ES2641325T3 - Antagonistas peptídicos de la familia calcitonina CGRP de hormonas peptídicas y su uso - Google Patents

Abstract

Un antagonista del péptido relacionado con el gen de la calcitonina que tiene la estructura de Fórmula I: X1-Y1-Z1 (I), en la que X1 comprende X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO: 16), en la que X11 se selecciona del grupo que consiste en alanina (Ala), cisteína (Cys) y glicina (Gly), y en la que X12 se selecciona del grupo que consiste en cisteína (Cys) y serina (Ser), siempre que uno de X11 y X12 sea Cys; X13 se selecciona del grupo que consiste en arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp) y valina (Val); X14 se selecciona del grupo que consiste en leucina (Leu), fenilalanina (Phe) y treonina (Thr); X15 se selecciona del grupo que consiste en alanina (Ala), glicina (Gly) y serina (Ser); X16 se selecciona del grupo que consiste en alanina (Ala), isoleucina (Ile), leucina (Leu) y serina (Ser); X17 es Cys; y en la que Y1 es -Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn- (SEQ ID NO: 34); y Z1 es -Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 46).

Description

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DESCRIPCION

Antagonistas peptidicos de la familia calcitonina CGRP de hormonas peptidicas y su uso Antecedentes de la invencion Campo de la invencion

Las presentes realizaciones se refieren a antagonistas peptfdicos de la familia calcitonina/peptido relacionado con el gel de calcitonina (CT/CGRP) de hormonas peptidicas y sus usos terapeuticos.

Descripcion de la tecnica relacionada

La familia peptidica CT/CGRP incluye peptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), adrenomedulina (ADM), intermedina (IM), calcitonina (CT) y amilina. Las acciones biologicas de estos peptidos estan mediadas a traves de la union a dos receptores acoplados a protema G de tipo II estrechamente relacionados, el receptor de la calcitonina (CTR) y el receptor similar al receptor de la calcitonina (CRLR) (Christopoulos, et al. 1999, Mol. Pharmacol. 56: 235-242; Poyner et al. 2002 Pharmacol. Rev. 54: 233-246). Aunque el receptor de la calcitonina es el principal mediador de la accion de la calcitonina, preferentemente se une a amilina, cuando el receptor se asocia con una protema modificadora de la actividad del receptor (RAMP) (vease, por ejemplo, Tilikaratne, et al. 2000, J. Pharmacol. Exp. Ther. 294(1): 61-72). Los estudios de clonacion y funcionales han mostrado que CGRP, ADM, IM y a un menor nivel, la amilina, interaccionan del mismo modo con diferentes combinaciones de CRLR y con las tres protemas modificadoras de la actividad del receptor (RAMP-1, RAMP-2 y RAMP-3); vease, por ejemplo, McLatchie et al. 1998, Nature 393: 333-339 y Roh et al. 2004, JBC 279(8): 7264-7274). De hecho, se requiere la expresion conjunta del receptor similar al receptor de calcitonina (CRLR) y de las protemas modificadoras de la actividad del receptor (RAMP), para generar receptores funcionales para el peptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), adrenomedulina (ADM) e intermedina (IM). La formacion de heterodfmeros entre las RAMP y el CRLR es esencial para el adecuado direccionamiento en la superficie celular y caractensticas farmacologicas de receptores de CGRP, ADM e IM. La expresion conjunta de RAMP-1 con CRLR conduce a la formacion de un receptor de CGRP, mientras que la expresion conjunta de RAMP-2 y RAMP-3 con CRLR forman receptores de AdM e IM respectivamente (Miret, et al. 2002, JBC 277(9): 6881-6887). Se ha mostrado que la IM es un agonista no selectivo de los tres correceptores RAMP/CRLR.

Las funciones fisiologicas de los peptidos hormonales en la familia CT/CGRP estan determinadas por la especificidad de union al receptor y perfiles de expresion tisular de ligandos individuales y sus receptores respectivos y se ha mostrado que estan implicados en la morfogenesis cardiovascular, neurotransmision sensorial, reacciones inflamatorias, comportamiento nociceptivo y homeostasis de la glucosa (vease, por ejemplo, Hay, et al. 2001, Trends Pharmacol. Sci. 22: 57-59; Shindo, et al. 2001, Circulation 104: 1964-1971; Zhang et al. 2001, Pain 89: 265-273; Salmon et al. (1999) Neuroreport 10: 849-854; Salmon, et al. 2001, Nat. Neurosci. 4: 357-358 y Mulder, et al. 2000, Am. J. Physiol. 278: E684-E691).

El CGRP (peptido relacionado con el gen de la calcitonina), un peptido bien estudiado en la familia CT/CGRP de hormonas peptfdicas, es un neuropeptido sensorial con fuerte accion vasodilatadora y cardiotonica, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 4.530.838 de Evans, et al. CGRP esta presente en el sistema nervioso tanto central como periferico y esta concentrado en aquellas zonas del cuerpo que reciben informacion sensorial desde el asta posterior con cantidades ilimitadas asociadas a una informacion autonoma. En el cerebro, el peptido esta presente en los nucleos de nervios craneales sensoriales y motores y en cuerpos celulares en el hipotalamo, area preoptica, talamo ventromedial, hipocampo y similar (Poyner, D. 1992, Pharmac. Ther. 56: 23-51).

Se postula que, a nivel de receptor, los inhibidores contra CGRP son utiles en afecciones patofisiologicas en las que se ha producido una activacion excesiva del receptor de CGRP. Algunas de estas incluyen vasodilatacion neurogenica, inflamacion neurogenica, migrana, cefalea en brotes y otras cefaleas, lesion termica, choque circulatorio, sofocos menopausicos y asma. La activacion del receptor de CGRP se ha implicado particularmente en la patogenesis de la jaqueca (Edvinsson L. 2001, CNS Drugs 15(10): 745-53; Williamson, D. J. 2001 Microsc. Res. Tech. 53: 167-178.; Grant, A. D. 2002, Brit. J. Pharmacol. 135: 356-362). Las migranas se advierten por la intensidad de la cefalea que se presenta con su patologfa. Se cree que la cefalea asociada a migranas produce una intensa vasodilatacion cerebral asociada a acontecimientos de migrana. Las fibras nerviosas que contienen CGRP inervan vasos cerebrales y durales donde se piensa que el CGRP prolonga la vasodilatacion. (Moskowitz 1992, Trends Pharmacol. Sci. 13: 307-311). Ademas, los niveles en suero de CGRP estan elevados durante la migrana (Goadsby, et al. 1990, Ann. Neurol. 28: 183-7) y el tratamiento con farmacos antimigrana retorna los niveles de CGRP a la normalidad lo que coincide con el alivio de la cefalea (Gallai, et al. 1995, Cephalalgia 15: 384-90). Las personas con migrana muestran niveles de CGRP basales elevados en comparacion con controles (Ashina, et al., 2000, Pain 86(1-2)133-8). La infusion intravenosa de CGRP produce cefalea permanente en personas con migrana (Lassen, et al. 2002, Cephalalgia 22(1): 54-61). Por tanto, los antagonistas de CGRP han sido el centro de reciente investigacion como un metodo para bloquear a los receptores de CGRP cerebrovascular y por tanto bloquear la vasodilatacion causante de la migrana.

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Se conocen antagonistas tanto peptidicos como de molecula pequena del receptor de CGRP. Estos incluyen, por ejemplo, olcegepant intravenoso (BIBN4096 BS) y telcagepant oral (MK-0974), producidos por Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals y Merck & Co., Inc., respectivamente. Se ha visto que estos dos antagonistas de CGRP de molecula pequena son inocuos, eficaces y bien tolerados en ensayos clmicos anteriores para el tratamiento agudo de migranas. (Vease, por ejemplo, Tepper y Stillman, 2008, Headache 48(8): 1259-1268 y Durham y Vause 2010, CNS Drugs 24(7): 539-548). Sin embargo, recientemente, Merck y Co., Inc interrumpieron una investigacion en Fase II sobre el uso del antagonista de CGRP de molecula pequena, MK-3207, para prevenir migranas, debido a la observancia de anomalfas en analisis hepaticos asintomaticos en algunos pacientes en un estudio farmacologico de Fase I ampliado ("Merck Updates Status of Clinical Development Programs for Investigational CGRP Receptor Antagonist Treatments for Acute Migraine; MK-3207 Clinical Development Discontinued." 10 de septiembre de 2009. Merck y Co., Inc. Web. 1 de junio de 2011).

Otras moleculas que se sabe que compiten con el receptor de CGRP son peptidos que comprenden la secuencia de CGRP pero que carecen de al menos los siete primeros aminoacidos de la secuencia de aminoacidos de CGRP, por ejemplo, incluyendo, pero sin limitacion, CGrP (8-37), CGRP (28-37), [Tyr°]CGRP (28-37) y CGRP (12-37). Otros antagonistas de CGRP incluyen h-a-CGRP (9-37), h-a-CGRP (10-37), h-a-CGRP (11-37) (Mimeault, M. et al 1992, J. Med. Chem. 35: 2163-2168). Incluso otros antagonistas de CGRP incluyen [Ala 9]-h-a-CGRP (8-37), [Ala 10]-h-a- CGRP (8-37), [Ala 11]-h-a-CGRP (8-37) y [Ala 12]-h-a- CGRP (8-37), id. Como antagonistas adicionales de CgRp se incluyen h-a-CGRP (19-37), h-a-CGRP (23-37) y acetil-h-a-CGRP (19-37) (Rovero, P. et al. 1992, Peptides 13: 1025-1027).

