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TWI526539B - 植物中生產類病毒顆粒(vlp)的方法及以該方法生產之vlp - Google Patents

植物中生產類病毒顆粒(vlp)的方法及以該方法生產之vlp Download PDF

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TWI526539B
TWI526539B TW100147730A TW100147730A TWI526539B TW I526539 B TWI526539 B TW I526539B TW 100147730 A TW100147730 A TW 100147730A TW 100147730 A TW100147730 A TW 100147730A TW I526539 B TWI526539 B TW I526539B
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馬克 安德烈 德奧斯特
曼儂 考特爾
皮埃爾 奧利維爾 拉沃伊
路易斯 菲力普 維西納
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苜蓿股份有限公司
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植物中生產類病毒顆粒(VLP)的方法及以該方法生產之VLP
本發明係相關於在植物中生產嵌合病毒蛋白(chimeric virus protein)。更具體地，本發明亦相關於在植物中生產包含嵌合病毒蛋白的類病毒顆粒(virus-like particle,VLP)。
疫苗接種經由引發個體在感染前發動防禦以提供對由類似媒介物引起之疾病的保護。傳統地，此經由活的減弱(live attenuated)或完全去活化(whole inactivated)形式之感染物的使用作為免疫原(immunogen)而達成。為了避免使用全病毒(例如殺死的或減弱的病毒)作為疫苗的危險，已將重組病毒蛋白例如次單元(subunit)實行為疫苗。肽與次單元疫苗兩者皆受到一些潛在的限制。由於不正確的折疊、不良抗原呈現(antigen presentation)或碳水化合物與脂質組成的差異，次單元疫苗可能表現不良致抗原性(immunogenicity)。主要問題為在其自然環境中確保工程蛋白的構型仿似抗原的構型之困難度。必須使用適合的佐劑以及在胜肽的例子中之載體蛋白以加強免疫反應。此外這些疫苗主要引起體液免疫(humoral response)，並因此可能無法引起有效的免疫。次單元疫苗對於可證實以全去活化病毒提供保護的疾病經常是無效的。
類病毒顆粒(VLPs)為包含在致抗原組成物的潛在候選。VLPs酷似成熟的病毒粒子，但它們不包含病毒的遺傳物質。因此，VLPs性質上為不可複製的，其使得將它們作為疫苗投予是安全的。此外，可將VLPs設計為在VLP的表面上表現病毒醣蛋白，其為它們最原生之生理構形。此外，因為VLPs類似完整的病毒粒子並且為多價粒子結構，VLPs在引發對醣蛋白的中和抗體比起可溶的套膜蛋白抗原可能是更有效的。
為了疫苗的目的，在昆蟲與哺乳動物系統中已產生超過三十個不同病毒的VLPs(Noad,R. and Roy,P.,2003,Trends Microbiol 11: 438-44)。許多研究證實在細胞培養中使用哺乳動物表現質體或桿狀病毒載體之重組流感蛋白自組裝至VLPs(例如，Gomez-Puertas et al.,1999,J. Gen. Virol,80,1635-1645；Neumann et al.,2000,J. Virol.,74,547-551；Latham and Galarza,2001,J. Virol.,75,6154-6165)。
Gomez-Puertas et al.(1999,J. Gen. Virol.,80,1635-1645)證實流感VLPs的有效形成視病毒蛋白質的表現程度而定。Neumann et al.(2000,J. Virol.,74,547-551)建立以哺乳動物表現質體為基礎的系統，以完全由選殖的cDNAs產生傳染性流感類病毒顆粒。Latham與Galarza(2001,J. Virol.,75,61546165)報導在以共同表現HA、NA、M1與M2基因之重組桿狀病毒感染的昆蟲細胞中的流感VLP之形成。此研究證實在真核細胞中流感病毒粒子蛋白於共同表現後自組裝並且需要M1基質蛋白用於VLP生產。
在許多表現系統中，包括桿狀病毒、牛痘病毒、果蠅(DS-2)細胞、Vero細胞以及酵母球形質體，來自人類免疫缺陷病毒(HIV)的Pr55gag之表現造成類病毒顆粒(VLPs)的組裝與釋出，其與未成熟的HIV病毒粒子之形態相似(由Deml et al.,2005,Molecular Immunology 42: 259-277回顧)。
可將HIV套膜蛋白gp160併入Gag-衍生的VLPs。然而，儘管Pr55gag的高度表現僅併入有限數量的套膜蛋白。Wang et al.展示HIV套膜蛋白的穿膜區域(transmembrane domain)與胞質尾區域(cytosolic tail domain)(TM/CT)被另一病毒套膜蛋白的那些區域之取代，其包括造成套膜蛋白併入至Pr55gag衍生的VLPs增加之流感血球凝集素(Journal of Virology,2007,81: 10869-10878)。當使用桿狀病毒表現系統在昆蟲細胞中共同表現時，包含HA TM/CT的嵌合HIV套膜蛋白亦顯示被併入流感M1衍生的VLPs(WO2008/005777)。
流感病毒滲入細胞係取決於HA依賴性受體媒介之胞飲作用。流感病毒感染週期係由病毒粒子表面HA蛋白附著於含有唾液酸的細胞受體(醣蛋白與醣脂質)而開始。神經胺酸酶(NA)蛋白媒介唾液酸受體的處理。在內化之含有流感病毒粒子的內體之酸性範圍中，HA蛋白歷經構形變化，其導致病毒與細胞膜的融合、病毒脫殼(uncoating)以及以M2為媒介的M1蛋白質由核鞘相關的核糖核蛋白(nucleocapsid-associated ribonucleoproteins,RNPs)釋出，其遷移至細胞核以進行病毒RNA合成。Latham與Galarza(200,J. Virol. 75,6154-6165)報導在以共同表現HA、NA、M1與M2基因之重組桿狀病毒感染之昆蟲細胞中流感VLPs的生成。此外，Gomez-Puertas et al.(2000,J Virol. 74,11538-11547)教導除了血球凝集素(HA)，流感病毒的基質蛋白(M1)對於VLP由昆蟲細胞出芽(budding)為關鍵的。然而，Chen et al.(2007,J. Virol. 81,7111-7123)教導M1對VLP生成可能是不需要的。
大部分具特徵的出芽機制使用宿主路徑的液泡蛋白質分類路徑(vacuolar protein sorting pathway,VPS)(見Chen and Lamb,Virology 372,2008)。許多具套膜的病毒已顯示與VPS路徑的蛋白質交互作用，其需要運輸所需的內體分類複合體(ESCRT)蛋白質複合體的作用(見Chen與Lamb 2008的表格I)。發現與VPS路徑之蛋白質交互作用的晚期蛋白區域位於病毒的核心以及基質蛋白，因而VPS依賴性出芽需要基質或核心蛋白質的存在。流感HA之胞質尾的棕櫚醯化為出芽所需但此機制還不清楚並且可能涉及其他表面蛋白區域的參與。出芽的最低需求仍然未知並且不能排除在此過程中的胞外區域之參與。此外，植物中的VPS路徑所知甚少(見Schellmann S.,and Pimpl P.,Current Op Plant Biol 12:670-676,200)。
已知流感的出芽是與VPS路徑獨立的。流感病毒的出芽涉及Rab11路徑(Bruce et al.,J. Virol 84:58485859,2010)。Rab蛋白質為定位於細胞內之運輸囊泡表面的GTPase錨點，並且它們涉及從供給者間隔、運輸、對接以及融合至接受者間隔的囊泡生成(VazquezMartinez與Malagon Frontiers in Endocrinology 2:1-9,2011)。已確定在植物中Rab11路徑的組成物。然而，植物的運輸組成物進化導致植物內膜系統的數個特定特徵，包括例如大且特化的液泡、高基堆疊的快速移動與內體間隔的獨特組織，以及擴充數目的Rab GTPase(Rojo E.,and Deneke J.,Plant Phys 147:14931503,2008)。流感顆粒或病毒出芽係依賴於Rab11(Bruce et. al.,J. Virol 84:5848-5859,2010)但仍未確定與Rab11或Rab11相關蛋白質交互作用的蛋白質或蛋白質區域。然而，出芽過程以及VLP生產可能需要的最小區域或HA區域為未知的。
在植物中，若不設計於葉綠體中累積，HIV Pr55gag以極低量累積(Meyers et al.,2008,BMC Biotechnology 8:53；Scotti et al.,2010,Planta 229: 1109-1122)。然而，在葉綠體中的累積與正確折疊的HIV套膜蛋白之併入為不相容的，因為後者的成熟與折疊需要特定分泌路徑的轉譯後修飾(post-translational modification)。Rybicki et al.(2010,Plant Biotechnology Journal 8: 620-637)提到「似乎沒有人在植物中以合理產量成功表現全HIV Env gp160蛋白質或甚至大部分的蛋白質」。
狂犬病病毒(RV)為桿狀病毒科(Rhabdoviridae)的成員。類似此科的大部分成員，RV為不分段的、負股RNA病毒，其基因組編碼五個病毒蛋白質：RNA-依賴性RNA聚合酶(L)；核蛋白(N)；磷酸化蛋白(P)；位於病毒蛋白套膜內側的基質蛋白(M)；以及外表面的醣蛋白(G)。Dietzschold B et al.(1991),Crit. Rev. Immunol. 10: 427-439。
以細胞培養為基礎的狂犬病疫苗限制在於細胞培養中使去活化的病毒品系生長。這些疫苗包含生長於細胞培養的病毒。現今的生物技術方法旨在表現狂犬病病毒的鞘蛋白(coat protein)基因以發展出可配置為具活性疫苗的安全重組蛋白。已顯示在中國倉鼠卵巢細胞中狂犬病病毒醣蛋白的穩定表現(Burger et al.,1991)。獲得與從受病毒感染的細胞分離的G蛋白共同遷移之全長的、醣化的67 K蛋白質。
WO/1993/001833教導在含有RNA基因組，其包括一3'區域以及由狂犬病M蛋白之鞘以及狂犬病M1蛋白環繞的填充區域(filler domain)之桿狀病毒表現系統中的類病毒顆粒(VLPs)生產。此VLP亦包括狂犬病G蛋白的脂質套膜。
水痘帶狀疱疹病毒(Varicella Zoster virus,VZV)，亦稱為人類疱疹病毒3(HHV3)，為疱疹病毒科(Herpesviridae)病毒之a-疱疹病毒(alphaherpesvirus)亞科的一員。表現醣蛋白或外被蛋白的VLPs先前已從不同的疱疹病毒科成員產生。由套膜外被蛋白組成的輕粒子(L-顆粒)，已由受單純疱疹病毒第1型(HSV-1)、馬疱疹病毒第1型(EHV-1)或偽狂犬病病毒感染的細胞獲得(McLauchlan and Rixon(1992) J. Gen. Virol. 73: 269-276；U.S. Pat. No. 5,384,122)。不同類型的VLP，稱為前病毒DNA複製套膜顆粒(PREPs)，可在病毒DNA複製抑制劑的存在下由受HSV-1感染的細胞產生。PREPs在結構上與L-顆粒相似，但包含不同的蛋白質組成(Dargan et al.(1995) J. Virol. 69: 4924-4932；U.S. Pat. No. 5,994,116)。已經由使用酵母菌Ty反轉錄轉位子編碼的p1蛋白質技術生產來自VZV的gE蛋白質之雜交VLPs表現片段(Garcia-Valcarcel et al.(1997) Vaccine 15: 709-719；Welsh et al.(1999) J. Med. Virol. 59: 78-83；美國專利號6,060,064)。US 2011/0008838描述包含至少一VZV蛋白質但不包含酵母菌Ty蛋白質的嵌合VLPs。嵌合VLPs包含病毒核心蛋白質例如流感M1或新城病蛋白質M以及至少一水痘帶狀疱疹病毒(VZV)蛋白質。
於2003年，新進化的冠狀病毒(CoV)傳播造成嚴重急性呼吸道症候群(SARS)流行病的全球性威脅(Kuiken,T. et al.,2003,Lancet 362: 263-270)。如同其他冠狀病毒，SARS-CoV具有套膜顆粒伴隨典型的周圍突起的形態，該突起環繞病毒核心表面，稱為「冠狀」或「突棘」(Ksiazek,T. G. et al.,2003,N Engl J Med 348: 1953-1966；Lin,Y. et al.,2004,Antivir Ther 9: 287-289)。在冠狀病毒顆粒核心外是脂質套膜層，其主要包含三個膜蛋白，最充足的M(膜)蛋白質、小E(套膜)蛋白質以及S(棘)蛋白質。S蛋白質的同源三聚體集合形成上述的冠狀物，其涉及冠狀病毒的病毒結合至宿主受體、病毒進入的膜融合、細胞至細胞傳播以及組織驅性。
已使用桿狀病毒表現系統生產SARS VLPs(Ho,Y. et al.,2004,Biochem Biophys Res Commun 318: 833-838；Mortola,E. and Roy,P.,2004,FEBS Lett 576: 174-178)。然而，由於昆蟲細胞與哺乳動物細胞本身的差異，於昆蟲(SF9)細胞中組裝的VLP展現了110 nm的半徑尺寸，其較真實的SARS-CoV病毒粒子的78 nm大許多(Lin,Y. et al.,2004,supra,and Ho,Y. et al.,2004,supra)。此外，仍未調查以昆蟲細胞為基礎的SARS-VLP之致抗原性。其他研究者亦試著使用哺乳動物表現系統以生產SARS VLP(Huang,Y. et al.,2004,J Virol 78: 12557-65)。然而，VLP的胞外釋出效率不高，並且VLP的產量不能令人滿意。例如WO/2005/035556描述製作SARS-CoV-類病毒顆粒(SARS-CoV-VLPs)的系統，其包含在哺乳動物細胞中表現SARS-CoV E蛋白質、SARS-CoV M蛋白質以及SARS-CoV S蛋白質的一或更多重組載體。
在任何系統的VLP生成對於蛋白質的結構樹立相當高的要求-改變蛋白質序列延伸可能對多肽本身的表現沒有效果，然而結構的研究缺乏證明此類改變對VLP生成的效果。蛋白質的各種區域與結構的合作已隨著病毒一起演進，並且在不喪失VLP生成下對類似的改變可能是不容修正的。
為了改良VLPs為疫苗候選，需要探索昆蟲與哺乳細胞之外的其他表現系統。因此有需要評估植物表現系統的能力，以生產嵌合蛋白VLP。特別地，有需要識別將組裝進VLP的病毒蛋白質最小數目並且評估那些VLP的形態與致抗原性。
本發明係相關於在植物中生產嵌合病毒蛋白。更具體地，本發明亦相關於在植物中生產包含嵌合病毒蛋白的類病毒顆粒。
本發明提供在植物中生產類病毒顆粒(VLP)的方法，其包含，
a)將包含在植物中具活性的調節區域並且連續地操作性連結至編碼來自病毒三聚表面蛋白質或其片段的膜外區域、融合至流感穿膜區域以及胞質尾之嵌合核苷酸序列的核酸引入植物或植物的部分，膜外區域係來自非流感病毒三聚表面蛋白質並且相關於流感穿膜區域以及胞質尾為異源性的，以及
b)於允許核酸表現的條件下培養植物或植物的部分，從而生產VLP。
如上所述的方法可進一步包含步驟(c)將植物收穫並純化VLP。此外，VLP可不包含病毒基質或核心蛋白質。
本發明提供上述方法，其中來自病毒三聚表面蛋白質或其片段之膜外區域可衍生自反轉錄病毒、桿菌病毒、疱疹病毒、冠狀病毒、副黏液病毒、痘病毒或絲狀病毒科的病毒。來自病毒三聚表面蛋白質的膜外區域可衍生自例如來自慢病毒、狂犬病病毒、水痘病毒、冠狀病毒或伊波拉病毒屬。來自病毒三聚表面蛋白質的膜外區域可衍生自例如但不限於HIV、狂犬病病毒、VZV、RSV、SARS病毒、伊波拉病毒、麻疹、腮腺炎、水痘、巨細胞病毒、伊波拉/絲狀病毒、疱疹病毒、艾巴氏病毒或天花。在其原生形式的病毒三聚表面蛋白質可包含膜外區域以及穿膜區域/胞質尾，舉例來說但不限於F蛋白質(RSV、麻疹、腮腺炎、新城病)、S蛋白質(SARS)、env蛋白質(HIV)、G蛋白質(狂犬病)、包括E、B、C、I、H的套膜醣蛋白(VZV、巨細胞病毒、疱疹病毒、艾巴氏病毒)、GP醣蛋白(伊波拉、馬堡)、血球凝集素(天花病毒、牛痘病毒)。
本發明亦提供如上所述的方法，其中在引入的步驟中(步驟a)，該核酸在植物中為暫時地表現。替代地，在引入的步驟中(步驟a)，該核酸可在植物中穩定地表現。
本發明亦包括如同上述的方法，其中在引入的步驟中(步驟a)，將選自編碼一或多於一的帶位子蛋白質、質子通道蛋白質、蛋白酶抑制劑或其結合物的核酸序列之群組的一或多於一個額外核酸引入植物中。
本發明提供以上述方法生產的VLP。該VLP之嵌合病毒三聚表面蛋白可包含植物特定的N-聚糖或經修飾的N-聚糖。該VLP亦可包含一或多於一衍生自植物的脂質。
本發明包括含有有效劑量的如上所述用於引起免疫反應之VLP，以及藥學上可接受之載體的組成物。
本發明係相關於在植物中生產來自反轉錄病毒、桿狀病毒、疱疹病毒、冠狀病毒或絲狀病毒科之病毒的嵌合病毒三聚表面蛋白質以及生產含有這些嵌合病毒三聚表面蛋白質的類病毒顆粒。
