TWI850093B - 穿梭載體、包含其之原核宿主細胞及利用該宿主細胞生產蛋白質之方法 - Google Patents
穿梭載體、包含其之原核宿主細胞及利用該宿主細胞生產蛋白質之方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申請案提供一種穿梭載體，其可於多種宿主細胞中操作，從而提供基因工程領域中的一種新穎的工具。另一方面，本申請案更提供一種包含所述穿梭載體的原核宿主細胞，以利用該穿梭載體建構含有欲表現基因的表現載體，便可利用單一載體而在不同宿主中大量生產蛋白質。
Description
本申請案關於一種用於基因工程之載體，尤指一種能在不同宿主複製的穿梭載體、包含所述穿梭載體的宿主細胞及利用該等宿主細胞生產蛋白質之方法。
質體（plasmid）為微生物染色體外之遺傳物質（extrachromosomal genetic material），在基因工程中常被應用作為載體（vector），以攜帶外源基因至宿主細胞中進行表現。載體通常包含：（a）複製子基因（replicon）使載體得以於宿主中進行複製；（b）多重選殖位（multiple cloning site）包含各種限制酶切位，使目標基因得以插入至載體中；以及（c） 抗藥性基因，使宿主得以獲得抗藥性表現型（phenotype），並以此篩選含有正確目標基因的選殖株。常見的載體種類如穿梭載體（shuttle vector）、選殖載體（cloning vector）及表現載體（expression vector）。
其中，穿梭載體係指能在不同之生物中行複製或表現蛋白質之質體，如在不同原核細胞間，或原核及真核細胞間。為使其得以於不同宿主中複製或表現蛋白質，通常包含對應於不同宿主的複製起始點，以獲得具有可在不同之宿主中進行複製的能力，因此可有效提升基因操作之便利性。例如基因選殖常使用容易操作之大腸桿菌中進行，待選殖出擁有目標基因片段之穿梭載體後，即可轉形至另一可正常且大量表現蛋白質的宿主，以進行基因表現。有鑑於穿梭載體可應用於兩種或兩種以上宿主中進行基因操作之優勢，領域中持續需要多種新穎之穿梭載體以滿足研究與商業之需求。
橋石短芽孢桿菌（
Brevibacillus choshinensis）為可產生孢子之絕對好氧革蘭氏陽性桿菌。目前
Br. choshinensisHPD31株已被開發成為基因表現宿主，用於生產多種重組蛋白質。以其作為基因表現宿主具有多項優勢如：
Br. choshinensis為不具致病性之高安全性菌株，在操作與應用無安全之顧慮；
Br. choshinensis更具有強力蛋白質分泌之特性，能運用於胞外生產重組蛋白質，且相比於大腸桿菌表現系統，不易形成內涵體（inclusion bodies）；
Br. choshinensis之胞外蛋白酶活性極低，分泌表現之重組蛋白質不易被降解等。
雖然
Br. choshinensisHPD31株已廣泛應用於表現多樣異源蛋白質，但運用於橋石短芽孢桿菌之穿梭載體種類的選擇性仍偏低。
爰是，為了提供本領域對於載體有更加多樣的選擇，本申請案提供了一種新穎的穿梭載體，其可於不同宿主間複製與表現蛋白質。在一實施態樣中，宿主細胞至少可包含大腸桿菌（
Escherichia coli）、枯草桿菌（
Bacillus subtilis）與橋石短芽孢桿菌（
Br. choshinensis）。
在一方面，穿梭載體可包含：（a）大腸桿菌（
E. coli）質體pBR322之複製子區域，其具有如SEQ ID NO：1所示之序列；以及（b）革蘭氏陽性菌之質體複製子區域。
較佳地，所述穿梭載體之革蘭氏陽性菌之質體複製子區域可包含：（a）凝結芽孢桿菌（
Bacillus coagulans）無性狀質體pBC1之複製子區域，其具有如SEQ ID NO：3所示之序列；（b）金黃色葡萄球菌（
Staphylococcus aureus）質體pC194之複製子區域，其具有如SEQ ID NO：4所示之序列；或（c）胚芽乳酸桿菌（
Lactobacillus plantarum）無性狀質體pLP31-8之複製子區域，其具有如SEQ ID NO：5所示之序列。
較佳地，所述穿梭載體可更包含大腸桿菌質體pBR322之調控蛋白質基因，其具有如SEQ ID NO：2所示之序列。
較佳地，所述穿梭載體可更包含至少一篩選基因。在一實施態樣中，所述篩選基因可包含抗藥性篩選基因、非抗藥性篩選基因、或其組合。在一較佳實施態樣中，所述抗藥性篩選基因可包含一氯黴素抗性基因或一新黴素抗性基因。
較佳地，所述穿梭載體可更包含多重選殖部位，供選殖目標基因。
較佳地，所述穿梭載體可更包含表現訊號，包含：（a）表現訊號P01
HPD52，其具有如SEQ ID NO：8所示之序列；（b）表現訊號P02
HPD52，其具有如SEQ ID NO：9所示之序列；（c）表現訊號P03
HPD52，其具有如SEQ ID NO：10所示之序列；（d）表現訊號P04
HPD52，其具有如SEQ ID NO：11所示之序列；（e）表現訊號P05
HPD52，其具有如SEQ ID NO：12所示之序列；（f）表現訊號P06
HPD52，其具有如SEQ ID NO：13所示之序列；（g）表現訊號P07
HPD52，其具有如SEQ ID NO：14所示之序列；（h）表現訊號P08
HPD52，其具有如SEQ ID NO：15所示之序列；（i）表現訊號P09
HPD52，其具有如SEQ ID NO：16所示之序列；（j）表現訊號P10
HPD52，其具有如SEQ ID NO：17所示之序列；（k）表現訊號P11
HPD52，其具有如SEQ ID NO：18所示之序列；（l）表現訊號P13
HPD52，其具有如SEQ ID NO：20所示之序列；（m）表現訊號P14
HPD52，其具有如SEQ ID NO：21所示之序列；（n）表現訊號P15
HPD52，其具有如SEQ ID NO：22所示之序列；（o）表現訊號P16
HPD52，其具有如SEQ ID NO：23所示之序列；（p）表現訊號P17
HPD52，其具有如SEQ ID NO：24所示之序列；或（q）表現訊號P19
HPD52，其具有如SEQ ID NO：26所示之序列。在一較佳實施態樣中，所述表現訊號可更包含誘導型表現訊號，包含：（a）誘導型表現訊號P06
HPD52/
lacO-1，其具有如SEQ ID NO：69所示之序列；（b）誘導型表現訊號P06
HPD52/
lacO-2，其具有如SEQ ID NO：70所示之序列；（c）誘導型表現訊號P06
HPD52/
lacO-3，其具有如SEQ ID NO：71所示之序列；（d）誘導型表現訊號P06
HPD52/
lacO-4，其具有如SEQ ID NO：72所示之序列；（e）誘導型表現訊號P06
HPD52/
lacO-5，其具有如SEQ ID NO：73所示之序列；（f）誘導型表現訊號P06
HPD52/
lacO-6，其具有如SEQ ID NO：74所示之序列；或（g）誘導型表現訊號P06
HPD52/
lacO-7，其具有如SEQ ID NO：75所示之序列。在一更佳實施態樣中，所述之穿梭載體更包含誘導型表現訊號之調節基因。
較佳地，所述穿梭載體可更包含報導基因。在一實施態樣中，該報導基因包含：（a）枯草桿菌（
B. subtilis）之纖維素酶基因
bglC；（b）地衣芽孢桿菌（
Bacillus licheniformis）之α-澱粉酶基因
amyL；或（c）嗜熱脂肪芽孢桿菌（
Geobacillus stearothermophilus）之α-澱粉酶基因
amyS。
較佳地，所述穿梭載體可更包含訊息胜肽，包含：（a）訊息胜肽SP02，其具有如SEQ ID NO：92所示之序列；（b）訊息胜肽SP04，其具有如SEQ ID NO：94所示之序列；（c）訊息胜肽SP07，其具有如SEQ ID NO：97所示之序列；（d）訊息胜肽SP08，其具有如SEQ ID NO：98所示之序列；（e）訊息胜肽SP10，其具有如SEQ ID NO：100所示之序列；（f）訊息胜肽SP11，其具有如SEQ ID NO：101所示之序列；或（g）訊息胜肽SP13，其具有如SEQ ID NO：103所示之序列。
較佳地，所述穿梭載體可更包含蛋白質之基因。
本申請案的另一個目的在於提供一種原核宿主細胞，其可包含前述之穿梭載體。
較佳地，前述宿主細胞可包含大腸桿菌（
E. coli）、枯草桿菌（
B. subtilis）與橋石短芽孢桿菌（
Br. choshinensis）。
本申請案的再一個目的在於提供一種使用前述之原核宿主細胞生產蛋白質之方法，該方法可包含下列之步驟：將前述之原核宿主細胞置入培養基中，並於適當培養條件下使所述原核宿主細胞表現所述蛋白質；以及由所述原核宿主細胞或所述原核宿主細胞之培養液中回收蛋白質。
較佳地，前述方法中所述蛋白質可包含一苦瓜胰蛋白酶抑制劑；更佳地，該苦瓜胰蛋白酶抑制劑可包含如SEQ ID NO：169所示之序列。
除非另有定義，本申請案所用之所有技術與科學術語均與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所通常理解的意義相同。在發生衝突的情況下，以本說明書包含之定義為準。
於本申請案中提及濃度時，本文所使用之「百分比」、「%」等可為質量濃度或體積百分濃度；質量濃度定義為：溶質的質量除以相應混合物的體積的百分比（包括溶質的體積），在文中可由「百分比」、「%」等後接「（w/v）」來表示；體積百分濃度定義為：溶質體積佔全部溶液體積的百分比，在文中可由「百分比」、「%」等後接「（v/v）」來表示。
如本申請案中所用者，術語「由……製成」（produced from）與「包括」（comprising）同義。如本文中所用者，術語「包含」（includes, including）、「包括」（comprises, comprising）、「具有」（has, having）、「含有」（contains, containing）、或其任何其他變型，係意欲涵蓋非排他性的涵括。例如，含有清單列出的複數元素的一組合物、製程、方法、製品或裝置不一定僅限於清單上所列出的這些元素而已，而是可以包括未明確列出但卻是該組合物、製程、方法、製品或裝置固有的其他元素。術語「包含」一般係以包括之意思被使用，此即係允許一或數種其他特徵或組成份之存在。
位於本申請案中之元素或成份之前的不定冠詞「一」及「一個」旨在非限制性地說明該元素或成分的實例數目（即出現數）。因此「一」或「一個」應理解為包括一個或至少一個，且該元素或成分的單數詞形也包括複數，除非該數目顯然是指單數。
本申請案提供了許多序列，包含引子序列、基因DNA序列與胺基酸序列，在該等序列於生物體中的功能與效果不被改變的情況下，應允許其擁有些許突變。也就是說，即使序列不同，但其產生的功能與效果與本申請案提供之序列相同的情況下，其應視為相同的序列。例如：在引子序列中，即使引子序列有些許不同，但可增幅出相同產物之引子者，應視為相同；基因DNA序列中，若基因發生了沉默突變（silent mutation），因其轉錄之胺基酸序列與突變前相同，應視為相同的序列；又如在胺基酸序列中，類似物理性質的胺基酸鹼基（如：相同電性、相同親水或疏水性、苯環等）彼此之間互相突變，而不影響其原來之結構與功能者，應視為相同的序列。上述之情況僅為示例，不應作為限制之解釋。
本申請案的目的在於提供一種穿梭載體，其為一種至少可於大腸桿菌、枯草桿菌與橋石短芽孢桿菌之原核宿主細胞中複製的載體，並透過該穿梭載體攜帶欲表現蛋白質之基因序列，進而表現蛋白質。該穿梭載體憑藉其可於兩種以上的宿主細胞中複製的特性，藉此克服於某一宿主中無法正常表達蛋白質的缺點，在基因工程的應用上更具優勢。
本文所使用之「穿梭載體」及「表現載體」等術語於本文中可彼此相互交替使用，其係指在載體上同時存在有大腸桿菌及不同革蘭氏陽性菌之質體複製子區域（replicon），使此載體可至少於大腸桿菌及不同革蘭氏陽性菌中複製並增殖，以突破質體於菌種種別存在的限制性。而表現載體可特指擁有表現蛋白質能力之宿主中的穿梭載體。
本文中所使用之「複製子區域（replicon）」係指DNA複製起始的區域，其至少包含一複製起始點（origin of replication）。
在一實施例中，前述穿梭載體更包含一大腸桿菌質體pBR322之調控蛋白質基因。較佳地，該調控蛋白質基因可為一抑制子基因，包含
rop基因，其可調控前述載體的複製數，並維持載體複製的穩定性。
在一實施例中，穿梭載體包含篩選基因，如新黴素（neomycin）抗性基因標記或氯黴素（chloramphenicol）抗性基因標記，不以此為限。
在一實施例中，穿梭載體更包含多重選殖位（multiple cloning site），該多重選殖位包含各種限制酶切位，供嵌入欲表現基因。
在一實施例中，穿梭載體更包含一表現訊號。本文所使用之「表現訊號」一詞意指能使特定基因進行轉錄的DNA序列，其包含：至少一個或多個啟動子（promotor）。因不同表現訊號對於吸引RNA聚合酶有不同的強度，故轉錄強度也有所不同，進而影響蛋白質的表現量。較佳地，表現訊號可以藉由在其附近插入調控序列（operator），進而使該表現訊號成為一誘導型表現訊號。而誘導型表現訊號可為負向或正向調節，也就是透過加入或移除誘導劑（inducer）後，即可促進或抑制轉錄的進行。常見的誘導物包含糖類與胺基酸分子。較佳地，所述穿梭載體更包含一誘導型表現訊號之調控基因。
在本文所使用之「誘導型表現訊號之調控基因」中，該「調控基因」一詞係指能使誘導型表現訊號得以正常運作所需之必要基因，例如：在大腸桿菌表現系統之乳糖操縱子（
lacoperon）中，乳糖調控序列（
lacoperator,
lacO）存在於表現訊號中，其為乳糖壓抑子（
lacrepressor,
lacI）所能專一性結合之序列，
lacI為調控誘導型表現訊號必須之調控基因。於大腸桿菌表現系統中，因大腸桿菌本身可自行表現
lacI基因，故使用於大腸桿菌之載體僅需擁有
lacO即可達成誘導型表現訊號之目的。
在一實施例中，穿梭載體更包含一誘導型表現訊號之調控基因。因本申請案所使用之宿主無法自行表現該調控基因，為使誘導型表現訊號正常地運作，將該調控基因插入至穿梭載體上，使宿主得以正常表現該調控基因。較佳地，該調控基因可為大腸桿菌表現系統中之壓抑子
lacI基因。
在一實施例中，穿梭載體更包含一報導基因，藉由該等報導基因的表現量，得以用來評估本申請案中對於穿梭載體插入不同的基因，而造成蛋白質表現量的變化。較佳地，該等報導基因包含：枯草桿菌之纖維素酶基因
bglC；地衣芽孢桿菌之α-澱粉酶基因
amyL；或嗜熱脂肪芽孢桿菌之α-澱粉酶基因
amyS。
本文中所稱「報導基因」一詞係指可產生特定蛋白質的基因，該特定蛋白質具有易於偵測、靈敏及可被定量之特性，可用於探討表現訊號之表現效率、分析訊息胜肽之分泌效率、研究標的基因於細胞中之存在位置、偵測分子選殖（molecular cloning）是否成功、鑑定蛋白質間之交互作用及了解基因傳遞系統（gene delivery system）之效率。目前已有多種報導基因如
lacZ、
gusA及
gfp廣泛運用於不同研究領域。
在一實施例中，穿梭載體包含一訊息胜肽，於本申請案的實驗結果中，使用的訊息胜肽不同，對於蛋白質產量多寡也有不同程度的影響。