Aunque se ha visto que diversos antagonistas peptfdicos del receptor de CGRP compiten de un modo eficaz con CGRP in vitro, estos antagonistas no han funcionado igualmente en modelos in vivo de patologfas similares a la migrana.

Sumario de la invencion

Sorprendentemente, se ha encontrado que determinados aminoacidos seleccionados en la parte N terminal del peptido relacionado con el gen de la calcitonina, como se desvela y describe en el presente documento, son responsables de la actividad agonista del peptido. Ademas, la sustitucion de determinados aminoacidos en la parte N terminal del peptido relacionado con el gen de la calcitonina puede adaptar la actividad de un agonista a un antagonista. Mas aun, se ha descubierto que sustituciones o modificaciones adicionales pueden proporcionar caractensticas deseables adicionales a los antagonistas de la presente invencion.

Una realizacion proporciona un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado, teniendo dicho antagonista la estructura de Formula I:

X1-Y1-Z1 (I)

en la que X1 comprende X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO: 16),

en la que X11 se selecciona del grupo que consiste en alanina (Ala), cistema (Cys) y glicina (Gly), y en la que X se selecciona del grupo que consiste en cistema (Cys), y serina (Ser), siempre que uno de X y X sea Cys; X13 se selecciona del grupo que consiste en arginina (Arg), asparagina (Asn), acido aspartico (Asp) y valina (Val); X14 se selecciona del grupo que consiste en leucina (Leu), fenilalanina (Phe) y treonina (Thr);

X15 se selecciona del grupo que consiste en alanina (Ala), glicina (Gly) y serina (Ser);

X16 se selecciona del grupo que consiste en alanina (Ala), isoleucina (Ile), leucina (Leu) y serina (Ser);

X17 es Cys;

y en la que Y1 es -Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn- (SEQ ID NO: 34); y Z1 es -Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 46).

Algunas realizaciones proporcionan una composicion farmaceutica que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado, como se desvela y describe en el presente documento.

Algunas realizaciones facilitan un metodo de tratamiento de una afeccion asociada a niveles aberrantes de CGRP, que comprende la administracion, a un individuo, de un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado, como se desvela y describe en el presente documento, comprendiendo el metodo la administracion al individuo de una cantidad eficaz de un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado como se desvela y describe en el presente documento.

Algunas realizaciones proporcionan un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado que tiene la estructura seleccionada de las siguientes secuencias peptfdicas, indicadas en la Tabla 1.

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Tabla 1

NH2-ACDTAACVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSKAF-NH2;

(SEQ ID NO: 1)-NH2

NH2-ACDTASCVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSKAF-NH2;

(SEQ ID NO: 2)-NH2

NH2-ACDTAVCVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSKAF-NH2;

(SEQ ID NO: 3)-NH2

NH2-ACNTAACVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSKAF-NH2;

(SEQ ID NO: 4)-NH2

NH2-ACVLGACVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSKAF-NH2;

(SEQ ID NO: 5)-NH2

NH2-ACRFGACVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSKAF-NH2;

(SEQ ID NO: 6)-NH2

NH2-ACNLSACVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSKAF-NH2;

(SEQ ID NO: 7)-NH2

NH2-CSNTAACVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSKAF-NH2;

(SEQ ID NO: 8)-NH2

NH2-ACDTALCVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSKAF-NH2;

(SEQ ID NO: 9)-NH2

NH2-ACDTAICVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSKAF-NH2;

(SEQ ID NO: 10)-NH2

NH2-ACNLSVCVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSKAF-NH2;

(SEQ ID NO: 11)-NH2

NH2-CSNTAVCVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSKAF-NH2;

(SEQ ID NO: 12)-NH2

NH2-ACNLSACVLGRLSQELHRLQTYPTNTGSGTP-NH2;

(SEQ ID NO: 13)-NH2

NH2- ACVLGACVLGRLSQELHRLQTYPVDPSSPHSY-NH2; o

(SEQ ID NO: 14)-NH2

NH2-ACDTAACVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH2

(SEQ ID NO: 15)-NH2

Algunas realizaciones facilitan un metodo para liberar un agente terapeutico a una celula. El agente terapeutico esta unido a un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado como se desvela y describe en el presente documento que se une selectivamente a un miembro de la familia de receptores CGRP.

Algunas realizaciones proporcionan un conjugado que comprende un agente terapeutico unido a un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado como se desvela y describe en el presente documento que se une selectivamente a un miembro de la familia de receptores de CGRP. Algunas realizaciones proporcionan un metodo de identificacion de un ligando de union al receptor de CGRP proporcionando un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado unido a un receptor de CGRP, proporcionando un compuesto de ensayo o una biblioteca de compuestos de ensayo, e identificando compuestos que son capaces de disociar el antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina del receptor de CGRP. Dichos compuestos identificados por este metodo pueden analizarse tambien contra otros receptores de CGRP y agentes de union a receptores de CGRP para identificar ligandos de union a receptores de CGRP selectivos.

Descripcion detallada de la realizacion preferida

Una realizacion proporciona un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado, teniendo dicho antagonista la estructura de Formula I:

X1-Y1-Z1 (I)

en la que X1 comprende X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO: 16),

en la que X11 se selecciona del grupo que consiste en alanina (Ala), cistema (Cys) y glicina (Gly), v en la que X12 se selecciona del grupo que consiste en cistema (Cys), y serina (Ser), siempre que uno de X11 y X12 sea Cys; X13 se selecciona del grupo que consiste en arginina (Arg), asparagina (Asn), acido aspartico (Asp) y valina (Val); X14 se selecciona del grupo que consiste en leucina (Leu), fenilalanina (Phe) y treonina (Thr);

X15 se selecciona del grupo que consiste en alanina (Ala), glicina (Gly) y serina (Ser);

X16 se selecciona del grupo que consiste en alanina (Ala), isoleucina (Ile), leucina (Leu) y serina (Ser);

X17 es Cys;

y en la que Y1 es -Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn- (SEQ ID NO: 34); y Z1 es -Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 46).

El peptido completo puede liberarse solo o como una sal del mismo farmaceuticamente aceptable.

En algunas realizaciones del antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado que tiene la

^ 11 10 *“1^ 14 1^' 1ft1 17 ^ 1

estructura de Formula I, X-X-X-X-X-X-X se selecciona del grupo que consiste en NH2-Ala-Cys-Asp-Thr- Ala-Ala-Cys (SEQ ID NO: 17), NH2-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Ser-Cys (SEQ ID NO: 18), NH2-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Val- Cys (SEQ ID NO: 19), NH2-Ala- Cys-Asn-Thr-Ala-Ala-Cys (SEQ ID NO: 20), NH2-Ala-Cys-Val-Leu-Gly-Ala-Cys (SEQ ID NO: 21), NH2-Ala-Cys-Arg-Phe- Gly-Ala-Cys (SEQ ID NO: 22), NH2-Ala-Cys-Asp-Leu-Ser-Ala-Cys (SEQ ID NO: 23), NH2-Ala-Cys-Asn-Leu-Ser-Ala- Cys (SEQ ID NO: 24), NH2-Cys-Ser-Asn-Thr-Ala-Ala-Cys (SEQ ID NO: 25), NH2- Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Leu-Cys (SEQ ID NO: 26), NH2-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Ile-Cys (SEQ ID NO: 27), NH2-Ala-Cys- Asp-Leu-Ser-Val-Cys (SEQ ID NO: 30), NH2-Ala-Cys-Asn-Leu-Ser-Val-Cys (SEQ ID NO: 32) y NH2-Cys-Ser-Asn- Thr-Ala-Val-Cys (SEQ ID NO: 33).

En algunas realizaciones, uno o mas restos estan fusionados en el N terminal con X11, generando de este modo un polipeptido con una extension N terminal de restos con respecto a X1. En algunas realizaciones esta extension afecta a la estabilidad del antagonista despues de su administracion.

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En algunas realizaciones, el antagonista tiene una estructura seleccionada de la lista de estructuras que consiste en NH2-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Ala-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn- Val-Gly- Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 1), NH2-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Ser-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu- Leu-His- Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 2), NH2-Ala-Cys-Asp-Thr- Ala-Val-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala- Phe-NH2 (SEQ ID NO: 3), NH2-Ala-Cys-Asn-Thr-Ala-Ala-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln- Thr-Tyr- Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 4), NH2-Ala-Cys-Val-Leu-Gly-Ala-Cys-Val-Leu- Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 5), NH2-Ala-Cys-Arg-Phe-Gly-Ala-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-

Asn- Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SeQ ID NO: 6), NH2-Ala-Cys-Asn-Leu-Ser-Ala-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser- Gln-Glu- Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 7), NH2-Cys-Ser- Asn-Thr-Ala-Ala-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser- Lys-Ala- Phe-NH2 (SEQ ID NO: 8), NH2-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Leu-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His- Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 9), NH2-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Ile- Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 10), NH2-Ala-Cys-Asn-Leu-Ser-Val-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr- Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 11), NH2-Cys-Ser-Asn-Thr-Ala-Val-Cys-Val-Leu- Gly-Arg-Leu-Ser-Gln- Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 12) o una sal de las mismas farmaceuticamente aceptable. El presente antagonista puede ser un solo compuesto de la lista anterior.

