TWI579300B

TWI579300B - Synthetic amylospheroid (amylospheroid) manufacturing method

Info

Publication number: TWI579300B
Application number: TW101149355A
Authority: TW
Inventors: Minako Hoshi
Original assignee: Tao Health Life Pharma Co Ltd
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2012-12-22
Publication date: 2017-04-21
Also published as: US20140350229A1; EP2796464B1; JPWO2013094614A1; JP5831859B2; WO2013094614A1; HK1197417A1; EP2796464A1; TW201331222A; US8946327B2; EP2796464A4; CN103827140B; CN103827140A

Description

合成澱粉球蛋白(amylospheroid)之製造方法

本揭示係關於一種合成澱粉球蛋白(amylospheroid)之製造方法。

阿茲海默氏病係經由突觸變性而成熟神經細胞到達死亡的疾病。根據最近之研究，瞭解到阿茲海默氏病之發病具有階段性。作為最初之階段，有主要產生突觸變性之階段。該階段為可逆階段。作為上述可逆階段之下一階段，有產生神經細胞死亡之階段。該階段為不可逆階段，一般認為到達該不可逆階段則阿茲海默氏病發病(非專利文獻1)。

業界一直認為，突觸變性主要係堆積之β澱粉樣蛋白(Aβ)二聚物及十二聚物作用於麩胺酸受體等而引起。但是，Aβ二聚物及十二聚物均不會在體外(in vitro)及體內(in vivo)引起神經細胞死亡(非專利文獻2)。因此，為對人之阿茲海默氏病之病態進行分析，必需弄清楚可逆之突觸變性階段之後的不可逆階段中產生之神經細胞死亡的原因與分子機制。

澱粉球蛋白(ASPD)係對非神經細胞及幼小神經細胞不顯示毒性，而將功能成熟之神經細胞選擇性地致死之獨特之Aβ集合體(非專利文獻1)。澱粉球蛋白最初係以於體外(in vitro)引起神經細胞死亡之直徑約10 nm之球狀Aβ集合體之形式單離出(非專利文獻3)。其後，製作對該合成澱粉球蛋白具有特異性之抗體(專利文獻1及2)，使用該抗體自阿茲海默氏病之病人之腦中單離出於活體內形成之(即，天然之)澱粉球蛋白(非專利文獻3)。根據使用該天然澱粉球蛋白之研究，可明確：i)天然澱粉球蛋白與合成澱粉球蛋白同樣地對成熟神經細胞選擇性地誘導細胞死亡；又，ii)觀察到神經細胞脫落之阿茲海默氏病患者之大腦皮質中的天然澱粉球蛋白量與阿茲海默氏病之嚴重程度相關聯地增加；並且，iii)不怎麼觀察到神經細胞脫落之阿茲海默氏病患者之小腦中僅存在微量之天然澱粉球蛋白(非專利文獻3)。因此，可認為澱粉球蛋白於阿茲海默氏病發病之不可逆階段中發揮重要作用。進而，自路易氏體型癡呆症(Dementia with Lewy Bodies)患者之腦中亦檢測出天然澱粉球蛋白(非專利文獻1)，故而可認為於路易氏體型癡呆症中澱粉球蛋白亦在其發病中發揮重要作用。

再者，揭示出澱粉球蛋白與被視為引起突觸變性之主要原因的Aβ二聚物及十二聚物均為Aβ集合體，但係以不同之路徑由Aβ單體形成。即，Aβ二聚物及十二聚物係經由Aβ二聚物而形成，相對於此，澱粉球蛋白係由Aβ三聚物所形成(非專利文獻4)。

先前技術文獻 專利文獻

專利文獻1：WO2006/016644

專利文獻2：WO2009/057664

非專利文獻

非專利文獻1：Noguchi et al. J. Biol. Chem. vol. 284 no. 47, 32895-32905 (2009)

非專利文獻2：Shankar et al. Nature Medicine 14, 837-842 (2008)

非專利文獻3：Hoshi et al. Pro. Natl. Acad. Sci. U. S. A. vol. 100, no. 11, 6370-6375 (2003)

非專利文獻4：Matsumura et al. J. Biol. Chem. vol. 286 no. 13, 11555-11562 (2011)

