JP2018203770A - 油性アジュバント - Google Patents

Abstract

【課題】免疫原性組成物およびワクチン組成物中で使用するための抗原への免疫応答を増強するアジュバント製剤の提供。【解決手段】油相および水相を含むアジュバント製剤であって、前記油相が、前記製剤の少なくとも５０％ｖ／ｖを占め、前記製剤が、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体および免疫刺激性オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方を含み、ただしａ）前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、存在しない場合、前記製剤が、ｉ．ポリＩ：Ｃ、糖脂質、および所望により第四級アミン、またはｉｉ．ポリカチオン性担体を含み、ｂ）前記モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体が、存在しない場合、前記製剤が、アルミニウムの供給源を含むこと、を条件とする、アジュバント製剤。【選択図】なし

Description

［０００１］ 本発明は、一般に、免疫原性組成物およびワクチン組成物中で使用するための抗原への免疫応答を増強する新規アジュバント製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に関する。本発明はまた、アジュバント、免疫原性組成物およびワクチン組成物の調製および使用の方法に関する。

［０００２］ 細菌、ウイルス、および寄生虫の感染は、ヒトおよび動物に蔓延している。これらの感染病原体により引き起こされた疾患は、多くの場合、抗菌医薬療法への耐性を示し、処置の効果的手段を見出せないままになる。結果として、感染性疾患を制御するために、ワクチン学的アプローチが益々利用されるようになっている。感染性病原全体を化学的不活化または適切な遺伝子操作の後に、ワクチン製剤中での使用に適合させることができる。あるいは病原のタンパク質サブユニットを組換え発現系の中で発現させて、ワクチン製剤中での使用に向けて精製することができる。ワクチンは、該組成物中に適当なアジュバントを含むことで、より有効にすることができる。

［０００３］ 用語「アジュバント」は、一般に、抗原への液性または細胞性免疫応答を増強させる任意の材料を指す。アジュバントは、注射部位からの抗原の放出を遅延させる、および免疫系の刺激を高める、という２つの目的を果たすために用いられる。伝統的ワクチンは、一般に、不活化または死菌または変性生病原性微生物の粗調製物で構成されている。病原性微生物のこれらの培養物に関連する不純物は、免疫応答を増強するアジュバントとして作用し得る。しかし、病原性微生物または精製タンパク質サブユニットの均質調製物を抗原として使用するワクチンによって誘発される免疫は、多くの場合、不十分である。それゆえ、アジュバントなどの特定の外来物質の添加が必要になる。さらに幾つかの例では、合成およびサブユニットワクチンは、製造に費用がかかる場合がある。同じく幾つかの例では、病原体を商業的規模で増殖させることができず、このため合成／サブユニットワクチンは、実行可能な選択肢に過ぎないことになる。アジュバントの追加により、同様の免疫応答を刺激する抗原をより少量で使用することができ、それによってワクチンの製造コストを削減することができる。したがって幾つかの注射可能な医薬品の有効性は、それをアジュバントと一緒に用いた場合に有意に増大し得る。

［０００４］ 多くの因子が、アジュバント選択の際に考慮されなければならない。アジュバントは、毒性、アレルギー誘発性、刺激性、および宿主への他の望ましくない作用が最小限の効率的手法で、抗原の放出および吸収を比較的緩やかな速度で起こさなければならない。アジュバントは、望ましいものにするために、非死滅ウイルス作用性で、生体分解性があり、一貫して高レベルの免疫生成が可能で、交差防御の刺激が可能で、複数の抗原に適合性があり、複数の種に有効で、非毒性で、宿主に対して安全でなければならない（例えば、注射部位への反応がない）。アジュバントの他の所望の特性は、微量投与が可能であり、用量を節約し、優れた貯蔵安定性を有し、乾燥に適応可能で、オイルフリーにすることができ、固体または液体のいずれかとして存在することができ、等張性で、容易に製造され、製造が安価なことである。最後に、アジュバントを、ワクチン接種シナリオの要件に応じて、液性もしくは細胞免疫応答のいずれか、またはその両方を誘導するように構成させ得ることが、必要に望ましい。しかし、上記要件に適合し得るアジュバントの数は、限られている。

［０００５］ アジュバントの選択は、それが抗体応答の規模または機能の増加、細胞媒介性免疫応答の増加、粘液性免疫の誘導、または抗原用量の減少になるかどうかにかか
わらず、ワクチンの要件に依存する。複数のアジュバントが提案されたが、全てのワクチンに理想的に適することが示されたアジュバントはない。文献で報告された最初のアジュバントは、マイコバクテリウムの油中水エマルジョンおよび抽出物を含むフロイント（Freund）完全アジュバント（ＦＣＡ）であった。不幸にもＦＣＡは、忍容性が不良で、非制御的炎症を引き起こし得る。８０年よりも昔のＦＣＡの発見以来、アジュバントの非適切な副作用を低減することに努力が注がれてきた。

［０００６］ アジュバントとして用いられた幾つかの他の材料として、金属酸化物（例えば、水酸化アルミニウム）、ミョウバン、塩の無機キレート化剤、ゼラチン、様々なパラフィン型オイル、合成樹脂、アルギン酸塩、ムコイドおよび多糖類化合物、カゼイン塩、フィブリン塊などの血液由来物質が挙げられる。これらの材料は、一般に、免疫系を刺激するのに有効であるが、宿主における有害作用（例えば、無菌膿瘍の生成、臓器の損傷、発癌性、またはアレルギー誘発性の応答）または望ましくない医薬特性（例えば、注射部位からの急速な分散もしくは低い分散制御性、または該材料の膨潤）のために、全体として十分であることが見出されたものはない

［０００７］ 本発明は、ワクチンに有用な新規なワクチン組成物およびアジュバント製剤を提供する。

［０００８］ 第一の態様において、本発明は、油相および水相を含むアジュバント製剤であって、該油相が、該製剤の少なくとも５０ｖ／ｖ％を占め、前記製剤が、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体および免疫刺激性オリゴヌクレオチドの少なくとも一方を含み、ただし、ａ）前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、存在しない場合、該製剤が、ポリＩ：Ｃと糖脂質と所望により（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）第四級アミン；またはポリカチオン性担体を含み、ｂ）前記モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体が、存在しない場合、該製剤が、アルミニウムの供給源および所望によりポリカチオン性担体を含むことを条件とする、アジュバント製剤を提供する。

［０００９］ 異なる実施形態において、該油相は、油、および所望により脂溶性乳化剤を含み得る。

［００１０］ 幾つかの実施形態において、前記モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）またはその類似体の両方が、該アジュバント製剤中に存在する。これらの実施形態において、該製剤は、ステロール（例えば、コレステロール）、ポリＩ：Ｃまたはそれらの組み合わせをさらに含む。

［００１１］ 特定の組の実施形態において、該アジュバント製剤は、該油および該選択的な乳化剤（複数可）に加えて、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体と、ステロールと免疫刺激性オリゴヌクレオチド（「ＴＣＭＯ」）と、の組み合わせを含む。該アジュバント製剤は、ポリＩ：Ｃ（「ＴＣＭＹＯ」）および／またはサポニン（それぞれ「ＱＴＣＭＯ」または「ＱＴＣＭＹＯ」）も所望により含み得る。

［００１２］ さらに別の実施形態において、該アジュバント製剤はまた、該油および該選択的な乳化剤（複数可）に加えて、第四級アミン、糖脂質、ＭＰＬ−Ａもしくはその類似体、およびポリＩ：Ｃ（「ＯＤＹＲＭ」）、の組み合わせを含む。

［００１３］ さらなる組の実施形態において、該アジュバント製剤はまた、該油およ
び該選択的な乳化剤（複数可）に加えて、サポニン、ステロール、第四級アミン、およびポリカチオン性担体、の組み合わせを含むが、ただし、前記ポリカチオン性担体が、デキストランＤＥＡＥである場合、該抗原が、大腸菌J-5（E coli J-5）バクテリン（「ＱＣ
ＤＸＯ」）ではないことを条件とする。

［００１４］ さらなる実施形態において、該アジュバントは、該油および該選択的な乳化剤（複数可）に加えて、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、アルミニウム供給源、および所望によりポリカチオン性担体（それぞれ「ＴＯＡ」および「ＴＸＯ−Ａ」）を含み得る。

［００１５］ 第二の態様において、先に引用された実施形態のいずれかによるアジュバント製剤は、抗原成分を含むことでワクチン組成物を形成し得るが、ただし該アジュバント製剤が、ＤＥＡＥデキストラン、Quil A、コレステロール、およびＤＤＡからなる（または本質的にそれらからなる）場合、または該アジュバント製剤が、ＤＥＡＥデキストランおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチドからなる（または本質的にそれらからなる）場合、該抗原が、E coli J-5タンパク質でないことを条件とする。特定の実施形態において、この態様のワクチンは、ウシ、ヒツジ、ウマ、またはブタを罹患させる病原に由来する抗原（複数可）を含む。他の実施形態において、この態様のワクチンは、家禽またはネコ科動物を罹患させる病原に由来する抗原（複数可）を含む。

［００１６］ 本発明のさらなる態様において、該抗原化合物と該アジュバント製剤との異なる組み合わせが、提供される。

［００１７］ より具体的には、第三の態様において本発明は、アイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）および／またはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）抗原およ
びアジュバント製剤を含むワクチン組成物を提供する。この第三の態様の異なる実施形態において、該アジュバント製剤は、該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、ポリカチオン性担体、および所望により免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含み得る。本発明のこの態様に別の実施形態において、本発明は、該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ステロール、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体を含むアジュバント成分を含むワクチン組成物を提供する。

［００１８］ 第四の態様において、本発明は、ネオスポラ（Neospora）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物を提供する。この態様による本発明の異なる実施形態において、該アジュバント製剤は、該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体を含む。他の実施形態において、該アジュバント製剤は、該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびポリカチオン性担体を含む。

［００１９］ 第五の態様において、本発明は、クラミジア症（Chlamydophila abortis）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、該アジュバント製剤が
、該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、ステロール、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体、およびポリＩ：Ｃを含む、ワクチン組成物を提供する。

［００２０］ 第六の態様において、本発明は、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis（S. uberis））抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物で
あって、該アジュバント製剤が、該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、およびポリカチオン性担体を含む、ワクチン組成物を提供する。本発明のこの第六の態
様の異なる実施形態において、該アジュバント製剤はまた、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む。代わりまたは追加として、該アジュバント製剤は、サポニン、ステロール、および第四級アミンを含み得る。

［００２１］ 第七の態様において、本発明は、抗原性成分としてのミオスタチン、およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、該アジュバント製剤が、該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびポリカチオン性担体またはＭＰＬ−Ａもしくはその類似体のいずれかを含む、ワクチン組成物を提供する。本発明のこの態様による一組の実施形態において、該アジュバント製剤は、ＭＰＬ−Ａまたはその類似体を含む。この組の幾つかの実施形態において、該アジュバント製剤は、前記ワクチン組成物５０μｌあたり０．５μｇ未満のステロールを含み、好ましくはコレステロールを含まない。ミオスタチンの選択は、対象の種に依存する。１つの選択された実施形態において、選択された動物種は、ニワトリであり、ミオスタチンの供給源は、ニワトリミオスタチンである。

［００２２］ 第八の態様において、本発明は、Aピオゲネス（A. pyogenes）（正式にはアルカノバクテリウム・ピオゲネス（Arcanobacterium pyogenes）、アクチノマイセス・ピオゲネス（Actinomyces pyogenes）またはコリネバクテリウム・ピオゲネス（Corynebacterium pyogenes）として知られ、現在はトルペレラ・ピオゲネス（Trueperella pyogenes）として知られる）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、該アジュバント製剤が、該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびポリカチオン性担体を含む、ワクチン組成物を提供する。

［００２３］ 第九の態様において、本発明は、E coli抗原、BRV抗原もしくはBCV抗原、およびアジュバント製剤、を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびにポリカチオン性担体およびアルミニウム供給源の少なくとも一方を含む、ワクチン組成物を提供する。

［００２４］ 第十の態様において、本発明は、オウシマダニ（Rhipicephalus microplus）抗原およびアジュバントを含むワクチン組成物であって、前記アジュバントが、ａ
）免疫刺激性オリゴヌクレオチド、サポニン、ステロール、第四級アミン、ポリアクリルポリマー、および糖脂質を含む水性アジュバント、ならびに、ｂ）該ワクチン組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相を含み、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性担体を含む油性アジュバント、からなる群から選択される、ワクチン組成物を提供する。

［００２５］ 第十一の態様において、本発明は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記ワクチン組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびポリカチオン性担体を含む、ワクチン組成物を提供する。異なる実施形態において、該口蹄疫ウイルス抗原は、野生型ＦＭＤＶ、遺伝子修飾および／もしくは弱毒化ＦＭＤＶ株、または組換え発現されたＦＭＤＶ構造タンパク質、例えば血清型Ａ、Ｃ、Ｏ、Ａｓｉａ １、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、またはＳＡＴ３のウイルス様粒子（ＶＬＰ）のいずれかであり得る。

［００２６］ 第十二の態様において、本発明は、診断または治療抗体の生成方法であって、供給動物を本発明の第一の態様による実施形態のいずれかによるアジュバント製剤および抗原で免疫化し、次に該供給動物から該抗体の供給源を抽出すること、そして必要に応じて該抗体を精製すること、を含む、方法を提供する。

［００２７］ 特定の実施形態において、該供給動物は、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ウシ類動物、ヤギ、ウサギ、ウマ、ブタ類動物、またはヒツジである。幾つかの他の実施形態において、該供給動物は、ネコまたはイヌである。

［００２８］ ポリクローナル抗体に特に適した幾つかの実施形態において、該抗体の供給源は、血清または乳である。モノクローナル抗体に適した実施形態において、抗体の適切な供給源は、脾臓細胞である。

［００２９］ 特定の実施形態において、該アジュバント製剤は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性担体を含む。該アジュバントは、アルミニウム供給源を含む、アルミニウム供給源を所望により含有してもよく、該アルミニウム供給源は、水酸化アルミニウムゲルであってもよい。特定の実施形態において、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧであり、該ポリカチオン性担体は、ＤＥＡＥデキストランである。

［００３０］ 特定の実施形態において、該抗原は、ＦｅＬＶｇｐ７０、ウシパラインフルエンザ−３ ＢＰＩ−３（ＨＮタンパク質）、ヒストフィルス・ソムニ（Histophilus somni） p31、ボルデテラ（Bordetella ）FHA、パラポックス、ＢＶＤＶ１ ｇｐ５３
、ＢＶＤＶ２ ｇｐ５３、クロストリジア毒、イヌサーコウイルス、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア（Brachyspira hyodysenteriae） （ブタ種）抗原；不活化およびペプシ
ン消化不活化された全細胞から選択され得る。

［００３１］ 本発明はまた、本発明の第３〜第１２の態様による、ワクチンの使用方法を提供する。

［００３２］ 測定可能な数多くの変数に関連して用いられる「約」または「およそ」は、「約３週間」を１７〜２５日とし、約２〜約４週間を１０〜４０日とする、週の時間間隔に関して約が用いられる場合を除き、変数の指示された値、ならびに、該指示された値の実験誤差以内に入る（例えば、平均の９５％信頼区間内に入る）変数の全ての値または該指示された値の１０％以内に入る変数の全ての値のうちのいずれか大きい方、を指す。

［００３３］ 「アジュバント」は、抗原への液性または細胞性免疫応答を増強する任意の物質を意味する。アジュバントは、一般に、注射部位からの抗原の放出制御、および免疫系の刺激、という２つの目的を果たすために用いられる。

［００３４］ 「アジュバント製剤」は、免疫賦活特性を有する製剤を指す。

［００３５］ 「アルキル」は、直鎖状および分枝状の両方の飽和炭化水素部分を指す。

［００３６］ 「アミン」は、窒素を含有する化合物を指す。アミンは、水素原子を炭化水素基で置換することによりアンモニアから得られた化合物群である。「第四級アミン」は、炭化水素基を４つ有するアンモニウム塩基の化合物を指す。

［００３７］ 「抗体」は、特異的抗原への免疫応答の結果、その抗原に結合し得る免疫グロブリン分子を指す。免疫グロブリンは、「定常」および「可変」領域を有する「軽」および「重」ポリペプチド鎖で構成された血清蛋白質であり、定常領域の構成に基づいて分類（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）に分別される。

［００３８］ 「抗原」または「免疫原」は、動物の免疫系により認識され、免疫応答を生成する、任意の物質を指す。該用語は、死滅、不活化、弱毒化、または変性生細菌、ウイルスまたは寄生虫を包含する。用語「抗原」はまた、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、合成ペプチド、タンパク質抽出物、細胞（腫瘍細胞を含む）、組織、多糖もしくは脂質、またはそれらの断片を個別に、または任意の組み合わせで包含する。用語「抗原」はまた、抗イディオタイプ抗体またはその断片などの抗体、ならびに、抗原または抗原決定基（エピトープ）を模倣し得る合成ペプチドミモトープ、を包含する。

［００３９］ 「バクテリン」は、ワクチンまたは免疫原性組成物の成分として用いられ得る１種または複数の死菌の懸濁物を意味する。

［００４０］ 「緩衝剤」は、別の化学物質の濃度変化を予防する化学系を意味し、例えばプロトン供与および受容系は、水素イオン濃度（ｐＨ）の顕著な変化を予防する緩衝剤として作用する。緩衝剤のさらなる例は、弱酸とその塩（コンジュゲート塩基）または弱塩基とその塩（コジュゲート酸）の混合物を含む溶液である。

［００４１］ 「細胞性免疫応答」または「細胞媒介性免疫応答」は、Ｔリンパ球もしくは他の白血球細胞またはそれらの両方により媒介される免疫応答であり、活性化されたＴ細胞、白血球細胞またはそれらの両方により産生されるサイトカイン、ケモカインおよび類似分子；あるいは感染された細胞を死滅させるＴリンパ球または他の免疫細胞の応答を包含する。

［００４２］ 「コンパニオンアニマル」は、イヌ、ネコおよびウマを指す。

［００４３］ アジュバント製剤に適用される「本質的に〜からなる」は、列挙されていないさらなる免疫賦活剤または免疫調整剤を、測定可能な免疫賦活作用または免疫調整作用を発揮する量で含まない製剤を指す。

［００４４］ 「遅延型過敏反応（ＤＴＨ）」は、免疫系が外来物質として認識する抗原への暴露後２４〜７２時間で発症する炎症反応を指す。このタイプの免疫応答は、抗体（Ｂ細胞により生成される）よりもむしろ主にＴ細胞を含む。

［００４５］ 「用量」は、対象に与えられるワクチンまたは免疫原性組成物を指す。「初回用量」または「プライムワクチン」は、０日目に与えられるそのような組成物の用量を指す。「二回目の用量」または「３回目の用量」または「年間用量」は、初回用量に続いて与えられるそのような組成物の量を指し、初回用量と同じワクチンまたは免疫原性組成物であっても、またはそうでなくてもよい。

［００４６］ 用語「乳化剤」は、本開示においては広範に用いられる。それには、乳化剤として一般に許容される物質、例えばTWEEN（登録商標）またはSPAN（登録商標）製
品類（それぞれ、ポリエトキシル化ソルビトールの脂肪酸エステル、および脂肪酸置換されたソルビタン界面活性剤）の異なる製品、およびＰＥＧ−４０ひまし油または別のＰＥＧ化水添油などの溶解度の異なる溶解度上昇剤がある。

［００４７］ 「液性免疫応答」は、抗体により媒介される免疫応答を指す。

［００４８］ 対象における「免疫応答」は、抗原に対する液性免疫応答、細胞性免疫応答、または液性および細胞性免疫応答の発生を指す。免疫応答は、通常、当該技術分野
で公知である標準の免疫アッセイおよび中和アッセイを利用して決定され得る。

［００４９］ 抗原の「免疫学的防御量」または「免疫学的有効量」または「免疫応答を生じるための有効な量」は、レシピエントにおける免疫原性応答を誘導するのに効果的な量である。免疫応答は、診断目的もしくは他のテストに十分であり得るか、または疾患病原体への感染により引き起こされる有害な健康作用もしくはその合併症をはじめとする疾患の兆候もしくは症状を予防するのに適し得る。液性免疫もしくは細胞性免疫のいずれか、またはそれらの両方が、誘導され得る。免疫原性組成物に対する動物の免疫原性応答は、例えば抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイを通して間接的に、または野生株でのチャレンジ後の兆候および症状をモニタリングすることにより直接、評価され得るが、ワクチンにより付与される防御免疫は、例えば対象の死亡率、疾病率、体温、全体的身体状態、ならびに全体的健康および行動などの臨床兆候の低減を測定することにより評価され得る。免疫応答は、細胞性および／または液性免疫の誘導を含み得るが、これらに限定されない。

［００５０］ 「免疫原性」は、免疫または抗原応答を誘発することを意味する。したがって免疫原性組成物は、免疫応答を誘導する任意の組成物である。

［００５１］ 「免疫刺激性分子」は、非抗原特異性の免疫応答を刺激する分子を指す。

［００５２］ 「脂質」は、水に不溶性で非極性有機溶媒に可溶性であり、油性の触感であり、炭水化物およびタンパク質と一緒になって生存細胞の主要な構造材料を構成する、脂肪、油、ワックス、ステロールおよびトリグリセリドをはじめとする有機化合物群のいずれかを指す。

［００５３］ 「医薬的に許容し得る」は、正しい医学的な判断（sound medical judgment）の範囲内であり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを生じずに対象の組織と接触する使用に適し、合理的な利益・リスク比と相応であり、それらの意図する使用に効果的である物質を指す。

［００５４］ 用語「ポリＩ：Ｃ」は、例えば安定した主鎖を有し、好ましくはTLR-3
アゴニスト活性を有する、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸の天然由来ポリマーおよびそれらの合成形態を指す。

［００５５］ 「反応誘発性」は、アジュバント、免疫原性またはワクチン組成物の投与に応答して対象の体内で誘起される副作用を指す。それは、投与部位に生じる可能性があり、通常、多数の症状の発症に関して評価される。これらの症状は、炎症、発赤、および膿瘍を含み得る。それはまた、発生率、期間、および重症度に関して評価される。「低」反応は、例えば動悸によって検出できるだけで目によって検出できない腫脹を含み、短期間のものである。より重度の反応は、例えば目で確認できるか、または長期間のものである。

［００５６］ 「室温」は、１８〜２５℃の温度を意味する。

［００５７］ 「サポニン」は、ステロイドまたはトリテルペノイドのいずれかの構造の疎水性領域と会合した親水性領域（通常、複数の糖鎖）で構成された植物起源の表面活性グリコシドの群を指す。

［００５８］ 「ステロイド」は、有機溶媒に易可溶性で水にわずかに可溶性である、
脂質の生化学的分類に属する有機化合物の群のいずれかを指す。ステロイドは、３つの縮合シクロヘキサン（六炭素）環＋四番目のシクロペンタン（五炭素）環の四縮合環系を含む。

［００５９］ 「ステロール」は、テルペノイド前駆体から生物学的に生成される動物体内の化合物を指す。それらは、通常は３位炭素に結合した、ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するステロイド環構造を含む。脂肪酸置換基の炭化水素鎖は、通常は長さが炭素原子１６〜２０個で変動し、飽和または不飽和であり得る。ステロールは、一般に、環構造内の１つまたは複数の二重結合と、環に結合した様々な置換基を含む。ステロールおよびその脂肪酸エステルは、本質的に水に不溶性である。

［００６０］ 「対象」は、アジュバント組成物の投与が望ましい任意の動物を指す。それは、霊長類、家畜、コンパニオンアニマル、実験動物、捕獲された野生動物、鳥類（卵を含む）、爬虫類、および魚類などの哺乳動物および非哺乳動物が挙げられる。したがってこの用語は、サル、ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、他の家禽、カエル、およびトカゲを包含するが、これらに限定されない。

［００６１］ 「ＴＣＩＤ_５０」は、「組織培養感染用量」を指し、接種された細胞培養物の所与のバッチの５０％感染に必要となるウイルス希釈物と定義される。本明細書全体で利用されるスピアマン・カーバー（Spearman-Karber）法など、様々な方法を利用し
て、ＴＣＩＤ_５０を計算することができる。B. W. Mahy & H. O. Kangro, Virology Methods Manual, p. 25-46 (1996)を参照されたい。

［００６２］ 「治療有効量」は、ウイルスまたは細菌などの病原への感染により引き起こされる、有害な健康作用またはその合併症をはじめとする疾患の兆候または症状を予防または低減するのに十分である、抗原またはワクチンを受ける対象における免疫応答を誘導する抗原またはワクチンの量を指す。液性免疫もしくは細胞性免疫、または液性および細胞性の両方の免疫が、誘導され得る。ワクチンへの動物の免疫原性応答は、例えば抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイを通して間接的に、または野生株でのチャレンジ後の兆候および症状をモニタリングすることにより直接、評価され得る。ワクチンにより付与される防御免疫は、例えば対象の死亡率、疾病率、体温、全体的身体状態、ならびに全体的健康および行動などの臨床兆候の低減を測定することにより評価され得る。治療的に有効となるワクチン量は、用いられる特定のアジュバント、用いられる特定の抗原、または対象の状態に応じて変動してもよく、当業者によって決定され得る。

［００６３］ 「処置すること」は、そのような用語が適用される障害、疾病もしくは疾患を予防すること、またはそのような障害、疾病もしくは疾患の１つもしくは複数の症状を予防もしくは低減することを指す。

［００６４］ 「処置」は、先に定義された「処置すること」の行動を指す。

［００６５］ 「トリテルペノイド」は、幾千もの方法で構成および修飾され得る五炭素イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）単位６個から得られる天然由来有機分子の大規模で多様な分類を指す。ほとんどが、官能基および基本的炭素骨格が互いに異なる多環式構造である。これらの分子は、生存体の全ての分類で見出され得る。

［００６６］ 「ワクチン」は、本明細書に定義された抗原を含む組成物を指す。対象へのワクチン投与は、一般には１種または複数の特異的疾患に対して、免疫応答をもたらす。治療的に有効であるワクチン量は、用いられる特定の抗原、または対象の状態に応じ
て変動してもよく、当業者によって決定することができる。

［００６７］アジュバント製剤および製造方法
本出願は、本発明に適した複数のアジュバント製剤を開示する。これらのアジュバントに共通する特色は、油と、１種または複数の乳化剤の存在であり、該油相が本明細書に開示されたアジュバント製剤を含むワクチン組成物の５０％よりも多くを占める。

