TWI568848B - 使用與ＣｒｙｌＡｂ組合之ＤＩＧ３殺蟲晶體蛋白管理歐洲玉米螟之抗性 - Google Patents

Description

使用與Cry1Ab組合之DIG3殺蟲晶體蛋白管理歐洲玉米螟之抗性

本發明係有關於使用與Cry1Ab組合之DIG3殺蟲晶體蛋白管理歐洲玉米螟之抗性。

發明背景

人類為了食物及能量應用而種植玉米。人類亦種植許多其它作物，其包括大豆及棉花。昆蟲會咬食並損害植物，因此會削弱人類的這些努力。每年已花費數十億美金以控制蟲害。且由於昆蟲造成的損害已額外損失數十億。雖然合成有機化學殺蟲劑一直是用以控制蟲害的主要方法，但是生物殺蟲劑(諸如衍生自蘇力菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)之殺蟲蛋白)在某些區域已扮演重要角色。經由使用Bt殺蟲蛋白基因進行變性以製造抗蟲性植物的能力已使現代農業產生革命性變革且提高殺蟲蛋白及其等之基因的重要性及價值。

迄今，業經用以產生該等抗蟲性基因轉殖的植物之數種Bt蛋白業經成功地註冊並商業化。這些包括用於玉米之Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F及Cry3Bb，用於棉花之Cry1Ac及Cry2Ab、及用於馬鈴薯之Cry3A。

除了在其中二種蛋白質之合併殺蟲系列為所欲(例如用於玉米之Cry1Ab及Cry3Ab經合併可分別提供抗鱗翅目蟲害及根蟲性)或其中該等蛋白質之獨立作用使其等可作為用於延緩感病昆蟲族群之抗性的形成的方法(例如 用於棉花之Cry1Ac及Cry2Ab經合併可提供烟草夜蛾幼蟲之抗性管理)之情況外，該等可表現這些蛋白質之市售產品能表現一單一蛋白質。SMART STAX為可合併數種Cry蛋白質之市售產品。亦見美國專利申請公開案第2008/0311096號，其部份係有關於用於控制Cry1F-抗性歐洲玉米螟(ECB；Ostrinia nubilalis(Hübner))的Cry1Ab。美國專利申請公開案第2010/0269223號係有關於DIG-3。

該等抗蟲性基因轉殖植物的快速並廣泛地採用已產生以下之爭議：害蟲族群對於藉這些植物而產生的殺蟲蛋白會形成抗性。為了保持以Bt為基礎之抗蟲性特徵的用途，已建議數種策略，其包括與一庇護方式組合以高劑量部署蛋白質、及交替或共同部署不同毒素(McGaughey等人(1998),“B.t.Resistance Management,”Nature Biotechnol.16：144-146)。

選用於一抗蟲性管理(IRM)堆疊的該等蛋白質必需可獨立運用其等的殺蟲效用，因此對於一蛋白質所形成的抗性並不會對第二種蛋白質產生抗性(亦即對於該等蛋白質並不會產生交叉抗性)。若，例如一經選用對於“蛋白質A”具抗性的害蟲族群對於“蛋白質B”具敏感性，則可得到以下結論：並無交叉抗性且蛋白質A與蛋白質B的組合能有效延緩對於蛋白質A單獨的抗性。

在抗性昆蟲族群之不存在下，可根據已假定與作用機制及交叉抗性潛力有關的其它特徵進行評估。已建議使用受體媒介性結合力以確認可能不會顯示交叉抗性的殺 蟲蛋白(van Melleart等人，1999)。本方法固有的交叉抗性之缺乏的主要預報因素在該等殺蟲蛋白並不會與一敏感性昆蟲物種內之受體競爭。

若兩Bt毒素競爭在一昆蟲內的相同受體，則若在該昆蟲內之受體突變，因此該等毒素中之一者不再與該體體結合且因此對該昆蟲不再具殺蟲性，則情況會變成該昆蟲對於該第二毒素(其可競爭性結合至相同受體)亦具抗性。亦即，該昆蟲對這兩種Bt毒性具交叉抗性。然而，若兩毒素與兩不同受體結合，則表示該昆蟲對於這兩種毒性不會同時具抗性。

額外的Cry毒素列示於官方B.t.命名委員會的網址(Crickmore等人；lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。目前有將近60種主群組之“Cry”毒素(Cry1-Cry59)，且具有另外的Cyt毒素與VIP毒素等。許多各以數字表示之群組具有大寫字母的亞組，且該等大寫字母的亞組具有小寫字母的副-亞組(例如Cry1具有A-L，且Cry1A具有a-i)。

發明概要

本發明部份係有關於以下意外的發現：DIG-3及Cry1Ab並不會爭奪在歐洲玉米螟(ECB；Ostrinia nubilalis (Hübner))腸細胞膜製劑中之結合位置。靠著本揭示文的有利條件，如熟悉本項技藝者所知，可使用能產生這些蛋白質(其包括全長蛋白質之殺蟲蛋白)的植物以延緩或預防對 這些殺蟲蛋白中之任一種單獨形成抗性。根據本發明，玉米為較佳適用的植物。就該等毒素對而言，ECB為較佳靶昆蟲。

因此，本發明部份係有關於使用與DIG-3蛋白組合之Cry1Ab蛋白質。可產生這些蛋白質之植物(及種植等植物的土地)係包括在本發明的範圍內。

本發明亦係部份有關於3種(或更多種)毒素之三種堆疊或“錐形體(pyramid)”，其中Cry1Ab及DIG-3係為底對。在某些較佳錐形體實施例中，該等特定毒素的組合可提供抗ECB之3個作用位置。某些較佳的“3個作用位置”錐形體組合包括該等蛋白質底對加上作為用於靶定ECB的第三蛋白質(自美國專利20080311096已知Cry1Ab能有效對抗Cry1Fa-抗性ECB)。例如根據本發明之本特定三重堆疊可有利地且令人意外地提供抗ECB的3個作用位置。其可有助於減少或去除對於庇護土地的需求。

雖然在文中被本發明形容為毒素之底對的Cry1Ab及DIG-3(其可一起成為一對或呈含3或多種毒素的“錐形體”形式)可提供玉米之抗ECB的抗蟲性，但是應該瞭解根據本發明亦較佳可在玉米使用含有Cry1Ab及DIG-3的其它組合。

