЕ) глікопротеїном, який представляє собою тримерний клас | фузогенний оболонковий глікопротеїн, який містить дві гептадних повторюваних (НЕ) ділянки та гідрофобний злитий пептид. Вірус Хендра та вірус Ніпах інфікує клітини через рН-незалежний процес мембранного злиття в сприйнятливих клітинах- господарях, за рахунок узгоджених дій їх приєднання С глікопротеїну та Е глікопротеїну після зв'язування з рецептором.

І00177| Такий С глікопротеїн вірусу Хендра може потенційно проходити через захист проти інфекції та захворювання, викликаного вірусом Ніпах припускається К. Воззагї еї аІ..Уоигпаї ої

Мігоіоду, мої. 79, рр. 6690-6702 (2005), та В. Мипааї! єї аї., доигпаї ої Мігоіоду, мої. 80, рр. 12293- 12302 (2006). Однак, попередня робота не забезпечує вакцинні композиції, які є насправді клінічно ефективними в цьому відношенні, для будь-яких видів ссавців. Відповідно, представлений винахід охоплює імуногенну композицію, яка містить С протеїн вірусу Хендра, ад'ювант, як описано відповідно до практики за представленим винаходом, та один або більше ексципієнтів, в кількостях ефективних, щоб викликати клінічно ефективний захист проти вірусу 60 Хендра та/або Ніпах.

00178) Стосовно СО глікопротеїнових поліпептидів вірусу Хендра, які використовуються на практиці за представленим винаходом, та їх рекомбінантна експресія, робиться посилання на повне розкриття опублікованих міжнародних заявок на патент УМО 2012/158643 та УМО 2006/085979, де така інформація є чітко представленою. Переважні приклади конкретних о протеїнових поліпептидів вірусу Хендра, які використовуються в даному документі, є розкритими в УМО 2012/158643, та включають, наприклад: повнодовжинний С протеїн (його хЕО

ІЮ МО:2); його розчинний фрагмент (який кодує амінокислоти 73-604 з 5ЕБЕО ІЮ МО:2 УМО 2012/158643); та додатковий фрагмент, розкритий в даному документі, який має Ідфкапа) лідерну послідовність (ЗЕО І МО 16 з УМО 2012/158643). В цілому, розчинні форми о глікопротеїну вірусу Хендра містять всі або частину ектодомена, та виробляються шляхом видалення всього або частини трансмембранного домену глікопротеїну б, та всього або частини цитоплазматичного хвоста. Переважно, послідовність, яка кодує ген, представляє собою кодон, оптимізований для експресії. 00179) В деяких варіантах здійснення, с глікопротеїн Хендра може бути в димерній та/або тетрамерній формі. Такі димери залежать від утворення дисульфідних зв'язків, які уу'ворюються між залишками цистеїну в о глікопротеїну. Такі дисульфідні зв'язки можуть відповідати тим, які утворюються в нативному С глікопротеїні, або дисульфідні зв'язки можуть утворюватися в результаті отримуючи різні димерні та/або тетрамерні форми С глікопротеїну, які підвищують антигенність. Крім того, недимеризовані та тетрамеризовані форми також можуть бути використані відповідно до практики за представленим винаходом, знову беручи до уваги те, що

С глікопротеїн забезпечує численні конформаційно залежні епітопи (тобто, які виникають з третинної тривимірної структури), та що збереження численних таких природних епітопів є відповідно дуже переважним для того, щоб надати нейтралізуючи антитільну відповідь. 00180) Взагалі кажучи, конструювання векторів експресії для С протеїнів Хендра може бути таким, як описано в прикладі 1 з МО 2012/158643, з отриманою в результаті експресією протеїну з СНО клітин, які є такими, як описано в їх прикладі 2, або альтернативно, застосовуючи вакцинну систему (дивись їх приклад 3) або 293 клітини (дивись їх приклад 4). В конкретному переважному прикладі, передбаченим є розчинний С протеїн, як амінокислоти 73- 604 нативного С глікопротеїн вірусу Хендра (дивись ЗХЕО ІЮ МО: 2 в УМО 2012/158643). Їх димеризація відбувається спонтанно, одночасно з експресією з СНО клітин, та отриманий в результаті с протеїн містить приблизно 50 95 димеру та 50 95 тетрамер, з невеликою кількістю мономера, що залишається. Експресія в 293Е клітинах призводить до приблизно 70 95 димеру.

Отримані в результаті протеїнові фракції змішують 3 ад'ювантами, як описано в представленому описі. Як описано в УМО 2012/158643, переважні дози антигену для великих тварин знаходяться в діапазоні 50-200 мікроорганізмів на дозу, з 100 мікрограмами, яка є найбільш переважною дозою. Для невеликих тварин, таких як собаки, менші кількості є необхідними, такі як 25-50 мікрограмам, як буде зрозуміло кваліфікованим фахівцям в даній галузі. 001811) Крім того, ад'юванти відповідно до будь-якого з варіантів здійснення, описаних вище можуть бути використані для створення діагностичних або терапевтичних антитіл. В даному аспекті винаходу, тваринне джерело імунізують препаратом, який містить ад'ювантні композиції за представленим винаходом та антиген. Вибір антигену визначається особою, яка потребує отримання зазначеного терапевтичного або діагностичного антитіл та включає, без обмеження, віруси, бактерії, вірусні частинки, екстракти, рекомбінантні антигени, структури клітинних стінок, тощо. Антигени можуть також включати отрути для приготування лікарських засобів проти зміїних укусів. (00182) Антигени, прийнятні для даного аспекту винаходу, можуть бути котячого, собачого, кінського, свинячого, бичачого, овечого або пташиного походження. В деяких варіантах здійснення, антиген може бути вибраним з ЕРеіІ Мор70, бичачого парагриповірусу-3 ВРІ-З (НМ протеїну), Нізіорпйи5 зотпі р31, ВогаеїеПйа ЕНА, Рагарох, ВМОМІ др53, ВМОМ2 аорз53, токсинів клостридії, собачого цирковірусу, Вгаспузріга Ппуодузепіегіає (види свиней) антигенів; інактивованих цільних клітин та інактивованого пепсинового гідролізату.

ІО0183| Деякий час після імунізації, джерело антитіл екстрагують з тварини-джерела (наприклад, мишей, щурів, хом'яків, свиней, морських свинок, кроликів, кіз, овець, домашньої птиці, великої рогатої худоби, коней). В деяких інших варіантах здійснення, тварина-джерело є котом або собакою. Джерело антитіл в кінцевому рахунку залежить від того, чи є потрібними моноклональні, або поліклональні антитіла. Для поліклональних антитіл, антитіло може розглядатися з використанням сироватки або молока. Для моноклональних антитіл, клітини селезінки є прийнятним джерелом. Такі антитіла можуть використовувати для діагностики, 60 наукових досліджень або терапевтичних цілей, включаючи, без обмеження, протиотрути,

лікарські засоби від відторгнення трансплантата, аналізи сироваткової нейтралізації, ІФА,

ЕГІ5РОТ, Вестерн-блот, аналізи на основі клітин, аналізи ефективності, та імуногістохімію.

Винахід передбачає моноклональні та поліклональні антитіла, екстраговані з тварини-джерела для використання в діагностичних та терапевтичних застосуваннях, включаючи без обмеження, протиотрути, лікарські засоби від відторгнення трансплантата, аналізи сироваткової нейтралізації, ІФА, ЕГІБРОТ, Вестерн-блот, аналізи на основі клітин, аналізи ефективності, та імуногістохімію. (00184) В деяких варіантах здійснення, імунізації композиціями за представленим винаходом будуть викликати досить високі серологічні титри бажаного антигену (більше 1000, або більш переважно, більше 5000, або більш переважно, більше 10000, або більш переважно, більше 50000, або більш переважно, більше 100000, або більш переважно, більше 250000, або більш переважно, більше 500000, або більш переважно, більше 1000000) у, щонайменше, однієї тварини (переважно, щонайменше, 2 тварин, або, щонайменше, у трьох тварин, або у 50 95 оброблених тварин, або у, щонайменше, 75 95 оброблених тварин, або, найбільш переважно, у кожної обробленої тварини), таким чином, отримуючи в результаті достатню кількість антитіла для діагностичних або дослідницьких застосувань.

І00185| Як правило, антитіла ізотипу імуноглобуліну с (40) використовують в даних застосуваннях, хоча антитіла інших ізотипів, наприклад, імуноглобулін М (І9М), також використовують. Джерело антитіл, в кінцевому рахунку, залежить від того, чи є бажаним поліклональне, або моноклональне антитіло. Для поліклональні антитіл, як джерело антитіл можуть використовувати сироватку або молоко. Для моноклональних антитіл, селезінкові макрофаги є властивим джерелом антитіла. Додаткова очистка антитіл, якщо необхідно, або отримання моноклональних антитіл є широко описаними в літературі, та кваліфікований фахівець в даній галузі не буде мати ніяких надмірних труднощів в здійсненні даних процедур.

Крім того, антитіла можуть бути адаптовані до цільових видів, якщо необхідно (наприклад, канонізованими або фелінізованими). Більш того, способи для такої практики є добре відомими в даній галузі з рівня техніки та не існує необхідності їх описувати в даній заявці.

Застосування антитіл (00186) Антитіла були б прийнятними як реагенти для аналізів сироваткової нейтралізації,

ІФА, ЕГІБРОТ, Вестерн-блот, аналізів на основі клітин, аналізів ефективності, та імуногістохімії.

Дані методи є добре відомими в галузі.

Ї00187| Антитіла за представленим винаходом також можуть бути використані як терапевтичні агенти, наприклад, у відторгненні трансплантата, наприклад, для генерації антитимоцітарних глобулінових (АТО) агентів. На даний час, два таких агенти присутні на ринку: АЩатФют та ТпутодіобиійпФ. Способи отримання антитимоцітарних глобулінів в цілому були описані в О520040023340. 00188) Крім того, їх можуть використовувати для отримання протиотрутних лікарських засобів. В даних варіантах здійснення, компоненти отрути змії будуть використовуватися як антигени. Отрути та їх компоненти також є добре відомими в даній галузі з рівня техніки.

І00189| Тварини багатьох видів можуть бути використані як тваринні джерела, включаючи, без обмеження, види птиці, мишей, щурів, хом'яків, морських свинок, кроликів, собак, кішок, овець, кіз, свиней, велику рогату худобу та коней. Вибір тваринного джерела залежить від поставленого завдання та судження особи, з кваліфікованих фахівців в даній галузі. 00190) Конкретні необмежуючі варіанти здійснення є наступними:

ІЇ00191| В першому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта, яка містить олійну фазу та водну фазу, де олійна фаза складає, щонайменше, 50 95 препарата об./об6., де зазначений препарат містить, щонайменше, один монофосфорильний ліпід А (МРІ -

А) або його аналог та імуностимулюючий олігонуклеотид, за умови, що: а) якщо зазначений імуностимулюючий олігонуклеотид відсутній, то препарат містить: і. полі І:С, гліколіпід, та, необов'язково, четвертинний амін; або і. полікатіонний носій; р) якщо зазначений монофосфорильний ліпід А (МРІ-А) або його аналог відсутній, то препарат містить джерело алюмінію. 00192) В другому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за першим варіантом здійснення, де імуностимулюючий олігонуклеотид, якщо присутній, представляє собою Сро або олігорибонуклеотид; полікатіонний носій, якщо присутній, вибирають з групи, що складається з декстрану, декстрану ОЕАЕ (та їх похідних), ПЕГ, гуарових смол, хітозанових похідних, поліцелюлозних похідних, таких як гідроксіетилцелюлоза (НЕС), полієтиленімін, поліаміни; та четвертинний амін, якщо присутній, вибирають з групи, що складається з ОБА та (516) авридину.

ІЇ00193| В третьому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта відповідно до першого або другого варіанта здійснення, де імуностимулюючий олігонуклеотид, якщо присутній, представляє собою Сро, полікатіонний носій, якщо присутній, представляє собою декстран ОЕАЕ, та четвертинний амін, якщо присутній, представляє собою ЮА.

Ї00194| В четвертому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта відповідно до будь-яка одного з першого по третій варіанти здійснення, де гліколіпід, якщо присутній, містить сполуку формули І

В- 0--СН, о; ух - о М

Ми

Е- о Мн- 625

Формула де, В" та В? незалежно є воднем, або насиченим алкільним радикалом, який має аж до 20 атомів вуглецю; Х є -СНе-, -0- або -МН-; В? є воднем, або насиченим або ненасиченим алкільним радикалом, який має аж до 20 атомів вуглецю; КЗ, В" та ЕЕ? незалежно є воднем, - 5042, -РОг2, -СОбСіло алкілом; БУ є І-аланіном, І-альфа-амінобутилом, І -аргінілом, І1- аспаргінілом, І -аспартилом, І-цистеїнілом, І-глутамілом, І-гліцилом, І-гістиділом, 1- гідроксипропілом, І -ізолейцилом, Іі-лейцилом, І1-лізилом, І1-метіонілом, І-орнітилом, І- фенілаланілом, І-пролілом, І-серилом, І-треонілом, І-тирозилом, І-триптофанілом, та І1- валілом або їх О-ізомерами.

ІЇ00195| В п'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за четвертим варіантом здійснення, в якій гліколіпід представляє собою М-(2-дезокси-2-1 - лейциламіно-б-ЮО-глюкопіранозил)-М-октадецилдодеканоїламід або його сіль. 00196) В шостому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за п'ятим варіантом здійснення, де сіль є ацетатом.

І00197| В сьомому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за будь- яким одним з першого по четвертий варіанти здійснення, яка містить як зазначений монофосфорильний ліпід А (МРІ-А) або його аналог, так і додатковий, який містить, щонайменше, один з стерину та полі І:С.

І00198| В восьмому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта відповідно до сьомого варіанта здійснення, яка містить стерин, та яка додатково містить сапонін. 00199) В дев'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за будь- яким одним з сьомого та восьмого варіантів здійснення, в якій сапонін, якщо присутній, представляє собою тритерпеноїдний сапонін, та стерин, якщо присутній, вибирають з групи, що складається з ергостерину, ланостерину та холестерину.

І00200| В десятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта відповідно до дев'ятого варіанта здійснення, в якій сапонін, якщо присутній, представляє собою

Опції А, та стерин, якщо присутній, представляє собою холестерин.

І00201| В одинадцятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта відповідно до сьомого варіанта здійснення, яка містить полі ІС, та додатково яка містить, щонайменше, один з четвертинного аміну та гліколіпіду. (00202) В дванадцятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за будь-яким одним з першого-одинадцятого варіантів здійснення, яка містить МРІ-А або його аналог в кількості 0,5 - 100 мкг на дозу.

І00203| В тринадцятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта відповідно до дванадцятого варіанта здійснення, в якій МРІ --А або його аналог є присутнім в кількості 5-50 мкг на дозу, або 5-20 мкг на дозу, або 1-5 мкг на дозу. (00204) В чотирнадцятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за будь-яким одним з першого-тринадцятого варіантів здійснення, яка містить імуностимулюючий олігонуклеотид в кількості від 0,5 до 400 мкг на дозу. 00205) В п'ятнадцятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за чотирнадцятим варіантом здійснення, в якій імуностимулюючий олігонуклеотид є присутнім в кількості від приблизно 100 до приблизно 250 мкг на дозу або від приблизно 20 до приблизно 50 мкг на дозу, або приблизно 1 мкг на дозу.

(00206) В шістнадцятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за будь-яким одним з першого по п'ятнадцятий варіанти здійснення, яка містить полікатіонний носій в кількості від приблизно 0,5 до приблизно 400 мг на дозу. (00207) В сімнадцятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за шістнадцятим варіантом здійснення, в якій зазначений полікатіонний носій є присутнім в кількості 50-300 мг на дозу або 1-25 мг на дозу, або 1-10 мг на дозу. (00208) У вісімнадцятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за будь-яким одним з першого-сімнадцятого варіанта здійснення, яка містить гліколіпід в кількості від приблизно 0,5 до приблизно 2000 мкг на дозу. (00209) В дев'ятнадцятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за вісімнадцятим варіантом здійснення, в якій гліколіпід є присутнім в кількості приблизно 1000 мкг на дозу, або 25-50 мкг на дозу, або 1-10 мкг на дозу.

І00210)| В двадцятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за будь-яким одним з першого-дев'ятнадцятого варіантів здійснення, яка містить стерин в кількості від приблизно 0,1 до приблизно 1000 мкг на дозу. (00211) В двадцять першому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта відповідно до двадцятого варіанта здійснення, в якій стерин є присутнім в кількості 250-500 мкг на дозу, або 20-50 мкг на дозу, або 1-10 мкг на дозу. (00212) В двадцять другому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за будь-яким одним з першого по двадцять перший варіант здійснення, яка містить сапонін в кількості від 0,1 до 1000 мкг на дозу. (00213) В двадцять третьому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за двадцять другим варіантом здійснення, в якій сапонін є присутнім в кількості 250-500 мкг на дозу, або 20-50 мкг на дозу, або 1-10 мкг на дозу.

І00214| В двадцять четвертому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за будь-яким одним з першого по двадцять третій варіант здійснення, яка містить полі І:С в кількості від приблизно 0,5 до приблизно 100 мкг на дозу. 00215) В двадцять п'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за двадцять четвертим варіантом здійснення, в якій полі ІС є присутнім в кількості 5-50 мкг на

Ко) дозу, або 5-20 мкг на дозу, або 1-5 мкг на дозу. (00216) В двадцять шостому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за будь-яким одним з першого по двадцять п'ятий варіант здійснення, яка містить джерело алюмінію, яке представляє собою гель гідроксиду алюмінію.

І00217| В двадцять сьомому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за двадцять шостим варіантом здійснення, в якій зазначене джерело алюмінію є присутнім в кількості 5 95-20 95 об./06. препарата. (00218) В двадцять восьмому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за двадцять сьомим варіантом здійснення, в якій зазначене джерело алюмінію є присутнім в кількості 10 95 об./06. препарата.

