TWI545132B

TWI545132B - 人類化抗－ＴＡＵ（ｐＳ４２２）抗體及使用方法

Info

Publication number: TWI545132B
Application number: TW103144676A
Authority: TW
Inventors: 費歐娜古納格; 蓋喬治絲; 歐勒夫曼迪格; 麥可許洛梅; 本德波爾曼; 尤里奇高佛特; 喬治班斯; 胡伯特凱騰伯格
Original assignee: 赫孚孟拉羅股份公司
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2016-08-11
Also published as: US9562091B2; JP2017502034A; WO2015091656A1; PE20161032A1; CA2932958A1; SI3083680T1; PT3083680T; JP6608827B2; US20170129949A1; CN105899533B; EA201600473A1; HK1223953A1; BR112016013562A2; LT3083680T; EP3083680B1; TW201630933A; IL245862A0; CN105899533A; HRP20200384T1; ES2778498T3

Description

人類化抗-TAU(pS422)抗體及使用方法

本發明係關於人類化抗-Tau(pS422)抗體，其特異性結合至SEQ ID NO：03之磷酸化Tau片段；及其治療大腦疾病之用途。

人類Tau(微管相關蛋白Tau(神經元纖維纏結蛋白、成對螺旋纖絲-Tau，PHF-Tau))為主要存在於軸突中之神經元微管相關蛋白且用於促進微管蛋白聚合及穩定微管。人類大腦中存在八種同功異型物(同功異型物A、B、C、D、E、F、G、胎兒-Tau)，最長的同功異型物包含441個胺基酸(同功異型物F，Uniprot P10636-8)。亦由Reynolds,C.H.，等人，J.Neurochem.69(1997)191-198描述Tau及其特性。

呈Tau過磷酸化形式之Tau為成對螺旋纖絲(PHF)之主要組分、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease，AD)大腦中之神經元纖維病變之構建塊。Tau可藉由數種不同激酶在其絲胺酸或蘇胺酸殘基處磷酸化，該等激酶包括GSK3β、cdk5、MARK及MAP激酶家族成員。

Tau蛋白病藉由Tau之異常過磷酸化表徵且根據Iqbal,K.，等人(Biochim.Biophys.Acta 1739(2005)198-210)為：

‧阿茲海默症，包括該疾病之僅纏結形式

‧唐氏症候群(Down syndrome)，成人病例

‧關島型帕金森氏症癡呆綜合症(Guam Parkinsonism dementia complex)

‧拳擊員癡呆

‧皮克氏病(Pick disease)

‧嗜銀粒性癡呆

‧額顯葉型癡呆

‧皮質基底核退化症

‧蒼白球-腦橋-黑質退化症

‧進行性核上麻痺

‧具有纏結之傑茨曼-斯脫司勒-史茵克疾病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)。

迄今為止已在來自阿茲海默氏病大腦之Tau中發現幾乎40個絲胺酸(S)/蘇胺酸(T)磷酸化位點(Hanger,D.P.，等人，J.Biol.Chem.282(2007)23645-23654)。阿茲海默氏病中之Tau病變之發展與其磷酸化狀態相關。然而，40個磷酸化位點中之大部分與疾病病變無關，因為其亦存在於自健康胎兒大腦組織提取之Tau中。僅少量磷酸化對疾病病況而言是唯一的且大概為定義阿茲海默症大腦之PHF中之Tau的異常聚集及特殊不可溶性的原因(Morishima-Kawashima,M.，等人，J.Biol.Chem.270(1995)823-829)。根據Pei,J.J.，等人(J.Alzheimer's Disease 14(2008)385-392)，現存文獻提供關於此等對AD大腦具有特異性的位點之有限且不清楚的資訊。Pei使用Tau磷酸化特異性抗體之清單且量測其在來自22個AD患者及10個對照組之內側顯葉皮層勻漿中之含量。

Bussiere,T.，等人(Acta Neuropathol.97(1999)221-230)描述Tau蛋白上之磷酸化絲胺酸422為在伴隨神經元纖維退化之數種疾病中發現的病理性抗原決定基。Augustinack,J.C.，等人，(Acta Neuropathol.103(2002)26-35)將pS422描述為與阿茲海默氏病中之神經元病變之嚴重程度相關。Guillozet-Bongaarts,A.,(J.Neurochem.97(2006)1005-1014)將絲胺酸422處之Tau磷酸化描述為PHF之成熟過程的一部分。亦發現Tau pS422與阿茲海默氏病之各種轉殖基因小鼠模型之病變發展有關聯。因此，Deters,N.，等人在Biochem.Biophys.Res.Commun.379(2009)400-405中提到雙轉殖基因Dom5/pR5小鼠展示含有使病理性S422抗原決定基特異磷酸化之Tau的海馬神經元數量提高7倍。Goetz,J.，等人，(Science 293(2001)1491-1495)報導在注射有Abeta42原纖維之Tau P301L轉殖基因小鼠大腦中出現在S422處磷酸化之Tau。

EP 2 009 104係關於來自阿茲海默氏病PHF之Tau蛋白中以磷酸化狀態存在之Tau蛋白之抗原決定基及該抗原決定基之用途，其用於產生特異性偵測阿茲海默症Tau蛋白之抗體。WO 2002/062851及US 7,446,180係關於對異常截短形式之Tau蛋白具有特異性之抗體及關於阿茲海默氏病及相關Tau蛋白病之診斷性及治療性態樣。

WO 98/22120係關於一種治療患有阿茲海默氏病之患者的方法，其包含向患者投與針對具有胺基酸約207至約222、胺基酸約224至約240及胺基酸約390至約408之磷酸化Tau片段之抗體的步驟。Asuni,A.A.，等人，J.Neuroscience 27(2007)9115-9129中提到使用磷酸化Tau片段379-408[P-Ser396,404]來對Tau轉殖基因小鼠進行疫苗接種之動物研究。US 2008/0050383係關於藉由投與Tau蛋白片段來在個體體內治療及預防阿茲海默氏病或其他Tau蛋白病的方法。

Hasegawa,M.，等人(FEBS Lett.384(1996)25-30)報導對微管相關蛋白tau中之磷絲胺酸422具有特異性之單株抗體(AP422)。

在WO 01/55725中報導了特異性識別tau之抗體及特異性識別磷酸化tau(181)之抗體，其用於活體內診斷tau蛋白病及/或活體內鑑別診斷tau蛋白病與非tau蛋白病之方法中。

在WO 02/027017中報導了自具有磷酸化絲胺酸之多肽免疫原製備之抗體。WO 02/062851係關於對異常截短形式之Tau蛋白具有特異性的抗體及關於阿茲海默氏病及相關Tau蛋白病之診斷性及治療性態樣。

在WO 2004/016655中報導了對中樞神經系統(CNS)Tau蛋白具有特異性之抗體，其中該抗體特異性識別CNS tau蛋白而非周邊tau蛋白，且其中該抗體特異性識別在由編碼tau蛋白之基因之外顯子4編碼的胺基酸序列與由其外顯子5編碼的胺基酸序列之間的結締部分之胺基酸序列作為抗原決定基。

針對Tau pS422之單株抗體描述於例如EP 1 876 185中。針對Tau pS422之多株抗體為市售可得的(例如ProSci Inc.及Biosource International)。

在WO 2006/055178中報導了一種用於抑制tau蛋白在Ser202/Thr205處之磷酸化的方法，該方法包含使含有tau蛋白之樣品與結合澱粉狀蛋白β衍生可擴散配位體之抗體或抗原結合片段接觸，從而抑制tau蛋白在Ser202/Thr205處之磷酸化。

WO 2007/019273中報導了特異性結合至在tyr394及/或tyr310處磷酸化之tau之抗體製劑。Asuni,A.A.等人，J.Neuroscience 27(2007)9115-9129中提到使用磷酸化Tau片段379-408[P-Ser396,404]來對Tau轉殖基因小鼠進行疫苗接種之動物研究。

EP 2 009 104係關於來自阿茲海默氏病PHF之Tau蛋白中以磷酸化狀態存在之Tau蛋白之抗原決定基及該抗原決定基之用途，其用於產生特異性偵測阿茲海默症Tau蛋白之抗體。

US 2008/0050383係關於藉由投與Tau蛋白片段來在個體體內治療及預防阿茲海默氏病或其他Tau蛋白病的方法。

在WO 2010/037135中報導了經分離之合成或重組多肽或肽，該多肽或肽包含第一域，其包含血腦障壁(BBB)受體或等效物之配位體或由其組成；及第二域，其包含減慢蛋白質聚集體之聚集速率、抑制蛋白質聚集體之形成或逆轉、分解或溶解蛋白質聚集體的酶或組合物或由其組成。WO 2010/115843中報導了一種抗體，尤其單株抗體或其功能性部分，其能夠識別且活體外及/或活體內結合tau蛋白。

在WO 2011/026031中報導了特異性結合tau寡聚物且不會結合可溶性tau或tau原纖維之單株抗體或其片段，其適用於治療tau蛋白病，例如阿茲海默氏病、進行性核上麻痺及皮質基底核退化症。WO 2011/053565中報導了一種分離抗體，其特異性結合在Ser(238)及Thr(245)中之一或多者處磷酸化之人類tau蛋白。

在WO 2012/045882中報導了特異性結合至哺乳動物Tau蛋白上之磷酸化抗原決定基之抗體，其適用於治療諸如tau蛋白病之神經退化性疾病且適用於治療或緩解認知缺陷。WO 2012/049570中報導了人類單株抗tau抗體或其tau結合片段。WO 2012/106363中報導了一種在個體體內預防或治療阿茲海默氏病或其他tau蛋白病之方法，其包含向需要阿茲海默氏病或其他tau蛋白病療法之人類投與抗體，該等抗體對異常形式之tau蛋白具有特異性，該抗體展示不結合一般tau蛋白及/或對一般tau蛋白無反應，且其係在能有效地預防或治療阿茲海默氏病或其他tau蛋白病之條件及量下投與。

WO 2012/149365中報導了展示與聚集tau有反應且實質上與非聚集Tau無反應之抗體，其中聚集tau包含至少兩個在一或多個半胱胺酸殘基處直接或經由連接子彼此交聯之tau蛋白。

WO 2010/142423中報導了適用於治療例如阿茲海默症之Tau蛋白病之組合物，其包含與Tau結合之抗體、在特定位置處與特異磷酸化Tau及其片段特異性結合之經磷酸化絲胺酸修飾的化合物及載體。

EP 1 876 185 A中報導了識別磷酸化多肽之抗體。WO 2013/151762中報導了人類化tau抗體。WO 2014/016737中報導了針對人類磷酸化tau之新穎的雞單株抗體及其用途。WO 2014/016737中報導了針對人類磷酸化tau之新穎的雞單株抗體及其用途。WO 2012/149365中報導了對病理性tau二聚物及前纖維病理性tau寡聚物具有選擇性之抗體及其在治療、診斷及監測tau蛋白病中之用途。

本發明提供抗人類Tau(pS422)抗體，尤其人類化抗人類Tau(pS422)抗體，及使用該等抗體之方法。

如本文所報導之人類化抗體無法藉由標準人類化方法獲得。需要將非標準突變引入胺基酸序列中以便獲得具有與親本兔抗體可比較的結合特徵之人類化抗體，該親本兔抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：07及SEQ ID NO：11之可變域。此為尤其重要的，因為如本文所報導之抗體意欲穿過人類血腦障壁且在人類大腦內起作用。因此，選擇人類化抗體之一般應用準則不夠嚴格以至於無法直接應用於當前情況中。

如本文所報導之一個態樣為特異性結合至人類Tau(pS422)之(人類化)抗體，其中該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau。

如本文所報導之抗體展示相對於在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau，相對於非磷酸化野生型人類Tau及Tau突變體S422A具有選擇性。非磷酸化野生型人類Tau及Tau突變體S422A完全不結合或分別具有較低的親和力。

如本文所報導之一個態樣為特異性結合至人類Tau(pS422)之(人類化)抗體，其特徵在於該抗體包含a)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、18及10之HVR，或b)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR。

在一個實施例中，該抗體包含a)在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR，或b)在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：12、05及15之HVR。

在一個實施例中，該抗體包含a)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、18及10之HVR，及在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR，或b)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR，及在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：12、05及15之HVR，或c)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR，及在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR。

在一個實施例中，該抗體包含a)SEQ ID NO：20之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域，或b)SEQ ID NO：19之重鏈可變域及SEQ ID NO：16之輕鏈可變域，或c)SEQ ID NO：19之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域，或d)SEQ ID NO：21之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域。

在一個實施例中，該抗體用於治療阿茲海默氏病。

在一個實施例中，該抗體為效應功能靜默。在一個實施例中，該抗體不具有效應功能。在一個實施例中，該抗體屬於人類IgG1之子類別且在兩條重鏈中均具有突變L234A、L235A及P329G(根據Kabat之EU索引進行編號)。

在一個實施例中，該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體。

在一個實施例中，該抗體具有以下之EC₅₀值a)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或b)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或c)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或d)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau為125ng/mL或125ng/mL以下。

在一個實施例中，該抗體特異性結合至人類Tau(pS422)(SEQ ID NO：02)且不會結合至人類Tau(SEQ ID NO：01)。

在一個實施例中，該抗體為單株抗體。

在一個實施例中，該抗體為抗體片段，其結合至人類Tau(pS422)且 i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段，EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

在一個實施例中，該抗體為a)人類子類別IgG1之全長抗體，或b)人類子類別IgG4之全長抗體，或c)具有突變L234A、L235A及P329G之人類子類別IgG1之全長抗體，d)具有突變S228P、L235E及P329G之人類子類別IgG4之全長抗體，e)在兩條重鏈中均具有突變L234A、L235A及P329G且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C且在相應另一重鏈中具有突變T366S、 L368A、Y407V及Y349C之人類子類別IgG1之全長抗體，f)在兩條重鏈中均具有突變S228P及P329G且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C且在相應另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類別IgG4之全長抗體。

如本文所報導之一個態樣為(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體，其特徵在於a)該抗體包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)該可變域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：10之HVR，ii)該恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)該恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)該抗體包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)該可變域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之HVR，ii)該恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau (SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段，EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