Algunas realizaciones proporcionan una composicion farmaceutica que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y el presente antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado como se desvela y describe en el presente documento.

Algunas realizaciones facilitan un metodo de tratamiento de una cefalea en el individuo, comprendiendo el metodo administrar al individuo una cantidad eficaz del presente antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado como se desvela y describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el metodo puede comprender adicionalmente la identificacion de un sujeto que padece cefalea. En algunas realizaciones, la cefalea es una migrana.

Algunas realizaciones facilitan un metodo de tratamiento de una afeccion asociada con niveles aberrantes de CGRP, que comprende la administracion, a un individuo, del presente antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado, como se desvela y describe en el presente documento, comprendiendo el metodo administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado como se desvela y describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la afeccion es una migrana.

Algunas realizaciones proporcionan un conjugado que comprende un agente terapeutico unido al presente antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado como se desvela y describe en el presente documento, que se une selectivamente a un miembro de la familia de receptores de CGRP. En algunas realizaciones, el agente terapeutico puede ser un agente de obtencion de imagenes.

Algunas realizaciones proporcionan un metodo de identificacion de un ligando de union al receptor de CGRP proporcionando el presente antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado unido a un receptor de CGRP, proporcionando un compuesto de ensayo o una biblioteca de compuestos de ensayo, e identificando compuestos que sean capaces de disociar el antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado, del receptor de CGRP. Dichos compuestos identificados por este metodo pueden analizarse adicionalmente contra otros receptores de CGRP y agentes de union a receptores de CGRP para identificar ligandos de union a receptores de CGRP selectivos.

En algunas realizaciones del presente documento se describe un antagonista de CGRP modificado que conserva la secuencia de un agonista que incluye X1, la region N terminal que se une al receptor de CGRP en la membrana celular, y en su extremo C terminal, que inicia y estabiliza la helice a traves de un enlace disulfuro Y1, el motivo estructural en helice; y Z1, la region de union C terminal, pero que difiere mediante tan solo en un resto de la secuencia agonista. En una realizacion preferida, la helice procedente de calcitonina de salmon es parte de la estructura que se utiliza para aumentar la eficacia del presente antagonista.

Definiciones

Las siguientes definiciones se exponen para ilustrar y definir el significado y alcance de los diversos terminos utilizados para describir las realizaciones.

Como se usa en el presente documento, "modificado" se refiere a un polipeptido que conserva la estructura global de un peptido relacionado pero que se diferencia en al menos un resto con la del peptido relacionado. Como se usa en el presente documento un "extremo C modificado" es un extremo C de un polipeptido que tiene una estructura

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qmmica distinta de la de un grupo carboxilo de un peptido convencional, siendo un ejemplo de dicho extremo C modificado una carboxamida C terminal.

Como se usa en el presente documento, "agonista" se refiere a un ligando biologicamente activo que se une a su receptor complementario biologicamente activo y activa al ultimo causando una respuesta biologica en el receptor o potenciando la actividad biologica preexistente del receptor.

Como se usa en el presente documento, "antagonista" se refiere a un ligando biologicamente activo que se une a su receptor complementario biologicamente activo e inhibe la respuesta fisiologica del receptor.

Como se usa en el presente documento, "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a las sales no toxicas de metales alcalinos, metales alcalinoterreos y de amonio, habitualmente utilizadas en la industria farmaceutica, incluyendo las sales de sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, bario, amonio y protamina cinc, que se preparan por metodos bien conocidos en la materia. La expresion tambien incluye sales de adicion de acidos no toxicas, que generalmente se preparan haciendo reaccionar los antagonistas del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado desvelado en el presente documento con un acido organico o inorganico adecuado. Como sales representativas se incluyen el clorhidrato, bromhidrato, sulfato, bisulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, napsilato y similares. Por tanto, la expresion se refiere a aquellas sales que conservan la eficacia y propiedades biologicas de las bases libres y que no son biologicamente, o de otra manera, indeseables, formadas con acidos inorganicos tales como acido clortndrico, acido bromtndrico, acido sulfurico, acido mtrico, acido fosforico y similares, y acidos organicos tales como acido acetico, acido propionico, acido glicolico, acido piruvico, acido oxalico, acido malico, acido malonico, acido succmico, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido cftrico, acido benzoico, acido cinamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido p-toluenosulfonico, acido salidlico y similares. Para una descripcion de sales farmaceuticamente aceptables como profarmacos, vease Bundgaard, H. ed., 1985 Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam.

Como se usa en el presente documento, "ester farmaceuticamente aceptable" se refiere a aquellos esteres que despues de la hidrolisis del enlace ester, conservan la eficacia y las propiedades biologicas del acido o alcohol carboxflico y que no son biologicamente, o de otra manera, indeseables. Para una descripcion de esteres farmaceuticamente aceptables como profarmacos, vease Bundgaard, H. ed. 1985 Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam. Estos esteres se forman tfpicamente a partir del correspondiente acido carboxflico y un alcohol. Generalmente, la formacion de ester puede realizarse mediante tecnicas sinteticas convencionales.

Vease, por ejemplo, marzo, 1992 Advanced Organic Chemistry, 4a Ed., John Wiley & Sons, Nueva York, pags. 393396 y referencias citadas en su interior y Mark, et al. 1980 Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, Nueva York. El componente alcohol del ester generalmente comprendera (i) un alcohol alifatico C2-C12 que puede contener o no, uno o mas enlaces dobles y puede contener o no, carbonos ramificados o (ii) un alcohol aromatico o heteroaromatico C7-C12.

Como se usa en el presente documento, "amida C terminal" se refiere a un grupo amida que reemplaza al grupo hidroxilo C terminal normalmente presente en el extremo carboxilo de un polipeptido, de tal manera que el polipeptido finaliza con un grupo carboxamida (es decir, C(=O)-NH2) en lugar de con un carboxilo C terminal (es decir C(=O)-OH). Para una descripcion de amidas farmaceuticamente aceptables como profarmacos, vease Bundgaard, H. ed. 1985 Design of Prodrugs Elsevier Science Publishers, Amsterdam. Estas amidas se forman tfpicamente a partir del acido carboxflico correspondiente y una amina. Generalmente, la formacion de amida puede realizarse mediante tecnicas sinteticas convencionales. Vease, por ejemplo, marzo 1992 Advanced Organic Chemistry, 4a Ed., John Wiley & Sons, Nueva York, pag. 393 y Mark, et al. 1980 Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, Nueva York.

Como se usa en el presente documento, "transportador farmaceuticamente aceptable" se refiere a un medio transportador que no interfiere con la eficacia de la actividad biologica de los principios activos y que no es toxico para el hospedador o para el paciente.

Como se usa en el presente documento, "estereoisomero" se refiere a una entidad que tiene el mismo peso molecular, la misma composicion qmmica y secuencia de enlace que otra, pero que tiene sus atomos agrupados de manera diferente en el espacio sobre uno o mas centros quirales. Es decir, estereoisomeros de la misma formula qmmica contendran grupos qmmicos identicos localizados en diferentes orientaciones espaciales aproximadamente al menos un centro quiral. Cuando son puros, los estereoisomeros tienen la capacidad de girar en la luz polarizada plana. Sin embargo, algunos estereoisomeros puros, pueden tener una rotacion optica que sea tan ligera que no sea detectable con instrumentacion actual. Los antagonistas del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado, como se desvela en el presente documento, pueden tener uno o mas atomos de carbono asimetricos y por lo tanto incluir varios estereoisomeros. Todos los estereoisomeros se incluyen en el ambito de las realizaciones.

Como se usa en el presente documento, "cantidad terapeutica o farmaceuticamente eficaz" como se aplica a las composiciones que se desvelan en el presente documento, se refiere a la cantidad de composicion suficiente para

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inducir un resultado biologico deseado. Este resultado puede ser alivio de los signos, smtomas, o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteracion deseada de un sistema biologico.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "resto peptidico" y "estructura peptidica" pretenden incluir peptidos que comprenden L-aminoacidos de origen natural y los D-aminoacidos correspondientes, asf como derivados peptfdicos, analogos peptidicos y peptidomimeticos de las estructuras de L-aminoacidos de origen natural. En la tecnica se conocen estrategias para disenar analogos peptfdicos, derivados peptidicos y peptidomimeticos.