本文中所稱「訊息胜肽」（signal peptide）一詞係指參與在蛋白質分泌過程，並輔助蛋白質轉位（translocation）得以順利進行的一段多肽。典型之訊息胜肽可分為三個區域，包含N-區域、H-區域及C-區域（圖1）：N-區域通常帶有一個帶正電荷之胺基酸，如精胺酸（arginine）或離胺酸（lysine），此區域能與細胞膜上轉位相關之蛋白質或帶負電荷之磷脂質進行結合；H-區域多為疏水性胺基酸如白胺酸（leucine）所組成，可於細胞膜中形成穩定之α-螺旋結構；H-區域中央之胺基酸通常為甘胺酸（glycine）或脯胺酸（proline），能使訊息胜肽形成類似髮夾之結構並嵌入細胞膜中；C-region會形成β-摺板結構，其中含有訊息胜肽酶（signal peptidase）切割部位，此部位之保留性胺基酸序列為丙胺酸（alanine）-X-丙胺酸。當帶有訊息胜肽之蛋白質被轉位至細胞外後，訊息胜肽酶會辨識此部位並將訊息胜肽切除，使蛋白質釋放至細胞外。因訊息胜肽輔助蛋白質被轉譯後的轉移和定位，故對於提升重組蛋白質之分泌產量有相當的重要性。在一實施例中，提供一種原核宿主細胞，其包含前述之穿梭載體。在一可行實施態樣中，所述原核宿主細胞可包含大腸桿菌（
E. coli）、枯草桿菌（
B. subtilis）與橋石短芽孢桿菌（
Br. choshinensis）。
本文中所稱「宿主」及「宿主細胞」等術語於本文中可彼此相互交替使用，其可表示原核細胞。可於該宿主細胞中引入一或數種本發明所述之載體或經基因工程方法插入欲表現基因的所述載體。如本發明所屬技術領域中通常知識者所瞭解，上述術語不僅意指特定之細胞，而且亦指該種細胞之後代或潛在可能之後代。因為基因突變或環境之影響，後繼之世代中可能會出現改變，故該等細胞之後代實質上不會與親代之細胞相同，然而卻仍包括於本文中所使用之該術語之範圍內。
在一實施例中，穿梭載體包含一蛋白質之基因，在表現載體得以順利插入該蛋白質之基因序列的前提下，該表現蛋白質之基因序列可為任意基因序列。本申請案所屬技術領域具有通常知識者能理解，於各種生物技術中所使用之載體，其在載體允許的條件下，皆可插入不同蛋白質之基因。
在一實施例中，提供一種利用前述之原核宿主細胞生產蛋白質之方法。舉例而言，所述蛋白質可包含苦瓜胰蛋白酶抑制劑；在一態樣中，該苦瓜胰蛋白酶抑制劑可包含如SEQ ID NO：169所示之序列。
本文中提供之利用穿梭載體生產苦瓜胰蛋白酶抑制劑之實施例，其僅在說明本申請案提供之穿梭載體，具有能在不同宿主中大量生產蛋白質的能力。故得以插入穿梭載體並於宿主中表現之蛋白質，可為任意蛋白質。
以下揭露為本案所請發明之實例，作為本申請案的具體示例，應不得藉由以下實例，而對於本申請案有所限制。
實例1： 一種穿梭載體，包含：
(a) 大腸桿菌（
E. coli）質體pBR322之複製子區域，其具有如SEQ ID NO：1所示之序列；以及
(b) 革蘭氏陽性菌之質體複製子區域。
實例2： 如前述實例所述之穿梭載體，其中該革蘭氏陽性菌之質體複製子區域包含：
(a) 凝結芽孢桿菌（
B. coagulans）無性狀質體pBC1之複製子區域，其具有如SEQ ID NO：3所示之序列；
(b) 金黃色葡萄球菌（
S. aureus）質體pC194之複製子區域，其具有如SEQ ID NO：4所示之序列；或
(c) 胚芽乳酸桿菌（
L. plantarum）無性狀質體pLP31-8之複製子區域，其具有如SEQ ID NO：5所示之序列。
實例3： 如前述實例所述之穿梭載體，更包含大腸桿菌質體pBR322之調控蛋白質基因，其具有如SEQ ID NO：2示之序列。
實例4： 如前述實例所述之穿梭載體，更包含至少一篩選基因。
實例5： 如前述實例所述之穿梭載體，其中該至少一篩選基因包含抗藥性篩選基因、非抗藥性篩選基因、或其組合。
實例6： 如前述實例所述之穿梭載體，其中該抗藥性篩選基因包含氯黴素抗性基因或新黴素抗性基因。
實例7： 如前述實例所述之穿梭載體，更包含多重選殖部位。
實例8： 如前述實例所述之穿梭載體，更包含表現訊號，包含：
(a) 表現訊號P01
HPD52，其具有如SEQ ID NO：8所示之序列；
(b) 表現訊號P02
HPD52，其具有如SEQ ID NO：9所示之序列；
(c) 表現訊號P03
HPD52，其具有如SEQ ID NO：10所示之序列；
(d) 表現訊號P04
HPD52，其具有如SEQ ID NO：11所示之序列；
(e) 表現訊號P05
HPD52，其具有如SEQ ID NO：12所示之序列；
(f) 表現訊號P06
HPD52，其具有如SEQ ID NO：13所示之序列；
(g) 表現訊號P07
HPD52，其具有如SEQ ID NO：14所示之序列；
(h) 表現訊號P08
HPD52，其具有如SEQ ID NO：15所示之序列；
(i) 表現訊號P09
HPD52，其具有如SEQ ID NO：16所示之序列；
(j) 表現訊號P10
HPD52，其具有如SEQ ID NO：17所示之序列；
(k) 表現訊號P11
HPD52，其具有如SEQ ID NO：18所示之序列；
(l) 表現訊號P13
HPD52，其具有如SEQ ID NO：20所示之序列；
(m) 表現訊號P14
HPD52，其具有如SEQ ID NO：21所示之序列；
(n) 表現訊號P15
HPD52，其具有如SEQ ID NO：22所示之序列；
(o) 表現訊號P16
HPD52，其具有如SEQ ID NO：23所示之序列；
(p) 表現訊號P17
HPD52，其具有如SEQ ID NO：24所示之序列；或
(q) 表現訊號P19
HPD52，其具有如SEQ ID NO：26所示之序列。
實例9： 如前述實例所述之穿梭載體，其中該表現訊號為誘導型表現訊號，包含：
(a) 誘導型表現訊號P06
HPD52/
lacO-1，其具有如SEQ ID NO：69所示之序列；
(b) 誘導型表現訊號P06
HPD52/
lacO-2，其具有如SEQ ID NO：70所示之序列；
(c) 誘導型表現訊號P06
HPD52/
lacO-3，其具有如SEQ ID NO：71所示之序列；
(d) 誘導型表現訊號P06
HPD52/
lacO-4，其具有如SEQ ID NO：72所示之序列；
(e) 誘導型表現訊號P06
HPD52/
lacO-5，其具有如SEQ ID NO：73所示之序列；
(f) 誘導型表現訊號P06
HPD52/
lacO-6，其具有如SEQ ID NO：74所示之序列；或
(g) 誘導型表現訊號P06
HPD52/
lacO-7，其具有如SEQ ID NO：75所示之序列。
實例10： 如前述實例所述之穿梭載體，更包含該誘導型表現訊號之調節基因。
實例11： 如前述實例所述之穿梭載體，更包含報導基因，包含：
(a) 枯草桿菌（
B. subtilis）之纖維素酶基因
bglC；
(b) 地衣芽孢桿菌（
B. licheniformis）之α-澱粉酶基因
amyL；或
(c) 嗜熱脂肪芽孢桿菌（
G. stearothermophilus）之α-澱粉酶基因
amyS。
實例12： 如前述實例所述之穿梭載體，更包含訊息胜肽，包含。
(a) 訊息胜肽SP02，其具有如SEQ ID NO：92所示之序列；
(b) 訊息胜肽SP04，其具有如SEQ ID NO：94所示之序列；
(c) 訊息胜肽SP07，其具有如SEQ ID NO：97所示之序列；
(d) 訊息胜肽SP08，其具有如SEQ ID NO：98所示之序列；
(e) 訊息胜肽SP10，其具有如SEQ ID NO：100所示之序列；
(f) 訊息胜肽SP11，其具有如SEQ ID NO：101所示之序列；或
(g) 訊息胜肽SP13，其具有如SEQ ID NO：103所示之序列。
實例13： 如前述實例所述之穿梭載體，更包含蛋白質之基因。
實例14： 一種原核宿主細胞，其包括前述實例中任一項所述之穿梭載體。
實例15： 如前述實例所述之原核宿主細胞，其中該原核宿主細胞包含大腸桿菌（
E. coli）、枯草桿菌（
B. subtilis）與橋石短芽孢桿菌（
Br. choshinensis）。
實例16： 一種利用如前述實例所述之原核宿主細胞生產蛋白質之方法，該方法包含下列之步驟：
將如前述實例所述之原核宿主細胞置入培養基中，並於適當培養條件下使該原核宿主細胞表現所述蛋白質；以及
由該細胞或細胞之培養液中回收該蛋白質。
實例17： 如前述實例所述之方法，其中該蛋白質包含苦瓜胰蛋白酶抑制劑。
實例18： 如前述實例所述之方法，其中該苦瓜胰蛋白酶抑制劑包含如SEQ ID NO：169所示之序列
本申請案中之材料、方法及實例僅為說明性質，除非特別說明，否則非意欲為限制本發明。儘管可用類似或等效於本文所述的方法或材料來實施或測試本發明，然本文所述者為較適當的方法及材料。
實施例
1
：相關實驗材料
1.1.
菌種
大腸桿菌 ECOS
TM9-5
： E. coliECOS
TM9-5購自臺灣益生 （Yeastern） 公司；其基因型（genotype）為
recA1
endA1
gyrA96
thi-1
hsdR17(rK
-mK
+) e14
–(
mcrA
– )
supE44
relA1 Δ(
lac-proAB)/F' [
traD36,
proAB +,
lacI q, lacZΔM15]，以其作為DNA選殖用之宿主細胞。
橋石短芽孢桿菌 HPD52 ：購自財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心（Bioresource Collection and Research Center, BCRC），BCRC編號為15920；其係分離自土壤之菌株，以其作為重組蛋白質表現用之宿主細胞。
1.2.
載體
pJET1.2 ：購自美國Thermo Fisher Scientific公司，為鈍端選殖用載體（blunt cloning vector）。其大小為2,974 bp，帶有安比西林抗性基因（ampicillin resistance gene, Ap
R）。以其作為DNA選殖用之載體。
pNCMO2 ：購自日本TaKaRa公司，為
E. coli與
Br. choshinensis穿梭載體 （shuttle vector）。其大小為5,225 bp，帶有Ap
R與新黴素抗性基因（neomycin resistance gene, Nm
R），其中Ap
R能於
E. coli中表現，Nm
R則能於
Br. choshinensis中表現。載體中亦帶有多重選殖部位（multiple cloning site, MCS）、sec訊息胜肽DNA及強力啟動子P2；MCS所帶有之限制酶切位包括
PstI、
BamHI、
SalI、
XbaI、
XhoI、
EcoRI、
KpnI、
SmaI、
BstBI、
ClaI及
HindIII。以其進行
Br. choshinensisHPD52電轉形條件之測試，並作為P2啟動子與sec訊息胜肽DNA之來源。
pNY326 ：購自日本TaKaRa公司，為
Br. choshinensis用之表現載體。其大小為3,438 bp，帶有Nm
R。載體中亦帶有MCS、sec訊息胜肽DNA及表現效率較低之P5啟動子；MCS所帶有之限制酶切位包括
PstI、
BamHI、
SalI、
XbaI、
XhoI、
EcoRI、
KpnI、
SmaI、
BstBI、
ClaI及
HindIII。以其作為P5啟動子DNA之來源。
pEBR-1 ：申請案中所述之pEBR-1具有如SEQ ID NO：170所示之序列，其係由
E. coli載體pBR322之複製區域（replicon-pBR322）、pBR322調控蛋白質基因（
rop-pBR322）、氯黴素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cm
R）、Nm
R、一人工合成MCS及凝結芽孢桿菌（
B. coagulans）無性狀質體pBC1之複製區域（replicon-pBC1）所構成。其大小為4,766 bp，其中Cm
R能於
E. coli與
B. subtilis中表現，Nm
R則能於
B. subtilis與
Br. choshinensis中表現；MCS所帶有之限制酶切位包括
BglII、
EcoRI、
SpeI、
NdeI、
BamHI、
XmaI、
PstI、
SalI、
HindIII、
XbaI及
XhoI。以其進行
Br. choshinensisHPD52電轉形條件之測試並作為DNA選殖用之載體。
pEBR-2 ：申請案中所述之pEBR-2具有如SEQ ID NO：171所示之序列，其係由replicon-pBR322、
rop-pBR322、Cm
R、Nm
R、一人工合成MCS及金黃色葡萄球菌（
Staphylococcus aureus）質體pC194之複製區域（replicon-pC194）所構成。其大小為4,865 bp；MCS所帶有之限制酶切位與pEBR-1相同。以其進行
Br. choshinensisHPD52電轉形條件之測試。
pEBR-3 ：申請案中所述之pEBR-3具有如SEQ ID NO：172所示之序列，其係由replicon-pBR322、
rop-pBR322、Cm
R、Nm
R、一人工合成MCS及
EcoRI經定點突變之胚芽乳酸桿菌（
Lactobacillus plantarum）ATIT-031無性狀質體pLP31-8所構成。其大小為5,236 bp；MCS所帶有之限制酶切位與pEBR-1相同。以其進行
Br. choshinensisHPD52電轉形條件之測試。
pEBR-4 ：申請案中所述之pEBR-4具有如SEQ ID NO：173所示之序列，其係由replicon-pBR322、
rop-pBR322、Cm
R、Nm
R、一人工合成MCS及
Corynebacterium xerosispTZ12之複製區域（replicon-pTZ12）所構成。此載體大小為5,204 bp；MCS所帶有之限制酶切位與pEBR-1相同。以其進行
Br. choshinensisHPD52電轉形條件之測試。
pMUTIN-GFP+ ：帶有此載體之
E. coli購自美國芽孢桿菌菌種保存中心（
BacillusGenetic Stock Center, BGSC），編號為ECE149。以其作為
E. coli乳糖壓抑子（repressor）基因
lacI之來源。
pBRLP-8-P23-GFPT ：申請案中所述之pBRLP-8-P23-GFPT具有如SEQ ID NO：174所示之序列，其大小為5,852 bp；載體中帶有突變型綠螢光蛋白質基因，其內之
NdeI與
SalI已經過定點突變。以其作為綠螢光蛋白質基因之來源。
pJET1.2-BSBglC ：申請案中所述之pJET1.2-BSBglC具有如SEQ ID NO：175所示之序列，其大小為4,495 bp；載體中帶有突變型枯草桿菌（
B. subtilis）纖維素酶基因
bglC，其內之
EcoRI與
NdeI已經過定點突變。以其作為
bglC之來源。
pJET1.2-BLAmyL ：申請案中所述之pJET1.2-BLAmyL具有如SEQ ID NO：176所示之序列，其大小為4,534 bp；載體中帶有地衣芽孢桿菌（
Bacillus licheniformis）BCRC 10494之α-澱粉酶基因
amyL。以其作為
amyL之來源。
pJET1.2-GSAmyS ：申請案中所述之pJET1.2-GSAmyS具有如SEQ ID NO：177所示之序列，其大小為4,645 bp；載體中帶有嗜熱脂肪芽孢桿菌（
Geobacillus stearothermophilus）BCRC 10285之α-澱粉酶基因
amyS。以其作為
amyS之來源。
pBRCM-MCS ：申請案中所述之pBRCM-MCS大小為2,353 bp，由
E. coli載體pBR322之複製區域、Cm
R及一人工合成多重選殖部位所構成。以其作為多重選殖部位之來源。
pJET1.2-TI-4 ：申請案中所述之pJET1.2-TI-4大小為3,199 bp；載體中帶有依照
B. subtilis密碼子偏好所設計之苦瓜胰蛋白酶抑制劑（TI-4）基因。以其作為TI-4基因之來源。
1.3.