圖式簡單說明

第1圖表示在得自玉米螟(Ostrinia nubilabis)之BBMV蛋白內之¹²⁵I Cry1Ab(0.5nM)的專一結合性%對藉未標記同源性Cry1Ab(˙)及異源性DIG-3(■)而進行之競爭的 比較。藉Cry1Ab而進行之同源性競爭的置換曲線可形成S型曲線，其表示於約0.5nM之Cry1Ab下的該放射性配位體之50%置換率。於100nM或較低的濃度(高於本鑑定法內之¹²⁵I Cry1Ab的濃度200倍)下，DIG-3並不能取代得自其結合位置的¹²⁵I Cry1Ab之任何結合性。僅於300 nM下我們的確發現藉DIG-3而使¹²⁵I Cry1Ab之結合性得到約25%置換率。這些結果表示DIG-3並不能有效地與Cry1Ab競奪位於得自玉米螟之BBMV’s內的受體位置之結合性。

序列簡單說明

序列辨識編號(SEQ ID NO)：1為全長Cry1Ab例示的蛋白質。(MR818)

序列辨識編號：2為全長DIG-3例示的蛋白質。

較佳實施例之詳細說明

本發明係部份有關於以下意外的發現：Cry1Ab及DIG-3並不會彼此競奪在歐洲玉米螟(ECB；Ostrinia nubilalis(Hübner))或秋行軍蟲(fall armyworm)(FAW；Spodoptera frugiperda)之腸子內的結合位置。因此，與DIG-3蛋白組合之Cry1Ab蛋白可較佳用於基因轉殖的玉米內以延緩或防止ECB對於這些蛋白質中之任一者單獨產生抗性。本蛋白質對可有效保護植物(諸如玉米植物)免於受Cry抗性ECB損害。亦即本發明之一用途為保護玉米及其它經濟上重要的植物物種免於藉可對Cry1Ab或DIG-3形成抗性的ECB族群而導致的損害及產率損失。

本發明因此教示一含Cry1Ab及DIG-3之可防止或減緩藉ECB而對這些蛋白質中之任一者或兩者所形成的抗性之抗蟲性管理(IRM)堆疊。

此外，雖然文中所揭示之本發明教示一用於防止藉ECB而對於這些蛋白質中之任一者或兩者所形成的抗性之含Cry1Ab及DIG-3的IRM堆疊，文中所揭示之本發明範圍包括Cry1Ab及DIG-3中之一者或兩者可單獨或一起經修飾以防止藉FAW而對這些蛋白質中之任一者或兩者所形成的抗性。

本發明提供用於控制鱗翅目蟲害之組成物，其包括能產生含Cry1Ab玉米毒素之蛋白質、及含DIG-3玉米毒素之蛋白質。

本發明進一步包含一經轉形可兼產生Cry1Ab殺蟲蛋白及DIG-3殺蟲蛋白的宿主，其中該宿主為一微生物或植物細胞。該等多核苷酸(群)較佳在一非蘇力菌啟動子(群)的控制下，存在於一基因建構體內。該等多核苷酸可包含用於填強在一植物內的表現性之密碼組合用法。

額外預期本發明可提供一控制鱗翅目蟲害之方法，其包括以有效量之含有Cry1Ab殺蟲蛋白且進一步含有DIG-3殺蟲蛋白的組成物接觸該等害蟲或害蟲之環境。

本發明之一實施例包括含一可將含DIG-3核心毒素之蛋白質編碼的植物可表現性基因、及一可將含Cry1Ab核心毒素之蛋白質編碼的植物可表現性基因之玉米植物、以及此種植物之種子。

本發明之另一實施例包含一玉米植物，其中一可將DIG-3殺蟲蛋白編碼的植物可表現性基因、及一可將Cry1Ab殺蟲蛋白編碼的植物可表現性基因業經滲入該玉米植物、及此種植物的種子內。

如在以下實例中所述，使用DIG-3及放射性標記的Cry1Ab之競爭性受體結合性研究顯示該DIG-3並不會競奪在Cry1Ab所結合之ECB組織內的結合性。這些結果亦表示Cry1Ab及DIG-3蛋白之組合為減緩ECB族群對於這些蛋白質中之任一者的抗性之形成的有效方法。因此，部份基於文中所述的資料，在IRM堆疊內可使用高劑量之DIG-3與Cry1Ab的共製造物(堆疊)以控制ECB。

亦可添加其它蛋白質至本對。例如本發明亦係部份有關於3種(或更多種)毒素之三重堆疊或“錐形體”，其中Cry1Ab及DIG-3為該底對。在某些較佳錐形體實施例中，該等特定毒素具有3個可對抗ECB之不同的作用位置。某些較佳的“3個作用位置”錐形體組合包括該等蛋白質之底對加上作為用於靶定ECB之第三蛋白質的Cry1Fa。根據本發明，這些特殊的三重堆疊可有利地且非可預期地提供3個可對抗ECB之作用位置。其可有助於減少或去除對於庇蟲土地的需求。“不同的作用位置”意一指所予蛋白質中之任一種並不能彼此引起交叉抗性。

因此，一部署的選用方法為使用該等與第三毒素/基因組合之蛋白質對，且使用本三重堆疊以減緩ECB對於這些毒素中之任一者的抗性之形成。因此，本發明亦係部 份有關於3種(或更多種)毒素的三重堆疊或“錐形體”。在某些較佳的錐形體實施例中，該等特定毒素具有3個可對抗ECB之不同作用位置。

本發明之部署的選用方法可包括使用該等蛋白質中之2、3、或更多種蛋白質在其中ECB可(或已知可)形成抗藥性族群的種植作物之區域內。

係將Cry1Fa部署在，例如Herculex^®及Smartstax^TM產物中。該等基因對(Cry1Ab及DIG-3)可以結合併成，例如一Cry1Fa產物，諸如Herculex^®及/或Smartstax^TM。因此，該等蛋白質對可顯著地減少對於這些及其它蛋白質的選擇壓力。該等蛋白質對可以以3種基因組合的形式用於玉米。

如上述，根據本發明亦可添加額外毒素/基因。例如就用於靶定ECB之Cry1Ab與Cry1Be的組合而言，見WO 2011/084631。就用於靶定ECB之Cry1Ab及Cry2Aa的組合而言，見WO 2011/075590。因此，Cry1Be及或Cry2Aa可用於(可視需要選用Cry1Fa)具有該等蛋白質對之多蛋白質堆疊。

本發明之範圍包括可產生該等蛋白質之組合的任一者之植物(及種植此等植物的土地)。亦可添加額外毒素/基因，但是上述特殊堆疊可有利且非可預期地提供多個抗ECB之作用位置。其可有助於減少或去除對於庇護土地的需求。因此本發明包括超過10英畝的種植農地。

亦可使用GENBANK以獲得文中所論述的基因及蛋白質中之任一者的序列。亦可使用植物。例如美國專利第5,188,960號及美國專利第5,827,514號描述適用於進行 本發明之含Cry1Fa核心毒素的蛋白質。美國專利第6,218,188號描述適用於本發明之含可將Cry1Fa核心毒素編碼之植物最佳化DNA序列的蛋白質。