此外，本發明係相關於在植物中生產人類免疫缺陷病毒(HIV)、狂犬病毒、水痘帶狀疱疹病毒(VZV)、嚴重急性呼吸道症候群(SARS)病毒或伊波拉病毒嵌合三聚表面蛋白質。本發明相關於在植物中生產HIV、狂犬病、VZV、SARS以及伊波拉嵌合類病毒顆粒。
根據本發明，有提供在植物中生產嵌合HIV、狂犬病、VZV、SARS或伊波拉VLP的方法，其包含將操作性地連結至在植物中具活性的調節區域之編碼嵌合HIV、狂犬病、VZV、SARS或伊波拉病毒蛋白質的核酸引入植物或植物的部分，並且於允許核酸表現的條件下培養植物或植物的部分，從而生產嵌合HIV、狂犬病、VZV、SARS或伊波拉VLP。
本發明進一步提供含有嵌合HIV、狂犬病、VZV、SARS或伊波拉蛋白質的VLP。該VLP可經由如同本發明提供的方法生產。亦可在植物內生產HIV、狂犬病、VZV、SARS或伊波拉VLP。
根據本發明之嵌合VLPs或由HIV、狂犬病、VZV、SARS或伊波拉衍生的蛋白質生產之VLPs不包含M1蛋白質。已知M1蛋白質結合RNA，其可視為VLP製備的汙染。當獲得抗原(VLP)產物之管理批准時，RNA的存在是不希望的，因此缺少RNA的嵌合VLP製備可能是有利的。
雖然原生的HIV Env蛋白質不善累積於植物中，融合至來自流感HA之穿膜(TM)以及胞質尾(CT)區域的嵌合HIV Env蛋白質在植物中以高程度累積並且在無核心或基質蛋白下出芽至HIV VLP。
此發明之摘要不一定描述本發明的所有特徵。
下列描述為一較佳之具體實施例。
本發明係相關於類病毒顆粒(VLPs)。更具體地，本發明係針對包含嵌合病毒蛋白質之VLPs，以及在植物中生產嵌合VLP的方法。VLPs包含融合(嵌合)蛋白，其連續地包含來自病毒三聚表面蛋白質(病毒的三聚表面蛋白質)或其片段之膜外區域，其與穿膜區域以及胞質尾區域(TM/CT)融合。來自病毒三聚表面蛋白質的膜外區域相關於TM/CT為異源的。TM/CT為來自流感血球凝集素(HA)之TM/CT。
病毒三聚表面蛋白質(亦稱為病毒三聚表面蛋白質)為於具套膜病毒的表面發現之蛋白質，其以三聚體的形式(通常為同源三體)並且位於每個單體的C端末端包含穿膜區域以及胞質尾區域(TM/CT)。病毒三聚表面蛋白質可以是醣蛋白或套膜蛋白。三聚體為經由三個通常為非共價性鍵結的蛋白質形成的巨分子複合體。在不希望受理論約束的情況下，蛋白質的三聚區域對此類三聚體的形成可以是重要的。因此病毒三聚表面蛋白質或其片段的單體可包含三聚區域。病毒三聚表面蛋白質或其片段進一步包含膜外區域。三聚表面蛋白質的膜外區域係暴露於外部環境並且不包括穿膜區域以及胞質尾區域。如同本文所描述的，來自病毒三聚表面蛋白質的膜外區域不是衍生自流感病毒。
根據本發明的各種具體實施例之嵌合VLP包含穿膜區域以及胞質尾區域(TM/CT)由流感HA獲得之TM/CT取代的病毒三聚表面蛋白質。該病毒三聚表面蛋白質相關於TM/CT為異源性的。病毒三聚表面蛋白質可沒有限制地衍生自反轉錄病毒科、桿狀病毒科、疱疹病毒科、冠狀病毒科、副黏液病毒科、痘病毒科或絲狀病毒科的病毒。此病毒三聚表面蛋白質可衍生自例如慢病毒屬、狂犬病病毒屬、水痘病毒屬、冠狀病毒屬或伊波拉病毒屬。病毒三聚表面蛋白質可衍生自例如但不限於HIV、狂犬病病毒、VZV、RSV、SARS病毒、伊波拉病毒、麻疹、腮腺炎、水痘、巨細胞病毒、伊波拉/絲狀病毒、疱疹病毒、EpsteinBarr病毒或天花。病毒三聚表面蛋白質可以是例如三聚表面蛋白質並且在其原生形式可包含穿膜區域/胞質尾，其例如但不限於：
a.　F蛋白質(副黏液病毒科：RSV、麻疹、腮腺炎、新城病)；
b.　S蛋白質(冠狀病毒科：SARS)；
c.　env蛋白質(反轉錄病毒科：HIV)；
d.　G蛋白質(桿狀病毒科：狂犬病)；
e.　套膜醣蛋白例如E、B、C、I、H(疱疹病毒科：VZV、巨細胞病毒、疱疹病毒、艾巴氏病毒)；
f.　GP醣蛋白(絲狀病毒科：伊波拉、馬堡)；
g.　血球凝集素(痘病毒科：天花病毒、牛痘病毒)。
可根據本發明使用之數種病毒三聚表面蛋白質的非限制性範例係更詳細描述於下。
HIV
本發明提供包含嵌合人類免疫缺陷病毒(HIV)蛋白質的VLP，以及生產嵌合HIV VLP的方法，此嵌合HIV蛋白質包含帶有例如HIV Env蛋白質以及一部份流感血球凝集素(HA)(例如穿膜區域以及胞質尾區域(TM/CT))之融合蛋白質。
本發明提供包含操作性地連結至在植物中具活性的調節區域之編碼嵌合HIV蛋白質之核苷酸序列的核酸。
此外，本發明提供在植物中生產嵌合HIV VLP的方法。該方法涉及將操作性地連結至在植物中具活性的調節區域之編碼嵌合HIV蛋白質之核酸引入至植物或植物的部分，並且將植物或植物的部分於容許核酸表現的條件下培養，從而生產嵌合HIV VLP。
本發明進一步提供包含嵌合HIV蛋白的VLP。可經由如同本發明所提供之方法生產此VLP。
狂犬病病毒
本發明亦提供包含嵌合狂犬病病毒蛋白質的VLP，以及生產嵌合狂犬病VLP的方法，此嵌合狂犬病病毒蛋白質包含帶有例如狂犬病G蛋白質以及一部份的流感血球凝集素(HA)(例如穿膜區域以及胞質尾區域(TM/CT))之融合蛋白質。
本發明提供包含操作性地連結至在植物中具活性的調節區域之編碼嵌合狂犬病病毒蛋白質之核苷酸序列的核酸。
此外，本發明提供在植物中生產嵌合狂犬病病毒VLP的方法。該方法涉及將操作性地連結至在植物中具活性的調節區域之編碼嵌合狂犬病病毒蛋白質之核酸引入至植物或植物的部分，並且將植物或植物的部分於容許核酸表現的條件下培養，從而生產嵌合狂犬病病毒VLP。
本發明進一步提供包含嵌合狂犬病病毒蛋白質的VLP。可經由如同本發明所提供之方法生產此VLP。
VZV
本發明亦針對包含嵌合水痘帶狀疱疹病毒(VZV)蛋白質的VLP，以及生產嵌合VZV VLP的方法，此嵌合VZV蛋白質包含帶有例如VZV醣蛋白E以及一部份的流感血球凝集素(HA)(例如穿膜區域以及胞質尾區域(TM/CT))之融合蛋白質。
本發明提供包含操作性地連結至在植物中具活性的調節區域之編碼嵌合VZV蛋白質之核苷酸序列的核酸。
此外，本發明提供在植物中生產嵌合VZV VLP的方法。該方法涉及將操作性地連結至在植物中具活性的調節區域之編碼嵌合VZV蛋白質之核酸引入至植物或植物的部分，並且將植物或植物的部分於容許核酸表現的條件下培養，從而生產嵌合VZV VLP。
本發明進一步提供包含嵌合VZV蛋白質的VLP。可經由如同本發明所提供之方法生產此VLP。
SARS
本發明亦針對包含嵌合嚴重急性呼吸道症候群(SARS)病毒蛋白質的VLP，以及生產嵌合SARS VLP的方法，此嵌合SARS蛋白質包含帶有例如SARS醣蛋白S以及一部分的流感血球凝集素(HA)(例如穿膜區域以及胞質尾區域(TM/CT))之融合蛋白質。
本發明提供包含操作性地連結至在植物中具活性的調節區域之編碼嵌合SARS蛋白質之核苷酸序列的核酸。
此外，本發明提供在植物中生產嵌合SARS VLP的方法。該方法涉及將操作性地連結至在植物中具活性的調節區域之編碼嵌合SARS病毒蛋白質之核酸引入至植物或植物的部分，並且將植物或植物的部分於容許核酸表現的條件下培養，從而生產嵌合SARS VLP。
本發明進一步提供包含嵌合SARS病毒蛋白質的VLP。可經由如同本發明所提供之方法生產此VLP。
伊波拉
本發明亦針對包含嵌合伊波拉病毒蛋白質的VLP，以及生產嵌合伊波拉VLP的方法，此嵌合伊波拉病毒蛋白質包含帶有例如伊波拉病毒套膜醣蛋白以及一部分的流感血球凝集素(HA)(例如穿膜區域以及胞質尾區域(TM/CT))之融合蛋白質。
本發明提供包含操作性地連結至在植物中具活性的調節區域之編碼嵌合伊波拉病毒蛋白質之核苷酸序列的核酸。
此外，本發明提供在植物中生產嵌合伊波拉VLP的方法。該方法涉及將操作性地連結至在植物中具活性的調節區域之編碼嵌合伊波拉病毒蛋白質之核酸引入至植物或植物的部分，並且將植物或植物的部分於容許核酸表現的條件下培養，從而生產嵌合伊波拉VLP。
本發明進一步提供包含嵌合伊波拉病毒蛋白質的VLP。可經由如同本發明所提供之方法生產此VLP。
嵌合作用與VLP生成
水泡性口炎病毒(類桿狀病毒之狂犬病)以及單純疱疹病毒(類疱疹病毒之水痘帶狀疱疹病毒)兩者以VSP-4依賴性方式出芽(Taylor et al. J. Virol 81:13631-13639,2007；Crump et al.,J. Virol 81:7380-7387,2007)。由於VSP4與基質蛋白質的後期功能區交互作用，此意味需要基質蛋白質用於出芽，以及作為一個必然結果，用於VLP生產。然而，如同本文中所描述的，當將TM/CT區域以流感HA的那些者取代時，狂犬病以及VZV VLP可在沒有基質蛋白質下生產。在不希望受理論約束的情況下，此意味嵌合作用可消除對狂犬病與VZV之VLP生成之基質蛋白質共同表現的依賴。
將如同上述的病毒三聚表面蛋白質之膜外區域融合至穿膜區域以及胞質尾區域(TM/CT)，從而使病毒三聚表面蛋白質相關於TM/CT為異源的。此TM/CT可以是來自流感血球凝集素(HA)的TM/CT，例如來自H5或H3的TM/CT，例如但不限於A/印尼/5/05亞型(H5N1；「H5/Indo」；GenBank登錄號ABW06108.1)、H5 A/越南/1194/2004(A-越南；GenBank登錄號ACR48874.1)、H5 A/安徽/1/2005(A-安徽；GenBank登錄號ABD28180.1)；H3 A/布利斯班/10/2007(「H3/Bri」；GenBank登錄號ACI26318.1)、H3 A/威斯康辛/67/2005(A-WCN；GenBank登錄號ABO37599.1)。數個H3與H5序列邊界之TM/CT係於WO 2010/148511中描述(將其以引用的方式併入本文)。舉例來說，不將其視為限制TM/CT之胺基酸序列，可包括：
H5(A/印尼/05/2005)TM/CT(SEQ ID NO：41)：
QILSIYSTVASSLALAIMMAGLSLWMCSNGSLQCRICI
H3(A/布利斯班/10/2007)TM/CT(SEQ ID NO：42)：
DWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI
以及編碼SEQ ID NO：41或42之胺基酸序列的任何核苷酸序列。
在本發明中提到的特定核酸序列，可以是「大體上同源的」或「大體上相似」於與一或多於一如同本文所定義的核苷酸序列在嚴格的雜交條件下雜交之序列或互補序列。當至少大約70%或更佳地75%之核苷酸與定義長度之核苷酸序列相配時，序列為「大體上同源」或「大體上相似」，規定此類同源序列表現此序列的一或多於一之特性，或如同本文所描述之編碼產物。舉例來說，來自病毒三聚表面蛋白質之大體上同源的膜外區域，其與由H3或H5獲得的穿膜區域以及胞質尾區域融合、與H3或H5之TM/CT大體上同源的穿膜區域以及胞質尾並且融合至來自病毒三聚表面蛋白質之膜外區域，或來自病毒三聚表面蛋白質之大體上同源的TM/CT與大體上同源的膜外區域兩者，以形成VLP。嵌合蛋白質的正確折疊對於蛋白質的穩定性、集合體(multimer)的形成、VLP的形成與功能可能是重要的。蛋白質的折疊可被一或更多因素影響，其包括但不限於，蛋白質的序列、蛋白質的相對豐度、細胞內的擁擠程度、可結合或暫時結合於折疊的、部分折疊的或未折疊的蛋白質之輔助因子的可得性。
這種序列相似性可使用核苷酸序列比對程序測定，例如在DNASIS中提供者(使用例如但不限於下列參數：GAP懲罰5、頂對角線5#、固定GAP懲罰10,k-元組2、浮動差距10以及視窗尺寸5)。然而，序列對齊比對的其他方法為本領域熟知的，例如Smith & Waterman演算法(1981,Adv. Appl. Math. 2:482)、Needleman & Wunsch(J. Mol. Biol. 48:443,1970)、Pearson & Lipman(1988,Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444)以及經由這些演算法之計算實施(GAP、BESTFIT、FASTA以及BLAST，其經由NIH提供)，或經由手動對齊以及目視檢查(見例如Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.,eds. 1995 supplement)。或於嚴格的條件下使用南方或北方雜交(見Maniatis et al.,in Molecular Cloning(A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Laboratory,1982)。較佳地，大體上同源的序列表現出對於所定義長度分子至少約80%以及最佳地至少約90%之序列相似性。
此類嚴格雜交條件的一個範例可為於65℃下在4 X SSC中雜交隔夜(約16-20小時)，接著於65℃下在0.1 X SSC中清洗1小時，或於65℃下在0.1 X SSC中清洗2次，每次20或30分鐘。替代地範例性嚴格雜交條件可為於42℃下在50%甲醯胺、4 X SSC中隔夜(16-20小時)，接著於65℃下在0.1 X SSC中清洗1小時，或於65℃下在0.1 X SSC中清洗2次，每次20或30分鐘，或於65℃下在Church磷酸鹽緩衝水溶液(7% SDS；0.5M NaPO4緩衝液pH 7.2；10 mM EDTA)中隔夜(16-20小時)的雜交，針對獨特的序列區域伴隨於50℃下在0.1 X SSC、0.1% SDS的兩次清洗，每次20或30分鐘，或者於65℃下在2 X SSC、0.1% SDS的兩次清洗，每次20或30分鐘。
編碼嵌合多肽、嵌合蛋白質、融合蛋白質、嵌合病毒蛋白質或嵌合病毒三聚表面蛋白質的核酸可描述為「嵌合核酸」或「嵌合核苷酸序列」。舉例來說，其不認為是限制，可將包含嵌合HIV蛋白質、嵌合狂犬病病毒蛋白質、嵌合VZV蛋白質、嵌合SARS或嵌合伊波拉病毒蛋白質的類病毒顆粒描述為「嵌合VLP」。
由「嵌合蛋白質」或「嵌合多肽」，亦稱為融合蛋白質，它意指為包含來自兩個或多於兩個來源的胺基酸序列之蛋白質或多肽，其例如但不限於來自病毒三聚表面蛋白質或其片段的膜外區域，舉例來說F蛋白質(例如RSV、麻疹、腮腺炎、新城病)、S蛋白質(例如SARS)、env蛋白質(HIV)、G蛋白質(狂犬病)、套膜醣蛋白例如E、B、C、I、H(VZV、巨細胞病毒、疱疹病毒、艾巴氏病毒)、GP醣蛋白(例如伊波拉、馬堡)、血球凝集素(例如天花病毒、牛痘病毒)，以及例如HA的TM/CT，其以單一多肽融合。此嵌合蛋白質或多肽可包括與多肽或蛋白質的剩餘部分相同或同源的信號肽。
該用語「信號肽」為本領域熟知的並且一般意指胺基酸的短(大約5-30胺基酸)序列，一般發現於引導新轉譯的多肽轉位至特定胞器或協助多肽鏈的特定區域相對於其他者的定位之多肽的N端。作為非限制性的範例，此信號肽可能以蛋白質的轉位至內質網為目標及/或協助相對於新生多肽之膜錨定區域之N端近端區域的定位，以協助成熟蛋白質(不視為限制之例如成熟HA蛋白質)的切割與折疊。
信號肽(SP)對蛋白質或病毒蛋白質可為原生的，或是信號肽相關於蛋白質或表現的病毒蛋白質之一級序列可為異源的。蛋白質或病毒蛋白質可包含來自第一型流感、亞型或病毒株的信號肽，伴隨來自一或多於一不同型流感、亞型或病毒株之HA的平衡。舉例來說可使用HA的B、H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9亞型或流感B型的原生信號肽以在植物系統中表現嵌合病毒蛋白質。在本發明的一些具體實施例中，SP可能是流感B型、H1、H3或H5；或是H1/Bri、H1/NC、H5/Indo、H3/Bri或B/Flo亞型。在一些具體實施例中，SP可能是HIV Env蛋白質、狂犬病G蛋白質、VZV醣蛋白E、SARS醣蛋白S或伊波拉病毒套膜醣蛋白。
信號肽亦可能是非原生的，舉例來說，來自蛋白質、病毒蛋白質、病毒三聚表面蛋白質或病毒三聚表面蛋白質以外的病毒血球凝集素，或來自植物、動物或細菌的多肽。可使用的信號肽的一個非限制性範例為苜蓿草(alfalfa)蛋白質雙硫鍵異構酶(PDI SP；登錄號Z11499之核苷酸32-103)。
因此本發明提供包含原生的或非原生之信號肽的嵌合病毒蛋白質，以及編碼此類嵌合病毒蛋白質之核酸。
在其他特性中，表現之嵌合病毒蛋白質的正確折疊對蛋白質的穩定性、單體集合體的生成、VLP的生成、嵌合病毒蛋白質的功能與嵌合病毒蛋白質被抗體辨認可能是重要的。蛋白質的折疊與累積可被一或更多因素影響，其包括但不限於，蛋白質的序列、蛋白質的相對豐度、細胞內的擁擠程度、於細胞隔間內的pH、可結合或暫時結合於折疊的、部分折疊的或未折疊的蛋白質之輔助因子的可得性、一或更多帶位子蛋白質的存在，或諸如此類者。
熱休克蛋白(Hsp)或壓力蛋白(stress protein)為帶位子蛋白質的範例，其可參與於各種細胞程序包括蛋白質合成、細胞內運輸、錯誤折疊的預防、蛋白質聚集的預防、蛋白質複合體的組裝與分解、蛋白質折疊以及蛋白質解聚作用。此類帶位子蛋白質的範例包括但不限於Hsp60、Hsp65、Hsp 70、Hsp90、Hsp100、Hsp20-30、Hsp10、Hsp100-200、Hsp100、Hsp90、Lon、TF55、FKBPs、環菲林、ClpP、GrpE、泛蛋白、鈣聯蛋白以及蛋白質雙硫鍵異構酶(見例如Macario,A.J.L.,Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70. 1995；Parsell,D.A. & Lindquist,S. Ann. Rev. Genet. 27:437-496(1993)；美國專利號5,232,833)。如同本文所描述，可使用帶位子蛋白質例如但不限於Hsp40與Hsp70以確保嵌合病毒蛋白質的折疊。