藥品試劑
本申請案所用之藥品主要購自美國Sigma-Aldrich、美國BD、美國VWR Life Science AMRESCO、美國J.T.Baker及德國Merck公司，若為其他廠牌之藥品則另外標註。試劑部分中之核酸限制酶（restriction enzyme）、CloneJET PCR Cloning Kit、GeneRuler
TM100 bp plus DNA Ladder、GeneRuler
TM1 kb DNA Ladder、6倍DNA loading dye、DreamTaq DNA聚合酶（polymerase）、PageRuler
TMPrestained Protein Ladder、Pierce
TM660 nm Protein Assay、Albumin standard、20倍MES SDS running 緩衝液及NuPAGE 4～12%（w/v）Bis-Tris gel購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Q5 High-Fidelity DNA聚合酶購自美國New England Biolabs公司；50倍Tris-acetate-EDTA（TAE）緩衝液與6倍EZ-Vision
TMloading 緩衝液購自美國VWR Life Science Amresco公司；GDP-HiFi DNA聚合酶購自美國Genedirex公司；HiTrap
TMSP Sepharose FF購自瑞典GE Healthcare公司；Quick Coomassie Stain購自英國Protein Ark公司；DNeasy Blood & Tissue Kit購自德國Qiagen公司；T4 DNA接合酶（ligase）購自臺灣益生（Yeastern）公司；Plasmid Miniprep Purification Kit II、PCR Clean Up Kit及Plus Gel Eluted Kit購自臺灣捷恩麥克生物科技（GMbiolab）公司；10倍Tris-glycine-SDS（TGS）緩衝液購自臺灣拜爾碁特生物科技（Biokit）公司。
1.4.
培養基
利用Luria-Bertani（LB）培養基進行
E. coli與
B. subtilis之培養，以MT培養基進行
Br. choshinensisHPD52之培養，視實驗需求添加適量之抗生素或1.5%（w/v）之洋菜（agar）。LB培養基粉末購自美國BD公司；洋菜購自澳洲Focus Bioscience公司。MT培養基中之polypeptone購自加拿大Bio Basic公司；肉類萃取物（meat extract）與酵母萃取物（yeast extract）購自美國BD公司，其餘成分購自美國Sigma-Aldrich。本申請案中所使用培養基之配方如表1所述。
表 1 、培養基配方
| 培養基 配方 | LB培養基 | MT培養基 | |
| Bacto-tryptone | %（w/v） | 1.0 | - |
| 酵母萃取物 | %（w/v） | 0.5 | 0.2 |
| NaCl（pH 7.0） | %（w/v） | 1 | - |
| polypeptone | %（w/v） | - | 1.0 |
| 肉類萃取物 | %（w/v） | - | 0.5 |
| MgCl 2 | （mM） | - | 20 |
| FeSO 4・7H 2O | （mg/L） | - | 10 |
| MnSO 4・4H 2O | （mg/L） | - | 10 |
| ZnSO 4・7H 2O | （mg/L） | - | 10 |
| 葡萄糖 | %（w/v） | - | 1 |
1.5.
抗生素儲備溶液配製方式與使用濃度
安比西林（ Ap ）儲備液：將安比西林粉末溶於去離子水中，配製成25 mg/mL之濃度，以親水性聚醚碸（polyethersulfone, PES）材質之0.22 μm 無菌針頭式過濾器（Merck Millipore, USA）進行過濾除菌。將安比西林儲備液 （ampicillin stock solution）貯存於-20°C備用。使用濃度為100 μg/mL。
氯黴素（ Cm ）儲備液：將氯黴素粉末溶於絕對酒精中，配製成10 mg/mL之濃度，以親水性聚酰胺（nylon, NY）材質之0.22 μm 無菌針頭式過濾器（Sartorius, Germany）進行過濾除菌。將氯黴素儲備液（chloramphenicol stock solution）貯存於-20°C備用。使用濃度為25 μg/mL。
新黴素（ Nm ）儲備液：將新黴素粉末溶於去離子水中，配製成50 mg/mL之濃度，以親水性聚醚碸（polyethersulfone, PES）材質之0.22 μm 無菌針頭式過濾器進行過濾除菌。將新黴素儲備液（neomycin stock solution）貯存於-20°C備用。使用濃度為10 μg/mL。
1.6. 使用之引子 表 2 、增幅綠螢光蛋白質基因、乳糖壓抑子基因、報導基因、苦瓜胰蛋白酶抑制劑基因及 MCS 序列所用之引子
a粗體處為限制酶切位：CATATG（
NdeI），GGATCC（
BamHI），GTCGAC（
SalI），TCTAGA（
XbaI）， CTCGAG（
XhoI）；用於定點突變（site-directed mutagenesis）的突變鹼基以粗斜體表示。
| SEQ ID NO ： | 名稱 | 序列 （ 從 5’ 端到 3’ 端 ） a |
| 146 | GFPF | GATATA CATATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTC |
| 147 | GFPR | CTGCAG GTCGACTTATTTGTAGAGCTCATCCATGCC |
| 148 | LACIF | GATATA TCTAGAGAGCACTAGTGCAGCCCGCCT |
| 149 | LACIM1 | CGGTTGCATTTAAATCTTACATAT C TAATACTTTCAAAGACTACATTTG |
| 150 | LACIM2 | CAAATGTAGTCTTTGAAAGTATTA G ATATGTAAGATTTAAATGCAACCG |
| 151 | LACIR | CAATAT CTCGAGTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTC |
| 152 | BGLCF | GATATA CATATGAAACGGTCAATCTCTATTTTTATTACGTGT |
| 153 | BGLCR | CAATAT GTCGACATTTGGTTCTGTTCCCCAAATCA |
| 154 | BLAMYF | GATATA CATATGAAACAACAAAAACGGCTTTACG |
| 155 | BLAMYR | CAATAT CTCGAGCTATCTTTGAACATAAATTGAAACCGAC |
| 156 | GSAMYF1 | GATATA CATATGCTAACGTTTCACCGCATCA |
| 157 | GSAMYR1 | CAATAT CTCGAGTCAAGGCCATGCCACCAACCGTG |
| 158 | GSAMYSF2 | CAATAT GGATCCGCCGCACCGTTTAACGGC |
| 159 | GSAMYSM1 | CACTGAAAAACCAGGATC T GGACTGGCCGCATTGATC |
| 160 | GSAMYSM2 | GATCAATGCGGCCAGTCC A GATCCTGGTTTTTCAGTG |
| 161 | GSAMYSM3 | CAGTCATGGGTCGA T CCATGGTTCAAACC |
| 162 | GSAMYSM4 | GGTTTGAACCATGG A TCGACCCATGACTG |
| 163 | GSAMYSR2 | CAATAT GTCGACCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGCCATGCCACCAACCG |
| 164 | MCSF | GATATAAGATCTGCTAGCGAATTCACTAGTCATAT |
| 165 | MCSR | CAATATCTCGAGTACGTATCTAGAGCAAAGCTTA |
| 166 | TI-4F | GATATA GGATCCTGCCAAGGCAAATCTTCTTGG |
| 167 | TI-4R | CAATAT GTCGACTTAGCCGATTGTAGGAGGACGAGC |
實施例
2
：方法
2.1.
抽取
DNA
E. coli 質體 DNA 之抽取 ：利用Plasmid Miniprep Purification Kit II進行
E. coli質體DNA之抽取，操作流程依照廠商提供之方法進行修飾，流程中提及之Solution I、Solution II、Solution III、Washing solution A、Washing solution B及Elution solution均為套組所附之試劑。取1.8 mL經培養14～18小時後之
E. coli菌液於2.0 mL微量離心管中，以20,630 ×g與4°C之條件下離心5分鐘後，倒除上清液並收集菌體，重複此步驟1次。加入200 μL Solution I並進行菌體之懸浮。之後，加入200 μL Solution II，經緩和混合數次，使菌體裂解；再加入200 μL Solution III，緩和混合數次。以20,630 ×g與室溫之條件下離心10分鐘，並收集上清液。將分離小管（spin column）置於收集小管（collection tube）後，將上清液置入分離小管中。以20,630 ×g與室溫之條件下離心1分鐘，倒除收集小管中之溶液後，再加入500 μL Washing solution A於分離小管中。以20,630 ×g與室溫之條件下離心1分鐘並倒除收集小管之溶液，此步驟可有效降低核酸內切酶（endonuclease）之污染。接著加入600 μL Washing solution B於分離小管中，以20,630 ×g與室溫之條件下離心1分鐘，倒除收集小管之溶液，重覆此步驟1次。接著以20,630 ×g與室溫之條件下離心5分鐘，以去除分離小管中殘留之酒精。接著將分離小管置於1.5 mL微量離心管，並加入35 μL Elution solution。於室溫下靜置2分鐘後，以20,630 ×g與室溫之條件下離心2分鐘，進行質體DNA之沖提。將質體DNA貯存於-20°C中備用。
Br. choshinensis HPD52 質體 DNA 之抽取 ：利用Plasmid Miniprep Purification Kit II進行
Br. choshinensisHPD52質體之抽取，操作流程依照廠商提供之方法加以修飾。取1.8 mL 經培養14～17小時後之
Br. choshinensisHPD52菌液於2.0 mL微量離心管中，以7,000 ×g與4°C之條件下離心5分鐘，倒除上清液並收集菌體，重複此步驟1次。加入含有10 mg/mL lysozyme之200 μL Solution I並進行菌體之懸浮，並於37°C下作用30分鐘。後續之操作步驟同
E. coli質體DNA抽取流程。
Br. choshinensis HPD52 基因體 DNA 之抽取 ：利用DNA純化套組 （DNeasy Blood & Tissue Kit）進行
Br. choshinensisHPD52基因體（genomic） DNA之抽取，操作流程係依照廠商提供之方法加以修飾，流程中提及之Proteinase K solution、緩衝液 AL、緩衝液 AW1、緩衝液 AW2及緩衝液AE均為套組所附之試劑。取1.8 mL 經培養14～17小時後之
Br. choshinensisHPD52菌液於2.0 mL微量離心管中，以20,630 ×g與4°C之條件下離心5分鐘後，倒除上清液並收集菌體，重複此步驟1次。加入1 mL TSE 緩衝液（10 mM Tris, 10 mM EDTA, 300 mM NaCl, pH 8.0）並進行菌體之懸浮。以20,630 ×g與4°C之條件下離心5分鐘後，倒除上清液並收集菌體。接著加入180 μL lysis 緩衝液（50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA; 25% （w/v） sucrose, 100 μg/mL RNase A, 10 mg/mL lysozyme, pH 8.0）並進行菌體之懸浮。於37°C下作用30分鐘後，加入25 μL Protease K溶液與200 μL 緩衝液 AL。經充分混合後，於56°C下作用30分鐘；於反應過程中每5分鐘可緩和上下搖晃數次。接著加入200 μL絕對酒精並混合均勻。將上述溶液取至分離小管並置於收集小管中，以20,630 ×g與4°C之條件下離心1分鐘，倒除收集小管之溶液。加入500 μL 緩衝液 AW1於分離小管中，以20,630 ×g與4°C之條件下離心1分鐘，倒除收集小管之溶液。再加入500 μL 緩衝液 AW2於分離小管中，以20,630 ×g與4°C之條件下離心1分鐘，倒除收集小管之溶液。之後，以20,630 ×g與4°C之條件下離心5分鐘，以去除分離小管中殘留之酒精。接著將分離小管置於1.5 mL微量離心管，並加入100 μL 緩衝液 AE。於室溫下靜置2分鐘後，以20,630 ×g與室溫之條件下離心2分鐘，進行基因體DNA之沖提。將基因體DNA貯存於-20°C中備用。
2.2.
聚合酶連鎖反應
聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction, PCR）係以耐熱性DNA聚合酶、特異性引子（primer）組合、特定模板（template）、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates, dNTPs）及反應緩衝液於試管中 （
in vitro） 利用一連串升溫與降溫之反應，達到大量擴增特定DNA片段之技術。本申請案主要利用此技術進行特定DNA片段之增幅或突變。
進行PCR前，須針對欲增幅與欲突變之DNA片段設計引子組合，因此須計算引子之Tm值：一般引子之Tm值以Vector NTI（Thermo Fisher Scientific, USA）進行分析，溫度設定於55°C至65°C之間；突變引子之Tm值以Thermo Fisher Scientific公司所提供之公式 [Tm = 81.5 + 0.41 (%GC) - 675/N - %mismatch] 進行計算，其溫度值需高於75°C，公式中%GC為突變引子GC核苷酸所佔之百分比、N為突變引子長度，而%mismatch為突變鹼基於突變引子中所佔的百分比。為符合DNA選殖之需求，於某些引子之5’端設計限制酶切位。
進行PCR時，將耐熱性DNA聚合酶、引子、特定模板、dNTPs、反應緩衝液及適量滅菌去離子水混合後，利用聚合酶連鎖反應儀Biometra T-Gradient Thermocycler（Göttingen, Germany）於特定反應條件下進行DNA片段之擴增。有關PCR反應中所使用之Q5 High-Fidelity DNA聚合酶與GDP-HiFi DNA聚合酶之使用方式和PCR條件設定依廠商提供之說明書進行。於PCR反應結束後，以瓊脂醣膠體電泳（agarose gel）觀察PCR之結果。
2.3.
瓊脂醣膠體電泳
利用瓊脂醣膠體進行DNA分子之電泳，視實驗需求配製0.7%或2%（w/v）之膠體。將DNA樣本與6倍EZ-Vision
TMloading 緩衝液以5：1之比例進行混合。將上述混合物注入瓊脂醣膠體之樣本凹槽（loading well）中。以1倍TAE 緩衝液（40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA, pH 7.6）作為電泳緩衝液，並於100 V與30分鐘條件下進行電泳。電泳完畢後，將膠體放入E-BOX CX5膠片影像擷取分析系統（Vilber Lourmat, France）中，觀察DNA電泳之結果與照相。
2.4.
