JPH05236967A - ヘルペスウイルス粒子及びワクチン - Google Patents
ヘルペスウイルス粒子及びワクチンInfo
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- JPH05236967A JPH05236967A JP3220206A JP22020691A JPH05236967A JP H05236967 A JPH05236967 A JP H05236967A JP 3220206 A JP3220206 A JP 3220206A JP 22020691 A JP22020691 A JP 22020691A JP H05236967 A JPH05236967 A JP H05236967A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】ワクチン接種に使用するためのヘルペスウイル
ス粒子のある形態及びそれを含有するワクチンの提供。 【構成】ビリオンに加えて、ヘルペスウイルス感染細胞
は、Ｌ−粒子と呼ばれる非感染性粒子を産生し、その粒
子は、エンベロープにより包囲される外皮から成るが、
ヌクレオカプシドを欠く。ヘルペスウイルスのＬ−粒子
は、たとえば適当な温度感受性突然変異体をその非許容
温度で複製させることにより感染性ビリオンを実質的に
含まないで調製することができる。
ス粒子のある形態及びそれを含有するワクチンの提供。 【構成】ビリオンに加えて、ヘルペスウイルス感染細胞
は、Ｌ−粒子と呼ばれる非感染性粒子を産生し、その粒
子は、エンベロープにより包囲される外皮から成るが、
ヌクレオカプシドを欠く。ヘルペスウイルスのＬ−粒子
は、たとえば適当な温度感受性突然変異体をその非許容
温度で複製させることにより感染性ビリオンを実質的に
含まないで調製することができる。
Description
【０００１】本発明はワクチン接種に使用するためのヘ
ルペスウイルス粒子のある形態及びそれを含有するワク
チンに関する。
ルペスウイルス粒子のある形態及びそれを含有するワク
チンに関する。
【０００２】単純性疱疹ウイルスの感染性ビリオン中で
は、ウイルスＤＮＡは二十面体ヌクレオカプシドに含ま
れ、それは順に無定形の蛋白様外皮及び糖蛋白質含有エ
ンベロープにより包み込まれている（Dargan, 1986
年）。
は、ウイルスＤＮＡは二十面体ヌクレオカプシドに含ま
れ、それは順に無定形の蛋白様外皮及び糖蛋白質含有エ
ンベロープにより包み込まれている（Dargan, 1986
年）。
【０００３】速度勾配遠心法により単純性疱疹ウイルス
１型（ＨＳＶ−１）の菌株を精製する時、２つの別個の
粒子バンドを認めた。ビリオンバンドのほかに、もっと
軽い粒子のバンドがその上にあった。これらはエンベロ
ープにより囲まれている外皮から成るが、ウイルスカプ
シドとＤＮＡを欠き、従って非感染性である。それらは
「Ｌ−粒子」と命名されている。本発明者は、Ｌ−粒子
がＨＳＶ−１のもう１つの株と他のヘルペスウイルスに
よっても産生されることを見出した。
１型（ＨＳＶ−１）の菌株を精製する時、２つの別個の
粒子バンドを認めた。ビリオンバンドのほかに、もっと
軽い粒子のバンドがその上にあった。これらはエンベロ
ープにより囲まれている外皮から成るが、ウイルスカプ
シドとＤＮＡを欠き、従って非感染性である。それらは
「Ｌ−粒子」と命名されている。本発明者は、Ｌ−粒子
がＨＳＶ−１のもう１つの株と他のヘルペスウイルスに
よっても産生されることを見出した。
【０００４】Ｌ−粒子の外見と組成は、２つの型の粒子
の組成の相違が、それらのアセンブルの経路が同一でな
いことを示すけれども、それらの発生がビリオンの発生
に関係があることを示唆している。Ｌ−粒子は非感染性
サブユニットワクチンに対するポテンシャルを示すが、
ビリオンが実質上混入しないようにそれらを産生するの
が不可能であることが障害である。
の組成の相違が、それらのアセンブルの経路が同一でな
いことを示すけれども、それらの発生がビリオンの発生
に関係があることを示唆している。Ｌ−粒子は非感染性
サブユニットワクチンに対するポテンシャルを示すが、
ビリオンが実質上混入しないようにそれらを産生するの
が不可能であることが障害である。
【０００５】本発明者は、ｔｓ １２０１、即ち遺伝子
ＵＬ２６に欠損のあるＨＳＶ−１の温度感受性突然変異
体（Preston ら、1983年、Preston ら、1991年）を使用
してウイルス関連粒子の産生について試験した。非許容
温度では、ｔｓ １２０１はウイルスＤＮＡと後期構造
種を含むウイルス蛋白質の完全なスペクトルを生じる。
カプシドアセンブリはこれらの温度で生じるが、ウイル
スＤＮＡはパッケージングされないので未熟カプシドが
核中に残留する（Preston ら、1983年）。このような訳
で、成熟ビリオンは非許容温度では産生されない。本発
明者は、突然変異体ｔｓ １２０１が非許容温度で野生
型ウイルスにより生じるのと同様な量でＬ−粒子を産生
することを発見した。この突然変異体がＬ−粒子をアセ
ンブルできることにより、それらの形成をカプシドとの
掛かり合いなしに起すことができることが分る。かよう
にして、ｔｓ １２０１、及び野生型ウイルスの他の突
然変異体についての推論によっても、Ｌ−粒子のアセン
ブリはビリオンアセンブリとは無関係に作成でき、Ｌ−
粒子をワクチンの有効成分として使用することが可能に
なる。
ＵＬ２６に欠損のあるＨＳＶ−１の温度感受性突然変異
体（Preston ら、1983年、Preston ら、1991年）を使用
してウイルス関連粒子の産生について試験した。非許容
温度では、ｔｓ １２０１はウイルスＤＮＡと後期構造
種を含むウイルス蛋白質の完全なスペクトルを生じる。
カプシドアセンブリはこれらの温度で生じるが、ウイル
スＤＮＡはパッケージングされないので未熟カプシドが
核中に残留する（Preston ら、1983年）。このような訳
で、成熟ビリオンは非許容温度では産生されない。本発
明者は、突然変異体ｔｓ １２０１が非許容温度で野生
型ウイルスにより生じるのと同様な量でＬ−粒子を産生
することを発見した。この突然変異体がＬ−粒子をアセ
ンブルできることにより、それらの形成をカプシドとの
掛かり合いなしに起すことができることが分る。かよう
にして、ｔｓ １２０１、及び野生型ウイルスの他の突
然変異体についての推論によっても、Ｌ−粒子のアセン
ブリはビリオンアセンブリとは無関係に作成でき、Ｌ−
粒子をワクチンの有効成分として使用することが可能に
なる。
【０００６】前記の発見によって、本発明はヘルペスウ
イルスのビリオン様で非感染性のＬ−粒子を提供する。
それらはエンベロープにより囲まれている外皮を含み、
カプシド及びカプシド内のウイルスＤＮＡを欠く、その
もの自体と共にヘルペスウイルス感染に対するワクチン
接種で使用することが提供される。
イルスのビリオン様で非感染性のＬ−粒子を提供する。
それらはエンベロープにより囲まれている外皮を含み、
カプシド及びカプシド内のウイルスＤＮＡを欠く、その
もの自体と共にヘルペスウイルス感染に対するワクチン
接種で使用することが提供される。
【０００７】本明細書の用語「Ｌ−粒子」とは、それら
を産生するために使用される特定の方法を指示するもの
ではなく、寧ろ、前記定義の粒子を呼ぶための簡便な標
示と解釈することにする。それらは温度感受性突然変異
体から産生されたけれども、組換えＤＮＡの手段により
更に簡便に得られることが理解されよう。本明細書に説
明される知見は、ヌクレオカプシド構造の核からの生成
又は放出の原因となるプロセス及びシグナルを無力にす
ることにより、Ｌ−粒子を産生することが可能になるこ
とを示している。
を産生するために使用される特定の方法を指示するもの
ではなく、寧ろ、前記定義の粒子を呼ぶための簡便な標
示と解釈することにする。それらは温度感受性突然変異
体から産生されたけれども、組換えＤＮＡの手段により
更に簡便に得られることが理解されよう。本明細書に説
明される知見は、ヌクレオカプシド構造の核からの生成
又は放出の原因となるプロセス及びシグナルを無力にす
ることにより、Ｌ−粒子を産生することが可能になるこ
とを示している。
【０００８】本発明はヘルペスウイルスのＬ−粒子を含
有するワクチンをも包含する。このワクチンにはアジュ
バントのような免疫刺激剤を含めることができる。
有するワクチンをも包含する。このワクチンにはアジュ
バントのような免疫刺激剤を含めることができる。
【０００９】Ｌ−粒子が初めて確認された時には、それ
らがＨＳＶ−１若しくは使用されたＨＳＶ−１の株、即
ち株１７に特有のものか、又は更に広範に存在するもの
かどうか分らなかった。これらの粒子は、異なるＨＳＶ
−１株である、株Ｆ（Ejercitoら、1968年）及び他の遠
縁のα−ヘルペスウイルス、即ち仮性狂犬病ウイルス株
Ｋａ（Kaplan及びVatter, 1959年）及びウマヘルペスウ
イルス１株ＡＢ４（E.Telford, MRC Virology Unit, In
stitute of Virology, Glasgow G11 5JR, Scotland か
ら入手した）によっても産生されることが、ここに判明
した。これらのウイルスの多様な性質により、Ｌ−粒子
が一般にα−型ヘルペスウイルス及び他の型のヘルペス
ウイルスから得られことは極めて確からしいことにな
る。
らがＨＳＶ−１若しくは使用されたＨＳＶ−１の株、即
ち株１７に特有のものか、又は更に広範に存在するもの
かどうか分らなかった。これらの粒子は、異なるＨＳＶ
−１株である、株Ｆ（Ejercitoら、1968年）及び他の遠
縁のα−ヘルペスウイルス、即ち仮性狂犬病ウイルス株
Ｋａ（Kaplan及びVatter, 1959年）及びウマヘルペスウ
イルス１株ＡＢ４（E.Telford, MRC Virology Unit, In
stitute of Virology, Glasgow G11 5JR, Scotland か
ら入手した）によっても産生されることが、ここに判明
した。これらのウイルスの多様な性質により、Ｌ−粒子
が一般にα−型ヘルペスウイルス及び他の型のヘルペス
ウイルスから得られことは極めて確からしいことにな
る。
【００１０】本発明は、適当な遺伝子的無力化（geneti
c disablement ）を受けたウイルスを使用することによ
り感染性ビリオンを実質上含まないＬ−粒子の産生が可
能であるという発見を含んでいる。好ましい実施態様と
して、非許容条件の下に条件的致死突然変異体を細胞に
感染させる。用語「条件的致死突然変異体」とは、ある
種の条件下にウイルス増殖に対し致死的な突然変異体を
示す。温度はそのような条件の一般的な例であって、温
度感受性突然変異体、たとえばｔｓ １２０１を細胞に
感染させる。非許容温度とは野生型ウイルスは増殖する
が、突然変異体は増殖しない温度であって、通例３８〜
４０℃の範囲である。感染細胞は、ウイルス感染細胞