І00219| В двадцять дев'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за будь-яким одним з першого по двадцять-восьмий варіант здійснення, в якій олійна фаза містить олію та розчинний в олії емульгатор. (00220) В тридцятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за будь-яким одним з першого по двадцять дев'ятий варіант здійснення, в якій зазначена олійна фаза є присутньою в кількості аж до 85 95 об./об. (002211) В тридцять першому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта відповідно до тридцятого варіанта здійснення, в якій зазначена олійна фаза є присутньою в кількості 51 95. (00222) В тридцять другому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за будь-яким одним з двадцять дев'ятого по тридцять перший варіанти здійснення, в якій олія складає 40-84 95 об./06б. препарата, та розчинний в олії емульгатор складає 1-11 95 об./об. препарата. (00223) В тридцять третьому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта за тридцять-другим варіантом здійснення, в якій олія складає 4595 об./06б. препарата, та розчинний в олії емульгатор складає 6 95 об./06. препарата.

І00224| В тридцять четвертому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта відповідно до будь-якого одного з першого по тридцять-третій варіант здійснення, в якій зазначену олію вибирають з групи, що складається з сквалану, рослинних олій, тригліцеридів, неметаболізуючих олій з алканом з лінійним ланцюгом, та будь-якої їх комбінації.

(00225) В тридцять п'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає композицію ад'юванта відповідно до тридцять четвертого варіанта здійснення, в якій зазначена олія є легкою мінеральною олією. (00226) В тридцять шостому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить ефективну кількість антигену та композицію ад'юванта відповідно до будь-якого одного з першого по тридцять п'ятий варіант здійснення, в якій олійна фаза композиції становить, щонайменше, 50 95 об./об. (00227) В тридцять сьомому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить ефективну кількість антигену та композицію ад'юванта, яка містить олійну фазу та водну фазу, в якій олійна фаза складає, щонайменше, 50 95 препарата об./06., полікатіонний носій, та а. комбінацію сапоніну та стерину, та необов'язково, четвертинний амін; за умови, що, якщо зазначена композиція ад'юванта фактично складається з ОЕАЕ декстрану, Опції А, холестерину та ОСОБА, антигеном не є бактерин Е сої 9-5; або р. імуностимулюючий олігонуклеотид, за умови, що, якщо зазначена композиція ад'юванта фактично складається з ЮОЕАЕ декстрану та імуностимулюючого олігонуклеотиду, антиген містить збудник негативно діє на велику рогату худобу, овець, коней або свиней, або є похідною зазначеного збудника, та не є бактерином Е соїї 9-5. (00228) В тридцять восьмому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію відповідно до тридцять сьомого варіанта здійснення, в якій сапонін, якщо присутній, представляє собою тритерпеноїдний сапонін, стерин, якщо присутній, вибирають з групи, яка складається з ергостерину, ланостерину та холестерину, полікатіонний носій, якщо присутній, вибирають з групи, яка складається з декстрану, декстрану ОЕАЕ (або його похідних), ПЕГ, гуарових смол, хітозанових похідних, поліцелюлозних похідних, таких як гідроксіетилцелюлоза (НЕС), полієтиленімін, поліаміни, та четвертинний амін, якщо присутній, вибирають з групи, яка складається з ОБА та авридицину. (00229) В тридцять дев'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію відповідно до тридцять восьмого варіанта здійснення, в якій сапонін представляє собою Опії А, стерин представляє собою холестерин, полікатіонний носій представляє собою декстран ОЕАЕ,

Зо та четвертинний амін представляє собою ЮБА. (00230) В сороковому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за будь- яким одним 3 тридцять сьомого по тридцять дев'ятий варіанти здійснення, в якій імуностимулюючий олігонуклеотид представляє собою Сро. 00231) В сорок першому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за будь-яким одним з тридцять сьомого по сороковий варіант здійснення, в якій зазначений полікатіонний носій є присутнім в кількості від приблизно 0,5 до приблизно 400 мг на дозу. (00232) В сорок другому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за сорок першим варіантом здійснення, в якій зазначений полікатіонний носій є присутнім в кількості 50-300 мг на дозу або 1-25 мг на дозу, або 1-10 мг на дозу. 00233) В сорок третьому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за будь-яким одним з тридцять сьомого по сорок другого варіантів здійснення, яка містить сапонін в кількості від приблизно 0,1 до приблизно 1000 мкг на дозу. (00234) В сорок четвертому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за сорок третім варіантом здійснення, в якій сапонін є присутнім в кількості 250-500 мкг на дозу, або 20-50 мкг на дозу, або 1-10 мкг на дозу. 00235) В сорок п'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за будь-яким одним з тридцять сьомого по сорок четвертий варіанти здійснення, яка містить стерин в кількості від приблизно 0,1 до приблизно 1000 мкг на дозу. (00236) В сорок шостому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за сорок п'ятим варіантом здійснення, в якій стерин є присутнім в кількості 250-500 мкг на дозу, або 20-50 мкг на дозу, або 1-10 мкг на дозу. (00237) В сорок сьомому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за будь-яким одним з тридцять сьомого по сорок шостий варіанти здійснення, яка містить четвертинний амін в кількості від приблизно 1 до приблизно 200 мкг на дозу. (00238) В сорок восьмому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за сорок сьомим варіантом здійснення, в якій четвертинний амін є присутнім в кількості приблизно 100 мкг на дозу або від приблизно 10 до приблизно 100 мкг на дозу або приблизно 5 мкг на дозу. (00239) В сорок дев'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за 60 будь-яким одним з тридцять сьомого по сорок восьмий варіанти здійснення, яка містить імуностимулюючий олігонуклеотид в кількості від приблизно 0,5 мкг до приблизно 400 мкг на дозу. (00240) В п'ятидесятому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за сорок дев'ятим варіантом здійснення, в якій імуностимулюючий олігонуклеотид є присутнім в кількості 100-250 мкг на дозу, або 20-50 мкг на дозу або приблизно 1 мкг на дозу. (00241) В п'ятдесят першому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за будь-яким одним з тридцять сьомого по п'ятидесятий варіанти здійснення, в якій олійна фаза містить олію та розчинний в олії емульгатор. (00242) В п'ятдесят другому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за будь-яким одним з тридцять сьомого по п'ятдесят перший варіанти здійснення, в якій зазначена олійна фаза є присутньою в кількості аж до 85 95 об./06б. (00243) В п'ятдесят третьому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за п'ятдесят другим варіантом здійснення, в якій зазначена олійна фаза є присутньою в кількості 51 95 об./об.

І(00244| В п'ятдесят четвертому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за будь-яким одним з п'ятдесят першого по п'ятдесят третій варіанти здійснення, в якій олія складає 40-84 95 об./06. вакцинної композиції, та розчинний в олії емульгатор містить 1-11 95 об./об. вакцинної композиції. (00245) В п'ятдесят п'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за п'ятдесят третім варіантом здійснення, в якій олія складає 45 95 об./об. препарата, та розчинний в олії емульгатор складає 6 95 об./об. препарата. (00246) В п'ятдесят шостому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить Еїтегіа тахіта або Сіозігідішт регігіпдеп5 антиген та композицію ад'юванта, яка містить: а) олійну фазу, де зазначена олійна фаза присутня в кількості, щонайменше, 50 95 об./о6. композиції; полікатіонний носій, та необов'язково, імуностимулюючий олігонуклеотид; або р) олійну фазу, де зазначена олійна фаза присутня в кількості, щонайменше, 50 95 об./об. композиції; імуностимулюючий олігонуклеотид, стерин та монофосфорильний ліпід А (МРІ--А) або його аналог.

Зо І00247| В п'ятдесят сьомому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за п'ятдесят шостим варіантом здійснення, яка містить антигени проти Еітегіа тахіта та

Сіозіайт рептгіпдепв. (00248) В п'ятдесят восьмому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за п'ятдесят шостим варіантом здійснення або п'ятдесят сьомим варіантом здійснення, в якій зазначений полікатіонний носій представляє собою ОЕАЕ-Декстран.

І00249| В п'ятдесят дев'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає застосування вакцинної композиції відповідно до пунктів з п'ятдесят шостого по п'ятдесят восьмий варіант здійснення для лікування або попередження інфекцій, викликаних Ейітегіа тахіта або

Сіозігідіит регігіпдеп5 у домашньої птиці. 00250) В шістдесятому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить Меозрога антиген та композицію ад'юванта, яка містить олійну фазу, де зазначена олійна фаза присутня в кількості, щонайменше, 50 95 об./об. композиції; та а) монофосфорильний ліпід А (МРІ-А) або його аналог; або р) комбінацію з імуностимулюючого олігонуклеотида та полікатіонного носія. 00251) В шістдесят першому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за шістдесятим варіантом здійснення, яка містить комбінацію з імуностимулюючого олігонуклеотиду та декстрану ОЕАЕ. (00252) В шістдесят другому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за шістдесятим варіанта здійснення, яка містить монофосфорильний ліпід А (МРІ -А) або його аналог, та додатково яка містить імуностимулюючий олігонуклеотид. (00253) В шістдесят третьому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцину за шістдесят другим варіантом здійснення, яка додатково містить стерин.

І(00254| В шістдесят четвертому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцину за шістдесят третім варіантом здійснення, в якій стерин є холестерином. (00255) В шістдесят п'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцину відповідно до будь-якого одного з шістдесятого по шістдесят четвертий варіант здійснення, в якій Меозрога антиген представляє собою Меозрога сапіпит антиген. (00256) В шістдесят шостому варіанті здійснення, винахід передбачає застосування вакцини відповідно до будь-якого одного з шістдесятого по шістдесят п'ятий варіант здійснення для бо лікування або попередження інфекції, викликаної Меозрога.

І00257| В шістдесят сьомому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить Спіатуаорнпіїа аброгііз антиген та композицію ад'юванта, яка містить олійну фазу, де зазначена олійна фаза є присутньою в кількості, щонайменше, 50 95 об./06. композиції; стерин; імуностимулюючий олігонуклеотид; монофосфорильний ліпід А (МРІ--А) або його аналог; та полі

ГО.

І(00258| В шістдесят восьмому варіанті здійснення, винахід передбачає застосування вакцини відповідно до шістдесят сьомого варіанта здійснення для лікування або попередження викидня, викликаного С. абогії5 в вівцематок.

І00259| В шістдесят дев'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить міостатин та композицію ад'юванта, де зазначена композиція ад'юванта містить олійну фазу, де зазначена олійна фаза присутня в кількості, щонайменше, 50 95 об./о6б. композиції, імуностимулюючий олігонуклеотид та або: а) полікатіонний носій; або

Б) МРІ--А або його аналог.

І00260| В семидесятому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за шістдесят дев'ятим варіантом здійснення, яка містить МРІ -А або його аналог, в якій зазначений препарат містить менше, ніж 0,5 мкг стерину на 50 мкл зазначеної композиції. (00261) В сімдесят першому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за семидесятим варіантом здійснення, яка не містить стерин. 00262) В сімдесят другому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за семидесятим варіантом здійснення, в якій стерин є холестерином. (00263) В сімдесят третьому варіанті здійснення, винахід передбачає застосування вакцини відповідно до будь-якого одного з варіантів здійснення від 69 по 72 для зменшення кількості міостатину у тварини.

І00264| В сімдесят четвертому варіанті здійснення, винахід передбачає застосування відповідно до сімдесят третього варіанта здійснення, в якій зазначений тварина є домашньою птицею. (00265) В сімдесят п'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить ТгоерегеЇПа руодепех антиген та композицію ад'юванта, в якій композиція ад'юванта

Зо містить олійну фазу, де зазначена олійна фаза присутня в кількості, щонайменше, 50 95 об./о6. композиції; імуностимулюючий олігонуклеотид та полікатіонний носій. (00266) В сімдесят шостому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за сімдесят п'ятим варіантом здійснення, в якій Тгиерегеїїа руодепезх антиген є піолізином.

І00267| В сімдесят сьомому варіанті здійснення, винахід передбачає застосування вакцинної композиції за сімдесят четвертим або сімдесят п'ятим варіантом здійснення для лікування або попередження інфекції, викликаної ТгиерегеПа руодепев. (00268) В сімдесят восьмому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить антиген Е соїї, антиген ВКМ або антиген ВСУ, та композицію ад'юванта, в якій зазначена композиція ад'юванта містить олійну фазу, присутню в кількості, щонайменше, 50 95 об./о0б. зазначеної вакцинної композиції, імуностимулюючий олігонуклеотид та, щонайменше, один з полікатіонного носія та джерела алюмінію. (00269) В сімдесят дев'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за сімдесят восьмим варіантом здійснення, яка містить антиген Е соїї, антиген ВКМ та антиген

ВСУ. (00270) В вісімдесятому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за сімдесят восьмим або сімдесят дев'ятим варіантом здійснення в якій: а. антиген Е соїї, якщо присутній, вибирають з групи, що складається з Е соїї К9О9, Е соїї 41 та їх комбінації; р. антиген ВКМ, якщо присутній, вибирають з групи, що складається з ВКМ 6, ВЕМ С10 та їх комбінації. 002711 У вісімдесят першому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію відповідно до будь-якого одного з сімдесят восьмого по вісімдесятий варіант здійснення, в якій полікатіонний носій, якщо присутній, представляє собою декстран ОЕАЕ, та імуностимулюючий олігонуклеотид представляє собою Сро. (00272) У вісімдесят другому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію відповідно до будь-якого одного з сімдесят восьмого по вісімдесят перший варіант здійснення, яка містить джерело алюмінію, який представляє собою гель гідроксиду алюмінію. 00273) У вісімдесят третьому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за вісімдесят другим варіантом здійснення, в якій зазначене джерело алюмінію є присутнім в 60 кількості 5 95-20 95 об./о6.

І00274| У вісімдесят четвертому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за вісімдесят третім варіантом здійснення, в якій зазначений джерело алюмінію є присутнім в кількості 10 95-17 95 об./о6.

І00275| У вісімдесят п'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає застосування вакцинної композиції відповідно до будь-якого одного з сімдесят восьмого по вісімдесят четвертий варіант здійснення для лікування або попередження ентериту, викликаного Е соїї,

ВСМ або ВЕМ в бичачій тварині.

І00276| У вісімдесят шостому варіанті здійснення, винахід передбачає застосування відповідно до дев'яносто першого варіанта здійснення, де зазначена вакцина викликає, щонайменше, тривалістю в шість місяців імунітет до зазначеного(их) антигена(ів).

І00277| У вісімдесят сьомому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить антиген КПірісерпай|и5 тісгоріи5 та ад'ювант, де зазначений ад'ювант вибирають з групи, що складається з: а) водного ад'юванта, який містить імуностимулюючий олігонуклеотид, сапонін, стерин, четвертинний амін, поліакриловий полімер, та гліколіпід; та

Ю) на олійній основі ад'ювант, який містить олійну фазу, присутню в кількості, щонайменше, 5095 об./06б. вакцинної композиції, та яка містить імуностимулюючий олігонуклеотид та полікатіонний носій. (00278) У вісімдесят восьмому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за вісімдесят сьомим варіантом здійснення, в якій сапонін представляє собою ОціїЇ А, стерин представляє собою холестерин, четвертинний амін представляє собою ОБА, гліколіпід представляє собою М-(2-дезокси-2-І -лейциламіно-6-ЮО-глюкопіранозил)-М- октадецилдодеканоїламід або його сіль, та імуностимулюючий олігонуклеотид представляє собою Сро. 00279) У вісімдесят дев'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за вісімдесят сьомим варіантом здійснення, в якій полікатіонний носій представляє собою декстран ОЕАЕ, та імуностимулюючий олігонуклеотид представляє собою Сро. (00280) В дев'яностому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за будь-яким одним з вісімдесят сьомого по вісімдесят дев'ятий варіант здійснення, в якій

Зо КПірісерпа|ц5 тісгоріи5 антиген представляє собою Віт86 протеїн.

І00281| В дев'яносто першому варіанті здійснення, винахід передбачає застосування вакцинної композиції відповідно до будь-якого одного з вісімдесят сьомого по дев'яностий варіант здійснення для лікування або попередження інфекції, викликаної КПірісерпаЇй5 тісторіив5. 00282) В дев'яносто другому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить антиген захворювання ящуру (ЕМО) та композицію ад'юванта, де зазначена композиція ад'юванта містить олійну фазу, присутню в кількості, щонайменше, 36 95 об./об. зазначеної вакцинної композиції, імуностимулюючий олігонуклеотид та полікатіонний носій, де зазначена вакцинна композиція представляє собою емульсію вода-в-олії. В різних варіантах здійснення, зазначений антиген вірусу ящура може бути або немутантним типом ЕМОМ, генетично модифікованим та/лабо ослабленими ЕМОМ штамами, або рекомбінантно експресованими ЕМОМ структурними протеїнами, такими як вірусоподібні частинки (МІР) серотипів А, С, О, Авіа!, БАТ1, ЗБАТ2 або ЗАТЗ. (00283) В дев'яносто третьому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за дев'яносто другим варіантом здійснення, в якій імуностимулюючий олігонуклеотид представляє собою Сро, та полікатіонний носій представляє собою ОЕАЕ декстран.

І(00284| В дев'яносто четвертому варіанта здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за дев'яносто другим або дев'яносто третім варіантом здійснення, в якій антиген представляє собою винахід, що передбачає вакцинну композицію за пунктом дев'яносто восьмого або дев'яносто дев'ятого варіанта здійснення, в якій антиген отримують з генетично модифікованого віруса на платформі ЕМО-ІГ 3830, який є ослабленим у великої рогатої худоби та свиней, особливо, ЕМО-І І З3ЗВ830-А24 Стиг2віго.