如本文所報導之一個態樣為(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體，其特徵在於a)該抗體包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)該可變域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09及SEQ ID NO：10之HVR，ii)該恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)該恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)該抗體包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)該可變域包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：05及SEQ ID NO：15之HVR，ii)該恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及 c)該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段，EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

如本文所報導之一個態樣為(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體，其特徵在於a)該抗體包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)該可變域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09及SEQ ID NO：10之HVR，ii)該恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及 iii)該恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)該抗體包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)該可變域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之HVR，ii)該恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段，EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

如本文所報導之一個態樣為(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體，其特徵在於a)該抗體包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：20，ii)該恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)該恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)該抗體包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：17，ii)該恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段，EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或 viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

如本文所報導之一個態樣為(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體，其特徵在於a)該抗體包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：19，ii)該恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)該恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)該抗體包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：16，ii)該恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段，EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

如本文所報導之一個態樣為(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體，其特徵在於a)該抗體包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：19，ii)該恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)該恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)該抗體包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：17，ii)該恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或 iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段，EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

如本文所報導之一個態樣為(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體，其特徵在於a)該抗體包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：21，ii)該恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)該恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)該抗體包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：17，ii)該恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段，EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

在所有態樣之一個較佳實施例中，抗人類Tau(pS422)抗體之特徵在於該抗體在重鏈可變域中位置4、24及78處具有纈胺酸殘基。

在所有態樣之一個較佳實施例中，抗人類Tau(pS422)抗體之特徵在於該抗體在重鏈可變域中位置71處具有精胺酸殘基。

如本文所報導之一個態樣為編碼如本文所報導之(人類化)抗體之經分離核酸。

如本文所報導之一個態樣為包含如本文所報導之核酸之宿主細胞。

如本文所報導之一個態樣為一種產生(人類化)抗體之方法，其包含培養如本文所報導之宿主細胞以產生抗體之步驟。

在一個實施例中，該方法進一步包含自細胞或培養基回收抗體之步驟。

如本文所報導之一個態樣為一種醫藥調配物，其包含如本文所報導之(人類化)抗體及醫藥學上可接受之載劑。

在一個實施例中，醫藥調配物進一步包含額外治療劑。

在一個實施例中，該額外治療劑為抗澱粉狀蛋白治療劑。在一個實施例中，抗澱粉狀蛋白治療劑為抗人類α突觸核蛋白抗體或抗Aβ抗體。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗體，其用作藥劑。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗體，其用於治療阿茲海默氏病。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗體，其用於治療前驅性阿茲海默氏病。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗體，其用於治療輕度阿茲海默氏病。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗體，其用於減輕Tau(pS422)誘發之神經退化。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗體，其用於維持認知及功能。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗體，其用於減慢認知及功能減退速率。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗體，其用於減慢神經元纖維纏結積聚速率。

在前述態樣之一個實施例中，該用途為藉由清除Tau(pS422)來減輕神經元纖維纏結負荷。

在前述態樣之一個實施例中，該用途為預防神經元纖維纏結累積。

在前述態樣之一個實施例中，該用途為移除/清除神經原纖維纏結。

在一個實施例中，預防及/或移除為促進Tau聚集體之胞內清除。

在前述態樣之一個實施例中，該用途為抑制神經元纖維纏結擴散。在一個實施例中，抑制為預防病理性Tau形式/種源在神經元內轉移。

本發明之態樣亦為治療方法，其包含投與如本文所報導之(人類化)抗體從而治療阿茲海默氏病，從而治療前驅性阿茲海默氏病，從而治療輕度阿茲海默氏病，從而減輕Tau(pS422)誘發之神經退化，從而維持認知及功能，從而減慢認知及功能減退速率，及/或從而減慢神經元纖維纏結積聚速率。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗體之用途，其用於製造藥劑。

在一個實施例中，該藥劑用於治療阿茲海默氏病。

在一個實施例中，該藥劑用於治療前驅性阿茲海默氏病。

在一個實施例中，該藥劑用於治療輕度阿茲海默氏病。

在一個實施例中，該藥劑用於減輕Tau(pS422)誘發之神經退化。

在一個實施例中，該藥劑用於維持認知及功能。

在一個實施例中，該藥劑用於減慢認知及功能減退速率。

如本文所報導之一個態樣為治療患有阿茲海默氏病之個體的方法，其包含向該個體投與有效量之如本文所報導之(人類化)抗人類 Tau(pS422)抗體。

如本文所報導之一個態樣為一種在個體中減輕Tau(pS422)誘發之神經退化的方法，其包含向該個體投與有效量之如本文所報導之(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體以減輕Tau(pS422)誘發之神經退化。

如本文所報導之一個態樣為一種在個體中維持認知及功能之方法，其包含向該個體投與有效量之如本文所報導之(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體以維持認知及功能。

如本文所報導之一個態樣為一種在個體中減慢認知及功能減退之速率的方法，其包含向該個體投與有效量之如本文所報導之(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體以減慢認知及功能減退速率。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體在減輕Tau(pS422)誘發之神經退化中的用途。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體在維持認知及功能中的用途。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體在減慢認知及功能減退速率中的用途。

如本文所報導之抗體可用於治療阿茲海默氏病。

使用如本文所報導之(人類化)抗體可實現抑制/減輕阿茲海默氏病之惡化及神經病理學。

如本文所報導之(人類化)抗體可用於防止阿茲海默氏病發展或甚至用於終止阿茲海默氏病之惡化。

在一個實施例中，如本文所報導之(人類化)抗體i)結合至Tau(pS422)轉殖基因小鼠及阿茲海默氏病患者大腦切片上的Tau(pS422)；及/或在Tau(pS422)轉殖基因細胞中標記Tau(pS422)。

如本文所報導之(人類化)抗體可用於治療阿茲海默氏病。

如本文所報導之一個態樣為特異性結合至人類Tau(pS422)中之胺基酸序列SEQ ID NO：03的(人類化)抗體。

如本文所報導之(人類化)抗體特異性結合至/識別早期及晚期疾病相關形式之人類Tau(pS422)。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗體之用途，其用於預防人類Tau(pS422)相關阿茲海默氏病擴散。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗體之用途，其用於減少溶酶體膜崩解。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗體之用途，其用於針對人類Tau(pS422)誘發之不穩定及/或崩解穩定溶酶體膜。

如本文所報導之一個態樣為如本文所報導之(人類化)抗體之用途，其用於阻止阿茲海默氏病惡化。

如本文所報導之(人類化)抗體藉由細胞之間人類Tau(pS422)接種及擴散之抗體介導性抑制來起作用。

如本文所報導之(人類化)抗體藉由結合至人類Tau(pS422)來保護溶酶體免於原纖損傷。

序列簡單說明

SEQ ID NO：01人類Tau蛋白同功異型物F(441個殘基)

SEQ ID NO：02在位置422處之絲胺酸殘基處磷酸化之人類Tau蛋白同功異型物F(441個殘基)

SEQ ID NO：03在位置7(對應於SEQ ID NO：01之位置422)處具有磷酸化絲胺酸之人類Tau蛋白片段(SEQ ID NO：01之殘基416至430)：Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO₃H₂)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp

SEQ ID NO：04兔抗體086 CDRL1-QSSQSVRTNKLA

SEQ ID NO：05兔抗體086 CDRL2-SASTLDF

SEQ ID NO：06兔抗體086 CDRL3-LGYFDCSIADCVA

SEQ ID NO：07兔抗體086 VL00

SEQ ID NO：08兔抗體086 CDRH1-SNAIN

SEQ ID NO：09兔抗體086 CDRH2-YIAVSGNTYYASWAKG

SEQ ID NO：10兔抗體086 CDRH3-SNI

SEQ ID NO：11兔抗體086 VH00

SEQ ID NO：12人類化CDRL1變體1-RSSQSVRTNKLA

SEQ ID NO：13人類化CDRL1變體2-RSSQSVRTNRLA

SEQ ID NO：14人類化CDRL2變體1-SASTLDY

SEQ ID NO：15人類化CDRL3變體1-LGYFDSSADIVA

SEQ ID NO：16人類化VL變體1-VL21

SEQ ID NO：17人類化VL變體2-VL22

SEQ ID NO：18人類化CDRH2-YIAVSGNTYYADSVKG

SEQ ID NO：19人類化VH變體1-VH32

SEQ ID NO：20人類化VH變體2-VH20

SEQ ID NO：21人類化VH變體3-VH33

SEQ ID NO：22人類化CDRL2變體2-SASTLQS

SEQ ID NO：23人類化CDRL2變體3-SASTLES

SEQ ID NO：24人類化CDRL3變體2-LGYFDSSIADSVA

SEQ ID NO：25人類化CDRL3變體3-LGYFDSSIADRVA

SEQ ID NO：26人類化CDRL3變體4-LGYFDPSIADPVA

SEQ ID NO：27人類化CDRL3變體5-LGYFDSSIADIVA

SEQ ID NO：28人類化CDRL3變體6-LGYFDPSADPIA

SEQ ID NO：29人類化CDRL3變體7-LGYFDPSADPVA

SEQ ID NO：30人類化CDRL1變體3-RASQGVRTNKLA

SEQ ID NO：31人類化CDRL1變體4-RASQSVRTNKLA

SEQ ID NO：32人類化VL變體4-VL01

SEQ ID NO：33人類化VL變體5-VL09

SEQ ID NO：34人類化VL變體6-VL12

SEQ ID NO：35人類化VL變體7-VL15

SEQ ID NO：36人類化VL變體8-VL16

SEQ ID NO：37人類化VL變體9-VL17

SEQ ID NO：38人類化VL變體10-VL19

SEQ ID NO：39人類化VL變體11-VL28

SEQ ID NO：40人類化VL變體12-VL33

SEQ ID NO：41人類化VL變體13-VL35

SEQ ID NO：42人類化VL變體14-VL39

SEQ ID NO：43人類化VL變體15-VL40

SEQ ID NO：44人類化VL變體16-VL41

SEQ ID NO：45人類化VL變體17-VL42

SEQ ID NO：46人類化VH變體4-VH01

SEQ ID NO：47人類化VH變體5-VH02

SEQ ID NO：48人類化VH變體6-VH03

SEQ ID NO：49人類化VH變體7-VH04

SEQ ID NO：50人類化VH變體8-VH14

SEQ ID NO：51人類化VH變體9-VH15

SEQ ID NO：52人類化VH變體10-VH18

SEQ ID NO：53人類化VH變體11-VH19

SEQ ID NO：54人類化VH變體12-VH22

SEQ ID NO：55人類化VH變體13-VH23

SEQ ID NO：56人類化VH變體14-VH24

SEQ ID NO：57人類化VH變體15-VH31

圖1：兔及人類化輕鏈可變域之序列比對；CDR加框。

圖2(A)及圖2(B)：兔及人類化重鏈可變域之序列比對；CDR加框。

圖3：不同組合的人類化VH及VL與(A)磷酸化tau肽、(B)磷酸化全長人類tau、(C)非磷酸化tau肽、(D)非磷酸化全長人類tau之生物化學結合；(1)=VH00/VL00，(2)=VH32/VL21，(3)=VH20/VL22，(4)=VH32/VL22，(5)=VH33/VL22；塗佈濃度：磷酸化tau肽：50ng/ml，所有其他靶材：1μg/ml；(若用1μg/ml塗佈磷酸化tau肽，則獲得可比較的結果(資料未示出))。

圖4：不同組合的人類化VH及VL與(A)=全長人類tau S422A突變體、(B)=聚集人類Tau(pS422)之生物化學結合；(1)=VH00/VL00，(2)=VH32/VL21，(3)=VH20/VL22，(4)=VH32/VL22，(5)=VH33/VL22；塗佈濃度：磷酸化tau肽：50ng/ml，所有其他靶材：1μg/ml；(若用1μg/ml塗佈磷酸化tau肽，則獲得可比較的結果(資料未示出))。

圖5：西方墨點法，其展示所選人類化VH/VL組合之選擇性；(1)=VH00/VL00，(2)=VH32/VL21，(3)=VH20/VL22，(4)=VH32/VL22，(5)=VH33/VL22。

圖6：結合至阿茲海默氏病患者大腦提取物中之過磷酸化tau；(1)=VH00/VL00，(2)=VH32/VL21，(3)=VH32/VL22。

I. 定義

出於本文之目的，「接受體人類構架」為包含衍生自如以下所定義之人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「衍生自」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10個或10個以下、9個或9個以下、8個或8個以下、7個或7個以下、6個或6個以下、5個或5個以下、4個或4個以下、3個或3個以下、或2個或2個以下。在一些實施例中，VL接受體人類構架序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架在序列上一致。

「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和的強度。除非另外指示，否則如本文所使用之「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間的1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(kd)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所描述之方法)量測親和力。量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例描述於下文中。

「親和力成熟」抗體係指在一或多個高變區中具有一或多個改變之抗體，相較於在一或多個高變區(HVR)中不具有一或多個改變之親本抗體，此等改變使抗體對抗原之親和力得到提高。

術語「抗人類Tau(pS422)抗體」及「結合至人類Tau(pS422)之抗體」係指能夠以足夠親和力結合人類Tau(pS422)以使得抗體適用作靶向人類Tau(pS422)之診斷劑及/或治療劑的抗體。在一個實施例中，抗人類Tau(pS422)抗體與不相關非人類Tau(pS422)蛋白之結合程度小於該抗體與人類Tau(pS422)之結合程度的約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。

本文中之術語「抗體」以最廣泛意義使用且包涵各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展示所需抗原結合活性即可。

「抗體片段」係指不同於完整抗體之分子，其包含結合完整抗體所結合之抗原的完整抗體之部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。

與參考抗體「結合至相同抗原決定基之抗體」係指在競爭分析中，阻斷參考抗體與其抗原50%或50%以上之結合的抗體，且相反地，在競爭分析中，參考抗體阻斷該抗體與其抗原50%或50%以上之結合。在一個實施例中，與參考抗體結合至相同抗原決定基之抗體阻斷參考抗體與其抗原50%或50%以上之結合。在一個實施例中，與參考抗體結合至相同抗原決定基之抗體阻斷參考抗體與其抗原80%或80%以上之結合。在一個實施例中，與參考抗體結合至相同抗原決定基之抗體阻斷參考抗體與其抗原90%或90%以上之結合。在一個實施例中，與參考抗體結合至相同抗原決定基之抗體阻斷參考抗體與其抗原95%或95%以上之結合。在一個較佳實施例中，與參考抗體結合至相同抗原決定基之抗體在抗原上對與參考抗體相同的殘基具有結合相互作用。