Hsp70的範例包括來自哺乳動物細胞的Hsp72以及Hsc73、來自細菌的DnaK，特別地為分枝桿菌例如麻瘋分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)以及牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)(例如Bacille-Calmette Guerin：此處提及為Hsp71)。來自大腸桿菌(Escherichia coli)、酵母菌以及其他原核生物的DnaK，以及來自真核生物例如阿拉伯芥(A. thaliana)的BiP與Grp78(Lin et al. 2001 Cell Stress and Chaperones 6:201-208)。Hsp70的特定範例為阿拉伯芥Hsp70(由Genbank ref：AY120747.1編碼)。Hsp70能專一地結合ATP以及未折疊的多肽與肽，從而參與蛋白質折疊與展開以及在蛋白質複合體之組裝與分解。
Hsp40的範例包括來自原核生物例如E. coli與分枝桿菌的DnaJ以及來自真核生物例如苜蓿草(alfalfa)之HSJ1、HDJ1與Hsp40(Frugis et al.,1999. Plant Molecular Biology 40:397-408)。Hsp40的特定範例為M. sativa MsJl(Genbank ref：AJ000995.1)。Hsp40扮演於其他細胞活動中之蛋白質折疊、耐熱性與DNA複製中的分子帶位子角色。
在Hsps中，Hsp70以及其共同帶位子Hsp40涉及在合成完成之前轉譯與新合成之多肽的穩定。在不希望受理論約束的情況下，Hsp40結合至未折疊(新生或新轉移)的多肽之疏水區(hydrophobic patches)，因而促進Hsp70-ATP複合體與多肽的交互作用。ATP水解導致多肽、Hsp70與ADP間穩定複合體的生成以及Hsp40的釋出。Hsp70-ADP複合體與多肽疏水區的結合防止它們與其他疏水區的交互作用，防止不正確折疊以及與其他蛋白質之聚集體的形成(於Hartl,FU. 1996. Nature 381:571-579中回顧)。
原生帶位子蛋白質可能促進低表現量的重組蛋白質之正確折疊，但隨著表現量的增加，原生帶位子的豐度可能變為限制因素。在農桿菌轉殖之葉的嵌合病毒蛋白質之高表現量可能導致嵌合病毒蛋白質在細胞溶質中的累積，並且一或多於一的帶位子蛋白質例如Hsp70、Hsp40或Hsp70與Hsp40兩者的共同表現可能降低錯誤折疊或聚集的蛋白質量，並且增加表現容許類病毒顆粒生成的三級與四級結構特徵之蛋白質數量。
因此，本發明亦提供在植物中生產嵌合病毒蛋白質VLP的方法，其中編碼嵌合病毒蛋白質的第一核酸係與編碼帶位子的第二核酸共同表現。可將第一與第二核酸於同一步驟引至植物中，或可相繼地引至植物中。
根據本發明之由病毒衍生蛋白質生產的嵌合VLP不包含病毒基質或核心蛋白質。病毒基質蛋白質為組織與維持病毒顆粒結構的蛋白質。病毒基質蛋白質通常與細胞膜直接交互作用並且可涉及出芽程序。病毒核心蛋白質為構成核鞘的部分以及典型地直接關聯於病毒核酸的蛋白質。病毒基質或核心蛋白質的範例為流感M1、RSV M以及反轉錄病毒gag蛋白質。已知M1蛋白質結合RNA(Wakefield L.,and Brownlee G. G.,Nucl Acids res 11:85698580,1989)，其為VLP製備的汙染。當獲得嵌合VLP產物之管理批准時，RNA的存在是不希望的，因此缺少RNA的嵌合VLP製備可能是有利的。
本申請書中的用語「調節區域」、「調節元素」或「啟動子」之使用係意圖典型地反映核酸之部分，但非總是基因的蛋白質編碼區域上游，該編碼區域可由DNA或RNA或者DNA與RNA兩者組成。當調節區域為具活性的，並且與興趣基因於操作的結合或操作地連結時，此可造成興趣基因的表現。調節元素可能媒介器官專一性或控制進展的或時序的基因活化。「調節區域」可包括啟動子元素、表現基礎啟動子活性之核心啟動子元素、對回應外部刺激為可誘導之元素、媒介啟動子活性之元素例如負調控元素或轉錄增強子。如同本文使用的，「調節區域」亦可包括轉錄之後具活性的元素，舉例來說，調節基因表現的調節元素例如轉譯與轉錄增強子、轉譯與轉錄抑制子、上游活化序列以及mRNA不穩定性決定因素。這些後者因素中的幾個可位於編碼區域近端。
在此揭露內容之上下文中，該用語「調節元素」或「調節區域」典型地意指通常但非總是於結構基因的編碼序列上游(5')之DNA序列，其經由提供RNA聚合酶及/或轉錄需要的其他因子之辨識而於特定位點開始以控制編碼區域的表現。然而，要了解位於內含子內的其他核苷酸序列或序列的3'亦可有助於興趣編碼區域表現之調節。提供RNA聚合酶或其他轉錄元素辨識以確保於特定位點起始之調節元素的範例為啟動子元素。大部分但非全部地，真核生物的啟動子元素包含TATA盒、由腺苷酸與胸腺苷酸鹼基對組成之保留核酸序列，其通常位於轉錄起始位點上游大約25鹼基對。啟動子元素包含負責轉錄的起始之基礎啟動子元素，以及修飾基因表現的其他調節元素(如上所列者)。
有幾種類型的調節區域，包括那些發展性調節，可誘導的(inducible)或非誘導的(constitutive)。被發展性調節的或在其控制之下控制基因的分化表現的調節區域，係於那器官或組織發育期間的特定時間於某些器官或器官之組織內活化。然而，發展性調節的一些調節區域可於特定器官或組織內於特定發育階段較佳地活化，它們也可以發展性調節的方式具有活性，或同樣地在植物中的其他器官或組織位在基本量。組織特異的調節區域之範例，例如see-specific調節區域，其包括napin啟動子，以及cruciferin啟動子(Rask et al.,1998,J. Plant Physiol. 152: 595-599；Bilodeau et aI.,1994,Plant Cell 14: 125-130)。葉特異性啟動子的範例包括plastocyanin啟動子(見US 7,125,978，將其以引用的方式併入本文)。
可誘導的調節區域是能夠對誘導子反應而直接或間接活化一或更多DNA序列或基因之轉錄者。在缺少誘導子下，DNA序列或基因將不會被轉錄。典型地特異性地結合至可誘導調節區域以活化轉錄作用之蛋白質因子可以未活化形式存在，其再被誘導子直接或間接轉變為活化形式。然而，蛋白質因子亦可不存在。誘導子可以是化學劑例如蛋白質、代謝產物、生長調節劑、除草劑或酚類化合物或由熱、冷、鹽、有毒元素直接施加或經由病原體或疾病之劑(例如病毒)之作用間接施加的生理壓力。可將包含可誘導調節區域之植物細胞經由外部應用誘導子至細胞或植物(例如經由噴灑、澆灌、加熱或類似的方法)而暴露於誘導子。可誘導的調節元素可衍生自植物或非植物基因(例如Gatz,C. and Lenk,LR.P.,1998,Trends Plant Sci. 3,352-358；將其以引用的方式併入)。潛在的可誘導啟動子之範例包括但不限於可由四環黴素誘導之啟動子(Gatz,C.,1997,Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. BioI. 48,89-108；將其以引用的方式併入)、可由類固醇誘導之啟動子(Aoyama. T. and Chua,N.H.,1997,Plant 1. 2,397-404；將其以引用的方式併入)以及可由乙醇誘導之啟動子(Salter,M.G.,et aI,1998,Plant 10urnal 16,127-132；Caddick,M.X.,et al,1998,Nature Biotech. 16,177-180,將其以引用的方式併入)、可由細胞分裂素誘導之ID6與CKI 1基因(Brandstatter,I. and K.ieber,1.1.,1998,Plant Cell 10,1009-1019；Kakimoto,T.,1996,Science 274,982-985；將其以引用的方式併入)以及可由生長素誘導之元素DR5(Ulmasov,T.,et aI.,1997,Plant Cell 9,1963-1971；將其以引用的方式併入)。
結構性調節區域於整個植物的各部分以及持續地於整個植物發育中導引基因表現。已知的結構性調節元素包括關聯於CaMV 35S轉錄物之啟動子(Odell et aI.,1985,Nature,313: 810-812)、稻肌動蛋白1(Zhang et aI,1991,Plant Cell,3: 1155-1165)、肌動蛋白2(An et al.,1996,Plant J.,10:107-121)或tms 2(U.S. 5,428,147，將其以引用的方式併入本文)以及磷酸三碳醣異構酶(triosephosphate isomerase 1)基因(Xu et. aI.,1994,Plant Physiol. 106: 459-467)、玉米泛蛋白1基因(Cornejo et ai,1993,Plant Mol. BioI. 29: 637-646)、阿拉伯芥泛蛋白1與6基因(Holtorf et aI,1995,Plant Mol. BioI. 29: 637646)以及菸草轉譯起始因子4A基因(Mandel et aI,1995,Plant Mol. BioI. 29: 995-1004)。
該用語「結構性」(constitutive)如同本文中所使用，不一定指基因在非誘導調節區域的控制下於所有細胞類型中以相同量表現，而是指即使常常觀察到豐度的變化，基因在廣泛的細胞類型中表現。非誘導的調節元素可與其他序列耦合以進一步增強它們操作性結合的核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。舉例來說，CPMV-HT系統係衍生自豇豆嵌紋病毒(CPMV)的未轉譯區域並且展現相關編碼序列之增強轉譯。所謂「原生」意指核酸或胺基酸序列為天然地發生，或「野生型」。所謂「操作性地連結」意指使特定序列例如調節元素以及興趣編碼區域直接或間接交互作用以進行所欲功能，例如基因表現之媒介或調節。操作性地連結序列之交互作用可例如經由與操作性地連結序列交互作用的蛋白質媒介。
嵌合蛋白質或多肽可在包含以病毒為基礎的、DNA或RNA表現系統之表現系統中表現，例如但不限於豇豆嵌紋病毒屬(comovirus)為基礎的表現卡匣以及雙生病毒(geminivirus)為基礎的擴增元素。
如同本文所描述之表現系統可包含以雙向(bipartite)病毒或帶有兩條環狀單股基因組的病毒為基礎之表現卡匣。舉例來說，兩條環狀單股病毒可能是豇豆嵌紋病毒科(Comoviridae)。豇豆嵌紋病毒科之屬包括豇豆嵌紋病毒屬、線蟲核多角體病毒屬(Nepovirus)、豆科病毒屬(Fabavirus)、櫻桃銼葉病毒屬(Cheravirus)以及溫州蜜柑矮縮病毒屬(Sadwavirus)。豇豆嵌紋病毒屬包括豇豆嵌紋病毒(CPMV)、豇豆嚴重嵌紋病毒(CPSMV)、胡瓜嵌紋病毒(SqMV)、紅三葉草斑駁病毒(RCMV)、扁豆斑駁病毒(BPMV)、蕪菁環斑病毒(TuRSV)、蠶豆真嵌紋病毒(BBtMV)、蠶豆染色病毒(BBSV)、蘿蔔嵌紋病毒(RaMV)。包含對本發明的各方面有用的增強子元素之豇豆嵌紋病毒RNA-2序列的範例包括但不限於：CPMV RNA-2(GenBank登錄號NC_003550)、RCMV RNA-2(GenBank登錄號NC_003738)、BPMV RNA-2(GenBank登錄號NC_003495)、CPSMV RNA2(GenBank登錄號NC_003544)、SqMV RNA-2(GenBank登錄號NC_003800)、TuRSV RNA-2(GenBank登錄號NC_013219.1)、BBtMV RNA-2(GenBank登錄號GU810904)、BBSV RNA2(GenBank登錄號FJ028650)、RaMV(GenBank登錄號NC_003800)。
兩條環狀單股病毒豇豆嵌紋病毒RNA基因組的片段意指RNA-1與RNA-2。RNA-1編碼涉及複製的蛋白質而RNA-2編碼細胞-細胞移動所需的蛋白質以及兩蛋白衣蛋白質。可使用任何合適的以豇豆嵌紋病毒為基礎之卡匣包括CPMV、CPSMV、SqMV、RCMV或BPMV，舉例來說，表現卡匣可以CPMV為基礎。
「表現卡匣」意指包含在宿主細胞中在適合的啟動子或興趣核酸轉錄的其他調節元素的控制之下、並且操作性地連結於此之興趣核酸的核苷酸序列。
表現系統亦可包含來自雙生病毒的擴增元素，舉例來說，來自豆類黃矮病毒(BeYDV)之擴增元素。BeYDV屬於適應於雙子葉植物的Mastreviruses屬。BeYDV為具有單股環狀DNA基因組的單體(monopartite)並且可經由旋轉環狀機制複製至非常高的拷貝數。已使用BeYDV衍生之DNA複製子載體系統在植物中的快速高產量蛋白質生產。
如同本文中所使用的，該術語「擴增元素」意指包含雙生病毒基因組一或更多長間隔區(long intergenic region,LIR)的至少部分之核酸片段。如同本文中所使用的，「長間隔區」意指包含能夠經由雙生病毒Rep蛋白質媒介切除及複製之rep結合位點的長間隔區的區域。在一些方面，包含一或更多LIR的核酸片段可進一步包含雙生病毒基因組的短間隔區(SIR)。如同本文中所使用的，「短間隔區」意指互補之股(Mastrevirus之短IR(SIR))。任何合適的雙生病毒衍生之擴增元素可用於本文。見舉例來說WO2000/20557；WO2010/025285；Zhang X. et al.(2005,Biotechnology and Bioengineering,Vol. 93,271-279)、Huang Z. et al.(2009,Biotechnology and Bioengineering,Vol. 103,706-714)、Huang Z. et al(2009,Biotechnology and Bioengineering,Vol. 106,9-17)；將其以引用的方式併入本文。
可將嵌合蛋白質或嵌合多肽生產為來自嵌合核苷酸序列的轉錄物，與在合成後切割的嵌合蛋白質或嵌合多肽，並根據需要連結以形成單體聚合體蛋白質。因此，嵌合蛋白質或嵌合多肽亦包括含有經由雙硫橋(disulphide bridge)連結的次單元之蛋白質或多肽(即單體聚合體蛋白質)。舉例來說，可將含有來自二或多於二來源之胺基酸序列的嵌合多肽處理成次單元以及由雙硫橋連結的次單元，以生產嵌合蛋白質或嵌合多肽。
根據本發明各種具體實施例之嵌合病毒蛋白質包含來自流感HA之穿膜區域與胞質尾(TM/CT)。TM/CT可以是來自流感病毒的任何型、亞型的原生HA TM/CT，其包括，舉例來說，B、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15以及H16型或亞型。HI、H3、H5或B型或亞型的非限制性範例包括A/新喀里多尼亞/20/99亞型(H1N1)、H1 A/加州/04/09亞型(H1N1)、A/印尼/5/05亞型(H5N1)、A/布利斯班/59/2007、B/佛州/4/2006以及H3A/布利斯班/10/2007(見例如WO2009/009876；WO 2009/076778；WO 2010/003225；WO 2010/003235，將其以引用的方式併入本文)。進一步地，TM/CT可以是那些HA TM/CT中之任一者，其中已刪除1、2、3、4或5胺基酸，或已將1、2、3、4或5胺基酸之任何種類的間隔子或連結子序列加於其上。
較佳地，TM/CT係來自H5或H3，其例如但不限於A/印尼/5/05亞型(H5N1；“H5/Indo”；GenBank登錄號ABW06108.1)、H5 A/越南/1194/2004(A-越南；GenBank登錄號ACR48874.1)、H5 A/安徽/1/2005(A-安徽；GenBank登錄號ABD28180.1)；H3 A/布利斯班/10/2007(「H3/Bri」；GenBank登錄號ACI26318.1)、H3 A/威斯康辛/67/2005(A-WCN；GenBank登錄號ABO37599.1)。幾個H3與H5序列邊界的TM/CT描述於WO 2010/148511(將其經由引用的方式併入本文)。TM/CT胺基酸序列之非限制性範例包括SEQ ID NO：41與42，以及編碼SEQ ID NO：41與42之胺基酸序列的任何核苷酸序列。
在流感病毒的血球凝集素中容許胺基酸變化。此類變化提供不斷被識別的新病毒株。新病毒株間的感染性可能改變。然而，維持隨後形成VLP的血球凝集素三聚體的形成。因此，本發明提供包含血球凝集素胺基酸序列的嵌合病毒蛋白質，或編碼包含血球凝集素胺基酸序列的嵌合病毒蛋白質之核酸，其在植物中生成VLP，並且包括已知序列以及可能發展出的變異型HA序列。
該用語「類病毒顆粒」(VLP)或「類病毒顆粒」或「VLP」意指自組裝並且包含結構蛋白質例如嵌合病毒蛋白質之結構。VLP與嵌合VLP一般地在形態上與抗原性為類似於感染中產生的病毒粒子，但缺乏足以複製的遺傳資訊因而為非感染性的。VLP與嵌合VLP可在合適的宿主細胞包括植物宿主細胞中生產。在於合適條件下由宿主細胞萃取並且分離與進一步純化之後，VLP與嵌合VLP可純化為完整結構。