如上所述，澱粉球蛋白於阿茲海默氏病或路易氏體型癡呆症中發揮重要作用。然而，自患者腦中純化出天然澱粉球蛋白併用於治療藥等之開發非常困難。因此，可認為若與患者腦中所存在之天然澱粉球蛋白等效的合成澱粉球蛋白可於體外(in vitro)更容易製造，則會大大有助於阿茲海默氏病或路易氏體型癡呆症之研究、以及針對於該等疾病之預防方法及預防藥以及治療方法及預防/治療藥之開發。例如，開發以合成澱粉球蛋白本身作為抗原之主動疫苗療法、或深入至神經細胞死亡之分子機制而開發阻止神經細胞死亡之藥物變得容易。又，由於目前人腦中形成凝聚體之機制尚不明確，因此可使用合成澱粉球蛋白之形成作為模型體系而開發阻止澱粉球蛋白形成之預防藥。

因此，本揭示提供一種效率提高的合成澱粉球蛋白之製造方法。

本揭示於一態樣中係關於一種合成澱粉球蛋白之製造方法，其包括於塑化劑之存在下對含有澱粉樣蛋白β肽(amyloid β peptide)之液體進行攪拌之步驟(以下，亦稱為「本揭示之製造方法」)。

根據本揭示之製造方法，可提高合成澱粉球蛋白之製造效率。

本揭示係基於如下見解：於藉由對含有澱粉樣蛋白β肽之液體進行攪拌而形成合成澱粉球蛋白之情形時，若使塑化劑存在於上述溶液中，則形成效率顯著提高。換言之，本揭示係基於如下見解：藉由在塑化劑之存在下進行非專利文獻1及3中所記載之先前之合成ASPD之製造方法中的攪拌，合成澱粉球蛋白之形成效率顯著提高。

藉由上述塑化劑之存在而合成澱粉球蛋白之形成效率提高的詳細機制尚不明確，但推測如下。澱粉樣蛋白β通常於單體形態下較穩定(Grant MA et al.PNAS 104,16522-16527,2007)。並且，已知於澱粉樣蛋白β形成纖維之情形時首先形成澱粉樣蛋白β之二聚物，又，於澱粉樣蛋白β形成澱粉球蛋白之情形時首先形成澱粉樣蛋白β之三聚物(Matsumura et al JBC2011，非專利文獻4)。進而，已知與纖維形成不同，關於澱粉球蛋白形成，於生理溶劑環境下在磷酸等具有特定之部分結構之溶質存在下其形成受到促進(Hoshira學會發表資料)。因此，可認為塑化劑係藉由與澱粉樣蛋白β單體相互作用而發揮促進三聚物形成之效果，尤其是促進澱粉球蛋白形成。但是，本揭示亦可不限定於該機制而進行解釋。再者，於本說明書中，「合成澱粉球蛋白之形成效率」例如可設為所製造之合成澱粉球蛋白中所含之澱粉樣蛋白β肽量相對於所使用之澱粉樣蛋白β肽量的比率(形成合成ASPD之Aβ量/原料之Aβ量)。上述比率可為重量比，亦可為莫耳比。

[澱粉球蛋白]

於本說明書中，所謂澱粉球蛋白(以下，亦稱為「ASPD」)，係指可對功能成熟之神經細胞選擇性地誘導細胞死亡之Aβ集合體。ASPD包含「合成ASPD」及「天然ASPD」。所謂合成ASPD(合成澱粉球蛋白)，係指可使用合成Aβ於體外(in vitro)調製及單離且於電子顯微鏡觀察時為直徑約10~15 nm之球狀體的ASPD(非專利文獻3)。又，所謂天然ASPD，係指可自人活體內(尤其是阿茲海默氏病及/或路易氏體型癡呆症患者之腦)單離的ASPD(非專利文獻1)。合成ASPD及天然ASPD均對成熟人神經細胞誘導細胞死亡。亦製作出可識別出ASPD之特異之立體結構的抗ASPD抗體(單株抗體及多株抗體)(例如，專利文獻1及2中所揭示之haASD1、haASD2、mASD3等)。根據抗ASPD單株抗體之特性分析或ASPD之NMR(nuclear magnetic resonance，核磁共振)分析之結果，可知ASPD具有與迄今所報告之其他Aβ集合體不同之獨特之立體結構(例如，非專利文獻1之Supplemental Table S1)。因此，於本說明書中，ASPD亦可稱為與專利文獻1及2中所揭示之對ASPD具有特異性之抗ASPD抗體反應，可對功能成熟之神經細胞選擇性地誘導細胞死亡之Aβ集合體。