術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分衍生自特定來源或物種，同時重鏈及/或輕鏈之其餘部分衍生自不同來源或物種之抗體。

抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。存在五個主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等抗體中之若干者可進一步分成亞類(同型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、γ及μ。

「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性，其隨抗體類別變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。

藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在必需劑量下且持續必需時間有效達成所需治療或防治結果之量。

本文中之術語「Fc區」用於定義含有至少一部分恆定區之免疫球蛋白重鏈之C端區。該術語包括天然序列Fc區及變異Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH出版物91-3242中所描述。

「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基外的可變域殘基。可變域之FR一般由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，在VH(或VL)中HVR及FR序列一般以以下順序出現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用來指結構實質上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。術語「全長抗體」指示由藉由雙硫鍵連接之兩個抗體輕鏈多肽及兩個抗體重鏈多肽組成之多聚多肽，其中在兩個抗體重鏈多肽中可存在或不存在C端離胺酸殘基(K)。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉化體」及「轉化細胞」，其包括初級轉化細胞及自其衍生之後代(不考慮繼代次數)。後代與母細胞之核酸含量可能不完全相同，但可能含有突變。本文包括針對原始轉化細胞篩選或選擇具有相同功能或生物活性之突變體後代。

「人類共同構架」為表示所選人類免疫球蛋白VL或VH構架序列中最常出現之胺基酸殘基之構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之亞群。一般而言，序列亞群為如Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版， Bethesda MD(1991),NIH出版物91-3242，第1卷至第3卷中之亞群。在一個實施例中，對於VL，亞群為如Kabat等，前述中之亞群κI。在一實施例中，對於VH，亞群為如Kabat等人，前述中之亞群III。

「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且典型地兩個可變域之實質上全部，其中全部或實質上全部HVR(例如CDR)均對應於非人類抗體之HVR，且全部或實質上全部FR均對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含衍生自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指以經歷人類化之抗體。

如本文所使用之術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中在序列中高變(「互補決定區」或「CDR」)及形成結構上定義為環(「高變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原接觸點」)之各區域。一般而言，抗體包含六個HVR；三個在VH(H1、H2、H3)中，且三個在VL(L1、L2、L3)中。

本文中之HVR包括(a)出現在胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處之高變環(Chothia,C.及Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；(b)出現在胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)處之CDR(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH出版物91-3242)；(c)出現在胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)處之抗原接觸點(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；及(d)(a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)及94-102(H3)。

除非另外指示，否則在本文中根據Kabat等人，前述對可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)進行編號。

「免疫結合物」為與一或多個異源分子結合之抗體。

「個體(individual)」或「個體(subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，該個體(individual)或個體(subject)為人類。

「經分離之」抗體為已與其天然環境之組分分離之抗體。在一些實施例中，抗體純化達到大於95%或99%之純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細電泳法)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於評定抗體純度之方法之綜述，參見例如，Flatman,S.等人，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。

「經分離之」核酸係指已與其天然環境之組分分離之核酸分子。經分離核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含有的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或不同於其天然染色體位置之染色體位置處。

「編碼抗人類Tau(pS422)抗體之經分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，包括單一載體或各別載體中之此類核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置處之此類核酸分子。

如本文所使用之術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體之群體獲得之抗體，亦即除可能變異抗體(例如含有天然存在之突變或在產生單株抗體製劑期間產生之變異抗體，此等變體通常以較小量存在)之外，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。相比於典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體之特性為獲自實質上均質的抗體群體，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，待根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法，製得單株抗體之此類方法及其他例示性方法描述於本文中。

「天然抗體」係指具有不同結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體醣蛋白，其由二硫鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，繼而三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，繼而恆定輕鏈(CL)域。抗體輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種，兩種類型稱為κ及λ。

術語「藥品說明書」用於指通常包括於治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌之資訊及/或與使用該等治療性產品有關之警告。

相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且引入空位(若需要)以達到最大序列一致性百分比之後，且不將任何保守性取代視為序列一致性之部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以處於此項技術內的各種方式實現，例如使用公開可獲得的電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可測定適於比對序列之參數，包括在所比較序列之全長內實現最大比對所需的任何算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.設計，且原始程式碼已與使用說明書一起在美國版權局(U.S.Copyright Office)(Washington D.C.,20559)存檔，其中其以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程序可自Genentech,Inc.,South San Francisco,California公開獲得或可由原始程式碼編譯。ALIGN-2程序應經編譯以用於包括數位UNIX V4.0D之UNIX操作系統上。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定且並不變化。

在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，如下計算既定胺基酸序列A對於、與或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者，其可表述為對於、與或相對於既定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%的既定胺基酸序列A)：100乘分數X/Y

其中X為藉由序列比對程序ALIGN-2對A與B進行該程序比對時評為一致匹配的胺基酸殘基數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基之總數目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A與B之胺基酸序列一致性%將不等於B與A之胺基酸序列一致性%。除非另外特定陳述，否則本文所使用之所有胺基酸序列一致性%值如緊接前述段落中所描述使用ALIGN-2電腦程式獲得。

術語「醫藥調配物」係指呈准許其中所含活性成分之生物活性有效之形式，且不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之其他組分的製劑。

「醫藥學上可接受之載劑」係指除活性成分外的醫藥調配物中之成分，其對個體無毒。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

如本文所使用之術語「人類Tau(pS422)」係指天然人類Tau(pS422)(UniProt P37840)。該術語包涵「全長」、未經處理之人類Tau(pS422)以及由在細胞中處理產生之任何形式之人類Tau(pS422)。該術語亦包涵天然存在之人類Tau(pS422)之變體，例如，突變體、剪接變體或對偶基因變體。人類Tau(pS422)之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：02中。

如本文所使用之「治療(treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療之個體之自然病程的臨床介入且可用於預防或在臨床病理學之病程期間進行。治療之所需作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發，緩解症狀，減輕疾病之任何直接或間接病理性結果，預防癌轉移，減緩疾病惡化速率，改善或緩和疾病病況及緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明抗體用於延遲疾病發展或減慢疾病惡化。

術語「可變區」或「可變域」係指參與抗體結合抗原之抗體重鏈域或輕鏈域。天然抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)之可變域一般具有類似的結構，其中各域均包含四個保守性構架區(FR)及三個高變區(HVR)。(參見例如，Kindt,T.J.等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007)，第91頁)。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體的VH域或VL域來分離，以分別篩選互補VL域或VH域之集合庫。參見例如，Portolano,S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人，Nature 352(1991)624-628)。

如本文所使用之術語「載體」係指能夠繁殖其所連接之另一核酸之核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體及在已引入該載體之宿主細胞之基因組中所併入的載體。某些載體能夠主導以可操作方式所連接之核酸的表現。此類載體在本文中稱作「表現載體」。

II. 組合物及方法

A. 例示性人類化抗人類Tau(pS422)抗體

如本文所報導之人類化抗體無法藉由標準人類化方法獲得。需要在胺基酸序列中引入非標準突變，以便獲得具有與親本兔抗體可比擬的結合特性之人類化抗體。此點尤其重要，因為如本文所報導之抗體意欲穿過人類血腦障壁且在人類大腦內起作用。因此，選擇人類化抗體之一般應用準則不夠嚴格以至於無法直接應用於當前情況中。

已發現，為了獲得適合且可發展的人類化抗體，兩個在CDRL3(輕鏈CDR3)中形成二硫橋鍵之半胱胺酸必須分別被絲胺酸及異白胺酸置換。除確保相同CDRL3之恰當定向以外，亦使存在於兔CDRL3中間的異白胺酸殘基缺失，從而產生比親本兔CDRL3少一個胺基酸殘基之人類化CDRL3。

進一步發現在重鏈中位置4、24及78處保持三個纈胺酸胺基酸殘基為有利的。在不受此理論束縛之情況下，假定需要此等殘基確保恰當呈現重鏈可變區之抗原結合環。另外，在位置71處之精胺酸殘基之存在為有利的。

不同人類化輕鏈可變域之序列比對展示於圖1中。不同人類化重鏈可變域之序列比對展示於圖2中。如本文所使用之所有編號係基於Kabat可變域編號方案。

在下表中，展示分別與人類化重鏈可變域VH14及VH20組合之兔輕鏈可變域之不同人類化變體的特徵。結合搭配物為人類Tau(pS422)。

參考值VH00與VL00(兔抗體)：

25℃：kd=2.6E-04；t/2=44min。

37℃：ka=3.7E+04，kd=5.25E-03，KD=1.4E-08，t/2=22 min。

在下表中展示分別與人類化輕鏈可變域VL17及VL19組合之兔輕鏈可變域之不同人類化變體的特徵。

參考值VH00與VL00(兔抗體)：

25℃：kd=2.6E-04；t/2=44min。

37℃：ka=3.7E+04，kd=5.25E-03，KD=1.4E-08，t/2=22 min。

在下表中展示不同VH/VL組合之動力學常數。

人類化VH與VL之不同組合之生物化學結合展示於圖3及圖4中。

在下表中展示不同VH/VL組合之結合特異性(EC50值以[ng/ml]為單位)。

所選人類化VH/VL組合對人類tau突變體S422A之敏感性可見於圖5中所展示之西方墨點。所有人類化變體均選擇性地結合至在S422處磷酸化之人類tau。存在對親本兔抗體之非S422磷酸化抗原決定基的低水準x反應性，但所展示之人類化變體在此方面與親代兔抗體相比具有較低的交叉反應。

在圖6中展示親代兔抗體及所選人類化抗人類Tau(pS422)抗體結合至阿茲海默氏病患者大腦提取物中之PHF-tau。

下表概述所選人類化VH/VL組合之生物特性。

在一個態樣中，本發明提供包含至少一個或兩個或三個或四個或五個或六個HVR之(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體，該等HVR選自：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：08；(b)HVR-H2；其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；及(f) HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15。

在一個態樣中，本發明提供包含至少一個或兩個或三個或四個或五個或六個HVR之(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體，該等HVR選自(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：08；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：09；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：05；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15。

在一個態樣中，本發明提供包含至少一個或兩個或三個或四個或五個或六個HVR之(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體，該等HVR選自(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：08；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：09；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15。

在一個態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列的(人類化)抗體：i)(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：08；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；或 ii)(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：08；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：09；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10。

在一個實施例中，該抗體包含i)(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：08；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；或ii)(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：08；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：09；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10。

在另一實施例中，該抗體進一步包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：i)(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15，或ii)(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：05；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15。

在另一實施例中，該抗體包含i)(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15，或ii)(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：05；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15。

在一個態樣中，本發明提供(人類化)抗體，其包含 i)(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：08；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15，或ii)(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：08；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：09；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：05；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15，或iii)(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：08；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：09；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15。

在另一實施例中，VH或VL含有相對於參考序列之取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗人類Tau(pS422)抗體保留結合至人類Tau(pS422)之能力。

在本發明之另一態樣中，根據以上實施例中之任一者之抗人類Tau(pS422)抗體為單株抗體，包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一個實施例中，抗人類Tau(pS422)抗體為抗體片段，例如，Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')₂片段。在另一實施例中，抗體為全長抗體，例如完整IgG1或IgG 4抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。

如本文所報導之(人類化)抗體降低轉殖基因TauPS2APP小鼠大腦中之Tau(pS422)含量。

在另一態樣中，根據以上實施例中之任一者之(人類化)抗人類Tau(pS422)抗體可單獨或以組合形式併有如以下部分1-7中所描述之特徵中之任一者：

1. 抗體親和力

在某些實施例中，本文所提供之抗體之解離常數(KD)為100nM，50nM或在1nM與100nM之間(例如10^-7M或10^-7M以下，例如10^-7M至10^-9M)。

在一個實施例中，藉由放射性標記抗原結合分析(RIA)量測Kd。在一個實施例中，用相關抗體之Fab型式及其抗原進行RIA。舉例而言，藉由在未經標記抗原滴定系列存在下使Fab與最小濃度之經(¹²⁵I)標記之抗原平衡，隨後用經抗Fab抗體塗佈之盤捕捉結合抗原來量測FAB對抗原之溶液結合親和力(參見例如Chen,Y.等人，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。為了確立分析條件，將MICROTITER^®多孔盤(Thermo Scientific)用50mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5μg/ml捕捉抗Fab抗體(Cappel Labs)塗佈隔夜，且隨後在室溫(約23℃)下用含2%(w/v)牛血清白蛋白之PBS阻斷兩小時至五小時。在無吸附劑盤(Nunc #269620)中，將100pM或26pM[¹²⁵I]抗原與相關Fab之連續稀釋液混合(例如與Presta,L.G.等人，Cancer Res.57(1997)4593-4599中之抗VEGF抗體Fab-12之評定一致)。隨後培育相關Fab隔夜；然而，可持續培育較長時間(例如約65小時)以確保達到平衡。此後，在室溫下將混合物轉移至捕捉盤中以用於培育(例如持續一個小時)。隨後移除溶液且用含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20^®)之PBS洗滌盤八次。當盤乾燥時，添加150微升/孔之閃爍體(MICROSCINT-20^TM；Packard)，且在TOPCOUNT^TM γ計數器(Packard)上對盤計數10分鐘。選擇提供小於或等於20%最大結合之各Fab的濃度用於競爭性結合分析。

根據另一實施例，使用BIACORE^®表面電漿子共振分析量測Kd。舉例而言，使用BIACORE^®-2000或BIACORE^®-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，在25℃下用固定抗原CM5晶片以約10反應單位(RU)進行分析。在一個實施例中，根據供應商之說明書，用N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)來活化羧基甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5,BIACORE,Inc.)。用10mM乙酸鈉pH 4.8將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，隨後在5微升/分鐘之流動速率下注射以獲得大約10個反應單位(RU)之偶合蛋白質。在抗原注射後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應之基團。關於動力學量測，在25℃下，以約25μl/min之流動速率在含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)界面活性劑之PBS(PBST)中注射Fab兩倍連續稀釋液(0.78nM至500nM)。使用簡單一對一朗繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model)(BIACORE^®評估軟體版本3.2)藉由同時擬合締合及解離感測器圖譜來計算締合速率(k_on)及解離速率(k_off)。以k_off/k_on比率來計算平衡解離常數(Kd)(參見例如Chen,Y.等人，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。若藉由上文的表面電漿子共振分析測定之締合速率超過10⁶M^-1 s^-1，則締合速率可使用螢光淬滅技術量測，該技術在如光譜儀(諸如具有攪拌式光析槽之止流裝備型光譜光度計(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-AMINCO^TM光譜光度計(ThermoSpectronic))中所量測之濃度增加之抗原存在下、在25℃下量測含20nM抗-抗原抗體(Fab形式)之PBS(pH 7.2)之螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)之增加或減少。