本發明之嵌合VLP可在以缺乏將蛋白質唾液酸化的能力為特徵之宿主細胞中生產，舉例來說植物細胞、昆蟲細胞、真菌以及其他包括海綿、腔腸動物門、環節動物門、節肢動物門、軟體動物門、線蟲動物門、輪形動物門、扁形動物門、毛顎動物門、有觸手綱、披衣菌屬、螺旋體門、革蘭氏陽性菌、藍綠藻、古細菌以及諸如此類的生物體。見例如Gupta et al.,1999. Nucleic Acids Research 27:370-372；Toukach et al.,2007. Nucleic Acids Research 35:D280-D286；Nakahara et al.,2008. Nucleic Acids Research 36:D368-D371。
本發明亦提供由表現嵌合VLP之細胞質膜獲得脂質套膜之嵌合VLP。舉例來說，若於植物為基礎的系統表現嵌合病毒，造成的嵌合VLP可由植物細胞的質膜獲得脂質套膜。
一般而言，該用語「脂質」意指脂溶性(親油的)、自然發生的分子。根據本發明的一些方面在植物中生產的嵌合VLP可與植物衍生的脂質複合。植物衍生的脂質可能是以脂雙層的形式，並且可進一步包含圍繞VLP的套膜。植物衍生的脂質可能包含生產VLP植物之質膜的脂質組成物，其包括磷脂質、三-、二-以及單甘油酯，以及脂溶性固醇或包含固醇的代謝產物。範例包括磷脂醯膽鹼(PC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂醯肌醇、磷脂醯絲胺酸、鞘髓磷脂、植物固醇或其結合物。植物衍生的脂質可替代的稱為「植物脂」。植物固醇的範例包括油菜籽固醇、豆固醇、麥角固醇、菜子固醇、d-7-豆固醇、d-7-燕麥固醇、胡蘿蔔固醇、麥固醇、24甲基膽固醇、膽固醇或β-麥固醇-見例如Mongrand et ai.,2004。如同本領域之技術人員將了解的，細胞質膜的脂質組成可隨著獲得細胞之細胞或生物體或物種的培養或生長條件而變化。一般而言，β-麥固醇為最豐富的植物固醇。
細胞膜一般包含脂雙層以及各種功能之蛋白質。特定脂質的局部濃度可發現於脂雙層，稱為「脂筏」(lipid rafts)。這些脂筏微區域可富含神經脂質與固醇。在不希望受理論約束的情況下，在胞飲與胞吐作用、病毒或其他感染性之劑的進入或外出、細胞間訊息傳遞、與細胞或個體的其他結構組成分例如細胞內與細胞外間質之交互作用中，脂筏可能具有重要角色。
在植物內生產之VLP可誘導包含植物特異N-聚醣之嵌合病毒蛋白質。因此，此發明亦提供包含具有植物特異N-聚醣之嵌合病毒蛋白質的VLP。
此外，已知植物中N-聚醣的修飾作用(見例如U.S.60/944,344；將其以引用的方式併入本文)並且可生產具有修飾N-聚醣之嵌合病毒蛋白質。含有修飾的醣基化模式之嵌合病毒蛋白質，舉例來說具有降低的海藻糖苷化、木糖苷化或海藻糖苷化與木糖苷化兩者，可獲得N-聚醣，或可獲得具有修飾的醣基化模式之嵌合病毒蛋白質，其中蛋白質缺乏海藻糖苷化(fucosylation)、木糖苷化(xylosylation)或兩者，以及含有增加的醣基化。此外，轉譯後修飾之調節，舉例來說，當相較於表現嵌合病毒蛋白質之野生型植物，尾端半乳糖的添加可造成表現之嵌合病毒蛋白質海藻糖苷化與木糖苷化的降低。
舉例來說，不將其視為限制，具有經修飾的醣基化模式之嵌合病毒蛋白質的合成可經由共同表現嵌合病毒蛋白質與編碼β-1.4-半乳糖基轉移酶(GalT)的核苷酸序列而達成，其例如但不限於哺乳動物GalT或人類GalT，然而亦可使用來自另一來源的GalT。亦可將GalT的催化區域融合至N-乙醯葡萄醣胺移轉酶(N-acetylglucosaminyl transferase,GNT1)的CTS區域(即，胞質尾、穿膜區域、幹區域)以生產GNT1-GalT混合酶，並可將混合酶與嵌合病毒蛋白質共同表現。嵌合病毒蛋白質亦可與編碼N-乙醯葡萄醣胺移轉酶III(N-acetylglucosaminyltrasnferase III,GnT-III)的核苷酸序列，其例如但不限於哺乳動物GnT-III或人類GnT-III，亦可使用來自其他來源的GnT-III共同表現。此外，亦可使用包含融合至GnT-III的GNT1 CTS之GNT1-GnT-III混合酶。
因此本發明亦提供包含具有經修飾之N-聚醣的嵌合病毒蛋白質之VLP。
在不希望受理論約束的情況下，在嵌合病毒蛋白質之植物N聚醣的存在可經由促進由抗原呈現細胞對嵌合病毒蛋白質之結合而刺激免疫反應。使用植物N聚醣的免疫反應刺激已由Saint-Jore-Dupas et al.(2007)提出。此外，VLP的結構對於抗原呈現以及當與植物衍生之脂質層複合時增強VLP的佐劑效果可能是有利的。
VLP可經由例如血凝試驗、電子顯微鏡或經由尺寸排阻色層分析法評估結構與尺寸。
對於尺寸排阻色層分析法，可將總可溶性蛋白質從植物組織中經由將冷凍粉碎的植物材料樣本在萃取緩衝液中均質化(Polytron)而萃取，以及經由離心移除不可溶材料。以冰冷丙酮或PEG沉澱亦可以是有利的。將可溶性蛋白質量化，並且將萃取物通過SephacrylTM管柱，舉例來說SephacrylTM S500管柱。可使用Blue Dextran 2000作為校正標準品。在色層分析後，可將餾分經由免疫墨點法進一步分析以測定餾分的蛋白質補體。
分離的餾分可以是例如上清液(若經離心、沉積或沉澱)或過濾液(若經過濾)，且富含蛋白質或外殼構造蛋白質，例如舉例來說類簇生結構或較高階層、較高分子量的顆粒例如VLP。分離的餾分可經由例如額外的離心步驟、沉澱、層析步驟(例如，尺寸排阻、離子交換、親和力層析)、切向流過濾或其結合而進一步處理以分離、純化、濃縮或其結合蛋白質或外殼構造蛋白質。可經由使用合適的偵測抗體、毛細管電泳、電子顯微鏡或對本領域的技術人員將是顯著的任何其他方法例如原生或SDS-PAGE、西方墨點分析確認純化蛋白質或外殼構造蛋白質的存在。
溶析概況可視所使用的溶析條件而變化。第7、8O以及11B圖顯示包含嵌合VLP的植物萃取物之尺寸排阻色層分析法溶析概況之範例。在這個情況下，包含嵌合HIV、嵌合狂犬病G以及嵌合VZV病毒三聚表面蛋白質的VLP於管柱之排除液量(void volume)溶析出，簇生物與高分子量結構由大約餾分13至14溶析，以及低分子量或嵌合病毒三聚表面蛋白質的可溶性形式由餾分約15至約17溶析。
可將VLP使用任何合適的方法例如化學或生化萃取以純化或萃取。VLP對乾燥、熱、pH、表面活性劑與清潔劑相對地敏感。因此使用最大化產量、最小化帶有細胞蛋白質之VLP餾分的汙染、維持蛋白質或VLP以及當需要時，相關脂質套膜或膜的完整性的方法、放鬆細胞壁以釋出蛋白質或VLP的方法可能是有用的。舉例來說，可使用生產原生質體及/或原生質球的方法(見舉例來說WO 2011/035422，將其以引用的方式併入本文)以獲得如同本文所描述之VLP。將清潔劑或表面活性劑例如SDS或Triton X-100的使用最小化或消除對於改善VLP萃取產量可能是有利的。可再將VLP經由例如電子顯微鏡或經由如上所述之尺寸排阻色層分析法評估結構與尺寸。
本發明的一或多於一或更多的嵌合遺傳基因構築體可於被本發明之核苷酸序列或基因構築體或載體轉化的任何適合的植物宿主中表現。適合的宿主範例包括但不限於包括苜蓿草、油菜籽、甘藍屬、玉米、菸草屬、苜蓿草、馬鈴薯、人參、豌豆、燕麥、水稻、大豆、小麥、小麥、向日葵、棉花以及諸如此類的農作物。
本發明的一或更多嵌合遺傳基因構築體可進一步包含3'不轉譯區域。3'不轉譯區域意指含有包括聚腺苷酸化訊號以及能夠造成mRNA處理或基因表現的任何其他調節訊號之DNA片段的基因部分。聚腺苷酸化訊號通常以造成追蹤mRNA先驅物之3'端的聚腺苷酸的添加為特徵。雖然變化並不少見，聚腺苷酸化訊號通常由對標準形式5' AATAAA-3'同源性的存在而確認。合適的3'區域之非限制性範例為包含農桿菌屬(Agrobacterium)腫瘤誘導(Ti)質體基因例如胭脂胺酸合成酶(nopaline synthase,NOS)基因、植物基因例如大豆貯藏蛋白質基因、1,5-二磷酸核酮糖酶基因的小次單元(ssRUBISCO；US 4,962,028；將其以引用的方式併入本文)、用於調節質體藍素表現的啟動子，其描述於US 7,125,978(將其以引用的方式併入本文)的聚腺苷酸化訊號之3'已轉錄非轉譯區域。
本發明的一或更多嵌合遺傳基因構築體亦可能需要包括進一步的增強子，轉譯或轉錄增強子。增強子可位於要轉錄的序列之5'或3'。增強子區域為本領域之技術人員所熟知的，並且可包括ATG起始密碼子、相鄰序列或諸如此類。起始密碼子如果存在，可與編碼序列之讀取框架同相(「對準框架」)以提供已轉錄序列之正確轉譯。
本發明之基因構築體可使用Ti質體、Ri質體、植物病毒載體、直接DNA轉化作用、顯微注射、電穿孔等引入植物細胞。此類技術的回顧見例如Weissbach and Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Academy Press,New York VIII,pp. 421-463(1988)；Geierson and Corey,Plant Molecular Biology,2d Ed.(1988)；以及Miki and Iyer,Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism,2d Ed. DT. Dennis,DH Turpin,DD Lefebrve,DB Layzell(eds),Addison Wesly,Langmans Ltd. London,pp. 561-579(1997)。其他方法包括直接DNA攝取、脂質體的使用、電穿孔，例如使用原生質體、顯微注射、重金屬微粒子或晶鬚以及真空滲透。見例如Bilang,et al.(Gene 100: 247-250,1991)、Scheid et al.(Mol. Gen. Genet. 228: 104-112,1991)、Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116,1987)、Neuhause et al.(Theor. Appl Genet. 75: 30-36,1987)、Klein et al.,Nature 327: 70-73(1987)；Howell et al.(Science 208: 1265,1980)、Horsch et al.(Science 227: 1229-1231,1985)、DeBlock et al.(Plant Physiology 91: 694-701,1989)、Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach and Weissbach,eds.,Academic Press Inc.,1988)、Methods in Plant Molecular Biology(Schuler and Zielinski,eds.,Academic Press Inc.,1989)、Liu and Lomonossoff(J Virol Meth,105:343-348,2002)、美國專利號4,945,050；5,036,006；以及5,100,792、於May 10,1995提出之美國專利申請輯編號08/438,666，以及於Sep. 25,1992提出之07/951,715(將其所有以引用的方式併入此)。
如下描述的，可使用短暫表現的方法以表現本發明之基因構築體(見Liu and Lomonossoff,2002,Journal of Virological Methods,105:343-348；將其以引用的方式併入本文)。替代地，可使用以真空為基礎的短暫表現方法，如同由Kapila et al.,1997所描述的(將其以引用的方式併入本文)。這些方法可能包括，舉例來說但不限於，農桿菌接種(Agroinoculation)或農桿菌滲透(Agro-infiltration)、注射器滲透(syringe infiltration)的方法，然而，如上所提亦可使用其他短暫方法。伴隨農桿菌接種、農桿菌滲透或注射器滲透，包含想要的核酸之農桿菌混合物進入組織的細胞間隙，舉例來說，葉、植物的空中部分(包括莖、葉以及花)、植物的其他部分(莖、葉、花)或整株植物。在穿越表皮後，農桿菌感染並轉移t-DNA複本至細胞。附加體地轉錄t-DNA並且轉譯mRNA，導致在感染細胞中之興趣蛋白質的生產，然而，細胞核內的t-DNA通過為暫時性的。
為協助轉化的植物細胞之鑑定，可進一步操作本發明的基因構築體以包括植物可選擇標記。有用的可選擇標記包括提供對化學物質具抗性之酵素例如抗生素，舉例來說，健他黴素(gentamycin)、潮黴素(hygromycin)、康黴素(kanamycin)或除草劑例如phosphinothrycin、草甘膦(glyphosate)、chlorosulfuron以及諸如此類。類似地，可使用提供可經由顏色改變識別的化合物生產之酵素例如GUS(β-葡萄醣醛酸酶,beta-glucuronidase)或螢光例如螢光素酶(luciferase)或GFP。
亦考量本發明部分為基因轉殖植物、包含本發明之嵌合基因構築體的植物細胞或種子。從植物細胞再生整個植物的方法亦為本領域所熟知。一般而言，將轉化的植物細胞於合適的培養基中培養，其可包含選擇性之劑例如抗生素，其使用選擇性標記以促進轉化的植物細胞之鑑定。一旦癒傷組織形成，根據已知的方法採用合適的植物荷爾蒙可促進發芽，並將芽轉移至發根培養基以供植物再生。可再使用植物建立重複之子代，其由種子或使用無性繁殖技術。亦可不使用組織培養產生基因轉殖植物。
本發明包括核苷酸序列：
表格1.序列識別編號列表。
本發明將進一步以下列範例說明。
範例 基因構築體
表格2：包含編碼HIV蛋白質的序列之基因構築體
表格3：包含編碼狂犬病病毒蛋白質的序列之基因構築體
表格4：包含編碼VZV蛋白質的序列之基因構築體
表格5：包含編碼SARS蛋白質的序列之基因構築體
實施例1：具有HIV蛋白質的表現卡匣之組裝
2X35S-CPMV HT -PDISP-HIV ConS ΔCFI-NOS(基因構築體編號995)
將融合至HIV ConS ΔCFI具有原生的穿膜區域以及胞質尾之編碼苜蓿草PDI信號肽的序列轉殖至如下的2X35S-CPMV-HT表現系統。首先，將HIV ConS ΔCFI基因的核酸序列，其包含原生信號肽與穿膜區域以及胞質尾區域經由GeneArt AG(Regensburg,Germany)根據於Liao et al(2006,Virology 353: 268-282)中揭露的序列合成。HIV ConS ΔCFI的核酸序列展示於第1A圖(SEQ ID NO：1)。將苜蓿草蛋白質雙硫異構酶(PDISP)(核苷酸32-103；登錄號Z11499)的信號肽經由Darveau et al.(Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))呈現的以PCR為基礎之接合方法連結至HIV ConS ΔCFI。在PCR的第一回合，將包含PDISP的片段使用引子IF-ApaI-SpPDI.c(第1B圖，SEQ ID NO：2)及SpPDI-HIV gp145.r(第1C圖，SEQ ID NO：3)擴增，並且以基因構築體編號540(對於基因構築體編號540的序列見WO 2010/003225之第52圖，SEQ ID NO：61，將其以引用的方式併入本文)作為模板。將包含ConS ΔCFI而不帶原生信號肽的第二片段使用引子IF-SpPDI-gp145.c(第1D圖，SEQ ID NO：4)以及WtdTm-gp145.r(第1E圖，SEQ ID NO：5)擴增，其使用合成的ConS ΔCFI片段(第1A圖，SEQ ID NO：1)作為模板。在PCR的第二回合，使用引子IF-ApaI-SpPDI.c(第1B圖，SEQ ID NO：2)與WtdTm-gp145.r(第1E圖，SEQ ID NO：5)隨著來自PCR之第一回合的PCR產物兩者作為模板。將生成的PCR產物以ApaI限制酶消化並轉殖至以ApaIStuI消化之經修飾的972基因構築體。將經修飾的972受體質體(對於基因構築體編號972的原始序列見WO 2010/003225之第94圖，SEQ ID NO：134，將其以引用的方式併入本文)處理以消除2X35S啟動子上游的SbfI限制位點。SbfI位點經由以SbfI消化質體972而消除，以T4DNA聚合酶處理生成的質體以移除3’外懸並再接合經處理的質體，造成不帶SbfI位點之經修飾的972質體。給予生成的基因構築體編號995(第1F圖，SEQ ID NO：6)。PDISP-HIV ConS ΔCFI的胺基酸序列係展示於第1G圖(SEQ ID NO：7)。質體995示意係展示於第1H圖。此基因構築體不編碼M1蛋白質。
2X35S-CPMV HT-PDISP-HIV ConS ΔCFI+H3 A/布利斯班/10/2007(TmD+Cyto tail)-NOS(基因構築體編號997)