は、ウイルスＤＮＡ複製を生じて後期翻訳蛋白質を産生
できるようになり、そしてＬ−粒子をアセンブルして蓄
積できるようになるために充分な時間、保温、培養す
る。必要な時間は典型的には２０時間以上であり得る
が、突然変異の性質に従って変る。
c disablement ）を受けたウイルスを使用することによ
り感染性ビリオンを実質上含まないＬ−粒子の産生が可
能であるという発見を含んでいる。好ましい実施態様と
して、非許容条件の下に条件的致死突然変異体を細胞に
感染させる。用語「条件的致死突然変異体」とは、ある
種の条件下にウイルス増殖に対し致死的な突然変異体を
示す。温度はそのような条件の一般的な例であって、温
度感受性突然変異体、たとえばｔｓ １２０１を細胞に
感染させる。非許容温度とは野生型ウイルスは増殖する
が、突然変異体は増殖しない温度であって、通例３８〜
４０℃の範囲である。感染細胞は、ウイルス感染細胞
は、ウイルスＤＮＡ複製を生じて後期翻訳蛋白質を産生
できるようになり、そしてＬ−粒子をアセンブルして蓄
積できるようになるために充分な時間、保温、培養す
る。必要な時間は典型的には２０時間以上であり得る
が、突然変異の性質に従って変る。
【００１１】多くの他の温度感受性突然変異体を産生し
て、前記参考文献に記載されたのと同様な効果に対して
試験することができる。多くの突然変異体は「漏出性(l
eaky) 」であり、それらが非許容温度内のある温度でビ
リオンを産生するという意味である。従って、温度を最
適化してビリオンによる汚染を軽減することが必要であ
るが、これは当業者にとって日常的な事柄である。
て、前記参考文献に記載されたのと同様な効果に対して
試験することができる。多くの突然変異体は「漏出性(l
eaky) 」であり、それらが非許容温度内のある温度でビ
リオンを産生するという意味である。従って、温度を最
適化してビリオンによる汚染を軽減することが必要であ
るが、これは当業者にとって日常的な事柄である。
【００１２】ビリオン生成を防止する温度感受性に対す
る代りの条件としては、必須遺伝子を欠失したウイルス
の創出がある。たとえば、カプシド蛋白質をウイルスゲ
ノムから欠失させた場合には、このようなウイルスは、
この欠失したカプシド蛋白質を発現する遺伝子操作され
た細胞系でしか増殖させることができない。これらの条
件下に、その細胞系はビリオン産生に必須なカプシド蛋
白質を提供する。これらの細胞系で増殖するウイルスを
使用してカプシド蛋白質を発現しない細胞に感染させる
場合、ビリオン産生は起らないであろう。しかしなが
ら、カプシド蛋白質がそれらの産生の必須成分ではない
ので、Ｌ−粒子は作られる。これらの条件の下では、欠
失はウイルス増殖にとって致死的になろう。条件的致死
突然変異体を創造する更に巧妙な手段は他にもあって、
その用語はビリオン産生を防止する多くの方法を網羅す
る。
る代りの条件としては、必須遺伝子を欠失したウイルス
の創出がある。たとえば、カプシド蛋白質をウイルスゲ
ノムから欠失させた場合には、このようなウイルスは、
この欠失したカプシド蛋白質を発現する遺伝子操作され
た細胞系でしか増殖させることができない。これらの条
件下に、その細胞系はビリオン産生に必須なカプシド蛋
白質を提供する。これらの細胞系で増殖するウイルスを
使用してカプシド蛋白質を発現しない細胞に感染させる
場合、ビリオン産生は起らないであろう。しかしなが
ら、カプシド蛋白質がそれらの産生の必須成分ではない
ので、Ｌ−粒子は作られる。これらの条件の下では、欠
失はウイルス増殖にとって致死的になろう。条件的致死
突然変異体を創造する更に巧妙な手段は他にもあって、
その用語はビリオン産生を防止する多くの方法を網羅す
る。
【００１３】充実カプシドの生成の要因となる遺伝子は
いずれも、たとえばヌクレオチドの欠失、変異又は挿入
により適当に無力化することができる。一般的には、そ
の効果がより予知し易いため、欠失が好ましいが、多数
の温度感受性突然変異体が既に存在して、これらの中に
は感染性ビリオンを実質上含まないＬ−粒子を充分産生
するものも幾つかあるようである。
いずれも、たとえばヌクレオチドの欠失、変異又は挿入
により適当に無力化することができる。一般的には、そ
の効果がより予知し易いため、欠失が好ましいが、多数
の温度感受性突然変異体が既に存在して、これらの中に
は感染性ビリオンを実質上含まないＬ−粒子を充分産生
するものも幾つかあるようである。
【００１４】ＨＳＶ−１突然変異体ｔｓ １２０１には
遺伝子ＵＬ２６に変異を有し、それはＤＮＡパッケージ
ングに関与する蛋白質をコード化する。無力化されてビ
リオンを実質上含まないＬ−粒子を産生し得るＨＳＶ−
１の他の遺伝子は次のものから成る。
遺伝子ＵＬ２６に変異を有し、それはＤＮＡパッケージ
ングに関与する蛋白質をコード化する。無力化されてビ
リオンを実質上含まないＬ−粒子を産生し得るＨＳＶ−
１の他の遺伝子は次のものから成る。
【００１５】ＵＬ６．ＤＮＡパッケージングに関与する
後期蛋白質をコード化する遺伝子。ｔｓＮ（Ｍａｔｚ
ら、１９８３年）、ｔｓＦ１８及びｔｓＦ４３（Ｗｅｌ
ｌｅｒら、１９８７年）の変異はこの遺伝子中にある。
後期蛋白質をコード化する遺伝子。ｔｓＮ（Ｍａｔｚ
ら、１９８３年）、ｔｓＦ１８及びｔｓＦ４３（Ｗｅｌ
ｌｅｒら、１９８７年）の変異はこの遺伝子中にある。
【００１６】ＵＬ１２．ＤＮＡパッケージングに関与す
る蛋白質、アルカリ性ヌクレアーゼをコード化するもう
１つの遺伝子（Ｗｅｌｌｅｒら、１９９０年）。
る蛋白質、アルカリ性ヌクレアーゼをコード化するもう
１つの遺伝子（Ｗｅｌｌｅｒら、１９９０年）。
【００１７】ＵＬ１８．カプシド蛋白質遺伝子（Ｒｉｘ
ｏｎら、１９９０年）。
ｏｎら、１９９０年）。
【００１８】ＵＬ１９．カプシド蛋白質遺伝子。ｔｓＧ
３及びｔｓＧ８の変異（Ｗｅｌｌｅｒら、１９８７年）
はこの遺伝子中にある。
３及びｔｓＧ８の変異（Ｗｅｌｌｅｒら、１９８７年）
はこの遺伝子中にある。
【００１９】ＵＬ２８．ＤＮＡパッケージングに関与す
る蛋白質をコード化する遺伝子。ｔｓ１２０３の変異
（Ａｄｄｉｓｏｎら、１９９０年）はこの遺伝子中にあ
る。
る蛋白質をコード化する遺伝子。ｔｓ１２０３の変異
（Ａｄｄｉｓｏｎら、１９９０年）はこの遺伝子中にあ
る。
【００２０】ＵＬ３３．充実カプシド（Ａｌ−Ｋｏｂａ
ｉｓｉら、１９９１年）の産生に関与するもう１つの遺
伝子。
ｉｓｉら、１９９１年）の産生に関与するもう１つの遺
伝子。
【００２１】ＵＬ３８．カプシド蛋白質（Ｐｅｒｔｕｉ
ｓｅｔら、１９８９年；Ｒｉｘｏｎら、１９９０年）。
ｓｅｔら、１９８９年；Ｒｉｘｏｎら、１９９０年）。
【００２２】目的にされることの多いワクチン接種の用
途には少しの割合のビリオンでも好ましくないので、最
終の市販ワクチンにはＬ−粒子を組換えＤＮＡ技術で産
生することになるであろう。このようにして、１つ又は
少数のＤＮＡ断片として適当に無力化されてビリオン生
成を妨げられた完全なヘルペスウイルスゲノムをクロー
ニングして発現させ、Ｌ−粒子を「人工的に」産生し
て、これによりビリオンによる汚染を避ける。
途には少しの割合のビリオンでも好ましくないので、最
終の市販ワクチンにはＬ−粒子を組換えＤＮＡ技術で産
生することになるであろう。このようにして、１つ又は
少数のＤＮＡ断片として適当に無力化されてビリオン生
成を妨げられた完全なヘルペスウイルスゲノムをクロー
ニングして発現させ、Ｌ−粒子を「人工的に」産生し
て、これによりビリオンによる汚染を避ける。
【００２３】ＨＳＶ ＤＮＡをクローニングしてビリオ
ンを含まないＬ−粒子を産生するための２つの方法を例
としてここに挙げる。これらのうち第１は、バクテリオ
ファージ クローニング系（Ｐｌクローニング系と呼
ぶ）を使用し、それによりＨＳＶゲノムのクローニング
が２つの大きい部分のＤＮＡ（＞５０ｋｂの対）として
できる。このようにＤＮＡの大きい断片をクローニング
できることは、大抵の他のクローニング方法ではもっと
短いＤＮＡ断片しかクローニングされないため、特に有
利である。これらの大きい断片をＰｌ系を使用してクロ
ーニングする場合それらは標準的方法を使用する操作に
従う。クローニングされたＤＮＡの操作の期待される型
式はビリオンアセンブルを防止するような型である。例
としては、Ｌ−粒子生成には関与しないが、ビリオンア
センブルには必要とされるカプシド蛋白質のような必須
の構造遺伝子の欠失である。また、ＤＮＡパッケージン
グに必要とされるゲノムの内部に局在するシグナルを除
去して、成熟ビリオンの産生を防止することもできるで
あろう。Ｌ−粒子を得るために、これらのクローニング
されたＤＮＡ断片を哺乳動物細胞に移入され、近頃開発
された方法により高度の移入効率が得られる。
ンを含まないＬ−粒子を産生するための２つの方法を例
としてここに挙げる。これらのうち第１は、バクテリオ
ファージ クローニング系（Ｐｌクローニング系と呼
ぶ）を使用し、それによりＨＳＶゲノムのクローニング
が２つの大きい部分のＤＮＡ（＞５０ｋｂの対）として
できる。このようにＤＮＡの大きい断片をクローニング
できることは、大抵の他のクローニング方法ではもっと
短いＤＮＡ断片しかクローニングされないため、特に有
利である。これらの大きい断片をＰｌ系を使用してクロ
ーニングする場合それらは標準的方法を使用する操作に
従う。クローニングされたＤＮＡの操作の期待される型
式はビリオンアセンブルを防止するような型である。例
としては、Ｌ−粒子生成には関与しないが、ビリオンア
センブルには必要とされるカプシド蛋白質のような必須
の構造遺伝子の欠失である。また、ＤＮＡパッケージン
グに必要とされるゲノムの内部に局在するシグナルを除
去して、成熟ビリオンの産生を防止することもできるで
あろう。Ｌ−粒子を得るために、これらのクローニング
されたＤＮＡ断片を哺乳動物細胞に移入され、近頃開発
された方法により高度の移入効率が得られる。
【００２４】第２の方法は酵母ＤＮＡからのシグナルを
ＨＳＶゲノムに挿入し、こうして「酵母人工染色体（Ｙ
ＡＣ）」を創出する。酵母細胞への移入に続いて、ＹＡ
Ｃは正常の酵母染色体と同じ様に反応し、従って細胞分
裂後娘細胞に遺伝する。再びＨＳＶゲノムを操作してＬ
−粒子のみ作られビリオンが作られないようにする。Ｈ
ＳＶ ＹＡＣを含む酵母細胞からできるＤＮＡはそれか
ら哺乳動物細胞に移入されて、Ｌ−粒子の産生を評価試
験する。これらの特別な組換えＤＮＡ技術を使用するウ
イルスフリー系でのＬ−粒子の産生は本発明の好ましい
特徴である。
ＨＳＶゲノムに挿入し、こうして「酵母人工染色体（Ｙ
ＡＣ）」を創出する。酵母細胞への移入に続いて、ＹＡ
Ｃは正常の酵母染色体と同じ様に反応し、従って細胞分
裂後娘細胞に遺伝する。再びＨＳＶゲノムを操作してＬ
−粒子のみ作られビリオンが作られないようにする。Ｈ
ＳＶ ＹＡＣを含む酵母細胞からできるＤＮＡはそれか
ら哺乳動物細胞に移入されて、Ｌ−粒子の産生を評価試
験する。これらの特別な組換えＤＮＡ技術を使用するウ