PCR
產物之回收
利用PCR Clean Up Kit或Plus Gel Eluted Kit進行PCR產物之回收。有關PCR Clean Up Kit與Plus Gel Eluted Kit之操作流程依照廠商提供之方法進行，流程中提及之Binding 緩衝液、Wash solution及Elution solution均為套組所附之試劑。
PCR Clean Up Kit 操作流程：將100 μL PCR產物與300 μL Binding 緩衝液於1.5 mL微量離心管中混合均勻後，取至分離小管中。將含有上述溶液之分離小管置於收集小管中，以20,630 ×g與室溫之條件下離心1分鐘後，倒除收集小管之溶液。接著加入700 μL Wash solution於分離小管中，以20,630 ×g與室溫之條件下離心1分鐘後，倒除收集小管之溶液，重覆此步驟1次。之後，以20,630 ×g與室溫之條件下離心5分鐘。接著將分離小管置於1.5 mL微量離心管，並加入35 μL Elution solution。於室溫下靜置2分鐘後，以20,630 ×g與室溫之條件下離心2分鐘，進行PCR產物之沖提。將PCR產物貯存於-20°C中備用。
Plus Gel Eluted Kit 操作流程：將DNA樣本進行瓊脂醣膠體電泳後，利用E-BOX CX5膠片影像擷取分析系統判斷欲回收DNA片段於膠體中之位置。以乾淨刀片切下含有欲回收DNA片段之瓊脂醣膠體後，置於1.5 mL微量離心管中。接著加入500 μL Binding 緩衝液並於60°C下作用10分鐘，直至膠體完全熔解。將熔解後之膠體取至分離小管中，並置於收集小管內。於20,630 ×g與室溫之條件下離心1分鐘後，倒除收集小管之溶液。於分離小管中加入500 μL Binding 緩衝液，以20,630 ×g與室溫之條件下離心1分鐘後，倒除收集小管之溶液。接著於分離小管中加入700 μL Wash solution，以20,630 ×g與室溫之條件下離心1分鐘，重覆此步驟1次。之後以20,630 ×g與室溫之條件下離心5分鐘。接著將分離小管置於1.5 mL微量離心管，並加入35 μL Elution solution。於室溫下靜置2分鐘後，以20,630 ×g與室溫之條件下離心2分鐘，進行PCR產物之沖提。將PCR產物貯存於-20°C中備用。
2.5.
DNA
分子之剪切與回收
利用Thermo Fisher Scientific FastDigest限制酶進行DNA分子之剪切，操作流程係依照廠商提供之方法進行。將適量DNA樣本、10倍FastDigest緩衝液、滅菌去離子水及適量限制酶混合均勻後，於37°C下反應15分鐘。接著以瓊脂醣膠體電泳觀察DNA之剪切情形。利用Plus Gel Eluted Kit或PCR Clean Up Kit進行DNA剪切產物之回收。
2.6. DNA
分子黏合
利用YB Rapid Ligation Kit或CloneJET PCR Cloning Kit進行DNA分子之黏合，操作流程依照廠商提供之方法進行，流程中提及之緩衝液 A、緩衝液 B及T4 DNA接合酶（3 U/μL）為YB Rapid Ligation Kit所附之試劑；pJET1.2（50 ng/μL）、2倍Reaction 緩衝液與T4 DNA接合酶（5 U/μL）為CloneJET PCR Cloning Kit所附之試劑。
YB Rapid Ligation Kit 操作流程：將回收之載體DNA片段與欲嵌入載體中之DNA片段即外插DNA（insert DNA），以適量之莫耳數比例混合後，加入1 μL 緩衝液 A、1 μL 緩衝液 B及1 μL T4 DNA 接合酶（3 U/μL），反應總體積控制在10 μL，並緩和混合均勻。於22°C下反應30分鐘。此黏合混合物（ligation mixture）即可進行轉形作用。
CloneJET PCR Cloning Kit 操作流程：取3 μL回收後之PCR產物於1.5 mL微量離心管中，加入1 μL pJET1.2（50 ng/μL）、10 μL 2倍Reaction 緩衝液、5 μL滅菌去離子水及1 μL T4 DNA接合酶 （5 U/μL），緩和混合均勻。於22°C下反應30分鐘。此黏合混合物即可進行轉形作用。
2.7.
E. coliECOS
TM9-5
之熱震轉形
E. coliECOS
TM9-5之熱震轉形（heat shock transformation）係依照廠商提供之方法進行。自-80°C冰箱中取出
E. coliECOS
TM9-5並進行解凍後，加入2 μL載體或黏合混合物，並於冰浴中靜置30分鐘。於42°C下作用45秒後，進行震盪並於冰浴中靜置5分鐘。之後，加入200 μL Select APS
TM培養基（BD, USA）。於37°C與180 rpm之條件下培養1小時。取適量菌液塗抹於含適量抗生素之LB固體培養基上，於37°C下培養14～17小時，觀察菌落生長情形。
2.8.
菌落聚合酶連鎖反應
菌落聚合酶連鎖反應 （colony PCR） 為一種快速篩選轉形株中是否帶有標的DNA片段之技術。首先，配製100 μL PCR反應混合物，其中包含1倍Dream Taq緩衝液、200 μM之dNTPs、0.5 μM擴增引子、2.5 U Dream Taq DNA聚合酶及適量滅菌去離子水。將PCR反應混合物分裝於0.2 mL微量離心管（10 μL/管）中。於無菌操作台中，以滅菌牙籤沾取選定之菌落，並置入微量離心管中攪拌。將0.2 mL微量離心管置於聚合酶連鎖反應儀中，並進行PCR反應。反應條件設定為95°C反應5分鐘（1個循環）；95°C反應30秒、X°C反應30秒、72°C反應Y秒（25個循環）；72°C反應7分鐘（1個循環）。其中X為引子黏合之溫度，將其設定為引子之Tm值。Y為耐熱性DNA聚合酶延展時間。若增幅1 kb大小之DNA片段，將Y值設定為60秒。於PCR反應結束後，以瓊脂醣膠體電泳觀察PCR之結果。
2.9.
DNA
定序
利用colony PCR篩選出帶有標的DNA之
E. coli菌落後，將菌落接種於含適量抗生素之5 mL Superior broth
TM培養基（AthenaES, USA）中，並於37°C與180 rpm之條件下培養14～17小時。利用Plasmid Miniprep Purification Kit II進行
E. coli質體之抽取。委託源資國際生物科技股份有限公司進行DNA之定序。
2.10.
不同宿主之綠螢光蛋白質表現強度之偵測方法
E. coli 表現系統：將帶有綠螢光蛋白質表現載體之
E. coli菌落接種於含氯黴素之LB培養基中，於37°C與220 rpm之條件下培養14～17小時。將隔夜培養之菌液接種於含氯黴素之新鮮LB培養基中，並將起始OD
600調整至0.1後，於37°C與220 rpm之條件下進行培養。於不同培養時間下，取0.5 mL菌液置於1.5 mL滅菌微量離心管中，於7,000 ×g與4°C之條件下離心5分鐘，並收集菌體。以0.5 mL磷酸緩衝溶液（58 mM Na
2HPO
4, 17 mM NaH
2PO
4, 68 mM NaCl）洗滌菌體一次後，再將菌體重新懸浮於0.5 mL磷酸緩衝溶液中。取100 μL菌液加入96孔透明盤中，利用INFINITE M200微盤分析儀（Tecan, USA）於波長600 nm下，測量菌液之吸光值。另取100 μL菌液加入96孔黑盤中，於激發光與放射光波長分別為482 nm與512 nm之條件下，測定菌液之螢光值。若有必要，則將菌液進行適當稀釋。螢光強度（fluorescence intensity）以每單位細胞之螢光值（fluorescence/OD
600）表示。
Br. choshinensis HPD52 表現系統：將帶有綠螢光蛋白質表現載體之
Br. choshinensisHPD52菌落接種於含新黴素之MT培養基中，於37°C與220 rpm之條件下培養14～17小時。將隔夜培養之菌液添加至含新黴素之新鮮MT培養基中，並將起始OD
600調整至0.1後，於37°C與220 rpm之條件下進行培養。後續操作流程如
E. coli表現系統之步驟一致。
B. subtilis DB430 表現系統：將帶有綠螢光蛋白質表現載體之
B. subtilisDB430菌落接種於含氯黴素之LB培養基中，於37°C與220 rpm 之條件下培養14～17小時。將隔夜培養之菌液添加至含氯黴素之新鮮LB培養基中，並將起始OD600 調整至0.1 後，於37°C與220 rpm之條件下進行培養。後續操作流程如
E. coli表現系統之步驟一致。
Br. choshinensis HPD52 誘導型表現系統：將帶有綠螢光蛋白質誘導型表現載體之
Br. choshinensisHPD52菌落接種於含新黴素之MT培養基中，於37°C與220 rpm之條件下培養14～17小時。將隔夜培養之菌液添加至含新黴素之新鮮MT培養基中，並將起始OD
600調整至0.1後，於37°C與220 rpm之條件下進行培養。培養至OD
600約0.4～0.6時，加入1 mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG）後，於37°C與220 rpm之條件下繼續培養。後續操作流程如
E. coli表現系統之步驟一致。
2.11.
蛋白質相關實驗方法
Glycine-SDS PAGE 蛋白質電泳：首先製備聚丙烯醯胺膠體，其分為二層膠，分別為4% stacking gel及12.5% separation gel，其中separation gel之濃度可視實驗需求加以調整。將電泳膠片放入電泳槽設備（ATTO, Japan）中，並倒入1倍TGS 緩衝液（25 mM Tris, 250 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3）。將樣本與5倍sample 緩衝液（Biokit, Taiwan）以1:4之比例混合後，於100°C下加熱5分鐘。將PageRuler
TMPrestained Protein Ladder與樣本裝載（loading）至樣本凹槽（well）後，於80 V下進行電泳60分鐘，再以145 V進行電泳60分鐘。電泳完畢後，拆下膠體以Quick Coomassie Stain進行蛋白質染色。經染色16小時後，再以去離子水進行褪染。
NuPAGE
TM4
～ 12% （ w/v ） Bis-Tris 蛋白質電泳：拆除預鑄膠外包裝與下方封條後，將預鑄膠置於電泳槽設備（Thermo Fisher Scientific, USA）中，並倒入1倍 MES SDS Running 緩衝液（Thermo Fisher Scientific, USA）（50 mM MES, 50 mM Tris, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, pH 7.3）。將樣本與5倍sample 緩衝液以1:4之比例混合後，於100°C下加熱5分鐘。將SeeBlue
TMPre-stained Protein Standard（Invitrogen, USA）與樣本裝載至樣本凹槽後，於130 V下進行電泳60分鐘。電泳完畢後，拆下膠體以Quick Coomassie Stain進行蛋白質染色。經染色16小時後，再以去離子水進行褪染。
蛋白質之純化：利用1 mL HiTrap
TMSP Sepharose FF管柱搭配蛋白質液相層析系統ÄKTA prime plus（GE Healthcare, Sweden）進行目標蛋白質之純化，純化步驟如下所述。首先以5 mL平衡緩衝液（20 mM sodium phosphate, pH 7.0）進行管柱平衡，接著以5 mL沖提緩衝液（20 mM sodium phosphate, 1 M sodium chloride, pH 7.0）洗滌管柱，再以10 mL平衡緩衝液洗除管柱中之沖提緩衝液，此步驟能活化SP Sepharose FF樹脂。
將培養上清液與平衡緩衝液以1:4之比例混合後，利用0.1 N HCl溶液將溶液之pH值調整至7.0，再利用0.2 μm無菌過濾杯（Thermo Fisher Scientific, USA）進行過濾。接著將稀釋後之培養上清液注入HiTrap
TMSP Sepharose FF管柱中。待樣本注入完成後，以20 mL平衡緩衝液洗除非特異性結合之蛋白質。再利用NaCl線性梯度（0～1 M）方式進行目標蛋白質之沖提。利用NuPAGE
TM4-12% Bis-Tris 蛋白質電泳觀察蛋白質之純化情形。
蛋白質濃度之測定：利用Pierce
TM660 nm Protein Assay進行蛋白質濃度之測定。取10 μL蛋白質樣本於96孔盤中，加入150 μL protein assay reagent並混合均勻。置於室溫下作用5分鐘。接著利用INFINITE M200微盤分析儀於660 nm下測定吸光值。以牛血清蛋白質（bovine serum albumin, BSA）作為標準品製作蛋白質濃度標準曲線。將樣本之吸光值對照標準曲線，即可換算求得蛋白質樣本之濃度。
質譜分析蛋白質身分鑑定：將純化之目標蛋白質進行蛋白質電泳後，利用Quick Coomassie Stain進行蛋白質染色。經染色16小時後，以微量吸管將欲分析之蛋白質樣本自膠片上切取下來，並置於1.5 mL微量離心管中。以20%（v/v）酒精進行褪染。之後，將蛋白質樣本以冷凍方式寄送至中興大學生物科技發展中心，利用線性離子阱式質譜分析系統Finnigan LTQ XL（Thermo Electron, USA）進行蛋白質身份鑑定。
實施例
3
：不同穿梭載體於
Br. choshinensis
HPD52
株之適用性
3.1.
Br. choshinensisHPD52
之電轉形
電勝任細胞（electrocompetent cell）之製備係依照Okamoto等人所述之方法進行修飾（Biosci. Biotechnol. Biochem., 61: 202-203, 1997），並將電勝任細胞貯存於-80°C中備用。進行DNA電轉形試驗時，於-80°C冰箱中取出電勝任細胞進行解凍。將0.5 μg載體DNA與100 μL 15% PEG 6000（Sigma-Aldrich, USA）溶液加入100 μL電勝任細胞並緩和混合均勻後，置入預冷之電極管（electroporation cuvette）（Bio-Rad, USA）中，於冰浴中靜置5分鐘。接著利用微型電轉儀 （MicroPulser Electroporator）（Bio-Rad, USA）於特定之電阻、電容及電場強度下進行電轉形。將轉形後之菌液加入1 mL MT培養基中，於37°C與180 rpm之條件下振盪培養1小時。取適量菌液塗抹於含適量新黴素之MT固體培養基上。於37°C下培養24小時，觀察菌落生長情形。
3.2.