［００６８］ 複数の油およびその組み合わせが、本発明の使用に適している。これらの油は、動物油、植物油、および非代謝性油が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に適した植物油の非限定的例は、トウモロコシ油、ピーナッツ油、大豆油、ココナッツ油、およびオリーブ油である。動物油の非限定的例は、スクアレンである。非代謝性油の適切な非限定的例としては、軽質鉱物油、直鎖状または分枝状飽和油などが挙げられる。

［００６９］ 一組の実施形態において、本発明のアジュバント製剤中で用いられる油は、軽質鉱物油である。本明細書で用いられる用語「鉱物油」は、蒸留技術を介して石油から得られる液体炭化水素の混合物を指す。その用語は、「流動パラフィン」、「液状石油」および「白色鉱物油」と同義語である。その用語はまた、「軽質鉱物油」、即ち、石油の蒸留により同様に得られるが、白色鉱物油よりもわずかに低い比重を有する油を包含するものとする。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990, pages 788および1323)を参照されたい。鉱物
油は、様々な商業的供給源、例えばJ. T. Baker (Phillipsburg, Pa.)、USB Corporation
(Cleveland, Ohio)から得ることができる。好ましい鉱物油は、商品名DRAKEOL（登録商
標）として市販される軽質鉱物油である。

［００７０］ 典型的には該油相は、該ワクチン組成物の５０〜９５容量％の量で、好ましくは５０％より多く８５％までの量で、より好ましくは５０％より多く６０％までの量で、より好ましくは５０％より多く５２％までの量で存在する。任意の乳化剤（例えば、SPAN（登録商標）80、TWEEN（登録商標）80など）が存在する場合には、油相が油およ
びそのような乳化剤を含む。油相の容量は、油の容量と乳化剤（複数可）の容量の合計として計算される。したがって例えば油の容量が、組成物の４０％で、乳化剤（複数可）の容量が、組成物の１２％である場合、油相は、該組成物の５２％ｖ／ｖで存在することになる。同様に油が、組成物の約４５％の量で存在し、乳化剤（複数可）が、組成物の約６％の量で存在する場合、油相は、該組成物の約５１％ｖ／ｖで存在する。

［００７１］ 本発明のアジュバントが本発明のワクチンの一部のみを形成するため、油相が本発明のアジュバントそれぞれの５０〜９５容量％の量、好ましくは５０〜８５％の量、より好ましくは５０〜６０％の量、より好ましくは５０〜５２％ｖ／ｖの量で存在することも、理解されなければならない。

［００７２］ 本発明のアジュバント／ワクチン全てに適用可能な実施形態のサブセットにおいて、油および脂溶性乳化剤を一緒にした容量％は、ワクチン組成物の少なくとも５０％、例えば５０〜９５容量％、好ましくは５０〜８５容量％の量、より好ましくは５０〜６０％の量、より好ましくは５０〜５２％ｖ／ｖの量である。したがって限定ではなく例として、該油は、４５％の量で存在し得て、該脂溶性乳化剤は、５％ｖ／ｖを超える量で存在する。したがって油および脂溶性乳化剤を一緒にした容量％は、少なくとも５０％である。

［００７３］ 本発明のワクチン全てに適用可能なさらに別のサブセットにおいて、該油の容量％は、ワクチン組成物の４０％を超え、例えば４０〜９０容量％、４０〜８５％
、４３〜６０％、４４〜５０％ｖ／ｖである。

［００７４］ 本発明のエマルジョン中での使用に適した乳化剤としては、天然の生物学的適合性乳化剤および非天然の合成界面活性剤が挙げられる。生物学的適合性乳化剤としては、リン脂質化合物またはリン脂質の混合物が挙げられる。好ましいリン脂質は、大豆または卵レシチンなどのホスファチジルコリン（レシチン）である。レシチンは、粗植物油を水洗し、得られた含水ゴムを分離および乾燥させることにより、ホスファチドとトリグリセリドとの混合物として得ることができる。トリグリセリドおよび植物油をアセトン洗浄により除去した後に残留するアセトン不溶性のリン脂質と糖脂質について混合物を分画することにより、精製された生成物を得ることができる。あるいはレシチンは、様々な商業的供給源から得ることができる。他の適切なリン脂質としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、およびホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。該リン脂質は、天然の供給源から単離されても、または従来通り合成されてもよい。

［００７５］ 追加の実施形態において、本明細書で用いられる乳化剤は、レシチンを含まないか、または免疫学的に有効でない量のレシチンを使用する。

［００７６］ 本発明のアジュバント製剤中での使用に適した非天然の合成乳化剤としては、ソルビタンを基剤とする非イオン性界面活性剤、例えば脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤（商品名SPAN（登録商標）またはARLACEL（登録商標）として市販される）、ポリ
エトキシル化ソルビトールの脂肪酸エステル（TWEEN（登録商標））、ひまし油などの供
給源からの脂肪酸のポリエチレングリコールエステル（EMULFOR（登録商標））、ポリエ
トキシル化脂肪酸（例えば、商品名SIMULSOL（登録商標）M-53として入手されるステアリン酸）、ポリエトキシル化イソオクチルフェノール／ホルムアルデヒドポリマー（TYLOXAPOL（登録商標））、ポリオキシエチレン脂肪酸アルコールエーテル（BRIJ（登録商標）
）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（polyoxyethylene nonphenyl ethers）（TRITON（登録商標）N）、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（TRITON
（登録商標）X）が挙げられる。好ましい合成界面活性剤は、商品名SPAN（登録商標）お
よびTWEEN（登録商標）、例えばTWEEN（登録商標）-80 （ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート）およびSPAN（登録商標）-80（ソルビタンモノオレート）として
入手される界面活性剤である。

［００７７］ 概して言えば、該乳化剤（複数可）は、０．０１〜４０容量％、好ましくは０．１〜１５量％、より好ましくは２〜１０％の量で、該ワクチン組成物中に存在し得る。

［００７８］ 本発明のアジュバント製剤中に存在するさらなる原材料としては、カチオン性担体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、モノホスホリピドＡおよびその類似体（ＭＰＬ−Ａ）、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、サポニン、第四級アミン、ステロール、糖脂質、アルミニウム供給源（例えば、REHYDRAGEL（登録商標）またはVAC 20（登録商標）ウェットゲル）およびそれらの組み合わせが挙げられる。

［００７９］ 適切なカチオン性担体としては、デキストラン、デキストランＤＥＡＥ（およびその誘導体）、ＰＥＧ、グアーガム、キトサン誘導体、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）ポリエチレンイミンンのようなポリセルロース誘導体、ポリリシンのようなポリアミノなどが挙げられるが、これらに限定されない。

［００８０］ 適切な免疫刺激性オリゴヌクレオチドとしては、ＯＤＮ（ＤＮＡを基剤とする）、ＯＲＮ（ＲＮＡを基剤とする）オリゴヌクレオチド、またはキメラＯＤＮ−Ｏ
ＲＮ構造が挙げられ、それらは非限定的にホスホロチオエート修飾、ハロゲン化、アルキル化（例えば、エチルまたはメチル修飾）、およびホスホジエステル修飾をはじめとする修飾された主鎖を有し得る。幾つかの実施形態において、ポリイノシン酸−シチジル酸またはその誘導体（ポリＩ：Ｃ）が、用いられ得る。

［００８１］ ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、特定の塩基配列状態（ＣｐＧモチーフ）における非メチル化ＣＧ時ヌクレオチドの存在により特徴づけられる薬物療法剤の近年記載された分類である（参照により本明細書に組み込まれるHansel TT, Barnes PJ (eds): New Drugs for Asthma, Allergy and COPD. Prog Respir Res. Basel, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232）。これらのＣｐＧモチーフは、ＣＧジヌクレオチドが抑制された真核細胞ＤＮＡ中には認められず、存在する場合には通常メチル化されているが、細菌ＤＮＡ中には存在して、免疫刺激特性を付与する。

［００８２］ 選択された実施形態において、本発明のアジュバントは、いわゆるＰクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド、より好ましくは修飾されたＰクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド、より好ましくはＥ修飾されたＰクラスオリゴヌクレオチドを利用する。Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、パリンドロームの存在を特徴とし、一般に６〜２０ヌクレオチド長のＣｐＧオリゴヌクレオチドである。Ｐクラスオリゴヌクレオチドは、インビトロおよび／またはインビボのいずれかで自発的にコンカタマーに自己組織化する能力を有する。これらのオリゴヌクレオチドは、厳密に言えば一本鎖であるが、パリンドロームの存在によりコンカタマー、またはことによるとステム・ループ構造の形成が可能になる。Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドの全長は、１９〜１００ヌクレオチド、例えば１９〜３０ヌクレオチド、３０〜４０ヌクレオチド、４０〜５０ヌクレオチド、５０〜６０ヌクレオチド、６０〜７０ヌクレオチド、７０〜８０ヌクレオチド、８０〜９０ヌクレオチド、９０〜１００ヌクレオチドである。

［００８３］ 本発明の一態様において、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、５’ＴＬＲ活性化ドメインおよび少なくとも２つのパリンドローム領域を含み、一方のパリンドローム領域は少なくとも６ヌクレオチド長の５’パリンドローム領域であり、少なくとも８ヌクレオチド長の３’パリンドローム領域に直接またはスペーサを介して連結されている。

［００８４］ Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で公知の技術により修飾され得る。例えばＪ修飾は、ヨード修飾されたヌクレオチドを指す。Ｅ修飾は、エチル修飾されたヌクレオチド（複数可）を指す。したがってＥ修飾されたＰクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチド（好ましくは５’ヌクレオチド）がエチル化されているＰクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。追加の修飾としては、６−ニトロベンゾイミダゾール、Ｏ−メチル化、プロニリル−ｄＵでの修飾、イノシン修飾、２−ブロモビニル結合（好ましくはウリジンへの）が挙げられる。

［００８５］ Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、非限定的にホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合をはじめとする、修飾されたヌクレオチド間結合を含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、合成されていても、または商業的供給源から得られてもよい。

［００８６］ Ｐクラスオリゴヌクレオチドおよび修飾されたＰクラスオリゴヌクレオチドは、２００８年６月１２日出願の発行されたＰＣＴ出願第ＷＯ２００８／０６８６３８号にさらに開示されている。修飾されたＰクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドの適切な非限定的例を、以下の示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１〜１０において、「^＊」は、ホスホロチオエート結合を指し、「＿」は、ホスホジエステル結合を指す）。ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ１１〜１４において、結合は全て、ホスホジエステル結合である。
SEQ ID NO: 1 5' T^*C_G^*T^*C_G^*A*C_G^*A^*T^*C_G^*G^*C^*G^*C_G^*C^*G^*C^*C^*G 3'
SEQ ID NO: 2 5' T^*C_G^*A^*C^*G^*T^*C^*G^*A^*T^*C^*G^*G^*C^*G^*C^*G^*C^*G^*C^*C^*G 3'
SEQ ID NO: 3 5' T^*C^*G^*A^*C^*G^*T^*C^*G^*A^*T^*C^*G^*G^*C^*G^*C^*G^*C^*G^*C^*C^*G^*T 3'
SEQ ID NO: 4 5' JU^*C_G^*A^*C^*G^*T^*C^*G^*A^*T^*C^*G^*G^*C^*G^*C^*G^*C^*G^*C^*C^*G 3'
SEQ ID NO: 5 5' JU^*C_G^*A^*C^*G^*T^*C^*G^*A^*T^*C^*G^*G^*C^*G^*C^*G^*C^*G^*C^*C^*G^*T 3'
SEQ ID NO: 6 5' JU^*C^*G^*A^*C^*G^*T^*C^*G^*A^*T^*C^*G^*G^*C^*G^*C^*G^*C^*G^*C^*C^*G^*T 3'
SEQ ID NO: 7 5' EU^*C_G^*A^*C^*G^*T^*C^*G^*A^*T^*C^*G^*G^*C^*G^*C^*G^*C^*G^*C^*C^*G 3'
SEQ ID NO: 8 5' JU^*C_G^*T^*C^*G^*A^*C^*G^*A^*T^*C^*G^*G^*C^*G^*G^*C^*C^*G^*C^*C^*G^*T 3'
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SEQ ID NO: 10 5' T^*C_G^*T^*C_G^*A^*C_G^*A^*T^*C_G^*G^*C^*G^*C_G^*C^*G^*C^*C^*G 3'
SEQ ID NO: 11 5'-UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU-3'
SEQ ID NO: 12 5'-UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU-3'
SEQ ID NO: 13 5'-AAACGCUCAGCCAAAGCAG-3'
SEQ ID NO: 14 5'-dTdCdGdTdCdGdTdTdTdTrGrUrUrGrUrGrUdTdTdTdT-3'
［００８７］ アジュバント組成物中で使用されるＰクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドの量は、用いられたＰクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび予定した種の性質に依存する。

［００８８］ ＭＰＬ−Ａの適切な類似体としては、構造が改変された、もしくは改変されていない、または合成の細菌由来の天然ＬＰＳ、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、パータクチン、還元糖の３−Ｏ−位での様々な置換物、内毒性（endotoxicity）が低いリピドＡ類似体の合成形態が挙げられるが、これらに限定されない。

［００８９］ ステロールは、共通の化学的コアを有しており、該コアは、ステロイド環構造（複数可）であり、通常は３位炭素に結合した、ヒドロキシル（ＯＨ）基を有する。脂肪酸置換基の炭化水素鎖は、長さが様々で通常１６〜２０炭素原子であり、飽和または不飽和であり得る。ステロールは、共通して環構造内の１つまたは複数の二重結合、および環に結合した様々な置換基を含む。ステロールおよび脂肪酸エステルは、本質的に水に不溶性である。したがってこれらの化学的類似性の観点から、この化学的コアを共有するステロールは、本発明のワクチン組成物中で用いられた場合に類似の特性を有する可能性がある。ステロールは、当該技術分野で周知であり、購入することができる。例えばコレステロールは、Merck Index, 12th Ed., p. 369に開示されている。適切なステロール
としては、β−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール、およびコレステロールが挙げられるが、これらに限定されない。

［００９０］ 適切なサポニンとしては、トリテルペノイドサポニンが挙げられる。これらのトリテルペノイドは、植物起源の表面活性グリコシドの群であり、ステロイドまたはトリテルペノイドのいずれかの構造の疎水性領域と会合する親水性領域（通常は複数の糖鎖）で構成された共通の化学的コアを有する。これらの化学的コアを共有するサポニンは、これらの類似性のために、類似の免疫賦活特性を有する可能性がある。該アジュバント組成物中での使用に適したトリテルペノイドは、多くの供給源、非限定的にキラヤ（Quillaja saponaria）、トマチン、朝鮮人参エキス、マッシュルーム、およびステロイドサポニンと構造的に類似したアルカロイドグリコシドをはじめとする、植物由来または合成のいずれかの均等物から得ることができる。

［００９１］ サポニンが用いられる場合、該アジュバント組成物は、一般に、Quillaja saponariaの樹皮由来の免疫学的活性サポニン画分を含む。該サポニンは、例えばQuil
Aまたは別の精製もしくは部分精製サポニン調製物であってもよく、商業的に得ることができる。したがってサポニン抽出物は、ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、およびＱＳ
−２１などの混合物、または精製された個々の成分として用いることができる。一実施形態において、Quil Aは、少なくとも８５％純粋である。別の実施形態において、Quil Aは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％純粋である。

［００９２］ 第四級アミン化合物は、４つの炭化水素基を有するアンモニウムベースの化合物である。実際に炭化水素基は、一般に、アルキルまたはアリール基に限定される。一組の実施形態において、該第四級アミン化合物は、４つのアルキル鎖で構成され、そのうちの２つが、Ｃ１０〜Ｃ２０アルキルであり、残りの２つが、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである。一組の実施形態において、該第四級アミンは、臭化もしくは塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、または医薬的に許容し得る対イオン（ＤＤＡ）である。

［００９３］ 適切な糖脂質は、一般に、Ｔｈ２応答を活性化する糖脂質である。糖脂質としては、式Ｉによりもたらされ、米国特許出願公開第２００７０１９６３８４号（Ramasamyら）に概ね記載される糖脂質が挙げられるが、これらに限定されない。

［００９４］ 式Ｉの構造において、Ｒ^１およびＲ^２は、独立して水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキルラジカルであり；Ｘは、−ＣＨ_２−、−Ｏ−、または−ＮＨ−であり：Ｒ^２は、水素、または最大２０個の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和アルキルラジカルであり；Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、独立して水素、−ＳＯ_４ ^２−、−ＰＯ_４ ^２−、−ＣＯＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^６は、Ｌ−アラニル、Ｌ−α−アミノブチル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロリル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−トレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニル、およびＬ−バリル、またはそれらのＤ型異性体である。

［００９５］ 一組の実施形態において、適切な糖脂質は、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドまたはその酢酸塩である。

［００９６］ アルミニウムは、公知のアジュバントまたはアジュバント製剤成分であり、Reheis, IncのBrentag alhydrogel REHYDRAGEL（登録商標）またはVAC 20（登録商標）ウェットゲルのような形態で市販されている。 REHYDRAGEL（登録商標）は、鉱物学の
分野でベーマイトとして知られる結晶性オキシ水酸化アルミニウムである。それは、陰性電荷のタンパク質に結合する必要があれば、ワクチンにおいて効果的である。Ａｌ_２Ｏ_３の量は、等級に応じて２％〜１０％の範囲内であり、その粘度は、１０００〜１３００ｃＰである。一般に、吸着剤の水酸化アルミニウムとして記載される場合がある。VAC 20（登録商標）ウェットゲルは、白色またはほぼ白色で半透明の粘性コロイド状ゲルである。特定の実施形態において、Ａｌ_２Ｏ_３は、約２％ｗ／ｖである。

［００９７］ 他の実施形態において、アルミニウム供給源はまた、水酸化アルミニウムの沈殿工程により調製され得る。

［００９８］ 特定の組の実施形態において、該アジュバント製剤はまた、該油および該選択的な１種または複数の乳化剤に加えて、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）またはその類似体と、ステロールと、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと、の組み合わせを含む（または本質的にそれからなる、またはそれからなる）。これらの原材料を含むアジュバントは、「ＴＣＭＯ」と称される。ＴＣＭＯアジュバント製剤は、ポリＩ：Ｃ（「ＴＣＭＹＯ」）および／またはサポニンを所望により含み得る。したがって、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）またはその類似体と、ステロールと、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと、サポニンと、の組み合わせを含む、または本質的にそれからなる、またはそれからなるアジュバント製剤は、「ＱＴＣＭＯ」と称される。加えて、該アジュバント製剤はまた、ポリＩ：Ｃを含み得る。そのようなアジュバントは、「ＱＴＣＭＹＯ」と称される。

［００９９］ 一組の実施形態において、ＴＣＭＯアジュバントは、軽質鉱物油を該ワクチン組成物の総容量の４０〜５０％ｖ／ｖの量で含む。該乳化剤は、TWEEN-80およびSPAN-80を該ワクチン組成物の総容量の０．１〜４０％ｖ／ｖの総量で含むが、ただし、ソ
ルビタンモノオレートおよび油を一緒にすると該組成物の約５０．５〜５２％ｖ／ｖを占めることを条件とする。該免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮであり、好ましくは、所望により主鎖が修飾された、ＯＤＮを含むパリンドロームである。

［０１００］ 特定の実施形態において、ＴＣＭＯの一用量は、約１μｇ〜約４００μｇの免疫刺激性オリゴヌクレオチド、約１μｇ〜約１０００μｇのステロール、約０．１〜５００μｇのＭＰＬ−Ａまたはその類似体を含む。

［０１０１］ 一用量あたりの他の化合物は、対象の種に基づいて選択される。

［０１０２］ 例えばウシ、ヒツジまたは成体のブタに適した幾つかの実施形態において、ＴＣＭＯの一用量は、約５０〜４００μｇ（例えば、５０〜３００もしくは１００〜２５０μｇ、または成体のブタの場合約５０〜約１００μｇでありウシの場合約１００〜約２５０μｇ）の免疫刺激性オリゴヌクレオチド、約１００〜約１０００μｇ（例えば、２００〜１０００、２５０〜７００μｇ、または約４００〜５００μｇ）のステロール、例えばコレステロール、および約５〜約５００μｇ（例えば、５〜１００μｇ、または５〜５０μｇ、または１０〜２５μｇ）のＭＰＬ−Ａまたはその類似体を含む。

［０１０３］ コンパニオンアニマルまたは子ブタに適した幾つかの実施形態において、ＴＣＭＯの一用量は、約５〜１００μｇ（例えば、１０〜８０または２０〜５０μｇ）の免疫刺激性オリゴヌクレオチド、約５〜約１００μｇ（例えば、１０〜８０、または２０〜５０μｇ）のステロール、例えばコレステロール、および約０．５〜約２００μｇ（例えば、１〜１００μｇ、または５〜５０μｇ、または５〜２０μｇ）のＭＰＬ−Ａまたはその類似体を含む。

［０１０４］ 家禽に適した幾つかの実施形態において、ＴＣＭＯアジュバントの一用量は、約０．１〜約５μｇ（例えば、０．５〜３μｇ、または０．９〜１．１μｇ）の免疫刺激性オリゴヌクレオチド、約０．５〜約５０μｇ（例えば、１〜２０μｇ、または約１〜１０μｇ）のステロール、例えばコレステロール、および約０．１〜約１０μｇ（例えば、０．５〜５μｇ、または１〜５μｇ）のＭＰＬＡまたはその類似体を含む。ＭＰＬ−Ａは、０．１μｇ／用量〜２，０００μｇ／用量の量で存在する。

［０１０５］ 特定の実施形態において、ＴＣＭＯアジュバントは、以下の通り調製される：
ａ）ソルビタンモノオレート、ＭＰＬ−Ａおよびコレステロールを、軽質鉱物油に溶解する。得られた油性溶液を、濾過滅菌する；
ｂ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレートを水相に溶解し、それにより水性溶液を形成させる；
ｃ）該水性溶液を、連続で均質化させながら該油性溶液に添加して、アジュバント製剤ＴＣＭＯを形成させる。

［０１０６］ ＴＣＭＹＯアジュバントにおいて、コレステロール、油、選択的な乳化剤、ＭＰＬ−Ａ、および免疫刺激性オリゴヌクレオチが、それぞれの種に向けて、ＴＣＭＯアジュバント製剤中と同様に存在する。ポリＩ：Ｃが、概ね約１μｇ〜約１００μｇ／用量の量で存在し得る。

［０１０７］ より具体的にはポリＩ：Ｃは、ウシ、生体のブタ、またはヒツジに適した特定の実施形態において、５〜１００μｇ／用量（例えば、５〜５０μｇまたは１０〜３０μｇ）の量で存在し得る。コンパニオンアニマルまたは子ブタに適した特定の実施形態において、ＴＣＭＯの一用量は、約１〜５０μｇ（例えば、５〜５０μｇ、または１０〜２０μｇ）のポリＩ：Ｃを含む。家禽ワクチンに適した特定の実施形態において、ＴＣＭＯの一用量は、約１〜１０μｇ（例えば、１〜５μｇ、または３〜５μｇ）のポリＩ：Ｃを含む。

［０１０８］ 特定の実施形態において、ＴＣＭＹＯアジュバントは、ＴＣＭＯアジュバントと同様に調製され、ポリＩ：Ｃが、該水性溶液に添加される。

［０１０９］ 一組の実施形態において、ＱＴＣＭＯアジュバント中に、コレステロール、油、選択的な乳化剤、ＭＰＬ−Ａ、および免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、それぞれの種に向けて、ＴＣＭＯアジュバント製剤中と同様に存在する。サポニンは、好ましくはQuil Aまたはその精製画分であり、約０．１〜約１０００μｇ／用量の量で存在し得る。

［０１１０］ より具体的には、該サポニンは、家禽ワクチンに適した特定の実施形態において、該サポニンは、一用量あたりに０．１〜５μｇ／ワクチン組成物５０μｋ（例えば、０．５〜３０μｇ／該組成物５０μｌ、またはより好ましくは１〜１０μｇ）の量で存在し得る。コンパニオンアニマルおよび子ブタへの適用に適した特定の実施形態において、該サポニン、例えばQuil Aまたはその精製画分は、約１０〜約１００μｇ／用量（例えば、１０〜５０μｇまたは２０〜５０μｇ／用量）の量で存在する。ウシ、成体のブタまたはヒツジに適した特定の実施形態において、該サポニン、例えばQuil Aまたはその精製画分は、約１００〜約１０００μｇ／用量（例えば、２００〜８００μｇまたは２５０〜５００μｇ／用量）の量で存在する。

［０１１１］ 特定の実施形態において、ＱＴＣＭＯアジュバントは、ＴＣＭＯアジュバントと同様に調製され、サポニンが、該水性溶液中に添加される。

［０１１２］ 一組の実施形態において、ＱＴＣＭＹＯアジュバント中に、該サポニンが、それぞれの種に向けて、ＱＴＣＭＯアジュバント中と同様に存在し、残りの原材料は、ＴＣＭＹＯ中と同様に存在する。

［０１１３］ 特定の実施形態において、ＱＴＣＭＹＯアジュバントは、ＴＣＭＹＯア
ジュバントと同様に調製され、サポニンが、該水性溶液中に添加される。

［０１１４］ 別の実施形態において、該アジュバント製剤はまた、該油および選択的な乳化剤（複数可）に加えて、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）またはその類似体とポリカチオン性担体との組み合わせを含む（または本質的にそれからなる、またはそれからなる）。これらのアジュバントは、「ＸＯＭ」と称される。

［０１１５］ 一組の実施形態において、コンパニオンアニマルまたは子ブタ用のＸＯＭアジュバント中に、該ポリカチオン性担体が、１〜５０ｍｇ／用量（例えば、１〜２５μｇ／用量、または１０〜２５ｍｇ／用量）の量で存在し、該ＭＰＬ−Ａまたはその類似体が、約１〜５０μｇ／用量（例えば、１〜２５μｇ／用量、または１０〜２５μｇ／用量）の量で存在する。

［０１１６］ ウシ、ヒツジおよび成体のブタに適した特定の実施形態において、該ポリカチオン性担体は、約５〜約５００ｍｇ／用量（例えば、１０〜５００ｍｇ、または１０〜３００ｍｇ、または５０〜２００ｍｇ／用量）の量で存在し、該ＭＰＬ−Ａまたはその類似体は、約１〜約１００μｇ／用量（例えば、５〜１００μｇ、または５〜５０μｇ、または１０〜３０μｇ）の量で存在する。