Vease, por ejemplo, Laguero K. D. et al., publicacion de patente PCT n.° WO 2006/105527 A2; Farmer, P.S. en: Drug Design E. J. Ariens, ed. Academic Press, Nueva York, 1980, vol. 10, pp. 119-143; Ball J. B. y Alewood, P. F. 1990 J. Mol. Recognition 3: 55; Morgan, B. A. y Gainor, J. A. 1989 Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243 y Freidinger, R. M. 1989 Trends Pharmacol. Sci. 10: 270; Luthman, et al. 1996 A Textbook of Drug Design and Development, 14: 386406, 2nd Ed., Harwood Academic Publishers; Joachim Grante, Angew. 1994 Chem. Int. Ed. Engl. 33: 1699-1720; Fauchere, J. 1986 Adv. Drug Res. 15: 29; Veber y Freidinger 1985 TINS p. 392; Evans, et al. 1987 J. Med. Chem. 30: 229. Los peptidomimeticos, que son estructuralmente similares a peptidos terapeuticamente utiles, pueden utilizarse para producir un efecto terapeutico o profilactico equivalente o mejorado, mediante metodos conocidos en la tecnica y descritos adicionalmente en las siguientes referencias: Spatola, A. F. 1983 en: Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, Nueva York, p. 267; Spatola, A. F. 1983 Vega Data, Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (revision general); Morley, 1980 Trends. Pharm. Sci. pp. 463-468, (revision general); Hudson, et al. 1979 Int. J. Pept. Prot. Res. 14: 177-185 (- CH2NH-, CH2CH2-); Spatola, et al. 1986 Life Sci. 38: 1243-1249 (-CH2- S); Hann, 1982 J. Chem. Soc. Parkin. Trans.

I 307-314 (-CH-CH-, cis and trans); Almquist, et al. 1980 J. Med. Chem. 23: 1392-1398, (-COCH2-); Jennings-White, et al. 1982 Tetrahedron Lett. 23: 2533 (-COCH2-); Szelke, et al. 1982, solicitud europea EP 45665 (-CH(OH)CH2-); Holladay, et al. 1983 Tetrahedron Lett. 24: 4401-4404 (-C(OH)CH2-) y Hruby, 1982 Life Sci. 31: 189-199 (-CH2-S-).

Taylor C. K. et al.: "Pharmacological characterization of novel alpha-calcotinin gene-related peptide (CGRP) receptor antagonists that are selective for human CGRP receptors", Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, US, vol. 319, no. 2, 1 de noviembre de 2006, paginas 749-757, XP009084228, ISSN: 0022-3565, DOI: 1124/JPET.108316, describen antagonistas del peptido CGRP(8-37) truncado que tiene una modificacion en el extremo N dando como resultado una afinidad aumentada por el receptor de CGRP humano y un aumento de la inhibicion.

Como se usa en el presente documento, la expresion "estructura de aminoacido" (tal como una "estructura de leucina", una "estructura de fenilalanina" o una "estructura de glutamina") pretende incluir el aminoacido, asf como analogos, derivados y mimeticos del aminoacido que conservan la actividad funcional del compuesto. Por ejemplo, la expresion "estructura de fenilalanina" pretende incluir fenilalanina asf como piridilalanina y homofenilalanina. La expresion "estructura de leucina" pretende incluir leucina, asf como una sustitucion con valina, isoleucina u otro aminoacido natural o no natural que tiene una cadena lateral alifatica, tal como norleucina.

Como se usa en el presente documento, "marcador detectable" o "agente formador de imagenes" se refiere a materiales, que cuando se unen de manera covalente a un compuesto, permiten la deteccion del compuesto, incluyendo, pero sin limitacion, la deteccion in vivo en un paciente al cual se le va a administrar un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado. En la materia se conocen bien marcadores detectables adecuados e incluyen, como ejemplo, radioisotopos, marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluorescema) y similares. El marcador detectable particular empleado no es cntico y se selecciona en relacion con la cantidad de marcador a emplear asf como con la toxicidad del marcador a la cantidad de marcador empleado. La seleccion del marcador en relacion con dichos factores es bien conocida por el experto en la tecnica.

La union covalente del marcador detectable con el peptido o peptidomimetico se realiza mediante metodos convencionales bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, cuando se emplea el radioisotopo 125I como marcador detectable, la union covalente de 125I con el peptido o el peptidomimetico puede realizarse incorporando el aminoacido tirosina en el peptido o peptidomimetico y despues yodando el peptido (vease, por ejemplo, Weaner, et al. 1994 Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds, pags. 137-140). Si la tirosina no esta presente en el peptido o peptidomimetico, la incorporacion de tirosina en el extremo N o C del peptido o peptidomimetico puede realizarse mediante qmmica bien conocida. Del mismo modo, 32P puede incorporarse sobre el peptido o peptidomimetico como un grupo fosfato a traves de, por ejemplo, un grupo hidroxilo en el peptido o peptidomimetico utilizando qmmica convencional.

Como se usa en el presente documento, la expresion "agente terapeutico" significa un agente capaz de tener un efecto terapeutico deseado para una indicacion de enfermedad espedfica, incluyendo, pero sin limitacion, una migrana o un agente reductor del dolor.

Como se usa en el presente documento, la expresion "helice a" significa un componente estructural que forma una estructura de protema a-helicoidal o cualquier otro analogo estructural que de como resultado un posicionamiento similar de los dominios X1 y Z1 en un receptor.

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Preparacion de peptidos y peptidomimeticos 1. Sintesis en fase solida

Los antagonistas del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado descritos en el presente documento pueden prepararse por metodos clasicos conocidos en la materia, por ejemplo, utilizando tecnicas en fase solida convencionales. Vease, por ejemplo, Merrifield, 1963 J. Am. Chem. Soc. 85: 2149.

Estos procedimientos de sintesis de peptidos en fase solida son muy conocidos en la materia y se describen adicionalmente en J. M. Stewart y J. D. Young, 1984 Solid Phase Peptide Syntheses 2nd Ed., Pierce Chemical Company.

Tabla 2: Abreviaturas de una letra de los aminoacidos canonicos. Entre parentesis se indican las abreviaturas de tres letras.

TABLA 2

Alanina (Ala)

A

Glutamina (Gln)

Q

Leucina (Leu)

L

Serina (Ser)

S

Arginina (Arg)

R

Acido glutamico (Glu)

E

Lisina (Lys)

K

Treonina (Thr)

T

Asparagina (Asn)

N

Glicina (Gly)

G

Metionina (Met)

M

Triptofano (Trp)

W

Acido aspartico (Asp)

D

Histidina (His)

H

Fenilalanina (Phe)

F

Tirosina (Tyr)

Y

Cistema (Cys)

C

Isoleucina (lIe)

I

Prolina (Pro)

P

Valina (Val)

V

La nomenclatura y simbolismo de los aminoacidos y peptidos por la UPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) se han publicado en los siguientes documentos: Biochem. J., 1984, 219, 345-373; Eur. J. Biochem., 1984, 138, 9-5 37; 1985, 152, I; 1993, 213, 2; Internat. J. Pept. Prot. Res., 1984, 24, following p 84; J. Biol. Chem., 1985, 260, 14-42; Pure Appl. Chem., 1984, 56, 595-624; Amino Acids and Peptides, 1985, 16, 387-410; Biochemical Nomenclature and Related Documents, 2a edicion, Portland Press, 1992, pags. 39-69.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del presente antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado puede modificarse, con respecto a la secuencia de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 de tal manera que la modificacion reduce la susceptibilidad del presente antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado a la proteolisis enzimatica. En algunas realizaciones esta modificacion puede comprender la adicion N terminal de una secuencia que comprende todo o parte del polipeptido XTENS de 864 restos, un polipeptido que se ha mostrado que aumenta a estabilidad de la protema despues de la administracion a un sujeto. Vease, por ejemplo, Schellenberger, et al., 2009, Nature Biotechnology 27(12): 11861192.

En algunas realizaciones, el presente antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado puede incluir uno o mas restos de D-aminoacidos. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del presente antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado puede modificarse, con respecto a la secuencia de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 de tal manera que la modificacion incluye el reemplazo de uno o mas restos de L-aminoacidos con restos de D-aminoacidos correspondientes.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado puede modificarse, con respecto a la secuencia de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 de tal manera que la modificacion incluye la sustitucion con un aminoacido conservativo.

Los restos de origen natural pueden dividirse en clases basandose en propiedades comunes de la cadena lateral:

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hidrofobos: norleucina (Nor), Met, Ala, Val, Leu, Ile; hidrofilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; acidos: Asp, Glu; basicos: His, Lys, Arg;

restos que influyen en la orientacion de la cadena: Gly, Pro; y aromaticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones conservativas de aminoacidos pueden implicar el intercambio de un miembro de una clase con otro miembro de la misma clase. Las sustituciones conservativas de aminoacidos pueden incluir restos de aminoacidos de origen no natural, que se incorporan tipicamente mediante smtesis peptidica qmmica en lugar de mediante smtesis en sistemas biologicos. Estos incluyen peptidomimeticos y otras formas invertidas o inversas de aminoacidos.

En algunas realizaciones, las sustituciones conservativas pueden incluir la sustitucion de un resto de aminoacido no polar (hidrofobo), tal como isoleucina, valina, leucina, norleucina, alanina o metionina por otro, la sustitucion de un resto de aminoacido polar (hidrofilo) por otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre treonina y serina, la sustitucion de un resto aminoacido basico, tal como lisina, arginina o histidina por otro, o la sustitucion de un resto acido, tal como acido aspartico o acido glutamico, por otro. La frase "sustitucion conservativa de aminoacidos" tambien incluye el uso de un resto qmmicamente derivatizado en lugar de un resto no derivatizado, siempre que dicho polipeptido presente el requisito de actividad antagonista.

