KR20220097505A - 바실러스 세포에서 단백질 생산을 향상시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
바실러스 세포에서 단백질 생산을 향상시키기 위한 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시내용은 일반적으로 향상된 단백질 생산 표현형을 갖는 바실러스 종 숙주 세포(균주)를 구축하고 수득하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 개시내용의 특정 구현예는 부모 바실러스 종 세포(예를 들어, 예컨대 관심 단백질을 발현/생산하는 부모 바실러스 세포)로부터 유래된(수득된) 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포에 관한 것이다. 이에 따라, 특정 구현예는 내인성 관심 단백질 또는 이종 관심 단백질을 발현/생산하는 변형된 바실러스 종 세포에 관한 것이며, 변형된 바실러스 종 세포는 yitMOP 오페론의 유전학적 변형, yitMOP 오페론 및 sdpABC 오페론의 조합된 유전학적 변형, yitM 유전자의 유전학적 변형 등을 포함하며, 변형된 바실러스 종 세포는 (즉, 동일한 조건 하에서 성장/배양/발효되는 경우) 이들이 유래된 부모 세포에 비하여증가된 양의 POI를 생산한다.
Description
본 개시내용은 일반적으로 세균학, 미생물학, 유전학, 분자 생물학, 효소학, 산업용 단백질 생산 등의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 단백질 생산 능력이 증가된 바실러스(Bacillus) 종 세포를 얻기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 11월 11일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/933,536호에 대한 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
서열 목록에 대한 참조
"NB41375-WO-PCT_SequenceListing.txt"로 명명된 서열 목록 텍스트 파일의 전자 제출 내용은 2020년 10월 23일자로 생성되었고, 그 크기는 36 KB이며, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)와 같은 그람 양성 박테리아는, 이들의 우수한 발효 특성 및 높은 수율(예를 들어, 배양액 1리터당 최대 25 그램; 문헌[Van Dijl and Hecker, 2013])로 인해 관련 산업용 단백질의 생산을 위한 미생물 공장으로서 자주 사용된다. 예를 들어, 비. 서브틸리스는 식품, 직물, 세탁, 의료 기기 세척, 제약 산업 등에 필요한 α-아밀라아제(문헌[Jensen et al., 2000]; 문헌[Raul et al., 2014]) 및 프로테아제(문헌[Brode et al., 1996])를 생산하는 것으로 잘 알려져 있다(문헌[Westers et al., 2004]). 이들 비-병원성 그람 양성 박테리아는 독성 부산물(예를 들어, 지질다당류; LPS, 내독소로도 알려짐)이 완전히 결여된 단백질을 생산하기 때문에, 유럽 식품 안전성 당국(European Food Safety Authority)의 "공인된 안전성 추정(Qualified Presumption of Safety, QPS)" 자격을 얻었으며, 이들 생산물 중 다수가 미국 식품 의약국(US Food and Drug Administration)으로부터 "일반적으로 안전한 것으로 인정됨(Generally Recognized As Safe, GRAS)" 자격을 얻었다(문헌[Olempska-Beer et al., 2006]; 문헌[Earl et al., 2008]; 문헌[Caspers et al., 2010]).
따라서, 미생물 숙주 세포에서 단백질(예를 들어, 효소, 항체, 수용체 등)을 생산하는 것은 생명공학 분야에서 특별한 관심 대상이다. 마찬가지로, 하나 이상의 관심 단백질(들)의 생산 및 분비를 위한 바실러스 종 숙주 세포의 최적화는 특히 산업적 생명공학 환경에서 높은 관련성을 갖는데, 여기에서 단백질 수율에서의 작은 개선은 단백질이 산업적으로 대량으로 생산될 때 매우 중요하다. 따라서, 단백질 생산을 향상시키기 위하여 바실러스 종 숙주 세포를 변형시키고 조작하는 능력은 당업계에서 매우 바람직하다. 하기에 기재된 바와 같이, 본 개시내용은 당업계에서 이러한 요구를 다룬다. 더욱 특별히, 본원에 제시되고, 기재되고, 예시된 바와 같이, 본 개시내용의 특정 구현예는 증가된 양의 관심 단백질을 생산할 수 있는 바실러스 종 숙주 세포를 구축하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용은 일반적으로 향상된 단백질 생산 표현형을 갖는 바실러스 종 세포를 구축하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 특정 구현예는 부모 바실러스 종 세포(예를 들어, 예컨대 관심 단백질을 발현/생산하는 부모 바실러스 세포)로부터 유래된(수득된) 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포에 관한 것이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 종 세포는 내인성 관심 단백질 또는 이종 관심 단백질을 발현/생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래되며, 변형된 바실러스 종 세포는 yitMOP 오페론의 유전학적 변형을 포함하며, (즉, 동일한 조건 하에서 성장/배양/발효되는 경우) 이것이 유래된 부모 세포에 비하여 증가된 양의 POI를 생산한다. 다른 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 종 세포는 내인성 관심 단백질 또는 이종 관심 단백질을 발현/생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래(수득)되며, 변형된 바실러스 종 세포는 yitMOP 오페론 및 sdpABC 오페론의 조합된 유전학적 변형을 포함하며, (즉, 동일한 조건 하에서 성장/배양/발효되는 경우) 변형된 바실러스 종 세포는 부모 세포에 비하여 증가된 양의 POI를 생산한다. 다른 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 종 세포는 내인성 관심 단백질 또는 이종 관심 단백질을 발현/생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래되며, 변형된 바실러스 종 세포는 yitM 유전자의 유전학적 변형을 포함하며, (즉, 동일한 조건 하에서 성장/배양/발효되는 경우) 변형된 바실러스 종 세포는 부모 세포에 비하여 증가된 양의 POI를 생산한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 종 세포는 내인성 관심 단백질 또는 이종 관심 단백질을 발현/생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래되며, 변형된 바실러스 종 세포는 yitM 유전자 및 sdpABC 오페론의 조합된 유전학적 변형을 포함하며, (즉, 동일한 조건 하에서 성장/배양/발효되는 경우) 변형된 바실러스 종 세포는 부모 세포에 비하여 증가된 양의 POI를 생산한다.
도 1은 고유 비. 서브틸리스 yitMOP 오페론의 핵산 서열 및 인코딩된 아미노산 서열을 보여준다. 더욱 구체적으로, 도 1a는 yitM 폴리펩티드(SEQ D NO: 2)를 인코딩하는 yitM 오픈 리딩 프레임(ORF; SEQ ID NO: 1) 및 yitO 폴리펩티드(SEQ D NO: 4)를 인코딩하는 yitO 오픈 리딩 프레임(ORF; SEQ ID NO: 3)의 핵산 서열을 제시한 것이며, 도 1b는 yitP 폴리펩티드(SEQ D NO: 6)를 인코딩하는 yitP 오픈 리딩 프레임(ORF; SEQ ID NO: 5)의 핵산 서열을 제시한 것이다.
도 2는 yitMOP 및 sdpABC 상호포식(cannibalism) 오페론의 조합된 결실(ΔyitMOP + ΔsdpABC)을 포함하는 변형된 비. 서브틸리스 균주(JL77)의 대규모 발효 동안의 단백질 생산에 대한 유리한 영향을 보여준다. 더욱 특별히, 도 2에 제시된 바와 같이, JL77 균주 및 CB24-12 균주의 세포를 동일한 표준 조건 하에 발효기에서 시험하였으며, JL77 균주에 대한 발효의 마지막의 V42 프로테아제 생산의 평균 증가는 발효의 마지막에 CB24-12 균주에 의해 생산되는 V42 프로테아제의 양에 비하여 대략 10% 증가였다.
생물학적 서열의 간단한 설명
SEQ ID NO: 1은 SEQ ID NO: 2의 고유 YitM 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 서브틸리스 오픈 리딩 프레임(ORF) 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 2는 SEQ ID NO: 1에 의해 인코딩되는 비. 서브틸리스 YitM 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 3은 SEQ ID NO: 4의 고유 YitO 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 서브틸리스 ORF 서열이다.
SEQ ID NO: 4는 SEQ ID NO: 3에 의해 인코딩된 비. 서브틸리스 YitO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 5는 SEQ ID NO: 6의 고유 YitP 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 서브틸리스 ORF 서열이다.
SEQ ID NO: 6은 SEQ ID NO: 5에 의해 인코딩된 비. 서브틸리스 YitP 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 7은 프라이머 oJKL228의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 8은 프라이머 oJKL229의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 9는 프라이머 oJKL232의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 10은 프라이머 oJKL223의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 11은 프라이머 oJKL230의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 12는 프라이머 oJKL231의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 13은 프라이머 oJKL226의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 14는 프라이머 oJKL227의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 15는 프라이머 M13F의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 16은 프라이머 M13R의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 17은 프라이머 oJKL246의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 18은 프라이머 5' spec out의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 19는 프라이머 oJKL247의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 20은 프라이머 3' spec out의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 21은 프라이머 oJKL220의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 22는 프라이머 oJKL221의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 23은 프라이머 oJKL224의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 24는 프라이머 oJKL225의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 25는 프라이머 oJKL222의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 26은 프라이머 oJKL223의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 27은 프라이머 oJKL218의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 28은 프라이머 oJKL2195의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 29는 프라이머 oJKL238의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 30은 프라이머 tet 3' out의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 31은 프라이머 oJKL229의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 32는 프라이머 tet 5' out의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 33은 SEQ ID NO: 34의 고유 YitP 폴리펩티드를 인코딩하는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 오픈 리딩 프레임(ORF) 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 34는 SEQ ID NO: 33에 의해 인코딩되는 비. 아밀로리쿼파시엔스 YitP 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 35는 SEQ ID NO: 36의 고유 YitO 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 아밀로리쿼파시엔스 ORF 서열이다.
SEQ ID NO: 36은 SEQ ID NO: 35에 의해 인코딩되는 비. 아밀로리쿼파시엔스 YitO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 37은 SEQ ID NO: 38의 고유 YitM 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 아밀로리쿼파시엔스 ORF 서열이다.
SEQ ID NO: 38은 SEQ ID NO: 37에 의해 인코딩되는 비. 아밀로리쿼파시엔스 YitM 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 39는 비. 아밀로리쿼파시엔스 yitMOP 오페론의 프로모터 영역 DNA 서열이다.
SEQ ID NO: 40은 비. 서브틸리스 yitMOP 오페론의 프로모터 영역 DNA 서열이다.
SEQ ID NO: 41은 비. 서브틸리스 sdpABC 오페론의 프로모터 영역 DNA 서열이다.
SEQ ID NO: 42는 SEQ ID NO: 43의 고유 SdpA 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 서브틸리스 오픈 리딩 프레임(ORF) 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 43은 SEQ ID NO: 42에 의해 인코딩되는 비. 서브틸리스 SdpA 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 44는 SEQ ID NO: 45의 고유 SdpB 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 서브틸리스 오픈 리딩 프레임(ORF) 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 45는 SEQ ID NO: 44에 의해 인코딩되는 비. 서브틸리스 SdpB 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 46은 SEQ ID NO: 47의 고유 SdpC 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 서브틸리스 오픈 리딩 프레임(ORF) 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 47은 SEQ ID NO: 46에 의해 인코딩되는 비. 서브틸리스 SdpC 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 2는 yitMOP 및 sdpABC 상호포식(cannibalism) 오페론의 조합된 결실(ΔyitMOP + ΔsdpABC)을 포함하는 변형된 비. 서브틸리스 균주(JL77)의 대규모 발효 동안의 단백질 생산에 대한 유리한 영향을 보여준다. 더욱 특별히, 도 2에 제시된 바와 같이, JL77 균주 및 CB24-12 균주의 세포를 동일한 표준 조건 하에 발효기에서 시험하였으며, JL77 균주에 대한 발효의 마지막의 V42 프로테아제 생산의 평균 증가는 발효의 마지막에 CB24-12 균주에 의해 생산되는 V42 프로테아제의 양에 비하여 대략 10% 증가였다.
생물학적 서열의 간단한 설명
SEQ ID NO: 1은 SEQ ID NO: 2의 고유 YitM 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 서브틸리스 오픈 리딩 프레임(ORF) 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 2는 SEQ ID NO: 1에 의해 인코딩되는 비. 서브틸리스 YitM 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 3은 SEQ ID NO: 4의 고유 YitO 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 서브틸리스 ORF 서열이다.
SEQ ID NO: 4는 SEQ ID NO: 3에 의해 인코딩된 비. 서브틸리스 YitO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 5는 SEQ ID NO: 6의 고유 YitP 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 서브틸리스 ORF 서열이다.
SEQ ID NO: 6은 SEQ ID NO: 5에 의해 인코딩된 비. 서브틸리스 YitP 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 7은 프라이머 oJKL228의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 8은 프라이머 oJKL229의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 9는 프라이머 oJKL232의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 10은 프라이머 oJKL223의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 11은 프라이머 oJKL230의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 12는 프라이머 oJKL231의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 13은 프라이머 oJKL226의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 14는 프라이머 oJKL227의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 15는 프라이머 M13F의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 16은 프라이머 M13R의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 17은 프라이머 oJKL246의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 18은 프라이머 5' spec out의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 19는 프라이머 oJKL247의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 20은 프라이머 3' spec out의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 21은 프라이머 oJKL220의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 22는 프라이머 oJKL221의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 23은 프라이머 oJKL224의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 24는 프라이머 oJKL225의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 25는 프라이머 oJKL222의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 26은 프라이머 oJKL223의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 27은 프라이머 oJKL218의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 28은 프라이머 oJKL2195의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 29는 프라이머 oJKL238의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 30은 프라이머 tet 3' out의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 31은 프라이머 oJKL229의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 32는 프라이머 tet 5' out의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 33은 SEQ ID NO: 34의 고유 YitP 폴리펩티드를 인코딩하는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 오픈 리딩 프레임(ORF) 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 34는 SEQ ID NO: 33에 의해 인코딩되는 비. 아밀로리쿼파시엔스 YitP 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 35는 SEQ ID NO: 36의 고유 YitO 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 아밀로리쿼파시엔스 ORF 서열이다.
SEQ ID NO: 36은 SEQ ID NO: 35에 의해 인코딩되는 비. 아밀로리쿼파시엔스 YitO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 37은 SEQ ID NO: 38의 고유 YitM 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 아밀로리쿼파시엔스 ORF 서열이다.
SEQ ID NO: 38은 SEQ ID NO: 37에 의해 인코딩되는 비. 아밀로리쿼파시엔스 YitM 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 39는 비. 아밀로리쿼파시엔스 yitMOP 오페론의 프로모터 영역 DNA 서열이다.
SEQ ID NO: 40은 비. 서브틸리스 yitMOP 오페론의 프로모터 영역 DNA 서열이다.
SEQ ID NO: 41은 비. 서브틸리스 sdpABC 오페론의 프로모터 영역 DNA 서열이다.
SEQ ID NO: 42는 SEQ ID NO: 43의 고유 SdpA 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 서브틸리스 오픈 리딩 프레임(ORF) 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 43은 SEQ ID NO: 42에 의해 인코딩되는 비. 서브틸리스 SdpA 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 44는 SEQ ID NO: 45의 고유 SdpB 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 서브틸리스 오픈 리딩 프레임(ORF) 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 45는 SEQ ID NO: 44에 의해 인코딩되는 비. 서브틸리스 SdpB 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO: 46은 SEQ ID NO: 47의 고유 SdpC 폴리펩티드를 인코딩하는 비. 서브틸리스 오픈 리딩 프레임(ORF) 핵산 서열이다.
SEQ ID NO: 47은 SEQ ID NO: 46에 의해 인코딩되는 비. 서브틸리스 SdpC 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
본 개시내용은 일반적으로, 향상된 단백질 생산 표현형을 갖는 바실러스 종 세포를 구축하고 수득하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 개시내용의 특정 구현예는 부모 바실러스 종 세포(예를 들어, 예컨대 관심 단백질을 발현/생산하는 부모 바실러스 세포)로부터 유래된(수득된) 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 부모 바실러스 종 세포는 관심 단백질(POI)을 인코딩하는 내인성 유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, 내인성 유전자는 프로테아제 또는 아밀라아제를 인코딩한다. 다른 특정 구현예에서, 부모 바실러스 종 세포는 이종 관심 단백질(POI)을 인코딩하는 발현 카세트를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 종 세포는 내인성 관심 단백질 또는 이종 관심 단백질을 발현/생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래되며, 변형된 바실러스 종 세포는 yitMOP 오페론의 유전학적 변형을 포함하며, (즉, 동일한 조건 하에서 성장/배양/발효되는 경우) 부모 세포에 비하여 증가된 양의 POI를 생산한다. 다른 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 종 세포는 내인성 관심 단백질 또는 이종 관심 단백질을 발현/생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래되며, 변형된 바실러스 종 세포는 yitMOP 오페론 및 sdpABC 오페론의 조합된 유전학적 변형을 포함하며, (즉, 동일한 조건 하에서 성장/배양/발효되는 경우) 변형된 바실러스 종 세포는 부모 세포에 비하여 증가된 양의 POI를 생산한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 종 세포는 내인성 관심 단백질 또는 이종 관심 단백질을 발현/생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래되며, 변형된 바실러스 종 세포는 yitM 유전자의 유전학적 변형을 포함하며, (즉, 동일한 조건 하에서 성장/배양/발효되는 경우) 부모 세포에 비하여 증가된 양의 POI를 생산한다. 다른 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 종 세포는 내인성 관심 단백질 또는 이종 관심 단백질을 발현/생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래되며, 변형된 바실러스 종 세포는 yitMOP 오페론(또는 yitM 유전자) 및 sdpABC 오페론의 조합된 유전학적 변형을 포함하며, (즉, 동일한 조건 하에서 성장/배양/발효되는 경우) 변형된 바실러스 종 세포는 부모 세포에 비하여 증가된 양의 POI를 생산한다.
I.
정의
본 개시내용의 변형된 바실러스 종 세포 및 본원에 기술된 이의 방법을 고려하여, 하기 용어 및 어구를 정의한다. 본원에서 정의되지 않은 용어는 본 기술 분야에서 사용되는 통상적인 의미를 따를 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 조성물 및 방법이 적용되는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기술되는 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 조성물 및 방법의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있지만, 이제부터는 대표적인 예시적 방법 및 재료가 기술된다.
본원에 인용된 모든 공보 및 특허는 그 전체가 참조로서 통합된다.
또한 주목할 것은 청구범위가 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있다는 것이다. 따라서, 이러한 서술은 청구범위 요소의 설명과 관련하여 "오로지(solely)", "단지(only)", "제외하는(excluding)", "포함하지 않는(not including)" 등과 같은 배타적인 용어를 사용하거나, "부정적" 한정 또는 이의 단서를 사용하는 것에 대한 선행적 근거로서의 역할을 하기 위한 것이다.