含不同複製區域之穿梭載體轉形至
Br. choshinensis
HPD52
株
本申請案中主要探討4種穿梭載體pERB-1~pERB-4（圖2）於
Br. choshinensisHPD52中之適用性；該些載體中分別帶有pBC1、pC194、pLP31-8及pTZ12等革蘭氏陽性菌質體之複製區域。另為避免因勝任細胞製備不當或轉形條件不適所造成之試驗結果誤判情形，亦以習知帶有pUB110複製區域之
Br. choshinensis表現載體pNCMO2作為轉形之正控制組。
Br. choshinensisHPD52電勝任細胞之製備係依照Okamoto等人所述之方法進行修飾。將電勝任細胞與不同之載體進行混合後，於200 Ω、25 μF及7.5 kV/cm之條件下進行電轉形。結果顯示，利用pNCMO2、pERB-1、pERB-2及pERB-3進行電轉形所獲得之轉形效率分別為1.9 × 10
3、4.9 × 10
2、8.8 × 10
1及3.5 × 10
1transformants/μg DNA；pEBR-4則無法轉形至
Br. choshinensisHPD52。有關各載體資訊與轉形效率彙整於表3。
表 3 、不同穿梭載體於 Br. choshinensis HPD52 之電轉形效率
a複製子（replicon）為包含複製起始點與所有與複製有關的元件
bATRI，財團法人農業科技研究院
cRCR，滾環複製
| 載體 | 大小 (bp) | 來源 | 複製子 a | 在橋石短芽孢桿菌中的複製方式 | 抗生素篩選 (μg/mL) | 轉形效率 ( 轉形株 /μg DNA) | ||
| 大腸桿菌 | 橋石短芽孢桿菌 | 大腸桿菌 | 橋石短芽孢桿菌 | |||||
| pCMMO2 | 5,225 | TaKaRa | pBR322 | pUB110 | RCR c | Ap (100) | Nm (50) | 1.9 × 10 3 |
| pEBR-1 | 4,766 | ATRI b | pBR322 | pBC1 | RCR | Cm (25) | Nm (10) | 4.9 × 10 2 |
| pEBR-2 | 4,865 | ATRI | pBR322 | pC194 | RCR | Cm (25) | Nm (10) | 8.8 × 10 1 |
| pEBR-3 | 5,236 | ATRI | pBR322 | pLP31-8 | RCR | Cm (25) | Nm (10) | 3.5 × 10 1 |
| pEBR-4 | 5,204 | ATRI | pBR322 | pTZ12 | RCR | Cm (25) | Nm (10) | 0 |
為驗證
Br. choshinensisHPD52轉形株中確實帶有上述轉形成功之載體，進一步抽取轉形株中之載體，並以
SalI限制酶進行剪切確認。結果顯示 （圖3），pNCMO2、pERB-1、pERB-2及pERB-3的確可存在於
Br. choshinensisHPD52中，且載體之分子量大小皆符合預期，未於轉形後發生刪除（deletion）或重組（rearrangement）之現象。
由於pERB-1、pERB-2與pERB-3可轉形至
Br. choshinensisHPD52，將可作為適用於
Br. choshinensisHPD52之基因操作工具。而因pERB-1之電轉形效率高於pERB-2與pERB-3，故選用pERB-1穿梭載體進行後續表現載體之建構。
實施例
4
：不同表現訊號之表現效率
為使表現訊號之選擇更加多元化，於本申請案中，利用
Br. choshinensisHPD52全基因體定序資料開發新型表現訊號。
根據NCBI所揭露之
Br. choshinensisHPD52之全基因體序列，搜尋出19個可能帶有表現訊號之DNA片段；有關各表現訊號之簡示圖如圖4。針對這些DNA片段設計特異性引子，並利用PCR反應進行DNA片段之增幅。另以帶有P2與P5啟動子之pNCM02與pNY326作為模板，利用特異性引子增幅P2
pNCMO2與 P5
pNY326表現訊號。將不同之表現訊號嵌入pEBR-1-GFP中，共建構成21種綠螢光蛋白質表現載體。將該些表現載體分別轉形至
E. coliECOS
TM9-5、
Br. choshinensisHPD52及
B. subtilisDB430中。利用綠螢光蛋白質基因作為報導基因，探討各表現訊號於不同宿主中之表現效率。
4.1.
不同表現訊號之增幅與綠螢光蛋白質表現載體之建構
4.1.1.
表現訊號之增幅
以pNY326與pNCM02作為模板，利用特異性引子（表4） 搭配GDP-HiFi DNA聚合酶增幅P2
pNCMO2與P5
pNY326表現訊號。另根據美國國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）所揭露之
Br. choshinensisHPD52之全基因體序列（GenBank: LJJB01000010.1)，搜尋可能為表現訊號之DNA片段，進行特異性引子之設計。以
Br. choshinensisHPD52基因體DNA為模板，利用特異性引子（表4）搭配GDP-HiFi DNA聚合酶進行表現訊號P01
HPD52～P19
HPD52之增幅。以PCR Clean Up Kit進行PCR產物之回收。
表 4 、增幅表現訊號所用之引子
a粗體處為限制酶辨識切位：GAATTC（
EcoRI），CATATG（
NdeI）
| SEQ ID NO ： | 名稱 | 序列 （ 從 5’ 端到 3’ 端 ） a | |
| 27 | P2 pNCOM2F | GATATA GAATTCAAGGCGCCGCAACTTTTG | |
| 28 | P2 pNCOM2R | CAATAT CATATGCTTGTGTTCTCCTCCTCTAGTATAAACAAAT | |
| 29 | P5 pNY326F | GATATA GAATTCCAGGGGAATATACTAGAGATTTTTAACACA | |
| 30 | P5 pNY326R | CAATAT CATATGCTTGTGTTCTCCTCCTCTAGTATAAACAAA | |
| 31 | P01F | GATATA GAATTCCGACTCTGGCTGGGGAATAGTC | |
| 32 | P01R | CTGCAG CATATGCATTAACTCCTTTATTCATTATCCTGATCTT | |
| 33 | P02F | GATATA GAATTCGGGTCAGACCCTTGCATTTTG | |
| 34 | P02R | CTGCAG CATATGGATCTACTCCTTCATCATGCCGC | |
| 35 | P03F | GATATA GAATTCAAAAGAGAACAACGCTAGTGAACCA | |
| 36 | P03R | CTGCAG CATATGAAGTTCCTCCTAAATCGCTTTGATACA | |
| 37 | P04F | GATATA GAATTCGCCCAACAAGTACATGAACTACCTG | |
| 38 | P04R | CTGCAG CATATGAGTAATACCCCTCTTTCGTAACAGGG | |
| 39 | P05F | GATATA GAATTCATCTGTAAGTCACATGTACAAAAAGTCAGTC | |
| 40 | P05R | CTGCAG CATATGTCCACCTCCTTTACTTCCAACTCA | |
| 41 | P06F | GATATA GAATTCGTTGCTCAAAAGCTAGCGAATCA | |
| 42 | P06R | CTGCAG CATATGTCTTCCCTCCCTCCGCTAAA | |
| 43 | P07F | GATATA GAATTCATCATCAATGTTTTATCGTTGGCTG | |
| 44 | P07R | CTGCAG CATATGGGTCACCTCCGGATGATTTTACA | |
| 45 | P08F | GATATA GAATTCGGTTGAACCGTCAGCGCAT | |
| 46 | P08R | CTGCAG CATATGTGTAGCTCCTCTCATAACCAACTATACG | |
| 47 | P09F | GATATA GAATTCGATGTTTGGTTATTCTACAGTTCTTCGTT | |
| 48 | P09R | CTGCAG CATATGAAAAAGCCTCCTTATAATAAGGGTATATGTG | |
| 49 | P10F | GATATA GAATTCATCTCATGATTGCCGCGATCT | |
| 50 | P10R | CTGCAG CATATGTGTATACACCTCCGAAGTCTTGTACCT | |
| 51 | P11F | GATATA GAATTCGATGCGCAGGTGAAAAAGGTAG | |
| 52 | P11R | CTGCAG CATATGCAATCCTCCTACACTTCAACTGGC | |
| 53 | P12F | GATATA GAATTCGCTGGAGCTCGGAGCAGG | |
| 54 | P12R | CTGCAG CATATGGATTCTTTTCTCCTTTCTGTACGTACTTC | |
| 55 | P13F | GATATA GAATTCGGCGGTGGGGGCTGC | |
| 56 | P13R | CTGCAG CATATGTGTATACACCTCCGAAGTCTTGTACCT | |
| 57 | P14F | GATATA GAATTCCGGGTGGAAATGGTTGAGC | |
| 58 | P14R | CTGCAG CATATGAACCCCTCCAACGATGTCAATAT | |
| 59 | P15F | GATATA GAATTCATCTTCCTCTGGTCGAAGAAGTAGTTC | |
| 60 | P15R | CTGCAG CATATGAGTGACCACCTTTCTACAGAAGCACT | |
| 61 | P16F | GATATA GAATTCCGTTGCTTTGCTTCTTTAAGGG | |
| 62 | P16R | CTGCAG CATATGGGACCTCCTCATTTGGGATTGT | |
| 63 | P17F | GATATA GAATTCATCGTGCGCCGAATTGTCA | |
| 64 | P17R | CTGCAG CATATGTTCACCTCTCCATAATTTCTGTTACTCG | |
| 65 | P18F | GATATA GAATTCCATCCCGAAGTCCGCTTGG | |
| 66 | P18R | CTGCAG CATATGATTCTCCTCCAATTACCCCTTCTC | |
| 67 | P19F | GATATA GAATTCCGCCTCGCTGACGGCG | |
| 68 | P19R | CTGCAG CATATGCATTCCCTCCATTACTTTTAAGTAGCC | |
4.1.2.
綠螢光蛋白質表現載體之建構
pBRLP-8-P23-GFPT（陳等人, 台灣農業化學與食品科學, 54：236-246, 2016）以
NdeI與
XbaI剪切後，利用Plus Gel Eluted Kit回收含有突變綠螢光蛋白質基因、
E. coli噬菌體Lambda
t0terminator 及
E. coli rrnBT1 terminator之DNA片段。將回收之DNA片段以YB Rapid Ligation Kit接入以相同限制酶剪切之pEBR-1中，並轉形至
E. coliECOS
TM9-5。利用GFPF（SEQ ID NO：146）/GFPR（SEQ ID NO：147）引子組合進行菌落聚合酶連鎖反應，以挑選可能帶有外插DNA之轉形株。抽取轉形株中之質體並進行DNA定序。將帶有突變綠螢光蛋白質基因、
E. coli噬菌體Lambda
t0terminator 及
E. coli rrnBT1 terminator之pEBR-1命名為pEBR-1-GFP。
將4.1.1所述之表現訊號DNA片段以
EcoRI與
NdeI剪切後，利用PCR Clean Up Kit進行回收。將回收之DNA片段以YB Rapid Ligation Kit接入以相同限制酶剪切之pEBR-1-GFP中，並轉形至
E. coliECOS
TM9-5。利用合適之特異性引子組合進行菌落聚合酶連鎖反應，以挑選可能帶有外插DNA之轉形株。抽取轉形株中之質體並進行DNA定序。將帶有P2
pNCMO2與P5
pNY326表現訊號之綠螢光蛋白質表現載體分別命名為pEBR-1-P2
pNCMO2-GFP與pEBR-1-P5
pNY326-GFP。將帶有不同
Br. choshinensisHPD52表現訊號之綠螢光蛋白質表現載體依序命名為pEBR-1-P01
HPD52-GFP～pEBR-1-P19
HPD52-GFP。
4.2.
比較不同表現訊號於
E. coli
ECOS
TM9-5
中之表現效率
將綠螢光蛋白質表現載體轉形至
E. coli宿主後，先由轉形株之菌落顏色初步判斷綠螢光蛋白質之表現情形。結果顯示（圖5），
E. coli（pEBR-1-P07
HPD52-GFP）菌落呈現綠色之情形最為明顯。進一步將轉形株培養於LB液體培養基中，並於特定培養時間點收集菌體進行螢光強度（fluorescence intensity）分析。有關各轉形株之生長情形與菌體螢光強度之測定結果如圖6。將
E. coli轉形株培養24小時後之螢光強度分析結果彙整於圖7。結果顯示，P01
HPD52、P05
HPD52、P06
HPD52、P07
HPD52、P08
HPD52及P12
HPD52於
E. coli中之表現效率較佳，菌體螢光強度均高於5,000；其中又以P07
HPD52之表現效率最高，菌體螢光強度高達36,514，此與菌落顏色之觀察結果相符。
4.3.
比較不同表現訊號於
Br. choshinensis
HPD52
中之表現效率
將綠螢光蛋白質表現載體以電轉形之方式導入
Br. choshinensisHPD52宿主。亦先由轉形株之菌落顏色初步判斷綠螢光蛋白質之表現情形。結果顯示（圖8），
Br. choshinensisHPD52（pEBR-1-P2
pNCMO2-GFP）、
Br. choshinensisHPD52（pEBR-1-P5
pNY326-GFP）及
Br. choshinensisHPD52（pEBR-1-P06
HPD52-GFP）等轉形株之菌落呈現綠色較為明顯。進一步將轉形株培養於MT液體培養基中，並於特定培養時間點收集菌體進行螢光強度分析。有關各轉形株之生長情形與菌體螢光強度之測定結果如圖9。將
Br. choshinensisHPD52轉形株培養48小時後之螢光強度分析結果彙整於圖10。結果顯示，除P12
HPD52與P18
HPD52訊號較低落，其他組別皆有明顯的訊號，皆可作為建構表現系統之選擇。
其中，P2
pNCMO2、P5
pNY326、P06
HPD52、P07
HPD52及P10
HPD52於
Br. choshinensisHPD52中之表現效率較高，菌體螢光強度均高於50,000。因P06
HPD52之表現效率最高，故後續本申請案中改造表現載體的實施例，皆使用P06
HPD52作為表現訊號，其僅為示例之一，不得對於本申請案有所限制。
有關表現訊號於
Br. choshinensisHPD52中之表現效率依序為P2
pNCMO2＞P5
pNY326＞P06
HPD52＞P10
HPD52＞P07
HPD52＞P13
HPD52＞P16
HPD52＞P09
HPD52＞P05
HPD52＞P11
HPD52＞P01
HPD52＞P08
HPD52＞P03
HPD52＞P14
HPD52＞P19
HPD52＞P02
HPD52＞P04
HPD52＞P15
HPD52＞P17
HPD52＞P12
HPD52＞P18
HPD52。
結果說明，除P12
HPD52與P18
HPD52於
Br. choshinensisHPD52中之表現效率極低外，其他表現訊號皆可做為建構
Br. choshinensisHPD52表現系統之選擇，而效率較低之表現訊號即可用於表現會毒害細胞之蛋白質或進行代謝工程（metabolic engineering）之用。
值得注意的是，P06
HPD52之表現效率較習知載體P2
pNCMO2低1.5倍，但與P5
pNY326相近，其可作為建構
Br. choshinensisHPD52表現系統之選擇。
4.4.
比較不同表現訊號於
B. subtilis
DB430
中之表現效率
將帶有表現訊號之表現載體以電轉形之方式導入另一宿主
B. subtilisDB430中，並於特定培養時間點收集菌體進行螢光強度分析。有關各轉形株之生長情形與菌體螢光強度之測定結果如圖15。將
B. subtilisDB430轉形株培養48小時後之螢光強度分析結果彙整於圖16。結果顯示，P2
pNCMO2、P5
pNY326、P01
HPD52、P02
HPD52、P05
HPD52、P06
HPD52、P07
HPD52及P17
HPD52於
B. subtilisDB430中之表現效率較佳，菌體螢光強度均高於50,000。
結果說明，本申請案所使用之穿梭載體不僅可於
E. coli與
Br. choshinensis表現，另一宿主
B. subtilis也可作為一種選擇。
實施例
5
：表現訊號之改造並應用於誘導型表現系統之建立
實施例4所使用之表現訊號在進行重組蛋白質生產時，不須進行誘導步驟、可節省誘導劑成本及簡化發酵製程。但大量表現某些重組蛋白質可能會影響細菌之生長，甚至造成死亡，亦可能發生質體不穩定之現象。為避免上述之問題，可使用調控嚴謹之誘導型表現訊號進行重組蛋白質之生產。本申請案中亦嘗試改造P06
HPD52表現訊號成為誘導型表現訊號，以建構誘導型表現系統。
5.1.