[澱粉樣蛋白β肽]

於本說明書中，所謂「澱粉樣蛋白β肽」，係指藉由將澱粉樣蛋白前驅蛋白質(APP，amyloid precursor protein)切割成α-、β-、γ-分泌酶而切取之肽，亦記為「β澱粉樣蛋白」、「Aβ」或「Aβ肽」。又，於本說明書中，Aβ可包含根據其胺基酸序列之長度而稱為Aβ_1-39、Aβ_1-40、Aβ_1-41、Aβ_1-42、及Aβ_1-43者。於本說明書中，Aβ可為人型(存在於人之序列)，亦可為非人型(存在於人以外之動物之序列)。又，於本說明書中，Aβ可包含活體內之(天然之)Aβ、及合成之Aβ。合成Aβ並無特別限定，可利用公知之肽合成法(例如，Fmoc法或Boc法)合成，例如可利用公知之肽合成機而製造。人型之Aβ_1-42(亦稱為「Aβ42」)係包含胺基酸序列(自N末端起)：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(序列編號1)所表示之胺基酸序列的肽。又，人型之Aβ_1-41(Aβ41)、Aβ_1-40(Aβ40)、及Aβ_1-39(Aβ39)係包含自序列編號1之胺基酸序列之C末端起分別缺失A、IA、及VIA之胺基酸序列的肽。進而，人型之Aβ_1-43(Aβ43)係包含序列編號1之胺基酸序列之C末端上附加有1個蘇胺酸殘基(T/Thr)之胺基酸序列的肽。

[塑化劑]

於本說明書中，「塑化劑」並無特別限定，可列舉公知者。作為本揭示之製造方法中所使用之塑化劑，就提高合成ASPD之形成效率之觀點而言，例如較佳為鄰苯二甲酸二正辛酯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己酯)(DEHP)、鄰苯二甲酸二苄酯、鄰苯二甲酸二異癸酯等鄰苯二甲酸酯；間苯二甲酸二辛酯等間苯二甲酸酯；己二酸二正丁酯、己二酸二辛酯等己二酸酯；順丁烯二酸二正丁酯等順丁烯二酸酯；乙醯檸檬酸三正丁酯等檸檬酸酯；伊康酸單丁酯等伊康酸酯；油酸丁酯等油酸酯；二乙醯辛酸單甘油酯、二乙醯月桂酸單甘油酯、蓖麻油酸單甘油酯、十甘油單油酸酯等多元醇酯；磷酸三甲苯酯等磷酸酯；聚乙二醇(以下稱為PEG)、PEG二乙酸酯、聚丙二醇(以下稱為PPG)、PEG-PPG-PEG嵌段聚合物、PPG-PEG-PPG嵌段聚合物等聚伸烷基二醇類；三乙二醇單甲醚乳酸低聚物酯等乳酸低聚物酯類；二乙二醇松香酯乙酸酯等松香酸酯類。該等之中，就相同之觀點而言，更佳為鄰苯二甲酸二正辛酯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己酯)、鄰苯二甲酸二苄酯、鄰苯二甲酸二異癸酯等鄰苯二甲酸酯，進而較佳為鄰苯二甲酸二(2-乙基己酯)。

[攪拌]

於本說明書中，所謂「攪拌」，係指對流體施加運動。於本揭示中，「攪拌」較佳為低速及/或緩慢之攪拌，以不妨礙Aβ之集合及/或ASPD之形成。本揭示中之攪拌可藉由使保持含有Aβ之液體之容器運動、例如對上述容器施加旋轉、振盪、搖晃、及該等之組合之運動而進行，或者，亦可藉由在含有Aβ之液體中配置攪拌子並使上述攪拌子旋轉而進行。攪拌之強度如上所述般較佳為低速及/或緩慢，與非專利文獻1及3中所記載之先前之合成ASPD之製造方法中的攪拌為相同程度即可。又，本揭示之製造方法中之攪拌可於特定時間內連續地進行，亦可斷續地進行。

[合成ASPD之形成]