본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백해지는 것과 같이, 본원에 기술되고 예시된 개별적인 구현예 각각은 본원에 기술된 본 발명의 조성물 및 방법의 범위 또는 사상으로부터 벗어나지 않고도 다른 몇몇 구현예들 중 어느 하나의 구현예의 특징과 쉽게 분리되거나 조합될 수 있는 이산된 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 언급된 방법은 언급된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "숙주 세포"는 새롭게 도입된 DNA 서열을 위한 숙주 또는 발현 비히클로서 작용하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 따라서, 본 개시내용의 특정 구현예에서, 숙주 세포는 예를 들어 바실러스 종 세포 또는 이. 콜라이(E. coli) 세포이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형" 및 "고유"는 상호 교환 가능하게 사용되며, 자연에서 관찰되는 바와 같은 유전자, 프로모터, 단백질, 단백질 혼합물, 세포 또는 균주를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "바실러스 속" 또는 "바실러스 종" 세포는 비. 서브틸리스, 비. 리체니포르미스, 비. 렌투스(B. lentus), 비. 브레비스(B. brevis), 비. 스테아로써모필러스(B. stearothermophilus), 비. 알칼로필러스(B. alkalophilus), 비. 아밀로리쿼파시엔스, 비. 클라우시이(B. clausii), 비. 할로두란스(B. halodurans), 비. 메가테리움(B. megaterium), 비. 코아귤란스(B. coagulans), 비. 써큘란스(B. circulans), 비. 라우투스(B. lautus) 및 비. 튜링기엔시스(B. thuringiensis)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업자에게 알려진 "바실러스" 속 내의 모든 종을 포함한다. 바실러스 속은 분류학적 재편성을 계속 거치고 있음이 인정된다. 따라서, 상기 속은 현재 "지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus)"로 명명된 비. 스테아로써모필러스와 같은 유기체를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 재분류된 종을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "변형된 세포"는 변형된 세포가 유래된 "부모" 숙주 세포에 존재하지 않는 적어도 하나의 유전학적 변형을 포함하는 재조합 (숙주) 세포를 지칭한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, "부모" 세포는 (예를 들어, 부모 세포 내로 도입되는 하나 이상의 유전학적 변형을 통해) 변경되어, 이의 "변형된" (딸) 세포를 생성한다. 특정 구현예에서, 부모 세포는, 특히 "변형된" 바실러스 종 (딸) 세포와 비교하는 경우 또는 이에 비한 "대조군 세포"로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비변형된" (부모) 세포에서의 관심 단백질(POI)의 발현 및/또는 생산이 "변형된" (딸) 세포에서의 동일한 POI의 발현 및/또는 생산과 비교될 때, "변형된" 세포 및 "비변형된" 세포가 동일한 조건(예를 들어, 배지, 온도, pH 등과 같은 동일한 조건) 하에 성장/배양/발효된다는 것이 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 야생형 바실러스 서브틸리스 "yitMOP 오페론"은 "YitM 폴리펩티드", "YitO 폴리펩티드" 및 "YitP 폴리펩티드"를 인코딩한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 야생형 비. 서브틸리스 "yitM" 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2를 포함하는 야생형 비. 서브틸리스 "YitM" 폴리펩티드를 인코딩한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 야생형 비. 서브틸리스 "yitO" 핵산 서열은 SEQ ID NO: 4를 포함하는 야생형 비. 서브틸리스 "YitO" 폴리펩티드를 인코딩한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 야생형 비. 서브틸리스 "yitP" 핵산 서열은 SEQ ID NO: 6을 포함하는 야생형 비. 서브틸리스 "YitP" 폴리펩티드를 인코딩한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 야생형 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 "yitMOP 오페론"은 "YitM 폴리펩티드", "YitO 폴리펩티드" 및 "YitP 폴리펩티드"를 인코딩한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 야생형 비. 아밀로리쿼파시엔스 "yitM" 핵산 서열은 SEQ ID NO: 38을 포함하는 야생형 비. 아밀로리쿼파시엔스 "YitM" 폴리펩티드를 인코딩한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 야생형 비. 아밀로리쿼파시엔스 "yitO" 핵산 서열은 SEQ ID NO: 36을 포함하는 야생형 비. 아밀로리쿼파시엔스 "YitO" 폴리펩티드를 인코딩한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 야생형 비. 아밀로리쿼파시엔스 "yitP" 핵산 서열은 SEQ ID NO: 34를 포함하는 야생형 비. 아밀로리쿼파시엔스 "YitP" 폴리펩티드를 인코딩한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 야생형 비. 서브틸리스 "sdpA" 핵산 서열(SEQ ID NO: 42)은 SEQ ID NO: 43을 포함하는 야생형 비. 서브틸리스 "SdpA" 폴리펩티드를 인코딩한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 야생형 비. 서브틸리스 "sdpB" 핵산 서열(SEQ ID NO: 44)은 SEQ ID NO: 45를 포함하는 야생형 비. 서브틸리스 "SdpB" 폴리펩티드를 인코딩한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 야생형 비. 서브틸리스 "sdpC" 핵산 서열(SEQ ID NO: 46)은 SEQ ID NO: 47을 포함하는 야생형 비. 서브틸리스 "SdpC" 폴리펩티드를 인코딩한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "기능적 YitM 단백질의 생산의 결핍", "기능적 YitO 단백질의 생산의 결핍", "기능적 YitP 단백질의 생산의 결핍" 등과 같은 어구는 (즉, 동일한 조건 하에서 성장/배양/발효되는 경우 부모 세포에 비하여) 검출 가능한 양의 기능적 YitM 단백질, YitO 단백질 및/또는 YitM 단백질을 생산하지 않거나, 대안적으로, (즉, 동일한 조건 하에서 배양/발효되는 경우 부모 세포에 비하여) 적어도 약 5% 내지 약 99% 더 적은 하나 이상의 기능적 YitM, YitO 및/또는 YitP 단백질을 생산하는 변형된 (돌연변이) 바실러스 종 세포를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 종 세포는 yitMOP 오페론의 조절 영역을 결실시키는 것, 파괴하는 것, 불활성화시키는 것 등에 의해, 변형된 세포에서 기능적 유전자 생산물(즉, YitM, YitO 및/또는 YitP 단백질)의 생산이 결핍되게 하는 유전학적 변형을 포함한다. 따라서, 특정 구현예에서, 비. 아밀로리쿼파시엔스 yitMOP 오페론의 프로모터 영역 서열은 SEQ ID NO: 39에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 비. 서브틸리스 yitMOP 오페론의 프로모터 영역 서열은 SEQ ID NO: 40에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 비. 서브틸리스 sdpABC 오페론의 프로모터 영역 서열은 SEQ ID NO: 41에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 특정 구현예에서, 변형된 바실러스 종 세포는 yitM 유전자의 조절 영역(예를 들어, 프로모터 영역 서열; SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40)을 결실시키거나, 파괴하거나, 불활성화시키거나, 방해함으로써, 변형된 세포에서 기능적 YitM 단백질의 생산이 결핍되게 하는 유전학적 변형을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "pUCyitMOP:spec"로 명명된 플라스미드는 loxP 부위가 측접한 스펙티노마이신 내성(specR) 마커 유전자를 포함한다. 더욱 특별히, 플라스미드 pUCyitMOP:spec를 구축하여, 비. 서브틸리스 내의 전체 yitMOP 오페론을 스펙티노마이신 내성(specR) 마커로 대체하였다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "Topo-specR 벡터"는 그의 고유 프로모터 및 종결인자 요소를 갖는 스펙티노마이신 아데닐트랜스퍼라제 유전자(specR)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "pUCsdp::tet"로 명명된 플라스미드는 비. 서브틸리스 내의 전체 sdpABC 오페론을 loxP 부위가 측접한 테트라사이클린(tetR) 마커(본원에서, "loxP-tetR-loxP 카세트")로 대체하기 위한 상류(5') 및 하류(3') DNA 서열을 포함하며, 테트라사이클린 마커의 제거는 sdpABC 오페론의 결실을 초래한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "loxP-tetR-loxP 카세트"는 이를 사용하여 염색체 통합에 대해 선택한 후에, 나중에 테트라사이클린 내성 카세트의 루프 아웃(loop out)을 용이하게 하는 loxP 재조합 서열(문헌[Sauer, 1987, Sauer and Henderson 1988])을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "pUCLlacA-ganAB::tet"로 명명된 플라스미드는 비. 서브틸리스의 ganAB 유전자를 결실시키기 위해 사용되었으며, 이 플라스미드는 ganAB의 상류(5') 및 하류(3')의 상동성 영역 및 loxP-tetR-loxP 카세트를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "ME-3 프로테아제"는 써모비피다 셀룰로실리티카(Thermobifida cellulosilytica)로부터 유래된 열안정성 세린 프로테아제이다. 예를 들어, 티. 셀룰로실리티카 ME-3 프로테아제 및 이의 변이체는 전체가 본원에 참조로서 통합되는 PCT 공개 제WO2018/118815호에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "ZM207"로 명명되는 비. 서브틸리스 균주는 결실된 알라닌 라세마제 유전자(ΔalrA) 및 ME-3 프로테아제를 인코딩하는 도입된 발현 카세트를 포함한다. 더욱 특별히, 도입된 발현 카세트는 알라닌 라세마제를 인코딩하는 ORF(alrA)에 작동 가능하게 연결된 상류(5')에 존재하는 ME-3 프로테아제를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)에 작동 가능하게 연결된 상류(5')에 위치하는 프로모터 서열("P")을 포함하며, 카세트는 비. 서브틸리스 aprE 유전자좌 내로 통합된다(aprE::P-ME-3-alrA).
본원에서 사용되는 바와 같이, "ZM336"으로 명명된 유전학적으로 변형된 비. 서브틸리스 균주는 도입된 ME-3 프로테아제 발현 카세트 및 결실된 yitMOP 오페론(ΔyitMOP)을 포함하며, 결실된 yitMOP 오페론은 스펙티노마이신 내성(specR) 마커 유전자(즉, ΔyitMOP)로 대체되었다. 따라서, 결실된 yitMOP 오페론(ΔyitMOP)을 부모 ZM207 균주 내로 도입함으로써 ZM336 균주를 구축하였다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "ZM268"로 명명된 유전학적으로 변형된 비. 서브틸리스 균주는 yitMOP 오페론의 결실(ΔyitMOP) 및 sdpABC 오페론의 결실(ΔsdpABC)을 포함한다. 알라닌 라세마제 결실된 균주(ΔalrA)에서 yitMOP 및 sdpABC 오페론을 결실시킨 후에, ME-3 프로테아제를 인코딩하는 발현 카세트(aprE::P-ME-3-alrA)를 도입하여, ZM268 균주를 수득하였다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "ZM334"로 명명되는 유전학적으로 변형된 비. 서브틸리스 균주는 sdpABC 오페론의 결실(ΔsdpABC)을 포함하며, 결실된 sdpABC 오페론을 테트라사이클린 내성(tetR) 마커 유전자로 대체하였다(즉, ΔsdpABC). 따라서, 결실된 sdpABC 오페론(ΔsdpABC)을 부모 ZM207 균주 내로 도입함으로써 ZM334 균주를 구축하였다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "ZM434"로 명명되는 유전학적으로 변형된 비. 서브틸리스 균주는 ΔyitM 유전자의 결실(ΔyitM)을 포함하며, 결실된 yitM 오페론을 에리트로마이신 내성(ermC) 마커 유전자로 대체하였다(즉, ΔyitM). 따라서, 결실된 yitM(ΔyitM)을 부모 ZM207 균주 내로 도입함으로써 ZM434 균주를 구축하였다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "V42 프로테아제"는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 서브틸리신 프로테아제 BPN'으로부터 유래된 세린 프로테아제이다. 예를 들어, V42 프로테아제 및 이의 변이체는 PCT 공개 제WO2011/072099호에 기재되어 있다(전체가 본원에 참조로 통합됨).
본원에서 사용되는 바와 같이, "CB24-12"로 명명되는 부모 비. 서브틸리스 균주는 결실된 알라닌 라세마제 유전자(ΔalrA) 및 V42 프로테아제를 인코딩하는 도입된 발현 카세트를 포함한다. 더욱 특별히, 도입된 발현 카세트는 알라닌 라세마제를 인코딩하는 ORF(alrA)에 작동 가능하게 연결된 상류(5')에 존재하는 V42 프로테아제를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)에 작동 가능하게 연결된 상류(5')에 위치한 프로모터 서열("P4")을 포함하며, 카세트는 비. 서브틸리스 aprE 유전자좌 내로 통합된다(aprE::P4-V42-alrA).
본원에서 사용되는 바와 같이, "JL77"로 명명되는 유전학적으로 변형된(즉, CB24-12 부모 균주로부터 유래되는) 비. 서브틸리스 균주는 V42 프로테아제를 인코딩하는 동일한 발현 카세트, 결실된 yitMOP 오페론(ΔyitMOP) 및 결실된 sdpABC 오페론(ΔsdpABC)을 포함한다. 예를 들어, JL77 균주의 yitMOP 및 sdpABC 오페론을 항생제 내성 마커를 함유하는 카세트와의 상동성 재조합에 의해 결실시켰다. yitMOP 오페론을 loxP 서열이 측접한 스펙티노마이신 카세트로 대체하였다. spdABC 오페론을 loxP 서열이 측접한 테트라사이클린 카세트로 대체하였다. Cre 재조합효소의 발현을 위한 카세트를 함유하는 플라스미드로의 형질전환에서, 항생제 내성 마커는 게놈으로부터 절제되어, 하나의 loxP 서열을 남길 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "동등한 위치"는 특정 폴리펩티드 서열과의 정렬 후의 아미노산 잔기 위치 또는 특정 폴리뉴클레오티드 서열과의 정렬 후의 뉴클레오티드 위치를 의미한다.
용어 "변형(modification)" 및 "유전학적 변형(genetic modification)"은 상호 교환 가능하게 사용되며, 다음을 포함한다: (a) 유전자(또는 이의 ORF)에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 치환 또는 제거, 또는 유전자 또는 이의 ORF의 전사 또는 번역에 필요한 조절 요소에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 치환 또는 제거; (b) 유전자 파괴; (c) 유전자 전환; (d) 유전자 결실; (e) 유전자의 하향 조절; (f) 특이적 돌연변이 유발; 및/또는 (g) 본원에 개시된 임의의 하나 이상의 유전자의 무작위 돌연변이 유발.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유전자의 파괴", "유전자 파괴", "유전자의 비활성화" 및 "유전자 비활성화"는 상호교환 가능하게 사용되며, 넓게는 숙주 세포가 기능적 유전자 산물(예를 들어, YitM 단백질, YitO 단백질, YitP 단백질 등)을 생산하는 것을 실질적으로 방지하는 임의의 유전학적 변형을 지칭한다. 예시적인 유전자 파괴 방법은 폴리펩티드-코딩 서열, 프로모터, 인핸서, 또는 또 다른 조절 요소를 포함하는 유전자의 임의의 부분의 완전한 결실 또는 부분적 결실이나 이의 돌연변이 유발을 포함하며, 여기서 돌연변이 유발은 표적 유전자(들)을 파괴/비활성화하고 기능적 유전자 산물(즉, 단백질)의 생산을 실질적으로 감소시키거나 방지하는 치환, 삽입, 결실, 역위, 및 이들의 임의의 조합 및 변이를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "변형된 세포가 부모 세포에 비해 증가된 양의 관심 단백질을 발현/생산한다"와 같은 문구에서 사용되는 것과 같은 결합된 용어 "발현/생산하는"에 있어서, 해당 용어 "발현/생산하는"은 본 개시내용의 숙주 세포에서 관심 단백질의 발현 및 생산에 관여하는 임의의 단계를 포함하도록 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단백질 생산을 향상시키는" 또는 "단백질 생산을 증가시키는"과 같은 어구는 본 개시내용의 숙주 세포에 의해 생산되는 내인성 단백질 또는 이종 단백질의 증가된 양을 지칭한다. 특정 구현예에서, 관심 단백질은 숙주 세포의 내측에서 생산되거나, 배양 배지 내로 분비(또는 수송)된다. 특정 구현예에서, 관심 단백질은 배양 배지 내로 생산(분비)된다. 증가된 단백질 생산은 예를 들어, 부모 숙주 세포와 비교하여 더 높은 최대 수준의 생산되는 단백질 또는 효소 활성(예를 들어, 예컨대, 프로테아제 활성, 아밀라아제 활성, 셀룰라아제 활성, 헤미셀룰라아제 활성 등), 또는 총 세포외 단백질로서 검출될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산(nucleic acid)"은 뉴클레오티드 서열이나 폴리뉴클레오티드 서열 및 이의 단편 또는 일부를 지칭할 뿐 아니라, 센스 가닥을 나타내는지, 안티센스 가닥을 나타내는지 여부와 상관없이, 이중 가닥이거나 단일 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA, cDNA, 및 RNA도 지칭한다. 유전 암호의 축퇴성으로 인해 다수의 뉴클레오티드 서열이 주어진 단백질을 인코딩할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에 기술된 폴리뉴클레오티드(또는 핵산 분자)는 "유전자", "벡터" 및 "플라스미드"를 포함하는 것이 이해된다.
따라서, 용어 "유전자"는 단백질 코딩 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산의 특정 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 나타내며, 예를 들어 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 프로모터 서열과 같은 조절(비-전사) DNA 서열을 포함할 수 있다. 유전자의 전사 영역은 인트론, 5'-미번역 영역(UTR), 및 3'-UTR을 포함하는 미번역 영역(UTR)뿐만 아니라 코딩 서열도 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "코딩 서열"은 (인코딩된) 단백질 산물의 아미노산 서열을 직접적으로 특정하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 코딩 서열의 경계는 일반적으로 오픈 리딩 프레임(open reading frame, 이하, "ORF")에 의해 결정되며, 이는 대개 ATG 시작 코돈으로 시작된다. 코딩 서열은 전형적으로 DNA, cDNA, 및 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터(promoter)"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대하여 3'(하류)에 위치한다. 프로모터는 고유 유전자로부터 그 전체가 유래될 수 있거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터들로부터 유래되는 상이한 요소들로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 핵산 절편을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터들은 상이한 세포 유형에서 또는 상이한 발달 단계에서 또는 상이한 환경 또는 생리적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 대부분의 세포 유형에서 대부분의 시점에 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "구성적 프로모터(constitutive promoter)"로 칭해진다. 또한, 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편들이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있는 것으로 인식된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 하나의 기능이 다른 하나에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서 핵산 서열들이 회합하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열(예를 들어, ORF)의 발현에 영향을 줄 수 있는 경우 (즉, 해당 코딩 서열이 프로모터의 전사적 제어 하에 있는 경우) 프로모터는 코딩 서열과 작동 가능하게 연결된 것이다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
핵산이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있도록 위치될 때 이 핵산은 "작동 가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 분비 리더(즉, 신호 펩티드)를 인코딩하는 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프레-단백질(pre-protein)로서 발현되는 경우 이 DNA가 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동 가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 미칠 경우 이들이 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 리보솜 결합 부위가 번역을 촉진하도록 위치되는 경우 리보솜 결합부위가 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동 가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열들이 인접해 있음을 의미하고, 분비 리더의 경우, 연결되는 DNA 서열들이 인접해 있고 판독 단계(reading phase)에 있음을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접해 있을 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관례에 따라 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "관심 유전자의 단백질 코딩 서열에 연결된 관심 유전자(또는 이의 오픈 리딩 프레임)의 발현을 제어하는 기능적 프로모터 서열"은, 바실러스에서 코딩 서열의 전사 및 번역을 제어하는 프로모터 서열을 지칭한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 개시내용은 5' 프로모터(또는 5' 프로모터 영역, 또는 탠덤 5' 프로모터 등)를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 프로모터 영역은 본 개시내용의 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 따라서, 특정 구현예에서, 기능적 프로모터 서열은 본원에 개시된 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현을 제어한다. 다른 구현예에서, 기능적 프로모터 서열은, 바실러스 종 세포에서 관심 단백질을 인코딩하는 이종 유전자 (또는 내인성 유전자)의 발현을 제어한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 코딩 서열 내, 또는 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치하고, 회합된 코딩 서열의 전사, RNA 가공이나 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더(leader) 서열, RNA 가공 부위, 이펙터(effector) 결합 부위, 및 스템-루프 구조를 포함할 수 있다.