亦可靶定與ECB有關的昆蟲。這些可包括天牛(stem borer)及/或莖穿孔昆蟲。該西南方玉米螟(Diatraea grandiosella(其係為異角亞目(Heterocera)的亞目))為一實例。甘蔗螟亦為玉米螟物種(Diatraea saccharalis)。亦可使用文中所述的蛋白質組合以靶定該標昆蟲之幼蟲期。鱗翅目成蟲(例如蝴蝶及蛾)主要以花蜜為食物且係為授粉之主要效應基因。幾乎所有鱗翅目的幼蟲(亦即毛蟲)係以植物為食物，且許多為嚴重的害蟲。毛蟲會吃植物的葉子或葉子的內部、或根部或莖部，剝奪植物之營養物並通常摧毁該植物之物理支撐結構。此外，毛蟲會吃水果、組織、及貯存的穀物與麵粉，毁壞這些欲銷售的產物或嚴重減少其價值。

本發明之某些嵌合毒素包含一Bt毒素之全N-末端核心毒素部份且於某情況下，超出該核心毒素蛋白的末端時，該蛋白質具有一可轉換成異源性前體毒素(protoxin)序列的區域。一Bt毒素之該N-末端、殺蟲活性毒素部份稱為“核心”毒素。自該核心毒素段轉變成該異源性前體毒素段的作用可大約發生在該毒素/前體毒素接合處或，另一者，可保有該天然前體毒素之一部份(其可延伸超出該核心毒素部份)，且可在下游處轉變成該異源性前體毒素部份。

典型的全長3結構域B.t.Cry蛋白為約130 kDa至150 kDa。Cry1Ab為一實例。DIG-3亦為3結構域毒素-大 小為約142 kDa。

作為一實例，本發明之一嵌合毒素為Cry1Ab之一全核心毒素部份(約1至601個胺基酸)及/或一異源性前體毒素(至該C-末端約602個胺基酸)。在一較佳實施例中，含該前體毒素之一嵌合毒素的該部份係衍生自Cry1Ab蛋白毒素。在一較佳實施例中，含該前體毒素之一嵌合毒素的該部份係衍生自Cry1Ab蛋白毒素。

熟悉本項技藝者可知Bt毒素(甚至在某一種類內，諸如Cry1B)之自核心毒素部份轉變成前體毒素部份的長度及精確位置可達某程度之不同。典型之全長Cry毒素的長度為約1150至約1200個胺基酸。該自核心毒素部份轉變成前體毒素部份的作用典型上係發生在該全長毒素之約50%至約60%之間。本發明該嵌合毒素可包括本N-末端核心毒素部份的全範圍。因此，該嵌合毒素可佔該全長Cry1蛋白質之至少約50%。其典型上可以是至少約590個胺基酸(且可包括600-650個或這樣的殘基)。就該前體毒素部份而言，該Cry1Ab前體毒素的全部範圍係自該核心毒素部份之末端延伸至該分子之C-末端。

基因及毒素。根據本發明之可用的基因及毒素不僅包括所揭示的該等全長序列，而且包括可保有文中明確例示之該等毒素之特徵殺蟲活性的這些序列、變體、突變體、及融合蛋白之片段。如文中使用，基因之該等“變形”或“變異體”係指可將相同毒素編碼或可將具有殺蟲活性之同等毒素編碼的核苷酸。如文中使用，該名詞“同等毒素”係指 具有相同或本質上相同之抗該等靶害蟲之生物活性的可作為所主張毒素的毒素。

如文中使用，根據““Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins,”N.Crickmore,D.R.Zeigler,J.Feitelson,E.Schnepf,J.Van Rie,D.Lereclus,J.Baum，及D.H.Dean.Microbiology and Molecular Biology Reviews(1998)Vol 62：807-813，該等範圍代表約95%(例如Cry1Ab的序列)、78%(Cry1A及Cry1B的序列)、及45%(Cry1的序列)序列相同度。亦可僅使用這些分子量截留至該等核心毒素。

熟悉本項技藝者應該知道可經由數種方法而確認並獲得可將活性毒素編碼的基因。可自沈積於一培養基儲存庫之分離物獲得文中例示之專一性基因或基因部份。亦可，例如藉使用基因合成器而合成性建構這些基因或其部份或變體，經由使用製造點突變之標準技術，可輕易地建構基因之變異體。而且，可使用市售核酸外切酶或核酸內切酶，根據標準程序製成這些基因的片段。例如可使用酶(諸如Bal31或部位導向之誘變以自這些基因之末端系統性切掉核苷酸。亦可使用多種限制酶以獲得可將活性片段編碼的基因。可使用蛋白酶以直接獲得這些蛋白質毒素之活性片段。

本發明之範圍包括可保有所例示毒素之殺蟲活性的片段及同等物。而且，由於該遺傳密碼之豐富，所以多種不同的DNA序列可將文中所揭示的胺基酸序列編碼。 熟悉本項技藝者有能力製造可將該等相同或基本上相同的毒素編碼之這些可替代的DNA序列。本發明之範圍包括這些變體DNA序列。如文中使用，凡提到“基本上相同”序列係指具有不會實質上影響殺蟲活性之胺基酸取代、刪除、添加或插入的序列。本定義亦包括可將能保有殺蟲活性之蛋白質編碼的基因之片段。

另一用於確認能將根據本發明之有用的該等毒素及基因部份編碼的基因之方法為經由使用寡核苷酸探針。這些探針為可偵測的核苷酸序列。可藉一合適的標記而偵測這些序列或如國際申請案第WO 93/16094中所述，製成具有固有的螢光性。如本項技藝所熟知，若該探針分子與核酸試樣係藉在彼等之間形成一強鍵而雜交，則可合理地假定該探針與試樣具有大同質性。較佳藉如，例如在Keller,G.H.,M.M.Manak(1987)DNA Probes,Stockton Press,New York,N.Y.,pp.169-170中所述的在本項技藝中已熟知的技術而在嚴苛條件下進行雜交作用。鹽濃度及溫度組合的某些實例如下(其係為了增加嚴密性)：於室溫下2X SSPE或SSC；於42℃下1X SSPE或SSC；於42℃下0.1X SSPE或SSC；於65℃下0.1X SSPE或SSC。該探針之偵測可提供用於使用已知方式測定雜交作用是否發生的方法。此種探針分析提供一用於確認本發明之可將基因編碼的毒素之快速方法。可使用DNA合成器及標準程序合成根據本發明之可作為探針的該等核苷酸片段。這些核苷酸序列亦可作為擴增本發明之基因的PCR起始質。