La Tabla 3 proporciona ejemplo de sustituciones de restos de aminoacidos que pueden ser utiles de acuerdo con las presentes realizaciones.

TABLA 3

Restos originales

Sustituciones

Ala

Val, Leu, He, Aib

Arg

Lys, Gln, Asn, homoarginina

Asn

Gln

Asp

Glu

Cys

Ser, Ala

Gln

Asn

Glu

Asp

Gly

Pro, Ala

His

Asn, Gln, Lys, Arg

lie

Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina

Leu

Norleucina, Ile, Val, Met, Ala, Phe

Lys

Arg, Acido 1,4-diamino-butmco, Gln, Asn, ornitina

Met

Leu, Phe, Ile

Phe

Leu, Val, Ile, Ala, Tyr

Pro

Ala

Ser

Thr, Ala, Cys

Thr

Ser, Val, He

Trp

Tyr, Phe

Tyr

Trp, Phe, Thr, Ser

Val

He, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina

En algunas realizaciones, un grupo basico de un aminoacido como se desvela en el presente documento, tal como la guanidina de Arg, puede reemplazarse por un bioisostero de base.

"Hidroxiprolina" se refiere a cualquiera y a todos los parientes de hidroxilacion conocidos de prolina bien como un aminoacido libre o incorporado en el polipeptido. Este incluye (2S,4R)-4-hidroxiprolina, asf como restos de prolina que difieren con diferentes esteroqmmicas o carbonos hidroxilados.

Un grupo "O-carboxilo" se refiere a un grupo "RC(=O)O-" en el que R puede ser hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, heteroaliciclilo, aralquilo o (heteroalilciclil)alquilo, como se define en el presente documento. Un O-carboxilo puede estar sustituido o no sustituido.

Un grupo "C-carboxilo" se refiere a un grupo "-C(=O)OR" en el que R puede ser el mismo como se define con respecto a O-carboxilo. Un C-carboxilo puede estar sustituido o no sustituido.

Un grupo "C-amido" se refiere a un grupo "-C(=O)NRARB" en el que RA y RB pueden ser o no iguales y pueden definirse como se define R con respecto a O-carboxilo. Un C-amido puede estar sustituido o no sustituido.

Un grupo "N-amido" se refiere a un grupo "RC(=O)NRA-" en el que R y RA pueden ser o no iguales y pueden definirse como se define R con respecto a O-carboxilo. Un N-amido puede estar sustituido o no sustituido.

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Como se usa en el presente documento, una "amida" se refiere a un grupo "-C(=O)NRARB" en el que RA y RB pueden ser o no iguales y pueden definirse como se define R con respecto a O-carboxilo. En algunas realizaciones Ra y Rb pueden ser hidrogeno.

Como se usa en el presente documento, una "amina" se refiere a un grupo "-NRARB" en el que RA y RB pueden ser o no iguales y pueden definirse como se define R con respecto a O-carboxilo.

Como se usa en el presente documento, una "urea" se refiere a -NRAC(=O)NRB2 en el que cada RA y RB se define individualmente como se define R con respecto a O-carboxilo.

Formacion de enlace disulfuro

Los compuestos pueden existir en una forma ciclada con un enlace disulfuro intramolecular entre los grupos tiol de las cistemas.

Otras realizaciones incluyen analogos de estos derivados de disulfuro en los que uno de los azufres se ha reemplazado por un grupo CH2 u otro isostero por azufre. Estos analogos pueden producirse mediante un desplazamiento intramolecular o intermolecular, utilizando metodos conocidos en la tecnica.

Como alternativa, el extremo amino del peptido puede protegerse con un acido acetico alfa sustituido, en el que el alfa sustituyente es un grupo saliente, tal como un acido a-haloacetico, por ejemplo, acido a-cloroacetico, acido a- bromoacetico o acido a-yodoacetico. Los peptidos de las presentes realizaciones pueden ciclarse o dimerizarse mediante desplazamiento del grupo saliente por el azufre del resto de cistema o de homocistema. Vease, por ejemplo, Andreu, et al. 1994, Meth. Mol. Bio. 35(7): 91-169; Barker, et al. 1992, J. Med. Chem. 35: 2040-2048 y Or, et al. 1991, J. Org. Chem. 56: 3146-3149.

En algunas realizaciones, los antagonistas del peptido relacionado con el gen de la calcitonina modificado, como se desvela y describe en el presente documento, tambien pueden prepararse por tecnicas de ADN recombinante bien conocidas en la materia.

Algunas realizaciones incluyen composiciones farmaceuticas que comprenden, como principio activo, al menos uno de los peptidos modificados presentes, o peptidomimeticos desvelados en el presente documento, en asociacion con un transportador o diluyente farmaceutico. Estas composiciones farmaceuticas pueden administrarse por cualquier medio, como saben los expertos en la tecnica, e incluyen, sin limitacion, las vfas de administracion oral, pulmonar, parenteral (inyeccion intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutanea), inhalacional (mediante una formulacion de un polvo fino, o aerosol), transdermica, intranasal o sublingual y pueden formularse en formas de dosificacion apropiadas para cada via de administracion. Vease, por ejemplo, Bernstein, et al. publicacion de patente PCT n.° WO 93/25221, publicada el 23 de diciembre de 1993; Pitt, et al. publicacion de patente PCT n.° WO 94/17784, publicada el 18 de agosto de 1994 y Pitt, et al. solicitud de patente europea 613.683, publicada el 7 de septiembre de 1994. Los compuestos tambien pueden administrarse en formas de dosificacion de liberacion sostenida o controlada, incluyendo, pero sin limitacion, inyecciones en deposito, bombas osmoticas, parches transdermicos (incluyendo electrotransporte) y similares, para administracion pulsada, prolongada y/o temporalizada, a una velocidad predeterminada.

Las composiciones farmaceuticas de las presentes realizaciones pueden fabricarse de una manera que en sf misma es conocida, por ejemplo, mediante procesos convencionales de mezcla, disolucion, granulacion, preparacion de grageas, levigacion, emulsificacion, encapsulacion, atrapamiento o formacion de comprimidos.

Las composiciones farmaceuticas para su uso de acuerdo con las presentes realizaciones pueden por tanto formularse de una manera convencional utilizando uno o mas transportadores fisiologicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan en procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden utilizarse farmaceuticamente. La formulacion adecuada depende de la via de administracion seleccionada. Cualquiera de las tecnicas bien conocidas, transportadores y excipientes puede utilizarse segun sea adecuado y como se sabe en la tecnica, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, citado anteriormente.

Los inyectables pueden prepararse en formas convencionales, como soluciones o suspensiones lfquidas, formas solidas adecuadas para solucion o suspension en lfquido antes de inyeccion, o como emulsiones. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa, manitol, lactosa, lecitina, albumina, glutamato de sodio, clorhidrato de cistema y similares. Ademas, si se desea, las composiciones farmaceuticas inyectables pueden contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares no toxicas, tales como agentes humectantes, agentes tamponadores de pH y similares. Los tampones fisiologicamente compatibles incluyen, pero sin limitacion, solucion de Hanks, solucion de Ringer o solucion salina fisiologica. Si se desea, pueden utilizarse preparaciones que potencian la absorcion (por ejemplo, liposomas).

Para la administracion transmucosa, en la formulacion pueden utilizarse penetrantes apropiados para atravesar barreras.

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Las formulaciones farmaceuticas para administracion parenteral, por ejemplo, mediante inyeccion en embolada o infusion continua, incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble. Adicionalmente, pueden prepararse suspensiones de los compuestos activos como suspensiones apropiadas para inyeccion oleaginosa. Como disolventes o vetnculos lipofilos adecuados se incluyen aceites grasos, tales como aceite de sesamo u otros aceites organicos tales como aceites de semilla de soja, pomelo o almendra, o esteres de acidos grasos sinteticos, tales como etil oleato o trigliceridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyeccion pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspension, tal como carboximetil celulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspension tambien puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los presentes compuestos para permitir la preparacion de soluciones muy concentradas.

Las formulaciones para inyeccion pueden presentarse en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, con un conservante anadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vetnculos oleaginosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulacion tales como agentes de suspension, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, el principio activo puede estar en forma de polvo para su constitucion con un vehnculo adecuado, por ejemplo, agua apirogena esteril, antes de su uso.

Para la administracion oral, los presentes compuestos pueden formularse combinando los compuestos activos con transportadores farmaceuticamente aceptables, tales como los desvelados en D. J. Sarubbi, Oral GLP-1 Formulations, solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2010/0016229 A1, publicada el 21 de enero de 2010. Como se indica en su interior, las administraciones orales pueden adoptar la forma de comprimidos o capsulas de transportadores farmaceuticamente aceptables mezclados con el farmaco. Como agentes de liberacion adecuados, adicionales, ensenados en Goldberg, 2009, Compositions for Delivering Parathyroid Hormone and Calcitonin, solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2009/0264368 A1, publicada el 22 de octubre de 2009, se incluyen cualquiera de las formas de dosificacion lfquidas o solidas conocidas.