본원에서 정의되는 바와 같이, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임(ORF), 또는 이의 유전자 또는 이의 벡터를 "박테리아 세포 내로 도입하는" 또는 "바실러스 종 세포 내로 도입하는"과 같은 어구에서 사용될 때 용어 "도입하는(introducing)"은 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기 위한 당업계에 알려진 방법을 포함하며, 이에는 원형질체 융합, 천연 또는 인공 형질전환(예를 들어, 염화칼슘, 전기천공), 형질도입, 트랜스펙션, 컨쥬게이션 등(예를 들어, 문헌[Ferrari et al., 1989] 참조)이 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환된(transformed)" 또는 "형질전환(transformation)"은 세포가 재조합 DNA 기법을 사용하여 형질전환된 것을 의미한다. 형질전환은 전형적으로 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 폴리뉴클레오티드, ORF 또는 유전자)을 세포 내로 삽입함으로써 일어난다. 삽입된 뉴클레오티드 서열은 이종 뉴클레오티드 서열(즉, 형질전환될 세포에서는 자연적으로 발생하지 않는 서열)일 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 특정 구현예에서, 부모 바실러스 종 세포는 관심 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물을 부모 세포에 도입함으로써 변형(예를 들어, 형질전환)되어, 부모 세포로부터 유래된 변형된 바실러스 종(딸) 숙주 세포를 초래한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환"은 외인성 DNA를 숙주 세포 내로 도입함으로써 DNA가 염색체 통합체 또는 자가-복제성 염색체외 벡터로서 유지되는 것을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환 DNA", "형질전환 서열" 및 "DNA 구축물"은 서열을 숙주 세포 또는 유기체 내로 도입하는 데 사용되는 DNA를 지칭한다. 형질전환 DNA는 서열을 숙주 세포 또는 유기체 내로 도입하는 데 사용되는 DNA이다. DNA는 PCR 또는 임의의 다른 적합한 기법에 의해 시험관 내에서 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질전환 DNA는 유입 서열(incoming sequence)을 포함하는 반면, 다른 구현예에서는 상동성 박스(homology box)가 측접하는 유입 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 형질전환 DNA는 말단에 추가된 다른 비-상동성 서열(스터퍼(stuffer) 서열 또는 측접 서열)을 포함한다. 말단은 형질전환 DNA가, 예를 들어, 벡터 내로의 삽입과 같은 폐쇄된 원을 형성하도록 폐쇄될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 서열을 세포 내에 도입하는 것의 맥락에서의 용어 "도입된"은 세포 내로 핵산 서열을 전달하기에 적합한 임의의 방법을 지칭한다. 도입을 위한 이러한 방법은 원형질체 융합, 트랜스펙션, 형질전환, 컨쥬게이션 및 형질도입을 포함하되 이들로 한정되지는 않는다(예를 들어, 문헌[Ferrari et al., 1989] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, "유입 서열(incoming sequence)"은 바실러스 염색체 내로 도입되는 DNA 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 유입 서열은 DNA 구축물의 일부분이다. 다른 구현예에서, 유입 서열은 하나 이상의 관심 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유입 서열은 형질전환될 세포의 게놈에 이미 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 서열을 포함한다(즉, 상동성 서열이거나 이종 서열일 수 있음). 일부 구현예에서, 유입 서열은 하나 이상의 관심 단백질, 유전자, 및/또는 돌연변이된 또는 변형된 유전자를 인코딩한다. 대안적인 구현예에서, 유입 서열은 기능적 야생형 유전자 또는 오페론, 기능적 돌연변이 유전자 또는 오페론, 또는 비 기능적 유전자 또는 오페론을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 비-기능적 서열은 유전자 내에 삽입되어 유전자의 기능을 파괴할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 유입 서열은 선택성 마커를 포함한다. 추가의 구현예에서, 유입 서열은 2개의 상동성 박스를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "상동성 박스(homology box)"는 바실러스 염색체 내의 서열에 대해 상동성인 핵산 서열을 지칭한다. 보다 구체적으로, 상동성 박스는 본 발명에 따라 결실되거나, 파괴되거나, 비활성화되거나, 하향 조절되는 등의 유전자 또는 유전자의 일부의 바로 측접하는 코딩 영역과 약 80 내지 100%의 서열 동일성, 약 90 내지 100%의 서열 동일성, 또는 약 95 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 상류 또는 하류 영역이다. 이들 서열은 바실러스 염색체 내에 DNA 구축물이 통합되는 곳을 지시하고, 바실러스 염색체의 어느 부분이 유입 서열에 의해 치환되는 지를 지시한다. 본 개시내용을 한정하고자 하는 것은 아니지만, 상동성 박스는 약 1개의 염기쌍(bp) 내지 200 킬로베이스(kb)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상동성 박스는 약 1 bp 내지 10.0 kb; 1 bp 내지 5.0 kb; 1 bp 내지 2.5 kb; 1 bp 내지 1.0 kb, 및 0.25 kb 내지 2.5 kb를 포함한다. 상동성 박스는 약 10.0 kb, 5.0 kb, 2.5 kb, 2.0 kb, 1.5 kb, 1.0 kb, 0.5 kb, 0.25 kb 및 0.1 kb를 포함할 수도 있다. 일부 구현예에서, 선택성 마커의 5' 및 3' 말단은 상동성 박스가 측접하되, 상동성 박스는 유전자의 코딩 영역에 바로 측접하는 핵산 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "선택 가능한 마커 유전자" 또는 "선택 가능한 마커 인코딩 뉴클레오티드 서열"은 숙주 세포 내에서 발현이 가능한 뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 선택 가능한 마커의 발현은 대응하는 선택 가능한 제제의 존재 하에 또는 필수 영양소의 결여 하에 성장하는 능력을 발현된 유전자를 함유하는 세포에 부여한다. 이러한 선택 가능한 마커의 예에는 항미생물제가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 따라서, 선택 가능한 마커는 숙주 세포가 관심 유입 DNA를 흡수했거나 일부 다른 반응이 일어났음의 표시를 제공하는 유전자를 나타낸다. 전형적으로, 선택 가능한 마커는 형질전환 동안 임의의 외인성 서열을 수용한 적이 없는 세포로부터 외인성 DNA를 포함하는 세포를 구별할 수 있도록 숙주 세포에게 항미생물 내성 또는 대사적 이익(metabolic advantage)을 부여하는 유전자이다.
"상주 선택 가능한 마커(residing selectable marker)"는 형질전환될 미생물의 염색체 상에 위치하는 것이다. 상주 선택 가능한 마커는 형질전환 DNA 구축물 상의 선택 가능한 마커와 상이한 유전자를 인코딩한다. 선택성 마커는 당업자에게 잘 알려져 있다. 위에서 나타낸 바와 같이, 마커는 항미생물 내성 마커(예를 들어, ampR, phleoR, specR, kanR, eryR, tetR, cmpR 및 neoR)일 수 있다(예를 들어, 문헌[Guerot-Fleury, 1995]; 문헌[Palmeros et al., 2000]; 및 문헌[Trieu-Cuot et al., 1983]). 일부 구현예에서, 본 발명은 클로람페니콜(chloramphenicol) 내성 유전자(예를 들어, pC194에 존재하는 유전자 및 바실러스 종 게놈에 존재하는 내성 유전자)를 제공한다. 이러한 내성 유전자는 본 발명에서뿐만 아니라 염색체 통합 카세트 및 통합형 플라스미드의 염색체 증폭을 포함하는 구현예에서도 특히 유용하다(예를 들어, 문헌[Albertini and Galizzi, 1985]; 문헌[Stahl and Ferrari, 1984] 참조). 본 발명에 따른 유용한 다른 마커는 세린, 리신, 트립토판과 같은 영양요구성 마커; 및 β-갈락토시다아제 또는 형광 단백질과 같은 검출 마커를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
본원에서 정의되는 바와 같이, 숙주 세포 "게놈", 박테리아 세포 "게놈", 또는 바실러스 종 "게놈"은 염색체 유전자 및 염색체외 유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"는, 전형적으로 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 유전자를 종종 가지며, 대개는 원형 이중 가닥 DNA 분자의 형태인 염색체외 요소를 지칭한다. 이러한 요소는, 선택된 유전자 산물에 대한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 적절한 3' 미번역 서열과 함께 세포 내로 도입할 수 있는 특유한 구성으로 다수의 뉴클레오티드 서열이 결합되었거나 재조합된, 임의의 공급원 유래의 단일 가닥이나 이중 가닥 DNA 또는 RNA의 선형 또는 원형 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환 카세트"는 유전자(또는 이의 ORF)를 포함하고 외래 유전자에 더하여 특정 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 요소를 갖는 특정 벡터를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 세포에서 복제(증량)될 수 있고 새로운 유전자 또는 DNA 절편을 세포 내로 운반할 수 있는 임의의 핵산을 지칭한다. 따라서, 본 용어는 상이한 숙주 세포들 간의 전달을 위해 설계된 핵산 구축물을 지칭한다. 벡터는 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스(pro-virus), 플라스미드, 파지미드(phagemid), 트랜스포존(transposon), 및 인공 염색체, 예컨대 YAC(효모 인공 염색체), BAC(박테리아 인공 염색체), PLAC(식물 인공 염색체) 등을 포함하는데, 이들은 "에피좀"이다(즉, 자율적으로 복제되거나 숙주 유기체의 염색체 내에 통합될 수 있음).
"발현 벡터"는 세포에서 이종 DNA를 통합하고 발현시키는 능력을 갖는 벡터를 지칭한다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 상업적으로 이용 가능하고 당업자에게 알려져 있다. 적절한 발현 벡터를 선택하는 것은 당업자가 알고 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정한 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 명시된 핵산 요소(즉, 이들은 상기 기술된 바와 같은 벡터 또는 벡터 요소임)를 갖는, 재조합적으로 또는 합성에 의해 생산된 핵산 구축물을 지칭한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 색소체 DNA, 바이러스, 또는 핵산 단편 내로 혼입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은, 다른 서열 중에서도, 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 구축물은 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 명시된 핵산 요소를 또한 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 DNA 구축물은 본원에 정의된 바와 같은 선택성 마커 및 비활성화 염색체 또는 유전자 또는 DNA 절편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "표적화 벡터"는 표적화 벡터가 형질전환되는 숙주 세포의 염색체 내 영역에 대해 상동성이고, 해당 영역에서 상동성 재조합을 유도할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터이다. 예를 들어, 표적화 벡터는 상동성 재조합을 통해 숙주 세포의 염색체 내에 돌연변이를 도입하는 데 활용된다. 일부 구현예에서, 표적화 벡터는 예를 들어 말단에 부가된 다른 비-상동성 서열(즉, 스터퍼 서열 또는 측접 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 벡터는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제, DNA-가이드된 엔도뉴클레아제 및 재조합효소를 포함하지만 이들에 제한되지 않은 염색체와의 상동성 재조합을 증가시키기 위한 요소를 포함한다. 표적화 벡터가 예를 들어 벡터 내로의 삽입과 같이, 폐쇄된 원을 형성하도록 말단이 폐쇄될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "플라스미드"는 클로닝 벡터로서 사용되고, 많은 박테리아 및 일부 진핵 생물에서 염색체외 자가-복제 유전 요소를 형성하는 원형 이중 가닥(ds) DNA 구축물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 숙주 세포의 게놈 내에 통합되게 된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "관심 단백질"("POI"로 약칭)은 바실러스 종 숙주 세포에서 발현되기를 원하는 관심 단백질을 지칭한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, POI는 효소, 기질-결합 단백질, 표면-활성 단백질, 구조 단백질, 수용체 단백질 등일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 부모 세포에 비해 증가된 양의 이종 POI 또는 증가된 양의 내인성 POI을 생산한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 세포에 의해 생산된 POI의 증가된 양은 부모 세포에 비해 적어도 0.5% 증가, 적어도 1.0% 증가, 적어도 5.0% 증가, 또는 5.0% 초과의 증가이다.
유사하게, 본원에서 정의되는 바와 같이, "관심 유전자(gene of interest; "GOI"로 약칭됨)"는 POI를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 ORF)을 지칭한다. "관심 단백질"을 인코딩하는 "관심 유전자"는 자연 발생 유전자, 돌연변이된 유전자 또는 합성 유전자일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환 가능하게 사용되며, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 임의의 길이의 중합체를 지칭한다. 아미노산 잔기에 대한 통상적인 1문자 또는 3문자 코드가 본원에서 사용된다. 폴리펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 용어 폴리펩티드는 자연적으로 변형된, 또는 개입, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 컨쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 또한 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예컨대, 비천연 아미노산 등을 포함함)뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드도 정의에 포함된다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 유전자는 상업적으로 관련된 산업용 관심 단백질, 예컨대 효소(예를 들어, 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르보닉 안하이드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글리코실 하이드롤라아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 펩티다아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제, 및 이들의 조합)를 인코딩한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "변이체" 폴리펩티드는, 전형적으로 재조합 DNA 기법에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가 또는 결실에 의해 부모 (또는 기준) 폴리펩티드로부터 유래되는 폴리펩티드를 지칭한다. 변이체 폴리펩티드는 적은 수의 아미노산 잔기만큼 부모 폴리펩티드와 상이할 수 있으며, 부모 (기준) 폴리펩티드와의 일차 아미노산 서열 상동성/동일성 수준에 의해 정의될 수 있다.
바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 부모 (기준) 폴리펩티드 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "변이체" 폴리뉴클레오티드는 변이체 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, "변이체 폴리뉴클레오티드"는 부모 폴리뉴클레오티드와 명시된 정도의 서열 상동성/동일성을 갖거나, 엄격한 혼성화 조건 하에 부모 폴리뉴클레오티드(또는 이의 상보체)와 혼성화된다. 바람직하게는, 변이체 폴리뉴클레오티드는 부모 (기준) 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "돌연변이"는 핵산 서열에서의 임의의 변화 또는 변경을 나타낸다. 점 돌연변이, 결실 돌연변이, 침묵 돌연변이, 프레임 시프트 돌연변이, 스플라이싱 돌연변이 등을 포함하는 여러 가지 유형의 돌연변이가 존재한다. 돌연변이는 (예를 들어, 위치 지정 돌연변이 유발을 통해) 특이적으로 또는 (예를 들어, 화학 작용제, 복구 결핍된 박테리아 균주를 통한 계대를 통해) 무작위로 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드 또는 이의 서열의 맥락에서, 용어 "치환"은 하나의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체하는 것(즉, 치환하는 것)을 의미한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "내인성 유전자"는 유기체의 게놈 내에서 유전자의 자연적인 위치에 있는 유전자를 지칭한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "이종" 유전자, "비-내인성" 유전자, 또는 "외래" 유전자는 숙주 유기체에서 자연적으로는 발견되지 않지만, 유전자 전달(gene transfer)에 의해 숙주 유기체 내로 도입되는 유전자(또는 ORF)를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "외래" 유전자(들)는 비-고유 유기체 내로 삽입된 고유 유전자(또는 ORF) 및/또는 고유 또는 비-고유 유기체 내로 삽입된 키메라 유전자를 포함한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "이종" 핵산 구축물 또는 "이종" 핵산 서열은 서열이 발현되는 세포에 대해 고유하지 않은 서열의 부분을 갖는다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "이종 제어 서열"은 자연에서는 관심 유전자의 발현을 조절(제어)하도록 기능하지 않는 유전자 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)을 지칭한다. 일반적으로, 이종 핵산 서열은 이들이 존재하는 세포 또는 게놈의 부분에 대하여 내인성이 아니며(고유가 아니며), 감염, 트랜스펙션, 형질전환, 미세주입, 전기천공 등에 의해 세포에 부가된 것이다. "이종" 핵산 구축물은 고유 숙주 세포에서 발견되는 제어 서열/DNA 코딩 서열의 조합과 동일하거나 이와는 상이한 제어 서열/DNA 코딩(ORF) 서열의 조합을 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "신호 서열" 및 "신호 펩티드"는 성숙 단백질 또는 전구체 형태의 단백질의 분비 또는 직접적인 수송에 참여할 수 있는 아미노산 잔기의 서열을 지칭한다. 신호 서열은 전구체 또는 성숙 단백질 서열에 대해 전형적으로 N-말단에 위치한다. 신호 서열은 내인성 또는 외인성일 수 있다. 신호 서열은 통상적으로 성숙 단백질에 존재하지 않는다. 신호 서열은 전형적으로 단백질이 수송된 후 신호 펩티다제에 의해 단백질로부터 절단된다.
용어 "유래된(derived)"은 용어 "기인된", "수득된", "수득 가능한" 및 "생산된"을 포함하며, 하나의 명시된 물질 또는 조성물의 기원이 또 다른 명시된 물질 또는 조성물에서 발견되거나, 또 다른 명시된 물질 또는 조성물을 참조하여 기술될 수 있는 특징을 가진다는 것을 일반적으로 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상동성"은 상동성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 관련된다. 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 둘 이상의 폴리펩티드가 상동성인 경우, 이는 상동성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 한층 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98%의 "동일성 정도"를 갖는 것을 의미한다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 본원에서 정의된 바와 같이 상동성이 되기에 충분히 높은 정도의 동일성을 갖는지 여부는 본 기술 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 GCG 프로그램 패키지로 제공되는 "GAP"(Program Manual for the Wisconsin Package, 버전 8, 1994년 8월, [53711] 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))를 사용하여 두 서열을 정렬함으로써 적절히 조사할 수 있다(문헌[Needleman and Wunsch, (1970)]). DNA 서열 비교를 위하여 하기 설정을 갖는 GAP를 사용한다: 5.0의 GAP 생산 페널티 및 0.3의 GAP 연장 페널티.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동일성 백분율(%)"은, 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬할 때 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열 사이의 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 동일성 수준을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 비생산성(specific productivity)"은 주어진 기간에 걸쳐 시간 당 세포 당 생산된 단백질의 총량이다.
본원에서 정의되는 바와 같이, 용어 "정제된", "단리된" 또는 "농축된"은, 생체분자(예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)가 자연에서 이것이 회합된 자연 발생 구성요소 중 일부 또는 전부로부터 이를 분리함으로써 이의 자연 상태로부터 변경되는 것을 의미한다. 이러한 단리 또는 정제는 최종 조성물에서 바람직하지 않은 전체 세포, 세포 데브리스, 불순물, 무관한 단백질, 또는 효소를 제거하기 위한 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 분리, 투석, 프로테아제 처리, 황산암모늄 침전 또는 기타 단백질 염 침전, 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피, 여과, 미세여과, 겔 전기영동 또는 구배에 의한 분리와 같은 해당 분야에서 인정된 분리 기법에 의해 달성될 수 있다. 그 후 추가 이득을 제공하는 구성요소, 예를 들어 활성화제, 항-저해제, 바람직한 이온, pH를 제어하기 위한 화합물 또는 기타 효소 또는 화학물질을 정제되거나 단리된 생체분자 조성물에 첨가하는 것이 추가로 가능하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "상동성 유전자"는 상이하지만 통상적으로 관련된 종 유래의 유전자의 쌍을 지칭하며, 이들은 서로 상응하며, 서로 동일하거나 매우 유사하다. 이 용어는 유전자 중복(genetic duplication)에 의해 분리된 유전자(예를 들어, 파라로그 유전자(paralogous gene))뿐만 아니라 종분화(speciation)(즉, 새로운 종의 발생)에 의해 분리된 유전자(예를 들어, 오솔로그 유전자(orthologous gene))도 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "오솔로그(orthologue)" 및 "오솔로그 유전자"는 종분화에 의해 공통 조상 유전자(즉, 상동성 유전자)로부터 진화된 상이한 종에서의 유전자를 지칭한다. 전형적으로, 오솔로그는 진화 과정 동안 동일한 기능을 유지한다. 오솔로그의 확인은 새롭게 서열결정된 게놈에서의 유전자 기능의 신뢰 가능한 예측에서 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "파라로그(paralog)" 및 "파라로그 유전자"는 게놈 내의 중복에 의해 연관된 유전자를 나타낸다. 오솔로그는 진화 과정 내내 동일한 기능을 유지하지만, 파라로그에서는, 심지어 일부 기능이 흔히 원래의 것에 연관된다 해도, 새로운 기능이 발달된다. 파라로그 유전자의 예는 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제, 및 트롬빈(이들 전부는 세린 프로테이나아제이며, 동일 종 내에서 함께 나타남)을 인코딩하는 유전자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "상동성"은 서열 유사성 또는 동일성을 나타내며, 이때 동일성이 바람직하다. 이 상동성은 당업계에 공지된 표준 기법을 사용해 결정된다(예를 들어, 문헌[Smith and Waterman, 1981]; 문헌[Needleman and Wunsch, 1970]; 문헌[Pearson and Lipman, 1988]; 위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지(위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA와 같은 프로그램; 및 문헌[Devereux et. al., 1984] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "혼성화(hybridization)"는 당업계에 공지된 바와 같이 핵산 가닥이 염기 쌍형성을 통해 상보성 가닥과 결합하는 과정을 지칭한다. 핵산 서열은 두 서열이 중간 정도의 엄격성 내지 고 엄격성의 혼성화 및 세척 조건 하에서 서로에게 특이적으로 혼성화될 경우 기준 핵산 서열에 "선택적으로 혼성화 가능한" 것으로 간주된다. 혼성화 조건은 핵산 결합 복합체 또는 프로브의 용융 온도(Tm)에 기초한다. 예를 들어, "최대 엄격성(maximum stringency)"은 전형적으로 약 Tm -5℃(프로브 Tm의 5℃ 미만)에서 발생하고; "고 엄격성"은 Tm의 약 5 내지 10℃미만에서 발생하고; "중간 정도 엄격성"은 프로브 Tm의 약 10 내지 20℃ 미만에서 발생하며; "저 엄격성"은 Tm의 약 20 내지 25℃ 미만에서 발생한다.