本揭示之製造方法包括於塑化劑之存在下對含有Aβ之液體進行攪拌之步驟。可認為合成ASPD係藉由在上述攪拌過程中上述Aβ集合或締合而形成。因此，本揭示之製造方法於一實施形態中包括合成ASPD形成步驟，且上述步驟包括對含有Aβ及塑化劑之液體進行攪拌之步驟。

關於供至合成ASPD形成步驟的含有Aβ及塑化劑之液體中之Aβ之含量，就提高合成ASPD之形成效率之觀點而言，較佳為0.1~500 μM，更佳為1~350 μM，進而較佳為10~200 μM，進而更佳為20~100 μM，進而更佳為30~75 μM，進而更佳為40~60 μM。就提高合成ASPD之形成效率之觀點而言，上述液體中所含之Aβ較佳為單體，即，於合成ASPD形成步驟之前並未已形成Aβ集合體。又，上述液體中所含之Aβ可為1種，亦可為複數種之混合物。例如，可為Aβ42或Aβ40之1種，亦可為Aβ42與Aβ40之混合物。

關於供至合成ASPD形成步驟的含有Aβ及塑化劑之液體中之塑化劑之含量，就提高合成ASPD之形成效率之觀點而言，較佳為10 μM~10 mM，更佳為100~1000 μM，進而較佳為200~900 μM，進而更佳為400~800 μM，進而更佳為500~750 μM，進而更佳為600~700 μM。上述液體中所含之塑化劑可為1種，亦可為複數種之混合物。

關於合成ASPD形成步驟中之攪拌之溫度，就提高合成ASPD之形成效率之觀點而言，較佳為超過0℃且為40℃以下，更佳為37℃以下，進而較佳為32℃以下，進而更佳為12℃以下，進而更佳為5℃以下。再者，於本說明書中，所謂「攪拌之溫度」，係指進行攪拌之環境溫度或周圍溫度。

合成ASPD形成步驟中之攪拌之時間例如為10小時~8天。於供至上述步驟之上述液體中之Aβ為Aβ42之情形時，就提高合成ASPD之形成效率之觀點而言，攪拌時間較佳為10~20小時，更佳為11~18小時，進而較佳為12~16小時，進而更佳為13~15小時。於上述Aβ為Aβ40之情形時，就提高合成ASPD之形成效率之觀點而言，攪拌時間較佳為4~8天，更佳為5~7天。於上述Aβ為該等以外者或混合物之情形時，可於上述範圍內適當調節。

[合成ASPD之形成之確認]

利用本揭示之製造方法或上述合成ASPD形成步驟所形成之合成ASPD可根據細胞毒性及/或抗體反應性而確認。例如，若添加至成熟之神經細胞中時可誘導細胞死亡(細胞凋亡(apoptosis))，則可確認ASPD之存在(非專利文獻1及3)。或者，ASPD之存在可使用對ASPD具有特異性之抗體而確認。作為上述抗體，可使用專利文獻1及2中所揭示之haASD1、haASD2、mASD3等對ASPD具有特異性之單株抗體或rpASD1等對ASPD具有特異性之多株抗體。若使用該等抗體，則亦可依據先前公知之方法，對合成ASPD進行定量。

[合成ASPD之純化]

利用本揭示之製造方法或上述合成ASPD形成步驟所形成之合成ASPD可藉由如下方式而純化：使用孔徑0.22 μm之過濾器對攪拌後之液體進行過濾，然後利用截留分子量(cut-off)為50 kDa或100 kDa之超濾過濾器對該濾液進行過濾，並將滯留物回收。或者，上述合成ASPD亦可藉由使用對ASPD具有特異性之抗體、例如上述專利文獻1或2中所揭示之抗體的免疫沈澱法而純化。本揭示之製造方法亦可包括對所形成之合成ASPD進行純化之步驟。但是，合成ASPD之純化方法並不限定於該方法。

[含有Aβ及塑化劑之液體之調製]