［０１１７］ コンパニオンアニマルまたは子ブタに適した特定の実施形態において、該ポリカチオン性担体は、約１〜約５０ｍｇ／用量（例えば、１〜２５ｍｇ／用量、または１０〜２５ｍｇ／用量）の量で存在し、該ＭＰＬ−Ａまたはその類似体は、約０．５〜約２００μｇ（例えば、１〜１００μｇ、または５〜５０μｇ、または５〜２０μｇ）／用量の量で存在する。

［０１１８］ 家禽ワクチンに適した特定の実施形態において、該ポリカチオン性担体は、０．５〜２５ｍｇ／用量（例えば、１〜２０ｍｇ、１〜１０ｍｇ、または５〜１０ｍｇ）の量で存在し、該ＭＰＬ−Ａまたはその類似体は、約０．５〜１０μｇ／用量（例えば、１〜１０μｇ、または１〜５μｇ、または２〜５μｇ）の量で存在する。

［０１１９］ 特定の実施形態において、ＸＯＭアジュバントは、以下の通り調製される：
ａ）ソルビタンモノオレート、ＭＰＬ−Ａおよびコレステロールを、軽質鉱物油に溶解する。得られた油性溶液を、濾過滅菌する；
ｂ）デキストランＤＥＡＥおよびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレートを水相に溶解し、それにより水性溶液を形成させる；
ｃ）該水性溶液を、連続で均質化させながら該油性溶液に添加して、アジュバント製剤ＸＯＭを形成させる。

［０１２０］ 追加的な別の実施形態において、該アジュバント製剤はまた、該油および選択的な乳化剤（複数可）に加えて、免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性担体との組み合わせを含む（または本質的にそれからなる、またはそれからなる）が、ただし、前記ポリカチオン性担体が、デキストランＤＥＡＥである場合、抗原が、E coli J-5バクテリンでないことを条件とする。これらのアジュバントは、「ＴＸＯ」と称される。特定の実施形態において、ＴＸＯがアジュバント添加されたワクチンは、ウシ、ヒツジ、ウマまたはブタを罹患させる病原体を含む抗原（複数可）を含む。他の実施形態において、該抗原は、前記病原体に由来する。他の実施形態において、ＴＸＯがアジュバント添加されたワクチンは、家禽もしくはネコを罹患させる病原体を含む抗原（複数可）を含むか、または該抗原は、そのような病原体に由来し得る。一組の実施形態において、該ＴＸＯアジュバントはまた、Ａｌ（ＯＨ）_３ゲルなどのアルミニウム供給源を含み得る。アル
ミニウムを含むＴＸＯアジュバントは、「ＴＸＯ−Ａ」と称される。

［０１２１］ 一組の実施形態において、ＴＸＯアジュバント中では、好ましくはパリンドローム配列を含み、所望により主鎖が修飾された該免疫刺激性オリゴヌクレオチド、好ましくはＯＤＮは、０．５〜４００μｇ／用量の量で存在し得て、該ポリカチオン性担体は、０．５〜４００ｍｇ／用量の量で存在し得る。該投与量は、対象の種に注意を払う。

［０１２２］ 例えばウシ、ヒツジまたは成体のブタに適した特定の実施形態において、ＴＸＯの一用量は、約５０〜４００μｇ（例えば、５０〜３００もしくは１００〜２５０μｇ、または生体のブタの場合約５０〜約１００μｇ、またはウシの場合約１００〜約２５０μｇ）の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含み、該ポリカチオン性担体は、約５〜約５００ｍｇ／用量（例えば、１０〜５００ｍｇ、または１０〜３００ｍｇ、または５０〜２００ｍｇ／用量）の量で存在し得る。

［０１２３］ コンパニオンアニマルまたは子ブタに適した特定の実施形態において、ＴＸＯの一用量は、約５〜１００μｇ（例えば、１０〜８０μｇ、または２０〜５０μｇ）の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含み、該ポリカチオン性担体は、１〜５０ｍｇ／用量（例えば、１〜２５ｍｇ用量、または１０〜２５ｍｇ／用量）の量で存在し得る。

［０１２４］ 家禽に適した特定の実施形態において、ＴＸＯの一用量は、約０．１〜５μｇ（例えば、０．５〜３μｇ、または０．９〜１．１μｇ）の免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、該ポリカチオン性担体は、０．５〜２５ｍｇ／用量（例えば、１〜２０ｍｇ、または１〜１０ｍｇ、または５〜１０ｍｇ）の量で存在し得る。

［０１２５］ 特定の実施形態において、ＴＸＯアジュバントは、以下の通り調製される：
ａ）ソルビタンモノオレートを、軽質鉱物油に溶解する。得られた油性溶液を、濾過滅菌する；
ｂ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド、デキストランＤＥＡＥおよびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレートを水相に溶解し、それにより水性溶液を形成させる；
ｃ）該水性溶液を、連続で均質化させながら該油性溶液に添加して、アジュバント製剤ＴＸＯを形成させる。

［０１２６］ 一組の実施形態において、ＴＸＯ−Ａアジュバント中の該免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＴＸＯアジュバント中と同様に存在し、アルミニウム供給源は、４０％ｖ／ｖまで（例えば、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％）の量で存在する。一組の実施形態において、該アルミニウム供給源は、該ワクチン組成物の２〜２０％ｖ／ｖ、より好ましくは約５〜約１７％ｖ／ｖ存在する。

［０１２７］ 特定の実施形態において、ＴＸＯ−Ａアジュバントは、ＴＸＯアジュバントと同様に調製され、アルミニウム供給源が、該水性溶液に添加される。

［０１２８］ さらなる実施形態において、本発明のアジュバントは、油、選択的な乳化剤（複数可）、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびアルミニウム供給源を含む。これらの化合物は、ポリカチオン性担体がＴＯＡ中に存在しないことを除き、ＴＸＯ−Ａアジュバントに関して開示された範囲内で存在する。ＴＯＡアジュバントは、水相がＤＥＡＥデキストランよりもむしろアルミニウム供給源を含むことを除き、ＴＸＯアジュバントと同様に調製される。

［０１２９］ 特定の実施形態において、該アジュバント製剤はまた、該油および選択的な乳化剤（複数可）に加えて、ポリカチオン性担体とアルミニウム供給源との組み合わせを含む（または本質的にそれからなる、またはそれからなる）。このアジュバントは、ＡＸＯと称される。これらの化合物は、それぞれの種に向けて、アジュバントＴＸＯ−Ａ中に存在するそれらと同様の量で存在し得て、アジュバントＡＸＯは、ＴＸＯ−Ａと同様に調製され得るが、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは添加されていない。

［０１３０］ 特定の別の実施形態において、該アジュバント製剤はまた、該油および選択的な乳化剤（複数可）に加えて、サポニンとステロールとの組み合わせを含む（または本質的にそれからなる、またはそれからなる）。このアジュバントは、ＱＣＯと称される。ＱＣＯの原材料の性質および量は、アジュバントＱＴＣＭＯ中のサポニン、ステロール、油および乳化剤（複数可）の量と同様である。ＱＣＯは、サポニン、ステロール、そして好ましくは水溶性乳化剤を含む水性溶液を、油、そして好ましくは脂溶性乳化剤を含む油相に、連続して均質化させながら添加することにより調製され得る。

［０１３１］ さらに別の実施形態において、該アジュバント製剤はまた、該油および選択的な乳化剤（複数可）に加えて、第四級アミンと糖脂質とＭＰＬ−Ａまたはその類似体とポリＩ：Ｃとの組み合わせを含む（または本質的にそれからなる、またはそれからなる）。これらアジュバントは、「ＯＤＹＲＭ」と称される。

［０１３２］ ＯＤＹＲＭアジュバントにおいて、該油は、一般にホスファチジルコリンなどのリン脂質の混合物である。AMPHIGEN（登録商標）は、そのような油の適切な例であり、先に記載された油の量と同様の量で存在する。

［０１３３］ 一組の実施形態において、ＯＤＹＲＭアジュバント中の第四級アミン、例えばＤＤＡは、約１μｇ〜約２００μｇ／用量の量で存在し、ポリＩ：Ｃは、約０．５μｇ〜１００μｇ／用量の量で存在し、糖脂質は、約０．５μｇ〜約２０００μｇ／用量の量で存在し、ＭＰＬ−Ａまたはその類似体は、約０．５μｇ〜約１００μｇ／用量の量で存在する。

［０１３４］ より具体的には、ウシ、成体のブタまたはヒツジに適した特定の実施形態において、該第四級アミンは、約５０〜約２００μｇ／用量（例えば、５０〜１５０μｇまたは約１００μｇ）の量で存在し得て、該ポリＩ：Ｃは、約１〜約１００μｇ／用量（例えば、１〜５０μｇまたは約５〜５０μｇ）の量で存在し得て、該糖脂質は、約５００〜約２０００μｇ／用量（例えば、５００〜１００μｇまたは約１０００μｇ）の量で存在し得て、該ＭＰＬＡまたはその類似体は、約５〜約１００μｇ／用量（例えば、５〜５０μｇまたは約１０〜５０μｇ）の量で存在し得る。

［０１３５］ コンパニオンアニマルおよび子ブタに適した特定の実施形態において、該第四級アミンは、約５〜約５００μｇ／用量（例えば、１０〜１００μｇ／用量または２０〜５０μｇ／用量）の量で存在し得て、該ポリＩ：Ｃは、約５μｇ〜約２５μｇ／用量（例えば、５０〜２０μｇまたは約１０μｇ）の量で存在し得て、該糖脂質は、約１０〜約１００μｇ／用量（例えば、２０〜１００μｇまたは２５〜５０μｇ）の量で存在し得て、該ＭＰＬ−Ａまたはその類似体は、約５〜約５０μｇ／用量（例えば、５〜２０または約１０〜２０μｇ）の量で存在し得る。

［０１３６］ 家禽ワクチンに適した特定の実施形態において、一用量は、約１μｇ〜約１０μｇの第四級アミン化合物（例えば、５〜１０μｇまたは約５μｇ）、約０．５〜約１０μｇのポリＩ：Ｃ（例えば、１〜１０μｇまたは１〜５μｇ）、約０．５〜１０μｇの糖脂質（例えば、１〜１０μｇまたは５〜１０μｇまたは１〜５μｇ）、および約０
．５μｇ〜約５μｇのＭＰＬ−Ａまたはその類似体（例えば、０．５〜５μｇまたは１〜５μｇ）を含む。

［０１３７］ 特定の実施形態において、ＯＤＹＲＭアジュバントは、以下の通り調製される：
ａ）ソルビタンモノオレート、ＭＰＬ−Ａを、軽質鉱物油に溶解する。得られた油性溶液を濾過滅菌して、若干の界面活性剤、エタノール、および酢酸を含む水に分散させる；
ｂ）ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、第四級アミン、例えばＤＤＡ、およびポリＩ：Ｃを水相に溶解し、それにより水性溶液を形成させる；
ｃ）該水性溶液を、連続で均質化させながら該油性溶液に添加して、アジュバント製剤ＯＤＹＲＭを形成させる。

［０１３８］ さらなる組の実施形態において、該アジュバント製剤はまた、該油および選択的な乳化剤（複数可）に加えて、サポニンとステロールと第四級アミンとポリカチオン性担体との組み合わせを含む（または本質的にそれからなる、またはそれからなる）が、ただし、前記ポリカチオン性担体が、デキストランＤＥＡＥである場合、抗原が、E coli J-5バクテリンではないことを条件とする。これらのアジュバントは、「ＱＣＤＸＯ」と称される。

［０１３９］ ＱＣＤＸＯアジュバントにおける特定の実施形態において、該サポニン、例えばQuil Aは、約０．１μｇ〜約１０００μｇ／用量の量で存在し、該ステロール、例えばコレステロールは、約１μｇ〜約１０００μｇ／用量存在し、該第四級アミン、例えばＤＤＡは、約１μｇ〜約２００μｇ／用量の量で存在し、該ポリカチオン性担体は、０．５〜４００ｍｇ／用量の量で存在し得る。該投与量は、対象の種に応じて注意を払う。

［０１４０］ ウシ、ヒツジおよび成体のブタに適した特定の実施形態において、該サポニンは、約１００〜約１０００μｇ／用量（例えば、２００〜８００μｇ、または２５０〜５００μｇ／用量）の量で存在し、該ステロールは、約１００〜約１０００μｇ（例えば、２００〜１０００、２５０〜７００μｇ、または約４００〜５００μｇ）の量で存在し、該第四級アミンは、約５０μｇ〜約２００μｇ／用量（例えば、５０〜１５０μｇ、または約１００μｇ）の量で存在し得て、該ポリカチオン性担体は、約５〜約５００ｍｇ／用量（例えば、１０〜５００ｍｇ、または１０〜３００ｍｇ、または５０〜２００ｍｇ／用量）の量で存在し得る。

［０１４１］ コンパニオンアニマルおよび子ブタへの適用例に適した特定の実施形態において、該サポニン、例えばQuil Aまたはその精製画分は、約１０〜約１００μｇ／用量（例えば、１０〜５０μｇ、または２０〜５０μｇ／用量）の量で存在し、該ステロールは、約５〜１００μｇ（例えば、１０〜８０または２０〜５０μｇ）の量で存在し、該第四級アミンは、約５〜約５００μｇ／用量（例えば、１０〜１００μｇ／用量、または２０〜５０μｇ／用量）の量で存在し得て、該ポリカチオン性担体は、１〜５０ｍｇ／用量（例えば、１〜２５ｍｇ／用量、または１０〜２５ｍｇ／用量）の量で存在し得る。

［０１４２］ 家禽ワクチンに適した幾つかの実施形態において、該サポニンは、０．１〜５μｇ／ワクチン組成物５０μｌ（例えば、０．５〜３０μｇ／該組成物５０μｌ、またはより好ましくは１〜１０μｇ）の量で存在し得て、該ステロールは、約０．５〜約５０μｇ（例えば、１〜２０μｇ、または１〜１０μｇ）の量で存在し得て、該第四級アミンは、約５〜約５００μｇ／用量（例えば、１０〜１００μｇ／用量、または約２０〜５０μｇ／用量）の量で存在し得て、該ポリカチオン性担体は、０．５〜２５ｍｇ／用量（例えば、１〜２０ｍｇ、または１〜１０ｍｇ、または５〜１０ｍｇ）の量で存在し得る
。

［０１４３］ 特定の実施形態において、ＱＣＤＸＯアジュバントは、以下の通り調製される：
ａ）ソルビタンモノオレートを、軽質鉱物油に溶解する。得られた油性溶液を、濾過滅菌する；
ｂ）ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、第四級アミン、例えばＤＤＡ、ポリカチオン性担体、ステロールおよびサポニンを水相に溶解し、それにより水性溶液を形成させる；
ｃ）該水性溶液を、連続で均質化させながら該油性溶液に添加して、アジュバント製剤ＱＣＤＸＯを形成させる。

［０１４４］ 特に大規模な商業的適用において、抗原を濃縮することが不可能または実行不能で、低濃度の抗原溶液が用いられなければならない場合がある。したがって幾つかの実施形態において、本発明のワクチン組成物は、これらのアジュバント製剤中の油相の内容物が希釈されていて該ワクチン組成物が油中水エマルジョンである、先に記載されたアジュバント製剤を含む。

［０１４５］ 実際に、油相が５０％ｖ／ｖ未満である油中水エマルジョンを生成することは、可能である。

［０１４６］ 手短に述べると、最初に本発明のアジュバント製剤を、以下に記載される通り調製する。前記アジュバント製剤において、該油相は、アジュバント製剤の５０％ｖ／ｖよりも多くを占める。該油および該乳化剤（複数可）以外の原材料の量は、最終的な目的濃度および所望の希釈に基づいて、それぞれ増大することができる。例えば、該アジュバント製剤が８０％ｖ／ｖを占めるワクチン組成物を調製することを目的とする場合、該油以外の原材料の量は、１．２５（１／０．８）の分率だけ増大される。乳化剤の量は、もし存在するならば（例えば、TWEEN（登録商標）80および／またはSPAN（登録商標
）80）、必ずしも増大させる必要はないが、好ましくは該油と該乳化剤（複数可）の容量比を、アジュバント製剤中と最終的なワクチン中とで同じに保たせる。

［０１４７］ 抗原溶液が、その後、アジュバント製剤に添加される。

［０１４８］ 分散された球状の水滴が、単分散の液滴のランダム充填のための最大充填率、即ち０．６４よりも濃縮された形態で存在しない限り、油中水エマルジョンの完全性は維持され得る。Tadros, Emulsion Formation, Stability and Rheology, 1^sted. 2013, Wiley-VCH GmbH & Co KGaAを参照されたい。水性液滴が占める総容積率が、０．６４
、即ち６４％ｖ／ｖを超えない限り。逆にこれは、油相が３６％ｖ／ｖ未満で滴下されるはずがないことを示唆している。

［０１４９］ したがって本発明のこの態様の異なる実施形態において、抗原化合物およびこれまでの実施形態による希釈されたアジュバント製剤を含むワクチン製剤であって、該油相が、該ワクチン組成物の３６％ｖ／ｖよりも多くを占め、該ワクチン組成物が、油中水エマルジョンである、ワクチン製剤が提供される。非限定的に、本発明のこの態様に適したアジュバント製剤としては、ＴＣＭＯ、ＴＣＭＹＯ、ＱＴＣＭＯ、ＱＴＣＭＹＯ、ＸＯＭ、ＴＸＯ、ＴＸＯ−Ａ、ＴＡＯ、ＡＸＯ、ＱＣＯ、ＯＤＹＲＭ、ＱＣＤＸＯが挙げられる。油相の容量は、異なる実施形態において、該ワクチン組成物の３７％ｖ／ｖ、３８％ｖ／ｖ、３９％ｖ／ｖ、４０％ ｖ／ｖ、４１％ｖ／ｖ、４２％ｖ／ｖ、４３％ｖ／ｖ、４４％ｖ／ｖ、４５％ｖ／ｖ、４６％ｖ／ｖ、４７％ｖ／ｖ、４８％ ｖ／ｖ、４９％ｖ／ｖ、または５０％ｖ／ｖである。

［０１５０］ 油相の濃度は、デポ効果を生じて、宿主の免疫系による急速な分解から抗原および免疫調整物質（複数可）を防御するのに十分高くなければならず、好ましくは該ワクチン組成物の２０％ｖ／ｖ以上でなければならない。

［０１５１］ したがって別の態様において、本発明のワクチン組成物において、ワクチン製剤が水中油エマルジョンまたは水中油中水エマルジョンで、その油相が該ワクチン組成物の２０％ｖ／ｖ以上を占めるように、該アジュバント製剤の油相の量が希釈される。該油および該乳化剤以外の原材料の量は、最終的な目的濃度および所望の希釈に基づいて、それぞれ増大させる。例えば、該アジュバント製剤が３３．３％ｖ／ｖを占めるワクチン組成物を調製するために、該油および該乳化剤（複数可）以外の原材料の量は、３（１／０．３３３）の分率で増大される。乳化剤の量は、もし存在するならば（例えば、TWEEN（登録商標）80および／またはSPAN（登録商標）80）、増大させる必要はないが、好
ましくは該油と該乳化剤（複数可）の容量比を、アジュバント製剤中と最終的なワクチン組成物中とで同じに保たせる。

［０１５２］ 異なる実施形態において、該ワクチン組成物は、水中油エマルジョンまたは水中油中水エマルジョンであり、該油相は、該ワクチン組成物の２１％ｖ／ｖ、２２％ｖ／ｖ、２３％ｖ／ｖ、２４％ｖ／ｖ、２５％ｖ／ｖ、２６％ｖ／ｖ、２７％ｖ／ｖ、２８％ｖ／ｖ、２９％ｖ／ｖ、３０％ｖ／ｖ、３１％ｖ／ｖ、３２％ｖ／ｖ、３３％ｖ／ｖ、３４％ｖ／ｖ、３５％ｖ／ｖ、３６％ｖ／ｖ、３７％ｖ／ｖ、３８％ｖ／ｖ、３９％ｖ／ｖ、４０％ｖ／ｖ、４１％ｖ／ｖ、４２％ｖ／ｖ、４３％ｖ／ｖ、４４％ｖ／ｖ、４５％ｖ／ｖ、４６％ｖ／ｖ、４７％ｖ／ｖ、４８％ｖ／ｖ、４９％ｖ／ｖ、または５０％ｖ／ｖを占める。

［０１５３］ 本発明のこの態様に適したアジュバント製剤としては、ＴＣＭＯ、ＴＣＭＹＯ、ＱＴＣＭＯ、ＱＴＣＭＹＯ、ＸＯＭ、ＴＸＯ、ＴＸＯ−Ａ、ＴＡＯ、ＡＸＯ、ＱＣＯ、ＯＤＹＲＭ、ＱＣＤＸＯが挙げられるが、ただし該アジュバント製剤の油相が、最終的なワクチン組成物の５０％ｖ／ｖ未満で２０％ｖ／ｖを超え得ることを条件とする。

［０１５４］抗原および疾患
該組成物は、１種または複数の抗原を含有し得る。該抗原は、非限定的に１種または複数のウイルス（不活化、弱毒化、および変性生ウイルス）、細菌、寄生虫、ヌクレオチド（非限定的に核酸を基にした抗原、例えばＤＮＡワクチンを含む）、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、合成ペプチド、タンパク質抽出物、細胞（腫瘍細胞を含む）、組織、多糖、炭水化物、脂肪酸、タイコ酸、ペプチドグリカン、脂質、または糖脂質をはじめとする、対象における所望の免疫応答を生じることが可能な非常に様々な物質のいずれかの個別または任意の組み合わせであり得る。

［０１５５］ 本発明のアジュバントと共に用いられる抗原としては、本明細書で参照された生物体から単離され得る、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチドの免疫原性断片も挙げられる。

［０１５６］ 対象において疾患を誘発しない生ウイルス株、変性生ウイルス株、および弱毒化ウイルス株は、適切な細胞株での継代培養または紫外線もしくは化学的突然変異原への暴露など、当該技術分野で周知の方法を利用して、非猛毒性の形態で単離されているか、または弱毒化されている。不活化または死滅したウイルス株は、ホルマリン、βプロプリオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）での処理、放射線滅菌、加熱、または他のそのような方法をはじめとし、当業者に公知の方法により不活化されたものである。

［０１５７］ ２つ以上の抗原を組み合わせて、病原により誘発される非常に様々な疾患に対して対象を防御し得る多価組成物を生成することができる。現在、ワクチンの商業的製造業者およびエンドユーザーは、多価ワクチン製品を好む。従来のアジュバントは、多くの場合、効果的に用いられ得る（一価または多価のいずれか）様々な抗原中に限られるが、本明細書に記載されたアジュバントは、一価または多価の両方で広範囲の抗原と共に効果的に用いることができる。したがって本明細書に記載された抗原は、本明細書に記載されたアジュバントを含む１つの組成物に混和することができる。

［０１５８］ 該アジュバント組成物と共に、抗原として用いられる細菌の幾つかの例としては、Aceinetobacter calcoaceticus、Acetobacter paseruianus、Actinobacillus pleuropneumoniae、Aeromonas hydrophila、Alicyclobacillus acidocaldarius、Arhaeglobus fulgidus、Bacillus pumilus、Bacillus stearothermophillus、Bacillus subtilis、Bacillus thermocatenulatus、Bordetella bronchiseptica、Burkholderia cepacia、Burkholderia glumae、Campylobacter coli、Campylobacter fetus、Campylobacter jejuni、Campylobacter hyointestinalis、Chlamydia psittaci、Chlamydia trachomatis、Chlamydophila属、Chromobacterium viscosum、Erysipelothrix rhusiopathieae、Listeria monocytogenes、Ehrlichia canis、Escherichia coli、Haemophilus influenzae、Haemophilus somnus、Helicobacter suis、Lawsonia intracellularis、Legionella pneumophilia、Moraxellsa属、Mycobactrium bovis、Mycoplasma hyopneumoniae、Mycoplasma mycoidesの亜種、mycoides LC、Clostridium perfringens、Odoribacter denticanis、Pasteurella (Mannheimia) haemolytica、Pasteurella multocida、Photorhabdus luminescens、Porphyromonas gulae、Porphyromonas gingivalis、Porphyromonas salivosa、Propionibacterium acnes、Proteus vulgaris、Pseudomonas wisconsinensis、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas fluorescens C9、Pseudomonas fluorescens SIKW1、Pseudomonas fragi、Pseudomonas luteola、 Pseudomonas oleovorans、Pseudomonas属 B11-1、Alcaliges
eutrophus、Psychrobacter immobilis、Rickettsia prowazekii、Rickettsia rickettsia、Salmonella enterica 全血清型（例えば、Salmonella enterica Typhimurium、Salmonella enterica Bongori、Salmonella enterica Dublin、Salmonella enterica Choleraseuis、およびSalmonella enterica Newportなど）、Serratia marcescens、Spirlina platensis、Staphlyoccocus aureus、Staphyloccoccus epidermidis、 Staphylococcus hyicus、 Streptomyces albus、Streptomyces cinnamoneus、Streptococcus uberis、Streptococcus suis、Streptomyces exfoliates、Streptomyces scabies、Sulfolobus acidocaldarius、Syechocystis属、Vibrio cholerae、Borrelia burgdorferi、Treponema denticola、Treponema minutum、Treponema phagedenis、Treponema refringens、Treponema vincentii、Treponema palladium、Trueperella pyogenesならびにLeptospira属、例えば公知
の病原体Leptospira canicola、Leptospira grippotyposa、Leptospira hardjo、Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis、Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno、Leptospira interrogans、Leptospira icterohaemorrhagiae、Leptospira pomona、およびLeptospira bratislava、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

［０１５９］ 不活化ウイルスおよび弱毒化生ウイルスの両方が、該アジュバント組成物中で用いられ得る。抗原として用いられ得るウイルスの幾つかの例としては、トリヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、イヌヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルス、ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス、マレック病ウイルス、ヒツジヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス、ブタ流行性下痢症ウイルス（ＰＥＤｖ）、仮性狂犬病ウイルス、トリパラミキソウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、イヌディステンパーウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３、ヒツジパラインフルエンザ３、牛疫ウイルス、ボーダー病ウイルス
、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ＢＶＤＶ Ｉ型、ＢＶＤＶ ＩＩ型、豚コレラウイルス、トリ白血病ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウシ結核ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ニューカッスル病ウイルス、ヒツジ進行性肺炎ウイルス、ヒツジ肺腺癌ウイルス、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、汎親和性ＣＣＶ、イヌ呼吸器コロナウイルス、ウシコロナウイルス、ネコカリシウイルス、ネコ腸コロナウイルス、ネコ伝染性腹膜炎、ウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）Ｉ型、ＰＣＶ ＩＩ型、ブタ生殖器・呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、シチメンチョウコロナウイルス、ウシ流行熱ウイルス、狂犬病、ロトウイルス、水疱性口炎ウイルス、レンチウイルス、トリインフルエンザ、リノウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルス、ヒトインフルエンザウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、および麻疹ウイルス、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