2. 抗體片段

在某些實施例中，本文所提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、Fv及scFv片段，及下文所描述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134。關於scFv片段之綜述，參見例如 Plueckthun,A.，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore(編)，Springer-Verlag,New York(1994)，第269-315頁中；亦參見WO 93/16185、US 5,571,894及US 5,587,458。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基且活體內半衰期延長之Fab及F(ab')₂片段之論述，參見US 5,869,046。

雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可為二價或雙特異性抗體片段。參見例如EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134；及Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(20039129-134)中。

單域抗體為包含抗體之全部或部分重鏈可變域或全部或部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如US 6,248,516)。

抗體片段可藉由各種技術製得，包括(但不限於)蛋白分解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生，如本文所描述。

3. 人類化抗體

典型地，對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)衍生自非人類抗體，且FR(或其部分)衍生自人類抗體序列。人類化抗體視情況將亦包含人類恆定區之至少一部分或全長人類恆定區。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如HVR殘基所衍生自之抗體)之相應殘基取代以例如恢復或提高抗體特異性或親和力。

人類化抗體及其製得方法綜述於例如Almagro,J.C.及Fransson,J., Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，且進一步描述於例如Riechmann,I.等人，Nature 332(1988)323-329；Queen,C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321及US 7,087,409；Kashmiri,S.V.等人，Methods 36(2005)25-34(描述特異性測定區(SDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述「表面再塑」)；Dall'Acqua,W.F.等人，Methods 36(2005)43-60(描述「FR改組」)；及Osbourn,J.等人，Methods 36(2005)61-68及Klimka,A.等人，Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述FR改組之「導引選擇」方法)中。

可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之構架區(參見例如Sims,M.J.等人，J.Immunol.151(1993)2296-2308)；衍生自具有輕鏈或重鏈可變區之特定亞群之人類抗體共同序列的構架區(參見例如Carter,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；及Presta,L.G.等人，J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro,J.C.及Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；及來源於篩選FR集合庫之構架區(參見例如Baca,M.等人，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684及Rosok,M.J.等人，J.Biol.Chem.271(19969 22611-22618)。

4. 多特異性抗體

在某些實施例中，本文所提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對人類Tau(pS422)且另一者係針對任何其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至人類Tau(pS422)之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段。

用於製得多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共同表現具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein,C.及Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540,WO 93/08829，及Traunecker,A.等人，EMBO J.10(1991)3655-3659)及「杵-臼(knob-in-hole)」工程改造(參見例如US 5,731,168)。多特異性抗體亦可由以下製得：用於製得抗體Fc-雜二聚分子之工程改造靜電轉向效應(WO 2009/089004)；交聯兩種或兩種以上抗體或片段(參見例如US 4,676,980及Brennan,M.等人，Science 229(1985)81-83)；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny,S.A.等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用製得雙特異性抗體片段之「雙功能抗體」技術(參見例如Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber,M等人，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；及如例如Tutt,A.等人J.Immunol.147(1991)60-69中所描述製備三特異性抗體。

本文中亦包括具有三個或三個以上功能性抗原結合位點之工程改造抗體，包括「章魚抗體」(參見例如US 2006/0025576)。

本文中之抗體或片段亦包括「雙效Fab」或「DAF」，其包含結合至人類Tau(pS422)以及另一不同抗原之抗原結合位點(參見例如US 2008/0069820)。

本文中之抗體或片段亦包括描述於以下中之多特異性抗體：WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792及WO 2010/145793。

5. 抗體變體

在某些實施例中，涵蓋本文所提供之抗體之胺基酸序列變體。舉例而言，可能需要提高抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變體可藉由將適當的修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成製備。此類修飾包括例如在抗體之胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合。

a)取代、插入及缺失變體

在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變體。用於取代型突變誘發之相關位點包括HVR及FR。保守性取代展示於下表中標題「較佳取代」下。較多實質性變化提供於下表中標題「例示性取代」下，且參考胺基酸側鏈類別如下文進一步描述。胺基酸取代可引入相關抗體中且篩選具有所需活性的產物，例如保留/改良的抗原結合、降低之免疫原性或改良的ADCC或CDC的產物。

胺基酸可根據共有側鏈特性進行分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代將需要將此等類別中之一者之成員換成另一類別。

一種類型之取代型變體涉及取代親本抗體(例如人類化抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選用於進一步研究之所得變體相對於親本抗體將在某些生物性質方面具有修改(例如改良)(例如親和力提高、免疫原性降低)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物特性。一種例示性取代型變體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所描述之技術)便利地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且在噬菌體上呈現變異型抗體並篩選具有特定生物活性(例如結合親和力)之變異型抗體。

改變(例如取代)可在HVR中進行以例如提高抗體親和力。可在HVR「熱點」(亦即由在體細胞成熟過程期間經歷高頻率突變之密碼子編碼的殘基(參見例如Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)，及/或接觸抗原之殘基)中進行此類改變，且測試所得變異型VH或VL之結合親和力。藉由構築及自二級集合庫再選擇之親和力成熟已描述於例如Hoogenboom,H.R.等人Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之突變誘發)中之任一者將多樣性引入所選用於成熟之可變基因中。隨後產生二級集合庫。隨後篩選該集合庫以鑑別具有所需親和力之任何抗體變體。引入多樣性之另一方法(method)涉及HVR引導方法(approach)，其中將若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機分組。參與抗原結合之HVR殘基可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來特定鑑別。尤其常以CDR-H3及CDR-L3為目標。

在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此類改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守性改變(例如，如本文所提供之保守性取代)。此類改變可例如在HVR中接觸抗原之殘基之外。在上文提供之變異型VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。

一種適用於鑑別可被靶向以用於突變誘發之抗體之殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如由Cunningham,B.C.及Wells,J.A.,Science 244(1989)1081-1085所描述。在此方法中，鑑別出一個殘基或一組標靶殘基(例如帶電荷殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且將其置換為中性或帶負電荷胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)以判定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，利用抗原-抗體複合物之晶體結構來鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之目標或排除在取代候選物之外。可篩選變體以判定其是否含有所需特性。

胺基酸序列插入包括在一個殘基至含有一百個或一百個以上殘基之多肽長度範圍內的胺基及/或羧基端融合體，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入型變體包括抗體之N端或C端與酶(例如對於ADEPT而言)或延長抗體之血清半衰期之多肽的融合體。

b)糖基化變體

在某些實施例中，對本文所提供之抗體進行改變以增加或降低抗體糖基化之程度。在抗體上添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來便利地實現。

在抗體包含Fc區之情況下，可改變連接於其上之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體典型地包含分支鏈雙觸角寡醣，其一般藉由N鍵連接至Fc區之CH2域的Asn297(參見例如Wright,A.及Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以便形成具有某些改良特性之抗體變體。

c)Fc區變體

在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供之抗體之Fc區中，從而產生Fc區變體。Fc區變體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，其在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)。

在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非所有效應功能之抗體變體，此使得該抗體成為合乎應用需要之候選物，在該等應用中，活體內抗體半衰期至關重要，而某些效應功能(諸如補體及ADCC)為不必要或有害的。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/耗盡。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體不具有FcγR結合能力(因此可能不具有ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初級細胞、NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概述於Ravetch,J.V.及Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9 (1991)457-492之第464頁之表3中。評定相關分子之ADCC活性之活體外分析之非限制性實例描述於US 5,500,362(參見例如Hellstrom,I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；及Hellstrom,I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如流動式細胞量測術之ACTI^TM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96^®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。用於此類分析之適用效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可在活體內，例如，在諸如Clynes,R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中所揭示者之動物模型中評定相關分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合分析以確認抗體不能結合C1q且因此不具有CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評定補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro,H.等人，J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人，Blood 101(2003)1045-1052；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743)。亦可使用此項技術中已知之方法(參見例如Petkova,S.B.等人，Int.Immunol.18(2006：1759-1769))進行FcRn結合及活體內清除/半衰期測定。

效應功能降低之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代之彼等抗體(US 6,737,056)。此類Fc區突變體包括胺基酸位置265、269、270、297及327之兩者或兩者以上處經取代的Fc區突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂的「DANA」Fc區突變體(US 7,332,581)。

描述與FcR之結合提高或降低之某些抗體變體(參見例如US 6,737,056；WO 2004/056312；及Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276 (2001)6591-6604)。

在一些實施例中，在Fc區中進行改變，其使C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即降低)例如，如US 6,194,551；WO 99/51642；及Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184中所描述。

半衰期延長且與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn)(Guyer,R.L.等人，J.Immunol.117(1976)587-593；及Kim,J.K.等人，J.Immunol.24(1994)2429-2434)之結合提高之抗體描述於US 2005/0014934中。彼等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，該等取代提高Fc區與FcRn之結合。此類Fc區變體包括在以下Fc區殘基中之一或多者處具有取代之彼等變體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc區殘基434之取代(US 7,371,826)。

關於Fc區變體之其他實例，亦參見Duncan,A.R.及Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351。

d)半胱胺酸工程改造抗體變體

在某些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程改造抗體，例如「硫基MAb(thioMAb)」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於抗體之可達位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基從而定位於抗體之可達位點且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生如本文中進一步描述之免疫結合物。在某些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。可如例如US 7,521,541中所描述產生半胱胺酸工程改造抗體。

e)抗體衍生物

在某些實施例中，可將本文所提供之抗體進一步修飾以含有此項技術中已知且可易於獲得的額外非蛋白質部分。適合於抗體衍生作用之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或未分支鏈。與抗體連接之聚合物的數目可變化，且若連接一個以上聚合物，則聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生作用之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良抗體之特殊特性或功能，抗體衍生物是否將用於指定條件下之療法等考慮因素來確定。

在另一實施例中，提供抗體與可藉由暴露於輻射選擇性地加熱之非蛋白質部分之結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam,N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)不損害一般細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死抗體-非蛋白質部分近側之細胞之溫度的波長。

B. 重組方法及組合物

可使用例如如US 4,816,567中所描述之重組方法及組合物產生抗體。在一個實施例中，提供編碼本文所描述之抗人類Tau(pS422)抗體之經分離核酸。此類核酸可編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及/或包含抗體之VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供包含此類核酸之一或多個載體(例如表現載體)。在另一實施例中，提供包含此類核酸之宿主細胞。在一個此類實施例中，宿主細胞包含(例如已經以下轉化)：(1)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的載體，或(2)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列之核酸的第一載體，及包含編碼包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供一種製得抗人類Tau(pS422)抗體之方法，其中該方法包含在適合於表現抗體之條件下培養如上文所提供之包含編碼該抗體之核酸的宿主細胞且視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。

就重組產生抗人類Tau(pS422)抗體而言，分離例如如上文所描述之編碼抗體的核酸且將其插入一或多個載體中以便於進一步選殖及/或在宿主細胞中表現。此類核酸可易於使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合之寡核苷酸探針)分離及定序。

適於選殖或表現抗體編碼載體之宿主細胞包括本文所描述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可於細菌中產生，尤其當不需要糖基化及Fc效應功能時。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見例如US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523。(亦參見Charlton,K.A.,在Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(編)，Humana Press,Totowa,NJ(2003)，第245-254頁中，其描述抗體片段在大腸桿菌中之表現。)在表現之後，可以可溶性溶離份自細菌細胞糊狀物分離抗體且其可進一步經純化。

除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為抗體編碼載體之適合的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而使得所產生之抗體具有部分或完全人類糖基化型態的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；及Li,H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。

用於表現糖基化抗體之適合的宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物細胞及昆蟲細胞。已鑑別出眾多可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。

植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978及US 6,417,429(描述在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIES^TM技術)。

脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的適用的哺乳動物宿主細胞株之其他實例為藉由SV40(COS-7)轉化之猴腎CV1株；人胚腎株(如例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所描述之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏(sertoli)細胞(如例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所描述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌瘤細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞(如例如Mather,J.P.等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所描述)；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他適用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR^- CHO細胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適合於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，參見例如Yazaki,P.及Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(編)，Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268頁。

C. 分析

可藉由此項技術中已知之各種分析對本文所提供之抗人類Tau(pS422)抗體進行針對其物理/化學特性及/或生物活性之鑑別、篩選或表徵。

1. 結合分析及其他分析

在一個態樣中，例如藉由已知方法(諸如ELISA、αLISA、西方墨點、抗體或逆相陣列等)測試本發明抗體之抗原結合活性。

在例示性ELISA或αLISA分析中，溶液(細胞上清液、細胞或組織溶解物、體液等)中之Tau(pS422)由以下抗體結合：捕捉抗體，其特異性結合至Tau(pS422)上之第一抗原決定基或某一構形之Tau(pS422)；及偶合至偵測實體之偵測抗體，其特異性結合至Tau(pS422)之第二抗原決定基或構形。讀取結果係基於偵測實體(化學發光、螢光、能量轉移誘導之發光等)。在一些情況下，可在同一分析中使用同一抗體作為捕捉及偵測抗體以偵測Tau(pS422)之聚集形式(參見例如Tokuda,T.等人，Neurology 75(2010)1766-1772)。

就抗體陣列而言，將抗體點樣至玻璃或硝化纖維素晶片上。將載玻片封閉且用含有Tau(pS422)之溶液培育，洗滌以移除未結合抗體且用螢光標記之對應二級抗體偵測結合抗體。藉由螢光片掃描器量測螢光信號。類似地對於逆相陣列，將重組Tau(pS422)、細胞上清液、細胞或組織溶解物、體液等點樣至玻璃或硝化纖維素晶片上。將載玻片封閉且用針對Tau(pS422)上之特異性抗原決定基之抗體培育個別陣列。洗去未結合抗體且用螢光標記之對應二級抗體偵測結合抗體。藉由螢光片掃描器量測螢光信號(Dernick,G.等人，J.Lipid Res.52(2011)2323-2331)。