イルスフリー系でのＬ−粒子の産生は本発明の好ましい
特徴である。
【００２５】Ｌ−粒子は、本明細書では、外皮及び外部
エンベロープを有するが、カプシド及びウイルスＤＮＡ
を欠くとして定義している。Ｌ−粒子はビリオンにより
惹起される免疫応答を刺激できることが予想される。こ
うしてそれらは体液性応答を刺激することができる。更
にその上、Ｌ−粒子は宿主細胞に結合し、これらの細胞
と融合して、それらの内容物を放出することが予想さ
れ、このようにしてそれらは細胞媒介免疫の獲得を助け
る。これらの免疫応答は、Ｌ−粒子が由来するヘルペス
ウイルスの型に対する防御を提供することが期待され
る。Ｌ−粒子はＬ−粒子の関連蛋白質を与える株のヘル
ペスウイルス感染に対する防御を提供することが目的と
して考えられているが、ある血清型の中の他の株に対し
て、又は血清型の異なる株に対してまでもある程度は防
御があることは多くの場合確からしい。
エンベロープを有するが、カプシド及びウイルスＤＮＡ
を欠くとして定義している。Ｌ−粒子はビリオンにより
惹起される免疫応答を刺激できることが予想される。こ
うしてそれらは体液性応答を刺激することができる。更
にその上、Ｌ−粒子は宿主細胞に結合し、これらの細胞
と融合して、それらの内容物を放出することが予想さ
れ、このようにしてそれらは細胞媒介免疫の獲得を助け
る。これらの免疫応答は、Ｌ−粒子が由来するヘルペス
ウイルスの型に対する防御を提供することが期待され
る。Ｌ−粒子はＬ−粒子の関連蛋白質を与える株のヘル
ペスウイルス感染に対する防御を提供することが目的と
して考えられているが、ある血清型の中の他の株に対し
て、又は血清型の異なる株に対してまでもある程度は防
御があることは多くの場合確からしい。
【００２６】これまで記載した本発明は単一株のヘルペ
スウイルスの成分で完全に構成されるＬ−粒子に関する
が、他のウイルス型又はヘルペスウイルスの他の株に由
来する蛋白質又はエピトープ性ペプチドをＬ−粒子の中
に発現して取込む能力を有するウイルス組換え体を産生
することにより、もっと広範囲の防御を提供することが
できよう。たとえば、水痘帯状疱疹ウイルスをＨＳＶ−
１ ＤＮＡに挿入してＶＺＶ蛋白質を生じる粒子を産生
することができる。実際、このような構築物の非天然Ｄ
ＮＡは異種蛋白又は異種ペプチドをコードする非ヘルペ
スウイルスＤＮＡとすることまで可能である。
スウイルスの成分で完全に構成されるＬ−粒子に関する
が、他のウイルス型又はヘルペスウイルスの他の株に由
来する蛋白質又はエピトープ性ペプチドをＬ−粒子の中
に発現して取込む能力を有するウイルス組換え体を産生
することにより、もっと広範囲の防御を提供することが
できよう。たとえば、水痘帯状疱疹ウイルスをＨＳＶ−
１ ＤＮＡに挿入してＶＺＶ蛋白質を生じる粒子を産生
することができる。実際、このような構築物の非天然Ｄ
ＮＡは異種蛋白又は異種ペプチドをコードする非ヘルペ
スウイルスＤＮＡとすることまで可能である。
【００２７】Ｌ−粒子を形成するためには、充実カプシ
ドの形成を防御することで充分である。欠失する必須の
構造成分を欠くカプシドは多分感染性ビリオンを創出す
ることができない。
ドの形成を防御することで充分である。欠失する必須の
構造成分を欠くカプシドは多分感染性ビリオンを創出す
ることができない。
【００２８】本発明のワクチンは、ヘルペスウイルスの
蛋白質に対する抗体の生成を刺激できるＬ−粒子のどん
な配合物でもあり得る。従ってワクチンはＬ−粒子と共
に、免疫刺激剤（たとえばアジュバント）又はビヒクル
を通常含有する。
蛋白質に対する抗体の生成を刺激できるＬ−粒子のどん
な配合物でもあり得る。従ってワクチンはＬ−粒子と共
に、免疫刺激剤（たとえばアジュバント）又はビヒクル
を通常含有する。
【００２９】
【実施例】次の実施例により本発明について説明する。
【００３０】実施例１ 本実施例は野生型ウイルスからＬ−粒子を得る方法を示
す。
す。
【００３１】方 法 ウイルス株 ＨＳＶ−１株１７（Ｂｒｏｗｎら、１９７３年）はInst
itute of Virology, University of Glasgow, Glasgow
G11 5JR から入手した。
itute of Virology, University of Glasgow, Glasgow
G11 5JR から入手した。
【００３２】ウイルス粒子の増殖と標識化 回転瓶中の単層ＢＨＫ−２１ Ｃ１３細胞に、４０mlの
培養基（子ウシ血清２％を含有するイーグル培地、Macp
herson & Stocker, 1962年）に懸濁した極めて少数の勾
配精製ＨＳＶ−１株１７ビリオン（約１ pfu／105 個細
胞）を感染させた。３１℃で３日間の保温培養の後、大
部分の細胞は生産的感染を受けていると見なされ、４０
mlの新しい培養基で培地を置き換え、更に４８時間保温
培養を続け、その時までには細胞変性効果が認められ
た。
培養基（子ウシ血清２％を含有するイーグル培地、Macp
herson & Stocker, 1962年）に懸濁した極めて少数の勾
配精製ＨＳＶ−１株１７ビリオン（約１ pfu／105 個細
胞）を感染させた。３１℃で３日間の保温培養の後、大
部分の細胞は生産的感染を受けていると見なされ、４０
mlの新しい培養基で培地を置き換え、更に４８時間保温
培養を続け、その時までには細胞変性効果が認められ
た。
【００３３】ウイルス蛋白質、糖蛋白質及びＤＮＡを標
識化するため、培地を変更した７時間後にＬ−［35Ｓ］
メチオニン（２６ＭＢｑ／瓶）、Ｄ−［２，６− 3Ｈ］
マンノース（２６ＭＢｑ／瓶）又は［Ｍｅ− 3Ｈ］チミ
ジン（２６ＭＢｑ／瓶）のいずれかを添加して、更に４
１時間保温培養を続けた。
識化するため、培地を変更した７時間後にＬ−［35Ｓ］
メチオニン（２６ＭＢｑ／瓶）、Ｄ−［２，６− 3Ｈ］
マンノース（２６ＭＢｑ／瓶）又は［Ｍｅ− 3Ｈ］チミ
ジン（２６ＭＢｑ／瓶）のいずれかを添加して、更に４
１時間保温培養を続けた。
【００３４】燐蛋白質を標識化するため、感染後３日間
で普通濃度の１％だけの燐酸塩を含有する培養基に培地
を置き換え、７時間後［32Ｐ］オルト燐酸塩（３７ＭＢ
ｑ／瓶）を添加して更に４１時間保温培養を続けた。
で普通濃度の１％だけの燐酸塩を含有する培養基に培地
を置き換え、７時間後［32Ｐ］オルト燐酸塩（３７ＭＢ
ｑ／瓶）を添加して更に４１時間保温培養を続けた。
【００３５】ウイルス粒子の精製 細胞外ウイルス粒子の精製の基本的特徴は、粒子を修正
培地（後記）中に常に懸濁し、勾配遠心法には浸透圧的
に不活性な Ficoll を使用して、精製の間一定のモル浸
透圧濃度を保持することであった。
培地（後記）中に常に懸濁し、勾配遠心法には浸透圧的
に不活性な Ficoll を使用して、精製の間一定のモル浸
透圧濃度を保持することであった。
【００３６】このようにして、保温培養の５日後に４つ
の回転瓶から培地をまとめ、細胞片を低速遠心分離（10
00ｇ、４℃で３０分間）により除去して、静澄にした培
地中のウイルス粒子を遠心沈澱（23000 ｇ、４℃で２時
間）によりペレットにした。次いでペレットを１mlの修
正培地（フェノールレッドと子ウシ血清を含まない培養
基）に穏やかに再懸濁し、この培地に懸濁した、前もっ
て形成した５〜１５％の勾配の３５mlのFicoll 400（Si
gma 製）の上に重層した。スイングアウトローターを使
用する遠心沈降（26000 ｇ、４℃で２時間）の後、２つ
の十分に分離した粒子バンドを、側面に孔をあけて個別
に取出した。最後にこれらのバンドを構成している粒子
を遠心沈降（80000 ｇ、４℃で２時間）によりペレット
にし、２００μｌの修正培地中に穏やかに再懸濁して、
直ちに使用するか又は−７０℃で貯蔵した。
の回転瓶から培地をまとめ、細胞片を低速遠心分離（10
00ｇ、４℃で３０分間）により除去して、静澄にした培
地中のウイルス粒子を遠心沈澱（23000 ｇ、４℃で２時
間）によりペレットにした。次いでペレットを１mlの修
正培地（フェノールレッドと子ウシ血清を含まない培養
基）に穏やかに再懸濁し、この培地に懸濁した、前もっ
て形成した５〜１５％の勾配の３５mlのFicoll 400（Si
gma 製）の上に重層した。スイングアウトローターを使
用する遠心沈降（26000 ｇ、４℃で２時間）の後、２つ
の十分に分離した粒子バンドを、側面に孔をあけて個別
に取出した。最後にこれらのバンドを構成している粒子
を遠心沈降（80000 ｇ、４℃で２時間）によりペレット
にし、２００μｌの修正培地中に穏やかに再懸濁して、
直ちに使用するか又は−７０℃で貯蔵した。
【００３７】ウイルス粒子の分析 粒子中の放射性標識物の量を２００μｌの最終懸濁液か
らの２μｌの試料を使用してシンチレーション分光光度
測定により測定した。
らの２μｌの試料を使用してシンチレーション分光光度
測定により測定した。
【００３８】粒子中の蛋白質の量はウシ血清アルブミン
を標準に使用してＬｏｗｒｙら、（１９５１年）の方法
により定量した。
を標準に使用してＬｏｗｒｙら、（１９５１年）の方法
により定量した。
【００３９】ウイルス粒子の力価測定 ウイルス粒子の系列的希釈液を修正培地を用いてつくっ
た。ＢＨＫ−２１ Ｃ１３細胞（３５mmペトリ皿中）
に、系列的に希釈した粒子の１mlのアリコートを用いて
感染させ、３１℃で１時間保温培養した後、接種材料を
除去し、３mlの上掛け固形培地（フェノールレッドを除
くが、子ウシ血清２．８％及びアガロース0.625 ％を含
有する培養基；アガロースタイプＨＳＡ、Park Scienti
fic 製）を添加して、室温で培地を凝固させた後（約１
日間）、皿を３１℃で４時間保温培養した。最後に培養
物をＣｉｄｅｘを用いて固定し（室温で４時間）、次い
でギムザ染色液を用いて染色した。
た。ＢＨＫ−２１ Ｃ１３細胞（３５mmペトリ皿中）
に、系列的に希釈した粒子の１mlのアリコートを用いて
感染させ、３１℃で１時間保温培養した後、接種材料を
除去し、３mlの上掛け固形培地（フェノールレッドを除
くが、子ウシ血清２．８％及びアガロース0.625 ％を含
有する培養基；アガロースタイプＨＳＡ、Park Scienti
fic 製）を添加して、室温で培地を凝固させた後（約１
日間）、皿を３１℃で４時間保温培養した。最後に培養
物をＣｉｄｅｘを用いて固定し（室温で４時間）、次い
でギムザ染色液を用いて染色した。
【００４０】粒子計数 ウイルス懸濁液を等体積の珪タングステン酸ナトリウム
の１％溶液及びラテックスビーズの懸濁液（1.42×1011
粒子／ml）と混合した。この懸濁液の１滴を電子顕微鏡
グリッド上に置き、５分後粒子を定着させるために、過
剰の懸濁液を除去して、電子顕微鏡下で粒子を計数し
た。
の１％溶液及びラテックスビーズの懸濁液（1.42×1011
粒子／ml）と混合した。この懸濁液の１滴を電子顕微鏡
グリッド上に置き、５分後粒子を定着させるために、過
剰の懸濁液を除去して、電子顕微鏡下で粒子を計数し