І00285| В дев'яносто п'ятому варіанті здійснення, винахід передбачає застосування вакцинної композиції за будь-яким одним з дев'яносто другого або дев'яносто четвертого варіанта здійснення для лікування або попередження ЕМО у великої рогатої худоби. (00286) В дев'яносто шостому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію, яка містить антиген 5ігеріососси5 ибегі5 (5. ирегіз5) та композицію ад'юванта, яка містить олійну фазу, де зазначена олійна фаза присутня в кількості, щонайменше, 50 95 об./0б. композиції; полікатіонний носій; та бо а) імуностимулюючий олігонуклеотид;

р) комбінацію, яка містить сапонін, стерин та четвертинний амін; або с) їх комбінацію.

І00287| В дев'яносто сьомому варіанті здійснення, винахід передбачає вакцинну композицію за дев'яносто шостим варіантом здійснення, в якій антиген представляє собою адгезійну молекулу 5. ибегі5 або її імуногенний фрагмент.

І00288| В дев'яносто восьмому варіанті здійснення, винахід передбачає застосування вакцини відповідно до будь-якого одного з дев'яносто шостого або дев'яносто сьомого варіанта здійснення для лікування або попередження інфекції, викликаної 5. ибегів. (00289) Наступні приклади представлені як ілюстративні варіанти здійснення, їх не слід розглядати як обмежуючі об'єм винаходу. Багато змін, варіацій, модифікацій та інших використань та застосувань даного винаходу будуть очевидні кваліфікованим фахівцям в даній галузі.

ПРИКЛАДИ.

Приклад 1. Розробка рекомбінантної стратегії вакцинації для підвищення імунітету проти некротичного ентериту свиней.

ІЇ00290| Мета дослідження полягала в тому, щоб оцінити вплив вакцинації іп мімо ад'ювантною рекомбінантною клостридієвою вакциною проти живого контрольного зараження інфекцією Еїтегіа тахіта та Сіозігідішт регігтіпдеп5 в моделі захворювання некротичного ентериту.

Матеріали та способи

І00291| Рекомбінантні протеїни: Повнодовжинні кодуючі послідовності для генів, які кодують

С. регітіпдеп5 (АТСС 13124, Американська колекція типових культур, Мапаззаз, МА) МеїВ та ЕБ-

Ти клонували, застосовуючи ПЛР в рЕТЗга(ж) векторі з МН2-термінальним полігістидиновим епітопним тегом. Клоновані гени трансформували в компетент Е5бсПегіспіа сої, бактерії культивували протягом 16 год. при 37 "С, та індукували протягом 5 год. при 37 "С 1,0 мМ ізопропіл В-О-тіогалактопіранозидом (Атгезсо, Сіемеіапа, ОН). Бактерії збирали, застосовуючи центрифугування на 10 000 обер./хв. протягом 10 хв. при 4 "С, знову суспендували в РВ5, руйнували ультразвуком, та центрифугували на 10 000 обер./хв. протягом 15 хв. Супернатант інкубували протягом 1 год. при 22 Сб з Мі-МТА агарозою (Оіадеп, МаїЇепсіа, СА), смолу

Зо промивали РВ5, та очищені клостридієві протеїни елюювали 250 мМ імідазолу в РВ5, рН 9.2.

Чистота протеїну чистота була підтверджена на Кумассі забарвлених синім 5205-акриламідних гелях. Концентрацію протеїну визначали з використанням комерційного набору від Зідта. (00292) Тварини: Одноденного віку бройлери птиці (Ко55/Ко55), які вилупилися в інкубаторії

ГопдепескКег5 (Еїй2ареїйіомп, РА) транспортували до ВАКС-Еаві, Виїйдіпуд 1082, та пташенята були розміщені в Реїегзіте стартерні брудер-одиниці відповідно до встановлених настанов

ВАКС комітету з догляду за малими тваринами. Птахів утримували в брудерних місцях в вільних від Еїтегіа засобу та переносили в великі підвісні клітки в окремому місці, де їх інфікували та утримували до кінця експериментального періоду для дослідження живого контрольного зараження інфекцією. Всі процедури, що стосуються транспортування, вимірювання маси тіла, інфекції, та збирання крові та селезінки були схвалені ВАКС комітетом з догляду за малими тваринами (БОР додається). АКЗ ВАКС комітет з догляду за малими тваринами встановив настанови для експериментів на тваринах при ВАКС та проводить регулярні інспекції всіх засобів для тварин. (00293) Імунізація: Первинну імунізацію проводили шляхом підшкірної ін'єкції одноденного віку курчат-бройлерів 100 мкл вакцини (Ад 10Омкг/доза). Вторинну імунізацію проводили шляхом підшкірної ін'єкції семиденного віку курчат-бройлерів, яким підшкірно ін'єкційно вводили 100 мкл вакцини (Ад 100 мкг/доза).

І00294| Контрольне зараження Еїтегпа: ВАКС штами Еїтегіа 5рр., які зберігались в паразитарній лабораторії захворювань тварин та поширювали відповідно до встановленої процедури. Е. тахіта (41А) чистили за рахунок флотації з 5 9о розчином гіпохлориту натрію, промивали тричі РВ5, та життєздатність підраховували за допомогою три"панового блакитного, застосовуючи гемоцитометр. Кількість ооцисту грунтується на тільки спорулірованних ооцистах.

Через шість днів після бустер-імунізації, кури були щеплені стравохідно 10 000 Е. Махіта застосовуючи інокуляційну голку.

І00295| Контрольне зараження С. регітіпдепе: Через чотирі дні після інфекціонування

Еїітегіа, птахів з МЕ групи щеплювали стравоходно 1х109 КУО Сіовігідіит регітіпдеп5 кожному, застосовуючи інокуляційну голку.

І00296| Аналізи: Птахи були зважені в день прибуття, одразу перед контрольним зараженням ЕМ, перед контрольним зараженням С. регігіпдеп5, через 2 дні після С.Р., та 10 бо днів після С.Р. контрольного зараження, щоб розрахувати збільшення ваги.

І00297| Для підрахунку кишкових уражень, птахів (5 птахів/група) умертвляли через два дні після С.Р. інфікування. Приблизно 20 см кишкові сегменти, що розтягуються на 10 см від переднього відділу та заднього до дивертикулу, отримували та розрізали в поздовжньому напрямку. Бали ураження оцінювались 2 незалежними спостерігачами від 0 до 4 в порядку зростання ступеня тяжкості ураження. 00298) Двома основними чинниками С. репгіпдеп5 вірулентності у курей є альфатоксин та

МеїВ (В-подібний некротичний ентерит) токсин, обидва з яких беруть участь в патогенезі МЕ.

Додаткові С. регітіпдеп5 протеїни, які можуть бути включеними в бактеріальний патогенез та захисний імунітет господаря, включаючи піруват: ферредоксин оксидоредуктазу (РЕО), та фактор елонгації с (ЕБ-б), як раніше повідомлялося, індукує захисний імунітет проти експериментального контрольного зараження інфекцією з С. регігіпдеп5. Відповідно, титри антитіла до даних чинників визначали, як описано нижче. (00299) П'ять птахів в кожній групі вибирали випадковим чином для крові, яку збирали за допомогою пункції серця відразу ж після евтаназії. Сироватку отримували центрифугуванням з низькою швидкістю та використовували в твердофазному імуноферментному аналізі (ІФА), щоб виміряти рівні а-токсин-, МеїВ-, ЕЕ, та РЕО-специфічного антитіла. Коротко кажучи, 96-лункові планшети для мікротітрованія покривали протягом ночі 1,0 мкг/лунка очищених рекомбінантних протеїнів а-токсину-, МеїВ-, ЕЕ, та РРО. Планшети промивали РВ5, який містить 0,05 95 Гуееп (РВ5О-Т) та блокували РВ5, який містить 195 ВА. Сироватку (100 мкл/лунка) інкубували протягом 2 год. при кімнатній температурі з обережним перемішуванням. Планшети промивали

РВО-Т, та зв'язане антитіло детектували з використанням кон'югованого з пероксидазою кролячого антикурячого Ідс (Зідта, 5ї. І оці5, МО) та пероксидаза-специфічний субстрат.

Оптичну густину (00)) на 450 нм вимірювали застосовуючи автоматизований мікропланшетний рідер (Віо-Рай, Вісптопа, СА).

І00300| Статистичні аналізи: Всі значення виражені у вигляді середнього значення ж ЗЕМ.

Середні значення для збільшення ваги тіла та бали ураження порівнюються між групами за допомогою тесту Туреччини після АМОМА з використанням 5РБ5 15.0 для УМіпдому5 (З5РЗЗ5 Іпс.,

Спісадо, І). Відмінності між середніми значеннями будуть вважатися значимими при р « 0,05. 00301) Експериментальний дизайн ілюструються в таблиці 1.

Коо)

Таблиця 1

Група Птахи Протеїн Ад'ювант Інфекція для МЕ я (Кількість) (100 мкг/птах) (ЕМАСРУ 4 15 Й 10 мМ Буфер Й 2 15 Й 10 мМ Буфер й

МмеїВ (5Омкг) ї- ЕБ-Ти 10 мМ Буфер

З 15 ня (5Омкг)

А 15 " 1. ТХхо й 15 2. ТСМО й "' - б 15 3. ХО "' - 7 15 4. ХОМ "' й - 8 15 5. 5Р-ОЇ. " б. 5 95 щ 9 15 АМРНІСЕМФ " 7.559565 щ

АМРНІСЕМФ з полі І:С " 8. 5 95 щ 11 15 АМРНІСЕМФ з

Сра " 9. 5 95 щ 12 15 АМРНІСЕМФ з

ОЕАЕ Декстран 10.5 95 ня 13 15 АМРНІСЕМФ з

ОрА " Кури були заражені перорально 1,0 х 107 ооцист/птах Е. тахіта (ЕМ) на 14 день після штрихування та 1,0 х 109 КУО/птах С. регігіпдеп5 (СР) на 18-й день. 5 00302) Композиції ад'ювантів були наступними (на 50 мкл): 00303) ТХО: 5ЕО ІО МО: 8 була присутня в кількості 1 мкг, декстран ОЕАЕ був присутній в кількості 5 мкг, легка мінеральна олія була присутня в кількості 51 95 об./0б. композиції.

І(00304| ТСМО: 5ЕО ІО МО: 8 була присутня в кількості 1 мкг, холестерин був присутній в 10 кількості 1 мкг, МРІ--А був присутній в кількості 1 мкг/50 мкл доза, легка мінеральна олія була присутня в кількості 51 95 об./0б. композиції. (00305) ХО: Декстран ОЕАЕ був присутній в кількості 5 мкг, легка мінеральна олія була присутня в кількості 51 95 об./0б. композиції.

І00306| ХОМ: Декстран ОЕАЕ був присутній в кількості 5 мкг, легка мінеральна олія була 15 присутня в кількості 51 95 об./06. композиції, МРІ -А був присутній в кількості 1 мкг.

Ї00307| 5 96 АМРНІСЕМО « полі І:С: полі І:С був присутній в кількості 1 мкг. 00308) 5 926 АМРНІСЕМФ «Сро: 5ЕО ІО МО: 8 був присутній в кількості 1 мкг. 003091 5 926 АМРНІСЕМФО «ОЕАЕ Декстран: ОЕАЕ декстран був присутній в кількості 25 мкг. 003101 5 926 АМРНІСЕМФО я ОБА: ОСОБА був присутній в кількості 1 мкг. 00311) Збільшення маси тіла було значно знижено при ЕМ та СР інфекції в контрольній групі МЕ (Р «0,05). Однак, збільшення маси тіла, в цілому, підвищувалося в групах, імунізованих рекомбінантними СР протеїнами (Меї ВЕР) на 4 «21 95. Значна відмінність з контролем МЕ

Зо була виявлена в Ргої ТСМО групі, яка була імунізована СР протеїнами, кон'югованими з ТСМО ад'ювантом.

Таблиця 2

Збільшення маси тіла 1 Контроль 347,93 9,387 2 МЕ контроль 286,36 14,436

З Ргої 317,86 7,828 4 Ргої ТХО 316,42 8,826

Ргої ТСМО 345,73 11,745 (5) Ргої ХО 334,67 8,605 7 Ргої ХОМ 331,17 11,387 8 Ргої РО 304,09 10,330 9 Ріг АМР 310,09 9,479

Ргої АМРРІС 314,86 9,571 11 РІЇ АМР СРО 313,82 11,976 12 Ргої АМР РЕАЕ 299,20 15,000 13 Рг АМР ОБА 301,25 10,440 5

Таблиця З

Бали щодо ураження 2 МЕ контроль 3,0 0,0

З Ргої 2,7 0,2 4 РОЇ ТХО 2,5 0,2 5 Ргої ТСМО 2,6 02 (5) РОЇ ХО 1,7 02 7 Ргої ХОМ 24 02 8 Рг 5РО 24 02 9 Ргої АМР 1,7 01 10 Ргої АМРРІС 21 01 11 РІЇ АМР СРО 2,3 02 12 Ріг АМР ОЕАЕ 21 01

І00312| Через шість днів після ЕМ інфікування та через 2 дні після СР інфікування оцінювали антитільні відповіді в сироватці проти а-токсину, Меї-В, ЕЕ та РЕО. Результати представлені в таблиці 4. Коротко кажучи, СР протеїн в цілому підвищував АБ титри проти СР 10 антигенів у птахів, імунізованих СР протеїнами. АБ відповіді до Меї В, ЕЕ та РЕО антигенів були значно вищими, ніж до а-токсину.

Таблиця 4

АБ відповіді до Меї В, ЕЕ та РЕО антигенів

Групи а-токсин Меї В ЕЕ РЕО

Середнє 5ЕМ | Середнє 5ЕМ | Середнє 5ЕМ | Середнє 5ЕМ 2 МЕ контроль 36 02 З «01 21 /01 22 «01

З Ргої 40 04 44 05 40 09 36 05 4 Ргої ТХО 39 ОЗ А 04 ,56 05 40 03

Ргої ТСМО ЗА г 42 ОЗ АВ 06 40 06 6 Ргтої ХО 34 2 3 05 38 07 36 04 7 Ргої ХОМ З3 2 40 04 55 3 А 04 8 Ргої 5РО "30 01 З 02 19 02 20 02 9 Ргтої АМР 37 01 ЗЗ 00 22 оз 32 07

Ргої АМРРІС Заг г З 06 36 10 33 бе 11 Ріг АМР СРО 42 бе А бе 24 08 28 01 12 РІіоїАМР ОЕАЕ 38 бе 3 05 17 02 З оз 13 Ріо АМР ОА й 01 28 г 45 03 ,36 ОЗ

Приклад 2: Куряча антиміостатинова вакцина. 5 І00313| Міостатин є секретованим фактором диференціації росту, який є членом родини

ТОР бета-протеїну, яка інгібує м'язове диференціювання та ріст. Міостатин продукується в основному в клітинах скелетних м'язів, циркулює в крові та впливає на м'язову тканину, шляхом зв'язування клітинно-зв'язуваного рецептора, який називається рецептором активіну типу І.

Відповідно, інгібування міостатину в результаті призводить до тварин, які мають, підвищену 10 кількість м'яса/м'язів. Одним з підходів до зниження кількості міостатину у тварини є генерувати анти-міостатинову імунну відповідь, яку можуть зручно вимірювати, використовуючи титри анти- міостатиного антитіла. В даному прикладі використовували курячу модель. 00314) Кури Сорь 500 Рагепі 5іосК та Коз5 308 (віком 12-10 тижнів, відповідно) ініціювали вакциною, яка містить міостатин-кон'югований пептид та композицію ад'юванта. Композиції ад'юванта, які використовували в дослідженні, є показаними в таблиці 5.

Таблиця 5

Групи лікування

СЕАЛЕА

ІЕА/СЕА

СЕАЛЕА кІін/сВМ тоМо кін/свМ тсМо 200 мкг/50 мкг 200 мкг/50 мкг тсМо

Позначення "200 мкг/50 мкг" стосується кількості антигену в "прайм-буст" дозі, об'єм 0,2 мл. 00315) Компоненти в ад'ювантах є такими, як описано в таблиці 6.

ІЇ0О0316|Ї Кури Сорр 500 Рагепі 5іосК та Ко55 308 ініціювали на тижнях 12 або 10 та збільшували на тиждень 18. Титри сироватки антиміостатинового антитіла вимірювали, застосовуючи ІФА перед вакцинуванням та кожні два тижні після первинної обробки до 22 та 20 тижневого віку, відповідно.

І00317| Групи ТО06, Т07, Т09 та 110 продукували найвищі відповіді (середньо геометричне титрів антитіла становить від 50000 до 15000 на 22 тижні). Серед цих чотирьох груп, птахи Сорр 500 в групах Т06 та Т07 продемонстрували середньо геометричні титри вище 100 000.