將融合至HIV ConS ΔCFI以及H3 A/布利斯班/10/2007之穿膜以及胞質尾區域之編碼苜蓿草PDI信號肽的序列使用由Darveau et al.(Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))呈現的以PCR為基礎之接合方法轉殖至如下的2X35S-CPMV-HT表現系統。在PCR的第一回合，將包含PDISP-HIV ConS ΔCFI而不帶原生穿膜以及胞質尾區域的片段使用引子IF-ApaISpPDI.c(第1B圖，SEQ ID NO：2)以及IF-H3dTm+gp145.r(第2A圖，SEQ ID NO：8)擴增，使用基因構築體995(第1F圖，SEQ ID NO：6)作為模板。將包含H3A/布利斯班/10/2007之穿膜以及胞質尾區域的第二片段使用引子Gp145+H3dTm.c(第2B圖，SEQ ID NO：9)以及H3dTm.r(第2C圖，SEQ ID NO：10)擴增，使用基因構築體編號776(對於基因構築體編號776序列見WO 2010/003225之第60圖，SEQ ID NO：69，將其以引用的方式併入本文)作為模板。再將來自兩擴增之PCR產物混合並且使用作為第二回合的擴增之模板，使用IF-ApaI-SpPDI.c(第1B圖，SEQ ID NO：2)以及H3dTm.r(第2C圖，SEQ ID NO：10)作為引子。再將第二回合PCR的產物以ApaI消化並轉殖至以ApaI以及StuI限制酶消化之基因構築體編號995(第1F圖，SEQ ID NO：6)(Figure 1F,SEQ ID NO：6)。給予生成的基因構築體編號997(第2D圖，SEQ ID NO：11)。PDISP-HIV ConS ΔCFI-A/布利斯班/10/2007H3 TM+CT的胺基酸序列係展示於第2E圖(SEQ ID NO：12)。質體997示意係展示於第2F圖。此基因構築體不編碼M1蛋白質。
2X35S-CPMV HT-PDISP-HIV ConS ΔCFI-H5 A/印尼/5/2005(TmD+Cyto tail)-NOS(基因構築體編號999)
將融合至HIV ConS ΔCFI以及H5 A/印尼/5/2005之穿膜以及胞質尾區域之編碼苜蓿草PDI信號肽的序列使用由Darveau et al.(Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))呈現的以PCR為基礎之接合方法轉殖至如下的2X35S-CPMV-HT表現系統。在PCR的第一回合，將包含PDISP-HIV ConS ΔCFI而不帶原生的穿膜以及胞質尾區域的片段使用引子IF-ApaISpPDI.c(第1B圖，SEQ ID NO：2)以及IF-H5dTm+gp145.r(第3A圖，SEQ ID NO：13)擴增，使用基因構築體995(第1F圖，SEQ ID NO：6)作為模板。將包含H5 A/印尼/5/2005之穿膜以及胞質尾區域的第二片段使用引子Gp145+H5dTm.c(第3B圖，SEQ ID NO：15)以及IF-H5dTm.r(第3C圖，SEQ ID NO：15)擴增，使用基因構築體編號972(對於基因構築體編號972序列見WO 2010/003225之第94圖，SEQ ID NO：134，將其以引用的方式併入本文)作為模板。再將來自兩擴增之PCR產物混合並且使用作為第二回合的擴增之模板，使用IF-ApaI-SpPDI.c(第1B圖，SEQ ID NO：2)以及IFH5dTm.r(第3C圖，SEQ ID NO：15)作為引子。再將第二回合PCR的產物以ApaI消化並轉殖至以ApaI以及StuI限制酶消化之基因構築體編號995(第1F圖，SEQ ID NO：6)。給予生成的基因構築體編號999(第3D圖，SEQ ID NO：16)。PDISP-HIV ConS ΔCFI-A/印尼/5/2005 H5 TM+CT. TM+CT的胺基酸序列係展示於第3E圖(SEQ ID NO：17)。質體999示意係展示於第3F圖。此基因構築體不編碼M1蛋白質。
質體藍素-P19-質體藍素(基因構築體編號172)
如下所述將編碼來自番茄叢矮病毒(Tomato Bushy StuntVirus,TBSV)的P19沉默抑制子的序列轉殖至苜蓿草質體藍素啟動子以及3’UTR與終止子之間。將基因構築體編號R472(對於組裝見WO 2010/003225 A1，將其以引用的方式併入本文，以及對於R472質體之示意見WO 2010/003225 A1之第86圖)以限制酶DraIII(起始ATG上游84鹼基對)以及SacI(終止碼下游9鹼基對)消化以移除包含84 bp來自苜蓿草質體藍素啟動子以及編碼TBSV P19沉默抑制子的序列之片段。將生成的片段轉殖至先前以DraIII與SacI消化的基因構築體540(對於組裝見WO 2010/003225，將其以引用的方式併入本文，以及對於540質體之示意，見相同專利的第6圖)。給予生成的基因構築體編號172(SEQ ID NO：4A，第18圖)。TBSV P19蛋白質的胺基酸序列係展示於第4B圖(SEQ ID NO：19)。質體172示意係展示於第4C圖。
植物生質之製備、接種與農桿菌滲透
該用語「生質」以及「植物物質」如同本文中所使用地係意指反映衍生自植物的任何材料。生質或植物物質可包含整個植物、組織、細胞或其任何部分。進一步地，生質或植物物質可包含細胞內植物組成物、細胞外植物組成物、植物的液體或固體萃取物或其結合物。進一步地，生質或植物物質可包含來自植物的葉、莖、果實、根或其結合物的植物、植物細胞、組織、液體萃取物或其結合物，其。植物的部分可包含植物物質或生質。
圓葉菸草(Nicotiana benthamiana)植物係從充滿商業的泥炭蘚基質之平地中的種子生長。容許植物生長於16/8光照週期以及25℃日/20℃夜之溫度制度下的溫室。在播種後三星期，將個別的植株挑選出來，移植於盆中並使其在相同環境條件下於溫室生長額外的三星期。
將以每個基因構築體轉染之農桿菌於以10 mM 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)、20 μM乙醯丁香酮、50 μg/ml康黴素以及25 μg/ml卡本西林pH5.6補充的YEB培養基生長直到它們達到OD600介於0.6與1.6之間。將農桿菌懸浮液在使用前離心並重新懸浮於滲透培養基(10 mM MgCl2以及10 mM MES pH 5.6)並且於4℃儲存隔夜。在滲透之日，將培養批次以2.5培養體積稀釋並在使用前使其回溫。將圓葉菸草整株植物在20-40 Torr真空下倒置於在一氣密的不銹鋼罐中之細菌懸浮液2分鐘。將植物返回溫室2-6日的培養期間直到收穫。除非另外指出，所有滲透係以菌株AGL1/172以1：1比率共同滲透而操作。
如同本文所描述地，包含各種基因構築體之農桿菌(A. tumefaciens)菌株經由使用字首「AGL1」稱呼。舉例來說，包含基因構築體編號995之農桿菌(見第1H圖)稱為「AGL1/995」。
葉收穫以及總蛋白質萃取
在培養之後，收穫植物的空中部分，於-80℃下冷凍並粉碎成片狀。經由在三倍體積的冷50 mM Tris pH 8.0、0.15 M NaCl、0.1% Triton X-100以及1 mM苯基甲磺醯氟中將每個冷凍粉碎的植物材料樣品均質化(Polytron)以萃取總可溶性蛋白質。在均質化作用之後，將泥漿狀物於4℃以10,000 g離心10分鐘並且將這些澄清的粗萃取物(上清液)保存用於分析。
蛋白質分析與免疫墨點法
澄清的粗萃取物之總蛋白質含量係經由Bradford試驗(Bio-Rad,Hercules,CA)測定，使用胎牛血清白蛋白作為參考標準品。經由SDS-PAGE分離蛋白質並且電轉移至用於免疫偵測之聚二氟乙烯(PVDF)膜(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)。在免疫墨點法之前，將膜以5%脫脂牛奶以及在Tris緩衝液(Tris-buffered saline,TBS-T)中之0.1% Tween-20於4℃遮蔽16-18小時。
經由在TBS-Tween 20 0.1%中之2%脫脂牛奶中以2 μg/ml、1:2500稀釋之山羊多株抗gp120一級抗體(Abcam,ab21179)培養以操作免疫墨點法。化學發光偵測係於在TBS-Tween 20 0.1%之2%脫脂牛奶中以1:10000稀釋之與過氧化酶共軛的驢抗-山羊二級抗體(JIR 705-035-147)培養之後進行。免疫反應複合體係由使用發光胺(luminol)作為基質(Roche Diagnostics Corporation)之化學發光而偵測。
範例2：植物中之原生與嵌合HIV套膜蛋白質表現
HIV ConS ΔCFI為帶有縮短的可變環、切割位點的刪除、融合區域以及於gp41的免疫優勢區域之共同HIV群組M套膜蛋白。已顯示在天竺鼠中激發類似或比野生型套膜蛋白更大廣度與力價的交叉亞型中和抗體。(Liao et al.,Virology(2006)353: 268-282)。
第5圖展示使用於此研究的基因構築體。在基因構築體編號995中，將成熟HIV ConS ΔCFI(其後以Env簡稱)的編碼區域，其包含原生的TM/CT，置於CPMV-HT表現系統之控制之下。在基因構築體編號997與999中，將HIV Env之TM/CT區域分別以來自A/布利斯班/10/2007(H3N2)以及A/印尼/05/2005(H5N1)的流感血球凝集素(HA)的TM/CT區域取代。在所有例子中，將植物來源的信號肽一來自苜蓿草蛋白質雙硫異構酶(PDI)蛋白質-取代原生HIV Env蛋白質信號肽。
於農桿菌滲透之圓葉菸草植物中比較來自基因構築體995、997以及999的HIV Env生產。將來自以AGL1/995、GAL1/997以及AGL1/999滲透的植物之蛋白質萃取物經由西方墨點法分析，並且將結果顯示於第6圖，其中第1至4道為包含各種量之重組HIV-1 gp160(ab68171)的陽性控制組；第5道，陰性控制組；第6至8道，由AGL1/995-滲透之葉萃取之蛋白質；第9與10道，由AGL1/997-滲透之葉萃取之蛋白質；第11與12道，由AGL1/999-滲透之葉萃取之蛋白質。
如同第6圖所顯示的，原生HIV Env之表現在用於偵測的條件下無法被偵測，確認先前報導植物中HIV Env蛋白質的極低累積量(Rybicki et al.,2010,Plant Biotechnology Journal 8: 620-637)。Env的嵌合形式，其中將TM/CT區域以流感H3(基因構築體#997)或H5(基因構築體#999)之TM/CT區域取代，其累積較原生形式高得多之量。如上所提，基因構築體#997以及#999基因構築體不編碼M1蛋白質。
範例3　嵌合HIV Env組裝至類病毒顆粒
亦評估植物中嵌合HIV Env在缺乏核心或基質蛋白質下組裝至VLP的能力。將來自AGL1/997(Env/H3)與AGL1/999(Env/H5)的蛋白質萃取物施以凝膠過濾層析法接著使用山羊抗gp120抗體分析Env含量洗滌餾分。在第7A圖中表示的西方墨點法顯示在來自經AGL1/999滲透之植物的萃取物中，洗滌餾分中的嵌合Env/H5含量波峰在餾分7至10，表示它們以大於2百萬道爾頓(dalton)之極高分子量結構組裝。餾分7至18的相對蛋白質含量的測試清楚顯示絕大多數的宿主蛋白質於餾分11至18洗滌出(第7B圖)。這些結果顯示Env/H5組裝至高分子量結構大小超過同源三聚體所期望的之分子量大小。在AGL1/997滲透之植物中的Env/H3獲得類似結果。合併這些結果證實嵌合HIV Env/H5以高量累積於農桿菌滲透的植物並在缺乏核心或基質蛋白質時組裝至類病毒顆粒。這些結果亦證實流感HA TM/CT區域融合至非流感抗原是足以組裝並釋出呈現非流感抗原的VLP。
範例4：具有狂犬病蛋白質的表現卡匣之組裝
C-2X35S-CPMV HT-PDISP-狂犬病醣蛋白G(RabG)+H5A/印尼/5/2005穿膜區域以及胞質尾(TM+CT)-NOS(基因構築體編號1074；第8A、8H圖)
將融合至H5 A/印尼/5/2005之穿膜以及胞質區域之編碼狂犬病醣蛋白G(RabG)膜外區域的序列使用由Darveau et al.(Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))呈現的以PCR為基礎之接合方法轉殖至如下在包含質體藍素-P19-質體藍素質體中之2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS表現系統。在PCR的第一回合，將包含RabG膜外區域而不帶原生信號肽、穿膜以及胞質區域的片段使用引子IF-RabG-S2+4.c(第8B圖，SEQ ID NO：32)以及RabG+H5dTm.r(第8C圖，SEQ ID NO：33)擴增，使用合成的Rab G基因(與來自Genebank登錄號EF206707之nt3317-4891相對應)(第8D圖，SEQ ID NO：34)作為模板。將包含H5 A/印尼/5/2005之穿膜以及胞質區域的第二片段使用引子IFH5dTm.c(第8E圖，SEQ ID NO：35)以及IF-H5dTm.r(第3C圖，SEQ ID NO：15)擴增，使用基因構築體編號972(對於基因構築體編號972序列見WO 2010/003225之第94圖，SEQ ID NO：134，將其以引用的方式併入本文)作為模板。然後將來自兩次擴增之PCR產物混合並且使用作為第二回合的擴增之模板，使用IF-RabG-S2+4.c(第8B圖，SEQ ID NO：32)以及IF-H5dTm.r(第3C圖，SEQ ID NO：15)作為引子。將生成的片段與苜蓿草PDI信號肽對準框架使用來自Clontech(Mountain View,CA)之In-Fusion轉殖系統而轉殖於2X35S-CPMVHTMOS表現系統。將基因構築體141(第8F、8G圖)以SbfI與StuI限制酶消化並用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號141為用於在CPMV HT為基礎之表現卡匣中的興趣基因之「In Fusion」轉殖之受體質體。它也併入於苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子下的TBSV P19沉默抑制子共同表現的基因構築體。此載體為以pCAMBIA為基礎之質體以及由左至右t-DNA邊界的序列係於第8F圖呈現(SEQ ID NO：36)。載體141的示意圖係於第8G圖中呈現。給予生成的基因構築體編號1074(第8H圖，SEQ ID NO：37)。PDISP-Rab G-A/印尼/5/2005 H5 TM+CT的胺基酸序列係展示於第8I圖(SEQ ID NO：38)。質體1074示意係展示於第8A圖。此基因構築體不編碼M1蛋白質。
D-2X35S-PDISP-狂犬病醣蛋白G(RabG)+H5 A/印尼/5/2005穿膜區域以及胞質尾(TM+CT)-NOS intoBeYDV+複製酶擴增系統(基因構築體編號1094；第8L、8M圖)
將融合至H5 A/印尼/5/2005之穿膜以及胞質區域之編碼狂犬病醣蛋白G(RabG)膜外區域的序列使用由Darveau et al.(Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))呈現的以PCR為基礎之接合方法轉殖至如下在包含質體藍素-P19-質體藍素表現卡匣中之2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS之BeYDV+複製酶表現系統。在PCR的第一回合，將包含Rab G膜外區域而不帶原生信號肽、穿膜以及胞質區域的片段使用引子IF-RabG-S2+4.c(第8B圖，SEQ ID NO：32)以及RabG+H5dTm.r(第8C圖，SEQ ID NO：33)擴增，使用合成的Rab G基因(與來自Genebank登錄號EF206707之nt3317-4891相對應)(第8D圖，SEQ ID NO：34)作為模板。將包含H5A/印尼/5/2005之穿膜以及胞質區域的第二片段使用引子IFH5dTm.c(第8E圖，SEQ ID NO：35)以及IF-H5dTm.r(第3C圖，SEQ ID NO：15)擴增，使用基因構築體編號972(對於基因構築體編號972序列見WO 2010/003225之第94圖，SEQ ID NO：134，將其以引用的方式併入本文)作為模板。然後將來自兩次擴增之PCR產物混合並且使用作為第二回合的擴增之模板，使用IF-RabG-S2+4.c(第8B圖，SEQ ID NO：32)以及IF-H5dTm.r(第3C圖，SEQ ID NO：15)作為引子。將生成的片段與2X35S-CPMV HTNOS表現卡匣中之苜蓿草PDI信號肽對準框架，使用來自Clontech(Mountain View,CA)之In-Fusion轉殖系統而轉殖於BeYDV+複製酶擴增系統。將基因構築體144以SbfI與StuI限制酶消化並用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號144為用於在CPMV HT為基礎之表現卡匣中的興趣基因之「In Fusion」轉殖至BeYDV擴增系統之受體質體。它也併入於苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子下的TBSV P19沉默抑制子共同表現的基因構築體。此載體為以pCAMBIA為基礎之質體以及由左至右t-DNA邊界的序列係於第8J圖呈現(SEQ ID NO：39)。載體144的示意圖係於第8K圖中呈現。給予生成的基因構築體編號1094(第8L圖，SEQ ID NO：40)。PDISP-Rab G-A/印尼/5/2005 H5 TM+CT的胺基酸序列係展示於第8I圖(SEQ ID NO：38)。質體1094示意係展示於第8M圖。此基因構築體不編碼M1蛋白質。
範例5：植物中嵌合狂犬病蛋白質的表現
G蛋白質係與PDI Sp(基因構築體1071)融合而表現。基因構築體1074為狂犬病G蛋白質與PDI Sp以及H5A/Indo TM+CT區域之融合。基因構築體1094為狂犬病G蛋白質與BeYDV+rep,PDI Sp以及H5A/Indo TM+CT區域的融合。基因構築體1091為狂犬病G蛋白質與PDI Sp以及BeYDV+rep的融合。