Para la administracion por inhalacion, los presentes compuestos para su uso de acuerdo con las presentes realizaciones, se liberan convenientemente en forma de una presentacion de pulverizacion en aerosol a partir de envases presurizados o de un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dioxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificacion puede determinarse proporcionando una valvula para suministrar una cantidad medida. Las capsulas y cartuchos, por ejemplo, de gelatina, para su uso en un inhalador o insuflador, pueden formularse para que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidon. Como un ejemplo, las preparaciones para administracion por inhalacion pueden prepararse de acuerdo con las ensenanzas de Quay, et al., patente de Estados Unidos n.° 7.812.120 B2, presentada el 12 de octubre de 2010.

Adicionalmente en el presente documento se desvelan diversas composiciones farmaceuticas bien conocidas en la tecnica farmaceutica para usos que incluyen liberacion intraocular, intranasal e intraauricular. Los penetrantes adecuados para estos usos son conocidos en general en la tecnica. Las composiciones farmaceuticas para liberacion intraocular incluyen soluciones oftalmicas acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble, tales como gotas oculares, o en goma gelana (Shedden et al., 2001, Clin. Ther., 23(3): 440-50) o hidrogeles (Mayer et al., 1996, Ophthalmologica, 210(2): 101-3); pomadas oftalmicas; suspensiones oftalmicas, tales como micropartfculas, partfculas polimericas pequenas que contienen farmaco que se suspenden en un medio transportador lfquido (Joshi, A., J. Ocul. Pharmacol., 1994 10(1): 29-45), formulaciones solubles en lfpido (Alm et al., 1989 Prog. Clin. Biol. Res., 312: 447-58) y microesferas (Mordenti, 1999, Toxicol. Sci., 52(1): 101-6); e insertos oculares. Dichas formulaciones farmaceuticas adecuadas se formulan mas frecuente y preferentemente para que sean esteriles, isotonicas y tamponadas para estabilidad y comodidad. Las composiciones farmaceuticas para liberacion intranasal pueden tambien incluir gotas y pulverizaciones a menudo preparadas para simular en muchos aspectos secreciones nasales para garantizar el mantenimiento de la accion ciliar normal, dichas composiciones incluyen, por ejemplo y sin limitacion, las soluciones nasales desveladas por Azria, et al., en la patente de Estados Unidos n.° 5.733.569, presentada el 31 de marzo de 1998. Como se desvela en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990), muy conocida por los expertos en la tecnica, las formulaciones adecuadas son mas a menudo y preferentemente isotonicas, ligeramente tamponadas para mantener un pH de 5,5 a 6,5, y mas a menudo y preferentemente incluyen conservantes antimicrobianos y estabilizantes farmacologicos apropiados. Las formulaciones farmaceuticas para liberacion intraauricular incluyen suspensiones y pomadas para aplicacion topica en el ofdo. Los disolventes habituales para dichas formulaciones oticas incluyen glicerina y agua.

Ademas de las formulaciones descritas anteriormente, los presentes compuestos tambien pueden formularse como una preparacion en deposito. Dichas formulaciones de larga actuacion pueden administrarse por implante (por ejemplo por via subcutanea o intramuscular) o por inyeccion intramuscular. Por tanto, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales polimericos o hidrofobos adecuados (por ejemplo como una emulsion en un aceite aceptable) o resinas de intercambio ionico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, como una sal moderadamente soluble.

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Dependiendo de la naturaleza qmmica y de la estabilidad biologica del reactivo terapeutico, pueden emplearse estrategias adicionales para la estabilizacion de los peptidos.

En las composiciones farmaceuticas pueden incorporarse agentes de diagnostico o terapeuticos adicionales. De manera alternativa o adicional, las composiciones farmaceuticas pueden combinarse con otras composiciones que contengan otros agentes de diagnostico o terapeuticos.

Como ejemplos no limitantes de metodos de administracion se incluyen, entre otros, (a) administracion a traves de rutas orales, tales como las descritas en M. Goldberg, publicacion n.° US 2009/0264368 A1, publicada el 22 de octubre de 2009 y en D. Sarubbi, publicacion n.° US 2010/0016229 A1, publicada el 21 de enero de 2010; (b) la administracion puede ser a traves de rutas no orales, tales como intraocular, intranasal o intraauricular, cuya administracion incluye la administracion como una suspension acuosa, una preparacion oleaginosa o similar o como un gotero, pulverizador, balsamo, pomada o similar; (c) administracion mediante inyeccion, por via subcutanea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intradermica, intraorbital o similar, incluyendo suministro con bomba de infusion; (d) administracion por via local, tal como por inyeccion directamente intracraneal, por ejemplo, mediante un implante en deposito; asf como (e) administracion por via topica; como estimen oportuno los expertos en la tecnica para poner al peptido de las presentes realizaciones en contacto con tejido vivo. Un ejemplo representativo no limitante de aplicacion nasal se describe en Quay, et al., patente de Estados Unidos n.° 7.812.120 B2, presentada el 12 de octubre del 2010.

La formulacion, la via de administracion y la dosificacion exacta para las composiciones farmaceuticas de las presentes realizaciones puede seleccionarlas el medico individual a la vista de la afeccion del paciente. (Vease, por ejemplo, Fingl et al. 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", con particular referencia al cap. 1, pag. 1). Tfpicamente, el intervalo de dosis de la composicion administrada al paciente puede ser de aproximadamente 0,000001 a 100mg/kg de peso corporal del paciente. La dosificacion tambien ser individual o una serie de dos o mas dadas durante el ciclo de uno o mas dfas, segun necesite el paciente. En los casos en los que las dosificaciones humanas para los compuestos se hayan establecido para al menos alguna afeccion, las presentes realizaciones utilizaran las mismas dosificaciones, o dosificaciones que esten entre aproximadamente 0,1 % y 500 %, mas preferentemente entre aproximadamente 25 % y 250 % de la dosificacion humana establecida. Cuando no se establece dosificacion humana, asf como es el caso de compuestos farmaceuticos recientemente descubiertos, una dosificacion humana adecuada puede inferirse a partir de valores de DE50 o DI50, u otros valores apropiados obtenidos de estudios in vitro o in vivo, cualificados por estudios de toxicidad y estudios de eficacia en animales.

Debe observase que el medico tratante sabe como y cuando finalizar, interrumpir o ajustar la administracion debido a toxicidad o disfunciones organicas. A la inversa, el medico tratante tambien sabra ajustar el tratamiento a niveles mas altos si la respuesta clmica no fuera adecuada (excluyendo toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en la gestion del trastorno de interes, variara con la gravedad de la afeccion a tratar y con la via de administracion. La gravedad de la afeccion puede, por ejemplo, evaluarse, en parte, por metodos de evaluacion de pronostico convencionales. Ademas, la dosis y quiza su frecuencia, tambien variara de acuerdo con la edad, el peso corporal y la respuesta del paciente individual. Un programa comparable con el indicado anteriormente puede utilizarse en medicina veterinaria.

Aunque la dosificacion exacta se determinara en funcion de un farmaco u otro, en la mayona de los casos, pueden hacerse algunas generalizaciones con respecto a la dosificacion. El regimen de dosificacion diario para un paciente humano adulto puede ser, por ejemplo, una dosis intravenosa, subcutanea o intramuscular de cada principio activo a un intervalo ejemplar de entre 0,001 mg y 100 mg, o un intervalo ejemplar de entre 0,005 mg y 5 mg. En casos de administracion de una sal farmaceuticamente aceptable, las dosificaciones pueden calcularse como la base libre. En algunas realizaciones, la composicion se administra de 1 a 4 veces al dfa o como una sola dosis intensa, por ejemplo, para mejorar el dolor, tal como el asociado a migrana. Como alternativa las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse mediante infusion intravenosa continua, preferentemente a una dosis de cada principio activo de hasta 1.000 mg por dfa. Como sabran los expertos en la tecnica, en determinadas situaciones puede ser necesario administrar los peptidos desvelados en el presente documento en cantidades que superen, o incluso superen de lejos, el intervalo de dosificacion ejemplar, anteriormente indicado, para tratar de un modo eficaz y agresivo enfermedades o infecciones particularmente agresivas. En algunas realizaciones, los peptidos se administraran durante un periodo de terapia continua, por ejemplo, durante una semana o mas, o durante meses o anos.

La cantidad e intervalo de dosificacion pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles plasmaticos del grupo activo que sean suficientes para mantener los efectos moduladores, o la concentracion eficaz minima (CEM). La CEM variara para cada uno de los compuestos pero puede estimarse a partir de datos in vitro. Las dosificaciones necesarias para conseguir la CEM dependeran de caractensticas individuales y de la via de administracion. Sin embargo, para determinar las concentraciones plasmaticas pueden utilizarse ensayos o bioensayos con HPLC.

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Los intervalos de dosificacion tambien pueden determinarse utilizando valores CEM. Las composiciones deben administrate utilizando un regimen que mantenga los niveles plasmaticos por encima de la CEM durante el 10-90 % del tiempo, preferentemente entre el 30-90 % y mas preferentemente entre el 50-90 %.