於本揭示之製造方法中，就提高合成ASPD之形成效率之觀點而言，供至攪拌的含有Aβ及塑化劑之液體較佳為利用包括將Aβ溶解於含有塑化劑之有機溶劑之步驟，及利用水性溶液對所獲得之Aβ溶液進行稀釋之步驟的方法進行調製。因此，本揭示之製造方法於其他實施形態中係關於一種合成ASPD之製造方法，其包括1)含有Aβ及塑化劑之液體之調製步驟、及2)合成ASPD形成步驟；且上述步驟1)包括將Aβ溶解於含有塑化劑之有機溶劑之步驟，及利用水性溶液對所獲得之Aβ溶液進行稀釋之步驟；上述步驟2)包括對上述步驟1)中所獲得之含有Aβ及塑化劑之液體進行攪拌之步驟。

就提高合成ASPD之形成效率之觀點而言，溶解於含有塑化劑之有機溶劑中之Aβ較佳為冷凍乾燥。就提高合成ASPD之形成效率之觀點而言，上述有機溶劑較佳為可將Aβ及塑化劑溶解且為水溶混性的有機溶劑，更佳為選自N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N-二甲基乙醯胺(DMAc)、四氫呋喃(THF)、二甲基亞碸(DMSO)、丙酮、及該等之混合物中之有機溶劑，進而較佳為二甲基亞碸(DMSO)，進而更佳為無水DMSO。

上述含有塑化劑之有機溶劑中之塑化劑之濃度可根據利用下述水性溶液之稀釋倍率與上述之含有Aβ及塑化劑之液體中之塑化劑濃度而適當確定。

稀釋中所使用之水性溶液可使用先前公知之緩衝溶液或細胞培養培養基。就提高合成ASPD之形成效率之觀點而言，上述水性溶液較佳為具有生理離子強度與pH值之水性溶液。

作為用作上述水性溶液之緩衝溶液，就提高合成ASPD之形成效率之觀點而言，較佳為磷酸緩衝生理鹽水(PBS，Phosphate Buffered Saline)、具有三(羥基甲基)甲基骨架((HOCH2)₃C-骨架)之緩衝劑之溶液、2-(羥基甲基)-1,3-丙二醇(HMPD)溶液、及1,3-丙二醇溶液。再者，作為上述具有三(羥基甲基)甲基骨架之緩衝劑，可列舉：N-三(羥基甲基)甲基-2-胺基乙磺酸(TES)、三(羥基甲基)胺基甲烷 (Tris)、N-[三(羥基甲基)甲基]甘胺酸(Tricine)、N-三(羥基甲基)甲基-3-胺基丙磺酸(TAPS)及1,1,1-三(羥基甲基)乙烷(THME)。作為上述水性溶液，就相同之觀點而言，更佳為PBS，進而較佳為不含鈣及鎂之Dulbeco磷酸緩衝生理鹽水(D-PBS(-))。

作為用作上述水性溶液之細胞培養培養基，就提高合成ASPD之形成效率之觀點而言，較佳為BME培養基(Basal Medium Eagle，Eagle基本培養基)、BGJb培養基、CMRL1066培養基、GlasgowMEM培養基、改良MEM鋅選擇性培養基、IMDM培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，伊思考夫氏改良杜爾貝可氏培養基)、Medium199培養基、EagleMEM培養基、αMEM培養基、DMEM培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基)、Ham's F12培養基、RPMI1640培養基、Fischer's培養基、及該等之混合培養基等，該等培養基中，更佳為經除去pH指示劑者。作為上述水性溶液，就相同之觀點而言，更佳為Ham's F12培養基，進而較佳為不含L-麩醯胺及酚紅之Ham's F12培養基。

關於利用上述水性溶液對上述Aβ溶液進行稀釋之稀釋倍率，就提高合成ASPD之形成效率之觀點而言，較佳為5~5000倍，更佳為10~1000倍，進而較佳為50~500倍，進而更佳為75~200倍，進而更佳為90~120倍。

[預處理]

就提高合成ASPD之形成效率之觀點及對Aβ誘導α螺旋之觀點而言，供至上述「含有Aβ及塑化劑之液體之調製」之Aβ較佳為實施包括溶解於揮發性溶劑並進行冷凍乾燥之步驟的預處理。又，就相同之觀點而言，上述預處理較佳為將使粉末狀或冷凍乾燥之Aβ溶解於揮發性溶劑並進行冷凍乾燥設為1次循環，而進行2~3次循環。於上述第1次循環中，為使Aβ完全溶解，較佳為於揮發性溶劑中溶解之後進行培養。上述培養例如較佳為於2~8℃(較佳為約4℃)下進行整夜(例如，6~12小時)之後，於25~40℃(較佳為約37℃)下進行30分鐘~4小時(較佳為約2小時)，但並不限定於該條件。又，上述培養在一個或複數個實施形態中較佳為進行於2~8℃下進行的第1培養、與於25~40℃下進行的第2培養的2階段之培養。第1培養之溫度為2~8℃，較佳為約4℃，時間例如為整夜，較佳為6~12小時。第2培養之溫度為25~40℃，較佳為約37℃，時間例如為30分鐘~4小時，較佳為約2小時。