［０１６０］ ペプチド抗原の例としては、気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica） p68、ＧｎＲＨ、ＩｇＥペプチド、Ｆｅｌ ｄ１、および癌抗原、ならびにそれら
の組み合わせが挙げられる。他の抗原に例としては、ヌクレオチド、炭水化物、脂質、糖脂質、ペプチド、脂肪酸、リポタイコ酸、タイコ酸およびペプチドグリカン、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。

［０１６１］ アジュバント組成物と共に抗原として用いられ得る寄生虫の幾つかの例としては、Anaplasma、Fasciola hepatica（肝臓吸虫）、Coccidia、Eimeria属、Neospora caninum、Toxoplasma gondii、Giardia、Dirofilaria(ハートワーム)、Ancylostoma(フックワーム)、Cooperia、Haemonchus contortus(バーバーポールワーム)Ostertagia ostertagi（胃虫）、Dictyocaulus viviparous(肺線虫）、Trypanosoma属、Leishmania属、Trichomonas属、Cryptosporidium parvum、Babesia、Schistosoma、Taenia、Strongyloides、Ascaris、Trichinella、Sarcocystis、Hammondia、およびIsopsora、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。同じく企図されるのは、非限定的にIxodes属、Rhipicephalus属、Dermacentor属、Amblyomma属、Boophilus属、Hyalomma属、およびHaemaphysalis属をはじめとするダニ、ならびにそれらの組み合わせなどの外部寄
生虫である。

［０１６２］ 免疫応答を誘導するのに用いられる抗原の量は、用いられる抗原、対象、および所望の応答レベルに応じてかなり変動し、当業者により決定され得る。変性生ウイルスまたは弱毒化ウイルスを含むワクチンの場合、抗原の治療有効量は、一般に約１０^２組織培養感染用量（ＴＣＩＤ）_５０〜約１０^１０ＴＣＩＤ_５０（いずれの数値も含む）の範囲内である。多くのそのようなウイルスでは、治療有効用量は、一般に、約１０^２ＴＣＩＤ_５０〜約１０^８ＴＣＩＤ_５０（いずれの数値も含む）である。幾つかの実施形態において、治療有効用量の範囲は、約１０^３ＴＣＩＤ_５０〜約１０^６ＴＣＩＤ_５０（いずれの数値も含む）である。幾つかの他の実施形態において、治療有効用量の範囲は、約１０^４ＴＣＩＤ_５０〜約１０^５ＴＣＩＤ_５０（いずれの数値も含む）である。

［０１６３］ 不活化ウイルスを含むワクチンの場合、抗原の治療有効量は、一般に、少なくとも約１００相対単位／用量であり、多くの場合、約１，０００〜約４，５００相対単位／用量（いずれの数値も含む）の範囲内である。他の実施形態において、抗原の治療有効量は、約２５０〜約４，０００相対単位／用量（いずれの数値も含む）、約５００〜約３，０００相対単位／用量（いずれの数値も含む）、約７５０〜約２，０００相対単
位／用量（いずれの数値も含む）、または約１，０００〜約１，５００相対単位／用量（いずれの数値も含む）の範囲内である。

［０１６４］ 不活化ウイルスを含むワクチン中の抗原の治療有効量はまた、１ｍＬあたりの相対効力（ＲＰ）に関して測定することができる。治療有効量は、多くの場合、約０．１〜約５０ＲＰ／ｍＬ（いずれの数値も含む）の範囲内である。他の実施形態において、抗原の治療有効量は、約０．５〜約３０ＲＰ／ｍＬ（いずれの数値も含む）、約１〜約２５ＲＰ／ｍＬ（いずれの数値も含む）、約２〜約２０ＲＰ／ｍＬ（いずれの数値も含む）、約３〜約１５ＲＰ／ｍＬ（いずれの数値も含む）、または約５〜約１０ＲＰ／ｍＬ（いずれの数値も含む）の範囲内である。

［０１６５］ ワクチン中で投与される細菌抗原についての細胞数は、約１×１０^６〜約５×１０^１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）／用量（いずれの数値も含む）の範囲内である。他の実施形態において、該細胞数は、約１×１０^７〜約５×１０^１０ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^８〜約５×１０^１０ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）の範囲内である。さらに別の実施形態において、該細胞数は、約１×１０^２〜約５×１０^１０ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^４〜約５×１０^９ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^５〜約５×１０^９ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^６〜約５×１０^９ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^６〜約５×１０^８ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^７〜約５×１０^９ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）の範囲内である。

［０１６６］ ワクチン中で投与される寄生虫抗原についての細胞数は、約１×１０^２〜約１×１０^１０／用量（いずれの数値も含む）の範囲内である。別の実施形態において、該細胞数は、約１×１０^３〜約１×１０^９／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^４〜約１×１０^８／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^５〜約１×１０^７／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^６〜約１×１０^８／用量（いずれの数値も含む）の範囲内である。

［０１６７］ 従来のアジュバントでは、変性生ウイルスまたは弱毒化ウイルスよりも実質的に多くの量の不活化ウイルスが、同等レベルの血清学的応答を刺激するのに必要となるというのは、当該技術分野で周知である。しかし驚くべきことに、本明細書に記載されたアジュバント組成物では、ほぼ同量の不活化ウイルスと変性生ウイルスが、同様のレベルの血清学的応答を刺激することが見出された。加えて、本明細書に記載されたアジュバントでは、同レベルの血清学的応答を実現するための従来のアジュバントと比較して、少量の変性生ウイルス、弱毒化ウイルス、および不活化ウイルスが必要となる。これらの予想外の発見は、免疫原性組成物およびワクチン組成物を調製する際の供給資源の保存、およびコスト削減を実証している。広範囲の用途を有するワクチンでは、１年あたりに数百万用量の製造が必要となり、そのためこれらの節約は、相当な量になる可能性がある。

［０１６８］組成物の投与
該組成物の用量サイズは、典型的には、対象および抗原に応じて約１ｍＬ〜約５ｍＬ（いずれの数値も含む）の範囲内である。例えばイヌまたはネコの場合、典型的には約１ｍＬの用量が使用されるが、ウシの場合、典型的には約２〜５ｍＬの用量が使用される。しかしこれらのアジュバントは、マイクロドーズで配合することもでき、その場合、約１００μＬの用量が用いられ得る。

［０１６９］ 該アジュバント組成物の投与経路としては、非経口、経口、口鼻腔、鼻内、気管内、外用、皮下、筋肉内、経皮、皮内、腹腔内、眼内、静脈内投与または卵への
投与が挙げられる。シリンジ、点滴器、無針注射器、パッチなどの任意の適切なデバイスを用いて、該組成物を投与し得る。使用に選択される経路およびデバイスは、アジュバントの組成、抗原、および対象に依存し、そのようなことは、当業者に周知されている。

［０１７０］組成物の使用
商業的使用のための任意のワクチンアジュバント調製物の要件の１つが、長期貯蔵期間中のアジュバント溶液の安定性を確保することである。本明細書で提供されるのは、製造が容易で、少なくとも１８ヶ月間安定しているアジュバント製剤である。一実施形態において、該製剤は、約１８ヶ月間安定している。別の実施形態において、該製剤は、約１８〜２４ヶ月間安定している。別の実施形態において、該製剤は、約２４ヶ月間安定している。加速試験手順もまた、本明細書に記載された製剤が安定していることを示している。

［０１７１］ 本発明のアジュバント組成物の有利な特色は、それらが広範囲の対象に安全かつ効果的に投与され得ることである。当該技術分野において、アジュバントの組み合わせが個別の成分よりも反応原性を示すと予測されている。しかし、本明細書に記載された組成物は、アジュバントの効果を維持しながら、任意の１または２種の成分が用いられる組成物に比較して低い反応原性を示す。同じく驚くべきことに、本明細書に記載されたアジュバント組成物は、他のアジュバント組成物に比較して安全性の改善を示すことが見出されている。

［０１７２］ 本明細書に記載されたアジュバント組成物は、対象において所望の免疫応答を誘導するのに有用である。それらは、複数の種において有効である。適切な種は、アジュバント組成物の投与が望ましい任意の動物である。それには、霊長類、家畜、コンパニオンアニマル、実験動物、捕獲された野生動物、鳥類（卵を含む）、爬虫類、および魚類をはじめとする哺乳動物および非哺乳動物が挙げられる。したがってこの用語は、サル、ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、他の家禽、カエル、およびトカゲを包含するが、これらに限定されない。

［０１７３］ 本明細書に記載されたアジュバントを用いて、感染した動物とワクチン接種された動物の間の血清学的な識別を示すことができる。したがってそれらは、ワクチン中の抗原がワクチン接種動物において野生型ウイルスと異なる抗原パターンを誘発する、マーカーワクチン中で用いることができる。マーカーワクチンは、一般に、コンパニオン診断テストと併せて用いられ、そこで抗体パターンの差を測定して、どの動物がワクチン接種され、どの動物が野生型ウイルスに感染したかを実証する。そのような技術は、対象集団からのウイルスの制御および駆除に有用である。

［０１７４］ 本発明はまた、ヘンドラ（Hendra）ウイルスＧタンパク質（ならびにその断片、二量体、多量体、および修飾形態）から提供される抗原を利用してニパ（Nipah
）ウイルスおよび／またはHendraウイルスにより引き起こされる感染および疾患の防御に有用な新規ワクチン組成物を提供し、それらの全てが、本明細書に記載された通りアジュバント添加されている。特定の実施形態において、該アジュバントは、ＴＸＯ、ＴＡＯ、およびＴＸＯ−Ａからなる群から選択される。そのようなワクチンは、例えばウマ、イヌ、ブタおよびヒトにおいて、感染および疾患を予防するのに有用である。最も好ましい実施形態において、ブタおよびイヌの両方が、HendraおよびNipahウイルスの両方から防御
される。

［０１７５］ 近年になり、相当数のヒトを死亡させるＮｉＶの再発生が、問題になっており、例えばButler, Nature, vol. 429, page 7 (2000);およびGurley et al., Emerging Infectious Diseases, vol. 13(7), pp. 1031-1037 (2007)を参照されたい。事例研
究によって、ヒトにおける疾患がブタからの人獣共有感染に関連づけられており、Parashar et al., J. Infect. Dis. vol 181, pp. 1755-1759 (2000)を参照されたい。Hendraウイルスはまた、ウマからの感染を介したヒトの死亡に明確に関連づけられた。現在、ウマへの使用で認可されたHendraウイルス（Equivac（登録商標）HeV; Zoetis）による感染または疾患の予防のための使用権許諾を受けたワクチンが１種存在するが、Nipahウイルス
感染を予防するために使用許諾を受けたワクチンは、存在しない。臨床的に有効になり得るNipahウイルスまたはHendraウイルスワクチンが、依然として求められている。

［０１７６］ HendraウイルスおよびNipahウイルスなどのパラミクソウイルスは、ウ
イルス粒子のエンベロープ中に２つの主要な膜結合型糖タンパク質を有する。一方の糖タンパク質は、宿主細胞上の受容体へのビリオン結合に必要であり、ヘマグルチニン-ノイ
ラミニダーゼタンパク質（ＨＮ）またはヘマグルチニンタンパク質（Ｈ）のどちらかで呼称されており、他方は、赤血球凝集活性もノイラミニダーゼ活性も有さない糖タンパク質（Ｇ）である。これらの結合糖タンパク質は、ＩＩ型膜タンパク質であり、該分子のアミノ（Ｎ）末端が細胞質の方に向かい、タンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端が細胞外にある。他の主要な糖タンパク質が、融合（Ｆ）糖タンパク質であり、これは２つのヘプタッド反復（ＨＲ）領域および疎水性融合ペプチドを含む三量体Ｉ型膜融合性エンベロープ糖タンパク質である。HendraウイルスおよびNipahウイルスは、受容体への結合後、それらの
結合Ｇ糖タンパク質とＦ糖タンパク質との協奏的な作用により、受け手の宿主細胞へのｐＨ非依存的膜融合プロセスを介して細胞に感染する。

［０１７７］ HendraウイルスＧ糖タンパク質がNipahウイルスによる感染および疾患
を潜在的に交差防御する可能性が、K. Bossart et al.,Journal of Virology, vol. 79, pp. 6690-6702 (2005)、およびB. Mungall et al., Journal of Virology, vol. 80, pp.
12293-12302 (2006)により示唆されている。しかし、先行の研究は、いずれの哺乳動物
種についても、これに関して実際に臨床上有効なワクチン組成物を提供しなかった。したがって本発明は、Hendraおよび／またはNipahウイルスへの臨床上有効な防御を誘発する
のに効果的な量で、HendraウイルスＧタンパク質、本発明の実践に従って記載されたアジュバント、および１種以上の賦形剤を含む免疫原性組成物を包含する。

［０１７８］ 本発明の実践において有用となるHendraウイルスＧ糖タンパク質ポリペプチド、およびその組換え発現に関しては、そのような情報が明瞭に示された、発行された国際特許出願第ＷＯ２０１２／１５８６４３号およびＷＯ２００６／０８５９７９号の開示全体を参照されたい。本明細書において有用となる特定のHendraウイルスＧタンパク質ポリペプチドの好ましい例は、ＷＯ２０１２／１５８６４３号に開示されており、それには例えば全長Ｇタンパク質（そのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；その可溶性断片（ＷＯ２０１２／５８６４３号のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸７３〜６０４をコードする）；およびＩｇ（κ）リーダー配列（ＷＯ２０１２／１５８６４３号のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
１６）を有するそれに開示されたさらなる断片がある。一般にHendraウイルスＧ糖タンパク質の可溶性形態は、エクトドメインの全てまたは一部を含み、Ｇ糖タンパク質の膜貫通ドメインの全てまたは一部、および細胞質テールの全てまたは一部を欠失することによって生成される。好ましくはコードする遺伝子配列は、発現のためにコドン最適化されている。

［０１７９］ 幾つかの実施形態において、HendraＧ糖タンパク質は、二量体および／または四量体形態であり得る。そのような二量体は、Ｇ糖タンパク質内のシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合の形成に依存する。そのようなジスルフィド結合は、ネイティブＧ糖タンパク質内に形成されたものに対応することができ、または異なるジスルフィド結合が形成されることで、抗原性を増強させる異なるＧ糖タンパク質二量体および／または四量体形態をもたらすことができる。加えて、同じくＧ糖タンパク質が数多くの
立体配座依存性エピトープ（即ち、第三級の三次元構造から生じる）を提示すること、および多数のそのような天然エピトープの保存が中和抗体反応を付与するのに非常に好ましいことを考慮すれば、非二量体および四量体形態もまた、本発明の実践により有用となる。

［０１８０］ 概して言えば、HendraＧ糖タンパク質のための発現ベクターの構築は、ＷＯ２０１２／１５８６４３号の実施例１に記載された通りで、得られたＣＨＯ細胞からのタンパク質発現は、その実施例２に記載された通りであっても、あるいはワクチン系（その実施例３参照）または２９３細胞（その実施例４参照）を利用してもよい。具体的な好ましい実施形態において、可溶性Ｇタンパク質は、ネイティブなHendraウイルスＧ糖タンパク質のアミノ酸７３〜６０４として提供される（ＷＯ２０１２／１５８６４３号のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２参照）。その二量体化は、自発的に、ＣＨＯ細胞からの発現と同時に起こり、得られたＧタンパク質は、およそ５０％二量体および５０％四量体であり、単量体はほとんど残留しない。２９３Ｆ細胞内での発現により、約７０％二量体になる。得られたタンパク質画分は、本出願全体に記載された通りアジュバントと混合される。ＷＯ２０１２／１５８６４３号に記載された通り、大型動物での好ましい抗原用量は、５０〜２００マイクログラム／用量の範囲内であり、１００マイクログラムが最も好ましい用量である。当業者に理解される通り、イヌなどの小動物の場合、２５〜５０マイクログラムなど、より少量が必要となる。

［０１８１］ 加えて、先に記載された実施形態のいずれかによるアジュバントは、診断または治療抗体の作製に用いられ得る。本発明のこの態様において、供給動物が、本発明のアジュバント組成物および抗原を含む製剤で免疫化される。抗原の選択は、前記治療または診断抗体を得る必要がある人物によって決定され、それには、ウイルス、ウイルス、細菌、ウイルス粒子、抽出物、組換え抗原、細胞壁構造などが挙げられるが、これらに限定されない。抗原には、ヘビの咬傷の薬品を製造するための毒液も含まれ得る。

［０１８２］ 本発明のこの態様に適した抗原は、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジまたはトリ起源のものであり得る。特定の実施形態において、該抗原は、ＦｅＬＶｇｐ７０、ウシパラインフルエンザ−３ ＢＰＩ−３（ＨＮタンパク質）、 Histophilus somni p31、Bordetella FHA、パラポックス、ＢＶＤＶ１ ｇｐ５３、ＢＶＤＶ２ ｇｐ５３、クロストリジア毒、イヌサーコウイルス、 Brachyspira hyodysenteriae (ブタ種)
抗原、不活化された全細胞、および不活化されたペプシン消化物から選択され得る。

［０１８３］ 免疫化後の特定の時間に、抗体供給源が、供給動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、家禽、ウシ、ウマ）から抽出される。特定の他の実施形態において、該供給動物は、ネコまたはイヌである。抗体の供給源は、最終的にはモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のどちらが必要であるか、に依存する。ポリクローナル抗体の場合、血清または乳の使用を考慮することができる。モノクローナル抗体の場合、脾臓細胞が、適切な供給源である。そのような抗体は、非限定的に抗毒液、移植片拒絶用医薬、血清中和アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ウェスタン（Western）ブロット、細胞アッセイ、効力アッセイ、および免疫組
織化学的測定をはじめとし、診断、研究、または治療目的で用いることができる。本発明は、非限定的に抗毒液、移植片拒絶用医薬、血清中和アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、Westernブロット、細胞アッセイ、効力アッセイ、および免疫組織化学的測定をは
じめとし、診断および治療適用に用いられる供給動物から抽出されたモノクローナルおよびポリクローナル抗体を提供する。

［０１８４］ 特定の実施形態において、本発明の組成物での免疫化は、少なくとも１種の動物（好ましくは少なくとも２種の動物、または少なくとも３種の動物、または処置
動物の５０％、または処置動物の少なくとも７５％、または最も好ましくは各処置動物）の所望の抗原に対して十分に高い（１０００を超える、またはより好ましくは５０００を超える、またはより好ましくは１００００を超える、またはより好ましくは５００００を超える、またはより好ましくは１０００００を超える、またはより好ましくは２５００００を超える、またはより好ましくは５０００００を超える、またはより好ましくは１００００００を超える）血清力価を誘発し、それにより診断または研究適用に十分な抗体量を得る。

［０１８５］ 典型的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）アイソタイプの抗体が、これらの適用例に用いられるが、他のアイソタイプの抗体、例えば免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）も用いられる。抗体供給源は、最終的にはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらが望ましいかに依存する。ポリクローナル抗体の場合、抗体供給源として血清または乳を利用することができる。モノクローナル抗体の場合、脾臓細胞が、適切な供給源である。必要な場合の抗体の更なる精製、またはモノクローナル抗体の調製は、文献に詳細に記載されており、当業者は、これらの手順を実施するのに過剰な難題を有さない。さらに抗体は、必要に応じて、標的種に適合され得る（例えば、イヌ化（canonized）また
はネコ化）。同じくそれを実施する技術は、当該技術分野で周知であり、本出願に記載される必要はない。

［０１８６］抗体の適用
抗体は、血清中和アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、Westernブロット、細胞ア
ッセイ、効力アッセイおよび免疫組織化学的測定のための試薬として適している。これらの技術は、当該分野において公知である。

［０１８７］ 本発明の抗体は、例えば移植片拒絶において、例えば抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）剤の生成用の、治療剤としても用いられ得る。現在、２種のそのような薬剤：Atgam（登録商標）およびThymoglobulin（登録商標）が、販売されている。一般に抗胸腺グロブリンを生成する方法は、米国特許出願公開第２００４００２３３４０号に記載されている。

［０１８８］ それは、抗毒液医薬品の調製にも用いられ得る。これらの実施形態において、ヘビ毒成分が、抗原として用いられる。その毒液およびその成分もまた、当該技術分野で周知である。

［０１８９］ 非限定的に家禽、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、およびウマの種をはじめとする多くの種の動物が、供給動物として用いられ得る。供給動物の選択は、目の前の課題と当業者の判断に依存する。

［０１９０］ 具体的で非限定的な実施形態は、以下の通りである：
［０１９１］ 第一の実施形態において、本発明は、油相および水相を含むアジュバント製剤であって、該油相が、該製剤の少なくとも５０％ｖ／ｖを占め、前記製剤が、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）またはその類似体および免疫刺激性オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方を含むが、ただし
ａ）前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、存在しない場合、該製剤が、
ｉ．ポリＩ：Ｃ、糖脂質、および所望により第四級アミン、または
ｉｉ．ポリカチオン性担体
を含み、
ｂ）前記モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）またはその類似体が、存在しない場合、該製剤が、アルミニウムの供給源を含むこと、
を条件とする、アジュバント製剤を提供する。

［０１９２］ 第二の実施形態において、本発明は、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、存在する場合には、ＣｐＧまたはオリゴリボヌクレオチドであり；ポリカチオン性担体が、存在する場合には、デキストラン、デキストランＤＥＡＥ（およびその誘導体）、ＰＥＧ、グアーガム、キトサン誘導体、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）ポリエチレンイミンのようなポリセルロース誘導体、ポリアミノからなる群から選択され；第四級アミンが、存在する場合には、ＤＤＡおよびアブリジンからなる群から選択される、第一の実施形態のアジュバント製剤を提供する。

［０１９３］ 第三の実施形態において、本発明は、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、存在する場合には、ＣｐＧであり；ポリカチオン性担体が、存在する場合には、デキストランＤＥＡＥであり；第四級アミンが、存在する場合には、ＤＤＡである、第一または第二の実施形態によるアジュバント製剤を提供する。

［０１９４］ 第四の実施形態において、本発明は、糖脂質が、存在する場合には、式Ｉ：

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、独立して水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキルラジカルであり；Ｘは、−ＣＨ_２−、−Ｏ−、または−ＮＨ−であり：Ｒ^２は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和もしくは不飽和アルキルラジカルであり；Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、独立して水素、−ＳＯ_４ ^２−、−ＰＯ_４ ^２−、−ＣＯＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^６は、Ｌ−アラニル、Ｌ−α−アミノブチル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロリル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−トレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニル、およびＬ−バリル、またはそれらのＤ型異性体である）で示される化合物を含む、第一〜第三の実施形態のいずれか１つによるアジュバント製剤を提供する。

［０１９５］ 第五の実施形態において、本発明は、該糖脂質が、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−ｂ−Ｄ−グリコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドまたはその塩である、第四の実施形態のアジュバント製剤を提供する。

［０１９６］ 第六の実施形態において、本発明は、該塩が、酢酸塩である、第五の実施形態のアジュバント製剤を提供する。

［０１９７］ 第七の実施形態において、本発明は、前記モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）またはその類似体の両方を含み、ステロールおよびポリＩ：Ｃのうちの少なく
とも一方をさらに含む、指標と思われる（fists thought）第四の実施形態のいずれか１
つのアジュバント製剤を提供する。

［０１９８］ 第八の実施形態において、本発明は、ステロールを含み、サポニンをさらに含む、第七の実施形態によるアジュバント製剤を提供する。

［０１９９］ 第九の実施形態において、本発明は、サポニンが、存在する場合には、トリテルペノイドサポニンであり、ステロールが、存在する場合には、エルゴステロール、ラノステロール、およびコレステロールからなる群から選択される、第七および第八の実施形態のいずれか一方のアジュバント製剤を提供する。

［０２００］ 第十の実施形態において、本発明は、サポニンが、存在する場合には、Quil Aであり、ステロールが、存在する場合には、コレステロールである、第九の実施形態によるアジュバント製剤を提供する。

［０２０１］ 第十一の実施形態において、本発明は、ポリＩ：Ｃを含み、第四級アミンおよび糖脂質のうちの少なくとも一方をさらに含む、第七の実施形態によるアジュバント製剤を提供する。

［０２０２］ 第十二の実施形態において、本発明は、該ＭＰＬ−Ａまたはその類似体を０．５〜１００μｇ／用量の量で含む、第一〜第十一の実施形態のいずれか１つのアジュバント製剤を提供する。

［０２０３］ 第十三の実施形態において、本発明は、該ＭＰＬ−Ａまたはその類似体が５〜５０μｇ／用量、または５〜２０μｇ／用量、または１〜５μｇ／用量の量で存在する、第十二の実施形態によるアジュバント製剤を提供する。

［０２０４］ 第十四の実施形態において、本発明は、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドを０．５〜４００μｇ／用量の量で含む、第一〜第十三の実施形態のいずれか１つのアジュバント製剤を提供する。

［０２０５］ 第十五の実施形態において、本発明は、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドが約１００〜約２５０μｇ／用量、または約２０〜約５０μｇ／用量、または約１μｇ／用量の量で存在する、第十四の実施形態のアジュバント製剤を提供する。

［０２０６］ 第十六の実施形態において、本発明は、該ポリカチオン性担体を約０．５〜約４００ｍｇ／用量の量で含む、第一〜第十五の実施形態のいずれか１つのアジュバント製剤を提供する。

［０２０７］ 第十七の実施形態において、本発明は、前記ポリカチオン性担体が５０〜３００ｍｇ／用量、または１〜２５ｍｇ／用量、または１〜１０ｍｇ／用量の量で存在する、第十六の実施形態のアジュバント製剤を提供する。

［０２０８］ 第十八の実施形態において、本発明は、該糖脂質を約０．５〜約２０００μｇ／用量の量で含む、第一〜第十七の実施形態のいずれか１つのアジュバント製剤を提供する。

［０２０９］ 第十九の実施形態において、本発明は、前記糖脂質が約１０００μｇ／用量、または２５〜５０μｇ／用量、または１〜１０μｇ／用量の量で存在する、第十八の実施形態のアジュバント製剤を提供する。