表現訊號之改造
5.1.1. 將P06
HPD52 表現訊號改造為誘導型表現訊號
設計14條引子（表5），利用重疊延展聚合酶連鎖反應（overlap extension polymerase chain reaction, OEPCR）將
E. coli操縱子
lacO或
SacI-
lacO之序列嵌入P06
HPD52表現訊號中之不同位置，或進一步刪除特定序列，改造P06
HPD52成為誘導型表現訊號。共建構出P06
HPD52/
lacO-1～P06
HPD52/
lacO-7等7個誘導型表現訊號（圖11）。
表 5 、改造 P06
HPD52 表現訊號為誘導型表現訊號所用之引子
a粗體處為限制酶辨識切位：GAGCTC（
SacI）
| SEQ ID NO ： | 名稱 | 序列 （ 從 5’ 端到 3’ 端 ） a |
| 76 | P06LACO1F | AATTGTGAGCGGATAACAATTAGTCTGTTCGTACGTTCGATTCAGG |
| 77 | p06lacO1r | CAGACTAATTGTTATCCGCTCACAATTGTCACACTTCATTATAGGATAGTTGACTAAAGA |
| 78 | p06SacIlacO2f | GAGCTCAATTGTGAGCGGATAACAATTGTTCGTACGTTCGATTCAGGCG |
| 79 | p06SacIlacO2r | AATTGTTATCCGCTCACAATT GAGCTCAGACTGTCACACTTCATTATAGGATAGTTGA |
| 80 | p06SacIlacO3f | GAGCTCAATTGTGAGCGGATAACAATTGTGACAGTCTGTTCGTACGTTCGA |
| 81 | p06SacIlacO3r | AATTGTTATCCGCTCACAATT GAGCTCACTTCATTATAGGATAGTTGACTAAAGAAGGTC |
| 82 | p06SacIlacO4f | GAGCTCAATTGTGAGCGGATAACAATTAGTCTGTTCGTACGTTCGAATCAGG |
| 83 | p06SacIlacO4r | AATTGTTATCCGCTCACAATT GAGCTCGTCACACTTCATTATAGGATAGTTGACTAAAGA |
| 84 | p06SacIlacO5f | GAGCTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTACGTTCGATTCAGGCGTCC |
| 85 | p06SacIlacO5r | AATTGTTATCCGCTCACAATT GAGCTCCGAACAGACTGTCACACTTCATTATAGG |
| 86 | p06SacIlacO6f | GAGCTCAATTGTGAGCGGATAACAATTGCGGAGGGAGGGAAGACAA |
| 87 | p06SacIlacO6r | AATTGTTATCCGCTCACAATT GAGCTCAGACTGTCACACTTCATTATAGGATAGTTGAC |
| 88 | p06SacIlacO7f | GCGGAGGGAGGGAAGACATAT |
| 89 | p06SacIlacO7r | ATATGTCTTCCCTCCCTCCGCAGACTGTCACAATTGTTATCCGCTC |
5.1.2. P06
HPD52/
lacO-1
～
P06
HPD52/
lacO-7
之增幅
以pEBR-1-P06
HPD52-GFP作為模板，利用2組引子組合包括P06F（SEQ ID NO：41）/P06LACO1R（SEQ ID NO：77）與P06LACO1F（SEQ ID NO：76）/P06R（SEQ ID NO：42）；P06F（SEQ ID NO：41）/P06SACILACO2R（SEQ ID NO：79）與P06SACILACO2F（SEQ ID NO：78）/P06R（SEQ ID NO：42）；P06F（SEQ ID NO：41）/P06SACILACO3R（SEQ ID NO：81）與P06SACILACO3F（SEQ ID NO：80）/P06R（SEQ ID NO：42）；P06F（SEQ ID NO：41）/P06SACILACO4R（SEQ ID NO：83）與P06SACILACO4F（SEQ ID NO：82）/P06R（SEQ ID NO：42）；P06F（SEQ ID NO：41）/P06SACILACO5R（SEQ ID NO：85）與P06SACILACO5F（SEQ ID NO：84）/P06R（SEQ ID NO：42）；P06F（SEQ ID NO：41）/P06SACILACO6R（SEQ ID NO：87）與P06SACILACO6F（SEQ ID NO：86）/P06R（SEQ ID NO：42）；P06F（SEQ ID NO：41）/P06SACILACO7R（SEQ ID NO：89）與P06SACILACO7F（SEQ ID NO：88）/P06R（SEQ ID NO：42）搭配GDP-HiFi DNA聚合酶進行PCR反應。PCR產物以Plus Gel Eluted Kit進行回收。接著以回收後之2個PCR產物作為模板，利用P06F（SEQ ID NO：41)/P06R（SEQ ID NO：42）引子組合搭配GDP-HiFi DNA聚合酶進行PCR反應。經此步驟後，即可獲得P06
HPD52/
lacO-1～P06
HPD52/
lacO-7表現訊號（表6）。利用Plus Gel Eluted Kit進行PCR產物之回收。
表 6 ： P06HPD52/lacO-1 ～ P06HPD52/lacO-7 表現訊號
| SEQ ID NO ： | 名稱 | 序列 （ 從 5’ 端到 3’ 端 ） |
| 69 | P06 HPD52/ lacO-1 | GAATTCGTTGCTCAAAAGCTAGCGAATCAGCTGGGACTGAAAGGTTTCCGCCTGATCAACAACTGCGGCAAAGAAGGTGGACAGGAAGTTTTCCACATTCATTATCATCTTCTTGCAGGCTTTCAGGAAGAAAAATGAACTAAAGGTTGACCTTCTTTAGTCAACTATCCTATAATGAAGTGTGACAATTGTGAGCGGATAACAATTAGTCTGTTCGTACGTTCGATTCAGGCGTCCCACGGTTTTAGCGGAGGGAGGGAAGACATATG |
| 70 | P06 HPD52/ lacO-2 | GAATTCGTTGCTCAAAAGCTAGCGAATCAGCTGGGACTGAAAGGTTTCCGCCTGATCAACAACTGCGGCAAAGAAGGTGGACAGGAAGTTTTCCACATTCATTATCATCTTCTTGCAGGCTTTCAGGAAGAAAAATGAACTAAAGGTTGACCTTCTTTAGTCAACTATCCTATAATGAAGTGTGACAGTCTGAGCTCAATTGTGAGCGGATAACAATTGTTCGTACGTTCGATTCAGGCGTCCCACGGTTTTAGCGGAGGGAGGGAAGACATATG |
| 71 | P06 HPD52/ lacO-3 | GAATTCGTTGCTCAAAAGCTAGCGAATCAGCTGGGACTGAAAGGTTTCCGCCTGATCAACAACTGCGGCAAAGAAGGTGGACAGGAAGTTTTCCACATTCATTATCATCTTCTTGCAGGCTTTCAGGAAGAAAAATGAACTAAAGGTTGACCTTCTTTAGTCAACTATCCTATAATGAAGTGAGCTCAATTGTGAGCGGATAACAATTGTGACAGTCTGTTCGTACGTTCGATTCAGGCGTCCCACGGTTTTAGCGGAGGGAGGGAAGACATATG |
| 72 | P06 HPD52/ lacO-4 | GAATTCGTTGCTCAAAAGCTAGCGAATCAGCTGGGACTGAAAGGTTTCCGCCTGATCAACAACTGCGGCAAAGAAGGTGGACAGGAAGTTTTCCACATTCATTATCATCTTCTTGCAGGCTTTCAGGAAGAAAAATGAACTAAAGGTTGACCTTCTTTAGTCAACTATCCTATAATGAAGTGTGACGAGCTCAATTGTGAGCGGATAACAATTAGTCTGTTCGTACGTTCGATTCAGGCGTCCCACGGTTTTAGCGGAGGGAGGGAAGACATATG |
| 73 | P06 HPD52/ lacO-5 | GAATTCGTTGCTCAAAAGCTAGCGAATCAGCTGGGACTGAAAGGTTTCCGCCTGATCAACAACTGCGGCAAAGAAGGTGGACAGGAAGTTTTCCACATTCATTATCATCTTCTTGCAGGCTTTCAGGAAGAAAAATGAACTAAAGGTTGACCTTCTTTAGTCAACTATCCTATAATGAAGTGTGACAGTCTGTTCGGAGCTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTACGTTCGATTCAGGCGTCCCACGGTTTTAGCGGAGGGAGGGAAGACATATG |
| 74 | P06 HPD52/ lacO-6 | GAATTCGTTGCTCAAAAGCTAGCGAATCAGCTGGGACTGAAAGGTTTCCGCCTGATCAACAACTGCGGCAAAGAAGGTGGACAGGAAGTTTTCCACATTCATTATCATCTTCTTGCAGGCTTTCAGGAAGAAAAATGAACTAAAGGTTGACCTTCTTTAGTCAACTATCCTATAATGAAGTGTGACAGTCTGAGCTCAATTGTGAGCGGATAACAATTGCGGAGGGAGGGAAGACATATG |
| 75 | P06 HPD52/ lacO-7 | GAATTCGTTGCTCAAAAGCTAGCGAATCAGCTGGGACTGAAAGGTTTCCGCCTGATCAACAACTGCGGCAAAGAAGGTGGACAGGAAGTTTTCCACATTCATTATCATCTTCTTGCAGGCTTTCAGGAAGAAAAATGAACTAAAGGTTGACCTTCTTTAGTCAACTATCCTATAATGAAGTGAGCTCAATTGTGAGCGGATAACAATTGTGACAGTCTGCGGAGGGAGGGAAGACATATG |
5.1.3.
建構誘導型表現載體
將改造之誘導型表現訊號P06
HPD52/
lacO-1～P06
HPD52/
lacO-7以
EcoRI與
NdeI剪切後，利用PCR Clean Up Kit進行回收。以YB Rapid Ligation Kit將回收後之DNA片段接入以相同限制酶剪切後之pEBR-1-GFP中，並轉形至
E. coliECOS
TM9-5。利用P06F（SEQ ID NO：41）/P06R（SEQ ID NO：42）引子組合進行菌落聚合酶連鎖反應，以挑選可能帶有外插DNA之轉形株。抽取轉形株中之質體並進行定序。將帶有改造表現訊號之綠螢光蛋白質表現載體分別命名為pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-GFP～pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-7-GFP。
5.2.
為表現載體加入乳糖壓抑子基因
5.2.1.
乳糖壓抑子基因之突變
由於
lacI中帶有基因選殖常用之
NdeI切位。為避免影響後續基因選殖，利用OEPCR針對該切位進行定點突變。首先設計LACIF（SEQ ID NO：148）、LACIM1（SEQ ID NO：149）、LACIM2（SEQ ID NO：150）及LACIR（SEQ ID NO：151）等4條引子，其中LACIF與LACIR為增幅引子；LACIM1與LACIM2則為突變引子。突變過程中，以pMUTIN-GFP+作為模板，分別以LACIF/LACIM2與LACIM1/LACIR引子組合搭配Q5 High-Fidelity DNA聚合酶進行PCR反應。PCR產物以Plus Gel Eluted Kit回收。接著以回收後之2個PCR產物作為模板，利用LACIF/LACIR引子組合搭配Q5 High-Fidelity DNA聚合酶進行PCR反應。經此步驟後，即可獲得全長之定點突變
lacIM。利用Plus Gel Eluted Kit進行PCR產物以回收。
5.2.2.
建構帶有壓抑子基因之表現載體
將定點突變之
lacIM以
XbaI與
XhoI剪切後，利用PCR Clean Up Kit進行回收。接著利用YB Rapid Ligation Kit將回收後之DNA片段接入以相同限制酶剪切之pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-GFP中，並轉形至
E. coliECOS
TM9-5。利用LACIF（SEQ ID NO：148）/LACIR（SEQ ID NO：151）引子組合進行菌落聚合酶連鎖反應，以挑選可能帶有外插DNA之轉形株。抽取轉形株之質體並進行定序。將帶有
lacIM之綠螢光蛋白質表現載體命名為pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-
lacIM-GFP。
5.3.
探討
P06
HPD52
誘導型表現訊號於之表現效率
將pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-GFP～pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-7-GFP等表現載體以電轉形之方式導入
Br. choshinensisHPD52宿主後，先觀察轉形株之菌落顏色。結果顯示（圖12），轉形株之菌落呈現蘋果綠或黃綠色，代表
Br. choshinensisHPD52無法產生LacI壓抑子（repressor）或類似之調控蛋白質 （regulatory protein）進行基因表現調控。
進一步將轉形株培養於MT液體培養基中，並於特定培養時間點下收集菌體進行螢光強度分析。有關各轉形株之生長情形與菌體螢光強度之測定結果如圖13。將
Br. choshinensisHPD52轉形株培養48小時後之螢光強度分析結果彙整於圖14。結果顯示，將
lacO或
SacI-
lacO嵌入P06
HPD52中，會造成表現效率顯著下降，且會因嵌入位置而有不同程度之影響。P06
HPD52/
lacO-1～P06
HPD52/
lacO-5於宿主中皆有訊號，且以P06
HPD52/
lacO-3之表現效率最高，菌體螢光強度可達47,790。
進一步將P06
HPD52/
lacO-2與P06
HPD52/
lacO-3之特定序列進行刪除，成為P06
HPD52/
lacO-6與P06
HPD52/
lacO-7，發現有提高表現效率之效果；其中P06
HPD52/
lacO-6之表現效率較P06
HPD52/
lacO-2高2.2倍，P06
HPD52/
lacO-7之表現效率較P06
HPD52/
lacO-3高2.3倍。
綜上所述，本申請案中所使用之表現訊號P06
HPD52/
lacO-1~P06
HPD52/
lacO-7於宿主中皆有訊號，並以P06
HPD52/
lacO-7之表現效率最佳，菌體螢光強度可達111,286；此表現效率已趨近於P2
pNCMO2，具有作為強力表現訊號之潛力。
同樣地，將pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-GFP～pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-7-GFP等表現載體以電轉形之方式導入另一宿主
B. subtilisDB430中，觀察各轉形株之生長情形與菌體螢光強度，測定結果如圖17。將
B. subtilisDB430轉形株培養48小時後之螢光強度分析結果彙整於圖18，結果顯示，P06
HPD52/
lacO-1～P06
HPD52/
lacO-7於宿主中皆有訊號，且以P06
HPD52/
lacO-7之表現效率最高，該結果與在
Br. choshinensisHPD52宿主中相同。
5.4.
探討帶有抑制子基因之表現載體之表現效率
由於
Br. choshinensisHPD52無法表現LacI壓抑子，為達基因表現調控之目的，將帶有抑制子基因之表現載體pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-
lacIM-GFP，利用電轉形方式將表現載體導入
Br. choshinensisHPD52宿主中，並將轉形株接種於MT液體培養基中。利用不同誘導劑包括IPTG與乳糖進行綠螢光蛋白質之誘導表現。結果顯示（表7），IPTG為有效之誘導劑，而乳糖則否。當添加1 mM IPTG作為誘導劑時，培養48小時後之菌體螢光強度為48843.6，較未添加誘導劑時之螢光強度為7312.2，提升6.7倍。上述之結果顯示，利用帶有
lacO之表現訊號搭配LacI抑制子基因可成功建構
Br. choshinensisHPD52誘導型表現系統。
表 7 、不同誘導劑對 P06
HPD52/
lacO-3-
lacIM 誘導型表現訊號於 Br. choshinensis HPD52 中表現效率之影響
| 誘導劑 | 螢光 /OD 600 | ||
| 24 小時 | 48 小時 | 72 小時 | |
| － | 5,374.6 ± 1,165.8 | 7,312.2 ± 477.2 | 6,945.2 ± 1,183.6 |
| 1 mM IPTG | 42,356.3 ± 1,555.6 | 48,843.6 ± 1,126.4 | 46,711.5 ± 1,996.9 |
| 1 mM lactose | 5,740.2 ± 415.6 | 7,984.3 ± 1,515.6 | 6,530.9 ± 3,033.0 |
| 10 mM lactose | 5,820.6 ± 390.0 | 8,280.8 ± 1,951.5 | 8,076.9 ± 1,795.1 |
實施例
6
：不同酵素基因作為報導基因
6.1.
不同酵素表現載體之建構、轉形及平板培養基活性分析
方法
6.1.1.