就提高合成ASPD之形成效率之觀點及對Aβ誘導α螺旋之觀點而言，上述預處理中所使用之揮發性溶劑較佳為二氯甲烷、丙酮、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)、四氫呋喃(THF)、及該等之組合等，更佳為HFIP。

[試劑套組]

本揭示於其他態樣中係關於一種試劑套組，其係用於藉由本揭示之製造方法而製造合成ASPD者，包含經冷凍乾燥之Aβ、上述有機溶劑、及上述塑化劑。上述經冷凍乾燥之Aβ較佳為經進行上述預處理者。藉由本揭示之試劑套組，可容易地進行上述「含有Aβ及塑化劑之液體之調製」，可更簡便地實施本揭示之製造方法。

實施例 [實施例1]

於在下述條件下調製之冷凍乾燥狀態之Aβ42原料(Ca.50 nmol/試管)中，添加以如下所述之方式調製之含65 mM鄰苯二甲酸二(2-乙基己酯)(DEHP)之DMSO溶液10 μL使之溶解，獲得5 mM Aβ溶液。於該5 mM Aβ溶液中添加不含L-麩醯胺及酚紅之F12緩衝劑(KOHJIN BIO公司製造)990 μL，獲得50 μM Aβ溶液。使用旋轉器(rotator)將該50 μM Aβ溶液於4℃下旋轉攪拌14小時，形成合成ASPD。自含有所形成之合成ASPD之上述溶液中於下述條件下純化合成ASPD。經純化之合成ASPD於下述條件下算出之合成ASPD形成效率為57%(單體換算)。再者，確認合成ASPD之形成係藉由電子顯微鏡觀察、及使用抗ASPD抗體之斑點雜交(dot blot)、胺基酸分析而進行，最後利用下述條件之細胞毒性試驗對神經毒性進行測定。

[Aβ42原料之調製方法]

使用肽合成機(Applied Biosystems公司製造，model 433A)，利用Fmoc法合成包含序列表之序列編號1之胺基酸序列的Aβ42肽並進行純化。於冷凍乾燥後之約50 mg之Aβ42肽中添加100 mL之HFIP(1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇，HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析法)用，關東化學公司製造)進行溶解，於4℃下培養整夜，於37℃下培養3小時，其後，向各試管中分別分注500 μL，於-80℃下儲存。將所儲存之Aβ42溶液進行冷凍乾燥之後，再次添加HFIP 500 μL將Aβ42溶解(Aβ濃度Ca.100 μM)。將該溶液再次冷凍乾燥，於-20℃下儲存，作為Aβ42原料。

[65 mM DEHP/DMSO溶液之調製]

於75.7 μL之無水DMSO(無水二甲基亞碸，SIGMA公司製造)中添加2 μL之DEHP(鄰苯二甲酸二(2-乙基己酯)，東京化成工業公司製造)，製成65 mM DEHP/DMSO溶液。

[合成ASPD之純化條件]

利用孔徑0.22 μm之過濾器對經旋轉攪拌後之500 μL之合成ASPD溶液進行過濾，利用截留分子量100 kDa或50 kDa之超濾過濾器對濾液進行過濾，並將滯留物回收，作為「158-669 kDa合成ASPD組份」。

[ASPD形成效率之測定條件(算出方法)]

為檢查ASPD形成效率，藉由使用兔多株抗ASPD抗體rpASD1之斑點雜交法，依據濃度已知之標準ASPD，算出以如上所述之方式純化之ASPD量。為對其進行進一步確認，而藉由胺基酸分析求出澱粉樣蛋白β含量。

[細胞毒性試驗]