기능적으로, 최대 엄격성 조건은 혼성화 프로브와 엄격한 동일성 또는 거의 엄격한 동일성을 갖는 서열을 확인하는 데 사용될 수 있는 반면, 중간 정도 또는 저 엄격성 혼성화는 폴리뉴클레오티드 서열 상동체를 확인하거나 검출하는 데 사용될 수 있다. 중간 정도 엄격성 혼성화 조건 및 고 엄격성 혼성화 조건은 해당 분야에 잘 알려져 있다. 고 엄격성 조건의 예는 약 42℃에서 50% 포름아미드, 5X SSC, 5X 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 0.5% SDS 및 100 pg/㎖의 변성된 담체 DNA에서의 혼성화에 이어서, 실온(RT)에서 2X SSC 및 0.5% SDS 중에서의 2회 세척 및 42℃에서 0.1X SSC 및 0.5% SDS 중에서 2회의 추가 세척을 포함한다. 중간 정도의 엄격성 조건의 예는 37℃에서 20% 포름아미드, 5 x SSC(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 ㎎/㎖의 변성된 분쇄 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서의 밤샘 배양에 이어서, 약 37 내지 50℃에서 1x SSC 중에서의 필터 세척을 포함한다. 당업자라면 프로브 길이 등과 같은 인자를 수용하기 위하여 필요할 경우 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 알고 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "재조합(recombinant)"은 이종 핵산 서열의 도입에 의해 변형되었거나, 그렇게 변형된 세포로부터 세포가 유래되는, 세포 또는 벡터에 대한 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 고유(비-재조합) 형태 내에서는 동일한 형태로 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 의도적인 인간의 개입으로 인해 달리 비정상적으로 발현되었거나, 덜 발현되었거나, 전혀 발현되지 않은 고유 유전자를 발현한다. "재조합(recombination, recombining)" 또는 "재조합된(recombined)" 핵산을 생산하는 것은 2개 이상의 핵산 단편을 어셈블리하는 것이며, 어셈블리를 통해 키메라 유전자가 생산된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "측접 서열(flanking sequence)"은 논의 중인 서열의 상류(5') 또는 하류(3')에 있는 임의의 서열을 지칭한다(예를 들어, 유전자 A-B-C의 경우, 유전자 B는 A 및 C 유전자 서열이 측접함). 특정 구현예에서, 유입 서열은 각 측 상의 상동성 박스가 측접한다. 또 다른 구현예에서, 유입 서열 및 상동성 박스는 각각의 측에 스터퍼 서열이 측접한 단위를 포함한다. 일부 구현예에서, 측접 서열은 일 측에만(3' 또는 5') 존재하지만, 바람직한 구현예에서는, 이는 측접하는 서열의 각각의 측에 존재한다. 각각의 상동성 박스의 서열은 바실러스 염색체에서의 서열에 대하여 상동성이다. 이들 서열은 새로운 구축물이 바실러스 염색체 내의 어디에 통합되는지 및 바실러스 염색체의 어느 부분이 유입 서열에 의해 치환될 것인지를 지시한다. 다른 구현예에서, 선택 마커의 5' 및 3' 말단은 비활성화 염색체 절편의 섹션을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이 측접한다. 일부 구현예에서, 측접 서열은 오직 일 측에만(3' 또는 5') 존재하는 반면, 다른 구현예에서는, 이는 측접하는 서열의 각각의 측에 존재한다. 일부 구현예에서, 상동성 박스는 서로 바로 측접하며 개재 서열이 결여되어(예를 들어, 유전자 D-E-F에 대하여 구축물 D-F), 구축물이 게놈 내에서 재조합된다면, 유전자 E가 게놈으로부터 제거될 것이다.
II. 상호포식 세포 스트레스 반응
이들의 천연 환경에서, 미생물은 끊임없이 영양소를 위하여 경쟁해야 한다. 이들의 서식지를 침입하는 종으로부터 방어하기 위하여, 많은 박테리아는 세포 피막의 온전성 및/또는 생합성을 방해하는 항미생물 펩티드(AMP)를 생산하고 분비한다(예를 들어, AMP 작용은 세포 성장의 저지 및 종종 세포 용해를 야기한다(문헌[Silver, 2003]; 문헌[Silver, 2006])). 따라서, 이러한 항미생물 펩티드(AMP) 공격에 대해 방어하기 위하여, 많은 박테리아는 복잡한 세포 피막 스트레스 반응을 유도한다. 예를 들어, 탄소원 제한에 직면하는 경우, 비. 서브틸리스는 포자형성으로 지칭되는 생존 전략을 개시하여, 비. 서브틸리스가 긴 기간의 기아를 견디게 하는 고도의 내성의 내생포자의 형성을 야기한다. 많은 에너지가 요구되고 비가역적인 이 과정에 전념하게 되는 것을 피하기 위하여, 비. 서브틸리스는 "상호포식"으로 지칭되는 또 다른 전략을 사용하여, 포자형성을 가능한 길게 지연시킨다(문헌[Gonzalez-Pastor et al., 2003]). 비. 서브틸리스에서의 상호포식은 일반적으로 2가지의 공지된 상호포식 독소(AMP), 포자형성 지연 단백질(SDP) 및 포자형성 사멸 인자(SKF)의 생산 및 분비를 포함하며, 이 상호포식 독소 단백질은 민감성 동일세대(sibling)를 용해시킬 수 있다. 따라서, 용해된 동일세대 세포는 이어서 상호포식을 늦추기 위한 영양소를 제공하거나, 심지어 이들이 포자형성에 들어가는 것을 방지하는 것으로 생각된다.
예를 들어, 문헌[Gonzalez-Pastor et al. (2003)]에 일반적으로 기재된 바와 같이, 비. 서브틸리스 skf 오페론은 여덟(8)개의 유전자(즉, skfABCDEFGH)를 포함하며, skfA 유전자는 AMP 독소 SKF를 인코딩하며; 비. 서브틸리스 sdp 오페론은 세(3)개의 유전자(즉, sdpABC)를 포함하며, sdpC 유전자는 AMP 독소 SPD를 인코딩한다. 문헌[Perez Morales et al. (2013)]에 의한 spdABC 오페론의 더욱 최근의 연구는 인코딩된 SdpA 및 SdpB 단백질이 세포외로 분비되는 성숙 및 활성 SDP 독소 단백질로의 미성숙 SpdC 단백질의 번역후 가공에 필수적임을 뒷받침한다. 문헌[Wang et al. (2014)]에서는 비. 서브틸리스에서의 특정 세포 용해 유전자(즉, skfA, sdpC, xpf 또는 lytC)의 단일의 및 조합된 결실의 영향을 연구하였으며, 가장 많은 수의 온전한 세포가 4중-돌연변이(ΔlytCΔsdpCΔxpfΔskfA)의 배양물에서 검출되었다. 문헌[Wang et al. (2014)]에 의해 결론지어진 바와 같이, 세포내 및 분비된 재조합 단백질(각각 나토키나제 및 β-갈락토시다제)의 생산은 주요 PG 하이드롤라아제를 인코딩하는 lytC, 프로파지-인코딩된 xpf 및 상호포식 인자 skfA 및 sdpC의 결실에 의한 4중 돌연변이체 LM2531(ΔlytCΔsdpCΔxpfΔskfA)의 배양물에서 유의미하게 상승되었다.
본원에 기재되고, 하기 실시예 섹션에 제시된 바와 같이, 본 발명자는 yitMOP로 명명되는 비. 서브틸리스에서의 신규한 상호포식 오페론을 확인하였으며, 이 오페론은 YitM 단백질(SEQ ID NO: 2), YitO 단백질(SEQ ID NO: 4) 및 YitP 단백질(SEQ ID NO: 6)을 인코딩한다. 더욱 구체적으로, 본 발명자는 FNA 프로테아제를 발현하는 비.서브틸리스 균주의 전사체 분석에서 고도로 발현되는 전사물로서 신규한 yitMOP 오페론을 확인하였다.
따라서, 하기 실시예 3에 추가로 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 도입된 프로테아제(ME-3) 발현 카세트를 포함하는 ZM207로 명명되는 부모 비. 서브틸리스 세포(균주), 및 ZM334, ZM336 및 ZM434로 명명되는 이의 변형된 비. 서브틸리스 세포(균주)를 구축하였으며; ZM334 세포는 동일한 프로테아제(ME-3) 발현 카세트 및 결실된 sdpABC 오페론(ΔsdpABC)을 포함하며, ZM336 세포는 ME-3 프로테아제 발현 카세트 및 결실된 yitMOP 오페론(ΔyitMOP)을 포함하며, ZM434 세포는 ME-3 프로테아제 발현 카세트 및 yitM 유전자의 결실(ΔyitM)을 포함한다. ZM268 세포는 ME-3 프로테아제 발현 카세트, 결실된 yitMOP 오페론(ΔyitMOP) 및 결실된 sdpABC 오페론(ΔsdpABC)을 포함하며, 프로테아제(ME-3) 발현 카세트를 yitMOP 오페론의 결실(ΔyitMOP), 결실된 sdpABC 오페론(ΔsdpABC) 및 알라닌 라세마제 유전자의 결실(ΔalrA)을 갖는 숙주 내로 도입함으로써 구축하였다.
실시예 3에 제시된 바와 같이, 부모(ZM207; 대조군) 및 변형된 비. 서브틸리스 세포(ZM334, ZM336, ZM268 및 ZM434)를 진탕 플라스크에서 동일한 조건 하에 Grant's II 배지 중에 42℃에서 사십(40) 시간 동안 발효시켰다. 이후에, 발효 상청액을 취하고, ME-3 프로테아제 활성(표 15)을 측정하였다. 예를 들어, 표 15에 나타낸 바와 같이, ZM334(ΔsdpABC) 균주 및 ZM336(ΔyitMOP) 균주 둘 모두는 ZM207(대조군) 균주에 비하여 증가된 양의 ME-3 프로테아제를 생산하였다. 유사하게, yitMOP 및 sdpABC 오페론의 조합된 결실(즉, ΔyitMOP + ΔsdpABC)을 포함하는 ZM268 균주(표 15)는 ZM207 부모 균주, ZM334 균주(ΔsdpABC) 및 ZM336 균주(ΔyitMOP)에 비하여 증가된 양의 프로테아제를 생산한다. 또한, ZM434(ΔyitM) 균주가 ZM336(ΔyitMOP) 균주보다 약간 더 많은 ME-3 프로테아제를 생산하였기 때문에, 단독의 yitM ORF의 파괴 또는 결실이 증가된 단백질 생산의 유리한 표현형을 유도하기에 충분하였음이 놀랍게도 관찰되었다(표 15).
마찬가지로, 하기 실시예 4에 제시되고 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 추가로 도입된 프로테아제(V42) 발현 카세트를 포함하는 CB24-12로 명명되는 부모 비. 서브틸리스 세포(균주) 및 동일한 V42 프로테아제 발현 카세트 및 yitMOP 오페론 및 sdpABC 오페론(ΔyitMOP + ΔsdpABC)의 조합된 결실을 포함하는 JL77로 명명되는 변형된 비. 서브틸리스 딸 세포를 구축하였다. 실시예 4에 기재된 바와 같이, 비. 서브틸리스 CB24-12 및 JL77 균주를 대규모 발효 조건 하에 V42 프로테아제 생산에 대하여 평가하였다. 예를 들어, 도 2에 제시된 바와 같이, CB24-12 및 L77 균주를 동일한 표준 조건 하에 발효기에서 시험하였으며, 각각의 균주를 2벌로 시행하였으며, 발효의 마지막의 V42 프로테아제 생산의 평균 개선이 나타나 있다. 따라서, 도 2에 나타낸 바와 같이, JL77 균주에 대한 발효의 마지막의 V42 프로테아제 생산의 평균 증가가 발효의 마지막에 CB24-12 균주에 의해 생산되는 V42 프로테아제의 양에 비하여 대략 10% 증가되었다.
이들 발견은 바실러스 종 세포에서의 yitMOP 오페론의 유전학적 변형이 (즉, 고유 yitMOP 오페론을 포함하는) 부모 바실러스 종 세포에 비하여 향상된 단백질 생산성 표현형을 초래하는 것을 입증한다. 또한, 이들 발견은 바실러스 종 세포에서의 yitMOP 오페론 및 sdpABC 오페론의 조합된 유전학적 변형이 단독의 yitMOP 오페론의 유전학적 변형을 포함하는 변형된 바실러스 종 세포에 비하여 관찰되는 단백질 생산성 표현형을 더욱 향상시키는 것을 입증한다(실시예 3, 표 15 및 실시예 4, 도 2 참조).
마찬가지로, 단독의 yitM 유전자의 유전학적 변형을 포함하는 바실러스 종 세포가 yitMOP 및 sdpABC 오페론(ΔyitMOP + ΔsdpABC; 실시예 3, 표 15)의 조합된 유전학적 변형을 포함하는 바실러스 종 세포에 비하여 향상된 단백질 생산성 표현형을 보였음이 본원에서 놀랍게도 관찰되었다.
II. 분자 생물학
상기 제시된 바와 같이, 본 개시내용의 특정 구현예는 고유 yitMOP 오페론을 포함하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래되는 변형된 바실러스 종 세포에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 변형된 바실러스 종 세포는 변형된 yitMOP 오페론을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 변형된 바실러스 종 세포는 파괴된 또는 결실된 yitM 유전자를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 종 세포는 결실된 spdABC 오페론을 추가로 포함한다. 특정 구현예는 부모 바실러스 종 세포를 유전학적으로 변형시켜, 이로부터 변형된 비. 리케니포르미스(딸) 세포를 생성하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 개시내용의 특정 구현예는 (a) 유전자 (또는 이의 ORF)에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 도입, 치환, 또는 제거하거나, 유전자 (또는 이의 ORF)의 전사 또는 번역에 필요한 조절 요소에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 도입, 치환, 또는 제거하는 것, (b) 유전자 파괴, (c) 유전자 전환, (d) 유전자 결실, (e) 유전자 하향 조절, (f) 위치 특이적 돌연변이 유발 및/또는 (g) 무작위 돌연변이 유발을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는 바실러스 종 세포를 유전학적으로 변형시키기 위한 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 바와 같이, 유전학적 변형은 바실러스 종 세포로부터의 하나 이상의 유전자(예를 들어, yitMOP 오페론 및/또는 spdABC 오페론 중 하나 이상의 유전자)의 변형을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 세포는 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어, 삽입, 파괴, 치환, 또는 결실을 사용해 유전자의 발현을 감소시키거나 제거함으로써 구축된다. 변형 또는 비활성화 대상인 유전자의 부분은, 예를 들어, 코딩 영역이거나 코딩 영역의 발현에 필요한 조절 요소일 수 있다.
이러한 조절 또는 제어 서열의 예는 프로모터 서열 또는 이의 기능적 부분(즉, 핵산 서열의 발현에 영향을 미치기에 충분한 부분)일 수 있다. 변형을 위한 다른 제어 서열은 리더 서열, 프로-펩티드 서열, 신호 서열, 전사 종결인자(transcription terminator), 전사 활성인자(transcriptional activator) 등을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
특정한 다른 구현예에서, 변형된 바실러스 종 세포는 전술한 본 개시내용의 유전자 중 적어도 하나의 발현을 제거하거나 감소시키기 위한 유전자 결실에 의해 구축된다. 유전자 결실 기법은 유전자(들)을 부분적으로 또는 완전하게 제거함으로써 이들의 발현을 제거하거나 비-기능적 (또는 활성이 감소된) 단백질 산물의 발현을 가능하게 한다. 이러한 방법에 있어서, 유전자(들)의 결실은 유전자에 측접하는 5' 및 3' 영역을 인접하여 포함하도록 구축된 플라스미드를 사용하여 상동성 재조합에 의해 달성될 수 있다. 인접한 5' 및 3' 영역은, 예를 들어, 플라스미드가 세포 내에 확립될 수 있게 하는 허용 온도에서 pE194와 같은 온도 감수성 플라스미드 상에서 제2 선택 가능한 마커와 회합되어 바실러스 세포 내로 도입될 수 있다. 그런 다음, 세포를 비-허용 온도로 이동시켜 상동성 측접 영역 중 하나에서 플라스미드가 염색체에 통합된 세포를 선택한다. 플라스미드의 통합에 대한 선택은 제2 선택 가능한 마커에 대한 선택에 의해 시행된다. 통합 후, 세포를 선택하지 않고 여러 세대 동안 허용 온도로 이동시킴으로써 제2 상동성 측접 영역에서의 재조합 이벤트가 자극된다. 세포를 플레이팅하여 단일 콜로니를 수득하고, 선택 가능한 마커 둘 다의 소실에 대해 콜로니를 검사한다(예를 들어, 문헌[Perego, 1993] 참조). 따라서, 당업자는 (예를 들어, yitM, yitO 및 yitP(핵산) 서열 및 이들의 인코딩된 YitM, YitO 및 YitP 단백질 서열을 참조함으로써) 유전자의 코딩 서열 및/또는 유전자의 비-코딩 서열에서 완전한 결실 또는 부분적인 결실에 적합한 뉴클레오티드 영역을 쉽게 식별할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 세포는 전사 또는 이의 번역에 필요한 유전자 또는 조절 요소에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 도입, 치환, 또는 제거함으로써 구축된다. 예를 들어, 뉴클레오티드는 정지 코돈이 도입되거나, 시작 코돈이 제거되거나, 오픈 리딩 프레임이 프레임-시프트되도록 삽입되거나 제거될 수 있다. 이러한 변형은 당업계에 알려진 방법에 따른 위치 지정 돌연변이 유발 또는 PCR에 의해 생산된 돌연변이 유발에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Botstein and Shortle, 1985]; 문헌[Lo et al., 1985]; 문헌[Higuchi et al., 1988]; 문헌[Shimada, 1996]; 문헌[Ho et al., 1989]; 문헌[Horton et al., 1989] 및 문헌[Sarkar and Sommer, 1990] 참조). 따라서, 특정 구현예에서, 본 개시내용의 유전자는 완전한 결실 또는 부분적인 결실에 의해 비활성화된다.
또 다른 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 유전자 전환의 과정에 의해 구축된다(예를 들어, 문헌[Iglesias and Trautner, 1983] 참조). 예를 들어, 유전자 전환 방법에 있어서, 유전자(들)에 상응하는 핵산 서열은 결함 핵산 서열을 생산하도록 시험관 내에서 돌연변이된 다음, 결함 유전자를 생산하도록 부모 바실러스 세포로 형질전환된다. 상동성 재조합에 의해, 결함 핵산 서열은 내인성 유전자를 대체한다. 결함 유전자 또는 유전자 단편이, 결함 유전자를 함유하는 형질전환체의 선택에 사용될 수 있는 마커도 인코딩하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 결함 유전자는 선택 가능한 마커와 회합되어 비-복제 또는 온도 감수성 플라스미드 상에 도입될 수 있다. 플라스미드의 통합에 대한 선택은 플라스미드 복제를 허용하지 않는 조건 하에서 마커에 대한 선택에 의해 시행된다. 유전자 대체(gene replacement)로 이어지는 제2 재조합 이벤트에 대한 선택은 선택 가능한 마커의 소실 및 돌연변이된 유전자의 획득에 대한 콜로니 검사에 의해 시행된다(문헌[Perego, 1993]). 대안적으로, 결함 핵산 서열은 하기 기술된 바와 같이, 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 치환 또는 결실을 함유할 수 있다.
다른 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 유전자의 핵산 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 사용하여 확립된 안티-센스 기법에 의해 구축된다(문헌[Parish and Stoker, 1997]). 보다 구체적으로, 바실러스 세포에 의한 유전자의 발현은 유전자의 핵산 서열에 대해 상보적이면서 세포 내에서 전사될 수 있고 세포 내에서 생산된 mRNA에 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 도입함으로써 감소(하향 조절)되거나 제거될 수 있다. 따라서, 상보적인 안티-센스 뉴클레오티드 서열이 mRNA에 혼성화될 수 있는 조건 하에서는 번역된 단백질의 양이 감소되거나 제거된다. 이러한 안티-센스 방법은 RNA 간섭(RNAi), 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드 등을 포함하되 이들로 한정되지 않으며, 이들 모두는 당업자에게 잘 알려져 있다.
다른 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 CRISPR-Cas9 편집을 통해 생산/구축된다. 예를 들어, YitM 단백질을 인코딩하는 유전자는 DNA 상의 표적 서열에 엔도뉴클레아제를 동원하는 가이드 DNA(예를 들어, NgAgo) 또는 가이드 RNA(예를 들어, Cas9)와 Cpf1 중 어느 하나에 결합함으로써 이들의 표적 DNA를 찾는 핵산 가이드된 엔도뉴클레아제(nucleic acid guided endonucleases)에 의해 파괴(또는 결실 또는 하향 조절)될 수 있으며, 엔도뉴클레아제는 DNA 내에 단일 또는 이중 가닥 파단을 생성할 수 있다. 이 표적화된 DNA 파단은 DNA 복구를 위한 기질이 되고, 제공된 편집 주형과 재조합되어 유전자를 파괴하거나 결실할 수 있다. 예를 들어, 핵산 가이드된 엔도뉴클레아제(이 경우, 에스. 피오게네스 유래의 Cas9)를 인코딩하는 유전자 또는 Cas9 뉴클레아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 유전자는 바실러스 세포에서 활성인 프로모터 및 바실러스 세포에서 활성인 종결인자에 작동 가능하게 연결되어 바실러스 Cas9 발현 카세트를 생산한다. 마찬가지로, 관심 유전자에 대해 고유한 하나 이상의 표적 부위가 당업자에 의해 쉽게 식별된다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 사용하여 관심 유전자 내의 표적 부위에 지향된 gRNA를 인코딩하는 DNA 구축물을 제조하기 위해, 가변 표적화 도메인(VT)은 (PAM) 프로토스페이서 인접 모티프(NGG)의 5'에 있는 표적 부위의 뉴클레오티드를 포함할 것이며, 이 뉴클레오티드는 에스. 피오게네스 Cas9에 대한 Cas9 엔도뉴클레아제 인식 도메인(CER)을 인코딩하는 DNA에 융합된다. VT 도메인을 인코딩하는 DNA와 CER 도메인을 인코딩하는 DNA의 조합에 의해 gRNA를 인코딩하는 DNA가 생산된다. 따라서, gRNA를 인코딩하는 DNA를 바실러스 세포에서 활성인 프로모터 및 바실러스 세포에서 활성인 종결인자에 작동 가능하게 연결함으로써 gRNA에 대한 바실러스 발현 카세트가 생성된다.