在西方墨點之實例中，在SDS PAGE或天然凝膠條件中藉由分子量分離聚集重組Tau(pS422)或來源於細胞上清液、細胞或組織溶解物、體液等之Tau(pS422)且將其吸至硝化纖維素或PVDF膜上。在封閉之後，用對Tau(pS422)之胺基酸序列或構形具有特異性之抗體培育膜。其後洗滌膜以移除未結合抗體。藉由偶合至偵測實體以達成化學發光或螢光或其他偵測方式之對應二級抗體偵測結合抗體。對Tau(pS422)之胺基酸序列具有特異性之抗體將結合至呈各種聚集形式且因此具有各種分子量之Tau(pS422)，只要抗原決定基未因聚集而遮蔽即可。另一方面，構形特異性抗體將僅偵測Tau(pS422)之某些聚集形式，且僅在特定分子量下顯露條帶(參見例如Towbin,H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)4350-4353；Burnette,W.N.,Anal.Biochem.112(1981)195-203)。

在另一態樣中，可使用競爭分析以鑑別與如本文所報導之(人類化)抗體競爭結合至人類Tau(pS422)的抗體。在某些實施例中，此類競爭抗體結合至由如本文所報導之(人類化)抗體所結合者相同之抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。用於定位抗體所結合之抗原決定基之詳細例示性方法提供於Morris,G.E.(編)，Epitope Mapping Protocols，在Methods in Molecular Biology，第66卷，Humana Press,Totowa,NJ(1996)中。

在例示性競爭分析中，在包含結合至人類Tau(pS422)之第一標記抗體及測試與第一抗體競爭結合至人類Tau(pS422)之能力之第二未標記抗體的溶液中培育固定人類Tau(pS422)。作為對照，在包含第一標記抗體但無第二未標記抗體之溶液中培育固定人類Tau(pS422)。在允許第一抗體結合至人類Tau(pS422)之條件下培育之後，移除過量未結合抗體，且量測與固定人類Tau(pS422)締合之標記量。若測試樣品中與固定人類Tau(pS422)締合之標記量相對於對照樣品實質上減少，則指示第二抗體與第一抗體競爭結合至人類Tau(pS422)(參見例如Harlow,E.及Lane,D.,Antibodies：A Laboratory Manual，第14章，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1988))。

2. 活性分析

在一個態樣中，提供鑑別具有生物活性之抗人類Tau(pS422)抗體之分析。生物活性可包括例如防止/降低/抑制Tau(pS422)誘發之細胞毒性，及/或防止/降低/抑制寡聚人類Tau(pS422)之細胞間傳輸，及/或降低LUHMES細胞中Tau(pS422)誘發之卡斯蛋白酶(caspase)活性。亦提供在活體內及/或活體外具有此類生物活性之抗體。

在某些實施例中，測試本發明抗體之此類生物活性。

可藉由添加含導致接受者神經元細胞細胞死亡之分泌性Tau(pS422)之條件培養基來評定保護性生物活性。可藉由添加如本文所描述之保護性抗體使此毒性逆轉。分泌性Tau(pS422)之毒性先前已確定(Emmanouilidou,E.等人，J.Neurosci.,30(2010)6838-6851)。

D. 用於診斷及偵測之方法及組合物

在某些實施例中，本文所提供之任何抗人類Tau(pS422)抗體適用於偵測生物樣品中人類Tau(pS422)之存在。如本文所使用之術語「偵測」包涵定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織，諸如腦組織。

在一個實施例中，提供用於診斷或偵測方法之抗人類Tau(pS422)抗體。在另一態樣中，提供一種偵測生物樣品中人類Tau(pS422)之存在之方法。在某些實施例中，該方法包含在允許抗人類Tau(pS422)抗體結合至人類Tau(pS422)之條件下使生物樣品與如本文所描述之抗人類Tau(pS422)抗體接觸，且偵測在抗人類Tau(pS422)抗體與人類Tau(pS422)之間是否形成複合物。此類方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，抗人類Tau(pS422)抗體用於選擇符合抗人類 Tau(pS422)抗體療法之個體，例如其中人類Tau(pS422)為選擇患者之生物標記。

可使用本發明抗體診斷之例示性病症包括1型腦鐵積聚神經退化(NBIA1)、單純性自主神經衰竭、唐氏症候群、關島型綜合症及數種路易體病症(Lewy body disorder)，諸如泛發性路易體疾病(DLBD)、阿茲海默氏病之路易體變體(LBVAD)、某些形式之高歇氏病(Gaucher's disease)及帕金森氏病癡呆(PDD)。

在某些實施例中，提供經標記之抗人類Tau(pS422)抗體。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光及放射性標記)，以及例如經由酶促反應或分子相互作用間接偵測之部分(諸如酶或配位體)。例示性標記包括(但不限於)放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H及¹³¹I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯、傘酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(US 4,737,456)；螢光素；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與採用過氧化氫氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基及其類似標記。

E. 醫藥調配物

如本文所描述之抗人類Tau(pS422)抗體之醫藥調配物係藉由將具有所需純度之此類抗體與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.(編)(1980))，以凍乾調配物或水溶液形式來製備。醫藥學上可接受之載劑在所採用之劑量及濃度下一般對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚(乙烯吡咯啶酮)；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文中之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rhuPH20(HYLENEX^®,Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP(包括rhuPH20)及使用方法描述於US 2005/0260186及US 2006/0104968中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種額外葡萄糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。

例示性凍乾抗體調配物描述於US 6,267,958中。抗體調配物水溶液包括US 6,171,586及WO 2006/044908中所描述之彼等抗體調配物水溶液，WO 2006/044908中所描述之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。

本文之調配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必需之活性成分，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之補充性活性的活性成分。舉例而言，可能需要進一步提供[[可能與抗人類Tau(pS422)抗體組合之清單藥物]]。此類活性成分適合地以有效達成預期目的之量組合存在。

可例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成分包覆於所製備之微膠囊中，例如分別在膠狀藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米囊劑)中或於巨乳液中之羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.(編)(1980)中。

可製備延釋製劑。延釋製劑之適合的實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如薄膜或微膠囊。

欲用於活體內投與之調配物一般為無菌的。無菌性可容易地例如藉由經由無菌過濾膜過濾來實現。

F. 治療方法及組合物

本文所提供之任何抗人類Tau(pS422)抗體可用於治療方法。

在一個態樣中，提供用作藥劑之抗人類Tau(pS422)抗體。在其他態樣中，提供用於治療阿茲海默氏病之抗人類Tau(pS422)抗體。在某些實施例中，提供用於治療方法之抗人類Tau(pS422)抗體。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有阿茲海默氏病之個體之方法的抗人類Tau(pS422)抗體，該方法包含向該個體投與有效量之抗人類Tau(pS422)抗體。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種例如如下文所描述之額外治療劑。在其他實施例中，本發明提供用於抑制人類神經元及神經膠質細胞中Tau(pS422)誘發之細胞毒性或抑制寡聚人類Tau(pS422)在神經元與神經膠質細胞之間的細胞間傳輸或降低Tau(pS422)誘發之卡斯蛋白酶活性的抗人類Tau(pS422)抗體。在某些實施例中，本發明提供用於在個體中抑制人類神經元及神經膠質細胞中Tau(pS422)誘發之細胞毒性或抑制寡聚人類Tau(pS422)在神經元與神經膠質細胞之間的細胞間傳輸或降低 Tau(pS422)誘發之卡斯蛋白酶活性之方法的抗人類Tau(pS422)抗體，該方法包含向該個體投與有效量之抗人類Tau(pS422)抗體以抑制人類神經元與神經膠質細胞中Tau(pS422)誘發之細胞毒性或抑制寡聚人類Tau(pS422)在神經元與神經膠質細胞之間的細胞間傳輸或降低Tau(pS422)誘發之卡斯蛋白酶活性。根據以上實施例中之任一者之「個體」較佳為人類。

在另一態樣中，本發明提供抗人類Tau(pS422)抗體之用途，其用於製造或製備藥劑。在一個實施例中，該藥劑用於治療阿茲海默氏病。在另一實施例中，該藥劑用於阿茲海默氏病之治療方法，該方法包含向患有阿茲海默氏病之個體投與有效量之藥劑。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種例如如下文所描述之額外治療劑。在另一實施例中，該藥劑用於抑制人類神經元及神經膠質細胞中Tau(pS422)誘發之細胞毒性或抑制寡聚人類Tau(pS422)在神經元與神經膠質細胞之間的細胞間傳輸或降低Tau(pS422)誘發之卡斯蛋白酶活性。在另一實施例中，該藥劑用於在個體中抑制人類神經元及神經膠質細胞中Tau(pS422)誘發之細胞毒性或抑制寡聚人類Tau(pS422)在神經元與神經膠質細胞之間的細胞間傳輸或降低Tau(pS422)誘發之卡斯蛋白酶活性之方法，該方法包含向該個體投與有效量之藥劑以抑制人類神經元及神經膠質細胞中Tau(pS422)誘發之細胞毒性或抑制寡聚人類Tau(pS422)在神經元與神經膠質細胞之間的細胞間傳輸或降低Tau(pS422)誘發之卡斯蛋白酶活性。根據以上實施例中之任一者之「個體」可為人類。

在另一態樣中，本發明提供治療阿茲海默氏病之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有此類阿茲海默氏病之個體投與有效量之抗人類Tau(pS422)抗體。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種如下文所描述之額外治療劑。根據以上實施例中之任一者之「個體」可為人類。

在另一態樣中，本發明提供一種在個體中抑制人類神經元及神經膠質細胞中Tau(pS422)誘發之細胞毒性或抑制寡聚人類Tau(pS422)在神經元與神經膠質細胞之間的細胞間傳輸或降低Tau(pS422)誘發之卡斯蛋白酶活性的方法。在一個實施例中，該方法包含向個體投與有效量之抗人類Tau(pS422)抗體以抑制人類神經元及神經膠質細胞中Tau(pS422)誘發之細胞毒性或抑制寡聚人類Tau(pS422)在神經元與神經膠質細胞之間的細胞間傳輸或降低Tau(pS422)誘發之卡斯蛋白酶活性。在一個實施例中，「個體」為人類。

在另一態樣中，本發明提供包含本文所提供之抗人類Tau(pS422)抗體中之任一者的醫藥調配物，從而例如用於以上治療方法中之任一者。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之抗人類Tau(pS422)抗體中之任一者及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之抗人類Tau(pS422)抗體中之任一者及至少一種例如如下文所描述之額外治療劑。

本發明抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，本發明抗體可與至少一種額外治療劑共同投與。

上文所提及之此類組合療法包涵組合投與(其中兩種或兩種以上治療劑包括在同一或單獨調配物中)及單獨投與，在此情況下，本發明抗體之投與可在投與額外治療劑之前、同時及/或之後進行。在一個實施例中，抗人類Tau(pS422)抗體之投與及額外治療劑之投與彼此相隔約一個月內；或相隔約一週、兩週或三週內；或相隔約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內進行。

本發明抗體(及任何額外治療劑)可藉由任何適合的手段投與，包括非經腸、肺內及鼻內投與，且若需要用於局部治療，則包括病灶內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。部分視投與之短期或長期性而定，可藉由任何適當途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投與或經各個時間點多次投與、快速投與及脈衝式輸注。

本發明抗體將以與良好醫療實踐一致的方式調配、給藥及投與。在此情形下，考慮因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之病因、藥劑遞送部位、投與方法、投與時程及醫學從業者已知之其他因素。抗體無需但視情況可與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。此類其他藥劑之有效量視存在於調配物中之抗體之量、病症或治療之類型及如上文所論述之其他因素而定。此等藥劑一般以相同劑量且用如本文所描述之投與途徑使用，或以本文所描述之劑量之約1%至99%使用，或以憑經驗/臨床上確定為適當之任何劑量及任何途徑使用。

為預防或治療疾病，本發明抗體之適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視待治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及病程、是出於預防還是治療目的投與抗體、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應及主治醫師之判斷而定。一次性或歷經一系列治療向患者適當地投與該抗體。無論例如藉由一或多次單獨投與，或藉由連續輸注，其均視疾病類型及嚴重程度而定，投與至患者之初始候選劑量為約1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg至10mg/kg)抗體。視上文所提及之因素而定，一種典型的日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或100mg/kg以上之範圍內。對於歷經數天或更長時間之重複投與，視病狀而定，該治療一般將持續至達到所需之抑制疾病症狀為止。抗體之一種例示性劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg範圍內。因此，可向患者投與一或多劑之約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何組合)。此類劑量可間歇投與，例如每週或每三週(例如以使得患者接受約二至約二十次或例如約六次劑量的抗體)。可投與初始較高之加載劑量，隨後可投與一或多個較低劑量。然而，其他給藥方案可能適用。很容易藉由習知技術及分析來監控此療法之進程。

應理解，上述任何調配或治療方法中，除了抗人類Tau(pS422)抗體以外，亦改用或增加使用本發明免疫結合物進行。

III. 製品

在本發明之另一態樣中，提供含有適用於治療、預防及/或診斷上文所描述之病症之材料的製品。該製品包含容器及容器上或容器隨附之標籤或藥品說明書。適合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV輸液袋等。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納單獨組合物或該組合物與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物之組合，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針頭刺穿之塞子的靜脈內輸液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明抗體。標籤或藥品說明書指示該組合物係用於治療所選病狀。此外，該製品可包含(a)內含組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明抗體；及(b)內含組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之藥品說明書。或者或另外，該製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。

應理解，替代抗人類Tau(pS422)抗體或除抗人類Tau(pS422)抗體以外，以上製品中之任一者可包括本發明之免疫結合物。

IV. 特定實施例

1.一種人類化抗體，其特異性結合至人類Tau(pS422)，其中該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau。

2.一種人類化抗體，其特異性結合至人類Tau(pS422)，其中該抗體包含a)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、18及10之HVR，或b)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR。

3.如項目2之人類化抗體，其進一步包含a)在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR，或b)在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：12、05及15之HVR。