［０２１０］ 第二十の実施形態において、本発明は、該ステロールを約０．１〜約１０００μｇ／用量の量で含む、第一〜第十九の実施形態のいずれか１つのアジュバント製剤を提供する。

［０２１１］ 第二十一の実施形態において、本発明は、前記ステロールが２５０〜５００μｇ／用量、または２０〜５０μｇ／用量、または１〜１０μｇ／用量の量で存在する、第二十の実施形態によるアジュバント製剤を提供する。

［０２１２］ 第二十二の実施形態において、本発明は、該サポニンを０．１〜１０００μｇ／用量の量で含む、第一〜第二十一の実施形態のいずれか１つのアジュバント製剤を提供する。

［０２１３］ 第二十三の実施形態において、本発明は、前記サポニンが２５０〜５００μｇ／用量、または２０〜５０μｇ／用量、または１〜１０μｇ／用量の量で存在する、第二十二の実施形態のアジュバント製剤を提供する。

［０２１４］ 第二十四の実施形態において、本発明は、該ポリＩ：Ｃを約０．５〜約１００μｇ／用量の量で含む、第一〜第二十三の実施形態のいずれか１つのアジュバント製剤を提供する。

［０２１５］ 第二十五の実施形態において、本発明は、前記ポリＩ：Ｃが５〜５０μｇ／用量、または５〜２０μｇ／用量、または１〜５μｇ／用量の量で存在する、第二十四の実施形態のアジュバント製剤を提供する。

［０２１６］ 第二十六の実施形態において、本発明は、水酸化アルミニウムゲルであるアルミニウム供給源を含む、第一〜第二十五の実施形態のいずれか１つのアジュバント製剤を提供する。

［０２１７］ 第二十七の実施形態において、本発明は、前記アルミニウム供給源が該製剤の５〜２０％ｖ／ｖの量で存在する、第二十六の実施形態のアジュバント製剤を提供する。

［０２１８］ 第二十八の実施形態において、本発明は、前記アルミニウム供給源が該製剤の１０％ｖ／ｖの量で存在する、第二十七の実施形態のアジュバント製剤を提供する。

［０２１９］ 第二十九の実施形態において、本発明は、前記油相が油および脂溶性乳化剤を含む、第一〜第二十八の実施形態のいずれか１つのアジュバント製剤を提供する。

［０２２０］ 第三十の実施形態において、本発明は、前記油相が８５％ｖ／ｖまでの量で存在する、第一〜第二十九の実施形態のいずれか１つのアジュバント製剤を提供する。

［０２２１］ 第三十一の実施形態において、本発明は、前記油相が５１％の量で存在する、第三十の実施形態によるアジュバント製剤を提供する。

［０２２２］ 第三十二の実施形態において、本発明は、前記油が、該製剤の４０〜８４％ｖ／ｖを占め、前記脂溶性乳化剤が該製剤の１〜１１％ｖ／ｖを占める、第二十九〜第三十一の実施形態のいずれか１つのアジュバント製剤を提供する。

［０２２３］ 第三十三の実施形態において、本発明は、前記油が、該製剤の４５％ｖ／ｖを占め、前記脂溶性乳化剤が該製剤の６％ｖ／ｖを占める、第三十二の実施形態のアジュバント製剤を提供する。

［０２２４］ 第三十四の実施形態において、本発明は、前記油が、スクアラン、植物油、トリグリセリド、非代謝性直鎖アルカン油、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、第一〜第三十三の実施形態のいずれか１つによるアジュバント製剤を提供する。

［０２２５］ 第三十五の実施形態において、本発明は、前記油が、軽質鉱物油である、第三十四の実施形態によるアジュバント製剤を提供する。

［０２２６］ 第三十六の実施形態において、本発明は、有効量の抗原、および第一〜第三十五の実施形態のいずれか１つによるアジュバント製剤、を含むワクチン組成物であって、該組成物の油相が、少なくとも５０％ｖ／ｖである、ワクチン組成物を提供する。

［０２２７］ 第三十七の実施形態において、本発明は、有効量の抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、該アジュバント製剤が、油相および水相を含み、該油相が、該製剤の少なくとも５０％ｖ／ｖを占め、ポリカチオン性担体、ならびに、
ａ．サポニンと、ステロールと、所望により第四級アミンとの組み合わせ；ただし、前記アジュバント製剤が本質的にＤＥＡＥデキストラン、Quil A、コレステロール、およびＤＤＡからなる場合、該抗原がE coli J-5バクテリンでないことを条件とする；あるいは
ｂ．免疫刺激性オリゴヌクレオチド；ただし、前記アジュバント製剤が本質的にＤＥＡＥデキストランおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチドからなる場合、該抗原がウシ、ヒツジ、ウマもしくはブタを罹患させる病原を含むか、または前記病原に由来し、E coli J-5バクテリンでないことを条件とする、
を含む、ワクチン組成物を提供する。

［０２２８］ 第三十八の実施形態において、本発明は、サポニンが、存在する場合には、トリテルペノイドサポニンであり、ステロールが、存在する場合には、エルゴステロール、ラノステロール、およびコレステロールからなる群から選択され、ポリカチオン性担体が、存在する場合には、デキストラン、デキストランＤＥＡＥ（およびその誘導体）、ＰＥＧ、グアーガム、キトサン誘導体、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）ポリエチレンイミンのようなポリセルロース誘導体、ポリアミノからなる群から選択され；第四級アミンが、存在する場合には、ＤＤＡおよびアブリジンからなる群から選択される、第三十七の実施形態によるワクチン組成物を提供する。

［０２２９］ 第三十九の実施形態において、本発明は、サポニンが、Quil Aであり、ステロールが、コレステロールであり、ポリカチオン性担体が、デキストランＤＥＡＥであり；第四級アミンが、ＤＤＡである、第三十八の実施形態によるワクチン組成物を提供する。

［０２３０］ 第四十の実施形態において、本発明は、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧである。第三十七〜第三十九の実施形態のいずれか１つのワクチン組成物を提供する。

［０２３１］ 第四十一の実施形態において、本発明は、前記ポリカチオン性担体が約０．５〜約４００ｍｇ／用量の量で存在する、第三十七〜第四十の実施形態のいずれか１つのワクチン組成物を提供する。

［０２３２］ 第四十二の実施形態において、本発明は、前記ポリカチオン性担体が５０〜３００ｍｇ／用量、または１〜２５ｍｇ／用量、または１〜１０ｍｇ／用量の量で存在する、第四十一の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２３３］ 第四十三の実施形態において、本発明は、該サポニンを約０．１〜約１０００μｇ／用量の量で含む、第三十七〜第四十二の実施形態のいずれか１つのワクチン組成物を提供する。

［０２３４］ 第四十四の実施形態において、本発明は、該サポニンが２５０〜５００μｇ／用量、または２０〜５０μｇ／用量、または１〜１０μｇ／用量の量で存在する、第四十三の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２３５］ 第四十五の実施形態において、本発明は、該ステロールを約０．１〜約１０００μｇ／用量の量で含む、第三十七〜第四十四の実施形態のいずれか１つのワクチン組成物を提供する。

［０２３６］ 第四十六の実施形態において、本発明は、該ステロールが２５０〜５００μｇ／用量、または２０〜５０μｇ／用量、または１〜１０μｇ／用量の量で存在する、第四十五の実施形態によるワクチン組成物を提供する。

［０２３７］ 第四十七の実施形態において、本発明は、該第四級アミンを約１〜約２００μｇ／用量の量で含む、第三十七〜第四十六の実施形態のいずれか１つのワクチン組成物を提供する。

［０２３８］ 第四十八の実施形態において、本発明は、該第四級アミンが約１０μｇ／用量、または約１０〜約１００μｇ／用量、または約５μｇ／用量の量で存在する、第四十七の実施形態によるワクチン組成物を提供する。

［０２３９］ 第四十九の実施形態において、本発明は、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドを約０．５〜約４００μｇ／用量の量で含む、第三十七〜第四十八の実施形態のいずれか１つのワクチン組成物を提供する。

［０２４０］ 第五十の実施形態において、本発明は、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドが１００〜２５０μｇ／用量、または２０〜５０μｇ／用量、または約１μｇ／用量の量で存在する、第四十九の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２４１］ 第五十一の実施形態において、本発明は、該油相が油および脂溶性乳化剤を含む、第三十七〜第五十の実施形態のいずれか１つのワクチン組成物を提供する。

［０２４２］ 第五十二の実施形態において、本発明は、前記油相が８５％ｖ／ｖまでの量で存在する、第三十七〜第五十一の実施形態のいずれか１つのワクチン組成物を提供する。

［０２４３］ 第五十三の実施形態において、本発明は、前記油相が５１％ｖ／ｖの量で存在する、第五十二の実施形態によるワクチン組成物を提供する。

［０２４４］ 第五十四の実施形態において、本発明は、該油がワクチン組成物の４０〜８４％ｖ／ｖを占め、該脂溶性乳化剤がワクチン組成物の１〜１１％ｖ／ｖを占める、第五十一〜第五十三の実施形態のいずれか１つのワクチン組成物を提供する。

［０２４５］ 第五十五の実施形態において、本発明は、該油が該製剤の４５％ｖ／ｖを占め、前記脂溶性乳化剤が該製剤の６％ｖ／ｖを占める、第五十三の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２４６］ 第五十六の実施形態において、本発明は、Eimeria maximaまたはClostridium perfringens抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、該アジ
ュバント製剤が、
ａ）該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、ポリカチオン性担体、および所望により免疫刺激性オリゴヌクレオチド；または
ｂ）該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ステロール、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体、
を含む、ワクチン組成物を提供する。

［０２４７］ 第五十七の実施形態において、本発明は、Eimeria maximaおよびClostridium perfringensに対する抗原を含む、第五十六の実施形態のワクチン組成物を提供す
る。

［０２４８］ 第五十八の実施形態において、本発明は、前記ポリカチオン性担体が、ＤＥＡＥデキストランである、請求項５６の実施形態または５７の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２４９］ 第五十九の実施形態において、本発明は、家禽においてEimeria maximaまたはClostridium perfringensにより引き起こされる感染の処置または予防のための、
請求項５６〜５８の実施形態によるワクチン組成物の使用を提供する。

［０２５０］ 第六十の実施形態において、本発明は、Neospora抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、該アジュバント製剤が、該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、ならびに、
ａ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体；または
ｂ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性担体との組み合わせ、
を含む、ワクチン組成物を提供する。

［０２５１］ 第六十一の実施形態において、本発明は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドとデキストランＤＥＡＥとの組み合わせを含む、第六十の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２５２］ 第六十二の実施形態において、本発明は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）またはその類似体を含み、免疫刺激性オリゴヌクレオチドをさらに含む、第六十の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２５３］ 第六十三の実施形態において、本発明は、ステロールをさらに含む、第六十二の実施形態のワクチンを提供する。

［０２５４］ 第六十四の実施形態において、本発明は、前記ステロールがコレステロールである、第六十三の実施形態のワクチンを提供する。

［０２５５］ 第六十五の実施形態において、本発明は、前記Neospora抗原がNeospora
caninum抗原である、第六十〜六十四の実施形態いずれか１つによるワクチンを提供する
。

［０２５６］ 第六十六の実施形態において、本発明は、Neosporaにより引き起こされる感染の処置または予防のための、第六十〜六十五の実施形態いずれか１つのワクチンを提供する。

［０２５７］ 第六十七の実施形態において、本発明は、Chlamydophila abortis抗原
およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、該アジュバント製剤が、該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相；ステロール；免疫刺激性オリゴヌクレオチド；モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）またはその類似体；およびポリＩ：Ｃを含む、ワクチン組成物を提供する。

［０２５８］ 第六十八の実施形態において、本発明は、雌ヒツジにおいてC. abortisにより引き起こされる流産の処置または予防のための、第六十七の実施形態によるワクチンの使用を提供する。

［０２５９］ 第六十九の実施形態において、本発明は、ミオスタチンおよびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、該アジュバント製剤が、該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびに、
ａ）ポリカチオン性担体；または
ｂ）ＭＰＬ−Ａもしくはその類似体、
のいずれか、を含む、ワクチン組成物を提供する。

［０２６０］ 第七十の実施形態において、本発明は、ＭＰＬ−Ａまたはその類似体を含む第六十九の実施形態のワクチン組成物であって、前記製剤が、前記組成物５０μｌあたり０．５μｇ未満のステロールを含む、ワクチン組成物を提供する。

［０２６１］ 第七十一の実施形態において、本発明は、ステロールを含まない、第七十の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２６２］ 第七十二の実施形態において、本発明は、該ステロールがコレステロールである、第七十の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２６３］ 第七十三の実施形態において、本発明は、動物におけるミオスタチンの量を減少させるための、実施形態６９〜７２のいずれか１つによるワクチンの使用を提供する。

［０２６４］ 第七十四の実施形態において、本発明は、前記動物が家禽動物である、第七十三の実施形態による使用を提供する。

［０２６５］ 第七十五の実施形態において、本発明は、Trueperella pyogenes抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、該アジュバント製剤が、該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびポリカチオン性担体を含む、ワクチン組成物を提供する。

［０２６６］ 第七十六の実施形態において、本発明は、該Trueperella pyogenes抗原がピオリシンである、第七十五の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２６７］ 第七十七の実施形態において、本発明は、Trueperella pyogenesにより引き起こされる感染の処置または予防のための、第七十四または七十五の実施形態のワク
チン組成物の使用を提供する。

［０２６８］ 第七十八の態様において、本発明は、E coli抗原、ＢＲＶ抗原もしくはＢＣＶ抗原、および、アジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記ワクチン組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびにポリカチオン性担体およびアルミニウム供給源の少なくとも一方を含む、ワクチン組成物を提供する。

［０２６９］ 第七十九の態様において、本発明は、E coli抗原、ＢＲＶ抗原およびＢＣＶ抗原を含む、第七十八の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２７０］ 第八十の実施形態において、本発明は、
ａ．E coli抗原が、存在する場合には、E coli K99、E coli F41およびそれらの組み合わせからなる群から選択され；
ｂ．ＢＲＶ抗原が、存在する場合には、ＢＲＶ Ｇ６、ＢＲＶ Ｇ１０およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、
第七十八または第七十九の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２７１］ 第八十一の実施形態において、本発明は、該ポリカチオン性担体が、存在する場合には、デキストランＤＥＡＥであり；免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧである、第七十八〜八十の実施形態のいずれか１つによるワクチン組成物を提供する。

［０２７２］ 第八十二の実施形態において、本発明は、水酸化アルミニウムゲルであるアルミニウム供給源を含む、第七十八〜第八十一の実施形態のいずれか１つによるワクチン組成物を提供する。

［０２７３］ 第八十三の実施形態において、本発明は、前記アルミニウム供給源が５〜２０％ｖ／ｖの量で存在する、第八十二の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２７４］ 第八十四の実施形態において、本発明は、前記アルミニウム供給源が１０〜１７％ｖ／ｖの量で存在する、第八十三の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２７５］ 第八十五の実施形態において、本発明は、ウシ類動物においてE coli、ＢＣＶまたはＢＲＶにより引き起こされる腸炎の処置または予防のための、第七十八〜八十四の実施形態のいずれか１つによるワクチン組成物の使用を提供する。

［０２７６］ 第八十六の実施形態において、本発明は、前記ワクチンが前記抗原（複数可）への少なくとも６ヶ月間の免疫を誘発する、第九十一の実施形態による使用を提供する。

［０２７７］ 第八十七の実施形態において、本発明は、Rhipicephalus microplus抗
原およびアジュバントを含むワクチン組成物であって、前記アジュバントが、
ａ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド、サポニン、ステロール、第四級アミン、ポリアクリルポリマー、および糖脂質を含む水性アジュバント；ならびに、
ｂ）該ワクチン組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相を含み、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性担体を含む、油性アジュバント、
からなる群から選択される、ワクチン組成物を提供する。

［０２７８］ 第八十八の実施形態において、本発明は、該サポニンが、Quil Aであり、該ステロールが、コレステロールであり、該第四級アミンが、ＤＤＡであり、該糖脂質
が、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドまたはその塩であり、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧである、第八十七の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２７９］ 第八十九の実施形態において、本発明は、該ポリカチオン性担体が、デキストランＤＥＡＥであり、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧである、第八十七の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２８０］ 第九十の実施形態において、本発明は、該Rhipicephalus microplus抗
原が、Ｂｍ８６タンパク質である、第八十七〜八十九の実施形態のいずれか１つのワクチン組成物を提供する。

［０２８１］ 第九十一の実施形態において、本発明は、Rhipicephalus microplusに
より引き起こされる感染の処置または予防のための、第八十七〜九十の実施形態のいずれか１つによるワクチン組成物の使用を提供する。

［０２８２］ 第九十二の実施形態において、本発明は、口蹄疫（ＦＭＤ）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記ワクチン組成物の少なくとも３６％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびポリカチオン性担体を含み、前記ワクチン組成物が、油中水エマルジョンである、ワクチン組成物を提供する。異なる実施形態において、前記口蹄疫ウイルス抗原は、野生型ＦＭＤＶ、遺伝子修飾および／もしくは弱毒化ＦＭＤＶ株、または組換え発現されたＦＭＤＶ構造タンパク質、例えば血清型Ａ、Ｃ、Ｏ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、またはＳＡＴ３のウイルス様粒子（ＶＬＰ）などであり得る。

［０２８３］ 第九十三の実施形態において、本発明は、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドがＣｐＧであり、該ポリカチオン性担体がＤＥＡＥデキストランである、第九十二のワクチン組成物を提供する。

［０２８４］ 第九十四の実施形態において、本発明は、抗原がある第九十二または九十三の実施形態のワクチン組成物を提供し、本発明は、抗原がウシおよびブタにおいて弱毒化される遺伝子修飾されたＦＭＤ−ＬＬ３Ｂ３Ｄプラットフォームウイルス、具体的にはFMD-LL3B3D-A24 Cruzeiroに由来する、請求項９８または９９の実施形態のワクチン組
成物を提供する。

［０２８５］ 第九十五の実施形態において、本発明は、ウシにおけるＦＭＤの処置または予防のための、第九十二または第九十四の実施形態のいずれか１つのワクチン組成物の使用を提供する。

［０２８６］ 第九十六の実施形態において、本発明は、Streptococcus uberis （S. uberis）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、該アジュバント製剤が、該組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、ポリカチオン性担体、ならびに、
ａ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド；
ｂ）サポニン、ステロール、および第四級アミンを含む組み合わせ；または
ｃ）それらの組み合わせ、
を含む、ワクチン組成物を提供する。

［０２８７］ 第九十七の実施形態において、本発明は、該抗原がS uberis接着分子またはそれらの免疫原性断片である、第九十六の実施形態のワクチン組成物を提供する。

［０２８８］ 第九十八の実施形態において、本発明は、S uberisにより引き起こされる感染の処置または予防のための、第九十六または九十七の実施形態のいずれか１つによるワクチンの使用を提供する。

［０２８９］ 以下の実施例は、例示的な実施形態として示されており、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。本発明の多くの変更、改変、修正、ならびに他の使用および適用例が、当業者に明白となろう。

［０２９０］実施例１．蜂巣炎性腸炎への免疫を増強するための組換えワクチン方策の開発
本試験の目的は、蜂巣炎性腸炎の疾患モデルにおけるEimeria maximaおよびClostridium perfringensの生菌チャレンジ感染に対するアジュバント添加組換えクロストリジアワ
クチンのインビボワクチン接種の影響を評価することであった。

［０２９１］材料と方法
組換えタンパク質：C. perfringens (VA州ManassasのATCC 13124, American Type Culture Collection) ＮｅｔＢおよびＥＦ−Ｔｕをコードする遺伝子の全長コード配列を、ＰＣＲにより、ＮＨ_２−末端ポリヒスチジンエピトープタグを有するｐＥＴ３２ａ（＋）ベクターにクローニングした。クローニングされた遺伝子を、拮抗するEscherichia coliに形質転換して、該細菌を３７℃で１６時間培養し、１．０ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（OH州Cleveland のAmresco）を用いて３７℃で５時間導入した。細
菌を４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより採取し、ＰＢＳに再懸濁させて、音波処理により破壊し、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清をNi-NTAアガロース（CA州Valencia のQiagen）と共に２２℃で１時間インキュベートし、
該樹脂をＰＢＳで洗浄し、精製されたクロストリジウムタンパク質をｐＨ９．２のＰＢＳ中の２５０ｍＭイミダゾールで溶出させた。タンパク質の純度をクーマシーブルー染色されたＳＤＳ−アクリルアミドゲルで確認した。タンパク質の濃度をSigmaの市販キットを
利用して決定した。

［０２９２］ 動物：Longeneckers Hatchery (PA州Elizabethtown)で孵化された１日
齢ブロイラー鳥（Ross/Ross）をBARC-East, Building 1082に運搬し、該ニワトリをBARC Small Animal Care Committeeの確立されたガイドラインに従ってPetersime幼動物保育器で飼育した。トリをEimeriaを含まない施設の保育器で飼育し、別の場所の大型吊り下げ
かごに移動させてそこで感染させ、生菌チャレンジ感染試験の実験期間終了まで飼育した。運搬、体重測定、感染ならびに血液および脾臓採取に関する手順は全て、BARC Small Animal Care Committee （SOP所有）により認可されたものであった。ARS BARC Small Animal Care Committeeは、BARCでの動物実験のためのガイドラインを確立し、動物施設全ての定期的検閲を実施している。

［０２９３］ 免疫化：１日齢ブロイラーニワトリにワクチン１００μｌ（Ａｇ １００μｇ／用量）を皮下注射することにより、一次免疫化を実施した。二次免疫化は、７週齢ブロイラーニワトリにワクチン１００μｌ（Ａｇ １００μｇ／用量）を皮下注射することにより、実施した。

［０２９４］ Eimeriaチャレンジ：Animal Parasitic Diseases Laboratory で生育され、確立された手順に従って増殖されたEimeria属のBARC株。E. maxima(41A)を５％次亜
塩素酸ナトリウムに浮遊させることにより浄化し、ＰＢＳで３回洗浄して、ヘモサイトメータを利用してトリパンブルーにより生存数を計数した。オーシスト数は、胞子形成され
たオーシストのみに基づいている。追加免疫の６日後に、接種針を用いてニワトリにE. maxima １０，０００個を食道内に接種した。

［０２９５］ C. perfringensチャレンジ：Eimeria感染の４日後に、それぞれ接種針
を用いて１×１０^９ＣＦＵのClostridium perfringensをＮＥ群のトリの食道内に接種し
た。

［０２９６］ 分析：到着日、ＥＭでのチャレンジ直前、C. perfringensでのチャレンジ前、Ｃ．Ｐチャレンジの２日後、およびＣ．Ｐチャレンジの１０日後に、トリを計量して、体重増加率を計測した。

［０２９７］ 腸病変をスコアリングするために、トリ（５匹／群）をＣ．Ｐ．感染の２日後に殺処分した。憩室の前後１０ｃｍに及ぶおよそ２０ｃｍの腸区分を得て、長手方向に切断した。病変スコアを、２名の独立した観察者により、病変の重症度が上昇する順に０〜４で評価した。

［０２９８］ ニワトリにおける２つの主要なC. perfringens病原因子は、アルファトキシンおよびＮｅｔＢ(壊死性腸炎Ｂ様) トキシンであり、それらは両者ともＮＥの病原
に関係している。ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯ）および伸長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）をはじめとする細菌病原および宿主防御免疫に関与し得る更なるC.
perfringensタンパク質は、これまでに、C. perfringensでの実験的チャレンジ感染に対する防御免疫を誘導することが報告されている。したがって、これらの因子に対する抗体力価は、以下に記載される通り決定された。

［０２９９］ 安楽死直後の心穿刺により採取された血液について、１群あたり５匹のトリを無作為に選択した。血清を低速遠心分離により得て、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に用いてα−トキシン−、ＮｅｔＢ−、ＥＦ、およびＰＦＯ−特異性抗体レベルを測定した。手短に述べると、９６ウェルマイクロタイタープレートを、精製された組換えαトキシン−、ＮｅｔＢ−、ＥＦ、およびＰＦＯ−タンパク質の１．０μｇ／ウェルで一晩コーティングした。０．０５％Tweenを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを洗浄し
、１％BSAを含むＰＢＳでブロッキングした。血清（１００μｌ／ウェル）を緩やかに撹
拌しながら室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄して、ペルオキシダーゼをコンジュゲートさせたウサギ抗ニワトリＩｇＧ（MO州St. Louis のSigma）
およびペルオキシダーゼ特異性基質で結合された抗体を検出した。４５０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）を、自動マイクロプレートリーダー（CA州Richmond のBio-Rad）で測定した。

［０３００］ 統計解析：値は全て、平均±SEMで表す。体重増加率および病変スコア
の平均値を、SPSS 15.0 for Windows (IL州ChicagoのSPSS Inc.)を用いた分散分析でのTurkey検定により群間で比較する。平均の差は、ｐ＜０．０５を有意と判断する。

［０３０１］ 実験計画を表１に示す。

［０３０２］ 該アジュバントの組成は、以下の通りであった（５０μｌあたり）：
［０３０３］ ＴＸＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８が、１μｇの量で存在し、デキストランＤＥＡＥが、５μｇの量で存在し、軽質鉱物油が、該組成物の５１％ｖ／ｖの量で存在した。

［０３０４］ ＴＣＭＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８が、１μｇの量で存在し、コレステロールが、１μｇの量で存在し、ＭＰＬ−Ａが、１μｇ／５０μｌ用量の量で存在し、軽質鉱物油が、該組成物の５１％ｖ／ｖの量で存在した。

［０３０５］ ＸＯ：デキストランＤＥＡＥが、５μｇの量で存在し、軽質鉱物油が、該組成物の５１％ｖ／ｖの量で存在した。

［０３０６］ ＸＯＭ：デキストランＤＥＡＥが、５μｇの量で存在し、軽質鉱物油が、該組成物の５１％ｖ／ｖの量で存在し、ＭＰＬ−Ａが、１μｇの量で存在した。

［０３０７］ ５％AMPHIGEN（登録商標）＋ポリＩ：Ｃ：ポリＩ：Ｃが、１μｇの量で存在した。

［０３０８］ ５％AMPHIGEN（登録商標）＋ＣｐＧ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８が、１μ
ｇの量で存在した。