특정 구현예에서, 엔도뉴클레아제에 의해 유도된 DNA 파단은 유입 서열로 복구/대체된다. 예를 들어, 전술한 Cas9 발현 카세트 및 gRNA 발현 카세트에 의해 생산된 DNA 파단을 정밀하게 복구하기 위해 뉴클레오티드 편집 주형을 제공하여, 세포의 DNA 복구 기구(DNA repair machinery)가 편집 주형을 사용할 수 있도록 한다. 예를 들어, 표적화된 유전자의 5'에 있는 약 500 bp를 표적화된 유전자의 3'에 있는 약 500 bp에 융합하여, 편집 주형을 생성할 수 있고, 이 주형은 바실러스 숙주의 기구에 의해 사용되어 RGEN에 의해 생성된 DNA 파단을 복구한다.
Cas9 발현 카세트, gRNA 발현 카세트 및 편집 주형은 많은 상이한 방법을 사용해 세포에 동시-전달될 수 있다. 형질전환된 세포는 표적 유전자의 유전자좌를 증폭시키는 PCR에 의해 정방향 및 역방향 프라이머로 유전자좌를 증폭시킴으로써 스크리닝된다. 이들 프라이머는 야생형 유전자좌 또는 RGEN에 의해 편집된 변형된 유전자좌를 증폭시킬 수 있다. 그런 다음, 서열결정 프라이머를 사용해 이들 단편을 서열결정하여 편집된 콜로니를 식별한다.
또 다른 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 화학적 돌연변이 유발(예를 들어, 문헌[Hopwood, 1970] 참조) 및 전위(transposition)(예를 들어, 문헌[Youngman et al., 1983] 참조)를 포함하되 이들로 한정되지 않는, 당업계에 잘 알려진 방법을 사용해 무작위 또는 특이적 돌연변이 유발에 의해 구축된다. 유전자의 변형은, 부모 세포에서 돌연변이를 유발시키고 유전자의 발현이 감소되거나 제거된 돌연변이체 세포에 대해 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. 특이적이거나 무작위적일 수 있는 돌연변이 유발은, 예를 들어, 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발제를 사용하거나, 적합한 올리고뉴클레오티드를 사용하거나, DNA 서열이 PCR에 의한 돌연변이 유발을 거치게 함으로써 수행될 수 있다. 또한, 돌연변이 유발은 이들 돌연변이 유발 방법의 임의의 조합을 사용함으로써 수행될 수 있다.
본 목적에 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발제의 예는 자외선(UV) 조사, 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), N-메틸-N'-니트로소구아니딘(NTG), O-메틸 히드록실아민, 아질산, 에틸 메탄 설포네이트(EMS), 아황산수소나트륨, 포름산, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 이러한 작용제가 사용될 때, 돌연변이 유발은 전형적으로, 적합한 조건 하에 선택된 돌연변이 유발제의 존재 하에 부모 세포를 인큐베이션시켜 돌연변이 유발시키고, 유전자의 발현 감소를 나타내거나 유전자를 발현하지 않는 돌연변이체 세포를 선택함으로써 수행된다.
국제 PCT 공개 제WO2003/083125호는 바실러스 세포를 변형시키기 위한 방법, 예컨대, 이. 콜라이를 우회하기 위해 PCR 융합을 사용한 바실러스 결실 균주 및 DNA 구축물의 생산을 개시하고 있다. PCT 공개 제WO2002/14490호는 바실러스 세포를 변형하기 위한 방법을 개시하고 있으며, 이는 (1) 통합 플라스미드(pComK)의 구축 및 형질전환, (2) 코딩 서열, 신호 서열 및 프로-펩티드 서열의 무작위 돌연변이 유발, (3) 상동성 재조합, (4) 형질전환 DNA에 대한 비-상동성 측접 서열의 추가에 의해 형질전환 효율 증가, (5) 이중 교차 통합(double cross-over integration) 최적화, (6) 위치 지정 돌연변이 유발 및 (7) 마커를 남기지 않는 결실(marker-less deletion)을 포함한다.
당업자는 폴리뉴클레오티드 서열을 박테리아 세포(예를 들어, 이. 콜라이 및 바실러스 종) 내로 도입하는 적합한 방법을 잘 알고 있다(예를 들어, 문헌[Ferrari et al., 1989]; 문헌[Saunders et al., 1984]; 문헌[Hoch et al., 1967]; 문헌[Mann et al., 1986]; 문헌[Holubova, 1985]; 문헌[Chang et al., 1979]; 문헌[Vorobjeva et al., 1980]; 문헌[Smith et al., 1986]; 문헌[Fisher et. al., 1981] 및 문헌[McDonald, 1984]). 실제로, 원형질체 형질전환과 콩그레션(congression)을 포함하는 형질전환, 형질도입, 및 원형질체 융합과 같은 방법이 공지되어 있으며 본 개시내용에서 사용하기에 적합하다. 형질전환 방법은 본 개시내용의 DNA 구축물을 숙주 세포 내에 도입하는 데 특히 바람직하다.
흔히 사용되는 방법에 추가하여, 일부 구현예에서는 숙주 세포가 직접 형질전환된다(즉, DNA 구축물을 숙주 세포 내로 도입하기 전에 이를 증폭하거나 달리 처리하는 데 중간 세포가 사용되지 않음). DNA 구축물을 숙주 세포 내로 도입하는 것은, DNA를 플라스미드 또는 벡터 내로 삽입하지 않고 숙주 세포 내로 도입하는, 당업계에 알려진 물리적 및 화학적 방법을 포함한다. 그러한 방법은 염화칼슘 침전, 전기천공, 네이키드 DNA, 리포좀 등을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 추가의 구현예에서, DNA 구축물은 플라스미드 내로 삽입되지 않고 플라스미드와 동시-형질전환된다. 다른 구현예에서, 선택 마커는 당업계에 알려진 방법에 의해 변형된 바실러스 균주로부터 결실되거나 실질적으로 절제된다(예를 들어, 문헌[Stahl et al., 1984]; 문헌[Palmeros et al., 2000]). 일부 구현예에서, 숙주 염색체로부터 벡터를 분해하면 고유한(indigenous) 염색체 영역이 제거되면서 측접 영역이 염색체 내에 남는다.
바실러스 세포에서 유전자, 이의 오픈 리딩 프레임(ORF) 및/또는 이의 변이체 서열의 발현에 사용하기 위한 프로모터 및 프로모터 서열 영역은 일반적으로 당업자에게 알려져 있다. 본 개시내용의 프로모터 서열은 바실러스 세포에서 이들이 기능성이도록 일반적으로 선택된다. 특정한 예시적인 바실러스 프로모터 서열은 비. 서브틸리스 알칼리성 프로테아제(aprE) 프로모터, 비. 서브틸리스의 a-아밀라아제 프로모터, 비. 아밀로리쿼파시엔스의 a-아밀라아제 프로모터, 비. 서브틸리스 유래의 중성 프로테아제(nprE) 프로모터, 돌연변이 aprE 프로모터(예를 들어, PCT 공개 제WO2001/51643호) 또는 비. 리체니포르미스 또는 기타 관련 바실러스 유래의 임의의 다른 프로모터를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 바실러스 세포에서 다양한 활성(프로모터 세기)을 갖는 프로모터 라이브러리를 스크리닝하고 생산하는 방법은 PCT 공개 제WO2003/089604호에 기술되어 있다.
IV.
관심 단백질의 생산을 위한 변형된 세포의 배양
상기 일반적으로 기술된 바와 같이, 특정 구현예는 증가된 단백질 생산 표현형을 갖는 바실러스 세포를 구축하고 수득하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 따라서, 특정 구현예는 적합한 배지에서 세포를 발효함으로써 바실러스 세포에서 관심 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 당업계에 잘 알려진 발효 방법을 적용하여 본 개시내용의 부모 및 변형된 (딸) 바실러스 세포를 발효시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 세포를 회분식 또는 연속식 발효 조건 하에서 배양한다. 전통적인 회분식 발효는, 배지의 조성을 발효의 시작 시에 설정하고, 발효 동안 변경하지 않는 폐쇄 시스템이다. 발효의 시작 시에, 배지에 원하는 유기체(들)을 접종한다. 이 방법에서, 임의의 구성성분을 시스템에 첨가하지 않고, 발효가 발생하게 한다. 전형적으로, 회분식 발효는 탄소원의 첨가와 관련하여 "회분(batch)"으로서 자격이 제공되며, pH 및 산소 농도와 같은 인자를 제어하기 위한 시도가 종종 이루어진다. 회분식 시스템의 대사산물 및 바이오매스의 조성은 발효가 중단되는 시점까지 지속적으로 변화한다. 전형적인 회분식 배양물 내에서, 세포는 정적 지체기를 지나 고성장 로그기로, 마지막으로는, 성장 속도가 줄어들거나 성장이 멈추는 정지기까지 진행될 수 있다. 비처리될 경우, 정지기에 있는 세포는 결국 사멸한다. 일반적으로, 로그기에 있는 세포는 산물의 대량 생산을 담당한다.
표준 회분식 시스템에 대한 적합한 변형은 "유가식 발효(fed-batch fermentation)" 시스템이다. 전형적인 회분식 시스템의 이러한 변형 방식에서는, 발효가 진행됨에 따라 기질이 증분식으로 첨가된다. 유가식 시스템은 이화대사 억제가 세포의 대사를 저해할 가능성이 있을 때, 그리고 배지 중에 제한된 양의 기질이 있는 것이 바람직한 경우 유용하다. 유가식 시스템에서 실제 기질 농도를 측정하는 것은 어렵고, 따라서 pH, 용존 산소 및 폐가스, 예컨대 CO2의 분압과 같은 측정 가능한 인자의 변화에 기초하여 추산된다. 회분식 및 유가식 발효는 해당 분야에서 일반적이며 공지되어 있다.
연속식 발효는 규정된 발효 배지가 생물 반응기에 연속적으로 첨가되고, 동량의 조정 배지(conditioned medium)가 처리를 위하여 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 연속식 발효는 일반적으로 배양물을 일정한 고밀도로 유지하는데, 이때 세포는 주로 성장의 로그기에 있다. 연속식 발효는 세포 성장 및/또는 산물 농도에 영향을 미치는 하나 이상의 인자의 조절을 허용한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 비율로 유지되며, 다른 모든 파라미터는 조정될 수 있다. 다른 시스템에서는, 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도는 일정하게 유지되는 반면, 성장에 영향을 미치는 다수의 인자는 지속적으로 변경될 수 있다. 연속식 시스템은 정상 상태 성장 조건을 유지하는 데 집중한다. 따라서, 배지의 배출로 인한 세포 소실은 발효에서의 세포 성장 속도로 상쇄되어야 한다. 연속식 발효 공정을 위한 영양소 및 성장 인자를 조절하는 방법뿐만 아니라, 산물 형성 속도를 최대화하기 위한 기법이 산업 미생물학 분야에 잘 알려져 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 바실러스 세포에 의해 발현/생산되는 관심 단백질은 숙주 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 분리하는 것, 또는 필요할 경우 세포를 파괴하는 것 및 상청액을 세포 분획 및 데브리스로부터 제거하는 것을 포함하는 통상적인 절차에 의해 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 전형적으로, 청징 후에, 상청액 또는 여액의 단백질성 성분은 염, 예를 들어, 황산암모늄에 의해 침전된다. 그 후, 침전된 단백질은 가용화되며, 다양한 크로마토그래피 절차, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과에 의해 정제될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포를 회분식 또는 연속식 발효 조건 하에서 배양한다. 전통적인 회분식 발효는, 배지의 조성을 발효의 시작 시에 설정하고, 발효 동안 변경하지 않는 폐쇄 시스템이다. 발효의 시작 시에, 배지에 원하는 유기체(들)을 접종한다. 이 방법에서, 임의의 구성성분을 시스템에 첨가하지 않고, 발효가 발생하게 한다. 전형적으로, 회분식 발효는 탄소원의 첨가와 관련하여 "회분(batch)"으로서 자격이 제공되며, pH 및 산소 농도와 같은 인자를 제어하기 위한 시도가 종종 이루어진다. 회분식 시스템의 대사산물 및 바이오매스의 조성은 발효가 중단되는 시점까지 지속적으로 변화한다. 전형적인 회분식 배양물 내에서, 세포는 정적 지체기를 지나 고성장 로그기로, 마지막으로는, 성장 속도가 줄어들거나 성장이 멈추는 정지기까지 진행될 수 있다. 비처리될 경우, 정지기에 있는 세포는 결국 사멸한다. 일반적으로, 로그기에 있는 세포는 산물의 대량 생산을 담당한다.
표준 회분식 시스템에 대한 적합한 변형은 "유가식 발효(fed-batch fermentation)" 시스템이다. 전형적인 회분식 시스템의 이러한 변형 방식에서는, 발효가 진행됨에 따라 기질이 증분식으로 첨가된다. 유가식 시스템은 이화대사 억제가 세포의 대사를 저해할 가능성이 있을 때, 그리고 배지 중에 제한된 양의 기질이 있는 것이 바람직한 경우 유용하다. 유가식 시스템에서 실제 기질 농도를 측정하는 것은 어렵고, 따라서 pH, 용존 산소 및 폐가스, 예컨대 CO2의 분압과 같은 측정 가능한 인자의 변화에 기초하여 추산된다. 회분식 및 유가식 발효는 해당 분야에서 일반적이며 공지되어 있다.
연속식 발효는 규정된 발효 배지가 생물 반응기에 연속적으로 첨가되고, 동량의 조정 배지(conditioned medium)가 처리를 위하여 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 연속식 발효는 일반적으로 배양물을 일정한 고밀도로 유지하는데, 이때 세포는 주로 성장의 로그기에 있다. 연속식 발효는 세포 성장 및/또는 산물 농도에 영향을 미치는 하나 이상의 인자의 조절을 허용한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 비율로 유지되며, 다른 모든 파라미터는 조정될 수 있다. 다른 시스템에서는, 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도는 일정하게 유지되는 반면, 성장에 영향을 미치는 다수의 인자는 지속적으로 변경될 수 있다. 연속식 시스템은 정상 상태 성장 조건을 유지하는 데 집중한다. 따라서, 배지의 배출로 인한 세포 소실은 발효에서의 세포 성장 속도로 상쇄되어야 한다. 연속식 발효 공정을 위한 영양소 및 성장 인자를 조절하는 방법뿐만 아니라, 산물 형성 속도를 최대화하기 위한 기법이 산업 미생물학 분야에 잘 알려져 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 바실러스 세포에 의해 발현/생산되는 관심 단백질은 숙주 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 분리하는 것, 또는 필요할 경우 세포를 파괴하는 것 및 상청액을 세포 분획 및 데브리스로부터 제거하는 것을 포함하는 통상적인 절차에 의해 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 전형적으로, 청징 후에, 상청액 또는 여액의 단백질성 성분은 염, 예를 들어, 황산암모늄에 의해 침전된다. 그 후, 침전된 단백질은 가용화되며, 다양한 크로마토그래피 절차, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과에 의해 정제될 수 있다.
V.
관심 단백질
본 개시내용의 관심 단백질(POI)은 임의의 내인성 또는 이종 단백질일 수 있으며, 이는 이러한 POI의 변이체일 수 있다. 단백질은 하나 이상의 이황화 가교를 함유할 수 있거나, 기능적 형태가 단량체 또는 다량체인 단백질이며, 즉, 단백질은 4차 구조를 가지며, 복수의 동일한(상동성) 또는 동일하지 않은(이종) 서브유닛으로 구성되되, POI 또는 이의 변이체 POI는 바람직하게는 관심 특성을 갖는 것이다.
예를 들어, 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 세포는 이의 비변형 (부모) 세포에 비해 적어도 약 0.1% 이상, 적어도 약 0.5% 이상, 적어도 약 1% 이상, 적어도 약 5% 이상, 적어도 약 6% 이상, 적어도 약 7% 이상, 적어도 약 8% 이상, 적어도 약 9% 이상 또는 적어도 약 10% 이상 더 많은 POI를 생산한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 세포는 (비변형) 부모 세포에 비해 POI의 비생산성(Qp) 증가를 나타낸다. 예를 들어, 비생산성(Qp)의 검출은 단백질 생산을 평가하는 데 적합한 방법이다. 비생산성(Qp)은 다음 식을 사용하여 결정될 수 있다:
"Qp = gP/gDCW·hr"
여기서, "gP"는 탱크에서 생산된 단백질의 그램수이고, "gDCW"는 탱크 내의 건조 세포 중량(DCW)의 그램수이고, "hr"은 접종 시간으로부터의 발효 시간(h)으로서, 이는 생산 시간 및 성장 시간을 포함한다.
따라서, 특정한 다른 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 세포는 비변형 (부모) 세포에 비해 적어도 약 0.1%, 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10% 이상의 비생산성(Qp) 증가를 포함한다.
특정 구현예에서, POI 또는 이의 변이체 POI는 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르보닉 안하이드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글리코실 하이드롤라아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리가아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 펩티다아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
따라서, 특정 구현예에서, POI 또는 이의 변이체 POI는 효소 위원회(EC) 번호 EC 1, EC 2, EC 3, EC 4, EC 5 또는 EC 6으로부터 선택된 효소이다.
다른 특정 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바실러스 세포는 아밀라아제를 인코딩하는 발현 구축물을 포함한다. 매우 다양한 아밀라아제 효소 및 이의 변이체가 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 국제 PCT 공개 제WO2006/037484호 및 제WO 2006/037483호는 용매 안정성이 개선된 변이체 α-아밀라아제를 기술하고, PCT 공개 제WO1994/18314호는 산화 안정성 α-아밀라아제 변이체를 개시하고, PCT 공개 제WO1999/19467호, 제WO2000/29560호 및 제WO2000/60059호는 터마밀 유사 α-아밀라아제 변이체를 개시하고, PCT 공개 제WO2008/112459호는 바실러스 종 707번으로부터 유래된 α-아밀라아제 변이체를 개시하고, PCT 공개 제WO1999/43794호는 말토게닉 α-아밀라아제 변이체를 개시하고, PCT 공개 제WO1990/11352호는 초-내열성 α-아밀라아제 변이체를 개시하며, PCT 공개 제WO2006/089107호는 과립 전분 가수분해 활성을 갖는 α-아밀라아제 변이체 등을 개시한다.
세포내 및 세포외 발현된 단백질의 활성을 검출 및 측정하기 위한 다양한 검정법이 당업자에게 공지되어 있다.
PCT 공개 제WO2014/164777호는 본원에 기재된 아밀라아제 활성을 검출하는데 유용한 세랄파(Ceralpha) α-아밀라아제 활성 검정법을 개시한다.
V.
예시적인 구현예
본 개시내용의 비제한적인 구현예는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
1. (a) 내인성 POI를 생산하는 부모 바실러스 종 세포를 수득하는 단계, (b) yitMOP 오페론을 결실시키거나 파괴함으로써 부모 바실러스 종 세포를 유전학적으로 변형시키는 단계, 및 (c) 변형된 세포를 POI의 생산을 위한 적합한 조건 하에서 발효시키는 단계를 포함하는, 변형된 바실러스 종 세포에서의 증가된 양의 내인성 관심 단백질(POI)의 생산 방법으로서, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 내인성 POI를 생산하는, 방법.
2. (a) 내인성 POI를 생산하는 부모 바실러스 종 세포를 수득하는 단계, (b) yitMOP 오페론 및 sdpABC 오페론을 결실시키거나 파괴함으로써 부모 바실러스 종을 유전학적으로 변형시키는 단계, 및 (c) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건 하에서 발효시키는 단계를 포함하는, 변형된 바실러스 종 세포에서의 증가된 양의 내인성 관심 단백질(POI)의 생산 방법으로서, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 내인성 POI를 생산하는, 방법.