Таблиця 6 тоМо ЗЕО ІЮО МО: 8 /Холестерин/ | 10 мкг/10 мкг/5 мкг / ЮОгакКеої 5

МРГ А/олія олія (45 90), РАМ 80(6,3 Ув) б

ТУМУЕЕМФ 80 (1,45 Фо

МО (20:80 М/:О) МРІА (20:80 МО) емульсія | МРІА-5 мкг / Огакеої 6 низької в'язкості мінеральна олія, РАМ 8

ТМ/ЕЄМ 80

ТМО (20:80 М/:О) ЗЕО ІО МО: 8 /МРІ А (20:80 | 10 мкг /5 мкг / ОгаКеоЇї 6

Застосування МО емульсії | МО) емульсія низької | мінеральна олія, РАМ «8 та змішування Сро та | в'язкості ТМ/ЕЕМ 80 кон'югованих пептидів тхо ЗЕБЕО 10 МО: 8 /ОБАБ-| 10 мкг /20 мкг / Огакео!ї 5

Декстран мінеральна олія, (45 95), ЗРАМО 89(6,3 90) 5 ТУМЕЕМО 80 (1,45 Фо

Приклад 3. Вакцини проти Т. руодепе5

І00318| ТгиеригеПа руодепе5 (раніше Агсапобасіегішт руодепе5, та раніше Асііпотусе5 руодепезх та також Согуперасіегішт руодепевз) часто призводять до важкого клінічного метриту у великої рогатої худоби, що характеризується густою, гнійної секреції. Неприємний запах, іноді пов'язаний з даним станом, ймовірно, є викликаним анаеробними бактеріями, які також є присутніми, але не виявляються звичайними культуральними способами. Захворювання найбільш часто зустрічається в сухих корів або телиць до або під час періоду отелення, та іноді відбувається в період лактації тварин, як наслідок травми сосків або вимені. Економічно важливі захворювання, спричинені даним організмом включають метрит, та викидня у молочних корів та абсцесів печінки у великої рогатої худоби, що утримується на пасовиськах ділянках. Піолізин (РГО), холестерин-залежний цитолізин, експресований Тгиеригейа руодепе5, є важливим господар-захисним антигеном. 00319) Ангус кросбред великої рогатої худоби приблизно віком 14 місяців використовували в даному дослідженні. Тварини були в цілому з гарним здоров'ям та не мали будь-яких захворювань, які б ускладнювали включення в дослідження. Тварини мали досхочу доступу до корму та води. (003201 Препарати: Всі бактерії (Е. соїї та Т. руодепев) з 1Х107 на дозу. Піолізин вводили 150 мікроорганізмів на дозу тваринам в групах Т02 - Т07. Група Т01 використовували як контроль. 00321) Композиції ад'ювантів, які досліджували в даному досліджені, були наступними:

ІЗС/Полі ІС-ІБС 1000 мкг/ Полі І:С 50 мкг в 2 мл дози

ІБС/Сра-І5С 100Омкг/ 100 мкг Сро (ЗЕО ІЮ МО: 8) в 2 мл дози тТХО-Сро 100 мкг (ЗЕО ІЮ МО: 8)У/0ЕАЕ Декстран/Мінеральну олія 5І.Т МЕ в 2 мл дози

ОСОСВТ-Оцй А 150 мкг /холестерин 150 мкг/ООБА 100 мкг/САКВОРОЇ Ф (поліакриловий полімер) 0,0375 уо/К1005 1000 мкг/Сро (З5ЕО ІЮО МО: 8) 100 мкг в 2 мл дози

ОСАС-ОЦіЇ А 500 мкг/холестерин 500 мкг/АМРНІСЕМОФ (емульсія лецитинової олії) 2,5 96 в 2 мл дози (00322) Піолізинове антитіло вимірювали застосовуючи опосередкований ІФА, антиген на планшеті з наступним зразком сироватки (первинне антитіло), з наступним антибичачим Ідс кон'югатом вимірювали в дні 0, 28 та 56.

І00323| Всі зразки та контролі розбавляли 1:2000, та відповідь визначали шляхом розрахунку співвідношення ОО зразка до ОО позитивного контролю (Поз. контр. був пул сироватки від видужуючих тварин). Антитіло детектували НКР-кон'югованими 3 овечим антибичачим до.

Таблиця 7

Дизайн дослідження

Маточне

Контроль-

Е. соїї-1 (А). ЕН День 56 то2 руодепез РІ О в 0, 28 2 мл п Ш 5 х 108

ІЗС/РОЇУ:ІС Шо

Е. соїї-1 (А). ЕН День 56 то руодепез РІ О в 0, 28 2 мл п Ш 5 х 108

ІЗС/Сра шо

Е. соїї-1 (А). п.ш., День 56

Е. соїї-1 (А). ЕН День 56 то5 руодепе5?РІ О в 0,28 2 мл п ці 5 х 108 (ее,в/оікй Шо

Е. соїї-1 (А). п.ш День 56 тоб руодепез РІ О в 0, 28 2 мл п ш. 5 х 108 (веде; Шо й і.н., День 56 х Е. соїї вігаіп 5132351 (А). руодепе5 штам 51496, РІ О-піолізин

Її п.ш. - підшкірно, і.н. - інтраназально. (00324) Результати наведені в таблиці 8

Таблиця 8

ШИ ЇМ Ідс до РІО (Точка часу є днем в дослідженні) 0,274 0,245 0,444 0,252 0,229 0,451 0,205 0,506" 0,590" 0,291 0,246 0,373 0,243 0,512" 0,687" 0,315 0,280 0,624 00325) Групи 704 та Т06 (ад'юванти ТХО та ОАС) здійснювали значно краще, ніж контроль (Р«0,05). Крім того, виявленими були численні тенденції серед різних груп лікування (вибрані як різниці, де Р«О,1). Дані тенденції представлені в таблиці 9.

Таблиця 9

Відмінності між групами на день 0 (перший параметр), 28 (другий параметр), 56 (третій параметр). "У" означає, що Р «0,1 7. тої | то2 | тоз3 | то4 | то5 | тоб | то7

Приклад 4. Оцінка піолізинового вакцинного препарата в дійних корів проти метриту, контрольне зараження. 00326) Мета даного дослідження полягала в тому, щоб оцінити ефективність нативних та рекомбінантних піолізинових вакцинних препаратів, з ад'ювантом ТХО, у невагітних лактуючих гольштинських або гольштинських перехресних молочних корів, застосовуючи модель штучного контрольного зараження метритом.

ІЇ00327| Тварини мали в цілому гарне здоров'я, не мали будь-яких ускладнюючих захворювань, та не отримували ніякої хіміотерапії, системний антибіотик або інші протизапальні лікарські засоби протягом семи (7) днів, що передували та після вакцинації та контрольне зараження. Вони були в своїй їй - Зій парності, раніше в історії не мали метриту, та не давали позитивний результат на культуру Т. руодепе5 до контрольного зараження (день -1 або 0).

Тварини, у яких розвивалися клінічно значущі паралельні захворювання під час дослідження, були видалені. (00328) Тварини мали досхочу доступ до корму протягом, щонайменше, 20 годин на кожен 24-годинний період, за єдиним винятком, коли їх доїли. Використовували базальний, виготовлений на замовлення змішаний раціон харчування, представник промисловості для лактації. Тварини акліматизувалися протягом щонайменше 7 днів до початку дослідження.

Сформульовані вакцини, які вводили коровам (п-20 на групу), містили наступні компоненти:

Т01- Сольовий розчин; Т02-ТХО «з нативний піолізин (пРІ 0); ТО3-ТХО «ж рекомбінантний піолізин (ГРІ 0). Рекомбінантний піолізин отримували клонуванням, експресією, та очисткою антигену з

Согуперасіегіцшт дішатісцт. Очищений протеїн потім інактивували шляхом обробки формаліном. Нативний піолізин, експресований та очищений з Тгиерегейа руодепе5, також інактивували шляхом обробки формаліном. ТХО ад'ювант містив Сро олігонуклеотиди, ОЕАЕ-

Декстран, мінеральну олію, та поверхнево-активні речовини 2рап 80 та Ту"ееп 80. 00329) В день вакцинації, відповідний ІМР (Таблиця 10) вводили підшкірним способом.

Вакцини вводили в шию в день 0, та на протилежному боці шиї в день 28. Місце введення вакцини оцінювали в дні дослідження 0, 1, 2, 3, 7, 28, 29, 30, 31, 35, 49 та 77 реакції в місцях

Зо ін'єкції. В день вакцинації, місце введення оцінювали, щоб підтвердити, що ніяких набряків не було присутніх до введення вакцини. В день дослідження 28, 49 та 77 оглядали з обох боків шиї. Оцінки місця ін'єкції реєстрували. Крім того, вимірювали ректальні температури та реєстрували в дні дослідження 0 (до 10ї вакцинація), 1, 2, 3, 7, 28 (до 20ї вакцинації), 29, 30, 31 та 35 під час фази вакцинації. Крім того, вимірювали ректальну температуру та реєстрували в контрольному зараженні з дня 0 до 28.

І003301| Клінічні спостереження після вакцинації реєстрували в дні дослідження 0, 1, 2, 3, 7, 28, 29, 30, 31 та 35 (під час фази вакцинування). Крім того, клінічні спостереження спостерігали та реєстрували під час фази контрольного зараження починаючи з дня 49 до 77. (00331) Антитільні відповіді на піолізин визначали, застосовуючи ІФА в дні дослідження 0, 28, 49, та останній день дослідження (а77). Гемолітичний аналіз інгібування також проводили на кожному зразку сироватки. Даний аналіз вимірює анти-піолізинову антитільну відповідь, яка корелює з біологічною активністю (захистом).

Таблиця 10 по ДАО І ДА

І00332| До контрольного зараження, оваріальний цикл всіх корів був синхронізований.

Прогестерон вводили перед контрольним зараженням, та щодня протягом всієї фази 28 денного контрольного зараження. Застосовуючи стерильну канюлю подібну до селекційної канюлі, 10 мл ЕзсПегіспіа соїї штаму контрольного зараження та 10 мл ТгиерегеМПа руодепе5 штаму контрольного зараження (попередньо визначені дози контрольного зараження), кожен поміщали в окремий шприц, інфузійно вводили в матку всім коровам при контрольному зараженні в день 0. Для забезпечення повної доставки матеріалу контрольного зараження, канюлю промивали 10 мл стерильного культурального середовища. 00333) Контрольне зараження було визнане успішним, якщо, щонайменше, у 60 95 тварин в групі лікування Т01 (контрольна група) розвивався метрит. Присутність метриту буде визначатися присутністю слизово-гнійних маточних/вагінальних виділень з оцінкою 2 2. (Дана система підрахунку балів була прийнята зі способу, описаного ЗпеїЇдоп еї аї., Тпегіодепоіоду, 65:1516-1530, 2006; в якому оцінки 0 та 1 вважалися нормальними). (00334) Первинна змінна була присутністю слизово-гнійних маточних/вагінальних виділень з оцінкою 2 2, яка показує наявність метриту. Маточне/вагінальне виділення збирали, застосовуючи асептичний бітсго МеїйгіСнпеск"М пристрій з асепгичною чашкою, та оцінений початок контрольного зараження в день 0 до 28 (день дослідження 49 до 77).

ІЇ00335| Лікування вважалося ефективним, якщо тільки у ТО1 корів розвивався клінічний метрит, або якщо тривалість та/або частина днів з слизово-гнійними вагінальними виділеннями (оцінка 2 2) була значно коротшою (р - «0,1) в порівнянні з контрольною групою. Якби не було ніяких істотних відмінностей між групами за тривалістю та частиною днів з метритом, то частота

Т. руодепе5 виділення за допомогою маткового бактеріальної тампону використовували як допоміжні дані для ефективності вакцини. Безпеку відповідних вакцин оцінювали на основі оцінки місця ін'єкції, ректальних температур та будь-яких несприятливих наслідків для лактації.

І00336| Зібрані дані щодо метриту (присутність вагінальних/маточних виділень, Так/ні; оцінка вагінальних/маточних виділень) підсумовували для кожної тварини в кожній часовій точці, та використовували для визначення розподілу частоти кожної категорії для кожної

Зо обробки в кожен момент часу точкове. Розподіл частот для будь-якої тварина було

Нормальне/анормальне (Нормальне є рахунком - 0 або 1; Анормальне є рахунком 2 2) для кожної ознаки метриту (наприклад, оцінка вагінальних/маточних виділень) були узагальнені за обробкою та точкою часу. Коли тварина мала анормальну (оцінка 2 2) оцінку маточних виділення підсумовували за обробкою, застосовуючи узагальнену лінійну змішану модель (Ргос

Сійттіх), з біноміальним розподілом помилок та функцією логіт-зв'язок. Статистична модель включала фіксований ефект лікування, та рандомізований ефект партії. Контрасти були зроблені між групами лікування. Це повторювалось для кожного варіабельного метриту, описаного в даному параграфі. Якщо Ргос Сіїттіх не сходилися для варіабельного метриту, потім використовували точний критерій Фішера замість того, щоб порівняти групи лікування.

І00337| Тривалість анормальної оцінки (для кожного варіабельного метриту) визначали для кожної тварини, та розраховували як "(остання анормальна точка часу мінус перша анормальна точка часу) 1". Тривалість анормальної оцінки була встановлена на ноль для тварин, що не мали ніяких точок часу з анормальною оцінкою для такого варіабельного метриту. Тривалість анормальної оцінки розраховували як "(остання запланована точка часу колекції даних мінус перша анормальне точка часу) ж 1" для тварин, що були видалені з дослідження до останньої запланованої точка часу колекції даних для такого варіабельного метриту. Тривалість анормальної оцінки (для кожного варіабельного метриту) перетворювали в од, та потім аналізували за допомогою узагальненої лінійної змішаної моделі з фіксованим ефект: лікування, та випадковим ефект: залишок. Лінійні комбінації оцінок параметрів були використані в а ргіогі контрастах після дослідження для значного ефекту лікування (Р«х0,10). Порівняння були зроблені між лікуваннями. Зворотньо перетворювали середні значення, отримані методом найменших квадратів, їх стандартні похибки та їх 90 95 довірчі інтервали розраховували для кожної групи лікування, оцінки параметрів за методом найменших квадратів отримували з аналізу. (00338) Частина днів з анормальної оцінки (для кожного варіабельного метриту), а також частина днів з нормальною відсутністю Е. соїї та Т. руодепе5 в виділеннях (відсутність вважається значенням «-1-), визначали для кожної тварини. Кожен потім трансформували, застосовуючи агс 5зіп перетворення квадратного кореня до аналізів. Дану трансформовану варіабельну частину днів потім кожну аналізували за узагальненою лінійною змішаною моделлю з фіксованим ефект: лікування, та випадковим ефект: залишок. Лінійні комбінації оцінок параметрів використовували в а ргіогі контрастах після дослідження для значного ефекту лікування (Рх0,10). Порівняння були зроблені між лікуваннями. Зворотньо перетворювали середні значення, отримані методом найменших квадратів, їх стандартні похибки, та їх 90 95 довірчі інтервали розраховували для кожної групи лікування, оцінки параметрів за методом найменших квадратів отримували з аналізу. Частотні розподілу будь-якої тварини мали Е. соїї присутні (присутні вважається значенням 215), Т. руодепе5 присутні (присутні вважається значенням » 1), та обидва Е. сої та Т. руодепе5 присутні (присутні вважається значенням 21), підсумовувалися за обробкою в кожній часовій точці.

І00339| Результати. Антитільну відповідь до піолізину оцінювали, застосовуючи ІФА, вимірювання рівнім сироватки до. Результати (Таблиця 11), представлені як середні титри за методом найменших квадратів (І ЗМ), показують, що титри були значно вищими у корів в Т02 та

ТО3, в порівнянні з ТО1, в дні дослідження 28, 49 та 77. Вони також припускають, що не було статистично істотної відмінності між титрами груп 702 та ТО03. По відношенню до титрів антитіла в матці також оцінювали, застосовуючи ІФА, результати (Таблиця 12) продемонстрували, що були значно вищі титри в дні 49 та 77 у корів в межах 102 та ТО3, в порівнянні з тими, які в ТО1, в ті самі дні. Стосовно гемолітичного інгібування антитіл, результати в таблиці 13 показують, що тварини в 102 мали значно більш високі титри в дні дослідження 49 та 77, ніж ті, які в групах ТО1 та ТО03.

Таблиця 11

ІЇ 5М' сироваткові титри дО співвідношення 5:Р. не янв | ве» | я 0,250 2 0,197 8 0,178 2 0,366 2 0,226 2 0,6455 0,782 5 0,820 5

Зо 1 Різні індекси представляють собою значні відмінності між групами.

Таблиця 12

І 5М' Іде анти-РІ О в матці нини У ИН НО 1 Різні індекси представляють собою значні відмінності між групами.

Таблиця 13

І 5М' НІ Антитіло співвідношення 5:Р в сироватці ие рр гони 1 Різні індекси представляють собою значні відмінності між групами.

І00340| Стосовно первинної змінної, оціненої за рівнем слизово-гнійних маточних/вагінальних виділень (оцінка вагінального виділення, або МО5), коли вимірювали тривалість метриту, вона була значно коротшою в групі Т02, в порівнянні з групами ТО1 та ТО3, як вимірювали в дні 7 та 10 після контрольного зараження бактеріями (Таблиці 14, 15).

Таблиця 14

Тривалість метриту (МОЗ » 2); І 5М'

Тиждень 1 (дні з 50 до 56) Контрольне зараження дні з 0 до 10 1 Різні індекси представляють собою значні відмінності між групами.

Таблиця 15

Р значення; їй - | Р значення; ий - Відмінності лікування 7 дні 10 дні 00341) Стосовно 95 днів, за які метрит був очевидним (тобто МО5 » 2) протягом 10 днів після контрольного зараження (Таблиці 16 та 17), є очевидним, що група Т02 мала менше анормальних днів, в порівнянні з групами ТО1 та ТО3. Крім того, було продемонстровано, що Т. руодепе5 найбільш часто виділявся у корів в групі ТОЗ (дані не показані). Таким чином, ефект вакцини був найбільш помітним в групі Т02 (нативний піолізин ї- ТХО).

Таблиця 16

ШИ

706,7 95 756,1 95 (25 95) 44,3210,4 95 53,149,7 95 (46,9 925) 67,246,4 95 73,57 95 (26,6 95)

Таблиця 17

ШИ ШИ ШИ

ТО1 м Т02 0,0472 0,0594

ТО1 м ТОоЗ 0,7712 0,8204

Т02 м ТОЗ 0,0699 0,0790

І00342| Додаткове дослідження було проведено з метою оцінки ефективності експериментальних метритових вакцин, в нових композиціях ад'ювантів, у вагітних молочних корів. В даному дослідженні вагітних корів вакцинували під час сухого періоду. Ефективність вимірювали протягом перших 10 днів після отелення (пологів). 00343) Вагітність гольштинських або гольштинських перехресних корів, в їх з 10ї по Зю лактацію, були відібрані для дослідження. Всі відібрані корови мали в цілому гарне здоров'я, не було в історії ніякого метриту, та мали відому передбачувану дату отелення. Вони також не мали ніяких ускладнюючих захворювань, та не отримували ніякої хіміотерапії, системного антибіотика, або інших протизапальних лікарських засобів протягом семи (7) днів до і після вакцинації. Тварини, у яких розвивалися клінічно значущі паралельні захворювання в будь-який час під час дослідження були видалені. В ході дослідження, тварини мали досхочу доступ до корму, щонайменше, 20 годин на кожен 24-годинний період, за єдиним винятком під час доїння.