［０３０９］ ５％AMPHIGEN（登録商標）＋ＤＥＡＥデキストラン：ＤＥＡＥデキストランが、２５μｇの量で存在した。

［０３１０］ ５％AMPHIGEN（登録商標）＋ＤＤＡ：ＤＤＡが、１μｇの量で存在した。

［０３１１］ 体重増加率は、ＮＥ対照群においてＥＭおよびＣＰ感染により有意に低下した（ｐ＜０．０５）。しかし体重増加率は、概ね、組換えＣＰタンパク質（ＮｅｔＢ＋ＥＦ）で免疫化させた群では４〜２１％増加した。ＮＥ対照との有意差が、ＴＣＭＯアジュバントがコンジュゲートされたＣＰタンパク質で免疫化されたＰｒｏｔ ＴＣＭＯ群において見出された

［０３１２］ ＥＭ感染の６日後およびＣＰ感染の２日後に、αトキシン、Ｎｅｔ−Ｂ、ＥＦ、およびＰＦＯに対する血清抗体反応を評価した。結果を表４に示す。手短に述べると、ＣＰタンパク質は、概ね、ＣＰタンパク質で免疫化されたトリにおけるＣＰ抗原に対してＡｂ力価を上昇させた。Ｎｅｔ Ｂ、ＥＦ、およびＰＦＯ抗原に対するＡｂ反応は、α−トキシンに対する反応よりもかなり高かった。

［０３１３］実施例２：雌トリ抗ミオスタチンワクチン
ミオスタチンは、筋肉の分化および成長を阻害するＴＧＦβタンパク質ファミリーの一員である分泌型増殖分化因子である。ミオスタチンは、主に骨格筋細胞内で産生され、血中を循環し、アクチビンＩＩ型受容体と呼ばれる細胞結合受容体に結合することにより筋肉組織で作用する。したがってミオスタチンの阻害により、多量の肉／筋肉を有する動物
が得られる。動物体内のミオスタチン量を減少させる１つのアプローチが、抗ミオスタチン免疫反応を生成させることであり、それは従来通り抗ミオスタチン抗体の力価により測定され得る。この実施例では、雌トリのモデルを用いた。

［０３１４］ Cobb 500 Parent StockおよびRoss 308の雌トリ（それぞれ１２〜１０
週齢）を、ミオスタチンコンジュゲートペプチドおよびアジュバント製剤を含むワクチンでプライムした。試験に用いられたアジュバント製剤を、表５に示す。

［０３１５］ 該アジュバントの成分を、表６に記載する。

［０３１６］ Cobb 500 Parent StockおよびRoss 308の雌トリを、１２および１０週
目にプライムし、１８週目にブーストした。抗ミオスタチン抗体の血清力価を、それぞれ２２週齢および２０週齢まで、ワクチン接種前、およびプライム後２週間ごとにＥＬＩＳＡにより測定した。

［０３１７］ Ｔ０６、Ｔ０７、Ｔ０９およびＴ１０群は、最高の応答（２２週目で抗体幾何平均力価５００００〜１５０００）を生じた。これらの４群のうち、Ｔ０６およびＴ０７群のCobb 500トリは、１００，０００を超える幾何平均力価を示した。

［０３１８］実施例３．T. pyogenesに対するワクチン
Truepurella pyogenes（正式にはArcanobacterium pyogenes、そして正式にはActinomyces pyogenes、およびCorynebacterium pyogenes）は、多くの場合、濁った化膿性分泌物を特徴とするウシの重度臨床型子宮炎を引き起こす。この疾病に伴うこともある腐敗臭が、おそらく、存在しながらルーチン培養法では検出されない嫌気性細菌によって引き起こされる。この疾患は、分娩前または分娩時の乾乳牛または若雌牛に最も多く、泌乳動物においては乳首または乳房の傷害の結果、起こる場合がある。この生物体により引き起こされる経済的に重要な疾患としては、子宮炎、乳牛の流産、および肥育牛の肝膿瘍が挙げられる。Truepurella pyogenesにより発現されるコレステロール依存性シトリシンであるピオリシン（ＰＬＯ）は、重要な宿主防御性抗原である。

［０３１９］ およそ１４月齢のAngus種交雑牛を、この試験において用いた。動物は
、登録時に健康状態が全体的に良好で、任意の合併症を有さなかった。動物は、飼料および水を自由に摂取した。

［０３２０］製剤：全細菌（E. coliおよびT. pyogenes）が１×１０^９／用量。ピオリシンをＴ０２〜Ｔ０７群の動物に１５０マイクログラム／用量で投与した。Ｔ０１群を、対照群として用いた。

［０３２１］ この試験でテストされたアジュバント製剤は、以下の通りであった：
２ｍＬ用量中にＩＳＣ／ポリＩＣ−ＩＳＣ １０００μｇ／ポリＩ：Ｃ ５０μｇ
２ｍＬ用量中にＩＳＣ／ＣｐＧ−ＩＳＣ １０００μｇ／ＣｐＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）１００μｇ
２ｍＬ用量中にＴＸＯ−ＣｐＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）１００μｇ／ＤＥＡＥデキストラン／鉱物油５ＬＴ ＮＦ
２ｍＬ用量中にＱＣＤＣＲＴ− Quil A １５０μｇ／コレステロール１５０μｇ／ＤＤＡ
１００μｇ／CARBOPOL（登録商標）(ポリアクリルポリマー）０．０３７５％／Ｒ１００５ １０００μｇ／ＣｐＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）１００μｇ
２ｍＬ用量中にＱＡＣ−Quil A ５００μｇ／cコレステロール５００μｇ／AMPHIGEN（登
録商標）（レシチンオイルエマルジョン）２．５％
［０３２２］ ピオリシン抗体を、間接的ＥＬＩＳＡを利用して測定し、プレート上の抗原、続いて血清試料（一次抗体）、続いて抗ウシＩｇＧコンジュゲートを、０日目、２８日目、および５６日目に測定した。

［０３２３］ 試料および対照は全て、１：２０００に希釈し、試料のＯＤと陽性対照のＯＤとの比率を計算することにより応答を決定した（陽性対照は、回復期動物の血清プールであった）。抗体を、ＨＲＰコンジュゲートされたヒツジ抗ウシＩｇＧにより検出した。

［０３２４］ 結果を表８に示す。

［０３２５］ Ｔ０４およびＴ０６群（アジュバントＴＸＯおよびＱＡＣ）では、対照より有意に良好な性能であった（Ｐ＜０．０５）。加えて、異なる処置群間に複数の傾向（ｐ＜０．１の差として選択）が見出された。これらの傾向を、表９に要約する。

［０３２６］実施例４．子宮炎チャレンジに対する泌乳牛におけるピオリシンワクチン製剤の評価
本試験の目的は、人工子宮炎チャレンジモデルを利用して、非妊娠期泌乳HolsteinまたはHolstein交雑種乳牛において、ＴＸＯがアジュバント添加されたネイティブおよび組換えピオリシンワクチン製剤の有効性を評価することであった。

［０３２７］ 動物は、健康状態が全体的に良好で、任意の合併症を有さず、ワクチン接種およびチャレンジの前および後の７日間に、任意の化学療法、全身抗生物質投薬または他の抗炎症剤投薬を受けていなかった。動物は、初産〜３産であり、子宮炎の病歴を有さず、T. pyogenesプレチャレンジに関して培養陽性でなかった（−１または０日目）。
試験中に臨床的に有意な併発症を発症した動物は、離脱した。

［０３２８］ 動物は、搾乳されている時のみを除き、各２４時間の期間のうち少なく
とも２０時間は飼料を自由に摂取した。泌乳の業界で代表的な調合基礎混合飼料を用いた。動物を少なくとも７日間馴化させた後、試験を開始した。ウシ（ｎ＝２０／群）に投与される配合ワクチンには、以下の成分が含まれた：Ｔ０１ − 生理食塩水；Ｔ０２ −
ＴＸＯ＋ネイティブピオリシン（ｎＰＬＯ）；Ｔ０３ − ＴＸＯ組換えピオリシン（ｒＰＬＯ）。Corynebacterium glutamicumからの抗原のクローニング、発現、および精製により、組換えピオリシンを得た。精製タンパク質を、その後、ホルマリン処理により不活化させた。Trueperella pyogenesから発現および精製されたネイティブピオリシンもまた、ホルマリン処理で不活化させた。ＴＸＯアジュバントには、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを、ＤＥＡＥデキストラン、鉱物油、ならびに界面活性剤Span 80およびTween 80が含
まれた。

［０３２９］ ワクチン接種日に、適切なＩＶＰ（表１０）を皮下経路により投与した。ワクチンは、０日目に首に、そして２８日目に首の反対側に投与した。ワクチン投与部位を、試験０、１、２、３、７、２８、２９、３０、３１、３５、４９および７７日目に注射部位の反応について評価した。ワクチン接種日に、ワクチン投与前に腫脹が存在しないことについて確認するために、投与部位を評価した。試験２８、４９および７７日目に、首の両側を観察した。注射部位の評価を記録した。ワクチン接種期間の試験０（１回目のワクチン接種前）、１、２、３、７、２８（２回目のワクチン接種前）、２９、３０、３１および３５日目に、直腸温も測定および記録した。チャレンジ０〜２８日目にも、直腸温を測定および記録した。

［０３３０］ ワクチン接種後の臨床観察を、試験０、１、２、３、７、２８、２９、３０、３１および３５日目（ワクチン接種期間）に記録した。加えて、４９日目に開始して７７日目までのチャレンジ期間に、臨床観察を観察および記録した。

［０３３１］ 試験０、２８、４９日目、および試験最終日（７７日目）に、ピオリシンへの抗体応答をＥＬＩＳＡにより測定した。溶血阻害アッセイもまた、各血清試料で実施した。このアッセイは、抗ピオリシン抗体反応を測定して、生物活性（防御）と相関させる。

［０３３２］ チャレンジ前に、全てのウシの卵巣周期を同期させた。プロゲステロンをチャレンジ前、および２８日のチャレンジ期間に毎日投与した。繁殖用カニューレ（breeding cannula）と同様の滅菌カニューレを用いて、それぞれ別のシリンジに採取されたEscherichia coliチャレンジ株１０ｍＬおよびTrueperella pyogenesチャレンジ株１０ｍＬを、チャレンジ０日目に全てのウシの子宮に輸注した。チャレンジ材料を完全な送達を確実にするために、カニューレを滅菌培地１０ｍＬで流し出した。

［０３３３］ 処置群Ｔ０１（対照群）の動物の少なくとも６０％が子宮炎を発症すれ
ば、チャレンジが成功と判断した。子宮炎の存在は、スコア２以上である粘膿性の子宮／膣排出物の存在により示される。（このスコアリングシステムは、Sheldon et al., Theriogenology, 65:1516-1530, 2006に記載された方法から採用されており、それには０および１のスコアは正常と判断されている）
［０３３４］ 主要な変数は、子宮炎の存在を示すスコア２以上の粘膿性の子宮／膣排出物の存在であった。子宮／膣排出物は、無菌Simcro MetriCheck（商標）デバイスを無
菌カップと共に利用して採取され、チャレンジ０日目に開始して２８日目まで（試験４９〜７７日目に）スコアリングした。

［０３３５］ 処置は、Ｔ０１のウシのみが臨床型子宮炎を発症した場合、または粘膿性膣排出（スコア２以上）期間および／または日数比率が対照と比較して有意に短かった（ｐ＝＜０．１）場合、処置が有効と見なされた。子宮炎の期間および日数比率に関して群間に有意差がなければ、子宮細菌スワブからのT. pyogenes単離物の発生回数を、ワク
チン有効性を裏づけるデータとして用いた。各ワクチンの安全性を、注射部位評価、直腸温、および泌乳への任意の有害作用に基づいて評価した。

［０３３６］ 回収された子宮炎データ（膣／子宮排出物の存在のある／なし；膣／子宮排出物のスコア）を、各時点で各動物について要約して、各時点での各処置についての各分類の頻度分布を決定するために用いた。各子宮炎兆候（例えば、膣／子宮排出物スコア）について動物が正常か／異常か（正常はスコア０または１であり、異常はスコア２以上である）の頻度分布を、処置および時点により要約した。動物がそれまで異常（スコア２以上）であったかどうかにかかわらず、一般化線形混合モデル（Proc Glimmix）を二項誤差分布およびロジットリンク関数と共に用いて、子宮排出物スコアを処置により要約した。この統計モデルには、処置の固定効果およびバッチのランダム効果が含まれた。処置群の間で対比させた。これを、この段落に記載された各子宮炎変数に関して、繰り返し実施した。Proc Glimmixが、子宮炎変数に関して収束しなかった場合、Fisherの正確検定を、処置群比較の代わりに用いた。

［０３３７］ 異常スコア（各子宮炎変数について）の期間を、動物ごとに決定して、「（最後の異常時点−最初の異常時点）＋１」として計算した。異常スコアの期間は、子宮炎変数が異常スコアであった時点を有さない動物の場合、０と設定した。子宮炎変数について最後に計画されたデータ回収時点より前に試験から離脱した動物の場合、異常スコアの期間は、「（最後に計画されたデータ回収時点−最初の異常時点）＋１」として計算した。異常スコア（各子宮炎変数について）の期間を対数変換し、その後、固定効果：処置、およびランダム効果：残り、を含む一般化線形混合モデルにより解析した。パラメータ推定の線形結合を、有意な（ｐ≦０．１０）処置効果についてテストした後の事前対比に用いた。処置間で比較を実施した。逆変換最小二乗平均、その標準誤差および９０％信頼区間を、解析から得られた最小二乗パラメータ推定から、各処置群について計算した。

［０３３８］ 異常スコアの日数比率（各子宮炎変数について）、ならびに排出物に正常なE. coliおよびT. pyogenesの両方が存在しない（非存在は値＜＝１＋と見なす）日数比率を、各動物について測定した。その後、解析する前に、それぞれをアークサイン（arcsin）平方根変換を利用して変換した。これらの変換された日数割合変数を、その後、それぞれ固定効果：処置、およびランダム効果：残り、を含む一般化線形混合モデルにより解析した。パラメータ推定の線形結合を、有意な（ｐ≦０．１０）処置効果について検定した後に、事前対比に用いた。処置間で比較を実施した。逆変換最小二乗平均、その標準誤差、および９０％信頼区間を、解析から得られた最小二乗パラメータ推定から、各処置群について計算した。動物にE. coliが存在するか（存在は値＞１＋として判定）、T. pyogenesが存在するか （存在は値＞１＋として判定）、そしてE. coliおよびT. pyogenes
の両方が存在するか（存在は値＞１＋として判定）の頻度分布を、各時点での処置により
要約した。

［０３３９］ 結果． ピオリシンの抗体反応をＥＬＩＳＡにより評価して、血清ＩｇＧレベルを測定した。最小二乗平均（ＬＳＭ）力価として表された結果（表１１）から、その力価が試験２８、４９および７７日目にＴ０１に比較してＴ０２およびＴ０３のウシで有意に高かったことが示される。それらはまた、Ｔ０２群とＴ０３群の間で力価の統計学的有意差がないことを示唆している。ＥＬＩＳＡによっても評価された子宮内の抗体力価に関しては、４９日目および７７日目のＴ０１に比較してそれらの日のＴ０２およびＴ０３のウシで有意に高い力価であったことを、結果（表１２）が実証している。溶血阻害抗体に関しては、表１３の結果から、試験４９日目および７７日目にＴ０２の動物がＴ０１およびＴ０３群の動物よりも有意に高い力価を有したことが示される。

［０３４０］ 評価された主要な変数である粘膿性子宮／膣排出物のレベル（膣排出物スコアまたはＶＤＳ）に関して、子宮炎の期間を測定すると、細菌でのチャレンジ後７日目および１０日目に測定されたＴ０１およびＴ０３群に比較して、群Ｔ０２で有意に短かった（表１４、１５）。

［０３４１］ チャレンジ後１０日以内で子宮炎が明らかであった（即ち、ＶＤＳ＞２の）日数％に関して（表１６および１７）、Ｔ０１およびＴ０３群に比較してＴ０２群でより少ない異常日を有したことが明らかである。同じくT. pyogenesが、Ｔ０３群のウシ
から最も多く単離されたことが実証された（データは示さない）。したがってワクチンの効果は、Ｔ０２群（ネイティブピオリシン＋ＴＸＯ）で最も傑出していた。

［０３４２］ 妊娠した乳牛において新規アジュバント製剤中の実験的子宮炎ワクチンの有効性を評価するために、追加の試験を実施した。この試験において、妊娠した牛を、乾乳期にワクチン接種した。有効性は、出産（分娩）後の最初の１０日間に測定した。

［０３４３］ 泌乳１〜３回の妊娠HolsteinまたはHolstein交雑種のウシを、試験に選択した。 選択された牛は全て、健康状態が全体的に良好で、子宮炎の病歴を有さず、既
知の分娩予定日を有した。動物はまた、任意の合併症を有さず、ワクチン接種前および後７日間に、任意の化学療法、全身抗生物質投薬または他の抗炎症剤投薬を受けていなかった。試験の間の任意の時点で臨床的に有意な併発症を発症した動物は、離脱した。動物は、試験の途中、搾乳期のみを除き、各２４時間の期間のうち少なくとも２０時間は飼料を自由に摂取した。動物はまた、試験期間中は水を自由に摂取した。

［０３４４］ 群（ｎ＝１５／群）に投与されたワクチンは、以下の通りであった：Ｔ０１の動物は、生理食塩水からなるワクチン２ｍｌを受け；Ｔ０２の動物は、ＩＳＣＯＭＳ／ポリＩ：Ｃ＋ｎＰＬＯからなるワクチン２ｍｌを受け；Ｔ０３の動物は、ＴＸＯ＋ｎＰＬＯからなるワクチン２ｍｌを受け；Ｔ０４の動物は、Ｔ０４の動物は、ＴＸＯ＋Escherichia coli＋Trueperella pyogenes＋ｎＰＬＯからなるワクチン２ｍｌを受けた（ワクチン抗原は全て、ホルマリン不活化された）。

［０３４５］ 動物は、到着後、７日間馴化させた。出産のおよそ２ヶ月前（試験０日目）に、Ｔ０２群の動物が鼻内にワクチンを受けたことを除き、動物は首の左側の皮下に最初のワクチン接種を受けた（表１８）。２８日後に、動物は全て、首の右側の皮下に二回目のワクチン接種を受けた（表１８）。全てのウシが、最初のワクチン接種から乾乳期に入った。

［０３４６］ 出産日に開始し、その後２１日間継続して、子宮／膣排出物の存在を評価して、もし存在するならば、スコアを回収して割り付け、２以上のスコアであれば子宮炎の存在を示した。血液およそ３０ｍＬを、ＥＬＩＳＡによるE. coli、T. pyogenes、およびピオリシンへの抗体反応の測定のために採取した（試験０、２８および４９日目に）。手順にあるデータ回収の一部として得られたもの以外の任意の有害反応を、記録した。

［０３４７］ 主要な変数は、粘膿性子宮／膣排出物の存在であり、２以上のスコアは、子宮炎の存在を示した。Ｔ０１のウシのみが臨床型子宮炎を発症した場合、または粘膿性膣排出（スコア≧２）の期間が対象に比較して有意に短かった場合（ｐ＝＜０．１）、処置は有効と判断された。粘膿性排出物が存在する場合、それを分娩後に採取した。

［０３４８］ 各時点で、処置間の比較を実施した。最小二乗平均（血清学的データに
関して逆変換された）、その標準誤差、および９０％信頼区間を、解析から得られた最小二乗パラメータ推定から計算した。データにより動物の範囲および数を、各時点での各処置群で計算した。

［０３４９］ 回収された子宮炎のデータ（膣／子宮排出物の存在のあるなし；膣／子宮排出物のスコア；臨床兆候）を、各時点で各動物に関して要約し、各時点で各処置について各分類の頻度分布を測定するために用いた。各子宮炎兆候（例えば、膣／子宮排出物スコア）について動物が正常か／異常か（正常はスコア０または１であり、異常はスコア２以上である）の頻度分布を、処理および時点により要約した。動物がそれまで異常（スコア２以上）であったかどうかにかかわらず、子宮排出物スコアを要約して、二項誤差分布およびロジットリンク関数と共に一般化線形混合モデル（Proc Glimmix）を用いて解析した。この統計モデルには、処置の固定効果およびバッチのランダム効果と、バッチ内のブロックが含まれた。処置群の間で対比させた（これを、この段落に記載された各子宮炎変数に関して繰り返し実施した）。Proc Glimmixが、子宮炎変数に関して収束しなかった場合、Fisherの正確検定を、処置群比較の代わりに用いた。

［０３５０］ 異常スコア（各子宮炎変数について）の期間を、各動物について決定して、「（最後の異常時点−最初の異常時点）＋１」として計算した。異常スコアの期間は、子宮炎変数が異常スコアであった時点を有さない動物の場合、０と設定した。子宮炎変数について最後に計画されたデータ回収時点より前に試験から離脱した動物の場合、異常スコアの期間は、「（最後に計画されたデータ回収時点−最初の異常時点）＋１」として計算した。異常スコアの期間を、固定効果：処置、およびランダム効果のバッチ、バッチ内のブロック、そして残りを含む一般化線形混合モデルにより解析した。パラメータ推定の線形結合を、有意な（ｐ≦０．１０）処置効果について検定した後に、事前対比に用いた。処置間で、比較を実施した。最小二乗平均、その標準誤差、および９０％信頼区間を、解析から得られた最小二乗パラメータ推定から、各処置群について計算した。

［０３５１］ 結果． 双子を分娩したウシは、子宮炎の素因を有し、データをゆがめる可能性があることから、そのようなウシは全て試験から離脱した。離脱した牛には、対照群Ｔ０１の６頭、Ｔ０２およびＴ０３群のそれぞれ２頭、およびＴ０４群の１頭があった。各群の残りのウシで、子宮炎の罹患率および推定される子宮炎の日数を計算した。表１９に認められる通り、Ｔ０３およびＴ０４群の子宮炎罹患率は、他の群と比較して数値的に低かった。データはまた、Ｔ０３およびＴ０４群が、分娩後の最初の１０日のうちにＴ０１およびＴ０２群の動物よりも短い子宮炎期間を有したことを示した。したがって、ネイティブピオリシンが、単独であるか、またはE. coliおよびT. pyogenesとの組み合わせであるかにかからわらず、ＴＸＯがアジュバント添加された場合に、ウシにおける自然な子宮炎罹患率を低下させるのに効果的である、と結論づけることができる。

［０３５２］実施例５．ウシにおける子宮炎ワクチン
E. ColiバクテリンJ-5は、子宮炎を処置するための公知の抗原である。本試験において、J-5バクテリンと組み合わせた異なるアジュバントを、抗子宮炎効果に関して評価した
。

［０３５３］ 試験計画を表２０に要約する。出産は、およそ４９日目に起こった。血液および乳の試料を、０、７、２８、３５、４９、６３、７０および８４日目に採取した。７０日目にウシにチャレンジした。

［０３５４］ Ｔ０１〜Ｔ０６群においてE coliにより引き起こされた感染の期間は、以下の通りである：Ｔ０１ ２５２．１時間、Ｔ０２ ２１３時間、Ｔ０３ １９１．６時間、Ｔ０４ １９０．２時間、Ｔ０５ １９８．７時間。VACCIMAX（登録商標）での処置は、最も短い感染期間をもたらした。VACCIMAX（登録商標）は、抗原がリポソームの二層間に封入された多層状リポソームを含む水中油エマルジョンである。

［０３５５］ 処置の防御効果もまた、層化軽減率（stratified mitigated fraction
）を決定することにより評価した。層化された軽減率が高くい程、防御効果が大きい。同じくVACCIMAX（登録商標）を有する製剤が、最も大きな効果を有したが（対照の１３．９
５〜１７．１９倍）、ＴＸＯでの処置もまた、効果的であった（対照の６．２４倍）。

［０３５６］ 全細胞の血清J-5特異性ＩｇＧの総抗体反応を、間接的捕捉ＥＬＩＳＡ
を利用して測定した。結果を表２１および２２に要約する。

［０３５７］実施例６：Neospora Caninumワクチン
Neospora Caninumは、１９８８年に種として同定されたコクシジウム類寄生虫である。それは、感染した家畜における自然流産の重要な原因である。neosporosisは、ウシの流
産の重要な原因であることに加えて、世界中のイヌの重大な疾患でもある。該疾患が早期に確認されれば、イヌはクリンダマイシンおよび他の抗原虫薬での処置に成功し得る。しかし該疾患は多くの場合、幼少期のイヌにとって致命的となる。予防性のワクチンが、ウシでテストされた。不活化ワクチンが市販化されたが、様々な結果となった。弱毒化されたN. caninum tachyzoiteを用いた生ワクチンは、より成功したが、製造が高価になる。
本試験において、本発明者らは、N. caninumシクロフィリン（ＮｃＣＹＰ）およびプロフィリン（ＮｃＰｒｏ）を抗原として用いた、N. canimumへのワクチンの特性に及ぼす異なるアジュバントの影響を決定した。

［０３５８］ ８〜１０週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、この実験に用いた。全動物を、
指示されたアジュバントの存在下、３週間間隔で２回、ｒＮｃＣｙＰおよびｒＮｃＰｒｏｆにより免疫化した。２回目の免疫化の３週間後に、全動物を安楽死させて、脾臓および血液を採取した。ＮｃＣｙＰ／ＮｃＰｒｏｆ特異性の脾臓細胞増殖反応を、増殖アッセイで測定した（３〜４日目）。脾臓細胞をNeospora抗原で４８時間刺激することによりＮｃＣｙＰ／ＮｃＰｒｏｆ特異性の脾臓細胞サイトカイン反応を測定し、上清のサイトカインレベルをサイトカイン特異性ＥＬＩＳＡにより測定した。血清抗体レベルを、ＥＬＳＩＡにより測定した。表２３に要約された通り、動物を処置した。

［０３５９］ 先の処置群の特性を、表２４に要約する。

［０３６０］ 総括すると、これらのデータは、ＴＸＯおよびＴＣＭＯを用いて得られた優れた結果を実証している。

［０３６１］実施例７．Chlamydophila abortusによる生殖器感染への免疫応答に及ぼ
す異なるアジュバントの影響
C. abortusは、ヒツジおよびヤギにおいて流産を引き起こす細胞内細菌である。感染は、一般に、抗原刺激を受けていない雌ヒツジが流産を起こした物質（例えば、胎盤、体液、胎児）に暴露された際に起こる。細菌は、出産まで、そして懐胎中期または後期の間、感染した雌ヒツジのベイ（bay）が体内に潜伏し、胎盤内に存在して、抗体が応答したと
しても胎盤を壊死させる。流産の後、雌ヒツジは、典型的には再感染を免れる。