た。
【００４１】粒子の電子顕微鏡検査 ウイルス粒子を、等体積の８％ホルムアルデヒド溶液
（修正培地中で新たに調製した）と懸濁液を混合し、そ
れらを室温に１０分間放置して固定した。次いで等体積
の１％珪タングステン酸ナトリウムの添加により、固定
粒子をネガティブ染色し（粒子周辺部分が暗色になる）
電子顕微鏡下に検査した。
（修正培地中で新たに調製した）と懸濁液を混合し、そ
れらを室温に１０分間放置して固定した。次いで等体積
の１％珪タングステン酸ナトリウムの添加により、固定
粒子をネガティブ染色し（粒子周辺部分が暗色になる）
電子顕微鏡下に検査した。
【００４２】ポリペプチドのＰＡＧＥ分析 ジアリルタルタルジアミド（ＤＡＴＤ）を用いて橋かけ
した非連続ＳＤＳ−ポリアクリルアミド平板ゲルをＯｒ
ｇｒａｄｉら（１９８５年）の記載に従って使用した。
分離ゲルにはポリアクリルアミド１０，１２，１５又は
１８％を含有させ、ポリアクリルアミドとＤＡＴＤの比
は 100：1.75とした。
した非連続ＳＤＳ−ポリアクリルアミド平板ゲルをＯｒ
ｇｒａｄｉら（１９８５年）の記載に従って使用した。
分離ゲルにはポリアクリルアミド１０，１２，１５又は
１８％を含有させ、ポリアクリルアミドとＤＡＴＤの比
は 100：1.75とした。
【００４３】Ｍr 値の個々のポリペプチドに対する割当
ては、充分確認されているＭr （Ｖmw２７３、Ｖmw１５
５、Ｖmw８２／８１、Ｖmw６５及びＶmw３７）を有する
主要なポリペプチドの位置との関係でそれらの位置に基
いて行った。これらのＭr はゲルごとに含まれる標準標
識（［14Ｃ］メチル化蛋白質混合物；ＣＡＦ．６２６及
びＣＦＡ．６４５；Amersham製）から得られるものと良
く一致した。
ては、充分確認されているＭr （Ｖmw２７３、Ｖmw１５
５、Ｖmw８２／８１、Ｖmw６５及びＶmw３７）を有する
主要なポリペプチドの位置との関係でそれらの位置に基
いて行った。これらのＭr はゲルごとに含まれる標準標
識（［14Ｃ］メチル化蛋白質混合物；ＣＡＦ．６２６及
びＣＦＡ．６４５；Amersham製）から得られるものと良
く一致した。
【００４４】結 果 Ｈ粒子とＬ粒子の分離 ＨＳＶ−１の精製中に、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心法により
散漫な上方バンドと尖鋭で充分に明確な下方バンドに分
離される。バンドの位置はこれらのバンド中の粒子の密
度の有意の差を意味し、このためにそれらを軽（Ｌ）粒
子及び重（Ｈ）粒子と称する。
散漫な上方バンドと尖鋭で充分に明確な下方バンドに分
離される。バンドの位置はこれらのバンド中の粒子の密
度の有意の差を意味し、このためにそれらを軽（Ｌ）粒
子及び重（Ｈ）粒子と称する。
【００４５】２つのバンドから粒子を取出して、それら
の沈降特性を調べるため別々に再度遠心作用にかけた。
下方バンドの尖鋭さはこのバンドを構成するＨ粒子が均
質であることを示唆していた。上方バンド由来のＬ粒子
も幅が広いけれども充分明確なバンドとして移動し、こ
れらの粒子が別個なものではあるが、Ｈ粒子よりも均質
性が低いことを示した。
の沈降特性を調べるため別々に再度遠心作用にかけた。
下方バンドの尖鋭さはこのバンドを構成するＨ粒子が均
質であることを示唆していた。上方バンド由来のＬ粒子
も幅が広いけれども充分明確なバンドとして移動し、こ
れらの粒子が別個なものではあるが、Ｈ粒子よりも均質
性が低いことを示した。
【００４６】電子顕微鏡検査 粒子をホルムアルデヒドを用いて固定し、次いで珪タン
グステン酸ナトリウムを用いてネガティブ染色してそれ
らの構造の完全な状態を保存するようにした。
グステン酸ナトリウムを用いてネガティブ染色してそれ
らの構造の完全な状態を保存するようにした。
【００４７】Ｈ粒子は典型的ＨＳＶビリオンとして明ら
かに確認できた。何故ならば、それらは外表上に明らか
に目に見えるスパイクを有する外膜、二十面体ヌクレオ
カプシド及び膜とヌクレオカプシドの間の電子密度の高
い外皮から成るためである。
かに確認できた。何故ならば、それらは外表上に明らか
に目に見えるスパイクを有する外膜、二十面体ヌクレオ
カプシド及び膜とヌクレオカプシドの間の電子密度の高
い外皮から成るためである。
【００４８】Ｌ−粒子はヌクレオカプシドを有しないウ
イルス様物であるようであった。何故ならばそれらは認
識し易い内部構造を有しない均一な顆粒状物を包み込む
外膜（表面スパイクをを有する）から成るためである。
それらは大きさがビリオン程整然としたものでなく、そ
れはＦｉｃｏｌｌ勾配で幅の広いバンドを形成する理由
を説明し得る。Ｌ−粒子調製物中では、ビリオンを時た
まだけ認めた。
イルス様物であるようであった。何故ならばそれらは認
識し易い内部構造を有しない均一な顆粒状物を包み込む
外膜（表面スパイクをを有する）から成るためである。
それらは大きさがビリオン程整然としたものでなく、そ
れはＦｉｃｏｌｌ勾配で幅の広いバンドを形成する理由
を説明し得る。Ｌ−粒子調製物中では、ビリオンを時た
まだけ認めた。
【００４９】その他の特性 表 Ｈ粒子及びＬ粒子の化学組成と感染力 粒 子 * Ｈ Ｌ 蛋白質［35Ｓ］メチオニン（cpm/μl ） 56 600 75 300 Ｌｏｗｒｙ法（mg／ml） 5.1 6.2 感 染 力（pfu/ml） 5×109 4×106 粒子計数値（粒子／ml） 1.15×1011 8×1010 感染力と粒子の比 1：23 1：20,000 ＤＮＡ［ 3Ｈ］チミジン（cpm/μl ） 125 000 472 ＊精製したＨ粒子及びＬ粒子は［35Ｓ］メチオニン（蛋
白質感染力と粒子計数の定量のため）又は［ 3Ｈ］チミ
ジン（ＤＮＡの定量のため）の存在下に増殖した。３つ
の他の精製により得られた粒子を用いて同様の結果を得
た。
白質感染力と粒子計数の定量のため）又は［ 3Ｈ］チミ
ジン（ＤＮＡの定量のため）の存在下に増殖した。３つ
の他の精製により得られた粒子を用いて同様の結果を得
た。
【００５０】［35Ｓ］メチオニン標識した精製粒子をシ
ンチレーション分光光度法及びＬｏｗｒｙ法による解析
により、ビリオンとＬ粒子の大体同様な量が感染中に産
生されることが示唆され、このことは粒子の計数（表）
により確かめられた。
ンチレーション分光光度法及びＬｏｗｒｙ法による解析
により、ビリオンとＬ粒子の大体同様な量が感染中に産
生されることが示唆され、このことは粒子の計数（表）
により確かめられた。
【００５１】［ 3Ｈ］チミジン標識粒子のシンチレーシ
ョン分光光度解析により、ビリオン（Ｈ粒子）はゲノム
ＤＮＡを含有することが確認され、かつＬ粒子は含有し
ないことが示唆された。Ｌ粒子に伴う少量のＤＮＡはＨ
粒子との 0.1〜0.5 ％の交差汚染によることは大体確か
である（前記表参照）。
ョン分光光度解析により、ビリオン（Ｈ粒子）はゲノム
ＤＮＡを含有することが確認され、かつＬ粒子は含有し
ないことが示唆された。Ｌ粒子に伴う少量のＤＮＡはＨ
粒子との 0.1〜0.5 ％の交差汚染によることは大体確か
である（前記表参照）。
【００５２】Ｈ粒子の感染力と粒子の比により、Ｈ粒子
は感染性ビリオンであることが確認されたが、同じ感染
細胞集団を起源とするＬ粒子の遥かに低い比は、Ｌ粒子
が感染性ではなく低水準（約０．１％）のビリオンで単
に汚染されたに過ぎないことを示唆した。
は感染性ビリオンであることが確認されたが、同じ感染
細胞集団を起源とするＬ粒子の遥かに低い比は、Ｌ粒子
が感染性ではなく低水準（約０．１％）のビリオンで単
に汚染されたに過ぎないことを示唆した。
【００５３】こうして、これらの結果は、ウイルス複製
後のＨＳＶ−１感染細胞の培養基は２つの型の粒子を同
様な量含有することを示す。２つの型の粒子とは、熟知
された感染性ＨＳＶビリオンであるＨ粒子、及びカプシ
ドもウイルスＤＮＡも含有せず感染性でない新しい型の
ＨＳＶ−特異的な実体を明らかに示すＬ粒子である。
後のＨＳＶ−１感染細胞の培養基は２つの型の粒子を同
様な量含有することを示す。２つの型の粒子とは、熟知
された感染性ＨＳＶビリオンであるＨ粒子、及びカプシ
ドもウイルスＤＮＡも含有せず感染性でない新しい型の
ＨＳＶ−特異的な実体を明らかに示すＬ粒子である。
【００５４】ポリペプチド組成 ［35Ｓ］メチオニン標識したＨ粒子及びＬ粒子のポリペ
プチド組成について、ＤＡＴＤを用いて橋かけした１０
％，１２％，１５％及び１８％のポリアクリルアミドゲ
ルを使用し電気泳動法により解析した。
プチド組成について、ＤＡＴＤを用いて橋かけした１０
％，１２％，１５％及び１８％のポリアクリルアミドゲ
ルを使用し電気泳動法により解析した。
【００５５】１０％ポリアクリルアミドゲル上のＨ粒子
及びＬ粒子のポリペプチドプロフィールにより、両粒子
に共通のもっとも重要なポリペプチドは２７３Ｋ，８２
／８１Ｋ，６５Ｋ及び４０Ｋのポリペプチド、並びに大
体１３４〜１２３Ｋ及び６３Ｋ〜６０ＫのＭr を有する
重複するバンドの２つの散漫な区域であることが示され
た。他の幾つかのポリペプチド（１１５Ｋ，１０８Ｋ，
６９Ｋ，４６Ｋ，４４Ｋ及び４２Ｋ）も両粒子で観察さ
れた。
及びＬ粒子のポリペプチドプロフィールにより、両粒子
に共通のもっとも重要なポリペプチドは２７３Ｋ，８２
／８１Ｋ，６５Ｋ及び４０Ｋのポリペプチド、並びに大
体１３４〜１２３Ｋ及び６３Ｋ〜６０ＫのＭr を有する
重複するバンドの２つの散漫な区域であることが示され
た。他の幾つかのポリペプチド（１１５Ｋ，１０８Ｋ，
６９Ｋ，４６Ｋ，４４Ｋ及び４２Ｋ）も両粒子で観察さ
れた。
【００５６】Ｈ粒子は、Ｌ粒子に見かけ上ない幾つかの
ポリペプチド、即ち２つの主要カプチド蛋白質（１５５
Ｋ及び３７Ｋ並びに１４３Ｋ，１０４Ｋ，８６Ｋ，５６
Ｋ，５４Ｋ及び５０Ｋのポリペプチド）をも含有してい
た。それらはＬ−粒子よりも多くの６９Ｋポリペプチド
をも含有し、このことは、より大量のこのペプチドがＨ
粒子に組込まれること、又はこの粒子に独特な１つ以上
のポリペプチドが６９Ｋポリペプチドと共移動する（co
migrate ）ことを示す。
ポリペプチド、即ち２つの主要カプチド蛋白質（１５５
Ｋ及び３７Ｋ並びに１４３Ｋ，１０４Ｋ，８６Ｋ，５６
Ｋ，５４Ｋ及び５０Ｋのポリペプチド）をも含有してい
た。それらはＬ−粒子よりも多くの６９Ｋポリペプチド
をも含有し、このことは、より大量のこのペプチドがＨ
粒子に組込まれること、又はこの粒子に独特な１つ以上
のポリペプチドが６９Ｋポリペプチドと共移動する（co
migrate ）ことを示す。
【００５７】Ｌ粒子は、Ｈ粒子に存在しないか、あるい
は極めて少量存在する少くとも３つの別のポリペプチド
（１７５Ｋ，９２Ｋ及び５５Ｋ）を含有した。これらは
多分外皮又は膜関連蛋白質である。１７５Ｋ燐蛋白質は
前初期（immediate early ）調節蛋白質Ｖmw１７５であ
ることが判明している。Ｈ粒子の独特ポリペプチドの中
の２つ（１５５Ｋ及び３７Ｋ）のみがカプシドの成分で
あることは現在公知である。