Тварини також мали досхочу доступ до води протягом всього дослідження.

І00344| Вакцини вводили групам (п-15/група) були як зазначено далі: тварини в ТО1 отримували 2 мл вакцини, яка містить сольовий розчин; ті, які в Т02 отримували 2 мл вакцини, яка містить ІЗЄСОМ5/Полі І:СяпРІ О; ті, які в ТОЗ3 отримували 2 мл вакцини, яка містить

ТХоПРІ о; ті, які в Т04 отримували 2 мл вакцини, яка містить ТХОЖЕзспегіспіа соїї-ТгиерегеПа руодепе5пРІ 0. (Всі вакцинні антигени були формалін - інактивованими.) (00345) Після їх прибуття, тварин давали акліматизуватися протягом 7 днів. Приблизно за 2 місяці до отелення (день дослідження 0), тварини отримували першу вакцинацію, підшкірно в ліву сторону шиї, за винятком того, що тварини в групі Т02 отримували вакцину інтраназально (Таблиця 18). Через двадцять вісім днів, всі тварини отримували другу вакцинацію, підшкірно в праву сторону шиї (Таблиця 18). Починаючи з першої вакцинації, всі корови були сухими.

Таблиця 18 Пуля | жтвавнн | лювання 0 деьо/шляко-

ІЗС з Піолізин (РІ-О)

ТХО х Піолізин (РІ.О) то4 15 ТХО-Е. соїї-Т. руодепе5 т Піолізин 0, 28 п.ш., п.ш.

РІО

І00346)| Починаючи з дня отелення, та тривалістю протягом 21 днів після цього, оцінювали

Зо наявність маточних/вагінальних виділень, та якщо присутні, збирали та присвоювали оцінку, де оцінка » 2 показувала наявність метриту. Приблизно 30 мл крові збирали (Дні дослідження 0, 28, та 49), для визначення антитільних відповідей до БЕ. соїї, Т. руодепе5, та піолізин, застосовуючи ІФА. Будь-які побічні реакції, які не потрапили в межі процедурного збору даних, були задокументовані.

ІЇ00347| Первинна змінна була наявністю слизово-гнійного маточного/вагінального виділення; оцінка 2 2 буде вказувати на наявність метриту. Лікування вважалося ефективним,

якщо тільки у ТО1 корів розвивався клінічний метрит, або якщо тривалість слизово-гнійного вагінального виділення (оцінка 2 2) була значно коротшою (р- «0,1) в порівнянні з контрольними групами. Якщо присутній, слизово-гнійне виділення збирали після пологів.

І00348| Порівняння були зроблені між лікуваннями в кожну точку часу. Розраховували середні значення, отримані методом найменших квадратів (зворотньо перетворювали для серологічних даних), їх стандартні похибки, та їх 90 95 довірчі інтервали, оцінки параметрів за методом найменших квадратів отримували з аналізу. Діапазони та кількість тварин за даними розраховували для кожної групи лікування в кожну точку часу.

І00349| Зібрані метритні дані (присутнє вагінальне/маточне виділення, Так/Ні; оцінка вагінального/маточного виділення; клінічні ознаки) підсумовувалися для кожної тварини в кожну точку часу, та застосовували для визначення частотного розподілу кожної категорії для кожного лікування в кожну точку часу. Частотний розподіл будь-якої тварини було

Нормальне/анормальне (нормальне є оцінкою - 0 або 1; анормальне є оцінкою 22) для кожної метритної ознаки (наприклад, оцінка вагінального/уматочного виділення) підсумовували за лікуванням та точкою часу. Будь-яка тварина мала анормальну оцінку (оцінка 22) маточного виділення, підсумовану за лікуванням, та аналізували, застосовуючи узагальнену лінійну змішану модель (Ргос Сіїттіх), з біноміальним розподілом похибок та функцією логит-зв'язок.

Статистична модель включала фіксований ефект лікування та випадкові ефекти партії, та блок всередині партії. Контрасти були зроблені між групами лікування (це повторювали для кожного варіабельного метриту, описаного в даному параграфі). Якщо Ргос Сіїттіх не сходиться для варіабельного метриту, то точний критерій Фішера використовували замість того, щоб порівнювати групи лікування. 00350) Тривалість анормальної оцінки (для кожного варіабельного метриту) визначали для кожної тварини, та розраховували як "(остання анормальна точка часу мінус першу анормальну точку часу) 41". Тривалість анормальної оцінки була встановлена на нуль для тварин, які не мали ніяких точок часу з анормальної оцінки для такого варіабельного метриту. Тривалість анормальної оцінки розраховували як "(остання запланована точка часу колекції даних мінус перша анормальна точка часу) «ж 1" для тварин, яких видаляли з дослідження перед останньою запланованою точка часу колекції даних для такого варіабельного метриту. Тривалість

Зо анормальної оцінки аналізували за узагальненою лінійною змішаною моделлю з фіксованим ефект: лікування, та випадковими ефектами партії, блоком всередині партії та залишок. Лінійні комбінації оцінок параметрів використовували в а ргіогі контрастах після дослідження для значного (Р х 0,10) ефекту лікування. Порівняння були зроблені між лікуваннями. Середні значення, отримані методом найменших квадратів, їх стандартні похибки, та їх 90 95 довірчі інтервали розраховували для кожної групи лікування оцінки параметрів за методом найменших квадратів отримували з аналізу.

І00351| Результати. Всі корови, які народжували близнюків, були видалені з дослідження, оскільки така подія провокувала у корови метрит, та могла спотворити дані. Корів, яких видаляли, включали 6 з контрольної групи ТО1, 2 кожні з груп Т02 та ТО3, та 1 з групи 704. З решти корів в кожній групі, захворюваність метритом, та розраховували встановлені дні метриту. Як можна побачити в таблиці 19, захворюваність метритом в групах ТО3 та Т04 була чисельно нижчою в порівнянні з іншими групами. Крім того, дані показують, що групи ТОЗ та Т04 мали коротшу тривалість метриту в перші 10 днів після отелення, ніж мали тварини в групах

ТО01 та Т02. Таким чином, можна зробити висновок про те, що нативний піолізин, будь то самостійно або в комбінації з бактеринами Е. соїї та Т. руодепе5, коли як ад'ювант є ТХО, є ефективним в зниженні частоти захворюваності природнім метритом у великої рогатої худоби.

Таблиця 19

Група Захворюваність г. нижче 9095 | вище 90 95 (Ж тварини) метритом (95) Дні оцінки ЗМ СІ СІ тез тот тя

Приклад 5. Вакцини проти маститу у великої рогатої худоби 00352) Бактерин Е. Соїї 4-5 представляє собою відомий антиген для лікування маститу. В даному дослідженні, різні ад'юванти, поєднані з бактеринами .)-5 оцінювали щодо анти- маститних ефектів. 00353) Дизайн дослідження є підсумованим в таблиці 20. Отелення відбулося на «день 49.

Зразки крові та молока були взяті в дні нуль, 7, 28, 35, 49, 63, 70 та 84. Корови були контрольно заражені в день 70.

Таблиця 20 нн""'нЬИЬННПЛООВЛВОЛВОЛОВВОВООЛВОВОВОВОВОВВНИВОВВОИЛВОВОВВОВВВВВВНИ я ан С СЕС лікування тварин дози

Бактерин Езсепегіспіа Соїї, 9-5

Е. соїї ТХО

Е. соїї МАССІМАХ? - Сраї 0120 | мл | пш.

Ес сої МАССІМАХ»- Поліс | 01201 мл. | пш

І00354| Тривалість інфекції, викликаної Е. Соїї в групах Т01-Т06 була наступною: ТО1 - 2521 год., Т02 - 213 год., ТО3-191,6 год., Т04 - 190,2 год., ТО5 - 198,7 год. Обробки МАССІМАХФ забезпечували найбільш коротку тривалість інфікування. МАССІМАХФ представляє собою емульсію олія-в-воді, яка містить багатошарові ліпоси, в яких антиген є запакованим між двома шарами ліпосои. 00355) Захисні ефекти лікування були також оцінені шляхом визначення стратифікованої пом'якшеної фракції. Чим вищою є стратифікована пом'якшена фракція, тим більший є захисний ефект. Знову ж, препарати з МАССІМАХФ мали найбільший ефект (в 13,95 - 17,19 разів більше в порівнянні з контролем), але лікування з ТХО також була ефективною (в 6,24 разів більше в порівнянні з контролем). 00356) Загальні антитільні відповіді на специфічну Ідс в цільноклітинній сироватці «)-5 вимірювали, застосовуючи опосередковане захоплення ІФА. Результати підсумовували в таблицях 21 та 22.

Таблиця 21 стратифікована ом,

Період 0 - в день 1 - вакцинація, 1 - в день 28, 2 - в день 49, З - перед контрольним зараженням, 4 - кінець контрольного зараження. Групи лікування з однаковими літерами в межах кожної точки часу суттєво не відрізняються при альфа - 0,10

Приклад 6: Меозрога Сапіпит вакцина.

Ї00357| Меозрога сапіпит представляє собою кокцидій паразит, який був ідентифікований як вид в 1988 році. Він є основною причиною самовільного аборту в заражених тварин. Крім того, будучи основною причиною абортів у великої рогатої худоби, неоспороз є значущим захворюванням у собак по всьому світу. Якщо захворювання спіймане рано, собаки можуть бути успішно вилікуваними за допомогою кліндаміцину та інших антипротозойних лікарських засобів.

Однак, захворювання часто має смертельні наслідки для маленьких цуценят. Профілактичні вакцини були випробувані на великій рогатій худобі. Інактивована вакцина була комерційно доступною, але мала змішані результати. Жива вакцина з використанням ослаблених М. сапіпит тахізоїтів була більш успішною, але є більш коштовною у виробництві. В даному дослідженні, автори винаходу визначали ефекти різних ад'ювантів на властивості вакцини проти М. Сапітит з використанням М. сапіпит циклофіліну (МССУР) та профіліну (МоРго) як антигенів. 00358) Від восьми до 10 тижнів віком самок мишей лінії ВАСВ/с використовували для цього експерименту. Всі тварини були імунізовані двічі з З-тижневими інтервалами гМсоСуР та гМсРгої в присутності зазначеного ад'юванта. Через три тижні після другої імунізації, всіх тварин евтанізували та збирали селезінку та кров. МеоСур/МсРгої-специфічну спленоцитарну проліферативну відповідь визначали за проліфераційним аналізом (з З до 4 дня). МССУР/МеРГгої- специфічну спленоцитарну цитокінову відповідь визначали шляхом стимулювання селезінкових макроїагів Меозрога антигеном протягом 48 год. та визначали рівні цитокінів в супернатанті, застосовуючи цитокін-специфічний ІФА. Рівні антитіла в сироватці визначали, застосовуючи

Зо ІФА. Тварин обробляли як підсумовано в таблиці 23.

Таблиця 23

Ліку- Ад'ювант Кількості (отримані як 2 мл дози та 1/10ий 2 Антиген Кількість, вання мл використовували / миша доза.) (Меозрога введена сапіпит мишам в сусіорпіп час, мкл

МеСуР то ОСсосвтТ ОШ-А (250 мкг /2 мл), Холестерин (250 (100 100 мкг/2 мл), ОБА (100 мкг/2 мл), Сагророї мкКг/2 мл (0,075 95об./06./2 мл), К1005 (1,000 мкг/2 доза) мл), Сро (ЗЕО ІЮ МО: 8; 250 мкг/2 мл) то2 тхо Сро (5ЕО ІО МО: 8; 250 мкг/ 2 мл), ОЕАЕ- МеСуР 100

Декстран (100 мг/2 мл), Мінеральна олія (100 (50 Увоб./06./2 мл), 5РАМ (1,5 95об./о6./2 мкг/2 мл мл), ТМУЕЕМ 80 (7 9соб./о6./2 мл) доза) тОоЗ тоМо Сро (5ЕО ІО МО: 8; 250 мкг/ 2 мл), МеСуР 100

Мінеральну олія (50 95об./о6./2 мл), ЗРАМ (100 (1,5 Увоб./06./2 мл), ТМЕЕМ 80 (7 96о06./06./2 | мкг/2 мл мл), МЕРГА (25 мкг/2 мл) доза) то04 ОСОСВТе | Оі-А (250 мкг /2 мл), Холестерин (250 МеСуР 100 мкг/2 мл), ОБА (100 мкг/2 мл), Сагророї (100 (0,075 95об./06./2 мл), К1005 (1,000 мкг/2 мкг/2 мл мл, ) з "Тс" - Химерні-«0ОМ/ОВМ 5ЕО 10 доза)

МО: 14 (250 мкг/2 мл) то5 ІБСХ ІЗС-ІЗСОМ (100 мкг/2 мл), ОЕАЕ-Декстран МеСуР 100 (100 мг/2 мл) (100 мкКг/2 мл доза) тоб Негатив- Нормальний сольовий розчин НА НА ний

Контроль 003591 властивості груп лікування, зазначених вище, є підсумованими в таблиці 24.

Таблиця 24

Селезінкові ІЕМа Загальний Іде2а, ОО в ІЧе1, ОО в макрофаги, продукування Ід9о6, ОО в 1:2000 1:2000 індекс селезінковими 1:16000 (середнє (середнє стимуляції макрофагами (середнє значеннячт/- значеннячт/- (середнє (пг/мл) значеннятк/- ЗЕМ) ЗЕМ) значеннячт/- (середнє ЗЕМ)

ЗЕМ) значеннят/-

ЗЕМ

ТО 8,0-/-7,0 23,0-/-15,3 0,2076-/- 0,6155-- 0,3823-7/- (ОСОСВТ) 0,0547 0,264 0,03145 т02 (ТХО) 62,9-/-59,0 680,5-/-446,7 0,279-/- 0,6742-/- 0,7675-/- 0,06855 0,192 0,08285 0,0581 0,3393 0,199359048 то4 2,2-і-0,9 18,1-/-15,0 0,10780-/- 0,2584-/- 0,4404/- (ОСОСВТс) 0,01125 0,03315 0,0693

ТО5(ІЗСХ) 5,4-/-3,6 84,4-/-49 4 0,1313ч/- 0,2255-- 0,6486-4/- 0,018 0,0206 0,23585

ТОб(Контроль) 1/-2 12,0-у-7,3 0,0778-/- 0,18127-/- 0,22-у-0,012 0,0033 0,00959

00360) Взяті разом, ці дані демонструють чудові результати, отримані з використанням ТХО та ТСМО.

Приклад 7. Ефекти різних ад'ювантів на імунні відповіді на інфекції статевих шляхів з

СПатуадорпйа аропив 00361) С. арогпи5 є внутрішньоклітинною бактерією, що викликає аборт у овець та кіз.

Інфікування зазвичай відбувається під час експозиції наївних вівцематок абортним матеріалом (наприклад, плацентою, рідиною, плодом). Ділянка бактерії була латентною в інфікуванні вівцематок до розведення та протягом середини або пізньої вагітності, вона є присутньою в плаценті та викликає некротичний запалення плаценти навіть незважаючи на антитільну відповідь. Після аборту, вівцематки, як правило, мають імунітет до повторного зараження.

І00362| Вважається, що вакцинація може бути корисною перед впливом оскільки він запобігає первинному інфікуванню та запобігає хоумінгу бактерій до плаценти. Вищий ІЄМО, пов'язаний з антитільною відповіддю при після-обортному імунітеті, є ключовим корелятом захисту. ІЕМ також може бути пов'язаним з персистенцією, яку спостерігали у невагітних вівцематок. 00363) Вівцематки були вакциновані в дні нуль та 28 та проводили контрольне зараження в день 49. Тварин умертвляли в день 63 та проводили некропсію. В день нуль, відбирали вагінальні зразки та зразки цільної крові для ФПЛР. Кров відбирали щотижня для серологічних результатів та в дні нуль, 7, 28, та 35 для вимірювання цитокінів та ЕїЇїзрої вимірювання. (00364) Групи лікування представлені в таблиці 25.

Таблиця 25

А Нео) Сро (5ЕБЕО ІО МО: 8, 100 мкг/л, р),

Холестерин (100 мкг/л, р,), МРІ А (100 мкг/л, р,, Полі ІС (50 мкг/л, р, загущений 4595 мінеральною олією з 6,3 96 ЗРАМФО 80 та 05 з ТМУМЕЕМФО 80 1,45 95) та вода ее) Сро (5ЕБЕО ІО МО: 8, 100 мкг/л, р),

Холестерин (100 мкг/л, р,), МРГ А (100 мкг/л, р,), ОЕАЕ-Декстран (100 мг/л.р.), загущений 4595 мінеральною олією з 6,3 96 ЗРАМФО 80 та 05 з ТМУМЕЕМФО 80 1,45 95) та вода (о; не) Сро (5БО ІЮО МО: 8, 100 мкг/л, р),,,

Холестерин (100 мкг/л, р,), МРГ А (100 мкг/л, р,) загущений 45 95 мінеральною олією з 6,395 ЗРАМ! 80 та 05

ТМ/ЕЕМФ 80 (1,45 Фо) та вода 0 |Безад'юванта(сольовийрозчию |Нормальнийсольовийрозчин./-/://"

І00365| Антиген отримували з нирки абортованого овечого плода та розмножували на клітинах МеСоу. Елементарні тіла були очищені центрифугуванням та обробляли ультразвуком.

Антиген фіксували на рівні 100 мкг/доза в 0,1 956 формальдегідом в 0,9 956 хлориді натрію для вакцинація.