圓葉菸草(Nicotiana benthamiana)植物係從充滿商業的泥炭蘚基質之平地中的種子生長。容許植物生長於16/8光照週期以及25℃日/20℃夜之溫度制度的溫室。在播種後三星期，將個別的植株挑選出來，移植於盆中並使其在相同環境條件下於溫室生長額外的三星期。
將以每個基因構築體(基因構築體1071、1071、1074、1091以及1094)轉染之農桿菌於以10 mM 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)、20 μM乙醯丁香酮、50 μg/ml康黴素以及25 μg/ml卡本西林pH5.6補充的YEB培養基生長，直到它們達到OD600介於0.6與1.6之間。將農桿菌懸浮液在使用前離心並重新懸浮於滲透培養基(10 mM MgCl2以及10 mM MES pH 5.6)並且於4℃儲存隔夜。在滲透之日，將培養批次以2.5倍培養體積稀釋並在使用前使其回溫。將圓葉菸草整株植物在20-40 Torr真空下倒置於在一氣密的不銹鋼罐中之細菌懸浮液2分鐘。將植物返回溫室2-6日的培養期間直到收穫。除非另外指出，所有滲透係以菌株AGL1/172以1：1比率共同滲透而操作。
在培養之後，收穫植物的空中部分，於-80℃下冷凍並粉碎成片狀。經由在三倍體積的冷50 mM Tris pH 8.0、0.15 M NaCl、0.1% Triton X-100以及1 mM苯基甲磺醯氟中將每個冷凍粉碎的植物材料樣品均質化(Polytron)以萃取總可溶性蛋白質。在均質化作用之後，將泥漿狀物於4℃以10,000 g離心10分鐘並且將這些澄清的粗萃取物(上清液)保存用於分析。
澄清的粗萃取物之總蛋白質含量係經由Bradford試驗(Bio-Rad,Hercules,CA)測定，使用胎牛血清白蛋白作為參考標準品。經由SDS-PAGE分離蛋白質並且電轉移至用於免疫偵測之聚二氟乙烯(PVDF)膜(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)。在免疫墨點法之前，將膜以5%脫脂牛奶以及在Tris緩衝液(Tris-buffered saline,TBS-T)中之0.1% Tween-20於4℃遮蔽16-18小時。
經由在TBS-Tween 20 0.1%中之2%脫脂牛奶中的0.5ug/ul之Santa Cruz SE-57995一級抗體培養以操作免疫墨點法。化學發光偵測係於培養之後以在TBS-Tween 20 0.1%之2%脫脂牛奶中以1：10,000稀釋之與過氧化酶共軛的山羊抗-老鼠JIR，115-035-146二級抗體進行。免疫反應複合體係由使用發光胺(luminol)作為基質(Roche Diagnostics Corporation)之化學發光而偵測。
如同第8N圖中顯示的，狂犬病G蛋白質係以與PDI Sp(基因構築體1071)、BeYDV+rep(基因構築體1094或1091)、H5A/Indo TM+CT區域(基因構築體1074)或其組合融合而表現。
範例6：嵌合狂犬病G蛋白質組裝至類病毒顆粒
亦評估植物中嵌合狂犬病G蛋白質在缺乏核心或基質蛋白質下組裝至VLP的能力。將來自使用基因構築體1074或基因構築體1094轉化之植物的蛋白質萃取物澄清並且施以凝膠過濾層析法接著使用Santa Cruz SE-57995一級抗體進行狂犬病G含量洗滌餾分之分析。在第8O圖中表示的西方墨點法顯示在來自經滲透之植物的萃取物中，對使用基因構築體1074生產之蛋白質，洗滌餾分中嵌合狂犬病G含量的波峰位於餾分8至14，以及使用基因構築體1094製備之蛋白質萃取物的大部分蛋白質於餾分8至12洗滌出之餾分，表示它們以大於2百萬道爾頓(dalton)之極高分子量結構組裝。這些結果顯示狂犬病G組裝至高分子量結構大小超過同源三聚體所期望的之分子量大小。
第9A圖顯示由基因構築體1074表現之純化狂犬病G蛋白質之免疫墨點分析。第9B圖顯示衍生自基因構築體1074的表現之純化狂犬病G蛋白質VLP的穿透式電子顯微鏡圖片，其顯示VLP形態。
因此，狂犬病G在農桿菌滲透之植物中以高量累積並且在缺乏核心或基質蛋白質下組裝至類病毒顆粒。這些結果亦證實流感HA之TM/CT區域至非流感抗原例如狂犬病G蛋白質的融合足以組裝並釋出呈現非流感抗原之VLP。
範例7：表現卡匣與SARS之組裝
B-2X35S-CPMV HT-嚴重急性呼吸道症候群病毒醣蛋白S(SARS Gs)+H5 A/印尼/5/2005穿膜區域以及胞質尾(TM+CT)-NOS(基因構築體編號916；第12A、12F圖)
將融合至H5 A/印尼/5/2005之穿膜以及胞質區域之編碼SARS醣蛋白S(SARS gS)膜外區域的序列使用由Darveau et al.(Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))呈現的以PCR為基礎之接合方法轉殖至如下的2X35S-CPMV-HT表現系統。在PCR的第一回合，將包含SARS gS膜外區域而不帶原生穿膜以及胞質區域的片段使用引子IFwtSp-SARSgS.c(第12B圖，SEQ ID NO：26)以及IF-H5dTm+SARSgS.r(第12C圖，SEQ ID NO：27)擴增，使用合成的SARS gS基因(與來自Genebank登錄號AY278741.1之nt2149225259相對應；第12D圖，SEQ ID NO：28)作為模板。將包含H5 A/印尼/5/2005之穿膜以及胞質區域的第二片段使用引子SARSgS+H5dTm.c(第12E圖，SEQ ID NO：29)以及IF-H5dTm.r(第3C圖，SEQ ID NO：15)擴增，使用基因構築體編號972(對於基因構築體編號972序列見WO 2010/003225之第94圖，SEQ ID NO：134，將其以引用的方式併入本文)作為模板。然後將來自兩次擴增之PCR產物混合並且使用作為第二回合的擴增之模板，使用IF-wtSp-SARSgS.c(第12B圖，SEQ ID NO：26)以及IF-H5dTm.r(第3C圖，SEQ ID NO：15)作為引子。再將第二次PCR的產物以ApaI與StuI消化並轉殖至以ApaI以及StuI限制酶消化之基因構築體編號995(第1F圖，SEQ ID NO：6)。給予生成的基因構築體編號916(第12F圖，SEQ ID NO：30)。SARS gS-A/印尼/5/2005 H5 TM+CT的胺基酸序列係展示於第12G圖(SEQ ID NO：31)。質體916示意係展示於第12A圖。此基因構築體不編碼M1蛋白質。
範例8：在植物中嵌合SARS具有與不具有生產增強因子之表現實驗
使用包含SARS gS基因具有野生型信號肽以及H5A/Indo穿膜以及胞質尾區域之基因構築體916表現SARS蛋白質。
圓葉菸草(Nicotiana benthamiana)植物係從充滿商業的泥炭蘚基質之平地中的種子生長。容許植物生長於16/8光照週期以及25℃日/20℃夜之溫度制度的溫室。在播種後三星期，將個別的植株挑選出來，移植於盆中並使其在相同環境條件下於溫室生長額外的三星期。
將以每個基因構築體(基因構築體916)轉染之農桿菌於以10 mM 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)、20 μM乙醯丁香酮、50 μg/ml康黴素以及25 μg/ml卡本西林pH5.6補充的YEB培養基生長直到它們達到OD600介於0.6與1.6之間。將農桿菌懸浮液在使用前離心並重新懸浮於滲透培養基(10 mM MgCl2以及10 mM MES pH 5.6)並且於4℃儲存隔夜。在滲透之日，將培養批次以2.5倍培養體積稀釋並在使用前使其回溫。將圓葉菸草整株植物在20-40 Torr真空下倒置於在一氣密的不銹鋼罐中之細菌懸浮液2分鐘。將植物返回溫室2-6日的培養期間直到收穫。除非另外指出，所有滲透係以菌株AGL1/172以1：1比率之共同滲透而操作。
在培養之後，收穫植物的空中部分，於-80℃下冷凍並粉碎成片狀。經由在三倍體積的冷50 mM Tris pH 8.0、0.15 M NaCl、0.1% Triton X-100以及1 mM苯基甲磺醯氟中將每個冷凍粉碎的植物材料樣品均質化(Polytron)以萃取總可溶性蛋白質。在均質化作用之後，將泥漿狀物於4℃以10,000g離心10分鐘並且將這些澄清的粗萃取物(上清液)保存用於分析。
澄清的粗萃取物之總蛋白質含量係經由Bradford試驗(Bio-Rad,Hercules,CA)測定，使用胎牛血清白蛋白作為參考標準品。經由SDS-PAGE分離蛋白質並且電轉移至用於免疫偵測之聚二氟乙烯(PVDF)膜(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)。在免疫墨點法之前，將膜以5%脫脂牛奶以及在Tris緩衝液(Tris-buffered saline,TBS-T)中之0.1% Tween-20於4℃遮蔽16-18小時。
經由在TBS-Tween 20 0.1%中之2%脫脂牛奶中以2 ug/ul之Imgenex. IMG-690一級抗體操作免疫墨點法。化學發光偵測係於培養之後以在TBS-Tween 20 0.1%之2%脫脂牛奶中以1:10,000稀釋之與過氧化酶共軛的老鼠抗-兔IgG，JIR，115-035-144二級抗體進行。免疫反應複合體係由使用發光胺(luminol)作為基質(Roche Diagnostics Corporation)之化學發光而偵測。
第12H圖顯示在煙草中的嚴重急性呼吸道症候群(SARS)病毒蛋白質S表現之免疫墨點分析。觀察基因構築體916(帶有野生型信號肽以及H5A/Indo穿膜以及胞質尾區域之SARS gS基因)的表現。
範例9：表現卡匣與VZV蛋白質之組裝
A-2X35S-CPMV HT-水痘帶狀疱疹病毒醣蛋白E(VZVgE)+H5 A/印尼/5/2005穿膜區域以及胞質尾(TM+CT)-NOS(基因構築體編號946)將融合至H5 A/印尼/5/2005之穿膜以及胞質區域之編碼VZV醣蛋白E(VZV gE)膜外區域的序列使用由Darveau et al.(Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))呈現的以PCR為基礎之接合方法轉殖至如下的2X35S-CPMV-HT表現系統。在PCR的第一回合，將包含VZV gE膜外區域而不帶原生穿膜以及胞質區域的片段使用引子IF-wtSp-VZVgE.c(第10A圖，SEQ ID NO：20)以及IF-H5dTm+VZVgE.r(第10B圖，SEQ ID NO：21)擴增，使用合成的VZV gE基因(與來自Genebank登錄號AY013752.1之nt3477-5348相對應；第10C圖，SEQ ID NO：22)作為模板。將包含H5 A/印尼/5/2005之穿膜以及胞質區域的第二片段使用引子VZVgE+H5dTm.c(第10D圖，SEQ ID NO：23)以及IF-H5dTm.r(第3C圖，SEQ ID NO：15)擴增，使用基因構築體編號972(對於基因構築體編號972序列見WO 2010/003225之第94圖，SEQ ID NO：134，將其以引用的方式併入本文)作為模板。然後將來自兩次擴增之PCR產物混合並且使用作為第二回合的擴增之模板，使用IF-wtSp-VZVgE.c(第10A圖，SEQ ID NO：20)以及IF-H5dTm.r(第3C圖，SEQ ID NO：15)作為引子。再將第二次PCR的產物以ApaI與StuI消化並轉殖至以ApaI以及StuI限制酶消化之基因構築體編號995(第1F圖，SEQ ID NO：6)。給予生成的基因構築體編號946(第A5圖，SEQ ID NO：A5)。VZV gE-A/印尼/5/2005 H5 TM+CT的胺基酸序列係展示於第10F圖(SEQ ID NO：25)。質體946示意係展示於第10G圖。此基因構築體不編碼M1蛋白質。
範例10：植物中之嵌合VZV蛋白質表現
使用基因構築體946展示水痘帶狀疱疹病毒(VZV)E蛋白質的表現，其包含帶有野生型信號肽以及H5A/Indo TM+CT區域之VZV gE基因。
圓葉菸草(Nicotiana benthamiana)植物係從充滿商業的泥炭蘚基質之平地中的種子生長。容許植物生長於16/8光照週期以及25℃日/20℃夜之溫度制度的溫室。在播種後三星期，將個別的植株挑選出來，移植於盆中並使其在相同環境條件下於溫室生長額外的三星期。
將以每個基困構築體(基因構築體946)轉染之農桿菌於以10 mM 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)、20 μM乙醯丁香酮、50 μg/ml康黴素以及25 μg/ml卡本西林pH5.6補充的YEB培養基生長，直到它們達到OD600介於0.6與1.6之間。將農桿菌懸浮液在使用前離心並重新懸浮於滲透培養基(10 mM MgCl2以及10 mM MES pH 5.6)並且於4℃儲存隔夜。在滲透之日，將培養批次以2.5倍培養體積稀釋並在使用前使其回溫。將圓葉菸草整株植物在20-40 Torr真空下倒置於在一氣密的不銹鋼罐中之細菌懸浮液2分鐘。將植物返回溫室2-6日的培養期間直到收穫。除非另外指出，所有滲透係以菌株AGL1/172以1：1比率之共同滲透而操作。
在培養之後，收穫植物的空中部分，於-80℃下冷凍並粉碎成片狀。經由在三倍體積的冷50 mM Tris pH 8.0、0.15 M NaCl、0.1% Triton X-100以及1 mM苯基甲磺醯氟中將每個冷凍粉碎的植物材料樣品均質化(Polytron)以萃取總可溶性蛋白質。在均質化作用之後，將泥漿狀物於4℃以10,000 g離心10分鐘並且將這些澄清的粗萃取物(上清液)保存用於分析。
澄清的粗萃取物之總蛋白質含量係經由Bradford試驗(Bio-Rad,Hercules,CA)測定，使用胎牛血清白蛋白作為參考標準品。經由SDS-PAGE分離蛋白質並且電轉移至用於免疫偵測之聚二氟乙烯(PVDF)膜(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)。在免疫墨點法之前，將膜以5%脫脂牛奶以及在Tris緩衝液(Tris-buffered saline,TBS-T)中之0.1% Tween-20於4℃遮蔽16-18小時。
經由在TBS-Tween 20 0.1%中之2%脫脂牛奶中以1 ug/ul之老鼠mAb抗-VZVgE蛋白質(abcam,ab52549)作為一級抗體以操作免疫墨點法。化學發光偵測係於培養之後以在TBS-Tween 20 0.1%之2%脫脂牛奶中以1:10,000稀釋之與過氧化酶共軛的山羊抗-老鼠，JIR，115-035-146作為二級抗體進行。免疫反應複合體係由使用發光胺(luminol)作為基質(Roche Diagnostics Corporation)之化學發光而偵測。
第11A圖於第7-9道顯示來自基因構築體946之水痘帶狀疱疹病毒(VZV)E蛋白質表現之免疫墨點分析(分別為20、10以及2 μg萃取物)。第1至5道，陽性控制組-重組VZV gE，分別為500、100、50、10以及5 ng；第6道為陰性控制組。
亦評估植物中嵌合VZV E蛋白質在缺乏核心或基質蛋白質下組裝至VLP的能力。將來自使用基因構築體946轉化之植物的蛋白質萃取物澄清並且施以凝膠過濾層析法接著使用老鼠mAb抗VZVgE蛋白質(abcam,ab52549)一級抗體進行VZV E蛋白質洗滌餾分之分析。在第11B圖中表示的西方墨點法顯示在來自經滲透之植物的萃取物中，嵌合VZV E蛋白質洗滌餾分的波峰位於餾分10至13，表示VZV E蛋白質以大於2百萬道爾頓(dalton)之極高分子量結構組裝。這些結果顯示VZV E蛋白質組裝至高分子量結構大小超過同源三聚體所期望的之分子量大小。
因此，VZV E蛋白質以高量累積於農桿菌滲透之植物並且於缺乏核心或基質蛋白質下組裝至類病毒顆粒。這些結果亦顯示將流感HA之TM/CT區域融合至非流感抗原例如VZV E蛋白質足以組裝並釋出呈現非流感抗原的VLP。
範例11.表現卡匣與嵌合伊波拉病毒醣蛋白(GP)之組裝
A-2X35S-CPMV HT-PDISP-薩伊伊波拉病毒GP(EboGP)+H5 A/印尼/5/2005穿膜區域以及胞質尾(TM+CT)-NOS(基因構築體編號1366)