は極めて少量存在する少くとも３つの別のポリペプチド
（１７５Ｋ，９２Ｋ及び５５Ｋ）を含有した。これらは
多分外皮又は膜関連蛋白質である。１７５Ｋ燐蛋白質は
前初期（immediate early ）調節蛋白質Ｖmw１７５であ
ることが判明している。Ｈ粒子の独特ポリペプチドの中
の２つ（１５５Ｋ及び３７Ｋ）のみがカプシドの成分で
あることは現在公知である。
【００５８】燐蛋白質 粒子を［32Ｐ］オルト燐酸塩を用いて標識化し、ＰＡＧ
Ｅにより解析した。
Ｅにより解析した。
【００５９】１０％ゲルを使用して、ポリペプチド２７
３Ｋ，８２／８１Ｋ，６５Ｋ及び４０Ｋは両方の型の粒
子調製物で燐酸化されることが判明した。更に、Ｌ粒子
の３つのポリペプチド（１７５Ｋ，９２Ｋ二重バンド及
び５５Ｋ）も燐酸化された。これらの粒子は１３４Ｋお
よび６０Ｋの２つの燐酸化ポリペプチドをも含有した。
痕跡量のこれら２つのホスホポリペプチドもＨ粒子の調
製物中に認められた。
３Ｋ，８２／８１Ｋ，６５Ｋ及び４０Ｋは両方の型の粒
子調製物で燐酸化されることが判明した。更に、Ｌ粒子
の３つのポリペプチド（１７５Ｋ，９２Ｋ二重バンド及
び５５Ｋ）も燐酸化された。これらの粒子は１３４Ｋお
よび６０Ｋの２つの燐酸化ポリペプチドをも含有した。
痕跡量のこれら２つのホスホポリペプチドもＨ粒子の調
製物中に認められた。
【００６０】補助的な説明、写真等は対応する文献Szil
agyi及びCunningham（1991年）中に得られる。
agyi及びCunningham（1991年）中に得られる。
【００６１】知る限りでは、これが前記定義の意味の軽
粒子の最初の記載である。Irmiere及びGibson（1983
年）は、サイトメガロウィルスのヒトの株を用いて感染
させた組織培養細胞の培養基から軽い非感染性のエンベ
ロープのある粒子を回収したけれども、この粒子はウイ
ルスＤＮＡを欠くが、カプシド構造を有するため、それ
はＨＳＶ−１のＬ粒子とは異なる。Ｌ−粒子はカプシド
もコアも有しない。
粒子の最初の記載である。Irmiere及びGibson（1983
年）は、サイトメガロウィルスのヒトの株を用いて感染
させた組織培養細胞の培養基から軽い非感染性のエンベ
ロープのある粒子を回収したけれども、この粒子はウイ
ルスＤＮＡを欠くが、カプシド構造を有するため、それ
はＨＳＶ−１のＬ粒子とは異なる。Ｌ−粒子はカプシド
もコアも有しない。
【００６２】実施例２ 本実施例は突然変異体ウイルスから、感染性ビリオンの
著大な産生を伴うことなく、Ｌ−粒子をつくる方法を示
す。
著大な産生を伴うことなく、Ｌ−粒子をつくる方法を示
す。
【００６３】方 法 ｔｓ １２０１と称する単純性疱疹ウイルスタイプ１の
温度感受性突然変異体の調製 突然変異体１７ｔｓＪＣ１１６を、Coates（1982年）に
よるＨＳＶ−１株１７のＵＶ−変異誘発に従って単離し
た。この突然変異体由来のＤＮＡのクローンからのＥｃ
ｏＲＩ Ｆ断片をＨＳＶ−１株１７野生型（ＷＴ）ウイ
ルスに組換えて突然変異体ｔｓ １２０１を産生した
（Preston ら、1983年）。
温度感受性突然変異体の調製 突然変異体１７ｔｓＪＣ１１６を、Coates（1982年）に
よるＨＳＶ−１株１７のＵＶ−変異誘発に従って単離し
た。この突然変異体由来のＤＮＡのクローンからのＥｃ
ｏＲＩ Ｆ断片をＨＳＶ−１株１７野生型（ＷＴ）ウイ
ルスに組換えて突然変異体ｔｓ １２０１を産生した
（Preston ら、1983年）。
【００６４】突然変異の同定 ｔｓ １２０１突然変異を含有するＢａｍＨＩ／Ｓａｌ
Ｉ断片の配列を決めて、野生型ＤＮＡ配列からの単一塩
基対変化を同定した。変化は McGeochら、（１９８８
年）の配列上の位置50897 におけるＡ残基からＴ残基へ
のものである。この変化によりＵＬ２６蛋白質（Al−Ko
baisi ，1989年）のアミノ酸配列中、フェニルアラニン
によるチロシンの置換を生じた。
Ｉ断片の配列を決めて、野生型ＤＮＡ配列からの単一塩
基対変化を同定した。変化は McGeochら、（１９８８
年）の配列上の位置50897 におけるＡ残基からＴ残基へ
のものである。この変化によりＵＬ２６蛋白質（Al−Ko
baisi ，1989年）のアミノ酸配列中、フェニルアラニン
によるチロシンの置換を生じた。
【００６５】ｔｓ １２０１の特許寄託 この突然変異は必要なゲノム変化を起して、カプシド形
成を防止し、こうしてＬ−粒子を発生するのに充分であ
ると思われ、従ってこのＨＳＶ−１の突然変異体のＬ粒
子を組換えＤＮＡ手段により産生できると思われるが、
本発明を更に一層容易に実施できることを確実にするた
めの措置としてｔｓ １２０１を寄託した。寄託は特許
手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト
条約に従ったEuropean Collection of Animal Cell Cul
ture, PHLS Centre for AppliedMicrobiology and Rese
arch, Porton Down, Salistury, Wiltshire SP4 OJG，
英国への１９９１年６月２０日付受託番号第Ｖ91062004
号のものである。
成を防止し、こうしてＬ−粒子を発生するのに充分であ
ると思われ、従ってこのＨＳＶ−１の突然変異体のＬ粒
子を組換えＤＮＡ手段により産生できると思われるが、
本発明を更に一層容易に実施できることを確実にするた
めの措置としてｔｓ １２０１を寄託した。寄託は特許
手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト
条約に従ったEuropean Collection of Animal Cell Cul
ture, PHLS Centre for AppliedMicrobiology and Rese
arch, Porton Down, Salistury, Wiltshire SP4 OJG，
英国への１９９１年６月２０日付受託番号第Ｖ91062004
号のものである。
【００６６】細胞及びウイルス ＢＨＫ Ｃ１３細胞は前記のようにして増殖させた（Ri
xon 及びMcLanchlan、１９９０年）。ＨＳＶ−１株１７
及びｔｓ １２０１のストックを、１／３００ｐｆｕ／
細胞の感染多重度で１０本の回転瓶の細胞を感染させて
得た。３１℃で４日間の感染に続いて、ウイルスの収穫
を行い前記実施例１中に前記したようにして５〜１５％
Ｆｉｃｏｌｌ勾配で精製した。バンドを側面に孔をあけ
て収集し、フェノールレッドを含まないイーグル培地を
用いて希釈し、Sorvall Tst41 ローターにより21,000 r
pmで４℃で２時間遠心しペレット化した。ペレットはフ
ェノールレッドを含まないイーグル培地に再懸濁して、
−７０℃で貯蔵した。
xon 及びMcLanchlan、１９９０年）。ＨＳＶ−１株１７
及びｔｓ １２０１のストックを、１／３００ｐｆｕ／
細胞の感染多重度で１０本の回転瓶の細胞を感染させて
得た。３１℃で４日間の感染に続いて、ウイルスの収穫
を行い前記実施例１中に前記したようにして５〜１５％
Ｆｉｃｏｌｌ勾配で精製した。バンドを側面に孔をあけ
て収集し、フェノールレッドを含まないイーグル培地を
用いて希釈し、Sorvall Tst41 ローターにより21,000 r
pmで４℃で２時間遠心しペレット化した。ペレットはフ
ェノールレッドを含まないイーグル培地に再懸濁して、
−７０℃で貯蔵した。
【００６７】電子顕微鏡検査 電子顕微鏡検査に使用される細胞は１３mmガラススライ
ドを有する３０mmペトリ皿で増殖させた。感染後適宜の
時間に、燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて細胞を
洗浄し、ＰＢＳ中の２．５％グルタルアルデヒド溶液を
用いて４℃で１時間固定した。次いで細胞をＰＢＳ中で
洗浄し、四酸化オスミウム（ＰＢＳ中１％）を１時間で
添加した。
ドを有する３０mmペトリ皿で増殖させた。感染後適宜の
時間に、燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて細胞を
洗浄し、ＰＢＳ中の２．５％グルタルアルデヒド溶液を
用いて４℃で１時間固定した。次いで細胞をＰＢＳ中で
洗浄し、四酸化オスミウム（ＰＢＳ中１％）を１時間で
添加した。
【００６８】レプリカ形成 カバースライドを２４ウェル組織培養トレーにはずし、
勾配をもつアルコール系列を介して脱水し、臨界点乾燥
器中で乾燥した。カバースライドはBalzors シャドウイ
ングユニットで７５℃の角度に７秒間Ｐｔ／Ｐｄを用い
て影つけし、次いで炭素を用いてロータリシャドウイン
グして追加の支持体を提供した。影つけした表面に酢酸
アミル中の０．２５％ parlodin 溶液を５０μｌのせ、
乾燥させた。各々のカバースリップを半分に割り、影つ
けした表面を大体２mm正方形に切り目を入れた。レプリ
カを取出すため、カバースライドを溶解するまで弗化水
素酸に浮かせた。正方形のレプリカを白金線ループ上に
拾いあげて蒸留水で洗浄した。レプリカを６６％クロム
酸上に１時間浮べることにより細胞材料を除去した。清
浄レプリカを水で３回洗浄し、それから４００メッシュ
の銅の顕微鏡グリッドにつけて乾燥した。乾燥の場合、
parlodin 支持体フィルムはグリッドを酢酸アミル中に
浸漬して除去し、レプリカはＪＥＯＬ１００Ｓ電子顕微
鏡で検鏡した。
勾配をもつアルコール系列を介して脱水し、臨界点乾燥
器中で乾燥した。カバースライドはBalzors シャドウイ
ングユニットで７５℃の角度に７秒間Ｐｔ／Ｐｄを用い
て影つけし、次いで炭素を用いてロータリシャドウイン
グして追加の支持体を提供した。影つけした表面に酢酸
アミル中の０．２５％ parlodin 溶液を５０μｌのせ、
乾燥させた。各々のカバースリップを半分に割り、影つ
けした表面を大体２mm正方形に切り目を入れた。レプリ
カを取出すため、カバースライドを溶解するまで弗化水
素酸に浮かせた。正方形のレプリカを白金線ループ上に
拾いあげて蒸留水で洗浄した。レプリカを６６％クロム
酸上に１時間浮べることにより細胞材料を除去した。清
浄レプリカを水で３回洗浄し、それから４００メッシュ
の銅の顕微鏡グリッドにつけて乾燥した。乾燥の場合、
parlodin 支持体フィルムはグリッドを酢酸アミル中に
浸漬して除去し、レプリカはＪＥＯＬ１００Ｓ電子顕微
鏡で検鏡した。
【００６９】薄切片作製 ３０mmペトリ皿のおのおのに残存する細胞を収穫し、 P
restonら（1983年）に記載されたように、ＢＥＥＭカプ
セルにペレット化して、脱水し、Epon 812レジンに包埋
した。厚さ１３０nmの切片を切り出して酢酸ウラニル及
びクエン酸鉛を用いて染色した。
restonら（1983年）に記載されたように、ＢＥＥＭカプ
セルにペレット化して、脱水し、Epon 812レジンに包埋
した。厚さ１３０nmの切片を切り出して酢酸ウラニル及