變種毒素。本發明之某些毒素在文中業經明確例示。由於這些毒素僅為本發明該等毒素的實例，所以應該可輕易瞭解本發明包含具有相同或類似於所例示毒素的殺蟲活性之變種或同等毒素(及為同等毒素編碼的核苷酸序列)。同等毒素可具有與一例示毒素同質的胺基酸。本胺基酸同質性典型上可大於75%、較佳大於90%、且最佳大於95%。在構成生物活性或涉及三維構形(其最終為該生物活性的主因)之測定的該毒素之臨界區域內，該胺基質同質性可最高。關於這方面，某些胺基酸取代係可接受且若這些取代係發生在對活性無關緊要的區域內或係為不會影響該分子之三維構形的保守型胺基酸取代，則這些胺基酸取代可預期。例如可將胺基酸安排在以下種類內：非極性、未帶電荷的極性、鹼性、及酸性。本發明之範圍包括其中一種類之一胺基酸係經相同類型之另一胺基酸取代的保守性取代，其限制條件為該取代不會實質上改變該化合物的生物活性。以下為屬於各種類之胺基酸實例的列示。

在某些實例中，亦可進行非保守性取代。該重要因素為這些取代必需不會顯著損害該毒素之生物活性。

重組型宿主。可將能將本發明該等毒素編碼之基 因導入多種微生物或植物宿主內。該毒素基因之表現性可直接或間導致該殺蟲劑之細胞內產生及維持。可使用結合轉移及重組型轉移以產生一能兼表現本發明之毒素的Bt菌株。其它宿主有機體亦可經該等毒素基因之一或兩者轉形，其等接著可用以達成加乘性效用。經由使用合適微生物宿主，例如假單孢菌屬(Pseudomonas)，可施加該等微生物至該蟲害之位置，於其中其等可增殖並被攝取。其結果為該蟲害之控制。或者，可在能延長該毒素之活性並安定化該細胞之條件下處理負責該毒素基因的微生物。然保有該毒素活性之該經處置細胞可施加至該靶害蟲之環境。

若該Bt毒素基因係經由一合適病媒而導入一微生物宿主內，且該宿主係以活的狀態施加至該環境，則必需使用某些宿主微生物。選擇已知可佔有一或多種相關作物之“植物圈(phytosphere)”(葉面(phylloplane)、葉表(phyllosphere)、根圍(rhizosphere)、及/或根面(rhizoplane))的微生物宿主。這些微生物經選擇可成功地與野生型微生物在該特殊環境(作物及其它昆蟲棲息地)進行競爭，因此可以穩定地維持並表現該能表現聚胜肽殺蟲劑的基因，且，較佳可更佳地保護該殺蟲劑免於環境的降解及失活。

已知有很多微生物可棲息於多種重要作物之葉面(植物葉子的表面)及/或根圍(包圍植物根部的土壤)。這些微生物包括細菌、藻類、及真菌。特別重要為微生物，諸如細菌，例如假單胞菌屬、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、黃色單胞 菌屬(Xanthomonas)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬(Rhizobium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌屬(Methylophilius)、原野菌屬(Agrobactenum)、酯酸菌屬(Acetobacter)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、關節桿菌屬(Arthrobacter)、定氮菌屬(Azotobacter)、白色念珠菌屬(Leuconostoc)、及產鹼桿菌屬(Alcaligenes)；真菌，特別是酵母菌，例如釀母菌屬(Saccharomyces)、隱球菌屬(Cryptococcus)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、擲胞酵母菌屬(Sporobolomyces)、紅串狀釀母菌屬(Rhodotorula)、及金擔子菌屬(Aureobasidium)。特別重要者為，諸如以下之植物圈細菌物種：紫丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、靈桿菌(Serratia marcescens)、木質醋酸菌(Acetobacter xylinum)、根瘤原野菌(Agrobactenium tumefaciens)、球狀紅假單胞菌(Rhodopseudomonas spheroids)、野油菜黃色單胞菌(Xanthomonas campestris)、草木樨根瘤菌(Rhizobium melioti)、富養產鹼桿菌(Alcaligenes entrophus)、葡萄園定氮桿菌(Azotobacter vinlandii)；及植物圈酵母物種，諸如深紅酵母(Rhodotorula rubra)、黏紅酵母(R.glutinis)、海濱紅酵母(R.marina)、橙黃紅酵母(R.aurantiaca)、白色隱球菌(Cryptococcus albidus)、液化隱球菌(C.diffluens)、羅倫隱球菌(C.laurentii)、羅斯釀母菌(Saccharomyces rosei)、布雷多釀母菌(S.pretoriensis)、啤酒釀母菌(S.cerevisiae)、羅西擲胞酵母菌(Sporobolomyces roseus)、香味擲胞酵母菌(S. odorus)、維羅納克魯維酵母菌(Kluyveromyces veronae、及普路蘭金擔子菌(Aureobasidium pollulans)。特別重要者為該等著色微生物。

可在能安定地維持並表現該基因的條件，使用方法以將能將一毒素編碼的Bt基因導入一微生物內。這些方法為熟悉本項技藝者所熟知且描述在，例如美國專利第5,135,867號中，該專利案在此併入本案以為參考資料。

細胞之處置。能表現該等Bt毒素之蘇力菌或重組型細胞可經處置以延長該毒素活性並安定化該細胞。所形成之殺蟲劑微膠囊的細胞狀結構內包含該Bt毒素或毒素群，該細胞狀結構業經安定化且當施加該微膠囊至該靶蟲害的環境時可保護該毒素。合適的宿主細菌可包括原核生物或真核生物，通常侷限於對於高等有機體(諸如哺乳動物)不會產生毒性物質的彼等細胞。然而，若該等毒性物質不穩定或施用量夠低，因此可避免對於一哺乳動物宿主產生毒性的可能時，可使用可對高等有機體產生毒性物質的有機體。作為宿主，特別重要者可以是原核生物及低等真核生物，諸如真菌。

雖然在某些情況下，可使用孢子，但是當經處置時，該細胞通常係完整的且實質上呈增生形式而非孢子形式。

可藉化學或物理方法、或藉化學及/或物理方法之組合而處置該微生物細胞，例如含該Bt毒素基因或基因群的微生物，但其限制條件為該技術並不會有害地影響該 毒素之性質，也不會減少細胞保護該毒素之能力。化學藥劑的實例為鹵化劑，特別為含第17-80號原子數的鹵素。更特別是，可在溫和條件下使用碘且費時足夠時間以獲得所欲結果。其它合適的技術包括經醛類(諸如戊二醛)處置；抗感染劑，諸如氯化殺藻胺(zephiran chloride)及氯化鯨蠟基吡錠；醇類，諸如異丙醇及乙醇；各種組織固定劑，諸如魯果氏碘(Lugol iodine)、布因氏固定劑(Bouin’s fixative)、各種酸類及海里氏固定劑(Helly’s fixative)(見：Humason,Gretchen L.,Animal Tissue Techniques,W.H.Freeman and Company,1967)；或當對該宿主環境投與時可保存並延長在該細胞內所產生的毒素之活性的物理(熱)及化學藥劑之組合)。物理方法的實例為短波長輻射，諸如γ輻射及X-輻射；冷凍；UV照射；凍乾等。用於處置微生物細胞的方法係揭示在美國專利第4,695,455號及第4,695,462號內，其等在此併入本案以為參考資料。