［０３６２］ ワクチン接種は、初回感染を予防し、細菌による胎盤へのホーミングを予防するため、暴露前は有利になり得ると考えられている。流産後の免疫力における抗体反応関連のＩＦＮｇは、防御の重要な相関物質である。ＩＦＮｇは、非妊娠雌ヒツジにおいて認められる残留性とも関連し得る。

［０３６３］ 雌ヒツジを０および２８日目にワクチン接種し、４９日目にチャレンジした。動物を６３日目に殺処分して、剖検を実施した。０日目に、膣および全血試料をｑＰＣＲ用に採取した。血液を、血清学的検査結果のために週に一回、そしてサイトカインおよびElispot測定のために０、７、２８および３５日目にサンプリングした。

［０３６４］ 処置群を、表２５に示す。

［０３６５］ 抗原を、流産したヒツジ胎児腎臓から調製し、McCoy細胞で増量させた
。基本小体を、遠心分離および音波処理により精製した。抗原を、ワクチン接種のために０．９％塩化ナトリウム中の０．１％ホルムアルデヒドにより１００μｇ／用量で固定した。

［０３６６］ 血清学的検査結果をChek-it ELISAキットを用いて得て、先の表２６に
要約している。

［０３６７］ Chlamydia AGで刺激されたヒツジＰＭＢＣ中のＩＦＮｇ、ＩＬ−２およびＩＬ−４発現レベルを測定した。結果を表２７に示す。

［０３６８］Chlamydia abortus抗原へのヒツジＰＢＭＣの応答を、表２８に要約する
。

［０３６９］ 加えて、白血球の量を分析した（データは示さない）。二元配置分散分析から、Ｆ群がＡおよびＢ群よりも有意に高いＷＢＣ量を有し、Ｅ群がＢ群よりも有意に高いＷＢＣ量を有したことが示される。

［０３７０］ 注射時の小結節も分析した。予測通り、Ａ〜Ｃ群がＣ〜Ｄ群よりも大きな小結節を有した。用いられた３種のアジュバント（Ａ〜Ｃ群）のうち、Ｃ群が最大の小結節サイズを有し、次いでＢ群、次いでＡ群であった。

［０３７１］ 小結節の体積を測定した。同じくＡ〜Ｃ群は、Ｄ〜Ｆ群よりも大きな小結節体積を有した。Ａ〜Ｃ群のうち、Ａ群は、最小体積を有した。ＡおよびＢ群の小結節は、より出血性および／または壊死性組織を有した。Ｃ群の小結節は、より多くの線維形成を有した。細胞の特徴は、３群全てで類似しているが、Ｃ群は、より多くのリンパ球成分を有する可能性がある。

［０３７２］実施例８．ＴＸＯへのアルミニウム付加が安定性の改善をもたらす
現行のＴＸＯブレンド製剤は、５０ｍｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストランを含む。デキス
トランは、皮下注射中に高濃度で存在する場合、動物の注射部位で反応を誘発する可能性がある。それゆえ、ＤＥＡＥデキストランを様々な濃度で試験して、ワクチン製剤の安定性を損なわずに安全性および良好な治療値を得がえられるかについてチェックすることが提案されている。

［０３７３］ 特徴づけおよび安定性テストは、ワクチンが一貫性を持って、かつ製造上良好な保管期限を有しながら配合され得るかどうかを知らせることから重要である。非ニュートン流体の流動特性であるずり減粘（ずり速度が増加する程、見かけ粘度が低下する）またはずり増粘（ずり速度が増加する程、見かけ粘度が上昇する）を探索するために、粘性テストが一定範囲のずり速度で実施される。シリンジ力テスト（syringe force tests）を実施して、ワクチンが容易に引き抜かれること、および牧場で容易に数種の用量
で投与されることを確認にする。

［０３７４］ 免疫刺激オリゴヌクレオチドが、該製剤の安定性を変化させると予測されないため、この実施例でアジュバント混合物に添加しなかった。様々なREHYDRAGEL（登録商標）（５％〜１６％）およびＤＥＡＥデキストラン（５０ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ）濃度のＡＸＯ（アルミニウム＋デキストラン＋油）ブレンドを配合し、ＸＯ（デキストラン＋油）ブレンドを対照として用いて、粘度、シリンジ力および沈殿についてテストする。テストされた組成物は、以下の通りであった。

［０３７５］ およそ１０ｍｌの試料を、１５ｍｌCorning遠沈管５本のそれぞれに充
填し、遠沈管の狭い寸法および円錐の底部であることによる、エマルジョンの沈殿作用の促進を観察するために、１週間にわたり放置した。試料を注入性（syringeability）および粘性についてもテストした。結果を以下に示す。

［０３７６］ これらのデータから、遠沈管での沈殿促進へ供試した場合、１６％REHYDRAGEL（登録商標）とのブレンドが最も安定していることが示される。さらに本発明者らによる過去の研究から、ＤＥＡＥデキストラン濃度が高いことが粘性、そして可能性のあるずり増粘が高いことに関連することが知られている。これらの実験の結果は、より多くのREHYDRAGEL（登録商標）の添加が、ＤＥＡＥデキストランにより付与されたずり増粘性（擬塑性）の予測された損失を補填することが示される。１６％REHYDRAGEL（登録商標）
製剤がより高いシリンジ力を有するとしても、注射が著しく困難にならないことも観察された（水でのシリンジ力は３Ｎ）。

［０３７７］ データ全体から、１６％REHYDRAGEL（登録商標）と１０ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥデキストランとのブレンドが、ワクチン製剤、特にエンドトキシンを含まない結合を必要とするものの中で使用される場合、および／またはより長期のエマルジョン保管期限が望ましくなり得る場合に、最適になることが明白である。

［０３７８］実施例９．ＢＲＶ、ＢＣＶおよびE coli抗原
この実施例において、本発明者らは、腸炎に対するワクチンにおける本発明のアジュバントの使用を検討する。腸炎は、細菌、ウイルス、および／または寄生虫感染により引き起こされる。ウシ、特に新生子の乳牛および肉牛は、免疫系が完全に発達していない生後２、３時間の間、多くのストレスを受けるため、子ウシの下痢に罹り易い。子ウシの下痢による体液損失により脱水状態になり、多くの場合、死亡する。子ウシの下痢から生き残った動物は、多くは依然として脆弱で、生涯を通して能力が低い。下痢に関連する病原体としては、細菌、特にE coli K99およびF41、ならびにウイルス、例えばウシコロナウイ
ルス（ＢＣＶ）およびウシロタウイルス（ＢＲＶ）が挙げられる。

［０３７９］ １０ヶ月齢Holstein去勢牛を、この試験に用いた。動物は、E coli（Ｋ９９およびＦ４１）、ＢＲＶ（Ｂ２２３およびLincoln）およびＢＣＶに関して血清陰性
または低力価（low tittered）であった。

［０３８０］ 処置群は、以下の通りであった。

［０３８１］ 血液試料を血清学的検査のために２１日ごとに６ヶ月間、採取した。注射部位の反応を、０（ワクチン接種前）、１、２、３、７、１４、２１日目、そしてその後２１日ごとに測定した。E coli K96、E coli F41、BRV Lincoln、BRV B223およびBCVへの応答を、選択された日に抗体力価を定量することにより測定した。結果を以下に要約する（異なる文字は、α＝０．１での差を示す）。

［０３８２］ Ｔ０５およびＴ０６の処置は、２１日目から試験終了時（１８９日目）まで、最高の抗体力価をもたらした。注目すべきこととして、市販のワクチン(ROTAVEC（登録商標）)は、腸炎のウイルス成分に対する抗体の誘導について、Ｔ０５およびＴ０６
と同程度には作用しなかった。

［０３８３］ Ｔ０２およびＴ０５〜Ｔ０６の処置は、K99に対する応答の誘発に関し
て同様に良好に作用した。Ｔ０２の処置は、E coli F41に対して最良の応答を誘発した。
Ｔ０５の処置は、その抗原への応答誘発において２番目に有効であった。

［０３８４］ 総括すると、これらのデータから、Ｔ０５およびＴ０６が最も有望な製剤と思われることが示される。両者とも、１８９日目まで複数の分画で標的ＩｇＧ応答を提供した。Ｔ０５およびＴ０６は両者とも、ＳＱ投与によりROTAVEC（登録商標）（Ｔ０
２、ＩＭ）に比較して優れた、または同等の血清学的有効性を付与すると思われる。Ｔ０３およびＴ０４は、高い血清力価を、Ｔ０５およびＴ０６よりも短期間保持した。Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５およびＴ０６は、一用量のワクチン接種により、ＢＲＶ Ｇ６、ＢＲＶ
Ｇ１０およびＢＣＶについて標的レベルを超える血清力価を提供した。Ｔ０４、Ｔ０５およびＴ０６は、一用量のワクチン接種により、E. coli K99に対して標的レベルを超え
る血清力価を提供した。Ｔ０４、Ｔ０５およびＴ０６は、標的レベルを超える抗ウイルス血清力価を６ヶ月間保持した。Ｔ０５およびＴ０６は、標的レベルを超える抗E. coli K99血清力価を６ヶ月間保持した。評価された製剤は全て、Holstein去勢牛において十分な
安全性を実証した。

［０３８５］ 直腸温を０、１、２および３日目に測定した。Ｔ０１群（対照）とＴ０２〜Ｔ０６群の間に統計学的有意差はあったが、温度差（ＬＳＭ）は大きくなかった（１°Ｆ以内）。

［０３８６］ 妊娠した乳牛における製剤の予備試験は、実証された安全性を有している。Ｔ０１、Ｔ０３およびＴ０５群を各群５頭でテストした。ウシ１５頭のうち１３頭が出産し、１２頭は正常であり１頭は死産であった。

［０３８７］実施例１０．抗ダニワクチン
実験計画
Bm86抗原に基づく２種のワクチン製剤をテストした。以下に要約される通り、一方の製剤には水性アジュバント（ＱＣＤＣＲＴ）が含まれ、他方には油性アジュバント（ＴＸＯ）が含まれた。

［０３８８］ アジュバントは、先に記載された通り８０％容量で用いられたため、Ｔ０３群に投与されたワクチン組成物の一用量には、１００μｇ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８／１００ｍｇ ＤＥＡＥ−デキストラン、３６％ｖ／ｖ鉱物油、４．８％ ｖ／ｖ SPAN（登録商標）80および１．１６％ｖ／ｖ TWEEN（登録商標）80が含まれた。ＱＣＤＣＲＴ中には油が存在しないため、原材料の濃度は、表３５と同一であった。

［０３８９］ 子ウシ２４頭を、それぞれ８頭からなる処置群３群のうちの１群に無作為に割り付けた。各処置群の子ウシに、２種のＢｍ８６＋アジュバント製剤または生理食塩水（対照群）のうちの一方２ｃｃを個別にワクチン接種した。ワクチン接種は０および２８日目に行い、子ウシをスタンチョンに入れ、４２日目にR. annulatus larvae ２５
０ｍｇを感染させた。この試験で用いられたダニは、元々、Texas のVal Verde Countyの農場で採取された。６３〜８４日目に毎日、個々の子ウシから食いついた成体雌ダニを全て引き離して採取した。８５日目に、子ウシをスタンチョンから外した。採取されたダニを計数して、１３日間の各採取日に、各子ウシから最大１０匹を計量して、環境チャンバーに入れた。採取の１４日後に弱った雌を廃棄し、生まれた卵の重量を計量した。最初の孵化の１４日後に、孵化された無傷の卵の数を記録して、孵化率％の測定値を計算した。各ワクチン注射前、および続く注射後３日間は、注射部位を腫れについて各子ウシでモニタリングし、直腸温を測定した。ＥＬＩＳＡによる測定で試験期間全体でのＢｍ８６抗体力価を測定するために、−７、０、１４、２８、４２および８５日目に血清を各子ウシから採取した。

［０３９０］結果
予備試験の結果は、Ｔ０２およびＴ０３製剤からそれぞれＴ０１よりも有意に高い、９８．６および９９．６％対照を示している。これらの％対照の計算は、食いついた雌ダニおよび卵の重量の減少のみを考慮している。孵化％の低下は、後日に測定され、最終結果に加えられることになる。試験における子ウシ２４頭のうち１頭は、各注射後に小さな腫れを生じている（油性アジュバントを含む製剤）。腫れは、長さ１０ｃｍ未満および深さ３ｃｍ未満である。腫れは柔らかく、動物への痛みは認められない。試験全体を通して、処置動物の直腸温は上昇していない。

［０３９１］ 血清学的検査の結果から、１４日の時点でＱＣＤＣＲＴでの処置とＴＸＯでの処置の間に統計学的有意性はなかったこと（ｐ＝０．１１４）以外では、各時点での処置それぞれの間に統計学的有意差が実証される。ＱＣＤＣＲＴおよびＴＸＯは両者と
も、テストされた各時点でＢＭ８６抗体力価を効果的に上昇させている。ＴＸＯは、１４日目（ｐ＝０．１１４）以外の各テスト時点で、ＱＣＤＣＲＴよりも優れていた（ｐ＜０．０５）。

［０３９２］実施例１１．口蹄疫（モルモット）
この試験の目的は、異なるアジュバント製剤が添加された三価ＦＭＤワクチンを接種されたモルモットにおける液性免疫応答を比較することであった。モルモットは、表３７に要約された通り、０および２８日目にワクチン接種された。

［０３９３］ Ｔ０３〜Ｔ０７の各用量において、抗原は、ＦＭＶＤ Ｏ型（９μｇ）、Ａ型（５μｇ）およびＡｓｉａ１型（５μｇ／ｍｌ）の組み合わせであった。Ｔ０２の抗原組成物は、特許登録のある製造者情報であり、このため入手できなかった。

［０３９４］ −３、２５および５３日目に、血清学的試験のために血液試料を採取した。血清型Ｏ、ＡおよびＡｓｉａ１に対する抗体の血清力価を、以下に要約する。

［０３９５］ 血清型ＯおよびＡに対する応答は、陽性対照群（Ｔ０２）でも低かったが、Ａｓｉａ１に対する応答は、Ｔ０７（ＴＸＯアジュバント）では陽性対照群よりも高く、他のいずれの処置よりも大きかった。血清型ＯおよびＡに対する低い応答は、製剤中にＯおよびＡ抗原が低レベルで存在することにより消失する可能性がある。

［０３９６］ 注目すべきこととして、リポソームに基づくVACCIMAX（登録商標）の群（Ｔ０３〜Ｔ０５）は、抗原（Ｏ、Ａ、Ａｓｉａ１）のいずれに対しても有意な応答を示なかった。

［０３９７］ アジュバントＴＸＯおよびＱＣＤＣＲＴは、先に記載された通り８０％容量で用いられたため、Ｔ０７群に投与されたワクチン組成物の一用量には、１００μｇ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８／１００ｍｇ ＤＥＡＥ−デキストラン、３６％ｖ／ｖ鉱物油、５．０４％ ｖ／ｖ SPAN（登録商標）80、および１．１６％ｖ／ｖ TWEEN（登録商標）80が含まれた。ＱＣＤＣＲＴ中には油が存在しないため、原材料の濃度は、表３７と同一であった。

［０３９８］実施例１２．口蹄疫（ウシ）
この試験では、チャレンジモデルにおけるＦＭＤに対するワクチンの中で用いられる異なるアジュバントの効果を測定した。３種のアジュバントを試験した。ワクチンは、ＰＩＡＤＣにより開発されたチャレンジモデル中のＦＭＤに対するＡＲＳ実験用ワクチンであった。FMD-LL3B3D-A24 Cruzeiroが該ワクチン（１０μｇ）の抗原成分として両方で用い
られ、野生型FMDV A-24 Cruzeiroが、チャレンジウイルスとして用いられた。抗原は、過去に、例えば米国特許出願公開第２０１２０３１５２９５号 (Riederら、２０１１年６月９日出願、２０１２年１２月１３日公開）に記載されている。手短に述べると、FMD-LL3B3D-A24 Cruzeiroは、遺伝子修飾ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）を含む。該ＦＭＤＶは、遺
伝子修飾されており、即ち、リーダー（Ｌ_ｐｒｏ）タンパク質が欠如したＦＭＤウイルスがウシおよびブタにおいて弱毒化されるように、このタンパク質のコード領域の欠失を含むリーダーレス型ウイルスである。それは、２種の非構造型ウイルスタンパク質中に導入された突然変異（陰性マーカ）も含むため、特異的抗体により認識される２種の抗原エピトープ、つまりプロテイン３Ｂ中に配置された一方とプロテイン３Ｄ中のもう一方（これらのタンパク質において、陰性抗原エピトープとして働くウシリノウイルスの対応する配列により置換されている）が排除されており、したがってＤＩＶＡ（自然感染動物とワクチン接種動物の識別）血清学的テスト用の２種の可能性のあるターゲットが提供される。

［０３９９］ 各群において、４〜７頭のウシを用いた。注射の総容量は、２ｍｌであった。動物には野生型ＦＭＤＶを、０日目にＩＭ注射（２．０ｍｌ／用量）によりワクチン接種し、２１日目に皮内経路によりチャレンジした。以下のスケールに従って、０、３、７、および１０日目に臨床スコアを評価した：臨床兆候なし：０、小胞性足病変：足の罹患それぞれで１点。最大スコアは４である。実験結果は、以下の通りである。

［０４００］ Ｔ０１とＴ０２の差およびＴ０１とＴ０４の差は、統計学的に有意であった。

［０４０１］ 先の表から、少なくとも臨床スコアに基づけば、アジュバントＴＸＯおよびMONTANIDE（登録商標）ISA 206 VGは、ほぼ等しい効率であると結論づけることがで
きる。しかしＦＭＤＶーＡ２４への血清中和活性を測定した血清学的分析から、Ｔ０４群（アジュバントＴＸＯ）がＴ０２群（MONTANIDE（登録商標）ISA 206 VG）よりも高い力
価を有したことが実証される。

［０４０２］ これらの結果から、ＴＸＯアジュバントがウシにおいてＦＭＤ原因病原体でのチャレンジに対して１００％の防御を提供し得たこと、ならびに生理食塩水対照およびテストされた他の２種のアジュバントよりも高い抗体力価を付与することが実証される。

［０４０３］ ＦＭＤＶ ＲＮＡ（コピー／ｍＬ）の量を、鼻腔スワブおよび血清中で
測定した。データを表４１〜４４に示す。手短に述べると、これらのデータから、Ｔ０２およびＴ０４群が鼻腔スワブにおいてより少量のＦＭＤＶをもたらしたことが実証される。Ｔ０２およびＴ０４のうち、Ｔ０４群の動物がＦＭＤＶ ＲＮＡ量のより早期の減少（または増加の欠如）を示し、したがってアジュバントＴＸＯの優れた特性を示していることが注目される。

［０４０４］ Ｔ０１群の動物は全て、チャレンジ後に発熱を呈したが、Ｔ０４群の動物はいずれも発熱を有さなかった。Ｔ０２およびＴ０３群における応答は、一定していなかった（発熱を呈した動物もあれば、そうでない動物もあった）。この観察から、この試験で用いられた他のアジュバントに比較してＴＸＯが全般的に優秀であるという結論が確認される。

［０４０５］実施例１３：ＴＸＯは、細胞性免疫を活性化する
これまでの実施例に記載された動物モデルの模範的抗原としてＦＭＤを使用して、細胞性免疫に及ぼす該アジュバントの影響を分析した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ワクチン接種後４、７、１４および２１日目に採取されたウシ全血から精製した。ＦＭＤＶ特異性Ｔ細胞増殖応答を、カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）染色を利用して評価した。

［０４０６］ 結果を表４５に示す。

［０４０７］ これらのデータから、１４および２１日目の両方での細胞性免疫に及ぼすＴＸＯの優れた影響が実証される。これらのデータはまた、細胞性免疫が短期間の（duration off）免疫を担うことから、アジュバントＴＸＯが、ことによるとMONTANIDE（登
録商標）ISA 206 VGよりも長期の免疫を提供する可能性を示している。

［０４０８］実施例１４．診断使用のための抗体の作製
本発明のアジュバントＴＸＯを用いて、診断に使用するための抗体を作製した。手短に述べると、ＴＸＯ添加の選択された組換え抗原を含み、組成が以下の通りである製剤で、供給動物を２〜４週間ごとに免疫化した：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ １２５μｇ；ＤＥＡＥデキストラン １２５ｍｇ；鉱物油 製剤の４６．５６％ｖ／ｖ；TWEEN（登録商標）80 製剤の１．５％ｖ／ｖ；SPAN（登録商標）80 製剤の６．５１８％ｖ／ｖ。

［０４０９］ アジュバント製剤を、ワクチン組成物の８０％ｖ／ｖで使用した。したがってアジュバント製剤の最終的な成分濃度は、以下の通りであった：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ １００μｇ；ＤＥＡＥデキストラン １００ｍｇ；鉱物油 ワクチン組成物の３７．２４８％ｖ／ｖ；TWEEN（登録商標）80 ワクチン組成物の１．２％ｖ／ｖ；SPAN（
登録商標）80 ワクチン組成物の５．２１４％ｖ／ｖ。最終容量は、２ｍｌであった。

［０４１０］ 目視できる小さな注射部位の反応を注射後に観察したが、想定の反応サイズ以内であった。肋骨の上で観察された反応は、日常観察に基づけば、ヤギに疼痛を与えると思われなかった。

［０４１１］ 血液試料を各免疫化の２〜３週間後に採取し、様々なアッセイを実施して抗体力価を評価した。１０００を超える血清学的ＥＬＩＳＡ力価が、抗体採取を開始するのに十分と判断された。

［０４１２］ 動物を週に１回採血した（体重に基づき血液容量の７．５％）。試験終了時に、ヤギを終末瀉血（terminal exsanguinations）により安楽死させて、抗体採取用に採血も行った。必要な場合または更なる試験のために、動物を再使用した。

［０４１３］ ＦｅＬＶ ｇｐ７０用の血清抗体を、小規模精製用の施設内のプロテインＡもしくはプロテインＧのいずれかのカラムを用いて、またはME州PortlandのMaine Biotechnology Services (MBS)で大規模精製用のプロテインＧクロマトグラフィーを用いて、精製することに成功した。Millipore 30K Ultra Filter Unitsを用いて、ポリクローナル抗体を最終濃度約１ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。表４６に開示された他の抗原に対する抗体は、精製しなかった。

［０４１４］ 以下のステップを含む方法により、ＦｅＬＶｇｐ７０で免疫化された、自然に泌乳しているヤギから得られた乳から、抗体を単離した：
ａ）乳のｐＨを２Ｍ ＨＣｌで４．６に滴定し、カゼイン沈殿のために室温で３０分間
撹拌した；
ｂ）乳を１７，０００×ｇで３０分間遠心分離して、上清を採取した；
ｃ）平衡緩衝液を上清に添加して、３．３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ グリシンおよび０．２Ｍ Ｔｒｉｓ塩基にした；
ｄ）上清を３０００×ｇで１５分間遠心分離することにより透明化した；
ｅ）透明化された乳の上清を、ステップ「ｃ」において緩衝液で平衡化されたMabSelectカラムにアプライした；
ｆ）カラムを平衡緩衝液で洗浄して、０．１５ＭグリシンｐＨ３．０で溶出させた；
ｇ）溶出画分を、０．２Ｍリン酸ナトリウムで中和した。

［０４１５］ 非限定的実施例として、抗ＰＩ−３および抗ＦｅＬＶ ｇｐ７０を作製する方法を、以下に示す。

［０４１６］ 目的の１つは、インビトロアッセイで使用するための精製ウシパラインフルエンザ−３（ＢＰＩ−３）ＨＮタンパク質へのヤギポリクローナル抗血清を作製することであった。この試験は、抗原として用いられたＴＸＯアジュバントのウシパラインフルエンザ−３（ＢＰＩ−３）ＨＮタンパク質が配合された精製ウシパラインフルエンザ−３（ＢＰＩ−３）ＨＮタンパク質をヤギにワクチン接種するように設定された。

［０４１７］ 最初の注射後のおよそ７週目に、ヤギ４匹全てが、血清のための生成採血（production bleeds）を開始するのに十分高い血清抗体濃度（１０００を超えるＳＮ
）を有することが測定された。生成採血を、４回目の免疫化の１週間後に開始した。血清用に、３週間間隔で１週間に１回採血した。各ヤギからの血清を、個々の生成採血でプールした。合計３，１８７．５０ｍＬの血清を、生成採血のおよそ３週間で採取した。ＢＰＩ−３ ＨＮに基づくアッセイでの評価のために、血清を処理して−８０℃で貯蔵した。

［０４１８］ ヤギ３匹（＃３０、３１および３５）から採取された血清全てを、室温に解凍した。３４番ヤギの血清は、スクリーニングＥＬＩＳＡにおいて低い抗体反応であったため使用しなかった。表４７（ＰＩ−３ ＨＮポリクローナル抗体産生：ＳＮ応答および抗原能（antigen potency）ＥＬＩＳＡ）を参照されたい。

［０４１９］ ２０１３年１１月２０日に採取された３５番ヤギは、最小容量１１７ｍＬの利用可能な血清を有した。したがって１回の採取で各ヤギからの１１７ｍＬを、滅菌1L Nalgene PETGボトルにプールした。血清およそ１０５３ｍＬ（９×１１７ｍＬ）を、60mL Nalgene PETGボトル中の５０ｍＬアリコット２０本、および１．０ｍＬアリコット５０本に分配した。

［０４２０］ 結果として、この試験は完了時に、生成採血の３週間でＴＸＯ配合の精製ＢＰＩ−３タンパク質で繰り返し免疫化されたヤギ４匹から採取された全血の合計３，１８７．５ｍＬの生成に成功した。良好なポリクローナル抗体力価が、血清中で生成された。十分量の精製された試薬が、インビトロアッセイ適用例に用いるために得られた。

［０４２１］ ２０１０年、ＵＳＤＡは、LEUKOCELL（登録商標）およびVERSIFEL（登
録商標）アッセイに用いられるＦｅＬＶ ｇｐ８５／７０捕捉試薬がもはや供給されなくなることを業界に通告した。したがってこの試験の目的は、インビトロアッセイで使用される組換えＦｅＬＶ ｇｐ７０タンパク質へのヤギポリクローナル抗血清を作製することであった。