En casos de administracion local o captacion selectiva, la concentracion local eficaz del farmaco puede no estar relacionada con la concentracion plasmatica.

La cantidad de la presente composicion administrada puede depender del sujeto que vaya a tratarse, del peso del sujeto, de la gravedad de la dolencia, de la forma de administracion y del criterio del medico que prescribe.

Los compuestos desvelados en el presente documento pueden evaluarse con respecto a su eficacia y toxicidad utilizando metodos conocidos. Por ejemplo, la toxicologfa de un compuesto particular, o de un subconjunto de compuestos, que comparten determinados grupos qmmicos, puede estabilizarse determinando la toxicidad in vitro hacia a una lmea celular, tal como una lmea celular de mairnfero, y preferentemente de un ser humano. Los resultados de dichos estudios son a menudo predictivos de toxicidad en animales, tales como mamnferos, o mas espedficamente, seres humanos. Como alternativa, la toxicidad de compuestos particulares en un modelo animal, tal como ratones, ratas, conejos o monos, puede determinarse utilizando metodos conocidos. La eficacia de un compuesto particular puede establecerse utilizando diversos metodos reconocidos, tales como metodos in vitro, modelos animales o ensayos clmicos con seres humanos. Existen modelos in vitro reconocidos para casi cada clase de afeccion, incluyendo pero sin limitacion, cancer, enfermedad cardiovascular y diversas disfunciones inmunitarias.

De manera similar, pueden utilizarse modelos animales aceptables para establecer eficacia de productos qmmicos para tratar dichas afecciones. Cuando se selecciona un modelo para determinar la eficacia, el experto en la tecnica puede orientarse mediante el estado de la tecnica para seleccionar un modelo, una dosis y una via de administracion y regimen apropiados. Por supuesto, tambien pueden utilizarse ensayos clmicos humanos para determinar la eficacia de un compuesto en seres humanos.

Las presentes composiciones pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o mas formas de dosificacion unitaria que contienen el principio activo.

A lo largo de la memoria descriptica, cualquier comentario sobre un compuesto particular debe entenderse que incluye ese compuesto y cualquier (otra) sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

Las presentes composiciones que contienen los compuestos pueden administrarse para tratamientos profilacticos y/o terapeuticos. En aplicaciones terapeuticas, las composiciones de administran a un paciente que ya padece una enfermedad, como se describe anteriormente, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente los smtomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como “dosis terapeuticamente eficaz”. Las cantidades eficaces para este uso dependeran de la gravedad de la enfermedad y del peso y estado general del paciente.

Las composiciones descritas en el presente documento tambien pueden microencapsularse, por ejemplo, mediante el metodo de Tice y Bibi (en: Treatise on Controlled Drug Delivery, ed. A. Kydonieus, Marcel Dekker, N.Y. 1992, pags. 315-339).

En aplicaciones profilacticas, las composiciones que contienen los compuestos desvelados en el presente documento se administran a un paciente susceptible, o de otra manera en riesgo, de padecer una enfermedad particular. Dicha cantidad se define que es una “dosis profilacticamente eficaz”. En este uso, las cantidades exactas de nuevo dependeran del estado de salud y del peso del paciente, y un experto habitual en la materia puede determinarlas facilmente.

Las cantidades del presente antagonista, necesarias para una terapia eficaz, dependeran de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administracion, sitio diana, estado fisiologico del paciente y otras medicaciones administradas. Por tanto, las dosificaciones del tratamiento deben valorarse para optimizar la seguridad y eficacia. Tfpicamente, las dosificaciones utilizadas in vitro pueden proporcionar orientaciones utiles en las cantidades utiles para la administracion in situ de estos reactivos. El ensayo con animales de dosis eficaces para el tratamiento de trastornos particulares proporcionara una indicacion predictiva adicional de la dosificacion humana. Varias consideraciones se describen por ejemplo en: Gilman, et al. (eds.), 1990 Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics 8th ed., Pergamon Press y Remington's Pharmaceutical Sciences, 7a Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1985). En particular, la dosificacion debe ajustarse para adaptar metodos de liberacion tales como inyeccion intramuscular, inyeccion subcutanea, liberacion oral o subcutanea, introduccion del antagonista sin aguja.

Los peptidos antagonistas y peptidomimeticos descritos en el presente documento son eficaces en el tratamiento de afecciones mediadas por el receptor de CGRP cuando se administra a un intervalo de dosificacion ejemplar, por ejemplo, de aproximadamente 0,01 |jg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal al dfa. La dosis espedfica empleada se regula por la afeccion particular que vaya a tratarse, la via de administracion asf como por el criterio del

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medico tratante dependiendo de factores tales como la gravedad de la afeccion, la edad y estado general del paciente y similar. Los expertos en la tecnica pueden determinar facilmente dichas dosis.

Para administracion parenteral, los peptidos pueden formularse, por ejemplo, como una solucion, suspension, emulsion o polvo liofilizado en asociacion con un vetuculo parenteral farmaceuticamente aceptable. Como ejemplos de dichos vetuculos se incluyen agua, solucion salina, solucion de Ringer, solucion de dextrosa y albumina de suero humano al 5%. Tambien pueden utilizarse liposomas y vetuculos no acuosos tales como aceites no volatiles. El vetuculo o polvo liofilizado puede contener aditivos que mantengan la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol) y estabilidad qrnmica (por ejemplo, tampones y conservantes). La formulacion se esteriliza mediante tecnicas de uso habitual. Por ejemplo, una composicion parenteral adecuada para administracion por inyeccion se prepara disolviendo 1,5 % en peso de principio activo en solucion de cloruro de sodio al 0,9 %.

Las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento pueden administrarse como una sola dosis o en multiples dosis; administrarse bien como agentes terapeuticos individuales o en combinacion con otros agentes terapeuticos; y combinarse con terapias convencionales, que pueden administrarse secuencial o simultaneamente.

Los compuestos pueden administrarse en una formulacion de liberacion sincronizada, por ejemplo, una composicion que incluye un polfmero de liberacion lenta. Los compuestos activos pueden prepararse con transportadores que protegeran al compuesto contra a una liberacion rapida, tal como una formulacion de liberacion contralada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulado. Pueden utilizarse polfmeros biodegradables, biocompatibles, tales como etilenvinilacetato, poliantudridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, acido polilactico y copolfmeros de acido polilactico, poliglicolicos (PLG). Los expertos en la tecnica generalmente conocen muchos metodos para la preparacion de dichas formulaciones.

Los compuestos descritos en el presente documento pueden formularse en una composicion farmaceutica en la que el compuesto es el unico agente activo en su interior. Como alternativa, la composicion farmaceutica puede contener agentes activos adicionales. Ademas, el compuesto peptfdico puede combinarse con uno o mas agentes distintos que tienen efectos moduladores sobre la actividad del receptor de CGRP.

Otra utilidad

Los compuestos descritos en el presente documento son utiles in vitro como herramientas unicas para entender la funcion biologica de los receptores de CGRP, incluyendo la evaluacion de muchos factores a traves de la influencia, e influenciados por, la produccion de ligandos de efrina y procesos de union a receptores. Los presentes compuestos son tambien utiles en el desarrollo de otros compuestos que se unen a, y activan, receptores de CGRP, porque los presentes compuestos proporcionan informacion importante sobre la relacion entre la estructura y la actividad para facilitar dicho desarrollo.

Los compuestos tambien son utiles como aglutinantes competitivos en ensayos para explorar nuevos antagonistas de receptores de CGRP. En dichas realizaciones de ensayo, los compuestos descritos en el presente documento pueden utilizarse sin modificacion o pueden modificarse de diversas maneras; por ejemplo, marcando, tal como uniendo de manera covalente o no covalente, un grupo que proporciona directa o indirectamente una senal detectable. En cualquiera de estos ensayos, los materiales de los mismos pueden marcarse bien directa o indirectamente. Las posibilidades para el marcaje directo incluyen grupos marcadores tales como: radiomarcadores tales como 125I, enzimas (patente de Estados Unidos n.° 3.645.090) tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcadores fluorescentes (patente de Estados Unidos n.° 3.940.475) capaces de supervisar el cambio de densidad de fluorescencia, el desplazamiento de longitud de onda o polarizacion de fluorescencia. Las posibilidades del marcaje indirecto incluyen biotinilacion del constituyente seguido de union a avidina acoplada a uno de los grupos marcadores anteriores. Los compuestos tambien pueden incluir espaciadores o enlazadores en los casos en los que los compuestos se vayan a unir a un soporte solido.

La espectroscopfa de resonancia magnetica nuclear (RMN) se conoce por su capacidad para caracterizar estructuras macromoleculares y es una tecnica para investigar caractensticas tanto estaticas como transitorias de la union de ligandos a una molecula diana (Pellecchia, et al. 2002 Nature Rev Drug Disc 1: 211). La espectroscopfa RMN es una herramienta util para determinar la union de ligandos a moleculas diana, y tiene la ventaja de poder detectar y cuantificar interacciones con alta sensibilidad sin requerir un conocimiento previo de la funcion de las protemas. Ademas, la espectroscopia RMN puede proporcionar informacion estructural tanto sobre la diana como sobre el ligando para ayudar en la optimizacion posterior de aciertos de union debil en conductores de alta afinidad.