該等細胞通常可具有能增強對於環境條件之抗性的增強性結構安定性。若該殺蟲劑係呈純形式(proform)，應該選擇可藉該靶害蟲病毒而不會抑制該純形式形成該殺蟲劑之成熟形式的細胞處置方法。例如甲醛可交聯蛋白質且可抑制一多胜肽殺蟲劑之純形式的處理。該處置方法應該可保留該毒素之至少大部份的生物可利用性或生物活性。

就製法而言，在選擇一宿主細胞時的特別重要之特徵包括容易將該Bt基因或基因群導入該宿主內、表現系 統的可利用性、表現的效率、該殺蟲劑在宿主內的安定性、及輔助性遺傳能力的存在。作為一殺蟲劑微膠囊之相關特徵包括對於該殺蟲劑之防護性特質，諸如厚細胞壁、著色、及細胞內包裝或包涵體之形成；在水性環境內之存活；哺乳動物毒性之缺乏；害蟲對於攝食的誘引力；容易致死並固定且不會損害該毒性等。其它考慮因素包括容易調製及處理、經濟情況、貯存安定性等。

細胞之成長。可在任何方便的營養培養基內使含該Bt殺蟲基因或基因群的細胞宿主成長，其中該DNA結構物可提供一選擇性優點，其可得到一選擇性培養基，因此實質上所有或所有該等細胞可保有該Bt基因。然後可根據習知方法採集這些細胞。或者，可在採集前，處置該等細胞。

可使用標準技藝培養基及發酵技術培養可製造本發明該等毒素之Bt細胞。一旦完成該發酵周期，可藉首先使用本項技藝已熟知的方法而自該發酵肉湯分離該等Bt孢子及晶體而採集該等細菌。可藉添加表面活化劑、分散劑、惰性載劑、及可促進處理並對特定靶害蟲之施加的其它組份而將該等回收之Bt孢子及晶體調製成可濕粉末、液體濃縮液、顆粒或其它調配物。這些調配物及施加程序在本項技藝內係已為吾人所熟知。

調配物。可施加含一誘引劑及孢子、晶體、及該等Bt離析物的毒素之經調配餌顆粒、或含得自文中揭示之該等Bt離析物的基因之重組型微生物至土壤。亦可施加經 調配產物以作為於該作物周期之後階段的種子披衣或根部處置或總植物處置。藉與各種惰性材料(諸如無機礦物(頁矽酸鹽(phyllosilicate)、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等)或植物材料(粉末狀玉米穗軸、稻殼、胡桃殼等))混合，可使用含Bt細胞之植物及土壤處理物作為可濕粉末、顆粒或粉劑。該等調配物可包括展固劑佐劑、安定劑、其它殺蟲添加物、或表面活化劑。液體調配物可以是以水性為基礎或非水性且可呈泡沫、凝膠、懸浮液、可乳化濃縮物等形式使用。該等成份可包括流變劑、表面活化劑、乳化劑、分散劑、或聚合物。

如熟悉本項技藝者可知，根據該特定調配物的性質，特別是其是否為濃縮液、或欲直接使用，該殺蟲劑濃度可大不同。該殺蟲劑之存在量可以是至少1重量%且可以是100重量%。該等乾調配物可具有自約1-95重量%該殺蟲劑，且該等液體調配物可以通常是自1-60重量%該等呈液相的固體。該等調配物可通常具有自約10²至約10⁴個細胞/毫克。這些調配物之投與量可以是約50毫克(液體或乾)至1公或更多/每一公頃。

可藉噴撒、撒粉、噴淋等方法而施加該等調配物至鱗翅目蟲害之環境，例如葉子或土壤。

植物基因轉殖。用於製造本發明該等殺蟲蛋白之較佳重組型宿主為基因轉殖植物。可使用多種在本項技藝中已熟知的技術，將如上述之能將Bt毒素蛋白質編碼的基因插入植物細胞內。例如可使用很多含一在大腸桿菌 (Escherichia coli)內之一複製系統以及一可選擇該等基因轉殖細胞之標誌的選殖載體以製造能插入高等植物內之外來基因。該等載體尤其包含，例如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184。因此，可將具有能將該Bt毒素蛋白質之序列的該DNA片段插入該載體之一合適限制部位內。可使用所形成質體以轉變成大腸桿菌(E.coli)。在合適營養培養基因培養該等大腸桿菌細胞，然後採集並溶解。回收該質體。通常如分析方法進行序列分析、限制分析、電泳、及其它生化-分子生物學方法。於各次操作後，可分裂所使用該DNA序列並連接至下一DNA序列。可在相同或其它質體內選殖各質體序列。根據將所欲基因插入該植物內的方法，可能需要其它DNA序列。若，例如Ti或Ri質體係用於該植物細胞之基因轉殖，則該Ti或Ri質體T-DNA之右邊緣(但是通常為右邊緣及左邊緣)必需連接以作為欲插入之該基因的側翼區域。用於植物細胞之基因轉殖的T-DNA之用途業經密集研究且詳細地描述在EP 120 516,Lee and Gelvin(2008),Hoekema(1985),Fraley等人(1986)、及An等人(1985)中，且在本項技藝內係已被清楚地確認。

一旦該插入DNA在植物基因組內經整合，則其會相當穩定。該基因轉殖載體通常含有一可以使該等基因轉殖植物細胞對於殺蟲劑或抗生素(尤其，諸如畢拉草(Bialaphos)、卡那黴素(Kanamycin)、G418、愽萊黴素(Bleomycin)、或潮黴素(Hygromycin))形成抗性的可選擇性標誌。該各別使用之標誌因此可以選擇基因轉殖細胞，而 非不含該插入DNA之細胞。