ASPD之形成係藉由以下細胞毒性試驗而確認。使用源自成熟之大鼠海馬之初次培養神經細胞(培養19天以後)，一晚投予一定量之ASPD，使用Roche公司製造之細胞凋亡檢測ELISA，依據操作說明(protocol)測定神經毒性。其為對因細胞凋亡而產生的細胞內之組織蛋白結合DNA片段化進行定量檢測的ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酵素結合免疫吸附分析)套組。

[比較例1]

使用無水DMSO代替含65 mM DEHP之DMSO溶液，除此以外，以與實施例1相同之方式，由Aβ42肽製造合成ASPD。其結果，合成ASPD形成效率為1.2%(單體換算)。

將實施例1及比較例1之斑點雜交及胺基酸分析之結果之一例示於圖1。如圖1所示，可明確實施例1(DEHP+)與比較例1(DEHP-)相比，ASPD形成效率顯著提高。

又，將使用藉由實施例1及比較例1製造之合成ASPD之細胞毒性試驗之結果的一例示於圖2。圖2係以該圖中所示之Aβ42換算濃度(1 μM、2 μM、4 μM)使用純化前之包含合成ASPD之實施例1(DEHP+)之溶液及比較例1(DEHP-)之溶液進行細胞毒性試驗之結果。如圖2所示，實施例1之溶液依存於濃度地顯示較比較例1之溶液顯著之細胞毒性。再者，不含合成ASPD之含相同濃度之DEHP之溶液中未確認到細胞毒性(未示出資料)。

圖3係對純化前之包含合成ASPD之實施例1(DEHP存在下)之溶液及比較例1(DEHP非存在下)之溶液進行電子顯微鏡觀察之照片之一例。如圖3所示，與比較例1相比，於實施例1中確認到大量直徑約10~15 nm之球狀體之合成ASPD。

[實施例3~6]

將65 mM DEHP/DMSO溶液之DEHP之濃度設定為13 mM、26 mM、51 mM、及102 mM，除此以外，以與實施例1相同之方式由Aβ42肽製造合成ASPD(實施例3~6)，以與實施例1相同之方式進行ASPD形成效率之測定及細胞毒性試驗。其結果，合成ASPD形成效率分別為67%、61%、38%、及28%(單體換算)。將比較例1及實施例3~6(DEHP濃度分別為0 mM、13 mM、26 mM、51 mM、及102 mM)之ASPD形成效率之測定結果及細胞毒性試驗之結果之一例示於圖4。如圖4所示，ASPD形成效率及細胞毒性依存於ASPD形成中所使用之DEHP之濃度而增加。

產業上之可利用性

本揭示例如於與阿茲海默氏病及/或路易氏體型癡呆症相關之醫療及醫藥、研究之領域中有用。

圖1係表示實施例1(DEHP+)及比較例1(DEHP-)中之ASPD形成效率之測定結果之一例的圖。

圖2係表示實施例1(DEHP+)及比較例1(DEHP-)中之細胞毒性試驗之結果之一例的圖。

圖3係實施例1(DEHP存在下)及比較例1(DEHP非存在下)中之電子顯微鏡觀察照片之一例。

圖4係表示實施例3~6及比較例1中之ASPD形成效率測定及細胞毒性試驗之結果之一例的圖。

<110> TAO Health LifwPharma Co.,Ltd

<120> 合成AsPD之製造方法

<130> H4041

<140> 101149355

<141> 2012-12-22

<150> JP2011-281845

<151> 2011-12-22

<160> 1

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 42

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

Claims

一種合成澱粉球蛋白之製造方法，其包括於塑化劑之存在下對含有澱粉樣蛋白β肽之液體進行攪拌之步驟，其中上述塑化劑為鄰苯二甲酸二(2-乙基己酯)。
如請求項1之合成澱粉球蛋白之製造方法，其包括如下步驟：將澱粉樣蛋白β狀溶解於含有上述塑化劑之有機溶劑中；利用水性溶液對上述澱粉樣蛋白β肽之溶液進行稀釋；及對上述稀釋後之溶液進行攪拌。
如請求項2之合成澱粉球蛋白之製造方法，其中上述有機溶劑為水溶混性溶劑。
一種試劑套組，其係如請求項2或3之製造方法中所使用之試劑套組，且包含經冷凍乾燥之澱粉樣蛋白β肽、上述有機溶劑、及上述塑化劑。