3. (a) 내인성 POI를 생산하는 부모 바실러스 종 세포를 수득하는 단계, (b) yitMOP 오페론의 조절 영역을 결실시키거나 파괴함으로써 부모 바실러스 종 세포를 유전학적으로 변형시켜, 변형된 세포에서 기능적 YitM, YitO 및/또는 YitP 단백질의 생산이 결핍되게 하는 단계, 및 (c) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건 하에서 발효시키는 단계를 포함하는 변형된 바실러스 종 세포에서의 증가된 양의 내인성 관심 단백질(POI)의 생산 방법으로서, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 내인성 POI를 생산하는, 방법.
4. (a) 내인성 POI를 생산하는 부모 바실러스 종 세포를 수득하는 단계, (b) yitM 유전자를 파괴하거나 결실시킴으로써 부모 세포를 유전학적으로 변형시키는 단계, 및 (c) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건 하에서 발효시키는 단계를 포함하는 변형된 바실러스 종 세포에서의 증가된 양의 내인성 관심 단백질(POI)의 생산 방법으로서, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 내인성 POI를 생산하는, 방법.
5. (a) 내인성 POI를 생산하는 부모 바실러스 종 세포를 수득하는 단계, (b) yitM 유전자의 조절 영역을 결실시키거나 파괴함으로써 부모 바실러스 종 세포를 유전학적으로 변형시켜, 변형된 세포에서 기능적 YitM 단백질의 생산이 결핍되게 하는 단계, 및 (c) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건 하에서 발효시키는 단계를 포함하는 변형된 바실러스 종 세포에서의 증가된 양의 내인성 관심 단백질(POI)의 생산 방법으로서, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 내인성 POI를 생산하는, 방법.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 한 구현예에 있어서, 바실러스 종 세포가 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스, 비. 브레비스, 비. 스테아로써모필러스, 비. 알칼로필러스, 비. 아밀로리쿼파시엔스, 비. 클라우시이, 비. 할로두란스, 비. 메가테리움, 비. 코아귤란스, 비. 써큘란스, 비. 라우투스 및 비. 튜링기엔시스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
7. 구현예 6에 있어서, 바실러스 종 세포가 비. 서브틸리스인, 방법.
8. 구현예 6에 있어서, 바실러스 종 세포가 비. 아밀로리쿼파시엔스인, 방법.
9. 구현예 1 내지 5 중 어느 한 구현예에 있어서, POI가 효소인, 방법.
10. 구현예 7에 있어서, 효소가 프로테아제 또는 아밀라아제인, 방법.
11. 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 있어서, yitMOP 오페론이 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 38과 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는 YitM 폴리펩티드, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 36과 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는 YitO 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 34와 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는 YitP 폴리펩티드를 인코딩하는, 방법.
12. 구현예 4 또는 5에 있어서, yitM 유전자가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 37의 yitM 유전자와 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는, 방법.
13. 구현예 4 또는 구현예 5에 있어서, yitM 유전자가 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 38의 YitM 폴리펩티드와 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는 YitM 폴리펩티드를 인코딩하는, 방법.
14. 구현예 3 내지 5 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 세포가 sdpABC 오페론의 결실 또는 파괴를 추가로 포함하는, 방법.
15. (a) 이종 POI를 인코딩하는 도입된 발현 카세트를 포함하는 부모 바실러스 종 세포를 구축하는 단계, (b) yitMOP 오페론을 결실시키거나 파괴함으로써 부모 세포를 유전학적으로 변형시키는 단계, 및 (c) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건 하에서 발효시키는 단계를 포함하는 변형된 바실러스 종 세포에서의 증가된 양의 이종 관심 단백질(POI)의 생산 방법으로서, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 이종 POI를 생산하는, 방법.
16. (a) 이종 POI를 인코딩하는 도입된 발현 카세트를 포함하는 부모 바실러스 종 세포를 구축하는 단계, (b) yitMOP 오페론 및 sdpABC 오페론을 결실시키거나 파괴함으로써 부모 바실러스 종을 유전학적으로 변형시키는 단계, 및 (c) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건 하에서 발효시키는 단계를 포함하는 변형된 바실러스 종 세포에서의 증가된 양의 이종 관심 단백질(POI)의 생산 방법으로서, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 이종 POI를 생산하는, 방법.
17. (a) 이종 POI를 인코딩하는 도입된 발현 카세트를 포함하는 부모 바실러스 종 세포를 구축하는 단계, (b) yitMOP 오페론의 조절 영역을 결실시키거나 파괴함으로써 부모 바실러스 종 세포를 유전학적으로 변형시켜 변형된 세포에서 기능적 YitM, YitO 및/또는 YitP 단백질의 생산이 결핍되게 하는 단계, 및 (c) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건 하에서 발효시키는 단계를 포함하는 변형된 바실러스 종 세포에서의 증가된 양의 이종 관심 단백질(POI)의 생산 방법으로서, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 이종 POI를 생산하는, 방법.
18. (a) 이종 POI를 인코딩하는 도입된 발현 카세트를 포함하는 부모 바실러스 종 세포를 구축하는 단계, (b) yitM 유전자를 파괴하거나 결실시킴으로써 부모 세포를 유전학적으로 변형시키는 단계, 및 (c) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건 하에서 발효시키는 단계를 포함하는 변형된 바실러스 종 세포에서의 증가된 양의 이종 관심 단백질(POI)의 생산 방법으로서, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 이종 POI를 생산하는, 방법.
19. (a) 이종 POI를 인코딩하는 도입된 발현 카세트를 포함하는 부모 바실러스 종 세포를 구축하는 단계, (b) yitM 유전자의 조절 영역을 결실시키거나 파괴함으로써 부모 바실러스 종 세포를 유전학적으로 변형시켜, 변형된 세포에서 기능적 YitM 단백질의 생산이 결핍되게 하는 단계, 및 (c) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건 하에서 발효시키는 단계를 포함하는 변형된 바실러스 종 세포에서의 증가된 양의 이종 관심 단백질(POI)의 생산 방법으로서, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 이종 POI를 생산하는, 방법.
20. 구현예 15 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (a) 및 (b)가 동시에 수행되는, 방법.
21. 구현예 15 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, 바실러스 종 세포가 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스, 비. 브레비스, 비. 스테아로써모필러스, 비. 알칼로필러스, 비. 아밀로리쿼파시엔스, 비. 클라우시이, 비. 할로두란스, 비. 메가테리움, 비. 코아귤란스, 비. 써큘란스, 비. 라우투스 및 비. 튜링기엔시스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
22. 구현예 21에 있어서, 바실러스 종 세포가 비. 서브틸리스인, 방법.
23. 구현예 21에 있어서, 바실러스 종 세포가 비. 아밀로리쿼파시엔스인 방법.
24. 구현예 15 내지 19 중 어느 한 구현예에서, 이종 POI가 효소인, 방법.
25. 구현예 24에 있어서, 효소가 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르보닉 안하이드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글리코실 하이드롤라아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리가아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 펩티다아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제 및 헥소스 옥시다아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
26. 구현예 15 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, yitMOP 오페론이 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 38과 적어도 80% 서열 동일성을 포함하는 YitM 폴리펩티드, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 36과 적어도 80% 서열 동일성을 포함하는 YitO 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 34와 적어도 80% 서열 동일성을 포함하는 YitP 폴리펩티드를 인코딩하는, 방법.
27. 구현예 18 또는 19에 있어서, yitM 유전자가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 37의 yitM 유전자와 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는, 방법.
28. 구현예 18 또는 19에 있어서, yitM 유전자가 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 38의 YitM 폴리펩티드와 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는 YitM 폴리펩티드를 인코딩하는, 방법.
29. 구현예 17 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 세포가 sdpABC 오페론의 결실 또는 파괴를 추가로 포함하는, 방법.
30. 구현예 1 내지 5 중 어느 한 구현예의 방법에 따라 생산되는 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포 또는 구현예 15 내지 19 중 어느 한 구현예의 방법에 따라 생산되는 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포.
31. 내인성 관심 단백질(POI)을 생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래된 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포로서, 변형된 세포가 결실되거나 파괴된 yitMOP 오페론을 포함하며, 변형된 세포가 POI의 생산에 적합한 조건 하에서 발효되는 경우 부모 세포에 비하여 증가된 양의 내인성 POI를 생산하는 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포.
32. 내인성 관심 단백질(POI)을 생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래된 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포로서, 변형된 세포가 결실되거나 파괴된 yitMOP 오페론 및 결실되거나 파괴된 sdpABC 오페론을 포함하며, POI의 생산을 위해 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 내인성 POI를 생산하는 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포.
33. 내인성 관심 단백질(POI)을 생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래된 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포로서, 변형된 세포에서 기능적 YitM, YitO 및/또는 YitP 단백질의 생산이 결핍되게 하는 yitMOP 오페론의 결실된 또는 파괴된 조절 영역을 포함하며, POI의 생산을 위해 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 내인성 POI를 생산하는 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포.
34. 내인성 관심 단백질(POI)을 생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래된 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포로서, 변형된 세포가 결실된 또는 파괴된 yitM 유전자를 포함하며, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 내인성 POI를 생산하는 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포.
35. 내인성 관심 단백질(POI)을 생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래된 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포로서, 변형된 세포에서 기능적 YitM 단백질의 생산이 결핍되게 하는 yitM 유전자의 결실된 또는 파괴된 조절 영역을 포함하며, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 내인성 POI를 생산하는 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포.
36. 구현예 31 내지 35 중 어느 한 구현예에 있어서, 바실러스 종 세포가 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스, 비. 브레비스, 비. 스테아로써모필러스, 비. 알칼로필러스, 비. 아밀로리쿼파시엔스, 비. 클라우시이, 비. 할로두란스, 비. 메가테리움, 비. 코아귤란스, 비. 써큘란스, 비. 라우투스 및 비. 튜링기엔시스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 세포.
37. 구현예 36에 있어서, 바실러스 종 세포가 비. 서브틸리스인, 변형된 세포.
38. 구현예 36에 있어서, 바실러스 종 세포가 비. 아밀로리쿼파시엔스인, 변형된 세포.
39. 구현예 29 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, POI가 효소인, 변형된 세포.
40. 구현예 39에 있어서, 효소가 프로테아제 또는 아밀라아제인, 변형된 세포.
41. 구현예 31 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, yitMOP 오페론이 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 38과 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는 YitM 폴리펩티드, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 36과 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는 YitO 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 34와 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는 YitP 폴리펩티드를 인코딩하는, 변형된 세포.
42. 구현예 34 또는 35에 있어서, yitM 유전자가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 37의 yitM 유전자와 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는, 변형된 세포.
43. 구현예 34 또는 35에 있어서, yitM 유전자가 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 38의 YitM 폴리펩티드와 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는 YitM 폴리펩티드를 인코딩하는, 변형된 세포.
44. 구현예 33 내지 35 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 세포가 sdpABC 오페론의 결실 또는 파괴를 추가로 포함하는, 변형된 세포.
45. 이종 관심 단백질(POI)을 인코딩하는 도입된 발현 카세트를 포함하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래된 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포로서, 변형된 세포가 결실되거나 파괴된 yitMOP 오페론을 포함하며, POI의 생산을 위해 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 이종 POI를 생산하는, 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포.
46. 이종 관심 단백질(POI)을 인코딩하는 도입된 발현 카세트를 포함하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래된 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포로서, 변형된 세포가 결실되거나 파괴된 yitMOP 오페론 및 결실되거나 파괴된 sdpABC 오페론을 포함하며, POI의 생산을 위해 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 내인성 POI를 생산하는, 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포.
47. 이종 관심 단백질(POI)을 인코딩하는 도입된 발현 카세트를 포함하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래된 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포로서, 변형된 세포에서 기능적 YitM, YitO 및/또는 YitP 단백질의 생산이 결핍되게 하는 yitMOP 오페론의 결실되거나 파괴된 조절 영역을 포함하며, POI의 생산을 위해 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 내인성 POI를 생산하는, 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포.
48. 이종 관심 단백질(POI)을 인코딩하는 도입된 발현 카세트를 포함하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래된 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포로서, 변형된 세포가 결실되거나 파괴된 yitM 유전자를 포함하며, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 내인성 POI를 생산하는, 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포.
49. 이종 관심 단백질(POI)을 인코딩하는 도입된 발현 카세트를 포함하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래된 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포로서, 변형된 세포에서 기능적 YitM 단백질의 생산이 결핍되게 하는 yitM 유전자의 결실되거나 파괴된 조절 영역을 포함하며, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 내인성 POI를 생산하는, 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포.
50. 구현예 45 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, 바실러스 종 세포가 비. 서브틸리스, 비. 리체니포르미스, 비. 렌투스, 비. 브레비스, 비. 스테아로써모필러스, 비. 알칼로필러스, 비. 아밀로리쿼파시엔스, 비. 클라우시이, 비. 할로두란스, 비. 메가테리움, 비. 코아귤란스, 비. 써큘란스, 비. 라우투스 및 비. 튜링기엔시스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 세포.
51. 구현예 50에 있어서, 바실러스 종 세포가 비. 서브틸리스인, 변형된 세포.
52. 구현예 50에 있어서, 바실러스 종 세포가 비. 아밀로리쿼파시엔스인, 변형된 세포.
53. 구현예 45 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, POI가 효소인, 변형된 세포.
54. 구현예 53에 있어서, 효소가 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르보닉 안하이드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글리코실 하이드롤라아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리가아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 펩티다아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제 및 헥소스 옥시다아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 세포.
55. 구현예 45 내지 47 중 어느 한 구현예에 있어서, yitMOP 오페론이 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 38과 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는 YitM 폴리펩티드, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 36과 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는 YitO 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 34와 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는 YitP 폴리펩티드를 인코딩하는, 변형된 세포.
56. 구현예 48 또는 49에 있어서, yitM 유전자가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 37의 yitM 유전자와 적어도 80% 서열 동일성을 포함하는, 변형된 세포.
57. 구현예 48 또는 49에 있어서, yitM 유전자가 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 38의 YitM 폴리펩티드와 적어도 80% 서열 동일성을 포함하는 YitM 폴리펩티드를 인코딩하는, 변형된 세포.
58. 구현예 47 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 세포가 sdpABC 오페론의 결실 또는 파괴를 추가로 포함하는, 변형된 세포.
59. 구현예 3, 5, 17 또는 19 중 어느 한 구현예에 있어서, 결실된 또는 파괴된 조절 영역이 프로모터 서열인, 방법.
60. 구현예 59에 있어서, 프로모터 서열이 SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 39 및 SEQ ID NO: 40으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는, 방법.
61. 구현예 33, 35, 47 또는 49에 있어서, 결실된 또는 파괴된 조절 영역이 프로모터 서열인, 변형된 세포.
62. 구현예 61에 있어서, 프로모터 서열이 SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 39 및 SEQ ID NO: 40으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 60% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는, 변형된 세포.
실시예
본 개시내용의 특정 양태는 다음 실시예를 고려하여 추가로 이해될 수 있는데, 이는 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 재료 및 방법에 대한 변형은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 1
바실러스 세포에서의
yitMOP
오페론의 결실
일반적으로 상기 제시되고 기재된 바와 같이, yitMOP로 명명되는 신규한 비. 서브틸리스 상호포식 오페론을 FNA 프로테아제를 발현하는 비. 서브틸리스 균주의 전사체 분석을 통해 고도로 발현되는 전사물로서 확인하였다. 더욱 특별히, 도 1a 및 도 1b에 제시된 바와 같이, 비. 서브틸리스 yitMOP 오페론은 YitM 단백질(SEQ ID NO: 2), YitO 단백질(SEQ ID NO: 4) 및 YitP 단백질(SEQ ID NO: 6)을 인코딩한다. 본 실시예에는 부모 비. 서브틸리스 세포에서의 yitMOP 오페론의 결실이 기재되어 있다. 예를 들어, 변형된 비. 서브틸리스 (딸) 세포를 생성하기 위하여, "pUCyitMOP:spec"로 명명된 플라스미드를 구축하여, 비. 서브틸리스에서 yitMOP 오페론을 결실시켰다. 예를 들어, pUCyitMOP:spec 플라스미드를 구축하여, 비. 서브틸리스 내의 전체 yitMOP 오페론을 스펙티노마이신 내성(specR) 마커 유전자에 이어서 loxP 부위로 대체하였다(본원에서, "loxP-specR-loxP 카세트"). 따라서, 상류(5') 서열을 하기 표 1에 제시된 oJKL228(SEQ ID NO: 7) 및 oJKL229(SEQ ID NO: 8) 프라이머를 사용하여 비. 서브틸리스(균주 168) 게놈 DNA(gDNA)로부터 증폭시켰다.
하류(3') 상동성 서열을 하기 표 2에 제시된 oJKL232(SEQ ID NO: 9) 및 oJKL233(SEQ ID NO: 10) 프라이머를 사용하여 비. 서브틸리스(균주 168) gDNA로부터 증폭시켰다.
loxP-specR-loxP 카세트를 하기 표 3에 제시된 oJKL230(SEQ ID NO: 11) 및 oJKL231(SEQ ID NO: 12)을 사용하여 Topo-specR 벡터로부터 증폭시켰다. Topo-specR 벡터는 고유 프로모터 및 종결인자 요소를 갖는 스펙티노마이신 아데닐트랜스퍼라제 유전자(specR)를 포함하며, 이 유전자를 Invitrogen Topo 벡터 블런트 내로 클로닝하고, 이를 사용하여 이. 콜라이 TOP10 세포를 형질전환시켰다.
pUC 벡터 백본을 하기 표 4에 제시된 oJKL226(SEQ ID NO: 13) 및 oJKL227(SEQ ID NO: 14) 프라이머를 사용하여, 제조처의 설명에 따라 GeneArt Seamless 클로닝 키트로부터 수득된 pUCL 단편으로부터 증폭시켰다.
벡터 단편을 Gibson 클로닝 키트를 사용하여 어셈블시키고, 이를 사용하여 이. 콜라이를 형질전환시켰다. 벡터의 상류(5') 및 하류(3') 상동성 섹션을 하기 표 5에 제시된 정방향(M13F; SEQ ID NO: 15) 및 역방향(M13R; SEQ ID NO: 16) 프라이머를 사용하여 서열 확인하였다.
서열 확인된 벡터를 단리하고, AatII를 사용하여 선형화시켰으며, 이어서, 선형화된 벡터를 사용하여 비. 서브틸리스 세포를 형질전환시켰다. 이어서, 결실을 PCR을 사용하여 확인하였으며, 하기 표 6에 제시된 oJKL246(SEQ ID NO: 17) 및 5' spec out(SEQ ID NO: 18) 프라이머를 사용하여 상류(5') 통합 접합부를 확인하였다.
하기 표 7에 제시된 oJKL247(SEQ ID NO: 19) 및 3' spec out(SEQ ID NO: 20) 프라이머를 사용하여 하류 통합 접합부를 확인하였다.
실시예 2
sdpABC
오페론의 결실
본 실시예에는 "pUCsdp::tet"로 명명된 플라스미드의 구축 및 비. 서브틸리스 세포 내로의 이의 도입이 기재된다. 더욱 구체적으로, 비. 서브틸리스 세포에서 전체 sdpABC 오페론을 loxP 부위가 측접한 테트라사이클린(tetR) 마커(본원에서, "loxP-tetR-loxP 카세트")로 대체하도록 상류(5') 및 하류(3') DNA 서열을 포함하는 pUCsdp::tet 플라스미드를 구축하였으며, 테트라사이클린 마커의 제거는 sdpABC 오페론의 결실을 초래한다.
따라서, 상류(5') sdpABC 서열을 하기 표 8에 제시된 oJKL220(SEQ ID NO: 21) 및 oJKL221(SEQ ID NO: 22) 프라이머를 사용하여 비. 서브틸리스 gDNA로부터 증폭시켰다.
하류(3') 서열을 하기 표 9에 제시된 oJKL224(SEQ ID NO: 23) 및 oJKL225(SEQ ID NO: 24) 프라이머를 사용하여 비. 서브틸리스 gDNA로부터 증폭시켰다.
loxP-tetR-loxP 카세트를 하기 표 10에 제시된 oJKL222(SEQ ID NO: 25) 및 oJKL223(SEQ ID NO: 26) 프라이머를 사용하여 플라스미드 pUCLlacA-ganAB::tet로부터 증폭시켰다.
pUC19 벡터 백본을 하기 표 11에 제시된 oJKL218(SEQ ID NO: 27) 및 oJKL219(SEQ ID NO: 28) 프라이머를 사용하여 제조처의 설명에 따라 Life Technologies로부터의 GeneArt Linear pUC19L 벡터로부터 증폭시켰다.