びクエン酸鉛を用いて染色した。
【００７０】ポリアクリルアミドゲル電気泳動 Laemmli （1970年）の記載した緩衝系を使用し、５％
Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドを用いて橋かけ
した５〜１２％勾配ポリアクリルアミドゲル上で蛋白質
を分離した。McLeanら（1990年）の記載したようにして
銀染色により蛋白質を目に見えるようにした。
Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドを用いて橋かけ
した５〜１２％勾配ポリアクリルアミドゲル上で蛋白質
を分離した。McLeanら（1990年）の記載したようにして
銀染色により蛋白質を目に見えるようにした。
【００７１】結 果 突然変異体感染細胞中のＬ−粒子の外観 生産的及び非生産的の感染の条件下でビリオン様粒子の
産生を検査するため、細胞の内部及び表面上のそれらの
外観を電子顕微鏡によりモニターした。高度精製ビリオ
ンを、ウイルス接種物中の不純物から生じる可能性のあ
る人為産物を低減するため、次の実験に使用した。３１
℃で増殖した野生型（ＷＴ）とｔｓ １２０１ウイルス
は両方とも、実施例１の方法により勾配上で精製した。
精製ウイルス調製物を３１℃（許容温度）及び３８．５
℃（非許容温度）で力価測定し、それらの粒子数／ｐｆ
ｕ比は３１℃で同じオーダーであると測定された。ｔｓ
１２０１ビリオンストックの力価測定により、ｔｓ １
２０１は使用した条件下で温度感受性であって、１０5
以上の力価の低下をもたらすことを確認した。
産生を検査するため、細胞の内部及び表面上のそれらの
外観を電子顕微鏡によりモニターした。高度精製ビリオ
ンを、ウイルス接種物中の不純物から生じる可能性のあ
る人為産物を低減するため、次の実験に使用した。３１
℃で増殖した野生型（ＷＴ）とｔｓ １２０１ウイルス
は両方とも、実施例１の方法により勾配上で精製した。
精製ウイルス調製物を３１℃（許容温度）及び３８．５
℃（非許容温度）で力価測定し、それらの粒子数／ｐｆ
ｕ比は３１℃で同じオーダーであると測定された。ｔｓ
１２０１ビリオンストックの力価測定により、ｔｓ １
２０１は使用した条件下で温度感受性であって、１０5
以上の力価の低下をもたらすことを確認した。
【００７２】次の実験では、ビリオン様粒子の産生を力
価測定と電気顕微鏡により解析した。これらの異なる方
法から得られる結果を直接比較できるようにするため、
１３mmのガラススライドをおのおの有する３０mmペトリ
皿で細胞を増殖させた。５ｐｆｕ／細胞のＷＴウイルス
又はｔｓ １２０１のどちらかを用いて感染させた後、
細胞を３８．５℃で保温培養した。それぞれの接種物の
１部分を後の力価測定のために保留した（これらが零時
間試料を構成した）。感染後１時間で、投入接種物を除
去し、やはり保留した（これらが１時間試料を構成し
た）。細胞をＥＴＣ１０を用いて洗浄し、保温培養を３
８．５℃で続けた。６，１０及び２４時間目に、上澄み
培地を核プレートから集めて、力価測定のため保留し
た。各時刻の細胞を表面レプリカの形成に使用したが、
皿に残っている細胞は薄切片の調製に使用した。
価測定と電気顕微鏡により解析した。これらの異なる方
法から得られる結果を直接比較できるようにするため、
１３mmのガラススライドをおのおの有する３０mmペトリ
皿で細胞を増殖させた。５ｐｆｕ／細胞のＷＴウイルス
又はｔｓ １２０１のどちらかを用いて感染させた後、
細胞を３８．５℃で保温培養した。それぞれの接種物の
１部分を後の力価測定のために保留した（これらが零時
間試料を構成した）。感染後１時間で、投入接種物を除
去し、やはり保留した（これらが１時間試料を構成し
た）。細胞をＥＴＣ１０を用いて洗浄し、保温培養を３
８．５℃で続けた。６，１０及び２４時間目に、上澄み
培地を核プレートから集めて、力価測定のため保留し
た。各時刻の細胞を表面レプリカの形成に使用したが、
皿に残っている細胞は薄切片の調製に使用した。
【００７３】ａ．ウイルス増殖 予期したように、陰性期中の初期に力価の下落があった
後、ＷＴウイルスは、投入ウイルスより約１０倍高い水
準までウイルス産生の急速な増加を示した。対照的に、
ｔｓ １２０１力価は投入ウイルスの力価より約１００
倍下まで感染時間を通じて下落し、これによりこの実験
に使用したｔｓ １２０１はこの突然変異体に典型な様
子で反応していることが確認された。このことでｔｓ
１２０１感染細胞から得た結果が突然変異体の漏出又は
復帰の結果ではないことが確実になった。
後、ＷＴウイルスは、投入ウイルスより約１０倍高い水
準までウイルス産生の急速な増加を示した。対照的に、
ｔｓ １２０１力価は投入ウイルスの力価より約１００
倍下まで感染時間を通じて下落し、これによりこの実験
に使用したｔｓ １２０１はこの突然変異体に典型な様
子で反応していることが確認された。このことでｔｓ
１２０１感染細胞から得た結果が突然変異体の漏出又は
復帰の結果ではないことが確実になった。
【００７４】ｂ．細胞表面の粒子の外観 ＷＴ−感染細胞から調製したレプリカの検査により、細
胞表面に対する特徴のある系統的変化が明らかになっ
た。１時間目に細胞表面は滑らかであって、模擬感染試
料と比較して感染の証拠は示さなかった。６時間では、
多数の細胞がそれらの表面に少数の直径約２５０nmの粒
子を有し、１０時間では、これらの粒子の多数が大抵の
細胞に蓄積していた。これらの粒子の大きさはビリオン
の大きさと一致していた。２４時間では、細胞は明白に
丸くなって、粒子で緻密に覆われた。細胞表面のこれら
の粒子の分布はしばしば非対称であり、核の区域上及び
細胞の周辺の部位付近での著しい集中が典型的である。
胞表面に対する特徴のある系統的変化が明らかになっ
た。１時間目に細胞表面は滑らかであって、模擬感染試
料と比較して感染の証拠は示さなかった。６時間では、
多数の細胞がそれらの表面に少数の直径約２５０nmの粒
子を有し、１０時間では、これらの粒子の多数が大抵の
細胞に蓄積していた。これらの粒子の大きさはビリオン
の大きさと一致していた。２４時間では、細胞は明白に
丸くなって、粒子で緻密に覆われた。細胞表面のこれら
の粒子の分布はしばしば非対称であり、核の区域上及び
細胞の周辺の部位付近での著しい集中が典型的である。
【００７５】ｔｓ １２０１感染細胞の検査により変化
の様式が極めて類似していることが明らかになった。こ
のようにして感染後１時間に、それらの表面は、恐らく
接種物に由来する偶然見られる粒子の存在のほかには、
模擬感染細胞の表面と区別がつかなかった。６時間で
は、少数の粒子が細胞表面に存在し、それらの数は１０
時間と２４時間には増加していた。粒子の分布と多さと
はＷＴウイルスで認められたのと対等であったが、大き
さでは均一性がやや低かった。
の様式が極めて類似していることが明らかになった。こ
のようにして感染後１時間に、それらの表面は、恐らく
接種物に由来する偶然見られる粒子の存在のほかには、
模擬感染細胞の表面と区別がつかなかった。６時間で
は、少数の粒子が細胞表面に存在し、それらの数は１０
時間と２４時間には増加していた。粒子の分布と多さと
はＷＴウイルスで認められたのと対等であったが、大き
さでは均一性がやや低かった。
【００７６】ｃ．細胞表面上の粒子の性質 感染細胞の表面に存在する粒子の性質を決めるため、各
試料の残部から調製した薄切片について検査した。ビリ
オンとＬ−粒子と考えられる明確なカプシドを欠く粒子
とがＷＴ感染細胞に存在した。同様な粒子は細胞内液胞
中にもビリオンと共に認められた。
試料の残部から調製した薄切片について検査した。ビリ
オンとＬ−粒子と考えられる明確なカプシドを欠く粒子
とがＷＴ感染細胞に存在した。同様な粒子は細胞内液胞
中にもビリオンと共に認められた。
【００７７】ｔｓ １２０１−感染細胞の薄切片はこの
突然変異体に典型的な表現型の証拠となった（Preston
ら、1983年）。こうして、その核は、特徴的に大きい、
ＤＮＡを欠くコアカプシドの集合物を含んだ。ＤＮＡ含
有の充実カプシドは明らかでなく、成熟ビリオンの形跡
は細胞質中、又は細胞表面上のいずれにもなかった。表
面に存在する粒子はカプシドを欠き、外観がＬ−粒子に
酷似していた。同様な型の粒子は細胞質液胞にも見られ
ることが多かった。液胞中への出芽による形成の過程で
Ｌ−粒子を見なし得る特徴も数々見られた。しかしなが
ら、特徴を示すカプシドの欠失のために、これらの特徴
の性質に関しては断定することは不可能であった。
突然変異体に典型的な表現型の証拠となった（Preston
ら、1983年）。こうして、その核は、特徴的に大きい、
ＤＮＡを欠くコアカプシドの集合物を含んだ。ＤＮＡ含
有の充実カプシドは明らかでなく、成熟ビリオンの形跡
は細胞質中、又は細胞表面上のいずれにもなかった。表
面に存在する粒子はカプシドを欠き、外観がＬ−粒子に
酷似していた。同様な型の粒子は細胞質液胞にも見られ
ることが多かった。液胞中への出芽による形成の過程で
Ｌ−粒子を見なし得る特徴も数々見られた。しかしなが
ら、特徴を示すカプシドの欠失のために、これらの特徴
の性質に関しては断定することは不可能であった。
【００７８】ｔｓ １２０１−感染細胞から放出される
粒子の蛋白質組成 非許容温度でｔｓ １２０１により産生される粒子が典
型的Ｌ−粒子かどうか確認するために、回転瓶５本の細
胞を勾配精製したｔｓ １２０１及びＷＴウイルスを用
いて感染させた。３８．５℃で２４時間保温培養した
後、上澄培地中に存在する微粒状物質をペレット化に
し、再懸濁して、実施例１の記載に従って５〜１５％ F
icoll 勾配上のバンドにした。図面の図１では、写真は
勾配上で分離したペレット化微粒状物のバンドを示し、
バンドＬは軽粒子に、Ｖはビリオンに帰せられる。管Ａ
は野生型を、Ｂは突然変異体を含有する。ＷＴウイルス
調製物を含有する勾配（図１Ａ）は実施例１の記載に対
応する２つのバンドを有する。即ち、ビリオンの尖鋭な
下方バンドとＬ−粒子の散漫な上方バンドである。対照
的に、ビリオンバンドはｔｓ １２０１勾配（図１Ｂ）
では認めることができなかった。しかし、存在する散漫
なバンドは、ＷＴウイルス調製物に存在するＬ−粒子バ
ンドと共移動（co-migrate）し、強度が同様であった。
収集してネガティブ染色により検査した場合、このバン
ドは、典型的Ｌ−粒子と同一に見える物質を含有するこ
とが判明した。
粒子の蛋白質組成 非許容温度でｔｓ １２０１により産生される粒子が典
型的Ｌ−粒子かどうか確認するために、回転瓶５本の細
胞を勾配精製したｔｓ １２０１及びＷＴウイルスを用
いて感染させた。３８．５℃で２４時間保温培養した
後、上澄培地中に存在する微粒状物質をペレット化に
し、再懸濁して、実施例１の記載に従って５〜１５％ F
icoll 勾配上のバンドにした。図面の図１では、写真は
勾配上で分離したペレット化微粒状物のバンドを示し、
バンドＬは軽粒子に、Ｖはビリオンに帰せられる。管Ａ