將融合至H5 A/印尼/5/2005之穿膜以及胞質區域之編碼來自病毒株薩伊1995之伊波拉病毒醣蛋白(GP)膜外區域的序列使用由Darveau et al.(Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))呈現的以PCR為基礎之接合方法轉殖至如下在包含質體藍素-P19-質體藍素表現卡匣中之2X35S-CPMV HT-PDISP-NOS表現系統。伊波拉GP基因是由野生型基因序列對密碼子使用以及對GC含量最佳化(與來自Genebank登錄號AY354458之nt 6039-8069相對應)。再將隱蔽剪接位點、Shine Delgarno序列、RNA去穩定序列以及原核生物核糖體進入位點由最佳化序列移除以避免不想要的結構或序列。在PCR的第一回合，將包含編碼膜外區域(不帶信號肽、穿膜以及胞質區域)序列之最佳化GP基因的片段使用引子IF-Opt_EboGP.s2+4c(第13A圖，SEQ ID NO：43)以及H5iTMCT+Opt_EboGP.r(第13B圖，SEQ ID NO：44)擴增，以合成的GP基因(第13C圖，SEQ ID NO：45)作為模板。將包含來自流感A/印尼/5/2005之H5之穿膜以及胞質區域的第二片段使用引子Opt_EboGP+H5iTMCT.c(第13D圖，SEQ ID NO：46)以及IF-H5dTm.r(第3C圖，SEQ ID NO：15)擴增，使用基因構築體編號972(對於基因構築體編號972序列見WO 2010/003225之第94圖，SEQ ID NO：134，將其以引用的方式併入本文)作為模板。然後將來自兩次擴增之PCR產物混合並且使用作為第二回合的擴增之模板，使用IF-Opt_EboGP.s2+4c(第13A圖，SEQ ID NO：43)以及IF-H5dTm.r(第3C圖，SEQ ID NO：15)作為引子。使用來自Clontech(Mountain View,CA)之In-Fusion轉殖系統，將生成的PCR產物與卡匣中苜蓿草PDI信號肽對準框架而轉殖至2X35SCPMV HT-NOS表現系統。將基困構築體1192(第13E圖)以SacII與StuI限制酶消化並用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號1192為用於在CPMV HT為基礎之表現卡匣中與苜蓿草PDI信號肽對準框架之興趣基因的「In Fusion」轉殖至BeYDV擴增系統之受體質體。它也併入於苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子下的TBSV P19沉默抑制子共同表現的基因構築體。此載體為以pCAMBIA為基礎之質體以及由左至右t-DNA邊界的序列係於第13F圖呈現(SEQ ID NO：47)。給予生成的基因構築體編號1366(第13G圖，SEQ ID NO：48)。來自薩伊95之PDISP-GP伊波拉virus-H5 TM+來自A/印尼/5/2005CT的胺基酸序列係展示於第13H圖(SEQ ID NO：49)。質體1366示意係展示於第13I圖。
範例12.　植物中之嵌合伊波拉病毒GP的表現
使用包含帶有野生型信號肽以及H5A/Indo TM+CT區域之EV GP基因的基因構築體1366示例伊波拉病毒(EV)醣蛋白(GP)之表現。
圓葉菸草(Nicotiana benthamiana)植物係從充滿商業的泥炭蘚基質之平地中的種子生長。容許植物生長於16/8光照週期以及25℃日/20℃夜之溫度制度的溫室。在播種後三星期，將個別的植株挑選出來，移植於盆中並使其在相同環境條件下於溫室生長額外的三星期。
將以每個基困構築體(基因構築體946)轉染之農桿菌於以10 mM 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)、20 μM乙醯丁香酮、50 μg/ml康黴素以及25 μg/ml卡本西林pH5.6補充的YEB培養基生長，直到它們達到OD600介於0.6與1.6之間。將農桿菌懸浮液在使用前離心並重新懸浮於滲透培養基(10 mM MgCl2以及10 mM MES pH 5.6)並且於4℃儲存隔夜。在滲透之日，將培養批次以2.5倍培養體積稀釋並在使用前使其回溫。將圓葉菸草整株植物在20-40 Torr真空下倒置於在一氣密的不銹鋼罐中之細菌懸浮液2分鐘。將植物返回溫室2-6日的培養期間直到收穫。除非另外指出，所有滲透係以菌株AGL1/172以1：1比率共同滲透而操作。
在培養之後，收穫植物的空中部分，於-80℃下冷凍並粉碎成片狀。經由在三倍體積的冷50 mM Tris pH 8.0、0.15 M NaCl、0.1% Triton X-100以及1 mM苯基甲磺醯氟中將每個冷凍粉碎的植物材料樣品均質化(Polytron)以萃取總可溶性蛋白質。在均質化作用之後，將泥漿狀物於4℃以10,000 g離心10分鐘並且將這些澄清的粗萃取物(上清液)保存用於分析。
澄清的粗萃取物之總蛋白質含量係經由Bradford試驗(Bio-Rad,Hercules,CA)測定，使用胎牛血清白蛋白作為參考標準品。經由SDS-PAGE分離蛋白質並且電轉移至用於免疫偵測之聚二氟乙烯(PVDF)膜(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)。在免疫墨點法之前，將膜以5%脫脂牛奶以及在Tris緩衝液(Tris-buffered saline,TBS-T)中之0.1% Tween-20於4℃遮蔽16-18小時。
經由在TBS-Tween 20 0.1%中之2%脫脂牛奶中以150 ng/ml之親和力純化之兔抗-伊波拉GP薩伊(IBT Bioservices,0301-012)作為一級抗體操作免疫墨點法。化學發光偵測係於培養之後以與過氧化酶共軛的山羊抗兔二級抗體(JIR 11-035-144)，將其在TBS-Tween 20 0.1%之2%脫脂牛奶中以1：7500稀釋而進行。免疫反應複合體係由使用發光胺(luminol)作為基質(Roche Diagnostics Corporation)之化學發光而偵測。第13J圖顯示在來自以基因構築體編號1366轉形的植物之蛋白質萃取物中的嵌合伊波拉病毒GP表現的免疫墨點分析。獲得的結果顯示嵌合伊波拉GP係暫時性地表現。
將所有引用以此方式併入以作為參考。
本發明已關於一或更多具體實施例而描述。然而對於本領域之技術人員而言，在不悖離如同申請專利範圍中所定義之本發明範圍下可作出數個改變與修飾將是明顯的。
HIV．．．人類免疫缺陷病毒
PacI．．．啟動子上游
AscI．．．緊接NOS終止子的下游
NOS．．．胭脂胺酸合成酶
PDISP．．．苜蓿草蛋白質雙硫異構酶
CT．．．胞質尾
TM．．．穿膜
XmaI．．．啟動子質體藍素啟動子之上游
EcoRI．．．緊接質體藍素終止子的下游
TBSV．．．番茄叢矮病毒
SP．．．信號肽
PDI．．．編碼苜蓿草
Env．．．成熟HIV ConS ΔCFI
H3/H5．．．流感
RabG．．．狂犬病醣蛋白G
CPMV．．．豇豆嵌紋病毒
BeYDV．．．豆類黃矮病毒
VZV．．．水痘帶狀疱疹病毒
VZVgE．．．水痘帶狀疱疹病毒醣蛋白E
SARS Gs．．．嚴重急性呼吸道症候群病毒醣蛋白S
SARS．．．嚴重急性呼吸道症候群
M．．．膜
EboGP．．．薩伊伊波拉病毒GP
本發明的這些與其他特徵從下列對所附圖示作出參照的描述中將變得更顯著，其中：
第1圖顯示數個核苷酸以及胺基酸序列，以及根據本發明的各個具體實施例的表現卡匣。
第1A圖顯示HIV ConS ΔCFI的共同核酸序列(原生信號肽以粗體、原生穿膜以及胞質區域以底線)。第1B圖顯示寡核苷酸IF-ApaI-SpPDI.c的核苷酸序列。第1C圖顯示寡核苷酸SpPDI-HIV gp145.r的核苷酸序列。第1D圖顯示寡核苷酸IF-SpPDI-gp145.c的核苷酸序列。第1E圖顯示寡核苷酸WtdTm-gp145.r的核苷酸序列。第1F圖顯示表現卡匣編號995，從PacI(啟動子上游)至AscI(緊接NOS終止子的下游)。消除的SbfI限制位點為粗體。PDISP-HIV ConS ΔCFI下加底線。第1G圖顯示PDISP-HIV ConS ΔCFI的胺基酸序列。第1H圖顯示基因構築體編號995的示意圖。
第2圖顯示數個核苷酸以及胺基酸序列，以及根據本發明的各個具體實施例的表現卡匣。第2A圖顯示寡核苷酸IF-H3dTm+gp145.r的核苷酸序列。第2B圖顯示寡核苷酸Gp145+H3dTm.c的核苷酸序列。第2C圖顯示寡核苷酸H3dTm.r的核苷酸序列。第2D圖顯示表現卡匣編號997，從PacI(啟動子上游)至AscI(緊接NOS終止子的下游)。消除的SbfI限制位點是粗體。PDISP-HIV Con S ΔCFI-A/布利斯班/10/2007 H3 TM+CT下加底線。第2E圖顯示PDISP-HIV ConS ΔCFI-A/布利斯班/10/2007 H3 TM+CT的胺基酸序列。第2F圖顯示基因構築體編號997的示意圖。
第3圖顯示數個核苷酸以及胺基酸序列，以及根據本發明的各個具體實施例的表現卡匣。第3A圖顯示寡核苷酸IF-H5dTm+gp145.r的核苷酸序列。第3B圖顯示寡核苷酸Gp145+H5dTm.c的核苷酸序列。第3C圖顯示寡核苷酸IF-H5dTm.r的核苷酸序列。第3D圖顯示表現卡匣編號999，從PacI(啟動子上游)至AscI(緊接NOS終止子的下游)。消除的SbfI限制位點是粗體。PDISP-HIV ConS ΔCFI-A/印尼/5/2005 H5 TM+CT下加底線。第3E圖顯示PDISP-HIV ConS ΔCFI-A/印尼/5/2005 H5 TM+CT的胺基酸序列。第3F圖顯示基因構築體編號999的示意圖。
第4圖顯示根據本發明的各個具體實施例的胺基酸序列以及數個表現卡匣。第4A圖顯示表現卡匣編號172，從XmaI(質體藍素啟動子之上游)至EcoRI(緊接質體藍素終止子的下游)。TBSV P19核酸序列下加底線。第4B圖顯示TBSV P19沉默抑制子的胺基酸序列。第4C圖顯示基因構築體編號172的示意圖。
第5圖顯示如同本文描述表現之嵌合HIV Env基因的示意圖。
第6圖顯示在以農桿菌轉殖之菸草(Nicotiana benthamiana)葉中的HIV Env蛋白質表現之西方墨點分析。第1至4道，重組HIV-1 gp160(ab68171)，分別為100、50、10與5 ng，於由模擬滲透植物萃取之20 μg葉蛋白質(陽性控制組)中。第5道，來自模擬滲透植物之20 μg蛋白質(陰性控制組)。第6至8道，從AGL1/995-滲透的葉中萃取的蛋白質(分別為20 μg、10 μg與2 μg，由模擬滲透植物萃取之葉蛋白質完成至20 μg)。第9與10道，從AGL1/997-滲透的葉中萃取的蛋白質(分別為20 μg與10 μg，由模擬滲透植物萃取之葉蛋白質完成至20 μg)。第11與12道，從AGL1/999-滲透的葉中萃取的蛋白質(分別為20 μg與10 μg，由模擬滲透植物萃取之葉蛋白質完成至20 μg)。
第7圖顯示經由尺寸排阻色層分析法(size exclusion chromatography)之HIV ConS ΔCFI-衍生結構之特徵。將生產Env/H5嵌合蛋白質、從以AGL1/999滲透的葉萃取之蛋白質經由凝膠過濾法於經校正之S-500高解析管柱分離。(A)經由使用抗gp120抗體之免疫偵測發現洗滌餾分的HIV Env蛋白質含量。第1至4道，重組物HIV-1 gp160(ab68171)，分別為100、50、10與5 ng，於模擬滲透植物萃取之20 μg葉蛋白質(陽性控制組)中。第5道，從模擬滲透植物萃取之20μg蛋白質(陰性控制組)。第6道，從AGL1/999-滲透的葉中萃取的蛋白質20μg。第7至18道，來自凝膠過濾層析法的洗滌餾分7至18。(B)來自凝膠過濾層析法的洗滌餾分7至18之相對蛋白質含量。
第8A圖顯示基因構築體編號1074的示意圖。(於包含質體藍素P19-質體藍素沉默抑制劑之載體的C-2X35S-狂犬病醣蛋白G(RabG)+H5 A/印尼/5/2005穿膜區域與胞質尾(TM+CT)-NOS)。第8B圖顯示引子IF-RabG-S2+4.c(SEQ ID NO：32)。第8C圖顯示引子RabG+H5dTm.r(SEQ IDNO：33)。第8D圖顯示合成的Rab G基因(與來自Genebank登錄號EF206707的nt 3317-4891對應；原生信號肽以粗體、原生穿膜以及胞質區域下加底線；SEQ ID NO：34)。第8E圖顯示引子IFH5dTm.c(SEQ ID NO：35)。第8F圖由左而右顯示基因構築體141 t-DNA(下加底線)。具有質體藍素P19-質體藍素沉默抑制劑表現卡匣的2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS表現系統(SEQ ID NO：36)。第8G圖顯示基因構築體編號141的示意圖。用於質體線性化的SbfI與StuI限制酵素位點註明於圖示。第8H圖顯示表現卡匣編號1074由2X35S啟動子至NOS終止子的序列。PDISP-Rab G-A/印尼/5/2005 H5 TM+CT下加底線。(SEQ ID NO：37)。第8I圖顯示PDISPRab G-A/印尼/5/2005 H5 TM+CT的胺基酸序列(SEQ ID NO：38)。第8J圖由左而右顯示基因構築體144 t-DNA核苷酸序列(下加底線)。具有質體藍素P19-質體藍素沉默抑制劑表現卡匣之2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS至BeYDV+複製酶表現系統(SEQ ID NO：39)。第8K圖顯示基因構築體144的示意圖。用於質體線性化的SbfI與StuI限制酵素位點註明於圖示。第8L圖顯示表現卡匣編號1094的核苷酸序列由右至左BeYDVLIR.PDISP-Rab G -A/印尼/5/2005 H5 TM+CT下加底線(SEQ ID NO：40)。第8M圖顯示基因構築體編號1094的示意圖。第8N圖顯示植物中狂犬病G蛋白質表現之免疫墨點分析。狂犬病G蛋白質係與PDI Sp(基因構築體1071)、BeYDV+rep、H5A/Indo TM+CT區域或其組合融合而表現。更具體地，基因構築體1074為狂犬病G蛋白質與PDI Sp以及H5A/Indo TM+CT區域之融合。基因構築體1094為狂犬病G蛋白質與BeYDV+rep、PDI Sp以及H5A/Indo TM+CT區域之融合。基因構築體1091為狂犬病G蛋白質與PDI Sp以及BeYDV+rep之融合。第8O圖顯示由基因構築體1074與基因構築體1094表現之蛋白質的濃縮與澄清萃取物的尺寸排阻色層分析法免疫墨點分析。
第9A圖顯示由基因構築體1074表現的純化狂犬病G蛋白質之免疫墨點分析。第9B圖顯示衍生自基因構築體1074表現的純化WLP之穿透式電子顯微鏡圖片。
第10圖顯示製備A-2X35S-水痘帶狀疱疹病毒醣蛋白E(VZVgE)+H5 A/印尼/5/2005穿膜區域以及胞質尾(TM+CT)-NOS(基因構築體編號946)的順序。第10A圖顯示引子IF-wtSp-VZVgE.c(SEQ ID NO 20)；第10B圖顯示引子IF-H5dTm+VZVgE.r(SEQ ID NO：21)。第10C圖顯示合成的VZVGe基因(SEQ ID NO：22；與來自Genebank登錄號AY013752.1的nt 3477-5348對應)(原生信號肽以粗體、原生穿膜以及胞質區域下加底線)。第10D圖顯示VZVgE+H5dTm.c的引子(SEQ ID NO：23)。第10E圖顯示表現卡匣編號946(SEQ ID NO：24)，由PacI(啟動子之上游)至AscI(緊接NOS終止子的下游)。VZV gE-A/印尼/5/2005 H5 TM+CT下加底線。第10F圖顯示VZV gE-A/印尼/5/2005 H5 TM+CT的胺基酸序列(SEQ ID NO：25)。第10G圖顯示基因構築體編號946之示意圖。
第11A圖顯示水痘帶狀疱疹病毒(VZV)E蛋白質表現之免疫墨點分析。第1至5道，重組VZV gE，分別為500、100、50、10與5 ng(陽性控制組)。第6道由模擬滲透葉片之萃取物(陰性控制組)。第7-9道來自基因構築體946之重組蛋白，分別為20、10與2 μg萃取物。基因構築體946包含具有野生型信號肽與H5A/Indo TM+CT區域之VZV gE基因。第11B圖顯示粗萃取物(基因構築體946)尺寸排阻色層分析法之表現的免疫墨點分析。
第12A圖顯示基因構築體編號916的示意圖(B-2X35S-嚴重急性呼吸道症候群病毒醣蛋白S(SARS gS)+H5 A/印尼/5/2005穿膜區域以及胞質尾(TM+CT)-NOS)。第12B圖顯示引子IF-wtSp-SARSgS.c(SEQ ID NO：26)。第12C圖顯示引子IF-H5dTm+SARSgS.r(SEQ ID NO：27)。第12D圖顯示合成的SARS gS基因(SEQ ID NO：28；與來自Genebank登錄號AY278741.1的nt 21492-25259相對應；原生信號肽以粗體、原生穿膜以及胞質區域下加底線)。第12E圖顯示引子SARSgS+H5dTm.c SEQ ID NO：29)。第 12F圖顯示表現卡匣編號916(SEQ ID NO：30)由PacI(啟動子之上游)至AscI(緊接NOS終止子的下游)之核苷酸序列。SARS gS-A/印尼/5/2005 H5 TM+CT下加底線。第12G圖顯示SARS gSA/印尼/5/2005 H5 TM+CT的胺基酸序列(SEQ ID NO：31)。第12H圖顯示嚴重急性呼吸道症候群(SARS)病毒蛋白質S表現之免疫墨點分析。基因構築體916包含具有野生型信號肽以及H5 A/Indo穿膜以及胞質尾區域的SARS Gs基因。第1道來自模擬滲透的植物萃取物(陰性控制組)。第2至4道，來自基因構築體916的重組蛋白質(20、10以及5 μg之萃取物)。