可使用許多技術以將DNA插入一植物宿主細胞內。這些技術包括使用農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens)或農桿根群菌(Agrobacterium rhizogenes)作為基因轉殖劑之T-DNA進行基因轉殖、融合、注射、基因槍法(微粒子撞擊法)、或電子穿孔法以及其它可能的方法。若原野菌(Agrobacteria)係用於該基因轉殖，則欲插入之該DNA必需在特殊質體內經選殖，亦即在一中間載體內或在二元載體內經選殖，可藉同源性重組(由於序列與該T-DNA內之序列同源)而使該等中間載體在該Ti或Ri質體內整合。該Ti或Ri質體亦包含該T-DNA之轉殖所需的vir(毒性)區域。中間載體在原野菌內並不能複製本身。可藉一輔助質體而使該中間載體轉移入農桿腫瘤菌內(接合)。二元載體可兼在一大腸桿菌及原野菌內複製本身。其等包含一藉該等右及左T-DNA邊緣區域而建構的選擇標誌基因及連接體或多連接體。其等可直接在原野菌內基因轉殖(Holsters等人，1978)。該作為宿主細胞之原野菌必需包含一具有一vir區域的質體。該vir區域為使該T-DNA轉移入該植物細胞內所必需。可含有額外T-DNA。如此經基因轉殖的該細菌係用於植物細胞的基因轉殖。植物外植體最好可經農桿腫瘤菌或農桿根群菌培養以便使該DNA轉移入該植物細胞內。然後可自在一合適培養基(其可含有用於選擇的抗生素或殺蟲劑)內之經感染植物材料(例如葉片、莖段、根部、以及原生質體或經懸浮液培養的細胞)再生全植物。然後可測試如此獲得之植物 的插入DNA之存在。就注射法及電子穿孔法而言，該等質體並不需進行特殊處理。可使用普通質體，諸如pUC衍生物。

該等基因轉殖細胞可以以平常方式生長在該等植物內。其等可形成胚細胞並將該基因轉殖特徵傳遞至後代植物。可以以正常方式種植此等植物且經具有相同基因轉殖遺傳因子或其它遺傳因子之植物配種。所形成雜交個體具有對應表型性質。

在本發明之一較佳實施例中，植物可經其中該密碼子用法已為了用於植物而最佳化的基因轉殖。見，例如美國專利第5,380,831號，其在此併入本案以為參考資料。雖然某些截短的毒素在文中已例示，但是在該Bt技藝中已熟知130kDa-類型(全長)毒素具有-N-末端半部(其係為該核心毒素)、及一C-末端半部(其係為該前體毒素“尾”)。因此，合適“尾”可併用本發明經截短/核心毒素。見，例如美國專利第6,218,188號及美國專利第6,673,990號。此外，用於產生適用於植物之合成Bt基因在本項技藝中係已知(Stewart and Burgin,2007)。一較佳基因轉殖植物的非限制性實例為含一可將Cry1Ab蛋白編碼之植物可表現性基因且進一步含一可將Cry1Be蛋白編碼之第二植物可表現性基因的能育玉米植物。

可藉回交選擇育種法，例如藉回交法，而使該經Cry1Ab-及Cry1Be-決定的特徵(群)轉移(或基因滲入)入近交玉米系內。在本情況下，係首先使一所欲回交親本(recurrent parent)與具有適於該等經Cry1A-及Cry1Be-決定的 特徵之施體近交代(非回交親本)雜交。然後使本雜交之後代與該回交親本回交，繼而選擇所形成後代之欲自該非回交親本轉移的所欲特徵(群)。經過與該具有特定所欲特徵(群)之回交親本回交的3、較佳4、更佳5或更多代後，雖然該後代對於可控制欲轉移之特徵(群)的地點可具雜合性，但是對於大多數或幾乎所有其它基因而言，可如同該回交親本(見，例如Poehlman & Sleper(1995)Breeding Field Crops,第4版，172-175；Fehr(1987)Principles of Cultivar Development,Vol.1：Theory and Technique,360-376)。

抗蟲性管理(IRM)策略。例如Roush等人描述兩種用於管理殺蟲性基因轉殖作物之毒素策略，亦稱為“錐形體化”或“堆疊化”方法(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998)353,1777-1786)。

在其等之網址上，美國環保局(the United States Environmental Protection Agency(epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)公佈對於提供可併用能產生抗靶害蟲之單一Bt蛋白活性的非基因轉殖(亦即非-B.t.)庇護區(非-Bt作物/玉米之區塊)之以下需求。

“對於玉米螟-保護性Bt(Cry1Ab或Cry1F)玉米產物之專一性結構性需求如下：結構生庇護區：在玉米產區內之20%非鱗翅目的Bt玉米庇護區；在棉產區內之50%非鱗翅目的Bt庇護區

區塊

內(亦即在該Bt田間內)

外(亦即在該Bt田間之1/2英里(若可能，1/4英里)內的各別田間可以使無規雜交最大化)

田間狹長帶

狹長帶必需至少4排寬(較佳6排)以減少幼蟲遷移的影響”

此外，國家玉米種植者協會(the National Corn Growers Association)在他們的網址上：(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)

亦提供有關於該等庇護區需求的類似指示。例如：“該玉米螟IRM之需求：

- 種植你的玉米畝之至少20%以庇護雜種

- 在產棉區內，庇護區必需是50%

- 必需種植在該庇護雜種之1/2英里內

- 庇護區可經種植以作為該Bt田間內的狹長帶；該等庇護狹長帶必需至少4排寬

- 僅若靶昆蟲已達到經濟門檻，可使用習知殺蟲劑處理庇護區

- 以Bt為基礎的可噴撒殺蟲劑不能用在庇護玉米上

- 必需在每一具有Bt玉米之農場上種植合適庇護區”

如藉Roush等人所述(例如在第1780頁及第1784右列上)，兩不同蛋白質之堆疊法或錐形法各能有效對抗該等靶害蟲且由於幾乎沒有交叉抗性，所以可使用較小的庇護區。就成功的堆疊而言，Roush建議一就單一(非錐形化)特徵而言，小於10%庇護區之庇護區大小可提供與約50%庇護區類似的抗蟲性管理。就目前可用的錐形體化Bt玉米產物而言，美國環保局要求顯著小於單一特徵產物(通常20%)之可種植的非-Bt玉米的結構性庇護區(通常5%)。

如進一步藉Roush等人(如上述)、及美國專利第6,551,962號所論述，有各種能提供一庇護區之該等IRM效用的方法，其包括在該等田間(如上述)及在袋內種子混合物 中之各種幾何式種植圖案。

上述百分率、或類似庇護比可用於本發明該等雙或三重堆疊或錐形體。就具有3個抗單一靶害蟲之作用位置的三重堆疊而言，其目標可以是零庇護(或，例如小於5%庇護)。就，例如超過10英畝之商業土地而言，其特別為真。