4.如項目2至3中任一項之人類化抗體，其包含a)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、18及10之HVR，及在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR，或b)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR，及在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：12、05及15之HVR，或c)在重鏈可變域中，SEQ ID NO：08、09及10之HVR，及在輕鏈可變域中，SEQ ID NO：13、14及15之HVR。

5.如項目2至4中任一項之人類化抗體，其包含 a)SEQ ID NO：20之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域，或b)SEQ ID NO：19之重鏈可變域及SEQ ID NO：16之輕鏈可變域，或c)SEQ ID NO：19之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域，或d)SEQ ID NO：21之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域。

6.如項目2至5中任一項之人類化抗體，其中該抗體用於治療阿茲海默氏病。

7.如項目2至6中任一項之人類化抗體，其中該抗體為效應功能靜默。

8.如項目2至7中任一項之人類化抗體，其中該抗體不具有效應功能。

9.如項目2至8中任一項之人類化抗體，其中該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體。

10.如項目2至9中任一項之人類化抗體，其中該抗體具有以下之EC₅₀值a)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或 b)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或c)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或d)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau為125ng/mL或125ng/mL以下。

11.如項目2至10中任一項之人類化抗體，其中該抗體特異性結合至人類Tau(pS422)(SEQ ID NO：02)且不會結合至人類Tau(SEQ ID NO：01)。

12.如項目1至11中任一項之人類化抗體，其中該抗體在重鏈可變域中位置4、24及78處具有纈胺酸殘基。

13.如項目1至12中任一項之人類化抗體，其中該抗體在重鏈可變域中位置71處具有精胺酸殘基。

14.如項目2至13中任一項之人類化抗體，其中該抗體為單株抗體。

15.如項目2至10中任一項之人類化抗體，其中該抗體為抗體片段，其結合至人類Tau(pS422)且i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或 vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段，EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

16.如項目2至14中任一項之人類化抗體，其中該抗體為a)人類子類別IgG1之全長抗體，或b)人類子類別IgG4之全長抗體，或c)具有突變L234A、L235A及P329G之人類子類別IgG1之全長抗體，d)具有突變S228P、L235E及P329G之人類子類別IgG4之全長抗體，e)在兩條重鏈中均具有突變L234A、L235A及P329G且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C且在相應另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類別IgG1之全長抗體，f)在兩條重鏈中均具有突變S228P及P329G且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C且在相應另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類別IgG4之全長抗體。

17.一種人類化抗人類Tau(pS422)抗體，其中a)該抗體包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)該可變域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：10之HVR， ii)該恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)該恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)該抗體包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)該可變域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之HVR，ii)該恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段，EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

18.一種人類化抗人類Tau(pS422)抗體，其中a)該抗體包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)該可變域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09及SEQ ID NO：10之HVR，ii)該恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)該恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)該抗體包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)該可變域包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：05及SEQ ID NO：15之HVR，ii)該恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段， EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

19.一種人類化抗人類Tau(pS422)抗體，其中a)該抗體包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)該可變域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09及SEQ ID NO：10之HVR，ii)該恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)該恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)該抗體包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)該可變域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之HVR，ii)該恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau (SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段，EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

20.一種人類化抗人類Tau(pS422)抗體，其中a)該抗體包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：20，ii)該恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)該恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)該抗體包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：17，ii)該恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)該抗體 i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段，EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

21.一種人類化抗人類Tau(pS422)抗體，其中a)該抗體包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：19，ii)該恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)該恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)該抗體包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中 i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：16，ii)該恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段，EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

22.一種人類化抗人類Tau(pS422)抗體，其中a)該抗體包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：19，ii)該恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)該恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)該抗體包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：17，ii)該恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段，EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

23.一種人類化抗人類Tau(pS422)抗體，其中 a)該抗體包含兩條抗體重鏈，各重鏈包含重鏈可變域及重鏈恆定區，其中i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：21，ii)該恆定區為人類IgG1恆定區，其中C端離胺酸殘基可存在或不存在，及iii)該恆定區包含胺基酸變化L234A、L235A及P329G，b)該抗體包含兩條抗體輕鏈，各輕鏈包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中i)該可變域具有胺基酸序列SEQ ID NO：17，ii)該恆定區為人類κ輕鏈恆定區或人類λ輕鏈恆定區，及c)該抗體i)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體，及/或v)特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之全長人類Tau，及/或vi)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段，EC₅₀值為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或vii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)，EC₅₀值為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或viii)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體，EC₅₀值為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或ix)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau，EC₅₀值為125ng/mL或125ng/mL以下。

25.一種經分離核酸，其編碼如項目1至24中任一項之人類化抗體。

26.一種宿主細胞，其包含如項目25之核酸。

27.一種產生如項目1至23中任一項之人類化抗體的方法，其包含培養如本文所報導之宿主細胞以產生人類化抗體的步驟。

28.如項目27之方法，其進一步包含自細胞或培養基回收人類化抗體之步驟。

29.一種醫藥調配物，其包含如項目1至23中任一項之人類化抗體及醫藥學上可接受之載劑。

30.如項目29之醫藥調配物，其進一步包含額外治療劑。

31.如項目30之醫藥調配物，其中該額外治療劑為抗澱粉狀蛋白治療劑。

32.如項目31之醫藥調配物，其中該抗澱粉狀蛋白治療劑為抗人類α突觸核蛋白抗體或抗Aβ抗體。

33.如項目1至23中任一項之人類化抗體，其用作藥劑。

34.如項目1至23中任一項之人類化抗體，其用於治療阿茲海默氏病。

35.如項目1至23中任一項之人類化抗體，其用於治療前驅性阿茲海默氏病。

36.如項目1至23中任一項之人類化抗體，其用於治療輕度阿茲海默氏病。

37.如項目1至23中任一項之人類化抗體，其用於減輕Tau(pS422)誘發之神經退化。

38.如項目1至23中任一項之人類化抗體，其用於維持認知及功能。

39.如項目1至23中任一項之人類化抗體，其用於減慢認知及功能減退速率。

40.一種如項目1至23中任一項之人類化抗體之用途，其用於製造藥劑。

41.如項目33及40中任一項之用途，其中該藥劑用於治療阿茲海默氏病。

42.如項目33及40至41中任一項之用途，其中該藥劑用於治療前驅性阿茲海默氏病。

43.如項目33及40至42中任一項之用途，其中該藥劑用於治療輕度阿茲海默氏病。

44.如項目33及40至43中任一項之用途，其中該藥劑用於減輕Tau(pS422)誘發之神經退化。

45.如項目33及40至44中任一項之用途，其中該藥劑用於維持認知及功能。

46.如項目33及40至45中任一項之用途，其中該藥劑用於減慢認知及功能減退速率。

47.一種治療患有阿茲海默氏病之個體的方法，其包含向該個體投與有效量之如項目1至23中任一項之人類化抗人類Tau(pS422)抗體。

48.一種在個體中減輕Tau(pS422)誘發之神經退化的方法，其包含向該個體投與有效量之如項目1至23中任一項之人類化抗人類Tau(pS422)抗體以減輕Tau(pS422)誘發之神經退化。

49.一種在個體中維持認知及功能之方法，其包含向該個體投與有效量之如項目1至23中任一項之人類化抗人類Tau(pS422)抗體以維持認知及功能。

50.一種在個體中減慢認知及功能減退速率之方法，其包含向該個體投與有效量之如項目1至23中任一項之人類化抗人類Tau(pS422)抗體以減慢認知及功能減退速率。

51.一種如項目1至23中任一項之人類化抗人類Tau(pS422)抗體的用途，其用於減輕Tau(pS422)誘發之神經退化中。

52.一種如項目1至23中任一項之人類化抗人類Tau(pS422)抗體的用途，其用於維持認知及功能中。

53.一種如項目1至23中任一項之人類化抗人類Tau(pS422)抗體的用途，其用於減慢認知及功能減退速率中。

54.如項目1至23中任一項之人類化抗體，其中該抗體i)結合至Tau(pS422)轉殖基因小鼠及阿茲海默氏病患者大腦切片上的Tau(pS422)；及/或在Tau(pS422)轉殖基因細胞中標記Tau(pS422)。

55.如項目1至23中任一項之人類化抗體，其中該抗體特異性結合至/識別早期及晚期疾病相關形式之人類Tau(pS422)。

56.一種如項目1至23中任一項之人類化抗體之用途，其用於預防人類Tau(pS422)相關之阿茲海默氏病擴散。

57.一種如項目1至23中任一項之人類化抗體之用途，其用於減少溶酶體膜崩解。

58.一種如項目1至23中任一項之人類化抗體之用途，其用於針對人類Tau(pS422)誘發之不穩定及/或崩解穩定溶酶體膜。

59.一種如項目1至23中任一項之人類化抗體之用途，其用於阻止阿茲海默氏病惡化。

V. 實例

以下為本發明之方法及組合物之實例。應理解，考慮到上文提供之一般說明，可實踐各種其他實施例。

材料及方法

重組DNA技術

如Sambrook,J.等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所描述，使用標準方法來操作DNA。根據製造商之說明使用分子生物試劑。

基因及寡核苷酸合成

藉由在Geneart GmbH(Regensburg,Germany)化學合成來製備所需基因區段。將合成基因片段選殖至大腸桿菌質體中以用於繁殖/擴增。藉由DNA定序檢驗次選殖基因片段之DNA序列。或者，藉由黏接化學合成之寡核苷酸或經由PCR組裝短合成DNA片段。藉由metabion GmbH(Planegg-Martinsried,Germany)製備各別寡核苷酸。

試劑

若未另外陳述，則如根據製造商之方案所提供使用所有市售化學品、抗體及套組。

實例1

製備及純化兔抗體

免疫接種

將來自Charles River Laboratories International,Inc.之NZW兔用於免疫接種。將偶合於KLH上之磷酸肽Tau(416-430)[pS422]溶解於濃度為1mg/ml之K₃PO₄緩衝液(pH 7.0)中且與完全弗氏助劑(complete Freund's adjuvant，CFA)混合(1：1)直至產生穩定的乳液。三隻兔在一週間隔內接受皮膚內(i.d.)注射2ml乳液，繼而第二次肌肉內(i.m.)及第三次皮下(s.c.)各注射1ml。第四次1ml肌肉內注射在兩週後進行，繼而在四週間隔內進行另外兩次1ml皮下注射。在第三次、第四次、第五次及第六次注射4至6天後收集10ml各動物之周邊全血樣品且用於FACS中之單細胞分選。同時收集另外0.5ml各動物血清且用於測定Tau(416-463)[pS422]特異性抗體反應。

抗體反應

使用ELISA藉由連續稀釋血清來測定抗體對免疫接種之反應，在ELISA中，在預塗佈抗生蛋白鏈菌素之96孔微量滴定盤(MC1347,Micro Coat Biotechnologie GmbH,Bernried,Germany)上，在4℃下將每孔30ng之生物素標記Tau(416-430)[pS422]在1×PBS中培育隔夜。關於偵測，使用以1：16000稀釋之辣根過氧化酶連接之山羊抗兔IgG(傑克遜實驗室(Jackson laboratory))。來自Roche Diagnostics GmbH之BM Blue POD基質、沈澱四甲基聯苯胺(TMB)、即用溶液用於觀測。經由1N HCl停止反應且在Tecan Infinite上藉由450/690nm進行量測。

B細胞選殖

塗佈培養盤

在室溫下，在PBS中，用3種生物素標記之對照肽之混合物(非磷酸化Tau(416-430)、MCAK_人類(88-102)[95-pSer]及MAP2_人類(1802-1816)[pSer-1802])或生物素標記磷酸化肽Tau(416-430)[pS422](各呈0.5μg/ml至1μg/ml之濃度)培育無菌抗生蛋白鏈菌素塗佈的6孔培養盤(細胞培養級)持續1h。在使用之前將培養盤在無菌PBS中洗滌三次。在4℃下，用碳酸鹽緩衝液(0.1M碳酸氫鈉、34mM碳酸氫二鈉、pH 9.55)中之2μg/ml KLH(鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet haemocyanine))塗佈細胞培養6孔盤隔夜。在使用之前將培養盤在無菌PBS中洗滌三次。

分離兔周邊血液單核細胞(PBMC)

用1×PBS將含有EDTA之全血稀釋兩倍，隨後對哺乳動物淋巴細胞(Cedarlane Laboratories)進行密度離心，進行此舉以分離兔PBMC。洗滌PBMC兩次，隨後用抗體染色。

EL-4 B5培養基

補充有10% FCS(Hyclone,Logan,UT,USA)、2mM麩醯胺酸、1%青黴素/鏈黴素溶液(PAA,Pasching,Austria)、2mM丙酮酸鈉、10mM HEPES(PAN Biotech,Aidenbach,Germany)及0.05mM β-巰基乙醇(Gibco,Paisley,Scotland)之RPMI 1640(Pan Biotech,Aidenbach,Germany)。

巨噬細胞/單核細胞之耗盡

使用無菌6孔培養盤(細胞培養級)使巨噬細胞及單核細胞經由非特異性黏著耗盡。孔塗佈有KLH(鑰孔血藍蛋白)或抗生蛋白鏈菌素及對照肽。各孔至多填充有4ml培養基及至多6×10⁶個來自免疫接種兔之周邊血液單核細胞且使其在37℃下於培育箱中結合1h。上清液中50%之細胞用於淘選步驟；剩餘50%之細胞直接進行免疫螢光染色及單細胞分選。

在肽上淘選B細胞

塗佈有抗生蛋白鏈菌素及生物素標記肽Tau(416-430)[pS422]之6孔組織培養盤每4ml培養基接種有至多6×10⁶個細胞且使其在37℃下於培育箱中結合1h。藉由用1×PBS仔細洗滌該等孔1-2次移除非黏附細胞。在37℃下於培育箱中藉由胰蛋白酶分離剩餘黏性細胞10min，且隨後在培養基中洗滌兩次。將細胞保持在冰上直至免疫螢光染色。