纖維素酶基因
bglC
pJET1.2-BSBglC以
NdeI與
SalI剪切後，利用Plus Gel Eluted Kit回收纖維素酶基因
bglC。接著利用YB Rapid Ligation Kit將回收後之DNA片段接入以相同限制酶剪切之pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-GFP中，並轉形至
E. coliECOS
TM9-5。利用BGLCF（SEQ ID NO：152）/BGLCR（SEQ ID NO：153）引子組合進行菌落聚合酶連鎖反應，以挑選可能帶有外插DNA之轉形株。抽取轉形株之質體並進行定序。將序列正確之載體命名為pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-BSBglC。利用電轉形法將此載體導入
Br. choshinensisHPD52中。待菌落長成後，以滅菌牙籤沾取選定之菌落並點至含有0.1% （w/v） AZCL-HE-纖維素 （Megazyme, USA）與適量新黴素之MT固體培養基，於37°C下培養48小時。AZCL-HE-纖維素為不可溶性之多醣受質，若菌落具有分泌纖維素酶之能力，會水解固體培養基中之AZCL-HE-纖維素，並釋出水溶性之藍色染劑，因此可於菌落周圍形成藍色暈環。
6.1.2. α-
澱粉酶基因
amyL
與
amyS
pJET1.2-BLAmyL與pJET1.2-GSAmyS 分別以
NdeI與
XhoI剪切後，利用Plus Gel Eluted Kit回收α-澱粉酶基因。利用YB Rapid Ligation Kit將回收後之DNA片段分別接入以
NdeI與
SalI剪切後之pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-GFP中，並轉形至
E. coliECOS
TM9-5。分別利用BLAMYF（SEQ ID NO：154）/BLAMYR（SEQ ID NO：155）與GSAMYF1（SEQ ID NO：156）/GSAMYR1（SEQ ID NO：157）引子組合進行菌落聚合酶連鎖反應，以挑選可能帶有外插DNA之轉形株。抽取轉形株之質體並進行定序。將帶有
B. lichenifromisα-澱粉酶基因
amyL之表現載體命名為pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-BLAmyL；將帶有
G. stearothermophilusα-澱粉酶基因
amyS之表現載體命名為pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-GSAmyS。利用電轉形法將上述α-澱粉酶表現載體分別導入
Br. choshinensisHPD52中。待菌落長成後，以滅菌牙籤沾取選定之菌落並點至含有1%（w/v）可溶性澱粉（soluble starch）與適量新黴素之MT固體培養基。於37°C下培養48小時後，利用滅菌去離子水洗去固體培養基上之菌落，並加入10 mL碘液（iodine solution）（BASO, Taiwan）。於100 rpm下作用15分鐘後，倒除碘液。接著以10 mL 1 M 氯化鈉進行脫色。若菌落具有分泌α-澱粉酶酶之能力，會水解固體培養基中之澱粉。碘液僅能與澱粉結合，而無法與澱粉水解產物結合；因此菌落周圍將呈現透明環（clear zone）。
6.2.
不同酵素基因作為報導基因
本實施例主要探討來自於
B. subtilisDB430之纖維素酶基因
bglC、
B. licheniformisBCRC 10494之α-澱粉酶基因
amyL及
G. stearothermophilusBCRC 10285之α-澱粉酶基因
amyS運用於
Br. choshinensisHPD52作為報導基因之可行性。本申請案共建構pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-BSBglC、pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-BLAmyL及pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-GSAmyS等3種酵素表現載體。
將酵素表現載體以電轉形之方式導入
Br. choshinensisHPD52宿主中，並以平板培養基活性分析法與蛋白質電泳觀察
Br. choshinensisHPD52生產酵素之情形。平板培養基活性分析之結果顯示（圖19），帶有酵素表現載體之轉形株具有生產
B. subtilisBglC（簡稱BSBglC）、
B. licheniformisAmyL（簡稱BLAmyL）及
G. stearothermophilusAmyS（簡稱GSAmyS）之能力。蛋白質電泳結果（圖20）更進一步驗證轉形株分泌表現酵素之情形。
上述之結果顯示，
bglC、
amyL及
amyS皆可作為
Br. choshinensisHPD52用之報導基因。
實施例
7
：不同訊息胜肽之適用性
7.1.
含有不同訊息胜肽
DNA
之
α-
澱粉酶表現載體之建構
7.1.1. pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-MCS
之建構
以pBRCM-MCS為模板，利用MCSF（SEQ ID NO：164）/MCSR（SEQ ID NO：165）引子組合搭配GDP-HiFi DNA聚合酶進行PCR反應。PCR產物以Plus Gel Eluted Kit進行回收。回收之PCR產物與P06
HPD52/
lacO-3-GFP分別以
NdeI與
SalI剪切後，利用Plus Gel Eluted Kit進行回收。利用YB Rapid Ligation Kit將回收後之DNA片段進行黏合，並轉形至
E. coliECOS
TM9-5。利用MCSF（SEQ ID NO：164）/MCSR（SEQ ID NO：165）引子組合進行菌落聚合酶連鎖反應，以挑選可能帶有外插DNA之轉形株。抽取轉形株之質體並進行定序。將序列正確之載體命名為pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-MCS。
7.1.2. α-
澱粉酶蛋白質基因之增幅、改造及表現載體之建構
G. stearothermophilusα-澱粉酶之N端帶有訊息胜肽，係由34個胺酸所組成。本申請案針對
G. stearothermophilusα-澱粉酶蛋白質
amyS之熟成蛋白質，即不帶有訊息胜肽之胺基酸部分的DNA序列進行增幅，另亦對基因中之
BamHI與
SalI進行定點突變。
首先設計GSAMYSF2（SEQ ID NO：158）、GSAMYSM1（SEQ ID NO：159）、GSAMYSM2（SEQ ID NO：160）、GSAMYSM3（SEQ ID NO：161）、GSAMYSM4（SEQ ID NO：162）及GSAMYSR2（SEQ ID NO：163）等6條引子，其中GSAMYSF2與GSAMYSR2為增幅引子；GSAMYSM1、GSAMYSM2、GSAMYSM3及GSAMYSM4則為突變引子。突變過程中，以pJET1.2-GSAmyS作為模板，以GSAMYSF/GSAMYSM2、GSAMYSM1/GSAMYSM4及GSAMYSM3/GSAMYSR引子組合搭配Q5 High-Fidelity DNA聚合酶進行PCR反應。
PCR產物以Plus Gel Eluted Kit進行回收後，再以回收之3個PCR產物作為模板，利用GSAMYSF2與GSAMYSR2引子組合搭配Q5 High-Fidelity DNA聚合酶進行PCR反應，即可獲得定點突變熟成α-澱粉酶基因。
將PCR產物以Plus Gel Eluted Kit回收後，利用CloneJET PCR Cloning Kit進行基因之選殖，並將黏合產物轉形至
E. coliECOS
TM9-5。利用GSAMYSF2/GSAMYSR2引子組合進行菌落聚合酶連鎖反應，以挑選可能帶有外插DNA之轉形株。抽取轉形株中之質體並進行定序。將帶有定點突變熟成α-澱粉酶基因之載體命名為pJET1.2-GSAmySM。
pJET1.2-GSAmySM以
BamHI與
SalI剪切後，利用Plus Gel Eluted Kit回收定點突變熟成α-澱粉酶基因。利用YB Rapid Ligation Kit將回收後之DNA片段接入以相同限制酶剪切後之pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-MCS中。將黏合產物轉形至
E. coliECOS
TM9-5。利用GSAMYSF2/GSAMYSR2引子組合進行菌落聚合酶連鎖反應，以挑選可能帶有外插DNA之轉形株。抽取
E. coli轉形株之質體並進行定序。將序列正確之表現載體命名為pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-GSAmySM。
7.1.3.
訊息胜肽
DNA
之增幅與建構帶有不同訊息胜肽
DNA
之
α-
澱粉酶表現載體
根據訊息胜肽網（Signal Peptide website, http://www.signalpeptide.de/index.php）與NCBI中有關
Br. choshinensisHPD52蛋白質之資訊，共選擇13種分泌性蛋白質之訊息胜肽（表9）DNA進行特異性引子之設計（表8）。另亦針對pNCMO2中之改良訊息胜肽sec（R2L6）之DNA進行特異性引子之設計。
分別以
Br. choshinensisHPD52基因體DNA與pNCMO2作為模板，利用特異性引子（表8）搭配GDP-HiFi DNA聚合酶進行PCR反應。PCR產物以PCR Clean Up Kit進行回收後，再以
NdeI與
BamHI剪切。利用PCR Clean Up Kit進行剪切DNA之回收。再利用YB Rapid Ligation Kit將回收後之DNA片段接入以相同限制酶剪切後之pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-GSAmySM。
將黏合產物轉形至
E. coliECOS
TM9-5。利用特異性引子組合進行菌落聚合酶連鎖反應，以挑選可能帶有外插DNA之轉形株。抽取
E. coli轉形株之質體並進行定序。
將帶有sec訊息胜肽DNA之α-澱粉酶表現載體命名為pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-sec-GSAmySM；將帶有
Br. choshinensisHPD52分泌性蛋白質之訊息胜肽DNA之α-澱粉酶表現載體分別命名為pEBR-1-P06
PD52/
lacO-3-SP01-GSAmySM～pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP13-GSAmySM。
表 8 、增幅訊息胜肽 DNA 所用之引子
a粗體字為限制酶辨識切位：CATATG（
NdeI），GGATCC（
BamHI）；用於定點突變（site-directed mutagenesis）的突變鹼基以粗體斜體表示。
表 9 、本申請案中所使用之訊息胜肽
aD-分數, 區別分數。 該分數用於區分信號肽和非信號肽。
bMWP, middle wall protein, 中壁蛋白
| SEQ ID NO ： | 名稱 | 序列 （ 從 5’ 端 to 3’ 端 ） a |
| 104 | SECF | GATATA CATATGAAAAAAAGAAGGGTCGTTAACAG |
| 105 | SECR | CTGCAG GGATCCAGCGAAAGCCATGGGAGC |
| 106 | SP01F | GATATA CATATGTTGCCTAGATTCAAAGCGATCAC |
| 107 | SP01R | CTGCAG GGATCCTGCTGCTACAGGCAGACCTTG |
| 108 | SP02F | GATATA CATATGAAGCCTTGGCTCGTTCGCT |
| 109 | SP02R | CTGCAG GGATCCTGCGTGTGCTGAAAAAACAGG |
| 110 | SP03F | GATATA CATATGCAGGACTATATGCGACAATTGGG |
| 111 | SP03R | CTGCAG GGATCCTGCATCTGCCTGCTGAACG |
| 112 | SP04F | GATATA CATATGAAAAGAGCACTAGCCATATTTTTATCG |
| 113 | SP04R | CTGCAG GGATCCGGCACTCACAAAGGGAACGA |
| 114 | SP05F | GATATA CAT ATG CAAAAACTATTACGGACCCTTTCTTG |
| 115 | SP05R | CTGCAG GGATCCCGCTGAGGAAAAACCGGG |
| 116 | SP06F | GATATA CATATGAAAAAGCCATATCAACAATTTCGTCG |
| 117 | SP06R | CTGCAG GGATCCCGCAAACGCAGGAACCG |
| 118 | SP07F | GATATA CATATGCGCCGTGGCGCGTTATA |
| 119 | SP07R | CTGCAG GGATCCCGCCCAAGCAGGCAGG |
| 120 | SP08F | GATATA CAT ATG CCGAACAAGAGGCTCTTCCTTT |
| 121 | SP08R | CTGCAG GGATCCTCCAGACACATTCCCCATGATT |
| 122 | SP09F | GATATA CATATGAAAAAATGGAACAAGGCTGCTTT |
| 123 | SP09R | CTGCAG GGATCCCGCATAAGCAGATGTTGGTCCG |
| 124 | SP10F | GATATA CATATGAAAAAGAAACTGCCAATGACATTGC |
| 125 | SP10R | CTGCAG GGATCCAGCATTTGAACCGCAACCG |
| 126 | SP11F | GATATA CATATGAAGAAAGGAAGGGGCTTACATATTG |
| 127 | SP11R | CTGCAG GGATCCAGCTGGTGCCGAACAAGCTG |
| 128 | SP12F | GATATA CATATGAAAAAGACGGGAATTTTGCTTAGC |
| 129 | SP12R | CTGCAG GGATCCAGCCTCTTGTTTCCCGCCG |
| 130 | SP13F | GATATA CATATGAAAAAAGCACGTCGCATTACCA |
| 131 | SP13R | CTGCAG GGATCCGGCAAATGCAGAAGTCGTCATC |
| SEQ ID NO ： | 名稱 | 來源 | 胺基酸序列 | D 分數 a |
| 132 | SP01 | S-layer protein | MLPRFKAITVLALSMSILAQGLPVAA | 0.711 |
| 133 | SP02 | S-layer protein | MKPWLVRSSSFLLTASLVFPVFSAHA | 0.770 |
| 134 | SP03 | S-layer protein | MQDYMRQLGKKSAVMALVLSFVLLGVATSSIGVQQADA | 0.717 |
| 135 | SP04 | S-layer protein | MKRALAIFLSVMMFLTVVPFVSA | 0.786 |
| 136 | SP05 | S-layer protein | MQKLLRTLSCTLLAATLMTPGFSSA | 0.771 |
| 137 | SP06 | S-layer protein | MKKPYQQFRRWFAMCLTMMLLVTGVLPAVPAFA | 0.824 |
| 138 | SP07 | xylanase | MRRGALYVCLIACLLSWDILPAWA | 0.671 |
| 139 | SP08 | xylanase | MPNKRLFLFVFVTFLFMIVTAGIMGNVSG | 0.460 |
| 140 | SP09 | hypothetical protein | MKKWNKAAFLVVAASLLATSAVLTGPTSAYA | 0.771 |
| 141 | SP10 | ABC transporter substrate-binding protein | MKKKLPMTLLVGSLVLTMLSGCGSNA | 0.618 |
| 142 | SP11 | ABC transporter substrate-binding protein | MKKGRGLHIGLSCVLLVGLLAACSAPA | 0.615 |
| 143 | SP12 | lipoprotein | MKKTGILLSTLLLAASLLTACGGKQEA | 0.627 |
| 144 | SP13 | nucleotidase | MKKARRITMTALASVVFASLMTTSAFA | 0.869 |
| 145 | sec | MWP b（R2L6） | MKKRRVVNSVLLLLLLASALALTVAPMAFA | 0.522 |
7.2.
不同訊息胜肽對
α-
澱粉酶基因於
Br. choshinensis
HPD52
表現之影響
將表現載體pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-sec-GSAmySM及pEBR-1-P06
PD52/
lacO-3- SP01-GSAmySM～pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP13-GSAmySM以電轉形之方式導入
Br. choshinensisHPD52宿主中，並將轉形株接種至含適量新黴素之MT培養基中。於培養48小時後，進行胞外α-澱粉酶之酵素活性分析。結果顯示（圖21），SP02、SP04及SP13運用於α-澱粉酶表現之效果較佳，效率為sec之2.1、1.6及2.6倍。上述實驗說明，本申請案所提供之訊息胜肽可提升α-澱粉酶的表現量。
實施例
8
：利用
Br. choshinensis
HPD52
表現
苦瓜胰蛋白酶抑制劑
8.1.
苦瓜胰蛋白酶抑制劑表現載體之建構
將人工合成之苦瓜胰蛋白酶抑制劑（TI-4）基因（圖22）分別嵌入帶有sec、SP02、SP04及SP13等訊息胜肽DNA之表現載體中，可建構出4種TI-4分泌表現載體，分別為pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-sec-TI、pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP02-TI、pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP04-TI與pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP13-TI。
以pJET1.2-TI-4作為模板，利用TI-4F（SEQ ID NO：166）/TI-4R（SEQ ID NO：167）引子組合搭配Q5 High- Fidelity DNA聚合酶進行苦瓜胰蛋白酶抑制劑（TI-4）基因之增幅。PCR反應結束後，利用Plus Gel Eluted Kit進行PCR產物之回收。將回收後之PCR產物與不同之載體包括pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-sec-GSAmySM、pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP02-GSAmySM、pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP04-GSAmySM及pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP13-GSAmySM以
BamHI與
SalI剪切後，利用PCR Clean Up Kit回收特定之DNA片段。利用YB Rapid Ligation Kit進行回收DNA之黏合，並將黏合產物轉形至
E. coliECOS
TM9-5。利用TI-4F（SEQ ID NO：166）/TI-4R（SEQ ID NO：167）引子組合進行菌落聚合酶連鎖反應，以挑選可能帶有外插DNA之轉形株。抽取
E. coli轉形株之質體並進行定序。將帶有苦瓜胰蛋白酶抑制劑基因之表現載體分別命名為pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-sec-TI、pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP02-TI、pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP04-TI及pEBR-1- P06
HPD52/
lacO-3-SP13-TI。
8.2.