En las patentes de Estados Unidos n.° 5.698.401 y 5.804.390 se describen metodos de deteccion de union de un compuesto ligando con una biomolecula diana generando un primer y segundo espectros de correlacion de resonancia magnetica nuclear de biomoleculas diana que se han marcado uniformemente. El primer espectro se genera a partir de datos recogidos en la sustancia diana en ausencia de ligandos y el segundo en presencia de uno o mas ligandos. Una comparacion de los dos espectros permite determinar que compuestos en la mezcla de supuestos ligandos se une(n) con la molecula diana.

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Ademas, basandose en su capacidad para unirse selectivamente a receptores de CGRP, los peptidos descritos en el presente documento pueden utilizarse como reactivos para detectar selectivamente receptores de CGRP en celulas vivas, celulas fijadas, en fluidos biologicos, en homogeneizados tisulares, en materiales biologicos naturales purificados, etc.

Ejemplos

Para ilustrar adicionalmente las presentes realizaciones se proporcionan los siguientes ejemplos. Dichos ejemplos no pretenden limitar el alcance de las realizaciones.

Ejemplo 1

Utilizando un ensayo de flujo de calcio, la respuesta inhibidora dependiente de la dosis de los antagonistas peptfdicos de la presente invencion sobre un receptor de amilina, AMY1, se determino un complejo de receptor de CT (calcitonina)/RAMP1 (protema modificadora de la actividad del receptor). En el ensayo se empleo la lmea celular recombinante CHO-K1/AMY1/Gai5 (GenScript, Piscataway, NJ, catalogo n.° M00475). Las actividades antagonistas peptfdicas se ensayaron por duplicado a cinco concentraciones diferentes, comenzando con 1 pM y se diluyeron en serie cinco veces, en DMSO. Como un control positivo, en los ensayos se utilizo AC187 (SEQ ID NO: 55), un antagonista del receptor de amilina conocido (disponible, por ejemplo, en Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, catalogo n.° 3419) y como un control positivo, en los ensayos se utilizo a-CGRP humano, un agonista del receptor de amilina conocido (SEQ ID NO: 56), (disponible, por ejemplo, en Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, catalogo n.° 3012). Se utilizo el kit de ensayo FLIPR® Calcium 4 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Reactivos de control

El a-CGRP humano que tiene la secuencia de aminoacidos NH2-ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVG- SKAF-NH2(SEQ ID NO: 56) y AC187 que tiene la secuencia VLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSNTY (SEQ ID NO: 55) se emplearon como controles negativo y positivo, respectivamente. Adicionalmente, se diluyeron soluciones de reserva en tampon HBSS-HEPES para preparar soluciones de control final 5X.

Tabla 4: Reactivos de control

Compuesto de referencia

PM (g/mol) Solucion de reserva (disolvente) Pureza (%) Condicion de almacenamiento

a-CGRP

3787,32 2 mM (DMSO) 97,1 -20 °C

AC187

2849,17 50 mM (DMSO) 99,1 -20 °C

Otros reactivos

En la Tabla 5 se proporcionan otros materiales utilizados en el ensayo.

Tabla 5: Reactivos

Nombre

Fuente Numero de catalogo Numero de registro de la protema diana

CHO-K1/AMY1/Ga 15

Genscript M00475 NM 005855, NM 001742

Probenecid

Sigma P8761 N/A

Kit de ensayo FLIPR ® Calcium 4

Molecular Devices R8141 N/A

Preparacion del cultivo celular

Se sembraron celulas CHO-K1/AMY1/Ga15 en una placa de fondo transparente, de paredes negras, de 384 pocillos, a una densidad de 20.000 celulas/pocillo en 20 pl de medio de crecimiento 20 horas antes del dfa del experimento y se mantuvieron a 37 °C/CO2 5 %.

Protocolo del ensayo

Segun el protocolo del kit de ensayo, se anadio una solucion de carga colorante (a una concentracion final de 2X) en la placa de ensayo, 20 pl por pocillo. Se anadio solucion de compuesto (a una concentracion final de 5X) en la placa de ensayo, 10 pl por pocillo. La placa de ensayo se coloco en una incubadora a 37 °C durante 1 hora, y despues se dejo durante 15 min a TA. La placa con el agonista (a una concentracion CEs0 5x) se coloco en la Fuente 2. El tiempo de lectura total fue de 120 s. Se anadio agonista despues de una lectura de 20 segundos de la lmea basal y la senal de fluorescencia se capturo durante otros 100 segundos (21 s a 120 s).

En la exploracion, las celulas estimuladas con tampon de ensayo se seleccionaron como el fondo; las celulas estimuladas con agonista (a una concentracion CE90) se seleccionaron como control negativo.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina que tiene la estructura de Formula I:

   X1-Y1-Z1 (I),

   en la que X1 comprende X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO: 16),

   en la que X11 se selecciona del grupo que consiste en alanina (Ala), cistema (Cys) y glicina (Gly), y en la que

   X se selecciona del grupo que consiste en cistema (Cys) y serina (Ser), siempre que uno de X y X sea Cys;

   X13 se selecciona del grupo que consiste en arginina (Arg), asparagina (Asn), acido aspartico (Asp) y valina (Val);

   X14 se selecciona del grupo que consiste en leucina (Leu), fenilalanina (Phe) y treonina (Thr);

   X15 se selecciona del grupo que consiste en alanina (Ala), glicina (Gly) y serina (Ser);

   X16 se selecciona del grupo que consiste en alanina (Ala), isoleucina (Ile), leucina (Leu) y serina (Ser);

   X17 es Cys;

   y en la que Y1 es -Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn- (SEQ ID NO: 34); y Z1 es -Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 46).
2. 2. El antagonista de la reivindicacion 1, en la que:

   XI se selecciona del grupo que consiste en NH2-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Ala-Cys (SEQ ID NO: 17), NH2-Ala-Cys- Asp-Thr-Ala-Ser-Cys (SEQ ID NO: 18), NH2-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Val-Cys (SEQ ID NO: 19), NH2-Ala- Cys-Asn- Thr-Ala-Ala-Cys (SEQ ID NO: 20), NH2-Ala-Cys-Val-Leu-Gly-Ala-Cys (SEQ ID NO: 21), NH2-Ala-Cys-Arg-Phe- Gly-Ala-Cys (SEQ ID NO: 22), NH2-Ala-Cys-Asp-Leu-Ser-Ala-Cys (SEQ ID NO: 23), NH2-Ala-Cys-Asn-Leu-Ser- Ala- Cys (SEQ ID NO: 24), NH2-Cys-Ser-Asn-Thr-Ala-Ala-Cys (SEQ ID NO: 25), NH2-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Leu- Cys (SEQ ID NO: 26), NH2-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Ile-Cys (SEQ ID NO: 27), NH2-Ala-Cys-Asp-Leu-Ser-Val-Cys (SEQ ID NO: 30), NH2-Ala-Cys-Asn-Leu-Ser-Val-Cys (SEQ ID NO: 32) y NH2-Cys-Ser-Asn-Thr-Ala-Val-Cys (SEQ ID NO: 33).

   Y1 es -Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn- (SEQ ID NO: 34); y Z1 es -Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 46).
3. 3. El antagonista de la reivindicacion 2 que tiene la estructura:

   NH2-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Ala-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr- Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 1), NH2-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Ser-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser- Gln-Glu-Leu-His- Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 2), NH2-Ala- Cys-Asp-Thr-Ala-Val-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val- Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 3), NH2-Ala-Cys-Asn-Thr-Ala-Ala-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu- Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr- Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 4), NH2-Ala-Cys-Val- Leu-Gly-Ala-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser- Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 5), NH2-Ala-Cys-Arg-Phe-Gly-Ala-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His- Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn- Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 6), NH2-Ala-Cys-Asn-Leu-Ser- Ala-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala- Phe-NH2 (SEQ ID No: 7), NH2-Cys-Ser-Asn-Thr-Ala-Ala-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu- Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 8), NH2-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Leu-Cys- Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID No: 9), NH2-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Ile-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr- Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 10), NH2-Ala-Cys-Asn-Leu-Ser-Val-Cys-Val- Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 11), NH2-Cys-Ser-Asn-Thr-Ala-Val-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr- Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 12) o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
4. 4. El antagonista de la reivindicacion 1, que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, NH2-Ala-Cys-Asp-Leu-Ser-Ala- Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2 y NH2-Ala-Cys-Asp-Leu-Ser-Val-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Arg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn- Val-Gly- Ser-Lys-Ala-Phe-NH2.
5. 5. Una composicion farmaceutica que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. 6. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 5, para su uso en el tratamiento de cefalea.
7. 7. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 6, para su uso en el tratamiento de migrana.
8. 8. Un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en el tratamiento de una afeccion asociada a niveles aberrantes de CGRP.
9. 9. Un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina de la reivindicacion 8, para su uso en el 5 tratamiento de cefalea.
10. 10. Un antagonista del peptido relacionado con el gen de la calcitonina de la reivindicacion 9, para su uso en el tratamiento de migrana.