免疫螢光染色及單細胞分選

用於單細胞分選之抗兔IgG FITC來自AbD Serotec(STAR121F,Düsseldorf,Germany)。關於表面染色，用含抗兔IgG FITC抗體之PBS培育來自耗盡及淘選步驟之細胞持續30min，同時在4℃下在黑暗中在冷室內滾動。在離心之後，藉由抽吸移除上清液。PBMC經歷2個循環之離心及用冰冷PBS洗滌。最後，使PBMC再懸浮於冰冷的PBS中且立即進行FACS分析。在FACS分析之前添加濃度為5μg/ml之碘化丙錠(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA)以辨別死細胞及活細胞。使用配備FACSDiva軟體(BD Biosciences,USA)之Becton Dickinson FACSAria進行FACS且單個FITC標記之活細胞沈積於96孔培養盤中。

B細胞培養物

藉由類似於Zubler,R.H.等人，J.Immunol.134(1985)3662-3668所描述之方法製備B細胞培養物。簡言之，用具有Pansorbin細胞(1：20000)(Calbiochem(Merck),Darmstadt,Deutschland)、5%兔胸腺細胞上清液及γ輻射EL-4-B5小鼠胸腺瘤細胞(2×10⁴/孔)之210微升/孔EL-4 B5培養基於96孔培養盤中在37℃下5% CO₂之氛圍中於培育箱中將經單個分選之B細胞培養7天。移除B細胞培養物上清液以備篩選且立即收集細胞以便於可變區基因選殖或在100μl RLT緩衝液(Qiagen,Hilden,Germany)中冷凍在-80℃下。

B細胞純系篩選

藉由ELISA篩選結合至生物素標記Tau(416-430)[pS422]之B細胞培養物上清液。非磷酸化Tau(416-430)、KLH(鑰孔血藍蛋白)及不相關磷酸化肽MCAK_人類(88-102)[95-pSer]用作對照抗原。為了製備ELISA培養盤，在室溫下，以50ng/ml用生物素標記Tau(415-430)[pS422]培育抗生蛋白鏈菌素預塗佈的微量滴定培養盤1小時。KLH或對照肽塗佈以1μg/ml進行。以1：5至1：10稀釋B細胞上清液且在經抗原塗佈的微量滴定培養盤中培育60min。在充分洗滌之後，使用羊抗兔IgG地高辛(digoxigenin)結合偵測抗體(Chemicon AQ301D)來偵測兔抗體之結合。在室溫下用TMB培育之後，量測在370nm至492nm處之吸光度。進一步考慮與生物素標記Tau(416-430)[pS422]但不與KLH及MCAK_人類(88-102)[95-pSer]產生以上背景信號之B細胞純系且進行可變區基因選殖。

V域之PCR擴增及定序

根據製造商之方案使用NucleoSpin^® 8/96 RNA套組(Macherey&Nagel；740709.4，740698)製備總RNA。所有步驟均在epMotion 5075液體操作系統(Eppendorf)上進行。用60μl無RNA酶之水溶離RNA。根據製造商之說明使用Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen；18080-400)及寡聚dT-引子，使用6μl RNA藉由逆轉錄酶反應產生cDNA。使用4μl cDNA以用AccuPrime SuperMix(Invitrogen；12344-040)以50μl之最終體積針對重鏈使用引子rbHCfinal.up及rbHCfinal.do，且針對輕鏈使用rbLCfinal.up及rbLCfinal.do，來擴增免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區(VH及VL)(參見下表)。PCR條件如下：在94℃下熱起動5min；在94℃下20s，在70℃下20s，在68℃下45s 35個循環，且在68℃下最終延長7min。

將50μl PCR溶液中之8μl裝載於48 E-Gel 2%(Invitrogen G8008-02)上。根據製造商之方案使用NucleoSpin^® Extract II套組(Macherey&Nagel；740609250)清潔陽性PCR反應物且在50μl溶離緩衝液中將其溶離。針對重鏈使用rbHCfinal.up及rbHCfinal.do且針對輕鏈使用rbLCfinal.up及rbLCfinal.do在兩個方向上將12μl之純化PCR產物直接定序(參見上表)。

兔單株抗體及兔/小鼠嵌合抗體之重組表現

關於兔單株抗體之重組表現，藉由突出物選殖方法(Haun,R.S.等人，BioTechniques 13(1992)515-518；Li,M.Z.，等人，Nature Methods 4(2007)251-256)將編碼VH或VL之PCR產物作為cDNA選殖於表現載體中。藉由PCR使用重疊引子來擴增編碼兔κ或γ恆定區及VH插入物之VL的線性化表現質體。經純化之PCR產物用T4 DNA-聚合酶培育，其產生單鏈突出物。藉由添加dCTP停止反應。在下一步驟中，將質體及插入物組合且用RecA培育，其誘發位點特異性重組。將重組質體轉化至大腸桿菌中。次日，選取生長菌落且藉由質體製備、限制分析及DNA定序測試恰當的重組質體。關於抗體表現，暫時將經分離之HC及LC質體共轉染至HEK293細胞中且1週後收集上清液。關於兔小鼠嵌合抗體之選殖及表現，藉由PCR擴增VH及VL區域且將其次選殖於含有小鼠恆定κ或小鼠恆定γ1區之表現載體中。分離兔/小鼠嵌合HC及LC質體，藉由限制分析及DNA定序測試其恰當插入，且將其暫時共轉染至HEK293細胞中。在轉染一週後收集上清液。

抗體純化

在MabSelectSuRe^TM管柱(GE Healthcare)上，自細胞培養物上清液純化重組表現之兔抗體。在裝載樣品之前，用25mmol/L Tris-HCl、25mmol/L NaCl(pH 7.4)平衡管柱。用50mmol/L乙酸鹽(pH 3.14)實現抗體之溶離。將經溶離樣品立即裝載至脫鹽管柱(Sephadex G25,GE Healthcare)上，且在20mmol/L His-HCl、140mmol/L NaCl(pH 6.0)中進行溶離。此緩衝液亦用於儲存經純化之抗體。一般儲存溫度為4℃，在純化製程期間為室溫且在等分之後為-80℃。在MabSelectSuRe^TM管柱(GE Healthcare)上，自細胞培養物上清液純化重組表現之兔/小鼠嵌合體抗體。在裝載樣品之前，用1×PBS(pH 7.4)平衡管柱。用100mmol/L檸檬酸鹽(pH 3.0)實現抗體之溶離。經溶離樣品立即用2mol/L Tris/HCl(pH 9.0)中和。然後，將抗體裝載於尺寸排阻管柱(Superdex 200,GE Healthcare)上，且在20mmol/L His-HCl、140mmol/L NaCl(pH 6.0)中進行溶離。此緩衝液亦用於儲存經純化之抗體。一般儲存溫度為4℃，在純化製程期間為室溫且在等分之後為-80℃。

實例2

抗Tau pS422單株兔抗體對在pS422處磷酸化之Tau具有高度選擇性且結合至Tau pS422之纖維型聚集體。

ELISA

兔單株抗體重組表現於HEK 293細胞中。藉由ELISA，測試細胞培養物上清液或經純化之兔抗體與生物素標記Tau(416-430)[pS422]、非磷酸化Tau(416-430)、KLH(鑰孔血藍蛋白)及不相關磷酸化肽MCAK_人類(88-102)[95-pSer]的結合。為了製備ELISA培養盤，在室溫下，以50ng/ml用生物素標記Tau(415-430)[pS422]培育抗生蛋白鏈菌素預塗佈的微量滴定培養盤1小時。KLH或對照肽塗佈以1μg/ml進行。在抗原標記微量滴定培養盤中以各種濃度培育兔抗Tau pS422抗體(Abcam AB51071)或含有兔抗體之上清液60min。在充分洗滌之後，使用羊抗兔IgG地高辛結合偵測抗體(Chemicon AQ301D)來偵測兔抗體之結合。在室溫下用TMB培育之後，量測在370nm至492nm處之吸光度。抗體結合藉由其EC50值表徵。結合至生物素標記Tau(416-430)[pS422]及非磷酸化Tau(416-430)肽之抗體藉由其EC50值表徵。在較高濃度下，亦即在細胞培養物上清液之1：5稀釋度下藉由單點量測值估計與KLH或MCAK磷酸肽之交叉反應。結果展示於下表中。發現結合至Tau磷酸肽之EC50值低至小於結合至Tau肽之EC50值的1/100，指示相較於非磷酸化Tau肽，磷酸化Tau片段至少100倍之選擇性。所有抗體與KLH及MCAK對照磷酸肽之結合均處於背景水準下，其為Tau磷酸肽最大量測值之約1<3%。

表：

亦測試對可溶性及聚集全長Tau pS422之特異性。在室溫下，將Tau pS422之纖維型聚集體(300μg/ml)塗佈至聚苯乙烯基Maxisorb微量滴定盤(Nunc)上隔夜。以類似方式將可溶性全長Tau及Tau pS422塗佈至Maxisorb微量滴定盤上。以至多1000ng/ml之濃度添加兔抗Tau pS422抗體對照物(Abcam AB51071)或經純化之兔抗體且培育60min。在充分洗滌之後，使用羊抗兔IgG地高辛結合偵測抗體(Chemicon AQ301D)來偵測兔抗體之結合。在室溫下用TMB培育之後，量測在370nm至492nm處之吸光度。抗體結合藉由其EC50值表徵。結果展示於下表中。

兔單株抗體以低於1ng/ml之EC50值結合至Tau-pS422蛋白。偵測到纖維型Tau pS422之EC50值在0.4ng/ml至14ng/ml範圍內。結合至非磷酸化全長Tau蛋白之信號無法與背景水準區分開來。因此，據估計，抗體中之每一者以相較於Tau至少100倍之選擇性結合至Tau pS422及纖維型Tau pS422。

BIAcore ^TM

進一步研究與纖維型Tau pS422聚集體之結合且藉由BIAcore^TM分析進行確認。在37℃下使用BIAcore 3000儀器進行量測。系統及樣品緩衝液為HBS-EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005%聚山梨醇酯20(v/v))。對BIAcore^TM CM5感測器晶片進行預處理程序。持續30sec依次將0.1% SDS、50mM NaOH、10mM HCl及100mM H₃PO₄注射經過流槽FC1、FC2、FC3及FC4。根據製造商之說明書，使用BIAcore 3000^TM向導v.4.1進行胺偶合程序。在感測器表面之EDC/NHS活化之後，將非磷酸選擇性抗Tau抗體mAb<TAU>M-4/53-IgG固定在感測器流槽FC2、FC3及FC4上。在FC1上捕捉識別不相關抗原的針對CK-MM之抗體(肌酸激酶同型)作為對照物。以30μg/ml將mAb<TAU>M-4/53-IgG及抗體抗CK-MM稀釋於10mM NaAc(pH 5.0)中且以10μl min注射7min接觸時間以固定10.000RU之抗體捕捉系統。藉由使用1M乙醇胺飽和使表面去活化。以10μl/min使用磷酸化絲狀Tau蛋白(以1：100稀釋於HBS-EP中之0.3mg/ml儲備液)作為溶液中之被分析物持續2min，5個循環來使感測器適應。以30μl/min用10mM甘胺酸(pH 2.5)進行再生持續3min。據推測，結合至mAb 4/53之被分析物並不解離pTau纖絲，因為未觀測到pTau纖絲與mAb 4/53解離。關於所有其他量測循環，將0.3mg/ml pTau纖絲以1：100稀釋於HBS-EP緩衝液中且以10μl/min注射1min從而以異相夾層模式向各別抗體被分析物呈現pTau。將抗體被分析物稀釋於HBS-EP緩衝液中達到100nM之濃度且以20μl/min注射至系統中，持續3min。在3min解離之後，藉由以100μl/min注射2次10mM甘胺酸(pH 2.5)，每次持續1min，繼而以100μl/min HBS洗滌15sec來使感測器表面再生。監測相互作用之結合及解離階段。因為溶液中之抗體被分析物為二價，負擔親合力之抗體pTau動力學係藉由兩相解離模型表徵，該解離模型由基於親和力之快速早期解離步驟繼而在後者複合物解離過程中親合力穩定但限速之動力學步驟組成。被分析物注射結束10sec(早期)及50sec(晚期)後，在可能的情況下定量kd及t/2(解離)。使用雙參考程序評估動力學量測值。第一，減去來自FC1參考物之信號以校正緩衝液體效應及非特異性結合。第二，減去0nM被分析物注射以校正初級抗體與相應捕捉系統之解離。根據BIAcore^TM評估軟體v.4.1，使用朗格繆爾1.1解離擬合模型評估動力學速率。根據式ln(2)/60*kd計算抗原/抗體複合物穩定性半衰期(min)。

結果概述於下表中。

實例3

抗Tau pS422單株兔抗體與阿茲海默氏病患者大腦切片中之胞內pTau的結合

藉由免疫螢光染色實驗，使用來自AD患者之人類大腦組織冷凍切片，研究藉由單株兔抗Tau pS422抗體之阿茲海默氏病大腦組織中之pTau病變的特異性及敏感性免疫組織化學偵測。該程序基本上與實例X(小鼠抗體)中所描述相同。藉由山羊抗兔Alexa Fluor488^®結合二級抗體(Invitrogen/分子探針A11034)來偵測兔IgG。對於純系Mab 005、Mab 019、Mab 020、Mab 085、Mab 086及Mab 097而言，pTau沈積物及纖絲之特異性及敏感性染色為顯而易見的。如較大神經原纖維纏結及細長嗜中性白血球細線之胞內pTau沈積物為顯著的。測定出所研究的所有純系之最小有效濃度範圍均在0.08μg/ml與0.016μg/ml 之間，此指示高度敏感性結合至真正的人類pTau沈積物。

實例4

兔抗人類Tau(pS422)抗體之人類化

如本文所使用之「可變域」(輕鏈可變域(VL)、重鏈可變域(VH))指示其直接參與抗體與Tau(pS422)抗原之結合的輕鏈及重鏈域對中之每一者。可變輕鏈及重鏈域具有相同的通式結構且各域包含序列為廣泛保守性的四個構架區(FR)，其藉由三個「高變區」相連。

經由電腦分析兔抗體mAb 086之VH及VL域之結構且將其與人類VH及VL域之結構資料庫(IMGT)進行比較。選擇結構上最類似的V域組以將兔抗體之CDR移植於所選人類VH及VL域上。另外，藉由比對兔抗體VH及VL域之一級序列與人類V域抗體集合庫來考慮一級序列之相似性以縮小人類V域之選擇範圍。在一些人類化變體中，引入人類構架區內向兔親本殘基之回復突變。類似地，在一些變體中適當時引入CDR中之突變從而潛在地提高抗原親和力，從而維持CDR三級結構且從而移除非所需特徵，如半胱胺酸殘基或在抗體純化之後可進行修飾之殘基。