［０４２２］ Freundアジュバントとのワクチン接種後に抗体を産生する過去の試みは、成功しなかった。この試験は、アジュバントが配合された組換えE. coli発現ＦｅＬＶ
ｇｐ７０タンパク質の４４４アミノ酸断片をヤギに接種するように設定された。４回目の注射から、注射用量を１００μｇ ＦｅＬＶ ｇｐ７０タンパク質に減少させた（元々の用量２８２μｇ ＦｅＬＶ ｇｐ７０タンパク質の代わり）。初回用量２８２μｇ／ｍｌが注射部位反応を高頻度で生じたため、用量を変更した。用量は最初、１００μｇ／ｍｌに減少させたが、その後、７回目の免疫化で１５０μｇ／ｍＬに増加させて、試験終了時までそのレベルを維持した（合計１５回の免疫化）。ＰＢＳ緩衝液を用いて、投与容量が１ｍＬに維持されるように差を調整した。

［０４２３］ 血液をヤギから採取して、十分に高い抗体力価が直接およびサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定されたら、血清を採取してポリクローナル抗体を精製した。

［０４２４］ １〜３歳で体重が１００ポンドを超えるLaManchaおよびAlpine種の健常な雌ヤギ６匹を、この試験に使用するために得た。試験の間、ヤギは干草と穀物を摂取し、自由に水を飲んだ。一般的健康状態の観察を、１日１回実施した。実験用ワクチン１ｍＬ用量を、２１日間隔で各ヤギに皮下投与し、試験を完了した５匹のヤギそれぞれに合計１５回の免疫化が実施された。免疫化は最初、頸部または後脚に実施され、次の免疫化では側と部位を変更した。免疫化の後、目視できる小さな注射部位の反応が観察された。ヤギの右後脚の頭側のゆるんだ皮膚に実施した免疫化は、翌日、全てのヤギにおいて小さな腫脹、圧痛、および中度の跛行を生じたことが報告された。次の注射は、頸部の別の側または肋骨の上の領域に実施され、概ね良好に忍容された。しかし肋骨の上の領域は最終的に、ヤギに最も忍容される場所であることが見出された。

［０４２５］ 初回注射のおよそ８週間後に、ヤギ６匹中４匹（２１、２２、２４、２５）が、血清の生成採血を開始するのに十分高い血清抗体濃度を有することが測定された。残りのヤギ２匹（２３、２６）からの生成採血は、５週間後に開始した。１週間間隔で、血清用に血液を採取した。２５番ヤギは、生成用血液採取の６週後に試験から離脱した。そのヤギは、到着時に足が不自由で、Banamine処置にもかかわらず引き続き跛行を示した。最後の採血のために安楽死が指示され、部位ごとに処置を施して最大量の採決を確保した。各ヤギからの血清を、個々の生成採血でプールした。合計２６．７Ｌの血清を、生成採血のおよそ７ヶ月間で採取した。

［０４２６］ 予想に反し、２４番ヤギが試験中に擬妊娠を生じた。このヤギから乳が３ヶ月を超える間採取され、合計３００Ｌの乳が抗体採取に利用可能となった。乳からのＦｅＬＶ ｇｐ７０ポリクローナル抗体を高度精製用に、プロトコルを開発した。

［０４２７］ 異なる２日に、Maine Biotechnology ServicesにてプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを利用して、２４番ヤギのプール血清５００ｍＬから抗体を
精製した。精製されたヤギ抗ＦｅＬＶ ｇｐ７０抗体の合計６３８８ｍｇ（１９．９ｍｇ／ｍＬの３２１ｍＬ）および７３４３ｍｇ（２１．１ｍｇ／ｍｌの３４８ｍｌ）を、ＦｅＬＶに基づくアッセイでの評価のために調製した。

［０４２８］ 各ワクチン接種の１４日後に血液試料（およそ２５ｍＬ／試料）を１２．５ｍＬ血清分離管（ＳＳＴ）に採取して、ＦｅＬＶ ｇｐ７０への抗体濃度を測定した。ＳＳＴにヤギのＩＤおよび採取日を表記した。動物のＥＬＩＳＡシグナル強度に基づくＦｅＬＶ ｇｐ７０抗体力価が許容し得る濃度であることがアッセイで測定されたら、動物から産生採取（production collections）を開始した。各ヤギから抽出される血液容量をヤギの体重に基づいて決定し、最大血液容量を得た。ＩＡＣＵＣガイドラインは、週１回、血液容量の７．５％までの採取を許容している。

［０４２９］ 血液を産生採取用に１２．５ｍＬＳＳＴに採取した。試験終了時に、ヤギを終末瀉血により安楽死させて、抗体採取用に採血も行った。全ての試験管に、ヤギのＩＤおよび採取日を表記した。

［０４３０］ 血液を室温に放置して凝固させた。遠心分離後、血清を採取してポリプロピレンバイアルに移した。採取日に同じヤギから採取された異なるＳＳＴの血清をプールした。血清は、精製のために移送するまで氷上に静置した。生成の要約を、表４８に示す。

［０４３１］ ２４番ヤギは、全てのヤギのうち最高抗体濃度の血清を産生した。

［０４３２］ サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおいてＦｅＬＶ ｇｐ７０ Ｃ１１Ｄ８検出ｍＡｂを用いた捕捉試薬として、２４番ヤギからの精製血清抗体は、ＵＳＤＡ ９４−０６に比較して同様の用量応答を示した。ＦｅＬＶ ｇｐ８５／７０タンパク質を検出する能力についてWesternブロットにより、２４番ヤギからの精製血清をＵＳＤＡ
９４−０６試薬に比較した。さらなる約１５ｋＤバンドが２４番ヤギの捕捉で観察されたことを除き、現行の捕捉９４−０６と新しい２４番ヤギの捕捉とで、同様のWesternブロ
ットプロファイルが観察された。新しい捕捉抗体を用いたデータから、現行の参照が、該参照および検査された一連の検体を捕捉するために使用された場合に、現行の試薬とは異なる用量反応曲線形状を有することが示された。

［０４３３］ 血清および乳から精製された両方のanrendati-FeLV gp70は、ＦｅＬＶ
ＥＬＩＳＡアッセイにおける捕捉試薬として良好に機能した。

［０４３４］ 更なる試験は、表４９に示された通り継続中である。

［０４３５］ 製剤のそれぞれ（表４９に開示されたＴＸＯ添加の抗原）は、少なくとも１匹の動物（好ましくは少なくとも２匹、またはより好ましくは少なくとも３匹、または最も好ましくは処置された各動物）において十分に高い（１０００を超える、またはより好ましくは５０００を超える、またはより好ましくは１００００を超える、またはより好ましくは５００００を超える、またはより好ましくは１０００００を超える、またはより好ましくは２５００００を超える、またはより好ましくは５０００００を超える、またはより好ましくは１００００００を超える）血清力価を誘起し、したがって診断または研究適用に十分な量の抗体をもたらすと予測される。

［０４３６］ 本明細書に引用された全ての発行物は、特許および非特許の両方の発行物において、本発明が属する当業者のレベルを示している。これらの発行物は、個々の発行物が具体的かつ個別に参照により組み込まれるものとして示されているのと同程度に、全てが参照により本明細書に組み込まれる。

［０４３７］ 本明細書の発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、これらの実施形態が本発明の原理および適用例を示しているに過ぎずないことが理解されなければならない。それゆえ、以下の特許請求の範囲に定義された本発明の主旨および範囲を逸脱することなく、数多くの改良を例示的実施形態に施し得ること、および他の配列を考案し得ることが、理解されなければならない。

［０４３７］ 本明細書の発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、これらの実施形態が本発明の原理および適用例を示しているに過ぎずないことが理解されなければならない。それゆえ、以下の特許請求の範囲に定義された本発明の主旨および範囲を逸脱することなく、数多くの改良を例示的実施形態に施し得ること、および他の配列を考案し得ることが、理解されなければならない。
非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
油相および水相を含むアジュバント製剤であって、前記油相が、前記製剤の少なくとも５０％ｖ／ｖを占め、前記製剤が、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体および免疫刺激性オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方を含み、ただし
ａ）前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、存在しない場合、前記製剤が、
ｉ．ポリＩ：Ｃ、糖脂質、および所望により第四級アミン、または
ｉｉ．ポリカチオン性担体
を含み、
ｂ）前記モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体が、存在しない場合、前記製剤が、アルミニウムの供給源を含むこと、
を条件とする、アジュバント製剤。
［態様２］
前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、存在する場合には、ＣｐＧまたはオリゴリボヌクレオチドであり；
前記ポリカチオン性担体が、存在する場合には、デキストラン、デキストランＤＥＡＥ（およびその誘導体）、ＰＥＧ、グアーガム、キトサン誘導体、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）ポリエチレンイミンのようなポリセルロース誘導体、ポリアミノからなる群から選択され；
前記第四級アミンが、存在する場合には、ＤＤＡおよびアブリジンからなる群から選択される、態様１に記載のアジュバント製剤。
［態様３］
前記糖脂質が、存在する場合には、式Ｉ：

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、独立して水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキルラジカルであり；Ｘは、−ＣＨ_２−、−Ｏ−、または−ＮＨ−であり：Ｒ^２は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和もしくは不飽和アルキルラジカルであり；Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、独立して水素、−ＳＯ_４ ^２−、−ＰＯ_４ ^２−、−ＣＯＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^６は、Ｌ−アラニル、Ｌ−α−アミノブチル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロリル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−トレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニル、およびＬ−バリル、またはそれらのＤ型異性体である）で示される化合物を含む、態様１または２のいずれか１項に記載のアジュバント製剤。
［態様４］
前記糖脂質が、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グリコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドまたはその塩である、態様３に記載のアジュバント製剤。
［態様５］
前記モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体の両方を含み、ステロールおよびポリＩ：Ｃのうちの少なくとも一方をさらに含む、態様１〜４のいずれか１項に記載のアジュバント製剤。
［態様６］
前記ステロールを含み、サポニンをさらに含む、態様５に記載のアジュバント製剤。
［態様７］
前記ポリＩ：Ｃを含み、前記第四級アミンおよび前記糖脂質のうちの少なくとも一方をさらに含む、態様１〜６のいずれか１項に記載のアジュバント製剤。
［態様８］
水酸化アルミニウムゲルであるアルミニウム供給源を含む、態様１〜６のいずれか１項に記載のアジュバント製剤。
［態様９］
有効量の抗原、および態様１〜８のいずれか１項に記載のアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記組成物の油相が、少なくとも５０％である、ワクチン組成物。
［態様１０］
有効量の抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、油相および水相（前記油相は前記製剤の少なくとも５０％ｖ／ｖを占める）、ポリカチオン性担体、ならびに、
ａ．サポニンと、ステロールと、所望により第四級アミンとの組み合わせ；ただし、前記アジュバント製剤が本質的にＤＥＡＥデキストラン、Quil A、コレステロール、およびＤＤＡからなる場合、前記抗原がE coli J-5バクテリンでないことを条件とする；あるいは
ｂ．免疫刺激性オリゴヌクレオチド；ただし、前記アジュバント製剤が本質的にＤＥＡＥデキストランおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチドからなる場合、前記抗原がウシ、ヒツジ、もしくはブタを罹患させる病原を含むか、または前記病原（複数可）に由来し、E coli J-5バクテリンでないことを条件とする、
を含む、ワクチン組成物。
［態様１１］
前記サポニンが、Quil Aであり、前記ステロールが、コレステロールであり、前記ポリカチオン性担体が、デキストランＤＥＡＥであり、前記第四級アミンが、ＤＤＡであり、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧである、態様１０に記載のワクチン組成物。
［態様１２］
アイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）またはウェルシュ菌（Clostridium perfringen）抗原のうちの少なくとも一方およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、
ａ）前記組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、ポリカチオン性担体、および所望により免疫刺激性オリゴヌクレオチド；または
ｂ）前記組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ステロール、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体、
を含む、ワクチン組成物。
［態様１３］
前記ポリカチオン性担体が、ＤＥＡＥデキストランである、態様１２に記載のワクチン組成物。
［態様１４］
家禽においてEimeria maximaまたはClostridium perfringensにより引き起こされる感染の処置または予防のための、態様１２または１３に記載のワクチン組成物の使用。
［態様１５］
ネオスポラ（Neospora）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、ならびに、
ａ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体；または
ｂ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性担体との組み合わせ、
を含む、ワクチン組成物。
［態様１６］
前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドとデキストランＤＥＡＥとの組み合わせを含む、態様１５に記載のワクチン組成物。
［態様１７］
モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体を含み、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドをさらに含む、態様１５に記載のワクチン組成物。
［態様１８］
ステロールをさらに含む、態様１７に記載のワクチン。
［態様１９］
Neosporaにより引き起こされる感染の処置または予防のための、態様１５〜１８のいずれか１項に記載のワクチンの使用。
［態様２０］
クラミジア症（Chlamydophila abortis）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相；ステロール；免疫刺激性オリゴヌクレオチド；モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体；およびポリＩ：Ｃを含む、ワクチン組成物。
［態様２１］
雌ヒツジにおいてクラミジア症（C. abortis）により引き起こされる流産の処置または予防のための、態様２０に記載のワクチンの使用。
［態様２２］
ミオスタチンおよびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびに、
ａ）ポリカチオン性担体；または
ｂ）ＭＰＬ−Ａもしくはその類似体、
のいずれか、を含む、ワクチン組成物。
［態様２３］
ＭＰＬ−Ａまたはその類似体を含む態様２２に記載の組成物であって、前記製剤が、前記組成物５０μｌあたり０．５μｇ未満のステロールを含む、組成物。
［態様２４］
動物におけるミオスタチンの量を減少させるための、態様２２〜２３のいずれか１項に記載のワクチンの使用。
［態様２５］
前記動物が、家禽動物である、態様２４に記載の使用。
［態様２６］
トルペレラ・ピオゲネス（Trueperella pyogenes）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびポリカチオン性担体を含む、ワクチン組成物。
［態様２７］
Trueperella pyogenesにより引き起こされる感染の処置または予防のための、態様２６に記載のワクチン組成物の使用。
［態様２８］
大腸菌（E coli）抗原、ＢＲＶ抗原もしくはＢＣＶ抗原のうちの少なくとも１つ、および、アジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記ワクチン組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびにポリカチオン性担体およびアルミニウム供給源の少なくとも一方を含む、ワクチン組成物。
［態様２９］
ａ． E coli抗原が、存在する場合には、E coli K99、E coli F41およびそれらの組み合わせからなる群から選択され；
ｂ．ＢＲＶ抗原が、存在する場合には、ＢＲＶ Ｇ６、ＢＲＶ Ｇ１０およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、
態様２８に記載のワクチン組成物。
［態様３０］
前記ポリカチオン性担体が、存在する場合には、デキストランＤＥＡＥであり；前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧである、態様２８〜２９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
［態様３１］
水酸化アルミニウムゲルであるアルミニウム供給源を含む、態様２８〜３０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
［態様３２］
前記アルミニウム供給源が、５％〜２０％ｖ／ｖの量で存在する、態様３１に記載のワクチン組成物。
［態様３３］
ウシ類動物においてE coli、ＢＣＶもしくはＢＲＶにより引き起こされる腸炎の処置または予防のための、態様２８〜３２のいずれか１項に記載のワクチン組成物の使用。
［態様３４］
前記ワクチンが、前記抗原（複数可）への少なくとも６ヶ月間の免疫を誘発する、態様３３に記載の使用。
［態様３５］
オウシマダニ（Rhipicephalus microplus）抗原およびアジュバントを含むワクチン組成物であって、前記アジュバントが、
ａ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド、サポニン、ステロール、第四級アミン、ポリアクリルポリマー、および糖脂質を含む水性アジュバント；ならびに
ｂ）前記ワクチン組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相を含み、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性担体を含む、油性アジュバント、
からなる群から選択される、ワクチン組成物。
［態様３６］
前記サポニンが、Quil Aであり、前記ステロールが、コレステロールであり、前記第四級アミンが、ＤＤＡであり、前記糖脂質が、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドまたはその塩であり、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧである、態様３５に記載のワクチン組成物。
［態様３７］
前記ポリカチオン性担体が、デキストランＤＥＡＥであり、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧである、態様３５に記載のワクチン組成物。
［態様３８］
Rhipicephalus microplusにより引き起こされる感染の処置または予防のための、態様３５〜３７のいずれか１項に記載のワクチン組成物の使用。
［態様３９］
口蹄疫（ＦＭＤ）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記ワクチン組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびポリカチオン性担体を含む、ワクチン組成物
［態様４０］
口蹄疫（ＦＭＤ）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記ワクチン組成物が、前記ワクチン組成物の少なくとも３６％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびポリカチオン性担体を含み、さらに前記ワクチン組成物が、油中水エマルジョンである、ワクチン組成物。
［態様４１］
前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧであり、前記ポリカチオン性担体が、ＤＥＡＥデキストランである、態様３９または４０に記載のワクチン組成物。
［態様４２］
ウシにおけるＦＭＤの処置または予防のための、態様３９〜４１のいずれか１項に記載のワクチン組成物の使用。
［態様４３］
ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis（S. uberis））抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、ポリカチオン性担体、ならびに、
ａ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド；
ｂ）サポニン、ステロール、および第四級アミンを含む組み合わせ；または
ｃ）それらの組み合わせ、
を含む、ワクチン組成物。
［態様４４］
S uberisにより引き起こされる感染の処置または予防のための、態様４３に記載のワクチンの使用。

Claims (44)

1. 油相および水相を含むアジュバント製剤であって、前記油相が、前記製剤の少なくとも５０％ｖ／ｖを占め、前記製剤が、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体および免疫刺激性オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方を含み、ただし
   ａ）前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、存在しない場合、前記製剤が、
   ｉ．ポリＩ：Ｃ、糖脂質、および所望により第四級アミン、または
   ｉｉ．ポリカチオン性担体
   を含み、
   ｂ）前記モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体が、存在しない場合、前記製剤が、アルミニウムの供給源を含むこと、
   を条件とする、アジュバント製剤。
2. 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、存在する場合には、ＣｐＧまたはオリゴリボヌクレオチドであり；
   前記ポリカチオン性担体が、存在する場合には、デキストラン、デキストランＤＥＡＥ（およびその誘導体）、ＰＥＧ、グアーガム、キトサン誘導体、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）ポリエチレンイミンのようなポリセルロース誘導体、ポリアミノからなる群から選択され；
   前記第四級アミンが、存在する場合には、ＤＤＡおよびアブリジンからなる群から選択される、請求項１に記載のアジュバント製剤。
3. 前記糖脂質が、存在する場合には、式Ｉ：
   

   

   （式中、Ｒ^１およびＲ^２は、独立して水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキルラジカルであり；Ｘは、−ＣＨ_２−、−Ｏ−、または−ＮＨ−であり：Ｒ^２は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和もしくは不飽和アルキルラジカルであり；Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、独立して水素、−ＳＯ_４ ^２−、−ＰＯ_４ ^２−、−ＣＯＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^６は、Ｌ−アラニル、Ｌ−α−アミノブチル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロリル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−トレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニル、およびＬ−バリル、またはそれらのＤ型異性体である）で示される化合物を含む、請求項１または２のいずれか１項に記載のアジュバント製剤。
4. 前記糖脂質が、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グリコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドまたはその塩である、請求項３に記載のアジュバント製剤。
5. 前記モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体の両方を含み、ステロ
   ールおよびポリＩ：Ｃのうちの少なくとも一方をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアジュバント製剤。
6. 前記ステロールを含み、サポニンをさらに含む、請求項５に記載のアジュバント製剤。
7. 前記ポリＩ：Ｃを含み、前記第四級アミンおよび前記糖脂質のうちの少なくとも一方をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアジュバント製剤。
8. 水酸化アルミニウムゲルであるアルミニウム供給源を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアジュバント製剤。
9. 有効量の抗原、および請求項１〜８のいずれか１項に記載のアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記組成物の油相が、少なくとも５０％である、ワクチン組成物。
10. 有効量の抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、油相および水相（前記油相は前記製剤の少なくとも５０％ｖ／ｖを占める）、ポリカチオン性担体、ならびに、
    ａ．サポニンと、ステロールと、所望により第四級アミンとの組み合わせ；ただし、前記アジュバント製剤が本質的にＤＥＡＥデキストラン、Quil A、コレステロール、およびＤＤＡからなる場合、前記抗原がE coli J-5バクテリンでないことを条件とする；あるいは
    ｂ．免疫刺激性オリゴヌクレオチド；ただし、前記アジュバント製剤が本質的にＤＥＡＥデキストランおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチドからなる場合、前記抗原がウシ、ヒツジ、もしくはブタを罹患させる病原を含むか、または前記病原（複数可）に由来し、E coli J-5バクテリンでないことを条件とする、
    を含む、ワクチン組成物。
11. 前記サポニンが、Quil Aであり、前記ステロールが、コレステロールであり、前記ポリカチオン性担体が、デキストランＤＥＡＥであり、前記第四級アミンが、ＤＤＡであり、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧである、請求項１０に記載のワクチン組成物。
12. アイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）またはウェルシュ菌（Clostridium perfringen）抗原のうちの少なくとも一方およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、
    ａ）前記組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、ポリカチオン性担体、および所望により免疫刺激性オリゴヌクレオチド；または
    ｂ）前記組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ステロール、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体、
    を含む、ワクチン組成物。
13. 前記ポリカチオン性担体が、ＤＥＡＥデキストランである、請求項１２に記載のワクチン組成物。
14. 家禽においてEimeria maximaまたはClostridium perfringensにより引き起こされる感
    染の処置または予防のための、請求項１２または１３に記載のワクチン組成物の使用。
15. ネオスポラ（Neospora）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、
    前記アジュバント製剤が、前記組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、ならびに、
    ａ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体；または
    ｂ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性担体との組み合わせ、
    を含む、ワクチン組成物。
16. 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドとデキストランＤＥＡＥとの組み合わせを含む、請求項１５に記載のワクチン組成物。
17. モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体を含み、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１５に記載のワクチン組成物。
18. ステロールをさらに含む、請求項１７に記載のワクチン。
19. Neosporaにより引き起こされる感染の処置または予防のための、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のワクチンの使用。
20. クラミジア症（Chlamydophila abortis）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン
    組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相；ステロール；免疫刺激性オリゴヌクレオチド；モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ）もしくはその類似体；およびポリＩ：Ｃを含む、ワクチン組成物。
21. 雌ヒツジにおいてクラミジア症（C. abortis）により引き起こされる流産の処置または予防のための、請求項２０に記載のワクチンの使用。
22. ミオスタチンおよびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびに、
    ａ）ポリカチオン性担体；または
    ｂ）ＭＰＬ−Ａもしくはその類似体、
    のいずれか、を含む、ワクチン組成物。
23. ＭＰＬ−Ａまたはその類似体を含む請求項２２に記載の組成物であって、前記製剤が、前記組成物５０μｌあたり０．５μｇ未満のステロールを含む、組成物。
24. 動物におけるミオスタチンの量を減少させるための、請求項２２〜２３のいずれか１項に記載のワクチンの使用。
25. 前記動物が、家禽動物である、請求項２４に記載の使用。
26. トルペレラ・ピオゲネス（Trueperella pyogenes）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびポリカチオン性担体を含む、ワクチン組成物。
27. Trueperella pyogenesにより引き起こされる感染の処置または予防のための、請求項２６に記載のワクチン組成物の使用。
28. 大腸菌（E coli）抗原、ＢＲＶ抗原もしくはＢＣＶ抗原のうちの少なくとも１つ、および、アジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記ワ
    クチン組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびにポリカチオン性担体およびアルミニウム供給源の少なくとも一方を含む、ワクチン組成物。
29. ａ． E coli抗原が、存在する場合には、E coli K99、E coli F41およびそれらの組み
    合わせからなる群から選択され；
    ｂ．ＢＲＶ抗原が、存在する場合には、ＢＲＶ Ｇ６、ＢＲＶ Ｇ１０およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、
    請求項２８に記載のワクチン組成物。
30. 前記ポリカチオン性担体が、存在する場合には、デキストランＤＥＡＥであり；前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧである、請求項２８〜２９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
31. 水酸化アルミニウムゲルであるアルミニウム供給源を含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
32. 前記アルミニウム供給源が、５％〜２０％ｖ／ｖの量で存在する、請求項３１に記載のワクチン組成物。
33. ウシ類動物においてE coli、ＢＣＶもしくはＢＲＶにより引き起こされる腸炎の処置または予防のための、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載のワクチン組成物の使用。
34. 前記ワクチンが、前記抗原（複数可）への少なくとも６ヶ月間の免疫を誘発する、請求項３３に記載の使用。
35. オウシマダニ（Rhipicephalus microplus）抗原およびアジュバントを含むワクチン組
    成物であって、前記アジュバントが、
    ａ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド、サポニン、ステロール、第四級アミン、ポリアクリルポリマー、および糖脂質を含む水性アジュバント；ならびに
    ｂ）前記ワクチン組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相を含み、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオン性担体を含む、油性アジュバント、
    からなる群から選択される、ワクチン組成物。
36. 前記サポニンが、Quil Aであり、前記ステロールが、コレステロールであり、前記第四級アミンが、ＤＤＡであり、前記糖脂質が、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドまたはその塩であり、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧである、請求項３５に記載のワクチン組成物。
37. 前記ポリカチオン性担体が、デキストランＤＥＡＥであり、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧである、請求項３５に記載のワクチン組成物。
38. Rhipicephalus microplusにより引き起こされる感染の処置または予防のための、請求
    項３５〜３７のいずれか１項に記載のワクチン組成物の使用。
39. 口蹄疫（ＦＭＤ）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記ワクチン組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびポリカチオン性担体を含む、ワクチン組成物
40. 口蹄疫（ＦＭＤ）抗原およびアジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記ワクチン組成物が、前記ワクチン組成物の少なくとも３６％ｖ／ｖの量で存在する油相、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびポリカチオン性担体を含み、さらに前記ワクチン組成物が、油中水エマルジョンである、ワクチン組成物。
41. 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧであり、前記ポリカチオン性担体が、ＤＥＡＥデキストランである、請求項３９または４０に記載のワクチン組成物。
42. ウシにおけるＦＭＤの処置または予防のための、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載のワクチン組成物の使用。
43. ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis（S. uberis））抗原およびア
    ジュバント製剤を含むワクチン組成物であって、前記アジュバント製剤が、前記組成物の少なくとも５０％ｖ／ｖの量で存在する油相、ポリカチオン性担体、ならびに、
    ａ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド；
    ｂ）サポニン、ステロール、および第四級アミンを含む組み合わせ；または
    ｃ）それらの組み合わせ、
    を含む、ワクチン組成物。
44. S uberisにより引き起こされる感染の処置または予防のための、請求項４３に記載のワクチンの使用。