於宿主中表現苦瓜胰蛋白酶抑制劑
分別將帶有pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-sec-TI、pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP02-TI、pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP04-TI與pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP13-TI之
Br. choshinensisHPD52轉形株接種至含新黴素之MT培養基中，於37°C與180 rpm之條件下進行振盪培養。經培養14～17小時後，轉移適量菌液至含新黴素之新鮮MT培養基中，將起始OD
600調整為0.1。分別培養24、48及72小時後，以7,000 ×g與4°C之條件下離心30分鐘，並收集上清液之部分並進行蛋白質電泳。
結果顯示（圖23），帶有TI-4分泌表現載體之轉形株皆可分泌表現重組TI-4，於預期之TI-4分子量位置處皆可觀察到明顯條帶。其中以SP13運用於TI-4分泌表現之效果最佳。
8.3.
表現之苦瓜胰蛋白酶抑制劑之純化
將帶有pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP13-TI之
Br. choshinensisHPD52轉形株接種至含新黴素之MT培養基中。於培養48小時後，收集上清液部分並利用離子交換層析進行重組TI-4之純化。結果顯示（圖24），重組TI-4可利用陽離子交換樹脂進行純化，純化產量為16.63 mg/L，純度為99.93%。蛋白質身分鑑定結果顯示（圖25），純化之重組蛋白質確為TI-4。
上述結果說明，本申請案所提供之穿梭載體搭配
Br. choshinensisHPD52宿主可表現目標蛋白質，且表現出之蛋白質經身分鑑定後也符合預期。
按照本揭露內容無需過度實驗即能作出並執行此所揭露及請求保護之所有的穿梭載體、包含其之原核宿主細胞以及利用該宿主細胞製造蛋白質之方法。雖然本申請案的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定所請發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內。
無
圖1. 訊息胜肽之一般結構。
圖2. pEBR-1～pEBR-4之載體簡示圖。
圖3.
Br. choshinensisHPD52轉形株質體之確認。（A）
Br. choshinensisHPD52、（B）
Br. choshinensisHPD52（pNCMO2）、（C）
Br. choshinensisHPD52（pEBR-1）、（D）
Br. choshinensisHPD52（pEBR-2）與（E）
Br. choshinensisHPD52 （pEBR-3）之質體DNA與經限制酶切割之DNA的洋菜膠電泳結果。
圖4. P01
HPD52～P19
HPD52表現訊號之簡示圖。
圖5. 帶有不同表現訊號綠螢光蛋白質表現載體之
E. coliECOS
TM9-5於LB平板培養基培養24小時後之菌落形態。控制組：
E. coliECOS
TM9-5 （pEBR-1）。
圖6. 利用綠螢光蛋白質基因分析不同表現訊號於
E. coliECOS
TM9-5中之表現效率。圖中記錄不同時段轉形株（transformant）之OD
600之訊號（空心圓）及螢光強度（實心方形）。控制組：
E. coliECOS
TM9-5（pEBR-1）。
圖7. 帶有不同表現訊號綠螢光蛋白質表現載體之
E. coliECOS
TM9-5於培養24小時後之螢光強度。控制組：
E. coliECOS
TM9-5（pEBR-1）。
圖8. 帶有不同表現訊號綠螢光蛋白質表現載體之
Br. choshinensisHPD52於MT平板培養基培養48小時後之菌落形態。控制組：
Br. choshinensisHPD52（pEBR-1）。
圖9. 利用綠螢光蛋白質基因分析不同表現訊號於
Br. choshinensisHPD52中之表現效率。圖中記錄不同時段轉形株（transformant）之OD
600之訊號（空心圓）及螢光強度（實心方形）。控制組：
Br. choshinensisHPD52（pEBR-1）。
圖10. 帶有不同表現訊號綠螢光蛋白質表現載體之
Br. choshinensisHPD52於培養48小時後之螢光強度。控制組：
Br. choshinensisHPD52 （pEBR-1）。
圖11. P06
HPD52改造為誘導型表現訊號之序列。
圖12. 帶有不同誘導型表現訊號之綠螢光蛋白質表現載體之
Br. choshinensisHPD52於MT平板培養基培養48小時後之菌落形態。
圖13. 利用綠螢光蛋白質基因分析不同P06
HPD52/
lacO誘導型表現訊號於
Br. choshinensisHPD52中之表現效率。圖中記錄不同時段轉形株（transformant）之OD
600之訊號（空心圓）及螢光強度（實心方形）。控制組：
Br. choshinensisHPD52（pEBR-1）。
圖14. 帶有不同P06
HPD52/
lacO誘導型表現訊號表現載體之
Br. choshinensisHPD52於培養48小時後之螢光強度。
圖15. 利用綠螢光蛋白質基因分析不同表現訊號於
B. subtilisDB430中之表現效率。圖中記錄不同時段轉形株（transformant）之OD
600之訊號（空心圓）及螢光強度（實心方形）。控制組：
B. subtilisDB430（pEBR-1）。
圖16. 帶有不同表現訊號綠螢光蛋白質表現載體之
B.subtilisDB430於培養48小時後之螢光強度。
圖17. 利用綠螢光蛋白質基因分析不同P06
HPD52/
lacO誘導型表現訊號於
B. subtilisDB430中之表現效率。圖中記錄不同時段轉形株（transformant）之OD
600之訊號（空心圓）及螢光強度（實心方形）。控制組：
B. subtilisDB430（pEBR-1）。
圖18. 帶有不同P06
HPD52/
lacO誘導型表現訊號之
B. subtilisDB430於培養48小時後之螢光強度。
圖19. 以平板培養基測定
Br. choshinensisHPD52轉形株於培養48小時後之BSBglC、BLAmyL及GSAmyS之活性。（A） BSBglC：
Br. choshinensisHPD52 （pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-BSBglC）。（B） BLAmyL：
Br. choshinensisHPD52 （pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-BLAmyL）。（C） GSAmyS：
Br. choshinensisHPD52 （pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-GSAmyS）。控制組：
Br. choshinensisHPD52 （pEBR-1）。
圖20. 利用蛋白質電泳分析
Br. choshinensisHPD52轉形株分泌表現BSBglC、BLAmyL及GSAmyS之情形。（A） 控制組：
Br. choshinensisHPD52 （pEBR-1）。（B） BSBglC：
Br. choshinensisHPD52 （pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-BSBglC）。（C） BLAmyL：
Br. choshinensisHPD52 （pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-BLAmyL）。（D） GSAmyS：
Br. choshinensisHPD52 （pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-1-GSAmyS）。
圖21. 不同訊息胜肽對GSAmyS於
Br. choshinensisHPD52中分泌表現之影響。
圖22. 苦瓜胰蛋白酶抑制劑TI-4之核苷酸序列與胺基酸序列。
圖23. 利用蛋白質電泳分析
Br. choshinensisHPD52轉形株分泌表現苦瓜胰蛋白酶抑制劑之情形。（A） 控制組：
Br. choshinensisHPD52 （pEBR-1）。（B）
Br. choshinensisHPD52 （pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-sec-TI）。 （C）
Br. choshinensisHPD52 （pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP02-TI）。（D）
Br. choshinensisHPD52 （pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP04-TI）。（E）
Br. choshinensisHPD52 （pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP13-TI）。M： SeeBlue
TMPre-stained Protein Standard。
圖24. 利用蛋白質電泳分析自
Br. choshinensisHPD52（pEBR-1-P06
HPD52/
lacO-3-SP13-TI）培養上清液所純化之苦瓜胰蛋白酶抑制劑。
圖25. 利用線性離子阱式質譜分析儀鑑定純化之重組TI-4。
A0101_OR_PSEQ.xml
Claims (16)
- 一種穿梭載體，包含：(a)一大腸桿菌(Escherichia coli)質體pBR322之複製子區域，其具有如SEQ ID NO：1所示之序列；(b)一革蘭氏陽性菌之質體複製子區域，包含：一凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)無性狀質體pBC1之複製子區域，其具有如SEQ ID NO：3所示之序列；一金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)質體pC194之複製子區域，其具有如SEQ ID NO：4所示之序列；或一胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)無性狀質體pLP31-8之複製子區域，其具有如SEQ ID NO：5所示之序列；以及(c)一訊息胜肽，包含：訊息胜肽SP02，其具有如SEQ ID NO：92所示之序列；訊息胜肽SP04，其具有如SEQ ID NO：94所示之序列；訊息胜肽SP07，其具有如SEQ ID NO：97所示之序列；訊息胜肽SP08，其具有如SEQ ID NO：98所示之序列；訊息胜肽SP10，其具有如SEQ ID NO：100所示之序列；訊息胜肽SP11，其具有如SEQ ID NO：101所示之序列；或訊息胜肽SP13，其具有如SEQ ID NO：103所示之序列。
- 如請求項1所述之穿梭載體，更包含一大腸桿菌質體pBR322之調控蛋白質基因，其具有如SEQ ID NO：2示之序列。
- 如請求項1所述之穿梭載體，更包含至少一篩選基因。
- 如請求項3所述之穿梭載體，其中該至少一篩選基因包含抗藥性篩選基因、非抗藥性篩選基因、或其組合。
- 如請求項4所述之穿梭載體，其中該抗藥性篩選基因包含一氯黴素抗性基因或一新黴素抗性基因。
- 如請求項1所述之穿梭載體，更包含一多重選殖部位。
- 如請求項1所述之穿梭載體，更包含一表現訊號，包含：(a)表現訊號P01HPD52，其具有如SEQ ID NO：8所示之序列；(b)表現訊號P02HPD52，其具有如SEQ ID NO：9所示之序列；(c)表現訊號P03HPD52，其具有如SEQ ID NO：10所示之序列；(d)表現訊號P04HPD52，其具有如SEQ ID NO：11所示之序列；(e)表現訊號P05HPD52，其具有如SEQ ID NO：12所示之序列；(f)表現訊號P06HPD52，其具有如SEQ ID NO：13所示之序列；(g)表現訊號P07HPD52，其具有如SEQ ID NO：14所示之序列；(h)表現訊號P08HPD52，其具有如SEQ ID NO：15所示之序列；(i)表現訊號P09HPD52，其具有如SEQ ID NO：16所示之序列；(j)表現訊號P10HPD52，其具有如SEQ ID NO：17所示之序列；(k)表現訊號P11HPD52，其具有如SEQ ID NO：18所示之序列；(l)表現訊號P13HPD52，其具有如SEQ ID NO：20所示之序列；(m)表現訊號P14HPD52，其具有如SEQ ID NO：21所示之序列；(n)表現訊號P15HPD52，其具有如SEQ ID NO：22所示之序列；(o)表現訊號P16HPD52，其具有如SEQ ID NO：23所示之序列；(p)表現訊號P17HPD52，其具有如SEQ ID NO：24所示之序列；或 (q)表現訊號P19HPD52，其具有如SEQ ID NO：26所示之序列。
- 如請求項1所述之穿梭載體，更包含一誘導型表現訊號，包含：(a)誘導型表現訊號P06HPD52/lacO-1，其具有如SEQ ID NO：69所示之序列；(b)誘導型表現訊號P06HPD52/lacO-2，其具有如SEQ ID NO：70所示之序列；(c)誘導型表現訊號P06HPD52/lacO-3，其具有如SEQ ID NO：71所示之序列；(d)誘導型表現訊號P06HPD52/lacO-4，其具有如SEQ ID NO：72所示之序列；(e)誘導型表現訊號P06HPD52/lacO-5，其具有如SEQ ID NO：73所示之序列；(f)誘導型表現訊號P06HPD52/lacO-6，其具有如SEQ ID NO：74所示之序列；或(g)誘導型表現訊號P06HPD52/lacO-7，其具有如SEQ ID NO：75所示之序列。
- 如請求項8所述之穿梭載體，更包含該誘導型表現訊號之一調節基因。
- 如請求項1所述之穿梭載體，更包含一報導基因，包含：(a)枯草桿菌(Bacillus subtilis)之纖維素酶基因bglC；(b)地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)之α-澱粉酶基因amyL；或(c)嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)之α-澱粉酶基因amyS。
- 如請求項1所述之穿梭載體，更包含編碼蛋白質之一基因。
- 一種原核宿主細胞，其包括請求項1~11中任一項所述之穿梭載體。
- 如請求項12所述之原核宿主細胞，其中該原核宿主細胞包含大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(B.subtilis)與橋石短芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)。
- 一種利用如請求項13所述之原核宿主細胞生產蛋白質之方法，該方法包含下列之步驟：將如請求項13所述之原核宿主細胞置入一培養基中，並於一適當培養條件下使該原核宿主細胞表現所述蛋白質；以及由該細胞或細胞之培養液中回收該蛋白質。
- 如請求項14所述之方法，其中該蛋白質包含一苦瓜胰蛋白酶抑制劑。
- 如請求項15所述之方法，其中該苦瓜胰蛋白酶抑制劑包含如SEQ ID NO：169所示之序列。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW112133171A TWI850093B (zh) | 2023-09-01 | 2023-09-01 | 穿梭載體、包含其之原核宿主細胞及利用該宿主細胞生產蛋白質之方法 |
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| TW112133171A TWI850093B (zh) | 2023-09-01 | 2023-09-01 | 穿梭載體、包含其之原核宿主細胞及利用該宿主細胞生產蛋白質之方法 |
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| TWI850093B true TWI850093B (zh) | 2024-07-21 |
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| TW (1) | TWI850093B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3753945B2 (ja) * | 2001-02-14 | 2006-03-08 | ヒゲタ醤油株式会社 | 大腸菌とブレビバチルス属細菌間のプラスミドシャトルベクター |
-
2023
- 2023-09-01 TW TW112133171A patent/TWI850093B/zh active
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3753945B2 (ja) * | 2001-02-14 | 2006-03-08 | ヒゲタ醤油株式会社 | 大腸菌とブレビバチルス属細菌間のプラスミドシャトルベクター |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 期刊 Chen Zeng-Weng, et al. Construction and Application of a New Escherichia coli/Lactobacillus Shuttle Vector Taiwan Journal of Agricultural Chemistry and Food Science Vol.54 Taiwan Agricultural Chemistry Association 、Taiwan Food Science and Technology Society 2016 236-246;網路文獻 Mee,E.K. and Welker,N.E. Development of Genetic Tools to Analyze and Characterize Genes of the Thermophile Geobacillus stearothermophilus 24 JUN. 2003 NCBI GenBank: AY237122.1;期刊 YAO Dongbang, ZHANG Kang, ZHU Xuyang, et al. Identification of strong promoters based on the transcriptome of Brevibacillus choshinensis. Food and Fermentation Industries Vol.47 2021 15-22 * |
| 期刊 YAO Dongbang, ZHANG Kang, ZHU Xuyang, et al. Identification of strong promoters based on the transcriptome of Brevibacillus choshinensis. Food and Fermentation Industries Vol.47 2021 15-22 |
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