Таблиця 26

Серед. ОО на день: 710 1 7 | 14 | 28 | 35 | 42 | 49 | 56 | 63 0,055 | 0,090 | 0,060 | 0192 | 0266 | 0,374 | 0,314 | 0,315 |) 0,395

В | 0,015 0,052 | 0,073 | 0,137 | 0204 | 0234 | 0234 | 0,364 | 0,460 0,057 0,075 | 0,065 | 0,217 | 0,347 | 0,494 | 0,481 0,487 | 0,584 0 1 0,040 0,079 | 0,074 | 0,034 | 0,079 | 0,078 | 0,074 | 0,044 | 0109 0,042 0,082 | 0,056 | 0,022 | 0,038 | 0,032 | 0,039 | 0,008 | 0,170 0,051 0,095 | 0,055 | 0,016 | 0,033 | 0,029 | 0,038 | 0,015 | 0,033

І00366б| Серологічні результати отримували, застосовуючи набір Спек-й ІФА, та є підсумованими в таблиці 26 вище.

І00367| Визначали рівні експресії ІРМО, ІІ -2 та ІІ -4 в овечій РМВС, стимульованих СпПіатуаїіа

АС. Результати представлені в таблиці 27.

Таблиця 27

Рівні експресії ІРМО, 1--2 та І--4 в овеій РМВС, стимульованих Спіатуадіа А

Група

День | День 28 День День 7 День | День 35 | День 7 День | День 35 7 35 28 28 18,08 10,77 в ' |767 205 | 2,52 | 408 | 735 | 563 | 22б | 112 | 324 0 | 58 458 | 2,70 | 087 | 273 | 327 | 064 | 127 | 124 (00368) Відповідь овечих РВМС на антиген Спіатуаїйа арогіи5 є підсумованим в таблиці 28.

Таблиця 28

Відповіді овечих РВМС на антиген Спіатуаїйа аропив

Група Середні значення 5ЕС х 109 клітини в 'Ї 75 | 380 | 7140 | 70 | 268 | 140 0 | 350 | 495 | 3355 | 70 | 338 | 338

Е | 7155 | 7195 | 60 | 70 | 23 | 07 ( в ЇЇ 700 | 70 | 60 щ | 70 | 08 | 04 « 003691 Крім того, аналізували кількість білих кров'яних клітин (дані не показані). 2-смуговий

АМОМА вказує на те, що Група Е мала значно вищу кількість М/ВС, ніж Група А та В, та що

Група Е мала значно вищу кількість МВС кількість, ніж Група В. 00370) Вузли в час ін'єкцій також аналізували. Як і слід було очікувати, Групи А-С мали більш великі вузли, ніж Групи С-О. Серед трьох ад'ювантів, які використовували (Групи А-С),

Група С мали найбільш великий розмір вузла, з наступною Групою В, з наступною Групою А.

І00371| Визначали об'єм вузлів. Знову, групи А-С мали більш великі об'єми вузлів, ніж групи 0-Р. Серед груп А-С, Група А мала найменший об'єм. Вузли в Групах А та В мали більші крововиливні та/або некротичні тканини. Вузли в Групі С мав більший фіброз. Клітинні характеристики є аналогічними у всіх трьох вузлів, хоча Група С може мати більш лімфоцитарний компонент.

Приклад 8. Додавання алюмінію до ТХО давало в результаті покращену стабільність

І00372| На даний момент ТХО змішаний препарат містить 50 мг/мл ОЕАЄЕ Декстран.

Декстран, коли він присутній у високих концентраціях у підшкірних ін'єкціях, може викликати реакції в місцях ін'єкції у тварин. Отже, пропонується спробувати різні концентрації для ОЕАЕ Декстрану, щоб перевірити, якщо безпека та гарне терапевтичне значення можуть отримувати без шкоди для стабільності вакцинного препарата.

ІЇ00373| Дослідження характеристики та стабільності є важливими, оскільки вони повідомляють нам про те, чи дана вакцина може бути сформульована послідовно та з гарним терміном придатності для виготовлення. Дослідження в'язкості проводять в діапазоні швидкостей зсуву для того, щоб шукати зменшення в'язкості при зсуві (різке зниження динамічної в'язкості, оскільки швидкість зсуву йде вгору) або потовщення зсуву (збільшення динамічної в'язкості, оскільки швидкість зсуву йде вгору), що є характеристикою потоку неньютовських рідин. Шприц силові випробування проводяться, щоб гарантувати, що вакцина буде легко витягатися та легко вводитись через велику кількість доз в області.

І00374| Оскільки неочікувалось, що імуностимулюючий олігонуклеотид змінить стабільність препарата, його не додавали до ад'ювантих сумішей в даному прикладі. АХО (Алюмінію ж

Декстран «ж Олія) змішують з різними КЕНУОКАСЕЇ Ф (від 5 95 до 16 95), та концентрації ОЕАЕ

Декстрана (50 мг/мл - 10 мг/мл) формулюють для дослідження на в'язкість, шприцеву силу та осадження, застосовуючи ХО (Декстран ї- Олія) суміш як контроль. Досліджувані композиції були наступними: 00375) Приблизно 10 мл зразка завантажували в кожну з п'яти 15-мл центрифужні пробірки

Согпіпд та залишили ще протягом тижня для того, щоб спостерігати за впливом на прискорене осідання емульсій через вузькі розміри пробірок та конічне дно. Зразки також досліджували на здатність проходження через голку шприца та в'язкість. Результати наведені нижче.

Таблиця 29

РЕАЕ КЕЕНЖОКАСЕЇ Ф | ПУЕЕМВ8О 10 мМ Мінеральна | 5РАМ 80

Декстран 2 95 мас./об. РВ5 Олія

А29Оз

Вінн Пісьсоя ННЯ с ПОН НО ЧНО ВО об./об. об./об. об./об. об./об. об./об. об./об. об./об. об./об. об./об. об./об. об./об. об./об.

І00376| Ці дані вказують на те, що при піддаванні дії прискореному осадженню в центрифужних пробірках, суміш з 16 96 КЕНЖОКАСЕЇ Ф є найбільш стабільним. Крім того, з

Зо попередньої роботи авторів винаходу, було відомо, що більш висока концентрація ОЕАЕ

Декстрану є пов'язаною з більш високими в'язкостями та можливим розрідження при зсуві.

Результати даних експериментів показують, що додавання КЕНУХОКАСЕФ є більшими, ніж компенсуються очікувані втрати в'язкосних при зсуві (псевдопластичні рідини) властивостей, що надаються ОЕАЄ Декстраном. Крім того, спостерігалось, що хоча 1695 КЕНЖОКАСЕЇ г препарат мав більш високу шприцеву силу, було не помітно, що його важче ін'єкційно вводити (шприцева сила для води становить З Н).

Таблиця 30 (СП) (Ньютон)

І00377| Із загальних даних, є очевидним, що суміш з 16 95 КЕНХОКАСЕЇ Є та 10 мг/мл ОЕАЕ

Декстрану є оптимальною для застосування в вакцинних препаратах, особливо тих, які вимагають зв'язування вільного ендотоксину та/"або де більший термін придатності емульсії може бути потрібним.

Приклад 9. ВКМ, ВСУ та Е соїї антигени

І00378| В даному прикладі, автори винаходи досліджують застосування ад'ювантів за представленим винаходом в вакцинах проти ентериту. Ентерит спричиняється бактеріальними, вірусними та/або паразитарними інфекціями. Велика рогата худоба, зокрема, новонароджені молочні та м'ясні телята є вразливими до проносу телят, тому що вони піддаються дії багатьох стресів протягом перших декількох годин життя, коли їх імунні системи повністю не є розвиненими. Втрата рідини через пронос телят в результаті призводить до дегідратації та часто до смерті. Тварини, які переживають пронос телят, часто залишаються слабкими та погано працюють протягом усього свого життя. Агенти, пов'язані з проносом, включають бактерії, зокрема, Е. соїї КО9 та Е41, та віруси, такі як бичачий коронавірус (ВСМ) та бичачі ротавірус (ВКМ).

І00379| Гольштинські бички віком десять місяців використовували в даному дослідженні.

Тварини були серонегативними або мали низькі титри щодо Е сої (К99 та Е41), ВЕМ (8223 та

Мпсоїп) та ВСУ.

І00380| Групи лікування були наступними:

Таблиця 31 (мл) ж ж п розчин

Т02 |10 | КОТАМЕСО Мінеральна Олія | МА (комерційний 2 (Е сої КО9, | Алюмокалієвий галун продукт)

ВеЕМ 06 та всУ

Т03 /|10 ОЇ А ї Холестерин ж | ОШ-А (500 мкг/2,5 мл |п.ш.| 2.5

КЕНУОКАСЕЇГ Ф(15 96 доза), Холестерин (200 об./06б., 295 АІ28Оз | мкг/2,5 мл доза), мас./о06б.) - Сро (5ЕБЕО | КЕНУОКАСЕЇ

ІО МО: 8) (15 Увоб./о6.), Сро (100 мкг/2,5 мл доза)

Т04 |10 | Е. соїї | Оці А ї- Холестерин ж | Оц-А (500 мкг/2,5 мл | п.ш. 2.5

АМРНІСЕМФО мкг/2,5 мл доза),

Атрпідеп 2,5 У5о0б./06.

Продовження таблиці 31

Т05 |10 ТХОНКЕНУОКАСЕЇФ | Сро (100 мкг/5 млі п.ш. 5 (1595 об./об., 295 | доза), ЮОЕАЕ-Декстран

А269Оз мас./об.) (100 мг/5 мл доза),

Мінеральну Олія (45 Увоб./об.), Зрап (6,3 Ус), Тмжеєп 1,45 95о06./06.) тоб |10 ТО-КЕНХУОКАСЕГ Сро (100 мкг/5 млі п.ш. 5 (1595 об./об., 295 | доза), Мінеральна Олія

А269Оз мас./об.) (45 95об./об.), Зрап (6,3 Ус), Тмжеєп (1,45 9боб./06.),

КЕНМОКАСЕЇГ Ф(15 90 003811 Зразки крові збирали кожні 21 днів протягом шести місяців для серології. Реакції місця ін'єкції вимірювали в дні 0 (перед вакцинацією), 1, 2, 3, 7, 14, 21 та кожні 21 днів після цього. Відповіді на Е. соїї КУб, Е соїї Е41, ВЕМ Гіпсоіп, ВКМ В223 та ВСМ вимірювали шляхом кількісного визначення титру антитіл у вибрані дні. Результати є підсумованими нижче (різні літери вказують на відмінності при а-0,1):

Таблиця 32 ерееть | енметии | вомпирниннтюу

Титр мішені 21255 мішені »1472 ВСУ, Титр мішені 21107

РОКІ ди Я дно дяки ЯКО 0 21 189 0 День 21 189 День | День 21 189 нале зон 06 зр | овен ков: | зве.

ТО ь 208,12 | 152342 а 512,12 588,5 2 238,92 430,6 2 548,8 2 се Я дове зювн зви | ввлн змен звлт пово, т02 Ь 750,55 | 349,95 а 1024,25 | 675,725 | 34985 | 5997,15 | 139895 те В век ЕЕ ви | жовт змвлн | люва поле,

ТоЗ Ь с 533,9 5 а 2681,95 | 985,65 | 348,4 85 | 7299,1 5с | 110615 сивая вро звивин» кввн дон знов

Т04 | 91,4 в с 575,05 а 3511,8са4 | 1064,35 | 298,8 85 | 7023,0 бе | 14483 5 сова еве ОО БЕ до пою: яжан о овлег

Т05 | 81,8 25 с с а 9089,62 | 2998,62 | 326,3 25 с 2521,6 2 тв: ДОВ ИКЕ НЕ дае новоє вото» | вена: | зво: 706 | 39,12 с 9 а 6020232 | 4683,852 | 237,22 | 9556,22 | 2298,9 г (00382) Лікування 705 та ТО06 в результаті призводило до найвищих титрів антитіла з дня 21 до кінця дослідження (день 189). Слід зазначити, що комерційна вакцина (КОТАМЕСФ) не давала гарні результати, а також ТО5 та Т06 в індукції антитіл проти вірусних компонентів ентериту.

Таблиця 33

Середньо геометричні титри проти анти-Е. сої . . й антиген Е соїї Е41 різ (невизначена

Група антиген Е. соїї К99 ріїи5 (мішень 2742)

День День День День тов | зве | ва | ляє | ївуе | ває | моє | вве

І00383)| Лікування 702 та Т05-Т06 давала результати аналогічно гарні, викликаючи відповідь проти К 99. Лікування Т02 викликало найкращу відповідь до Е. соїї Е41. Лікування Т05 було другим найбільш ефективним у викликанні відповіді до такого антигену.

І00384| Взяті разом, ці дані демонструють, що ТО05 та ТО0б, як видається, є найбільш перспективними препаратами. Обидва мають доставлені відповіді мішені (ДС для декількох фракцій на день 189. Обидва ТО05 та Т0б, як представляється, забезпечують вищу або еквівалентну серологічну ефективність в порівнянні з КОТАМЕСФ (102, ІМ) шляхом п.ш. введення. ТО3 та 704 зберігали підвищені серологічні титри за коротші терміни, ніж ТО5 та ТО06.

З одиничною дозою вакцинація ТО3, Т04, Т05 та Т06 доставляла вищі цільові титри рівнів в сироватці для ВКМ 56, ВКМ 010 та ВСМ. З одиничною дозою вакцинація Т04, Т05 та Т06 доставляла вищі цільові титри рівнів в сироватці для Е. соїї КО9. Т04, Т05 та Т06 зберігали антивірусні титри в сироватці вищі за цільові рівні протягом б місяців. ТО5 та Т06 зберігали титри анти-Е. соїї КОО9 в сироватці вищі за цільові рівні протягом 6 місяців. Всі оцінені препарати продемонстрували достатню безпеку в гольштинських бичків.

І00385| Ректальні температури вимірювали в дні нуль, 1, 2 та 3. В той же час були статистично значущі відмінності між групами ТО1 (контроль) та групами Т02-Т06, відмінності в температурах (І ЗМ) не були великими (в межах одного градуса РК).

Таблиця 34

День 000 День 001 День 002 День 003 101,1 2(38.4) 102,2 г (39,0) 102,0 2 (38,9) 102,3 5 (39.1) 101,7 5(38,7) 102,6 абс (39 2) 102,2 25 (39,0) 101,8 2 (38,8) 101,8 5 (38,8) 102,7 бе (39,3) 102,2 25 (39,0) 101,9 2 (38,8) 101,3 а5(38,5) 102,8 г (39,3) 102,0 г (38,9) 102,0 25 (38,9) 101,7 5(387) 102,3 авс (39 1) 102,5 5 (39 2) 102,4 5 (391) 101,6 25 (38,7) 102,1 2 (38,9) 102,4 5 (39 1) 102,1 25 (38,9)

І00386| Попереднє дослідження препаратів у вагітних молочних корів продемонструвало безпеку. Групи ТО1, ТОЗ3 та ТО5 досліджували, 5 корів в кожній групі. Тринадцять з 15 корів отелилися, 12 телят були нормальними, один був мертвонародженим.

Приклад 10. Анти-ТісК вакцина.

Експериментальний дизайн 5О0

І00387| Досліджували два вакцинних препарата на основі антигену Віт8б6. Один препарат містив водний ад'ювант (ОСОСКТ) та інший ад'ювант на олійній основі (ТХО), як підсумовано нижче.

Таблиця 35 то2 ВПірісернаінв / тісторіиз | ОСОСВТ 250 мкг ОЦі-А, 250 мкг Холестерин, (раніше Воорпйив) 100 мкг ОБА, 0,0375 95 Сатбророї, 1,000 очищений гВіт86 протеїн мкг К1005, 100 мкг БЕО І МО: 8 (вихідний, 1,16 мг/мл) то хо 100 мкг 5ЕО ІЮ МО: 8 /100 мг ОЕАЕ-

Декстран в мінеральній олії (45 р),

ЗРАМФ 80(695) та ТУМЕЕМ: 80 1,45 95 (00388) Двадцять чотири телят рандомізовано розподіляли в одну з трьох груп лікування по вісім телят кожна. Телят з кожної групи лікування індивідуально вакцинували 2сс або одним з двох Втвбакомпозицію ад'юванти або сольовий розчин (контроль група). Вакцинації здійснювали в день 0 та 28. В день 41, велику рогату худобу поміщали в підпірку, та в день 42 інфікували 250 мг личинки К. аппшиіайш5. Кліщів, яких використовували в даному дослідженні, спочатку збирали з ранчо в Маї Мегде Сошпіу, Теха5. Всі відщеплені наповнені дорослі самки збирались щодня з індивідуальних телят на 63-84 день. Телята були видалені з підпірку на день 85. Зібраних кліщів підраховували та аж до 10 з кожного теляти зважували та поміщали в кліматичну камеру кожен день збору протягом 13 днів. Відпрацьовані самки були відкинуті через 14 днів після збору та масу отриманого яйця зважували. Через чотирнадцять днів після першого вилуплення, кількість вилуплених та інтактних яєць реєстрували та розраховували визначений відсоток вилуплення. Перед кожною ін'єкцією вакцини та протягом наступних трьох днів після ін'єкції, перевіряли місце ін'єкції у кожного теляти щодо припухлостей, та вимірювали ректальні температури. Сироватку крові збирали з кожного теляти в дні -7, 0, 14, 28, 42, та 85 для визначення титрів Віт8б6 антитіла протягом усього дослідження як визначали, застосовуючи

ІФА.