文中參考或列舉之所有專利案、專利申請案、臨時申請案、及公開案的全文在此併入本案以為參考資料，其併入程度並不與本專利說明書之詳細教示一致。

除非有明確指定或暗示，該等名詞“一”、及“該”表示如文中所使用的“至少一”。

下文為闡明用於實踐本發明之程序。除非另有指定，這些實例不應被視為具限制性。所有百分率為重量比且所有溶劑混合物比例為體積比。所有溫度為攝氏度數。

實例 實例1-Cry1Ab蛋白之¹²⁵I標記化

Cry1Ab核心毒素之碘化反應。使Cry1Ab毒素(序列辨識編號：1)經胰蛋白酶活化並使用Iodo-Beads(Pierce)進行碘化。簡言之，兩個Iodo-Beads經500微升磷酸鹽緩衝鹽液(PBS(20 mM磷酸鈉、0.15 M NaCl,pH 7.5))清洗兩次，且放入在鉛屏背後之離心管內。添加100微升PBS於其中。在一罩內且經由使用合適放射活性處理技術，添加0.5 mCi Na¹²⁵I(17.4居里/毫克(Ci/mg),Amersham)至該具有Iodo-Bead的PBS溶液內。於室溫下使該等組份反應5分鐘，然後添加10微克高純度截短的Cry1Ab蛋白至該溶液並 再使其等反應5分鐘。藉自該等Iodo-Beads移除溶液而終止該反應，並將其施加至已在20 mM CAPS緩衝劑，pH 10.5+1 mM DTT內經平衡的0.5毫升除鹽Zeba旋轉柱(InVitrogen)內。使該Iodo-Bead各經10微升PBS清洗兩次且亦將該清洗液施加至該除鹽柱內。經由該除鹽柱，藉於1,000×g下進行離心，費時2分鐘而溶析該放射性溶液。藉SDS-PAGE、磷光體成像法及γ計數法而測定該放射性碘化Cry1Ab之放射純度。簡言之，係藉SDS-PAGE，使用4-20%三甘胺酸聚丙烯醯胺凝膠(1毫米厚，InVitrogen)而分離2微升該放射性蛋白質。分離後，遵照製造廠之使用說明書，使用BioRad凝膠乾燥裝置乾燥該等凝膠。藉將其等包在Mylar薄膜(12微米厚)內，並使其等暴露在Molecular Dynamics貯存磷光體螢幕(35厘米×43厘米)下，費時1小時而使該等乾燥凝膠成像。使用Molecular Dynamics Storm 820磷光成像器使該等板塊顯像並使用ImageQuant^TM軟體分析影像。該比活性為約4微居里/微克蛋白質。

實例2-BBMV製造方案

可溶性BBMV溶離份之製造及分級分離。使晚齡玉米螟幼蟲禁食一夜，然後在冰上冷凍15分鐘後，於清晨進行解剖。自體腔移除中腸組織，留下與體被連接的後腸。將該中腸放在9X體積之已如供應商所建議經稀釋之蛋白酶抑制劑混合劑¹(Protease Inhibitor Cocktail¹)(Sigma P-2714)增補的冰冷均質化緩衝劑(300 mM甘露醇、17 mM tris鹼，pH 7.5)內。使該組織經玻璃組織均質機之15次敲擊而均質化。藉Wolfersberger之MgCl₂沈澱法(1993)而製備BBMV溶離份。簡言之，使等量之24mM MgCl₂溶液在300 mM甘露醇內之溶液與該中腸均質混合，攪拌5分鐘並在冰上靜置15分鐘。於4℃下以2,500×g離心處理該溶液，費時15分鐘。保存上澄清液並使該小粒懸浮在原有體積之經0.5-X稀釋的均質化緩衝劑內並再進行離心處理。合併兩上澄清液，於4℃下以27,000×g離心30分鐘以形成該BBMV溶離份。使該小粒懸浮在經蛋白酶抑制劑增補的10毫升均質化緩衝劑內，並再於4℃下以27,000×g離心30分鐘以清洗該BBMV溶離份。使所形成小粒懸浮在BBMV貯存緩衝劑(10 mM HEPES,130 mM KCl,10%甘油，pH 7.4)內以達約3毫克/毫升蛋白質的濃度。藉使用具有牛血清白蛋白(BSA)作為標準物之Bradford方法(1976)而測定蛋白質濃度。在遵照製造商之使用說明，在將該等試樣冷凍前，使用該Sigma分析法進行鹼性磷酸酶測定法。在該BBMV分級分離法內之本標誌酶的比活性典型上比在該中腸均質溶離份內所發現的比活性高7倍。將該BBMV溶離份分成250微升整份之試樣，在液態N₂內驟冷凍並貯存於-80℃下。

實例3-測定¹²⁵I Cry1Ab蛋白對BBMV蛋白之結合性的方法

¹²⁵I Cry1Ab蛋白對BBMV蛋白的結合性。為了測定可用於該等結合性分析的BBMV蛋白之最適量，產生一飽和曲線。於28℃下，使用不同數量之BBMV蛋白，其範圍為在結合緩衝劑(8 mM NaHPO₄,2 mM KH₂PO₄,150 mM NaCl, 0.1%牛血清白蛋白，pH 7.4)內自0-500微克/毫升，培養¹²⁵I放射性標記Cry1Ab蛋白(0.5 nM)，費時1小時。總體積為0.5毫升。藉自1.5毫升離心管採樣3份各150微升該反應混合物並送入500微升離心管且於室溫下以14,000×g離心處理該等試樣，費時6分鐘而使結合性¹²⁵I Cry1Ab蛋白與未結合¹²⁵I Cry1Ab蛋白分離。溫和地移除上澄清液，並以冰冷結合性緩衝劑溫和地清洗小粒共3次。切掉含該小粒之該離心器的底部並放入13×75-毫米玻璃培養管內。各在該γ計數器內計算該等試樣，費時5分鐘。自背景計算(與任何蛋白質反應之計數)減掉該試樣所包含的計數並畫出與BBMV蛋白濃度比較的曲線。欲使用之蛋白質的最佳量經測定為每毫升0.15毫克BBMV蛋白。

為了測定結合性動力學，產生一飽和曲線。簡言之，於28℃下，以漸增濃度之¹²⁵I Cry1Ab毒素，範圍自0.01至10 nM，培育BBMV蛋白(150微克/毫升)，費時1小時。藉採樣3份各150微升濃度，並如上述進行該試樣之離心處理及計數而測定總結合性。除了添加1,000 nM之該同源性胰蛋白酶化非放射性Cry1Ab毒素至該反應混合物內以飽和所有非專一性受體結合位置不同外，以相同方式測定該非專一性結合性。以總結合性與非專一結合性之差異計算專一結合性。

使用每毫升150微克BBMV蛋白及0.5 nM該¹²⁵I放射性標記Cry1Ab蛋白進行同源性(Cry1Ab)及異源性(DIG-3)競爭結合性分析。Cry1Ab及DIG-3(序列辨識編號：2)係經胰蛋白酶活化且作為競爭蛋白。添加濃度範圍為自0.03至 1,000 nM之該競爭性非放射性標記Cry1Ab及DIG-3毒性至該反應混合物並同時添加該等毒素作為該放射性配位體以確保真實的結合性競爭。於28℃下培育1小時，且如上述測定已減掉非專一結合性之結合至其受體毒素的¹²⁵I Cry1Ab蛋白之數量。在無任何競爭配位體的存在下，測定出100%總結合性。其結果以總專一結合性%對所添加競爭性配位體的濃度畫出半對數曲線圖。