第13A圖顯示引子IF-Opt_EboGP.s2+4c(SEQ ID NO：43)的核苷酸序列。第13B圖顯示引子H5iTMCT+Opt_EboGPr(SEQ ID NO：44)的核苷酸序列。第13C圖顯示優化的合成GP基因之核苷酸序列(對於野生型基因序列與來自Genbank登錄號AY354458之nt 6039-8069相對應。基因係針對密碼子使用以及GC含量、隱蔽剪接位點之刪除、Shine Delgarno序列、RNA去穩定序列以及原核生物核糖體進入位點優化)(原生信號肽以粗體、原生穿膜以及胞質區域下加底線)(SEQ ID NO：45)。第13D圖顯示引子opt_EboGP+H5iTMCT.c(SEQ ID NO：46)的核苷酸序列。第13E圖顯示基因構築體編號1192的示意圖。將用於質體線性化的SacII與StuI限制酵素位點註明於圖示。第13F圖顯示基因構築體編號1192從左至右核苷酸序列t-DNA邊界(下加底線)。具有質體藍素P19-質體藍素沉默抑制劑表現卡匣的2X35S/CPMV -HT/PDISP/NOS(SEQ ID NO. 47)。第13G圖顯示表現卡匣編號1366從2X35S啟動子至NOS終止子之核苷酸序列。來自A/印尼/5/2005之薩伊95伊波拉病毒-H5 TM+CT的PDISP-GP序列下加底線(SEQ ID NO：48)。第13H圖顯示來自A/印尼/5/2005之薩伊95伊波拉病毒-H5 TM+CT的PDISP-GP之胺基酸序列(SEQ ID NO. 49)。第13I圖顯示基因構築體編號1366的示意圖。第13J圖顯示伊波拉病毒醣蛋白(GP)蛋白質表現之免疫墨點分析。將五百毫微克攙入由模擬滲透的植物萃取之20 μg蛋白質並裝載作為陽性控制組(C+)。將由模擬滲透的植物中萃取之二十微克蛋白質裝載作為陰性控制組(C-)。基因構築體編號1366包含帶有野生型信號肽以及H5A/Indo TM+CT區域之伊波拉病毒GP基因。括號中的數字表示使用於滲透接種物製備的起始細菌培養量。(200)表示將200 ml培養物以2,3 L滲透緩衝液混合，以及(400)表示將400 ml培養物以2,1 L滲透緩衝液混合。
<110>　Medicago Inc.
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<160>　49
<170>　PatentIn version 3.5
<210>　1
<211>　2376
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　HIV ConS(delta)CFI之共同核酸序列
<400>　1
<210>　2
<211>　50
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　IF-ApaI-SpPDI.c
<400>　2
<210>　3
<211>　49
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　SpPDI-HIV gp145.r
<400>　3
<210>　4
<211>　45
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　IF-SpPDI-gp145.c
<400>　4
<210>　5
<211>　38
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　WtTM-gp145.r
<400>　5
<210>　6
<211>　4155
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　表現卡匣編號995
<400>　6
<210>　7
<211>　772
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　PDISP-HIV ConS(delta)CFI之胺基酸序列
<400>　7
<210>　8
<211>　46
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　IF-H3dTm+gp145.r
<400>　8
<210>　9
<211>　49
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　Gp145+H3TM.c
<400>　9
<210>　10
<211>　35
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　H3dTM.r
<400>　10
<210>　11
<211>　3735
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　表現卡匣編號997
<400>　11
<210>　12
<211>　646
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　PDISP-HIV ConS(delta)CFI-A/布利斯班/10/2007 H3 TM+CY之胺基酸序列
<400>　12
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<211>　46
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　IF-H5TM+gp145.r
<400>　13
<210>　14
<211>　45
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　Gp145+H5TM.c
<400>　14
<210>　15
<211>　35
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　IF-H5TM.r
<400>　15
<210>　16
<211>　3735
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　表現卡匣編號999
<400>　16
<210>　17
<211>　646
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　PDISP-HIV ConS(delta)CFI-A/印尼/5/2005 H5 TM+CY之胺基酸序列
<400>　17
<210>　18
<211>　1967
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　表現卡匣編號172
<400>　18
<210>　19
<211>　172
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　TBSV P19沉默抑制子之胺基酸序列
<400>　19
<210>　20
<211>　47
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　IF-wtSp-VZVgE.c
<400>　20
<210>　21
<211>　46
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　IF-H5TM+VZVgE.r
<400>　21
<210>　22
<211>　1872
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成VZVgE基因(與來自Genebank登錄號AY013752.1之nt 3477-5348相對應)
<400>　22
<210>　23
<211>　46
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　VZVgE+H5TM.c
<400>　23
<210>　24
<211>　3522
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　表現卡匣編號946
<400>　24
<210>　25
<211>　575
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　VZV gE-A/印尼/5/2005 H5 TM+CY之胺基酸序列
<400>　25
<210>　26
<211>　50
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　IF-wtSp-SARSgS.c
<400>　26
<210>　27
<211>　45
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　IF-H5TM+SARSgS.r
<400>　27
<210>　28
<211>　3768
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成SARS gS基因(與來自Genebank登錄號AY278741.1之nt 21492-25259相對應)
<400>　28
<210>　29
<211>　43
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　SARSgS+H5TM.c
<400>　29
<210>　30
<211>　5496
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　表現卡匣編號916
<400>　30
<210>　31
<211>　1233
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　SARS gS-A/印尼/5/2005 H5 TM+CY之胺基酸序列
<400>　31
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　IF-RabG-S2+4.c
<400>　32
<210>　33
<211>　48
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　RabG+H5TM.r
<400>　33
<210>　34
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成RabG基因(與來自Genebank登錄號EF206707之nt 3317-4891相對應)
<400>　34
<210>　35
<211>　29
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　IF-H5TM.c
<400>　35
<210>　36
<211>　4899
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　基因構築體141
<400>　36
<210>　37
<211>　3249
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　表現卡匣編號1074
<400>　37
<210>　38
<211>　502
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　PDISP-Rab G- A/印尼/5/2005 H5 TM+CY之胺基酸序列
<400>　38
<210>　39
<211>　6863
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　基因構築體144
<400>　39
<210>　40
<211>　5279
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　表現卡匣編號1094
<400>　40
<210>　41
<211>　38
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　H5(A/印尼/05/2005)TM/CT
<400>　41
<210>　42
<211>　38
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　H3(A/布利斯班/10/2007)TM/CT
<400>　42
<210>　43
<211>　45
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　IF-Opt_EboGP.s2+4c
<400>　43
<210>　44
<211>　48
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　H5iTMCT+Opt_EboGP.r
<400>　44
<210>　45
<211>　2031
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　優化合成之GP基因(對於野生型基因序列與來自Genbank登錄號AY354458之nt 6039-8069相對應)。
<400>　45
<210>　46
<211>　45
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　Opt_EboGP+H5iTMCT.c
<400>　46
<210>　47
<211>　4897
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　基因構築體1192
<400>　47
<210>　48
<211>　3780
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　表現卡匣編號1366
<400>　48
<210>　49
<211>　679
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　來自薩伊95伊波拉病毒之PDISP-GP-H5 TM+來自A/印尼/5/2005之CY之胺基酸序列
<400>　49
HIN．．．人類免疫缺陷病毒

Claims (16)

  1. 一種在一植物中生產一類病毒顆粒(VLP)的方法，其包含，a)將包含在該植物中具活性的一調節區域並且連續地操作性連結至編碼來自一病毒三聚表面蛋白質的一膜外區域、融合至一流感穿膜區域以及胞質尾區域(TM/CT)之一嵌合核苷酸序列的一核酸引入該植物或該植物的部分，其中該TM/CT由一流感血球凝集素TM/CT所組成，且該膜外區域係來自一非流感病毒三聚表面蛋白質並且相關於該流感穿膜區域以及該胞質尾區域為異源性的，以及b)於允許該核酸表現的條件下培養該植物或該植物的部分，從而生產該VLP，該VLP包括複數個病毒蛋白，其中該等病毒蛋白由複數個嵌合病毒表面蛋白所組成。
  2. 如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中來自該病毒三聚表面蛋白質之該膜外區域係衍生自反轉錄病毒、桿狀病毒、疱疹病毒、冠狀病毒、副黏液病毒、痘病毒或絲狀病毒科的一病毒。
  3. 如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中來自該病毒三聚表面蛋白質之該膜外區域係衍生自慢病毒、狂犬病病毒、水痘病毒、冠狀病毒或伊波拉病毒屬。
  4. 如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中來自該病毒三聚表面蛋白質之該膜外區域係衍生自人類免疫缺陷病 毒(HIV)、狂犬病病毒、水痘帶狀疱疹病毒(VZV)、嚴重急性呼吸道症候群(SARS)病毒、伊波拉病毒、麻疹、腮腺炎、水痘、巨細胞病毒、伊波拉/絲狀病毒、疱疹病毒、艾巴氏病毒或天花病毒。
  5. 如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中來自該病毒三聚表面蛋白質之該膜外區域係衍生自F蛋白質、S蛋白質、env蛋白質、G蛋白質、E套膜醣蛋白、B套膜醣蛋白、C套膜醣蛋白、I套膜醣蛋白、H套膜醣蛋白、GP醣蛋白或血球凝集素。
  6. 如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中在引入的該步驟(步驟a)中，該核酸係於該植物中暫時地表現。
  7. 如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中在引入的該步驟(步驟a)中，該核酸係於該植物中穩定地表現。
  8. 如申請專利範圍第1項中所述之方法，其進一步包含：c)收穫該植物並且純化該VLP的一步驟。
  9. 如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中在引入的該步驟(步驟a)中，將選自編碼一或多於一的帶位子蛋白質、質子通道蛋白質、蛋白酶抑制劑或其結合物之核苷酸序列之群組的一或多於一個額外核酸引入該植物中。
  10. 如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中該VLP不包含一病毒基質或一核心蛋白質。
  11. 如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中在引入的該步驟(步驟a)中，該流感穿膜區域以及胞質尾區域為 一H5穿膜區域以及胞質尾區域、一H1穿膜區域以及胞質尾區域或一H3穿膜區域以及胞質尾區域。
  12. 如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中該流感穿膜區域以及該胞質尾區域從H5(A/印尼/05/2005)獲得且包括SEQ ID NO：41所定義的核酸序列，或該流感穿膜區域以及該胞質尾區域從H3(A/布利斯班/10/2007)獲得且包括SEQ ID NO：42所定義的序列。
  13. 一種經由申請專利範圍第11項中所述之方法生產之VLP。
  14. 如申請專利範圍第13項中所述之VLP，其包含帶有植物特異之N-聚醣或經修飾之N-聚醣的一嵌合病毒蛋白質。
  15. 如申請專利範圍第13項中所述之VLP，其包含一或多於一衍生自該植物的脂質。
  16. 一種包含一有效劑量之如同申請專利範圍第13項中所述之誘導一免疫反應的VLP以及一藥學上可接受之載體的組成物。
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