は野生型を、Ｂは突然変異体を含有する。ＷＴウイルス
調製物を含有する勾配（図１Ａ）は実施例１の記載に対
応する２つのバンドを有する。即ち、ビリオンの尖鋭な
下方バンドとＬ−粒子の散漫な上方バンドである。対照
的に、ビリオンバンドはｔｓ １２０１勾配（図１Ｂ）
では認めることができなかった。しかし、存在する散漫
なバンドは、ＷＴウイルス調製物に存在するＬ−粒子バ
ンドと共移動（co-migrate）し、強度が同様であった。
収集してネガティブ染色により検査した場合、このバン
ドは、典型的Ｌ−粒子と同一に見える物質を含有するこ
とが判明した。
【００７９】ＰＡＧＥによる勾配バンドにした物質のポ
リペプチド組成の解析は、この割当てを裏づけした。図
面の図２では、レーン１及び２はそれぞれ、ＷＴウイル
スに由来するビリオン及びＬ−粒子のポリペプチドプロ
フィールを示し、レーン３は非許容温度でｔｓ １２０
１により産生される粒子の組成を示す。ＨＳＶがコード
する蛋白質Ｖmw１７５（Ｌ−粒子の特徴を示す）並びに
Ｖmw３７及び１５５（ビリオンの特徴を示す）に対する
バンドの位置が示されている。（Ｖmw数は相対分子質量
をkiloDaltonで示す）。ＷＴビリオン及びＬ−粒子の組
成は前記のパターン（実施例１）と合致した。こうし
て、ビリオンに多量にあるＶmw１５５（Mr155000）及び
Ｖmw３７（Mr 37000）のカプシド蛋白質はＬ−粒子では
大いに減少し、Ｖmw１７５はＬ−粒子でのみ明らかであ
った。ｔｓ １２０１バンドの蛋白質プロフィールはＷ
Ｔ Ｌ−粒子のそれと実際的に区別がつかず、特徴を示
すＶmw１７５バンドは明らかに目に見えた（図２、レー
ン３）。このバンドの感染性ビリオンでの水準が非常に
低いにも拘らず、Ｖmw１５５（Mr 155000 ）カプシド蛋
白質はＷＴ Ｌ粒子に見出される量と同様な量で存在し
ていたことは興味深い。
リペプチド組成の解析は、この割当てを裏づけした。図
面の図２では、レーン１及び２はそれぞれ、ＷＴウイル
スに由来するビリオン及びＬ−粒子のポリペプチドプロ
フィールを示し、レーン３は非許容温度でｔｓ １２０
１により産生される粒子の組成を示す。ＨＳＶがコード
する蛋白質Ｖmw１７５（Ｌ−粒子の特徴を示す）並びに
Ｖmw３７及び１５５（ビリオンの特徴を示す）に対する
バンドの位置が示されている。（Ｖmw数は相対分子質量
をkiloDaltonで示す）。ＷＴビリオン及びＬ−粒子の組
成は前記のパターン（実施例１）と合致した。こうし
て、ビリオンに多量にあるＶmw１５５（Mr155000）及び
Ｖmw３７（Mr 37000）のカプシド蛋白質はＬ−粒子では
大いに減少し、Ｖmw１７５はＬ−粒子でのみ明らかであ
った。ｔｓ １２０１バンドの蛋白質プロフィールはＷ
Ｔ Ｌ−粒子のそれと実際的に区別がつかず、特徴を示
すＶmw１７５バンドは明らかに目に見えた（図２、レー
ン３）。このバンドの感染性ビリオンでの水準が非常に
低いにも拘らず、Ｖmw１５５（Mr 155000 ）カプシド蛋
白質はＷＴ Ｌ粒子に見出される量と同様な量で存在し
ていたことは興味深い。
【００８０】ｔｓ １２０１感染細胞によりビリオンは
低水準で産生されるけれども、感染性ビリオンができな
い条件下にＬ−粒子を産生できることを本発明者が立証
したことは、ワクチン用途に適当な材料を調製する方法
を示唆する。
低水準で産生されるけれども、感染性ビリオンができな
い条件下にＬ−粒子を産生できることを本発明者が立証
したことは、ワクチン用途に適当な材料を調製する方法
を示唆する。
【００８１】参 考 文 献 ADDISON, C., RIXON, F. J. and PRESTON, V. G. (199
0). Herpes simplex virus type 1 UL28 gene product
is important for the formation of mature capsids.
J. Gen. Virol. 71, 2377-2384. AL-KOBAISI, M. F. (1989). Identification and chara
cterisation of herpes simplex virus genes required
for encapsidation of DNA. PhD thesis, Glasgow Uni
versity. AL-KOBAISI, M. F., RIXON, F. J., McDOUGALL, I. and
PRESTON, V. G. (1991). The herpes simplex virus U
L33 gene product is required for assemblyof full c
apsids. Virology 180, 380-388. BROWN, S. M., RITCHIE, D. A. and SUBAK-SHARPE, J.
H. (1973). Genetic studies with herpes simplex vir
us type 1. The isolation of temperature-sensitive
mutants, their arrangement into complementation gr
oups and recombination analysis leading to a linka
ge map. J. Gen. Virol.18, 329-346. COATES, J. A. V. (1982). Genetic and biochemical s
tudies with temperature-sensitive mutants of herpe
s simplex virus type 1. PhD thesis, Glasgow Univer
sity. DARGAN, D. J. (1986). The structure and assembly o
f herpesviruses. InElectron Microscopy of Protein
s, vol.5, Virus Structure, pp.359-437. Edited by
J. R. Harris and R. W. Horne. London: Academic Pre
ss. EJERCITO, P. M., KIEFF, E. D. and ROIZMAN, B. (196
8). Characterisationof herpes simplex virus strain
s differing in their effect on social behaviour o
f infected cells. J. Gen. Virol. 2, 357-364. IRMIERE, A. and GIBSON, W. (1983). Isolation and c
haracterisation of anon-infectious virion-like par
ticle released from cells infected with human stra
ins of cytomegalovirus. Virology 130, 118-133. KAPLAN, A. S. and VATTER, A. E. (1959). A comparis
on of herpes simplexand pseudorabies viruses. Viro
logy 7, 394-407. LAEMMLI, U. K. (1970). Cleavage of structural prot
eins during the assembly of the head of bacterioph
age T4. Nature, London 227, 680-685. LOWRY, O. H., ROSEBROUGH, N. J., FARR, A. L. and R
ANDALL, R. J., (1951). Protein measurement with th
e Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-27
5. MATZ, B., SUBAK-SHARPE, J. H. and PRESTON, V. G.
(1983). Physical mapping of temperature-sensitive
mutations of herpes simplex virus type 1 using clo
ned restriction endonuclease fragments. J. Gen. Vi
rol. 64, 2261-2270. MCGEOCH, D. J., DALRYMPLE, M.A., DAVISON, A, J., D
OLAN, A., FRAME, M.C., MCNAB, D. PERRY, L. J., SCO
TT, J. E., and TAYLOR, P. (1988). The complete DNA
sequence of the long unique region in the genome
of herpes simplex virus 1. J. Gen. Virol.69, 1531-
1574. McLEAN, G., RIXON, F. J., LANGELAND, N., HAARR,
L., and MARSDEN, H. (1990). Identification and cha
racterisation of the virion protein productsof her
pes simplex virus type 1 gene UL47. J. Gen. Viro
l.,71, 2953-2960. ONGRADI, J., CUNNINGHAM, C. and SZILAGYI, J. F. (1
985). The role of polypeptides L and NS in the tra
nscription process of vesicular stomatitusvirus Ne
w Jersey using the temperature-sensitive mutant ts
E1. J. Gen. Virol. 66, 1011-1023. PERTUISET, B., BOCCARA, M., CEBRIAN, J., BERTHELO
T, N., CHOUSTERMAN, S., PUVION-DUTILLEUL, F., SISM
AN, J. and SHELDRICK, P. (1989). Physical mapping
and nucleotide sequence of a herpes simplex virus
type 1 gene required for capsid assembly. J. Viro
l. 63, 2169-2179. PRESTON, V. G., COATES, J. A. V., and RIXON, F. J.