Результати (00389) Попередні результати показують 98,6 та 99,6 95 контроль з 702 та ТОЗ3 препаратів, відповідно, який є значно вищим, ніж Т01. Дані розрахунки відсоткового контролю враховують тільки зниження маси наповнених самок та маси яєць. Зниження відсотку вилуплення будуть визначати в більш пізній термін та додаватимуть до кінцевих результатів. Одне з 24 телят в дослідженні дає невелику припухлість після кожної ін'єкції (препарат, який містить олійний ад'ювант). Припухлості є меншими. ніж 10 см в довжину та З см в ширину. Припухлості є м'якими та не здаються болючими для тварини. Не відбувалося підвищення ректальної температури у оброблених тварин протягом усього дослідження.

І00390| Серологічні результати демонструють статистично значущі відмінності між кожною з обробок у відповідні тимчасові точки за винятком тих, які не мали ніякої статистичної значущості (р-0,114) між обробками ОСОСЕТ та ТХО в точку часу день 14. Як ОСОСЕКТ, такі ТХО ефективно підвищують титри ВМ86 антитіла в кожній точці часу, які досліджували. ТХО був кращим за ОСОСКТ (р«0,05) в кожну точку часу, яку досліджували, за винятком дня 14 (р-0,114).

Таблиця 36 найменших квадратів (Середнє 5 5ЕМ тої | 8 | 10034642 | 100531,52 | 100517,05 | 100-17,31 Н то2 | 8 | 20183937 | 11795372 | 1353252308 40825707 КЦ( і тоз | 8 | 5956:2765 | 8404х2649 | 28557:4870 | 1863853227

Приклад 11. Захворювання ящура (морські свинки)

І00391| Мета даного дослідження полягала в тому, щоб порівняти гуморальні імунні відповіді у морських свинок, вакцинованих тривалентними ЕМО доповненими з ад'ювантами вакцинами, з різними композиціями ад'ювантів. Морських свинок вакцинували в дні нуль та 28 як підсумовано в таблиці 37. 00392 В кожній дозі Т03-Т07, антиген представляв собою комбінацію з ЕММО типу О (9 мкг),

А (5 мкг) та Авіа! (5 мкг/мл). Антигенна композиція в Т02 є власною інформацією виробника та, таким чином, була недоступною.

І00393| Зразки крові збирали для серологічного дослідження в дні -3, 25 та 53. Титри сироватки антитіл проти серотипів ОС, А та Авіа 1 є підсумованими нижче. 00394) В той час як відповіді проти серотипів О та А були низькими навіть в позитивній контрольній групі (Т02), відповідь проти Авіа 1 була вищою в Т07 (ТХО ад'ювант), ніж в групі позитивного контролю, та більше, ніж в будь-якому іншому лікуванні. Низькі відповіді проти серотипів О та А можуть бути загиблими в присутності низьких рівнів О та А антигенів в препараті.

Ї00395| Слід зазначити, що на основі ліпосом групи МАССІМАХФ (Т03-Т05) не демонстрували значної відповіді проти будь-яких антигенів (0, А, Авіа).

Таблиця 37

Група М Ад'ювант/Інгредієнти Дні Доза | Шлях лікува- ння ее Тони розчин то2 24/24 | Комерційні Власний патентований засіб 0,28 0,2 мл вакцини-

Вакена моновалентні

ЕМОМ вакцини (меї) (позитивний контроль)

ТО0З | 23/22 | МАССІМАХФ 5100/Холестерин, 12 9омабс./об. 0,28 0,2 мл

З100/полі І:С (60 мг/дозау/Лолі ІС 100 мкг/доза вода в олії, 50 95 водні ліпосоми ж- 50595 МаїсоЇї 52 /

Мопіапіде 888

Паоло сок По БК В

З100/РатЗСув

Т05 | 23/22 | МАССІМАХФ МассімМмах Віоїроп 95, 100 мкг/ 0,28 0,2 мл (Віоїїроп 95) Полі І:С/л.р., вода в олії, 50 95 /РатЗСув водного ліпосоми т 50 95 Магсої 52 / Мопіапіде 888

ТО06 | 24/24 | ОСОСВТ 250 мкг ОцШй-А, 250 мкг 0, 28 0,2 мл (80 95 об'єм) Холестерин, 100 мкг ОбА, 0,0375 95 Сагророї, 1 000 мкг

К1005, 100 мкг 5ЕО ІО МО: 8

Т07 | 24/23| ТХО (8095 | 100 мкг 5ЕО ІО МО: 8; 100 мг 0, 28 0,2 мл об'єм) Декстран ОЕАЕ, 45 до мінеральна олія, 6,3 бо

ЗРАМФВО, 1,45 95 ТУУЕЕМФВО,

О5 вода

М позначає кількість тварин, що прожили протягом першого/другому вакцинація

Таблиця 38

Група Титри серотипу О 5М, Титри серотипу А 5М, Титри серотипу Авіа! 5М,

Середньо геометричний Середньо геометричний Середньо геометричний титр титр титр ве ре рере ет

З 28 56 З 28 56 З 28 56 то2 4 | 96 | 499 | 4 | 7 | 141 | 4 | 714 | 266,9 то3 її 4 | 48 | 138 | 4 | 41 | 9 | 4 | 59 | 243 і т07 | 4 | 5 | 9 | 4 | 56 | 43 | 4 | 198 | з20,8

Приклад 12. Захворювання ящуру (Велика рогата худоба)

І00396| В даному дослідженні, визначали ефект різних ад'ювантів, які використовували в вакцині проти ЕМО в моделі контрольного зараження. Досліджували три ад'юванти. Вакцина представляла собою АК5 експериментальна вакцина проти ЕМО в моделі контрольного зараження, яка розроблена РІАДОС. ЕМО-ІІ 3830-А24 Сгиеїго використовували як антигенний компонент вакцини (10 мкг), та немутантний тип ЕМОМ А-24 Сти?еїго використовували як вірус контрольного зараження. Антиген був описаний раніше, наприклад, в 5 20120315295 (Вівдег аї аІ, подана 9 червня 2011 та опублікована 13 грудня 2012). Коротко кажучи, ЕМО-ІІ 3830-А24

Стгигеійго містить генетично модифікований ЕМОМ (Вірус Захворювання Ящуру). ЕМОМ є генетично модифікованим, тобто, який представляє собою безлідерний вірус, який містить делецію лідерного (Грго) протеїну, який кодує ділянку таким чином, що ЕМО віруси, які втратили даний протеїн є ослабленими у великої рогатої худоби та свиней. Крім того, він містить мутації (негативні маркери), введені в два неструктурні вірусні протеїни, що в результаті призводить до ліквідації двох антигенних епітопів, які розпізнаються специфічними антитілами, один, розташований в протеїні ЗВ, та інший в протеїні ЗО (замінені на відповідну послідовність бичачого ріновірусу, що служить як негативний антигенний епітоп в даних протеїнах), таким чином, забезпечуючи дві можливих мішені для БІМА (диференціація природно інфікованих з вакцинованих тварин) серологічні тести.

І00397| Від чотирьох до семи корів використовували в кожній групі. Загальний об'єм ін'єкції становив 2 мл. Тварини були вакциновані в день нуль шляхом в.м. ін'єкції (2,0 мл на дозу) та проводили контрольне зараження в день 21 інтрадермальним шляхом немутантним типом

ЕМОМ. Клінічні оцінки виставляли в дні 0, 3, 7 та 10, відповідно, до наступної шкали: без клінічних ознак: 0, везикулярні ураження стопи: 1 бал за кожне ураження стопи. Максимальний бал дорівнює 4. Результати експерименту полягають в наступному:

Таблиця 39

Група Ад'ювант Деталі/На дозу (9) З 7 10 тої | Сольовийрозчин | НАС о | 30 351 40 то2 МОМТАМІОЕФІВА | ад'ювант на основі мінеральної 206 Уа олії, яка була розроблена для виробництва емульсій вода-в- олії-в-воді (МИОЛЛ/). Вона містить високий клас здатності для ін'єкційного введення мінеральної олії та високо очищений емульгатор отримували з маніту та очищену олеїнову кислоту рослинного походження. МОМТАМІСОЕФ ІА 206 МО не містить інгредієнтів тваринного походження. Точна композиція Є власністю виробника (Зерріс Іпс то ОСОСВАТ (8095| 250 мкг ОШшй-А, 250 мкг 1,14 | 2,86 2,43 об'єм) Холестерин, 100 мкг ОбА, 0,0375 95 Сагророї 1 000 мкг

К1005, 100 мкг БЕО ІЮ МО: 8 ее о днтео и 1

РЕАЕ-Декстран в УМО емульсії (003981 Відмінності між ТО1 та Т02 та між ТО1 та Т04 були статистично значущими. 00399) З наведеної вище таблиці, можна зробити висновок про те, що, щонайменше, на підставі клінічних показників, ад'юванти ТХО та МОМТАМІОЕФІВА 206 МО мають приблизно однакову ефективність. Однак, серологічні аналізи щодо вимірювання сироватки, які нейтралізують активність проти ЕМОМ-А24, демонструє, що група Т04 (ад'ювант ТХО) мали більш високі титри, ніж в групі ТО2 (МОМТАМІОЕФІЗА 206 МО).

Таблиця 40

Середні титри нейтралізації сироватки за методом найменших квадратів (зворотньо перетворювані) нІ?н"ЕИИИЙИИЬЬКИККККККННІООВОВООЛО СТЕ ТТ НОЇ 71111111 деньо/// | День7 | Деньї4 | День?!

Різні букви вказують статистично значуща відмінність (ре-0,05)

ІЇ00400| Дані результати демонструють, що ТХО ад'ювант був здатний забезпечити 100 95 захист проти контрольного зараження ЕМО, викликаного агентом у великої рогатої худоби та надають більш високі титри антитіла, ніж контрольний сольовий розчин та інші два ад'юванти, які досліджували. (00401) Кількість РНК ЕМОМ (копій на мл) визначали в назальних мазках та в сироватці. Дані представлені в таблицях 41-44. Коротко кажучи, ці дані демонструють, що групи 702 та Т04 в результаті дають менші кількості ЕМОМ в назальних мазках. Серед 102 та Т04, слід зазначити,

що тварини в групі Т04 демонстрували більш раннє зменшення (або відсутність збільшення)

ЕМОМ ЕММА кількості, таким чином, знову демонструючи кращі властивості ад'юванта ТХО.

Таблиця 41

ЕМОМ в назальних мазках ("зниження маси" ЕМОМ РНК копію на мл вимірювали, застосовуючи вРУ-ПЛР; середні І 5) 111111 тТочкачасуї7/////7777771111111111111111сС1сС

Таблиця 42

Статистична значимість (назальні мазки) ні Ре-0,057

ТО пр Т02

ТО пр ТОЗ

ТО пр ТО4

Т02 пр ТОЗ

Т02 пр ТО4

ТОЗ пр ТО4

Таблиця 43

ЕМОМ в сироватці ("Мігетіа", ЕМОМ КМА число копій на мл вимірювали, застосовуючи вРЧ-ПЛР; середні І 5) 111111 тТочкачасу.їд/////77777111111111111111111с1сС

Таблиця 44

Статистична значимість (сироватка) ші Р--0,057

ТО пр Т02

ТО пр ТОЗ

ТО1 пр Т04

Т02 пр ТОЗ

Т02 пр ТО4

ТОЗ пр ТО4

Приклад 12: ТХО активує клітинно-опосередкований імунітет

І00402| Тоді як всі тварини в групі ТОЇ демонстрували лихоманку після контрольного зараження, жодна з тварин в групі Т04 не мала лихоманки. Відповіді в групах 102 та ТО3 були суперечливі (деякі тварини демонстрували лихоманку та деякі ні). Дане спостереження підтверджує висновок загальної переваги ТХО в порівнянні з іншими ад'юванти, які використовували в даному дослідженні.

Приклад 13: ТХО активує клітинно-опосередкований імунітет

ІЇ00403| Застосовуючи ЕМО як ілюстративний антиген в тваринній моделі, описаній в попередньому прикладі, аналізували ефект ад'ювантів на клітинно-опосередкований імунітет.

Мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) були очищені від бичачої цільної крові, зібраної в дні 4, 7, 14 та 21 після вакцинація. ЕМОМ-специфічні Т клітинні проліферативні відповіді оцінювали, застосовуючи фарбування діацетатом карбоксифлуоресцеїну сукцінімідилового складного ефіру (СЕЗЕ). (00404) Результати представлені в таблиці 45.

Таблиця 45

Індекс проліферації (Середнє значення 550) (00405) Ці дані демонструють кращий ефект ТХО на клітинно-опосередкований імунітет як на 14-й день, так і на день 21. Ці дані також показують, що, оскільки клітинно-опосередкований імунітет відповідає за тривалість поза імунітетом, ад'ювант ТХО можливо може забезпечити більшу тривалість імунітету, ніж МОМТАМІОЕФІЗА 206 МО.

Приклад 14. Одержання антитіл для застосування в діагностиці

І00406| Ад'ювант ТХО за представленим винаходом використовували для одержання антитіл для застосування в діагностиці. Коротко кажучи, тваринні джерела були імунізовані кожні 2-4 тижні препаратами, які містять вибрані рекомбінантні антигени з добавленим як ад'ювант ТХО, композиція з якого була наступною: ЗЕО ІЮ МО: 8 - 125 мкг; ОЕАЕ декстран - 125

Ко) мг; Мінеральна олія - 46,56 95 об./0б. препарата; ТМУМЕЕМФОУ 80 - 1,595 об./06. препарата;

ЗРАМФВО-6,518 95 об./об. препарата.

І00407| Кінцевий об'єм становив 2 мл.

(00408) Спостерігалися видимі реакції в місці ін'єкції після ін'єкції, але знаходились в межах очікуваного розміру реакцій. На підставі щоденних спостережень, реакції, які спостерігалися по ребрах, як виявилось, не були болючими для кіз.

І00409| Зразки крові збирали через 2-3 тижні після кожної імунізації, та проводили різні аналізи, щоб оцінити титр антитіла. Серологічний титр за ІФА більше 1000 визнавався достатнім, щоб починати збирати антитіла.

ІЇ00410| У тварин брали кров щотижня (7,595 об'єму крові на основі маси тіла). Після закінчення дослідження, кіз евтанізували термінальним кровопусканням, та дану кров також збирали для збору антитіл. За необхідності або тварин переорієнтовували для додаткових досліджень.

Таблиця 46

Короткий опис повних досліджень отримання козиних поліклональних реагентів

Загаль- с. Твари- ва

Кількість нне Джерело ний об'єм Імуніза-

Антиген (мкг)/ зібраної й Коментарі джерело АВ ції, М доза сироват- (М) Ки 100-150 Сироват- сла. У всіх кіз

Ре М ар70 Коза (6) ка, Р 15 досягався титр

МКГ к ки, ЗОО л молоко понад 20000007 молока

У всіх кіз ! ! ! досягався титр

Нівюорнішв5 зотпі (Н. вотпі) рЗ1 150 мкг | Коза(4) | Сироват: | вд понад 2500000. . ка Дві досягали протеїн титр понад 5000000

У всіх кіз

Протеїн досягався титр бичачого | 61,8 мкг Коза (4) Сироват- зол А понад 2000. парагриповірусу- ка Три кози

З (ВРІ-3) НМ досягали титр понад 8000

У всіх кіз досягався титр

Сироват- понад 100000. "ВМО1 Е2 (дроі3) 150 мкг Коза (4) ка й 3,93 л З Одна коза стабільно мала титри понад 1200000

У всіх кіз досягався титр

Антиген собачого 150 мкг | Коза(4) | Сироват | /514 4 понад 500000. ирковірусу ка Дві досягали

В титр понад 2000000

У всіх кіз досягався титр

Протеїн Сироват- понад 800 000.

ВогаєїеІйа ЕНА 100 мкг Коза (4) ка 25 л 4 Дві досягали титр понад 4 000 000

Продовження таблиці 46 . - 150 мкг Коза (4) 135 л досягався титр (інактивований) ка понад 40000 " У однієї кози в групі розвинулась псевдовагітність та лактація. 300 л молока зібрали з цієї коза. я Титри, виведені з проведених аналізів ІФА. У той же час титри кінцевої точки не були зазначені, та сироватку не розбавляли достатньо, щоб визначити кінцеву точку. 00411) Сироватка антитіл для Ре! М др70 була успішно очищена, застосовуючи або Протеїн

А, або Протеїн б фірмові колонки, для невеликого масштабу очищення, або Протеїн с хроматографію для великомасштабного очищення, в Маїпе ВіоФесппоіоду бегмісе5 (МВ5),

Ропапа, МЕ. Поліклональні антитіла концентрували, застосовуючи МіПроге ЗОК Ойга ЕшШег Опіїб до кінцевої концентрації приблизно 1 мг/мл. Антитіла проти інших антигенів, розкриті в таблиці 46 не очищували. (00412) Антитіла виділяли з молоко, отриманого від спонтанно лактуючої кози, імунізованої

Ееї Мор70 відповідно до способу, який включає наступні стадії: а) рН молока титрували до 4,6 2 М розчином НС та перемішували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин для осадження казеїну; р) молоко центрифугували на 17 000 х д протягом 30 хвилин та збирали супернатант; с) буфер для врівноваження додавали до супернатанту з 3,3 М Масі, 0,3 М гліцину та 0,2 М

Тгів основи; а) Супернатант освітлювали центрифугуванням на 3000 х д протягом 15 хвилин; е) Освітлений супернатант молока завантажували в колонку Мабрзеїесі, врівноважену буфером зі стадії "с";

І) Колонку промивали буфер для врівноваження та елюювали 0,15 М гліцином рН 3,0; 9) фракції елюювання нейтралізували 0,2 М розчином фосфату Ма.

ІЇ00413| Як необмежуючі приклади, способи отримання анти-РІ-3 та анти-РєЇ М ар70 представлені нижче.

ІЇ00414| Одним із завдань було створення козиної поліклональної антисироватки до очищеного протеїну бичачого парагриповірусу-З (ВРІ-3) НМ для застосування в аналізах іп-міго.