상류, 하류, loxP-tetR-loxP 및 pUC19 앰플리콘을 제조처의 설명에 따라 NEB Gibson 키트를 사용하여 함께 융합시켰다. 이어서, 서열결정된 입증된 플라스미드를 AatII를 사용하여 선형화시켰으며, 이를 사용하여 비. 서브틸리스 세포를 형질전환시켰다. 게놈 sdp 오페론 결실(Δsdp:loxP-tetR-loxP)을 cPCR을 사용하여 확인하였으며, 하기 표 12에 제시된 oJKL 238(SEQ ID NO: 29) 및 tet 3' out(SEQ ID NO: 30) 프라이머를 사용하여 상류 통합 부위를 점검하였다.
하류 부위를 하기 표 13에 제시된 oJKL 239(SEQ ID NO: 31) 및 tet 5' out(SEQ ID NO: 32) 프라이머를 사용하여 점검하였다.
본원에 구축된 비. 서브틸리스 세포(균주)의 균주 명칭 및 간단한 설명이 하기 표 14에 제시되며, 하기 실시예 3에 추가로 기재된다.
실시예 3
변형된 비. 서브틸리스 세포에서의 이종 프로테아제 생산
본 실시예에는 비. 서브틸리스 세포에서의 이종 관심 단백질(POI)의 생산이 기재된다. 더욱 특별히, 부모(ZM207) 및 변형된 비. 서브틸리스 균주를 구축하였으며, 상기 실시예 1 및 2(예를 들어, 표 14 참조)에 기재되어 있으며, 42℃에서 사십(40)시간 동안 진탕 플라스크에서 동일한 조건 하에 Grant's II 배지에서 발효시켰다. Bacillus Genetic Stock Center로부터 수득된 균주 BKE11040(trpC2 yitM::erm)의 게놈 DNA를 부모 균주(ZM207) 내로 형질전환시킴으로써 ZM434로 명명된 비. 서브틸리스 딸 균주(ΔyitM)를 구축하였다.
이후에, 발효 상청액을 취하고, AAPF-검정(예를 들어, 본원에 전체가 참조로 포함되는 PCT 공개 제WO2018/118815호 참조)을 사용하여 ME-3 프로테아제 활성을 결정하고, 405 nm에서의 흡광도의 변화에 의해 모니터링하였다. 흡광도 변화의 기울기(mOD/분)는 ME-3 프로테아제 활성을 반영하였으며, 비교를 위하여 본원에 기록된다. 더욱 특별히, 하기 표 15에는 다중(n≥3) 생물학적 반복검증의 평균 ME-3 역가 및 표준 오차가 제시되어 있다.
예를 들어, 표 15에 나타낸 바와 같이, ZM334(ΔsdpABC) 딸 균주 및 ZM336(ΔyitMOP) 딸 균주 둘 모두가 ZM207 부모 균주에 비하여 증가된 양의 프로테아제를 생산하였다. 유사하게, yitMOP 및 sdpABC 오페론의 조합된 결실(즉, ΔyitMOP + ΔsdpABC)을 포함하는 변형된 ZM268 균주(표 15)는 ZM207(대조군) 균주, ZM334 균주(ΔsdpABC) 및 ZM336 균주(ΔyitMOP)에 비하여 증가된 양의 ME-3 프로테아제를 생산한다.
또한, ZM434(ΔyitM) 딸 균주가 ZM336(ΔyitMOP) 딸 균주보다 약간 더 많은 ME-3 프로테아제를 생산하였기 때문에, 단독의 yitM ORF의 파괴 또는 결실이 증가된 단백질 생산의 유리한 효과를 유도하기에 충분하였음이 놀랍게도 관찰되었다(표 15).
실시예 4
변형된 비. 서브틸리스 세포에서의 이종 프로테아제 생산
본 실시예에는 대규모 발효 조건 하의 부모 및 변형된 비. 서브틸리스 세포에서의 이종 프로테아제(V42)의 생산이 기재된다. 더욱 특별히, 본원에 기재된 바와 같이, CB24-12로 명명된 비. 서브틸리스 균주는 알라닌 라세마제 유전자(alrA)를 인코딩하는 ORF의 상류(5')에 존재하는 이에 작동 가능하게 연결된 V42 프로테아제를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)의 상류(5')에 위치하는, 이에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열 "P4"를 포함하는 도입된 발현 카세트를 포함하며, 카세트는 비. 서브틸리스 aprE 유전자좌 내로 통합된다(aprE::P4-V42-alrA). 마찬가지로, "JL77"로 명명되는 비. 서브틸리스 균주는 V42 프로테아제를 인코딩하는 도입된 발현 카세트(aprE::P4-V42-alrA) 및 yitMOP 오페론 및 sdpABC 오페론의 조합된 결실(ΔyitMOP + ΔsdpABC)을 포함한다.
따라서, 도 2에 제시된 바와 같이, JL77 균주 및 CB24-12 균주의 세포를 표준 조건 하에 대규모 발효기에서 시험하였으며, 각각의 균주를 2벌로 시행하였으며, 발효의 마지막(EOF)에 V42 프로테아제 생산의 평균 개선이 나타나 있다. 예를 들어, 도 2에 제시된 바와 같이, JL77 균주에 대한 발효의 마지막의 V42 프로테아제 생산의 평균 증가는 발효의 마지막에 CB24-12 균주에 의해 생산되는 V42 프로테아제의 양에 비하여 대략 10%였다.
SEQUENCE LISTING
<110> DANISCO US INC.
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCED PROTEIN PRODUCTION IN
BACILLUS CELLS
<130> NB41375-WO-PCT
<150> US 62/933,536
<151> 2019-11-11
<160> 47
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 585
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 1
ttgaagaagg cgtttctagt atttttgtcg gttgtattgg tgacgactgt gtttttggtg 60
aagcagcaag aaagtgtggc acaggcaaag cagcttgagt attcaggtga ggaaattttt 120
aaaggctttg tgtttgccca aggggaagtt ggcaaacagc ttccagaggt ctttaataaa 180
gcgatgacag acaaactcaa cacaaaacag gcaaaggctt ttgccaatca ggttgtcgct 240
gatattaaaa aagaggatgc tgactttttt gataacctga agaaagctgt ttacagcaaa 300
gatgcattga aagtggatga actgctgaaa aaagcaggtc aaatcgttga agaaaaagta 360
gaagctgcaa aggaaatcgc cgcttctaag gatgatacat ccagagttca ggccgagctt 420
gtcaacactg ttgataccgc taactatttc tattatgttt cttatgttgc tgcagcaggt 480
gccctgattc tgatcattct cgccattgat attacgccga ttgcgatttc agacaatgtg 540
gatcgcgaaa tggcaatcag aacgctggtt gatgaattaa actag 585
<210> 2
<211> 194
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 2
Met Lys Lys Ala Phe Leu Val Phe Leu Ser Val Val Leu Val Thr Thr
1 5 10 15
Val Phe Leu Val Lys Gln Gln Glu Ser Val Ala Gln Ala Lys Gln Leu
20 25 30
Glu Tyr Ser Gly Glu Glu Ile Phe Lys Gly Phe Val Phe Ala Gln Gly
35 40 45
Glu Val Gly Lys Gln Leu Pro Glu Val Phe Asn Lys Ala Met Thr Asp
50 55 60
Lys Leu Asn Thr Lys Gln Ala Lys Ala Phe Ala Asn Gln Val Val Ala
65 70 75 80
Asp Ile Lys Lys Glu Asp Ala Asp Phe Phe Asp Asn Leu Lys Lys Ala
85 90 95
Val Tyr Ser Lys Asp Ala Leu Lys Val Asp Glu Leu Leu Lys Lys Ala
100 105 110
Gly Gln Ile Val Glu Glu Lys Val Glu Ala Ala Lys Glu Ile Ala Ala
115 120 125
Ser Lys Asp Asp Thr Ser Arg Val Gln Ala Glu Leu Val Asn Thr Val
130 135 140
Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Tyr Tyr Val Ser Tyr Val Ala Ala Ala Gly
145 150 155 160
Ala Leu Ile Leu Ile Ile Leu Ala Ile Asp Ile Thr Pro Ile Ala Ile
165 170 175
Ser Asp Asn Val Asp Arg Glu Met Ala Ile Arg Thr Leu Val Asp Glu
180 185 190
Leu Asn
<210> 3
<211> 930
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 3
atgctcgaaa acataaaaca gaccatcacc agatgggacg aaagaaaccc gtggacaaat 60
gtatatggcc tcgcgcgaag catcattgcg ctatccagcc tgctgacgct gctcatcaat 120
cacccgagcc tcattatgaa gccagccagc gggatcagca gctatccagc ttgtaaaatg 180
aatctcagtc tcttttgtct cggcgaaaat aactatatga tgttaaatct tttcagatgg 240
gtctgcattg ccattctggt gcttgttgtc attggctggc gccccagaat caccggggtt 300
ctgcattggt atgtcagtta cagcctgcag tcatcgctga tcgtcatcga cggaggcgag 360
caggcagcag cagtcatgac ctttttattg cttcccatca cgctgaccga tccgagaaaa 420
tggcattgga gtacgagacc tatagagggc aaaagaacac ttggaaaaat aacagctttt 480
atttcttatt ttgtgatcag aatccaagtg gcggtgcttt attttcactc taccgtcgct 540
aagctatctc agcaggaatg ggtggacgga acggccgtct attatttcgc ccaggaaaaa 600
accattggct tcaacggctt ttttcaggcg ttaacgaagc caattgtaac aagtccgttc 660
gtggtgattc cgacatgggg gacgctgctg gttcaaattg tcatcttcgc ggcactgttt 720
gcgccgaaga agcattggag attgattttg atcatcgctg tttttatgca tgagattttt 780
gcagtcatgc tgggcctcat cagtttttcg attatcatgg ccggcatttt gatattgtat 840
ctcactccta tcgattccac gattcaattt acatatattc gcagactgtt gtggaataaa 900
aaacacaaga agggagaggt ttcagtttga 930
<210> 4
<211> 309
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 4
Met Leu Glu Asn Ile Lys Gln Thr Ile Thr Arg Trp Asp Glu Arg Asn
1 5 10 15
Pro Trp Thr Asn Val Tyr Gly Leu Ala Arg Ser Ile Ile Ala Leu Ser
20 25 30
Ser Leu Leu Thr Leu Leu Ile Asn His Pro Ser Leu Ile Met Lys Pro
35 40 45
Ala Ser Gly Ile Ser Ser Tyr Pro Ala Cys Lys Met Asn Leu Ser Leu
50 55 60
Phe Cys Leu Gly Glu Asn Asn Tyr Met Met Leu Asn Leu Phe Arg Trp
65 70 75 80
Val Cys Ile Ala Ile Leu Val Leu Val Val Ile Gly Trp Arg Pro Arg
85 90 95
Ile Thr Gly Val Leu His Trp Tyr Val Ser Tyr Ser Leu Gln Ser Ser
100 105 110
Leu Ile Val Ile Asp Gly Gly Glu Gln Ala Ala Ala Val Met Thr Phe
115 120 125
Leu Leu Leu Pro Ile Thr Leu Thr Asp Pro Arg Lys Trp His Trp Ser
130 135 140
Thr Arg Pro Ile Glu Gly Lys Arg Thr Leu Gly Lys Ile Thr Ala Phe
145 150 155 160
Ile Ser Tyr Phe Val Ile Arg Ile Gln Val Ala Val Leu Tyr Phe His
165 170 175
Ser Thr Val Ala Lys Leu Ser Gln Gln Glu Trp Val Asp Gly Thr Ala
180 185 190
Val Tyr Tyr Phe Ala Gln Glu Lys Thr Ile Gly Phe Asn Gly Phe Phe
195 200 205
Gln Ala Leu Thr Lys Pro Ile Val Thr Ser Pro Phe Val Val Ile Pro
210 215 220
Thr Trp Gly Thr Leu Leu Val Gln Ile Val Ile Phe Ala Ala Leu Phe
225 230 235 240
Ala Pro Lys Lys His Trp Arg Leu Ile Leu Ile Ile Ala Val Phe Met
245 250 255
His Glu Ile Phe Ala Val Met Leu Gly Leu Ile Ser Phe Ser Ile Ile
260 265 270
Met Ala Gly Ile Leu Ile Leu Tyr Leu Thr Pro Ile Asp Ser Thr Ile
275 280 285
Gln Phe Thr Tyr Ile Arg Arg Leu Leu Trp Asn Lys Lys His Lys Lys
290 295 300
Gly Glu Val Ser Val
305
<210> 5
<211> 537
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 5
atgcagaaat cgatatcatt ttttgtcatt ttttcaatcc tttggggttc gctatttctg 60
ttttctatta ttggcagctt agggacaacc ccgattccgc tgacaaagga ctccaaattt 120
ctcatgtcca gcatcctccc tcagggctgg ggctttttta gcaaaaatcc gcgtgatact 180
gcaatcggct tatatgaggc tgaaaatgcc agcgccaagg tcagatggcc caatatgagg 240
gctgacaacc tattcggcct gtatcggtat gggcggtcac aaggcgttga aatgggcgtg 300
atctacagcc aagtcggcaa ggaacagtgg acagcatgta aagaaaagga cctcggcgca 360
tgcaaaagca aagccaaaac cgtgcaatta aaaacacccg ctccccgccc gctgctttgt 420
ggcagctact atttgacgaa agaggatatt gttccttgga gctattctaa atatacccct 480
tcgtcttatc aggtaaaaag catagtcaag gttgtgatct catgctcgaa aacataa 537
<210> 6
<211> 178
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 6
Met Gln Lys Ser Ile Ser Phe Phe Val Ile Phe Ser Ile Leu Trp Gly
1 5 10 15
Ser Leu Phe Leu Phe Ser Ile Ile Gly Ser Leu Gly Thr Thr Pro Ile
20 25 30
Pro Leu Thr Lys Asp Ser Lys Phe Leu Met Ser Ser Ile Leu Pro Gln
35 40 45
Gly Trp Gly Phe Phe Ser Lys Asn Pro Arg Asp Thr Ala Ile Gly Leu
50 55 60
Tyr Glu Ala Glu Asn Ala Ser Ala Lys Val Arg Trp Pro Asn Met Arg
65 70 75 80
Ala Asp Asn Leu Phe Gly Leu Tyr Arg Tyr Gly Arg Ser Gln Gly Val
85 90 95
Glu Met Gly Val Ile Tyr Ser Gln Val Gly Lys Glu Gln Trp Thr Ala
100 105 110
Cys Lys Glu Lys Asp Leu Gly Ala Cys Lys Ser Lys Ala Lys Thr Val
115 120 125
Gln Leu Lys Thr Pro Ala Pro Arg Pro Leu Leu Cys Gly Ser Tyr Tyr
130 135 140
Leu Thr Lys Glu Asp Ile Val Pro Trp Ser Tyr Ser Lys Tyr Thr Pro
145 150 155 160
Ser Ser Tyr Gln Val Lys Ser Ile Val Lys Val Val Ile Ser Cys Ser
165 170 175
Lys Thr
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
ctcggtacga cacctgcaaa cat 23
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
accgtcgatc gactgctcct tttaac 26
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
cctaggcaca taaaaaaacg gctcgctccg c 31
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
tgcatgccga acaggaagga cgat 24
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
gcagtcgatc gacggtatcg ataagctg 28
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
ttttatgtgc ctaggatgca tatggcg 27
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
tcctgttcgg catgcaagct tggcgta 27
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
caggtgtcgt accgagctcg aattcac 27
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
aggcgattaa gttgggt 17
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
tcacacagga aacagctatg a 21
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 17
gataaaccgc accgactcg 19
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 18
agtccactct caactcctga tcc 23
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 19
cagcacatct ttcagctggc 20
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 20
aaattgaaaa aatggtggaa acac 24
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 21
ctcggtaccc cgcattgacg tgt 23
<210> 22
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 22
tatcaggata cagtaataat tccctttttt tttgatg 37
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 23
ctggaggatc cattataatt gagtgtcttg c 31
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 24
tgcatgccgg atatgactgc gggagat 27
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 25
ttactgtatc ctgataccgg gag 23
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 26
ataatggatc ctccagaatg tcaga 25
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 27
tcatatccgg catgcaagct tgg 23
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 28
aatgcggggt accgagctcg aatt 24
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 29
cagacaattg aatgcttccc 20
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 30
tcattgtcat tagttggctg gttacc 26
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 31
caaagctata tcagatccaa ca 22
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 32
acgcttccct cttttaattg aaccc 25
<210> 33
<211> 531
<212> DNA
<213> Bacillus amyloliquefaciens
<400> 33
ttgactgaca agagacaaaa cagcatgttt tcattctttc tttttataat ggccgcctgg 60
atcatcgttt tgtttttaac cgtcatcgcg gcactgccaa gctccgccat ccaattaacc 120
aagcatcaat ccaaaaccgt ttccatgatt tatccgcaaa gctggggatt tttcagtaaa 180
gatccgagag aagacagtct gaacatctat ctccttgatg gcgatgaaaa gctcagatgg 240
ccgaataatt cactgaaaaa tgtgatcggc ttaaaccgat acgggcggac gcaagggata 300
gagctcggcc ttatgctgga aaagctgcct tccaaagaga agtggcacga tttcacggct 360
ggccaggact ttaagaatac catatttttg aaaatgaaaa atgagtcgcc ctccccaagg 420
ctgaaaggga aaatgatcat tacatatgaa cgcattaccc catgggcatg gagcaaacat 480
accgaaacga aacgaaccgt taaaaaatac atcggagtgg atgtcaattg a 531
<210> 34
<211> 176
<212> PRT
<213> Bacillus amyloliquefaciens
<400> 34
Met Thr Asp Lys Arg Gln Asn Ser Met Phe Ser Phe Phe Leu Phe Ile
1 5 10 15
Met Ala Ala Trp Ile Ile Val Leu Phe Leu Thr Val Ile Ala Ala Leu
20 25 30
Pro Ser Ser Ala Ile Gln Leu Thr Lys His Gln Ser Lys Thr Val Ser
35 40 45
Met Ile Tyr Pro Gln Ser Trp Gly Phe Phe Ser Lys Asp Pro Arg Glu
50 55 60
Asp Ser Leu Asn Ile Tyr Leu Leu Asp Gly Asp Glu Lys Leu Arg Trp
65 70 75 80
Pro Asn Asn Ser Leu Lys Asn Val Ile Gly Leu Asn Arg Tyr Gly Arg
85 90 95
Thr Gln Gly Ile Glu Leu Gly Leu Met Leu Glu Lys Leu Pro Ser Lys
100 105 110
Glu Lys Trp His Asp Phe Thr Ala Gly Gln Asp Phe Lys Asn Thr Ile
115 120 125
Phe Leu Lys Met Lys Asn Glu Ser Pro Ser Pro Arg Leu Lys Gly Lys
130 135 140
Met Ile Ile Thr Tyr Glu Arg Ile Thr Pro Trp Ala Trp Ser Lys His
145 150 155 160
Thr Glu Thr Lys Arg Thr Val Lys Lys Tyr Ile Gly Val Asp Val Asn
165 170 175
<210> 35
<211> 945
<212> DNA
<213> Bacillus amyloliquefaciens
<400> 35
ttgattcagg atgcaaaaaa gcagctcact ttatggatga tgcagaatcc gccttggaca 60
aatgtgtacg ggcttgccag aagcttaatc gcgctcggca cgctgctgac attgcttttc 120
aatccggcgt ctgtcttctt caaaacgcaa aatcaaatgc tcagcttttc cgacacgttc 180
agtttgtttt tgctgtttcc cgatttccgt tacattgaga tcgtcaaagc cgtttgtatc 240
tgtattttaa ttctggttgt cattggctgg cggccccgcc tcaccggttt ttttcattgg 300
tggatttcgt acagcttcca aaactccgcc gttactcttg acggaggaga tcaggtggct 360
gctgttttta cgctgctgct gcttccgctg acattgactg atccgcggaa atggcactgg 420
tctccgtacg aggcgtcttt tgagaagagg ccgcttgagc cttactaccg ttcgttatgc 480
tgggcgacgc tgacgatcat cagaatacag gtcgcgatgc tgtactttaa ctccgtcatt 540
gccaagctga tggaagaaga atggcagaac ggaaccgccg tttattacta tttgaacgat 600
ccgatgctgg ggctgccgga tgcgcttcac agtctgtttg actttatcct gcagtcaaag 660
cttgtcatca tcccgacttg gggcacgctc attgtgcaaa ccattatgtt ctgcgctttg 720
ttcgctccga aaaaatattg gcgtctgata ttgtttatat ccattttcat gcatgaaatc 780
tttgctgtta tgctggggct tacctcgttc tccattacgg tagctggtat tttagacctg 840
tttttggtac cggcagagaa aacagtagct ttgaaccatt acaatccgct ttttatcaga 900
tacaattttc tcaataaaag gaaaaggagg aaattatatg gttaa 945
<210> 36
<211> 314
<212> PRT
<213> Bacillus amyloliquefaciens
<400> 36
Met Ile Gln Asp Ala Lys Lys Gln Leu Thr Leu Trp Met Met Gln Asn
1 5 10 15
Pro Pro Trp Thr Asn Val Tyr Gly Leu Ala Arg Ser Leu Ile Ala Leu
20 25 30