(1983). Identification and characterisation of a
herpes simplex virus gene product requiredfor enca
pisication of virus DNA. J. Virol.45, 1056-1064. PRESTON, V. G., RIXON, F. J., McDOUGALL, I. M., Mc
GREGOR, M. and AL KOBAISI, M. F. (1991, in press).
Processing of ICP 35 by UL26 gene product（課題、
提出原稿）．本論文の写しは英国特許出願第9109763.4
号の明細書の付録として提供されており、Mr. R. K. Pe
rcy, BTG Patent Services, 101 Newington Causeway,
London, SE1 6BU から請求により入手可能． RIXON, F. J., DAVISON, M. D. and DAVISON, A. J. (1
990). Identificationof the genes encoding two caps
id proteins of herpes simplex virus type1 by direc
t amino acid sequencing. J. Gen. Virol. 71, 1211-1
214. SZILAGYI, J. F. and CUNNINGHAM, C. (1991). Identif
ication and characterisation of a novel non-infect
ious herpes simplex virus-related particle. J. Ge
n. Virol, 72, 661-668. 刊行日：１９９１年３月１
日． WELLER, S. K., CARMICHAEL, E. P., ASCHMAN, D. P.,
GOLDSTEIN, D. J. andSCHAFFER, P. A. (1987). Geneti
c and phenotypic characterisation of mutants in fo
ur essential genes that map to the left half of HS
V-1 UL DNA.Virology 161, 198-210. WELLER, S. K., SEGHATOLESLAMI, M. R., SHAO, L., RO
WSE, D. and CARMICHAEL, E. P. (1990). The herpes s
implex virus type 1 alkaline nuclease is not essen
tial for viral DNA synthesis: isolation and charac
terisation ofa lacZ insertion mutant. J. Gen. Viro
l. 71, 2941-2952.
0). Herpes simplex virus type 1 UL28 gene product
is important for the formation of mature capsids.
J. Gen. Virol. 71, 2377-2384. AL-KOBAISI, M. F. (1989). Identification and chara
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for encapsidation of DNA. PhD thesis, Glasgow Uni
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985). The role of polypeptides L and NS in the tra
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E1. J. Gen. Virol. 66, 1011-1023. PERTUISET, B., BOCCARA, M., CEBRIAN, J., BERTHELO
T, N., CHOUSTERMAN, S., PUVION-DUTILLEUL, F., SISM
AN, J. and SHELDRICK, P. (1989). Physical mapping
and nucleotide sequence of a herpes simplex virus
type 1 gene required for capsid assembly. J. Viro
l. 63, 2169-2179. PRESTON, V. G., COATES, J. A. V., and RIXON, F. J.
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herpes simplex virus gene product requiredfor enca
pisication of virus DNA. J. Virol.45, 1056-1064. PRESTON, V. G., RIXON, F. J., McDOUGALL, I. M., Mc
GREGOR, M. and AL KOBAISI, M. F. (1991, in press).
Processing of ICP 35 by UL26 gene product（課題、
提出原稿）．本論文の写しは英国特許出願第9109763.4
号の明細書の付録として提供されており、Mr. R. K. Pe
rcy, BTG Patent Services, 101 Newington Causeway,
London, SE1 6BU から請求により入手可能． RIXON, F. J., DAVISON, M. D. and DAVISON, A. J. (1
990). Identificationof the genes encoding two caps
id proteins of herpes simplex virus type1 by direc
t amino acid sequencing. J. Gen. Virol. 71, 1211-1
214. SZILAGYI, J. F. and CUNNINGHAM, C. (1991). Identif
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n. Virol, 72, 661-668. 刊行日：１９９１年３月１
日． WELLER, S. K., CARMICHAEL, E. P., ASCHMAN, D. P.,
GOLDSTEIN, D. J. andSCHAFFER, P. A. (1987). Geneti
c and phenotypic characterisation of mutants in fo
ur essential genes that map to the left half of HS
V-1 UL DNA.Virology 161, 198-210. WELLER, S. K., SEGHATOLESLAMI, M. R., SHAO, L., RO
WSE, D. and CARMICHAEL, E. P. (1990). The herpes s
implex virus type 1 alkaline nuclease is not essen
tial for viral DNA synthesis: isolation and charac
terisation ofa lacZ insertion mutant. J. Gen. Viro
l. 71, 2941-2952.
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、野生型（Ａ）と突然変異体ｔｓ１２０
１（Ｂ）に関する勾配上で分離したウイルス粒子を示す
写真である。
１（Ｂ）に関する勾配上で分離したウイルス粒子を示す
写真である。
【図２】図２は、勾配分離したウイルス粒子からＰＡＧ
Ｅにより得られるポリペプチドバンドを示す銀染色ポリ
アクリルアミドゲルの写真である。
Ｅにより得られるポリペプチドバンドを示す銀染色ポリ
アクリルアミドゲルの写真である。
Ａ 野生型の勾配 Ｂ 突然変異体（ｔｓ １２０１）の勾配 Ｌ Ｌ−粒子のバンド Ｖ ビリオンのバンド １ ビリオンのレーン ２ Ｌ−粒子のレーン ３ ｔｓ １２０１の産生する粒子のレーン
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１１月１９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、野生型（Ａ）と突然異変体ｔｓ１２０
１（Ｂ）に関する勾配上で分離したウイルスの粒子構造
を示す写真である。
１（Ｂ）に関する勾配上で分離したウイルスの粒子構造
を示す写真である。
【図２】図２は、勾配分離したウイルス粒子からＰＡＧ
Ｅにより得られるポリペプチドバンドを示す銀染色ポリ
アクリルアミドゲルの電気泳動の写真である。
Ｅにより得られるポリペプチドバンドを示す銀染色ポリ
アクリルアミドゲルの電気泳動の写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 7/01 (72)発明者 ジヨン・マクロウクラン イギリス国、スコツトランド、グラスゴ ー・ジー・64・１・エイチ・エイ、ビシヨ ツプブリツグズ、カトリン・アベニユー・ 42 (72)発明者 フレイザー・ジヨン・リクソン イギリス国、スコツトランド、スターリン グシヤー・ジー・63・９・イー・ビー、ス トラスブレイン、エデンキルン・プレイ ス・15 (72)発明者 ジヨーゼフ・フエレンク・シーラギー イギリス国、スコツトランド、グラスゴ ー・ジー・71・７・デイー・ゼツト、ウツ デイングストン、シープバーン・ロード・ 30
Claims (9)
- 【請求項１】 エンベロープにより囲まれている外皮を
含み、カプシド及びカプシド内のウイルスＤＮＡを欠
く、ウイルス関連であって非感染性のヘルペスウイルス
のＬ−粒子。 - 【請求項２】 ウイルスが単純性疱疹ウイルス（ＨＳ
Ｖ）である請求項１に記載のＬ−粒子。 - 【請求項３】 ウイルスがＨＳＶ−１である請求項１又
は２に記載のＬ−粒子。 - 【請求項４】 ウイルス増殖に対する非許容条件下で、
ウイルスＤＮＡ及び後期蛋白質を生成することができる
が、感染性ビリオンをアセンブルすることができない、
ヘルペスウイルス条件的致死突然変異体の、ヘルペスウ
イルス感染に対するワクチン接種に使用するための請求
項１、２又は３に記載のＬ−粒子。 - 【請求項５】 条件的致死突然変異体が温度感受性突然
変異体であり、ウイルス増殖に対する非許容条件が温度
条件から成る請求項４に記載のＬ−粒子。 - 【請求項６】 ウイルスが、特許手続上の微生物の寄託
の国際的承認に関するブタペスト条約の条項の下にEuro
pean Collection of Animal Cell Cultures,PHLS Centr
e for Applied Microbiology and Research, Porton Do
wn, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Englandに、１９
９１年６月２０日付受託番号第Ｖ91062004号で寄託した
ＨＳＶ−１ ｔｓ １２０１である請求項５に記載のＬ
−粒子。 - 【請求項７】 ウイルスＤＮＡ複製が起り、後期翻訳蛋
白質が産生されて、Ｌ−粒子がアセンブルされかつ蓄積
され得るのに有効な時間、前記非許容条件で請求項４、
５又は６に定義されたヘルペスウイルスを細胞に感染さ
せることから成る請求項１に記載のＬ−粒子を産生する
方法。 - 【請求項８】 ワクチンに使用するための、請求項１〜
６のいずれか一項に記載のＬ−粒子。 - 【請求項９】 免疫刺激剤又はビヒクル及び請求項１〜
６のいずれか一項に記載のＬ−粒子を含むワクチン。
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|---|---|---|---|
| GB919109763A GB9109763D0 (en) | 1991-05-07 | 1991-05-07 | Herpes virus vaccine |
| GB9109763.4 | 1991-05-07 | ||
| GB919114714A GB9114714D0 (en) | 1991-07-08 | 1991-07-08 | Herpesvirus vaccine |
| GB9114714.0 | 1991-07-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=26298851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3220206A Pending JPH05236967A (ja) | 1991-05-07 | 1991-08-30 | ヘルペスウイルス粒子及びワクチン |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5384122A (ja) |
| JP (1) | JPH05236967A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007141866A (ja) * | 2007-02-26 | 2007-06-07 | Hitachi Ltd | 電子顕微方法及びそれを用いた電子顕微鏡並び生体試料検査方法及び生体検査装置 |
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|---|---|---|---|---|
| GB9401333D0 (en) * | 1994-01-25 | 1994-03-23 | Medical Res Council | Herpes virus pre-(viral dna replication) particles (preps) |
| US5972666A (en) * | 1996-07-26 | 1999-10-26 | G. D. Searle & Co. | Assembly-deficient herpesvirus vaccine |
| CA2291010A1 (en) * | 1997-06-02 | 1998-12-10 | Chiron Corporation | Herpes simplex virus vp22 vaccines and methods of use |
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| TWI526539B (zh) | 2010-12-22 | 2016-03-21 | 苜蓿股份有限公司 | 植物中生產類病毒顆粒(vlp)的方法及以該方法生產之vlp |
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|---|---|---|---|---|
| US4999296A (en) * | 1986-04-29 | 1991-03-12 | Novagene, Inc. | Thymidine kinase negative insertion mutants of pseudorabies virus and methods for the production of same |
-
1991
- 1991-08-30 JP JP3220206A patent/JPH05236967A/ja active Pending
-
1993
- 1993-07-22 US US08/095,041 patent/US5384122A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007141866A (ja) * | 2007-02-26 | 2007-06-07 | Hitachi Ltd | 電子顕微方法及びそれを用いた電子顕微鏡並び生体試料検査方法及び生体検査装置 |
Also Published As
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|---|---|
| US5384122A (en) | 1995-01-24 |
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