實例4-結果摘述

第1圖表示在得自玉米螟之BBMV蛋白內之¹²⁵I Cry1Ab(0.5 nM)的專一結合性%對藉未經標記同源性Cry1Ab(˙)及異源性DIG-3(■)而進行之競爭的比較圖示。藉Cry1Ab而進行之同源性競爭的置換曲線可得到一S型曲線，其表示於約0.5 nM之Cry1Ab下，該放射性配位體的50%置換率。於100 nM或更低的濃度(高於在本分析內之¹²⁵I Cry1Ab的濃度200倍)下，DIG-3自其結合位置並不能取代¹²⁵I Cry1Ab之任何結合性。僅於300 nM下，我們的確發現¹²⁵I Cry1Ab之結合性被DIG-3取代25%。這些結果表示DIG-3並不能與Cry1Ab有效地競爭對於在位於得自玉米螟之BBMV蛋白內的受體位置之結合性。

參考資料清單

Heckel, D. G., Gahan, L. J., Baxter, S. W., Zhao, J. Z., Shelton, A. M., Gould, F., and Tabashnik, B. E. (2007). The diversity of Bt resistance genes in species of Lepidoptera. J Invertebr Pathol 95, 192-197.

Luo, K., Banks, D., and Adang, M. J. (1999). Toxicity, binding, and permeability analyses of four bacillus thuringiensis cry1 delta-endotoxins using brush border membrane vesicles of spodoptera exigua and spodoptera frugiperda. Appl. Environ. Microbiol. 65, 457-464.

Palmer, M., Buchkremer, M, Valeva, A, and Bhakdi, S. Cysteine-specific radioiodination of proteins with fluorescein maleimide. Analytical Biochemistry 253, 175-179. 1997. Ref Type: Journal (Full)

Sambrook, J. and Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory).

Schlenz, M. L., Babcock, J. M., and Storer, N. P. Response of Cry1F-resistant and Susceptible European Corn Borer and Fall Armyworm Colonies to Cry1A. 105 and Cry12Ab2. DAI 0830, 2008. Indianapolis, Dow AgroSciences. Derbi Report.

Sheets, J. J. and Storer, N. P. Analysis of Cry1Ac Binding to Proteins in Brush Border Membrane Vesicles of Corn Earworm Larvae (Heleothis zea). Interactions with Cry1F Proteins and Its Implication for Resistance in the Field. DAI-0417, 1-26. 2001. Indianapolis, Dow AgroSciences.

Tabashnik, B. E., Liu, Y. B., Finson, N., Masson, L., and Heckel, D. G. (1997). One gene in diamondback moth confers resistance to four Bacillus thuringiensis toxins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 1640-1644.

Tabashnik, B. E., Malvar, T., Liu, Y. B., Finson, N., Borthakur, D., Shin, B. S., Park, S. H., Masson, L., de Maagd, R. A., and Bosch, D. (1996). Cross-resistance of the diamondback moth indicates altered interactions with domain II of Bacillus thuringiensis toxins. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2839-2844.

Tabashnik, B. E., Roush, R. T., Earle, E. D., and Shelton, A. M. (2000). Resistance to Bt toxins. Science 287, 42.

Wolfersberger, M. G. (1993). Preparation and partial characterization of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the gypsy moth (Lymantria dispar). Arch. Insect Biochem. Physiol 24, 139-147.

Xu, X., Yu, L., and Wu, Y. (2005). Disruption of a cadherin gene associated with resistance to Cry1Ac {delta}-endotoxin of Bacillus thuringiensis in Helicoverpa armigera. Appl Environ Microbiol 71, 948-954.

第1圖表示在得自玉米螟(Ostrinia nubilabis)之BBMV蛋白內之¹²⁵I Cry1Ab(0.5nM)的專一結合性%對藉未標記同源性Cry1Ab(˙)及異源性DIG-3(■)而進行之競爭的比較。藉Cry1Ab而進行之同源性競爭的置換曲線可形成S型曲線，其表示於約0.5nM之Cry1Ab下的該放射性配位體之50%置換率。於100nM或較低的濃度(高於本鑑定法內之¹²⁵I Cry1Ab的濃度200倍)下，DIG-3並不能取代得自其結合位置的¹²⁵I Cry1Ab之任何結合性。僅於300 nM下我們的確發現藉DIG-3而使¹²⁵I Cry1Ab之結合性得到約25%置換率。這些結果表示DIG-3並不能有效地與Cry1Ab競奪位於得自玉米螟之BBMV’s內的受體位置之結合性。

<110> 陶氏農業科學公司

<130> DAS-P0217

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1155

<212> PRT

<213> 蘇力菌

<400> 1

<210> 2

<211> 1256

<212> PRT

<213> 蘇力菌

<400> 2

Claims (7)

1. 一種製備含有一Cry1Ab殺蟲蛋白及一DIG-3殺蟲蛋白的一基因轉殖植物之方法，該方法包含以一編碼該Cry1Ab殺蟲蛋白的序列辨識編號：1之多核苷酸及一編碼該DIG-3殺蟲蛋白的序列辨識編號：2之多核苷酸來轉形該植物，其中該Cry1Ab殺蟲蛋白及該DIG-3殺蟲蛋白不共用在歐洲玉米螟(ECB)內的一結合位置。
2. 如申請專利範圍第1項之方法，該方法進一步包含以編碼一第三殺蟲蛋白的一DNA來轉形該植物，該第三殺蟲蛋白係選自於由Cry1Fa、Cry1Be及Cry2Aa所組成之群組。
3. 如申請專利範圍第2項之方法，該方法進一步包含以編碼一第四殺蟲蛋白的一DNA來轉形該植物，該第四殺蟲蛋白係選自於由Cry1Be及Cry2Aa所組成之群組，其中該第三殺蟲蛋白為Cry1Fa蛋白。
4. 一種藉由一昆蟲來管理對一Cry蛋白抗性之發展的方法，該方法包含產生多個植物，該多個植物包含多個如申請專利範圍第1項所述之含有一Cry1Ab殺蟲蛋白及一DIG-3殺蟲蛋白的基因轉殖植物及多個非Bt庇護植物，且使該等非Bt庇護植物佔該多個植物的5%-40%。
5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該多個植物佔有超過10畝。
6. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該多個植物係選自於由玉米、大豆及棉所組成的群組。
7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該多個植物為玉米植物。