Gly Thr Leu Leu Thr Leu Leu Phe Asn Pro Ala Ser Val Phe Phe Lys
35 40 45
Thr Gln Asn Gln Met Leu Ser Phe Ser Asp Thr Phe Ser Leu Phe Leu
50 55 60
Leu Phe Pro Asp Phe Arg Tyr Ile Glu Ile Val Lys Ala Val Cys Ile
65 70 75 80
Cys Ile Leu Ile Leu Val Val Ile Gly Trp Arg Pro Arg Leu Thr Gly
85 90 95
Phe Phe His Trp Trp Ile Ser Tyr Ser Phe Gln Asn Ser Ala Val Thr
100 105 110
Leu Asp Gly Gly Asp Gln Val Ala Ala Val Phe Thr Leu Leu Leu Leu
115 120 125
Pro Leu Thr Leu Thr Asp Pro Arg Lys Trp His Trp Ser Pro Tyr Glu
130 135 140
Ala Ser Phe Glu Lys Arg Pro Leu Glu Pro Tyr Tyr Arg Ser Leu Cys
145 150 155 160
Trp Ala Thr Leu Thr Ile Ile Arg Ile Gln Val Ala Met Leu Tyr Phe
165 170 175
Asn Ser Val Ile Ala Lys Leu Met Glu Glu Glu Trp Gln Asn Gly Thr
180 185 190
Ala Val Tyr Tyr Tyr Leu Asn Asp Pro Met Leu Gly Leu Pro Asp Ala
195 200 205
Leu His Ser Leu Phe Asp Phe Ile Leu Gln Ser Lys Leu Val Ile Ile
210 215 220
Pro Thr Trp Gly Thr Leu Ile Val Gln Thr Ile Met Phe Cys Ala Leu
225 230 235 240
Phe Ala Pro Lys Lys Tyr Trp Arg Leu Ile Leu Phe Ile Ser Ile Phe
245 250 255
Met His Glu Ile Phe Ala Val Met Leu Gly Leu Thr Ser Phe Ser Ile
260 265 270
Thr Val Ala Gly Ile Leu Asp Leu Phe Leu Val Pro Ala Glu Lys Thr
275 280 285
Val Ala Leu Asn His Tyr Asn Pro Leu Phe Ile Arg Tyr Asn Phe Leu
290 295 300
Asn Lys Arg Lys Arg Arg Lys Leu Tyr Gly
305 310
<210> 37
<211> 591
<212> DNA
<213> Bacillus amyloliquefaciens
<400> 37
atggttaaaa gcaaaaaatc cgctgccgcc atgatgctgg tgtttgtttt aatgatcgca 60
ttagtcggcc cgcatgccac agcgaaaact gaggcatccg tctcttattc gggtgaagac 120
attttttccg gcatcttttt cggacaaggt gaggtcgcaa agcttcttcc tgaagtatgg 180
gatacgaaag ccgtcaaaaa gattaatcag gatgaattaa agcaagtttc cgatcaggtg 240
atcgctgata ttaaaaagtc atcgccggat tattttaaga agttaaaagc ggcggtctac 300
agcggcgatt atgagaaagt gaacagcgtc atcgatcaag gctcacagat tatggcgaaa 360
gtgctgaaag aagagtttga caaaaaaagc atggacaaag gaaaatcaac ggccatcgga 420
caatgcgcaa cggctgtatg ggtattttta aacgcggcgg ctgccataga gacgatcgct 480
cttgccgtag cggccatcat tttgacggta gcaagcgttg acgaagattc cgacttagga 540
aaagagcagc tcatcgcaaa tgtcgttgac cgcattaatg cgcagcactg a 591
<210> 38
<211> 196
<212> PRT
<213> Bacillus amyloliquefaciens
<400> 38
Met Val Lys Ser Lys Lys Ser Ala Ala Ala Met Met Leu Val Phe Val
1 5 10 15
Leu Met Ile Ala Leu Val Gly Pro His Ala Thr Ala Lys Thr Glu Ala
20 25 30
Ser Val Ser Tyr Ser Gly Glu Asp Ile Phe Ser Gly Ile Phe Phe Gly
35 40 45
Gln Gly Glu Val Ala Lys Leu Leu Pro Glu Val Trp Asp Thr Lys Ala
50 55 60
Val Lys Lys Ile Asn Gln Asp Glu Leu Lys Gln Val Ser Asp Gln Val
65 70 75 80
Ile Ala Asp Ile Lys Lys Ser Ser Pro Asp Tyr Phe Lys Lys Leu Lys
85 90 95
Ala Ala Val Tyr Ser Gly Asp Tyr Glu Lys Val Asn Ser Val Ile Asp
100 105 110
Gln Gly Ser Gln Ile Met Ala Lys Val Leu Lys Glu Glu Phe Asp Lys
115 120 125
Lys Ser Met Asp Lys Gly Lys Ser Thr Ala Ile Gly Gln Cys Ala Thr
130 135 140
Ala Val Trp Val Phe Leu Asn Ala Ala Ala Ala Ile Glu Thr Ile Ala
145 150 155 160
Leu Ala Val Ala Ala Ile Ile Leu Thr Val Ala Ser Val Asp Glu Asp
165 170 175
Ser Asp Leu Gly Lys Glu Gln Leu Ile Ala Asn Val Val Asp Arg Ile
180 185 190
Asn Ala Gln His
195
<210> 39
<211> 122
<212> DNA
<213> Bacillus amyloliquefaciens
<400> 39
atgaacactc ctttttacat ataatagtat attagtccaa aaaatctaat ttctcaatat 60
tttacctgtt gaatggtgta taatcatgtc aatgaaatgt ccattcgata ggagggtttc 120
aa 122
<210> 40
<211> 177
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 40
ggtttaaata tatcgaaaaa aacactatat atcaatcaca tatagaagtg taaaatgtcc 60
tgtttttcct tttaacaaaa atggaatttc tcatactttt taaccttttt attacataaa 120
tgtttttata ttatgaaaag tgtaaaaacg attcttcagg ttaaaaggag cagtcga 177
<210> 41
<211> 221
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 41
aaagttccca aattcaattc tgggaacttt tttaagtcca atccaaatgg ttgaatatca 60
aacttcaaga aaacaaacaa aataatgcat aatttacatt aatttattaa ttatccattt 120
tttgttgatt attctgacta gctattatat aatctttttg aaatgattat attagcttag 180
aggaggtaat ctacatcaaa aaaaagggaa ttattactgt a 221
<210> 42
<211> 477
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 42
atgactatat gtttcctatt attttcttct tattacttta gcaatatttc acctcagaat 60
ccactgttca aaaaaaattt tttgcaacaa ttgtctcccc aaggctttgg cttttatagt 120
aaaagcccta cagaagaaaa catttcattt cacacaaaag aaaatttaaa gttacctaat 180
gcacttccca ataatttttt tgggataaaa agagaaggaa gagttcaggc aatagaatta 240
ggcaaaattg tagagaatat cgatccaaag aattggaaaa cttgtgaaaa caacaactcc 300
tgcacaaatt tagagaaaca aataaagcct attaaggtta taaaaaatga agattatata 360
catcttagca aaggagaata cctaatatat cgccaaaaac cactctcatg gtattggata 420
gactttaagc aaactacctc ttttgaaaga aaggtgctaa aaataaaaat agtatga 477
<210> 43
<211> 158
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 43
Met Thr Ile Cys Phe Leu Leu Phe Ser Ser Tyr Tyr Phe Ser Asn Ile
1 5 10 15
Ser Pro Gln Asn Pro Leu Phe Lys Lys Asn Phe Leu Gln Gln Leu Ser
20 25 30
Pro Gln Gly Phe Gly Phe Tyr Ser Lys Ser Pro Thr Glu Glu Asn Ile
35 40 45
Ser Phe His Thr Lys Glu Asn Leu Lys Leu Pro Asn Ala Leu Pro Asn
50 55 60
Asn Phe Phe Gly Ile Lys Arg Glu Gly Arg Val Gln Ala Ile Glu Leu
65 70 75 80
Gly Lys Ile Val Glu Asn Ile Asp Pro Lys Asn Trp Lys Thr Cys Glu
85 90 95
Asn Asn Asn Ser Cys Thr Asn Leu Glu Lys Gln Ile Lys Pro Ile Lys
100 105 110
Val Ile Lys Asn Glu Asp Tyr Ile His Leu Ser Lys Gly Glu Tyr Leu
115 120 125
Ile Tyr Arg Gln Lys Pro Leu Ser Trp Tyr Trp Ile Asp Phe Lys Gln
130 135 140
Thr Thr Ser Phe Glu Arg Lys Val Leu Lys Ile Lys Ile Val
145 150 155
<210> 44
<211> 972
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 44
atgaagatat taaatagttt agaaggttat attgacacct ataatccatg gaaaaataca 60
tatgcacttt ttagaagttt acttggtttc tcaacattac tagtactatt attcaatagt 120
actgatattt tatttagtta tagtgcaaat aatgtcacat gtgaaaatgt ctatatccct 180
accgcttttt gttttgctaa agaatatagt atcaattttg agattataag atacttaatg 240
atttttatat taaccttagt ggttataggg tggagaccta gatttaccgg tttatttcac 300
tggtatattt gctatagtat tcaaacttca gctttaacta tcgatggtgg agagcaaatt 360
gcaactgttc tttcttttct tatattacct gttacattat tagattcaag gcgaaatcat 420
tggaatataa agaaaaacaa taatgaatct ttcacaaaga agacagtatt gttttatata 480
atgacaataa ttaaaattca agtttttatc atttatttaa acgcagcttt agagcgattg 540
aaaaataaag agtgggcaga aggaacagca atttactatt tcttttctga tccggtgttt 600
ggattacctg aatatcaact taacttaatg aatccactac ttgaaagcaa ttttattgtt 660
gtcatcactt ggttagtaac tatttttgag ttgttcttag cagcaagcat aatttcaaat 720
atcagaataa agagaattgc ccttgttttg ggaatattat ttcatattgg gataatattc 780
agcattggta ttgtaagttt tggcttgatc atgatatcag cattaattat atatctgcat 840
cctgtacaac aaaatatcac tatgaattgg tgttctcctt tatttaaata tatatatgta 900
aaaggaaaga gaaatttcaa aagaatagga ggtgaatcag tcaagtttct tacaaaattg 960
tttcatagct aa 972
<210> 45
<211> 323
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 45
Met Lys Ile Leu Asn Ser Leu Glu Gly Tyr Ile Asp Thr Tyr Asn Pro
1 5 10 15
Trp Lys Asn Thr Tyr Ala Leu Phe Arg Ser Leu Leu Gly Phe Ser Thr
20 25 30
Leu Leu Val Leu Leu Phe Asn Ser Thr Asp Ile Leu Phe Ser Tyr Ser
35 40 45
Ala Asn Asn Val Thr Cys Glu Asn Val Tyr Ile Pro Thr Ala Phe Cys
50 55 60
Phe Ala Lys Glu Tyr Ser Ile Asn Phe Glu Ile Ile Arg Tyr Leu Met
65 70 75 80
Ile Phe Ile Leu Thr Leu Val Val Ile Gly Trp Arg Pro Arg Phe Thr
85 90 95
Gly Leu Phe His Trp Tyr Ile Cys Tyr Ser Ile Gln Thr Ser Ala Leu
100 105 110
Thr Ile Asp Gly Gly Glu Gln Ile Ala Thr Val Leu Ser Phe Leu Ile
115 120 125
Leu Pro Val Thr Leu Leu Asp Ser Arg Arg Asn His Trp Asn Ile Lys
130 135 140
Lys Asn Asn Asn Glu Ser Phe Thr Lys Lys Thr Val Leu Phe Tyr Ile
145 150 155 160
Met Thr Ile Ile Lys Ile Gln Val Phe Ile Ile Tyr Leu Asn Ala Ala
165 170 175
Leu Glu Arg Leu Lys Asn Lys Glu Trp Ala Glu Gly Thr Ala Ile Tyr
180 185 190
Tyr Phe Phe Ser Asp Pro Val Phe Gly Leu Pro Glu Tyr Gln Leu Asn
195 200 205
Leu Met Asn Pro Leu Leu Glu Ser Asn Phe Ile Val Val Ile Thr Trp
210 215 220
Leu Val Thr Ile Phe Glu Leu Phe Leu Ala Ala Ser Ile Ile Ser Asn
225 230 235 240
Ile Arg Ile Lys Arg Ile Ala Leu Val Leu Gly Ile Leu Phe His Ile
245 250 255
Gly Ile Ile Phe Ser Ile Gly Ile Val Ser Phe Gly Leu Ile Met Ile
260 265 270
Ser Ala Leu Ile Ile Tyr Leu His Pro Val Gln Gln Asn Ile Thr Met
275 280 285
Asn Trp Cys Ser Pro Leu Phe Lys Tyr Ile Tyr Val Lys Gly Lys Arg
290 295 300
Asn Phe Lys Arg Ile Gly Gly Glu Ser Val Lys Phe Leu Thr Lys Leu
305 310 315 320
Phe His Ser
<210> 46
<211> 612
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 46
ttgaaaagta aattacttag gctattgatt gtttccatgg taacgatatt ggttttttca 60
ttagtaggac tctctaagga gtcaagtaca tctgctaaag aaaaccatac attttctgga 120
gaagattact ttagaggact tttatttgga caaggggaag ttggtaaatt aatttcaaac 180
gatttggacc ctaaactcgt aaaagaggca aatagtacag aaggtaaaaa gttagtaaat 240
gatgtagtca aatttataaa aaaagatcaa ccacaatata tggatgaatt gaaacaatcg 300
attgacagca aagaccctaa aaaactcatt gaaaatatga ccaaagcaga ccaacttatc 360
caaaaatatg ctaagaaaaa tgaaaacgta aaatactctt ctaataaagt tactccatct 420
tgtgggcttt atgccgtctg tgtagcagct ggatatttat atgttgtggg cgttaacgca 480
gttgcattac aaacggctgc cgcagtaaca actgcagtgt ggaaatacgt tgccaaatat 540
tcctcttcag cttctaataa ttctgattta gaagcggctg ctgcaaaaac cctaaaattg 600
attcatcaat aa 612
<210> 47
<211> 203
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 47
Met Lys Ser Lys Leu Leu Arg Leu Leu Ile Val Ser Met Val Thr Ile
1 5 10 15
Leu Val Phe Ser Leu Val Gly Leu Ser Lys Glu Ser Ser Thr Ser Ala
20 25 30
Lys Glu Asn His Thr Phe Ser Gly Glu Asp Tyr Phe Arg Gly Leu Leu
35 40 45
Phe Gly Gln Gly Glu Val Gly Lys Leu Ile Ser Asn Asp Leu Asp Pro
50 55 60
Lys Leu Val Lys Glu Ala Asn Ser Thr Glu Gly Lys Lys Leu Val Asn
65 70 75 80
Asp Val Val Lys Phe Ile Lys Lys Asp Gln Pro Gln Tyr Met Asp Glu
85 90 95
Leu Lys Gln Ser Ile Asp Ser Lys Asp Pro Lys Lys Leu Ile Glu Asn
100 105 110
Met Thr Lys Ala Asp Gln Leu Ile Gln Lys Tyr Ala Lys Lys Asn Glu
115 120 125
Asn Val Lys Tyr Ser Ser Asn Lys Val Thr Pro Ser Cys Gly Leu Tyr
130 135 140
Ala Val Cys Val Ala Ala Gly Tyr Leu Tyr Val Val Gly Val Asn Ala
145 150 155 160
Val Ala Leu Gln Thr Ala Ala Ala Val Thr Thr Ala Val Trp Lys Tyr
165 170 175
Val Ala Lys Tyr Ser Ser Ser Ala Ser Asn Asn Ser Asp Leu Glu Ala
180 185 190
Ala Ala Ala Lys Thr Leu Lys Leu Ile His Gln
195 200
Claims (15)
- 하기를 포함하는, 변형된 바실러스 종 세포에서의 증가된 양의 관심 단백질(POI)의 생산 방법:
(a) POI를 생산하는 부모 바실러스 종 세포를 수득하는 단계,
(b) yitMOP 오페론을 파괴하거나 결실시킴으로써 부모 세포를 유전학적으로 변형시키는 단계, 및
(c) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건 하에서 발효시키는 단계로서, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 상기 변형된 세포가 상기 부모 세포에 비하여 증가된 양의 POI를 생산하는 단계. - 하기를 포함하는, 변형된 바실러스 종 세포에서의 증가된 양의 관심 단백질(POI)의 생산 방법:
(a) POI를 생산하는 부모 바실러스 종 세포를 수득하는 단계,
(b) yitMOP 오페론의 조절 영역을 파괴하거나 결실시킴으로써 부모 바실러스 종 세포를 유전학적으로 변형시켜, 변형된 세포에서 기능적 YitM, YitO 및/또는 YitP 단백질의 생산이 결핍되게 하는 단계, 및
(c) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건 하에서 발효시키는 단계로서, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 상기 변형된 세포가 상기 부모 세포에 비하여 증가된 양의 POI를 생산하는 단계. - 하기를 포함하는, 변형된 바실러스 종 세포에서의 증가된 양의 관심 단백질(POI)의 생산 방법:
(a) POI를 생산하는 부모 바실러스 종 세포를 수득하는 단계,
(b) yitM 유전자를 파괴하거나 결실시킴으로써 부모 세포를 유전학적으로 변형시키는 단계, 및
(c) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건 하에서 발효시키는 단계로서, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 상기 변형된 세포가 상기 부모 세포에 비하여 증가된 양의 POI를 생산하는 단계. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바실러스 종 세포가 sdpABC 오페론의 파괴 또는 결실을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바실러스 종 세포가 비. 서브틸리스(B. subtilis), 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 비. 렌투스(B. lentus), 비. 브레비스(B. brevis), 비. 스테아로써모필러스(B. stearothermophilus), 비. 알칼로필러스(B. alkalophilus), 비. 아밀로리쿼파시엔스(B. amyloliquefaciens), 비. 클라우시이(B. clausii), 비. 할로두란스(B. halodurans), 비. 메가테리움(B. megaterium), 비. 코아귤란스(B. coagulans), 비. 써큘란스(B. circulans), 비. 라우투스(B. lautus) 및 비. 튜링기엔시스(B. thuringiensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, POI가 효소인, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 효소가 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르보닉 안하이드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글리코실 하이드롤라아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리가아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 펩티다아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제 및 헥소스 옥시다아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산되는 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포.
- 관심 단백질(POI)을 생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래된 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포로서, 상기 변형된 세포가 파괴된 또는 결실된 yitMOP 오페론을 포함하며, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 상기 부모 세포에 비하여 증가된 양의 POI를 생산하는, 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포.
- 관심 단백질(POI)을 생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래된 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포로서, 상기 변형된 세포에서 기능적 YitM, YitO 및/또는 YitP 단백질의 생산이 결핍되게 하는 파괴된 또는 결실된 yitMOP 오페론의 조절 영역을 포함하며, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 상기 변형된 세포가 상기 부모 세포에 비하여 증가된 양의 POI를 생산하는, 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포.
- 관심 단백질(POI)을 생산하는 부모 바실러스 종 세포로부터 유래된 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포로서, 상기 변형된 세포가 파괴된 또는 결실된 yitM 유전자를 포함하며, 동일한 조건 하에서 발효되는 경우 상기 변형된 세포가 부모 세포에 비하여 증가된 양의 POI를 생산하는, 유전학적으로 변형된 바실러스 종 세포.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바실러스 종 세포가 sdpABC 오페론의 파괴 또는 결실을 추가로 포함하는, 변형된 세포.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바실러스 종 세포가 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스, 비. 브레비스, 비. 스테아로써모필러스, 비. 알칼로필러스, 비. 아밀로리쿼파시엔스, 비. 클라우시이, 비. 할로두란스, 비. 메가테리움, 비. 코아귤란스, 비. 써큘란스, 비. 라우투스 및 비. 튜링기엔시스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 세포.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, POI가 효소인, 변형된 세포.
- 제14항에 있어서, 상기 효소가 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르보닉 안하이드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글리코실 하이드롤라아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리가아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 펩티다아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제 및 헥소스 옥시다아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 세포.
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