Зо Дане дослідження було розроблено, щоб вакцинувати кіз очищеним протеїном бичачого парагриповірусу-3 (ВРІ-3) НМ, сформульованим з ТХО оад'ювантом протеїну бичачого парагриповірусу-З3 (ВРІ-3) НМ, який використовували як антиген. 00415) Через приблизно сім тижнів після першої ін'єкції, визначили, що всі чотири з кіз мали достатньо високі концентрації антитіла в сироватці (ЗМ понад 1000), щоб почати робити кровотечі для сироватки. Утворення кровотеч починали через один тиждень після четвертої імунізації. Кров збирали для сироватки з інтервалом в тиждень протягом трьох тижнів.

Сироватку від кожної кози об'єднували для окремих виробничих кровоточень. Всього З 187,50 мл сироватки збирали протягом приблизно З тижнів виробництва кровоточить. Сироватку обробляли та зберігали при -802С для оцінки а аналізах на основі ВРІ-3 НМ. 00416) Всю сироватку, зібрану з трьох кіз (Ж30, 31 та 35) розморожували при кімнатній температурі. Сироватку з кози за номером 34 не використовували через низьку реакцію антитіл в скринінгу ІФА. Дивись таблицю 47 (продукування РіІЗ-МН поліклонального антитіла: 5М відповідь та ефективність антигену за ІФА). 00417) Коза за номером 35, збирали 20 листопада 13, мала найнижчий об'єм доступної сироватки, 117 мл. Таким чином, 117 мл з кожної кози на колекцію збирали в стерильну 1 л

Маїдепе РЕТО ємність. Приблизно 1053 мл (9 х 117 мл) сироватки розливали в аліквотах 20, 50 мл в стерильні 60 мл МаІдепе РЕТО ємності та в аліквотах 50, 1,0 мл.

Таблиця 47 0 0111117111111ка1111111176 11111121 (00418) В результаті, дане дослідження при завершенні успішно генерувало всього З 187,5 мл цільної крові, зібраної з чотирьох кіз, яких неодноразово імунізували очищеним ВРІ-З3 протеїном, сформульованим з ТХО, протягом трьохтижневого періоду виробництва кровотеч.

Гарні титри поліклонального антитіла були згенеровані в сироватці. Достатні кількості очищеного реагенту отримували для застосування в призначеному аналізі іп-міїго. (004191) В 2010 році, ОБОА повідомив промисловість, що Ре! М др85/70 реагент захоплення, який використовується для | ЕШКОСЕЇ (Ф та МЕКЗБІРЕЇ! Ф аналізів не буде більше поставлятися.

Таким чином, мета даного дослідження полягала в тому, щоб створити козині поліклональні антисироватки з рекомбінантним Ре! М др70 протеїном для застосування в аналізах іп-міго. (00420) Попередні спроби отримання антитіл після вакцинації з ад'ювантом Фрейнда не були успішними. Дане дослідження було розроблено, щоб вакцинувати кіз 444 амінокислотним фрагментом рекомбінантного Е. соїї-експресованого Ре! М др70 протеїну, сформульованого з ад'ювантом. Починаючи з 40ї ін'єкції, дозу ін'єкція зменшували до 100 мкг Ре! М др70 протеїну (замість вихідної дози 282 мкг Бе! М др70 протеїну). Зміну дози було зроблено тому, що початкова доза в 282 мкг/мл викликала високу частоту реакцій в місці ін'єкції. Дозу спочатку зменшували до 100 мкг/мл, але потім підвищували до 150 мкг/мл для сьомої імунізації та залишали на такому рівні до кінця дослідження (всього 15 імунізацій). РВ5 буфер використовували, щоб компенсувати різницю в об'ємі дози, яка залишалася в 1 мл. (004211 Кров збирали з кіз, та однаразово титри антитіла визначали за допомогою прямого

ІФА аналізу та сендвіч-аналізу ІФА, щоб бути достатньо високими, сироватку збирали та поліклональні антитіл очищували. (00422) Шість здорових самок кіз порід Гамапспва та альпійських порід, які мали вік 1-3 роки та важили » 100 фунтів отримували для застосування в даному дослідженні. Кіз годували сіном та зерном, та кози мали досхочу доступ до води протягом всього дослідження. Загальні обстеження стану здоров'я проводили один раз на день. Доза 1 мл експериментальної вакцини вводили підшкірно кожній козі з інтервалами 21 день, всього 15 імунізацій вводили кожній з п'яти кіз, які завершили дослідження. Імунізації спочатку проводили в шию або задню ногу, змінюючи

Зо боки та місця для наступних імунізацій. Невеликі реакції, видимі в місці ін'єкції, спостерігалися після імунізацій. Коли імунізацію, проводили козам в пухку шкірі тільки краніальної правої задньої ноги, то повідомляли про випадок невеликого набряку, чутливості та помірну кульгавість у всіх кіз на наступний день. Наступні ін'єкції вводили в альтернативні боки шиї або ділянки над ребрами та як правило, добре переносились. Однак, ділянки над ребрами, як виявилось в кінцевому рахунку, були таким розташуванням, де ін'єкції найкраще переносились козами. (00423) Через приблизно вісім тижнів після першої ін'єкції визначили, що чотири з шести кіз (21, 22, 24, 25) мали достатньо високі концентрації антитіла в сироватці, щоб почати робити кровотечі для сироватки. Утворення кровотеч з двох кіз, які залишилися (23, 26) починали через п'ять тижнів пізніше. Кров збирали для сироватки з інтервалом в тиждень. Коза 25 була видалена з дослідження після шести тижнів проведення збору крові. Вона була кульгавою після прибуття та відображалась постійна кульгавість, незважаючи на лікування Вапатіпе. Евтаназія була специфічною для термінального кровоточення та введеною в місце процедури, щоб забезпечити максимальний збір об'єму крові. Сироватку з кожної кози об'єднували для окремих утворень кровотеч. В цілому 26,7 л сироватки збирали протягом В цілому 26,7 л сироватки збирали протягом приблизно 7 місяців утворень кровотеч.

І00424| Несподівано виявилося, що у кози 24 розвинулась псевдо вагітність під час дослідження. Молоко збирали від даної кози протягом »3 місяців, всього зібрали 300 л молока, доступного для збору антитіла. Протокол був розроблений для очищення високого рівня БеЇ М др70 поліклонального антитіла з молока. (00425) Антитіла були очищені з двох різні дат з 500 мл об'єднаної сироватки від кози 24, застосовуючи Протеїн С афінну хроматографію в Маїпе ВіотесппоЇоду 5егмісе5. Всього 6388 мг

(321 мл 19,9 мг/мл) та 7343 мг (348 мл 21,1 мг/мл) очищених козиних анти-Ре! М др70 антитіл отримували для оцінки в аналізах на основі Ре! М. (00426) Зразки крові(приблизно 25 мл/зразок) збирали в 12,5 мл пробірки сепаратора для сироватки (551Т:) через чотирнадцять днів після кожної вакцинації для визначення концентрацій антитіл до Ге! М др70. 557 помічали ІО кози та датою збору. Після того, як аналізи визначили, що титри антитіл др70 Ре! М на основі інтенсивності сигналу ІФА для тваринного були в прийнятній концентрації, виробництво колекції починали з цієї тварини. Об'єми крові, відібрані від кожної кози були визначені на основі маси кози, щоб отримати максимальний об'єм крові.

Рекомендації ІАСОС дозволяють збирати до 7,5 95 від об'єму крові щотижня.

І00427| Кров збирали в 12,5 мл 551 для створення колекцій. Після закінчення дослідження, кіз піддавали евтаназії шляхом термінального кровоточення та таку кров також збирали для збору антитіла. Всі пробірки маркували ІО кози та датою збору.

І00428| Крові давали згорнутися при кімнатній температурі. Після центрифугування, сироватку збирали та переносили в поліпропіленові флакони. Збирали сироватку, зібрану з різних 55Т, від однієї кози на день збору. Сироватка тримали на кризі доки не передавали для очищення. Коротка інформація про продукцію представлена в таблиці 48.

Таблиця 48 (мл) (мл) 00429) Коза 24 продукувала сироватку з найвищими концентраціями антитіла з усіх кіз. (00430) Очищені антитіла в сироватці від кози 24 в порівнянні з ОБОА 94-06 як реагентом захоплення, застосовуючи Ре! М дар70 С1108, детектування тАБ в сандвіч-аналізі ІФА показало аналогічну дозу-відповідь. Очищену сироватку від кози 24 порівнювали з О5БОА 94-06 реагентом, застосовуючи Вестерн-блот через здатність детектувати Бе! М др85/70 протеїн.

Аналогічний Вестерн-блот профіль спостерігали між поточним захопленням, 94-06 та новим захопленням кози 24, за виключенням того, що додаткова «15 кДа смуга спостерігалась із захопленням кози 24. Дані з використанням нового антитіло захоплення показали, що поточний еталон має різні форми кривих доза-відповідь, ніж поточний реагент, коли його застосовують для захоплення еталону та серій, які досліджують.

Зо І00431| Обидва апгепааїі-Ре! М др70, очищені від сироватки, та молоко функціонували добре як реагент захоплення в аналізах Ре! М ІФА. 00432 Додаткові дослідження ведуться, як це передбачено в таблиці 49.

ІЇ00433| Очікується, що кожен з препаратів (антигенів, розкритих в таблиці 49 та з добавленим як ад'ювант ТХО) будуть викликати достатньо високі серологічні титри (понад 1000, або більш переважно, понад 5000, або більш переважно, понад 10000, або більш переважно, понад 50000, або більш переважно, понад 100000, або більш переважно, понад 250000, або більш переважно, понад 500000, або більш переважно, понад 1000000) у, щонайменше, однієї тварини (переважно, щонайменше, у 2 тварин, або більш переважно, щонайменше, у трьох тварин, або найбільш переважно, у кожної обробленої тварини), таким чином, даючи в результаті достатню кількість антитіл для діагностичних або дослідницьких застосувань. бо

Таблиця 49 оовижено (УС | вв | Дегееать | обенобраної | МУ

Антиген Джерело АВ5 | об'єм зібраної ' (мкгу/доза | джерело (М) М сироватки

Альфа токсин

Стозідіт 100 мкг Коза (3) Сироватка | 3,31 л/діючий 10 репіпдепо (інактивований)

Бета токсин

Сіовігіаїйт 100 мкг Коза (3) Сироватка | 3,93 л/діючий репіпдепо (інактивований)

Епсілон токсин

Стозідіт 100 мкг Коза (3) Сироватка | 4,07 л/діючий 10 репіпдепо (інактивований) сти не | ен сш.) 000 вен очищений протеїн цільноклітинний інактивований

Вгаснузріга 150 мкг Коза (3) Сироватка З/діючий

Нуодузепіегіає (штам В204)

Пепсиновий гідролізат

Нуодузепіегіає

ВА2019-12 штам) 00434) Всі публікації, цитовані в описі, як патентні публікації, так і непатентні публікації, свідчать про високу кваліфікацію фахівців в даній галузі, до якої відноситься даний винахід. Всі дані публікації є в повному обсязі включеними в даний документ у вигляді посилання в тій самій мірі, як би, якщо кожна окрема публікація була конкретно та індивідуально вказана як включена за допомогою посилання.

Ї00435) Хоча винахід в даному документі був описаний з посиланням на конкретні варіанти здійснення, слід розуміти, що дані варіанти здійснення є лише ілюстраціями принципів та застосувань за представленим винаходом. Тому слід розуміти, що численні модифікації можуть бути зроблені на ілюстративні варіанти здійснення, та що інші механізми можуть бути розроблені без відступу від суті та обсягу представленого винаходу як визначено наведеною нижче формулою винаходу.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«поз ОТ Є

МОВБЕБВОМ ВЕББАКСН М ТТОТЕ

ПОМОЖУЕКІ, Раці Тохерв

ЖНМЕБ, Глваев

ВО, Вели Ї.

МОНЕ, ваогі

СА, СпеПето

НАВОНАМ, ва Могдавй

КНЕВХ, Віспнк ее

МОНТЕ, Баг Али Маг:

МАНАМ, Зап

МЕГНКАТТА, Ззпейа

М'УАМСЇ, Глас

ВА Из Кк.

ЗАТМОМ, Затай А

УОВА, Впашвлак

ЕСОМІТАЇМЕ, Місваві Спгіморвет

ЗМІН, Юа Сеогре Білене

КІТАЕРАТВІСК, Ле ГТ увів.

ПОЧАСТНВ. МИНата 1ІАСИАВА, Авйв МотегаАМ «120» Ал 'юванти на основі ет «ІЗ» АРОЮВІ5А «141х МН ачЧЮ»ТО «ІЩу» 51579959 «І 2013-09-19 «60» 14 «ГНЕ РшєвивВ ето 35 «відм і «ДІ «7» ДНК «кві3» Штучна послідовність ках «ві» ДиК «Ам 1

«ві» 23 «1 ДНК «вії» Штучна послідовність «Де» «ва» Ср олігонуклеотид «я нкх існісввева (рорсрсрвсв св Б «ках 3 «ії 53 «ій» ДНК «1» Штучна послідовність «Хуу» «вам СрОо олігонуклеотия «нм юрясвіснвісросвсисв ос 23 «105 3 «ар» за «аа» ДНК «213» Штучна поспідовність «ВД «аа Срородігонуклеотих кю» У ісввслісов'існпоснснся сс 24 «Цю 4 «і» ха «вій» ДИК «віз» Цітучна послідовність «аа «ої Сро олігонуклеотид ка» Ознака «ва1» модианкована основа «а «аа» 5Мод-д дечокоіуридни «НН 4 певастієдвісвосвсюсв сор я

«0» 5 «а» ря «із» ДНК «213» Штучна послідовність «вах «3» Сроолігонуклестид ха» Суенака «01» модифіконана основа кад С «но» У Мод «дезокоуУриди «НК 5 петасрісов сорсвсосв ссві а «а в «віх Я «І ДНК «13» ЦПегучна послідовність «ам» «аі» Сро олігонуклеотия «им» Ознака «021» моднфіковина основа «ша (ГА «ау» У-«МНоде» «дезокогуридни «щЮ» б псрасвісла ісросвенев сові Я «А 7 «ії» 23 «12» ДИК «Ф1Же Штучна послідовність «М» «ой Сро опігонуклеотид «вай Ознака кий» модифікована основа «ай «да» У-Етил-й «дезоксіуридни «МК 7 перасивісва срососнсв сов 73 «ДЦ» й «11 а «ія» ДИК «13» Штучна послідеавність «о кан Ст слігонуклеотий «ай» Ознака «аа1» модиінкована основа «ай ОСЛА «да» 5Йод-о-дезоксіуридии «ще Я пешіснаснла сорсивссв ос Я «0» 5 «1» За «ВХ» ДиК «аІ13» Штучналюєліловність ка «а» СК олігонуклеотид «дк» Озвака «ваї» модифікованя основи «аа (1 «АХ» 5«Мод-» дезоксуридии о» 9 перісваова іскослвесо сої 8 «ах 10 «1 3 «а» ДАК «13» Штучна послідовать «ах «ай СРО ол онуклеотид «Ам 10 ісвісвноря ісвлевсров ссд Кк

«АН «1» 20 «ма» ДНК «ах» Цігучна послідовнієть «0» «аа ВЕНК «а» звик чеше 20 «і» 15 «1» зо «ах» ДНК «1 Піхучна послідонннть «Ах «аз» НК «13 повачацнац часа 20 «о» 13 каі1х 19 «й» ДНК «ії» ПШітучни послідовність «Ох «3» РНК «мн 13 зайсриеєсав кеаданево 15 ка» 18 «1» а «12» ДИК «21У» Штучна послідовиеть «Оу «а3» ДИКЛНК «Ак Сюмака «ої» Мате Кеу: зміш сзнака. «ай ПТ «3» рибонуклеотиди «м 14 ісвевий виодиецеї хі

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Вакцинна композиція, яка містить ефективну кількість антигену та ад'ювантну композицію, яка містить олійну фазу та водну фазу, причому: а) олійна фаза складає щонайменше 36 95 об./об. композиції; Б) вказана композиція містить монофосфорильний ліпід А (МРІ-А) або його аналог та імуностимулюючий олігонуклеотид; с) вказана вакцинна композиція являє собою емульсію вода-в-олії; і антиген вибирають з групи, яка складається з антигену Еітегіа тахіта, антигену Сіовігідійт регітіпдеп5, антигену Меозрога та антигену Спіатудорпйа аропів.

2. Вакцинна композиція за пунктом 1, в якій імуностимулюючий олігонуклеотид являє собою Сро або олігорибонуклеотид; ад'ювантна композиція додатково містить: а) полікатіонний носій, вибраний з групи, яка складається з декстрану, декстрану ОЕАЕ (та його похідні), ПЕГ, гуарових смол, похідних хітозану, похідних поліцелюлози, поліетиленіміну, поліамінів; і р) необов'язково, четвертинний амін, вибраний із групи, яка складається з ОБА та авридину.

3. Вакцинна композиція за будь-яким одним з пунктів 1-2, яка додатково містить принаймні один зі стеролу та полі І:С.

4. Вакцинна композиція за пунктом 3, яка містить стерол та додатково містить сапонін.

5. Вакцинна композиція за будь-яким одним з пунктів 1-4, яка містить принаймні один антиген Еїітегіа тахіта або Сіовігідішт регігіпдепв5.

6. Застосування вакцинної композиції за пунктом 5 для лікування або профілактики інфекцій, викликаних Еїтегіа тахіта або Сіовігідічт регітіпдеп5 у домашньої птиці.

7. Вакцинна композиція за будь-яким одним з пунктів 1-4, в якій антиген містить Меозрога антиген.

8. Застосування вакцини за пунктом 7 для лікування або профілактики інфекції, викликаної Меозрога у собак.

9. Вакцинна композиція за пунктом 3, яка містить Спіатуаорпйа абогіїх антиген та додатково Зо містить полі ІС.

10. Застосування вакцини за пунктом 9 для лікування або профілактики викидня у овець, викликаного С. арогіі5.