在微量滴定培養盤中，以矩陣方式將含有人類化變體中之每一者之重鏈及輕鏈載體共轉染於HEK293懸浮細胞中以獲得表現所有可能的輕鏈/重鏈組合之完全尺寸IgG的細胞培養物。在37℃下培育5天之後，收集上清液且以微量滴定規模藉由蛋白A親和性層析法進行純化。

實例5

產生重組表現載體

a)使用人類IgG1恆定區產生表現免疫球蛋白重鏈之載體

藉由將編碼各別抗Tau(pS422)特異性抗體VH域之DNA片段融合至編碼人類IgG1恆定區之序列元件來組裝編碼人類化重鏈之融合基因，該融合基因包含人類IgG1恆定區(CH1、鉸鏈、CH2、CH3)及衍生自兔抗體Mab 086之人類化抗人類Tau(pS422)抗體VH域。

人類IgG1恆定區具有以下胺基酸序列：

(SEQ ID NO：58)。

表現載體亦包含來自載體pUC18之複製起點，其允許在大腸桿菌中複製此質體，及β-內醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌之安比西林(ampicillin)抗性。

抗體重鏈之轉錄單元在5'至3'方向上包含以下功能元件：- 人類巨細胞病毒之即刻早期強化子及啟動子(P-CMV)，包括內含子A，- 人類重鏈免疫球蛋白5'未轉譯區(5'UTR)，- 小鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，- 編碼重鏈可變(VH)域之核酸，- 編碼人類IgG1恆定區之核酸，及- 牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

b)使用人類Ig-κ恆定區產生表現免疫球蛋白輕鏈之載體

藉由將編碼各別抗人類Tau(pS422)抗體VL(κ)域之DNA片段融合至編碼人類Ig-κ恆定區之序列元件來組裝編碼人類化κ輕鏈之融合基因，該融合基因包含人類Ig-κ恆定區(CL-κ)及衍生自兔抗體Mab 086之抗人類Tau(pS422)抗體VL(κ)域。

人類Ig-κ恆定區具有以下胺基酸序列：

(SEQ ID NO：59)。

表現載體亦包含來自載體pUC18之複製起點，其允許在大腸桿菌中複製此質體，及β-內醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌中之安比西林抗性。

抗體κ輕鏈之轉錄單元在5'至3'方向上包含以下功能元件：- 人類巨細胞病毒之即刻早期強化子及啟動子(P-CMV)，包括內含子A，- 人類重鏈免疫球蛋白5'未轉譯區(5'UTR)，- 小鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，- 編碼輕鏈可變(VL)域之核酸，- 編碼人類Ig-κ恆定區之核酸，及- 牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

c)使用人類Ig-λ恆定區產生表現免疫球蛋白輕鏈之載體

藉由將編碼各別抗人類Tau(pS422)抗體VL(λ)域之DNA片段融合至編碼人類Ig-λ恆定區之序列元件來組裝編碼人類化λ輕鏈之融合基因，該融合基因包含人類Ig-λ恆定區(CL-λ)及衍生自兔抗體Mab 086之抗人類Tau(pS422)抗體VL(λ)域。

人類Ig-λ恆定區具有以下胺基酸序列：

(SEQ ID NO：60)。

抗體λ輕鏈之轉錄單元在5'至3'方向上包含以下功能元件：- 人類巨細胞病毒之即刻早期強化子及啟動子(P-CMV)，包括內含子A，- 人類重鏈免疫球蛋白5'未轉譯區(5'UTR)，- 小鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，- 編碼可變輕鏈(VL)域之核酸，- 編碼人類Ig-λ恆定區之核酸，及- 牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

d)使用人類Ig-κ恆定區產生表現免疫球蛋白κ輕鏈之載體

藉由將編碼各別抗人類Tau(pS422)抗體VL(κ)域之DNA片段融合至編碼人類Ig-κ恆定區之序列元件來組裝編碼人類化Ig-κ輕鏈之融合基因，該融合基因包含人類Ig-κ恆定區(CL-κ)及衍生自兔抗體Mab 086之抗人類Tau(S422)抗體VL(κ)域。構築體在基因組組織結構中，亦即內含子存在於信號肽中及VL(κ)域與CL-κ域之間。

抗體κ輕鏈之轉錄單元在5'至3'方向上包含以下功能元件：- 人類巨細胞病毒之即刻早期強化子及啟動子(P-CMV)，- 人類重鏈免疫球蛋白5'未轉譯區(5'UTR)，- 小鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，- 編碼輕鏈可變(VL)域之核酸，- 人類IgG κ恆定區，及- 牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

e)使用人類Ig-λ恆定區產生表現免疫球蛋白λ輕鏈之載體

藉由將編碼各別抗人類Tau(pS422)抗體VL(λ)域之DNA片段融合至編碼人類Ig-λ恆定區之序列元件來組裝編碼人類化Ig-λ輕鏈之融合基因，該融合基因包含人類Ig-λ恆定區(CL-λ)及衍生自兔抗體Mab 086之抗人類Tau(S422)抗體VL(λ)域。構築體在基因組組織結構中，亦即內含子存在於信號肽中及VL(λ)與CL-λ域之間。

抗體λ輕鏈之轉錄單元在5'至3'方向上包含以下功能元件：- 人類巨細胞病毒之即刻早期強化子及啟動子(P-CMV)，- 人類重鏈免疫球蛋白5'未轉譯區(5'UTR)，- 小鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，- 編碼輕鏈可變(VL)域之核酸，- 人類IgG λ恆定區，及- 牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

實例6

重組產生抗人類Tau(pS422)抗體

在F17培養基(Invitrogen Corp.)中培養之暫時轉染HEK293細胞(來源於人胚腎細胞株293)中產生抗體。為了轉染如實例5中所描述之各別載體，使用「無293(293-Free)」轉染試劑(Novagen)。自個別表現質體表現抗體。如製造商之說明中所規定進行轉染。在轉染三天至七天之後，收集含有重組抗體之細胞培養物上清液。在低溫(例如-80℃)下儲存上清液直至純化。

關於人類免疫球蛋白在例如HEK293細胞中之重組表現之一般資訊提供於：Meissner,P.等人，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中。

實例7

重組抗人類Tau(pS422)抗體之純化

過濾含有抗體之培養物上清液且藉由兩個層析步驟純化。

使用經PBS(1mM KH₂PO₄、10mM Na₂HPO₄、137mM NaCl、2.7mM KCl)(pH 7.4)平衡之HiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)藉由親和性層析法捕捉抗體。藉由用平衡緩衝液洗滌來移除未結合蛋白質，且用25mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 3.1)回收抗體，其在緊接於溶離之後經1M Tris鹼(pH 9.0)調節至pH 6.0。

使用Superdex 200^TM(GE Healthcare)上之尺寸排阻層析作為第二純化步驟。在20mM組胺酸緩衝液，0.14M NaCl(pH 6.0)中進行尺寸排阻層析。用配備有Biomax-SK膜(Millipore,Billerica,MA,USA)之Ultrafree-CL離心過濾器單元濃縮含有抗體之溶液且儲存在-80℃下。

實例8

動力學篩選

根據Schraeml等人(Schraeml,M.及M.Biehl,Methods Mol.Biol.901(2012)171-181)在安裝有BIAcore CM5感測器之BIAcore 4000儀器上進行動力學篩選。BIAcore 4000儀器受軟體版本V1.1之控制。根據製造商之說明書，BIAcore CM5串聯S晶片安裝於儀器中且以水動力方式進行處理及預處理。儀器緩衝液為HBS-EP緩衝液(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.05%(w/v)P20)。抗體捕捉系統製備於感測器表面上。使用NHS/EDC化學方法，在10,000RU下，以30μg/ml將具有人類IgG-Fc特異性之多株山羊抗人類抗體(傑克遜實驗室)於10mM乙酸鈉緩衝液(pH 5)中固定至儀器之流槽1、2、3及4中之點1、2、4及5上。在各流槽中，在點1及點5上捕捉抗體。點2及點4用作參考點。用1M乙醇胺溶液將感測器去活化。以介於44nM與70nM之間的濃度將人類化抗體衍生物施加於補充有1mg/ml CMD(羧基甲基葡聚糖)之儀器緩衝液中。以30μl/min之流動速率注射抗體持續2min。以相關反應單位(RU)量測表面呈現抗體之捕捉水準(CL)。以300nM、30μl/min之流動速率注射溶液中之被分析物，即磷酸化人類tau蛋白、非磷酸化人類tau蛋白及磷酸化人類tau突變體蛋白T422S持續3min。監測解離5min。藉由以30μL/min將10mM甘胺酸緩衝液(pH 1.7)注射1min經過所有流槽來再生捕捉系統。兩個報導點用於表徵動力學篩選效能，即被分析物注射結束前不久的記錄信號，表示為後期結合(BL)；及解離時間結束前不久的記錄信號，表示為後期穩定(SL)。此外，根據朗格繆爾模型(Langmuir model)計算解離速率常數kd(1/s)且根據式ln(2)/(60*kd)計算以分鐘為單位之抗體/抗原複合物半衰期。根據式MR=(後期結合(RU))/(捕捉水準(RU))*(MW(抗體)/(MW(抗原))計算莫耳比(MR)。在感測器經組態具有適合量之抗體配位體捕捉水準的情況下，各抗體應在功能上能夠至少結合至溶液中之一種被分析物，其由莫耳比MR=1.0表示。隨後，莫耳比亦為被分析物結合之價數模式的指示物。對於結合兩個被分析物之抗體而言最大價數可為MR=2，各Fab價數均為一。

在另一實施例中，在25℃及37℃下，使用相同實驗性設備但使用溶液中多種濃度系列之之各被分析物(在0nM(緩衝液)、1.2nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM、100nM及300nM下)測定動力學速率。根據製造商之說明書及具有總體RMAX之朗格繆爾1.1模型，自濃度依賴性結合狀態使用BIAcore評估軟體計算動力學資料。

實例9

ELISA

將非生物素標記肽/蛋白質/聚集體添加至未經塗佈的Maxisorb培養盤中且將含生物素標記肽/蛋白質/聚集體之PBS添加至抗生蛋白鏈菌素塗佈的Maxisorb培養盤中且培育隔夜。丟棄上清液且用90μl洗滌緩衝液(1×PBS/0.1% Tween 20)洗滌孔三次。藉由培育1h，用阻斷緩衝液阻斷剩餘反應點(1×PBS/2% BSA(牛血清白蛋白部分V，無脂肪酸，Roche，目錄號：10735078001)/0.05% Tween 20)。丟棄上清液且用90μl洗滌緩衝液洗滌孔三次。以500ng/mL之起始濃度，於12個稀釋液(1：2)中於ELISA緩衝液中製備樣品及對照抗體(1×PBS/0.5% BSA(牛血清白蛋白部分V，無脂肪酸，Roche，目錄號：10735078001)/0.05% Tween 20)。培育時間為在室溫下在震盪器上60分鐘。丟棄上清液且用90μl洗滌緩衝液洗滌孔三次。於ELISA緩衝液中製備二次抗體溶液。將總計25μl之抗體混合物轉移入分析盤之所有孔中且此後將該盤在震盪器上在室溫下培育60分鐘。丟棄上清液且用90μl洗滌緩衝液洗滌孔三次。將25μl ABTS溶液添加至所有孔中。在405nm至492nm處讀取吸光度。

<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司

<120> 人類化抗-Tau(pS422)抗體及使用方法

<130> 31911 FT

<150> EP13199123.4

<151> 2013-12-20

<150> EP14174047.2

<151> 2014-06-26

<160> 64

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 441

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 441

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (422)..(422)

<223> X=磷絲胺酸

<400> 2

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> X=磷絲胺酸

<400> 3

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 家兔

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 家兔

<400> 5

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 家兔

<400> 6

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 家兔

<400> 7

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 家兔

<400> 8

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> 家兔

<400> 9

<210> 10

<211> 3

<212> PRT

<213> 家兔

<400> 10

<210> 11

<211> 108

<212> PRT

<213> 家兔

<400> 11

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 12

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 13

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 14

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 15

<210> 16

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 16

<210> 17

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 17

<210> 18

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 18

<210> 19

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 19

<210> 20

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 20

<210> 21

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 21

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 22

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 23

<210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 24

<210> 25

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 25

<210> 26

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 26

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 27

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 28

<210> 29

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 29

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 30

<210> 31

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 31

<210> 32

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 32

<210> 33

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 33

<210> 34

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 34

<210> 35

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 35

<210> 36

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 36

<210> 37

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 37

<210> 38

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 38

<210> 39

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 39

<210> 40

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 40

<210> 41

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 41

<210> 42

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 42

<210> 43

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 43

<210> 44

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 44

<210> 45

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 45

<210> 46

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 46

<210> 47

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 47

<210> 48

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 48

<210> 49

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 49

<210> 50

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 50

<210> 51

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 51

<210> 52

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 52

<210> 53

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 53

<210> 54

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 54

<210> 55

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 55

<210> 56

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 56

<210> 57

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化序列

<400> 57

<210> 58

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人

<400> 58

<210> 59

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 59

<210> 60

<211> 106

<212> PRT

<213> 智人

<400> 60

<210> 61

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rbHCfinal.up

<400> 61

<210> 62

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rbHCfinal.do

<400> 62

<210> 63

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rbLCfinal.up

<400> 63

<210> 64

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rbLCfinal.do

<400> 64

Claims

一種人類化抗體，其特異性結合至人類Tau(pS422)，其中該抗體包含a)在該重鏈可變域中具SEQ ID NO：08、09及10之HVR；及b)在輕鏈可變域中具SEQ ID NO：13、14及15之HVR。
如請求項1之人類化抗體，其包含c)SEQ ID NO：19之重鏈可變域及SEQ ID NO：17之輕鏈可變域。
如請求項1或2之人類化抗體，其中該抗體為效應功能靜默。
如請求項1或2之人類化抗體，其中該抗體i)特異性結合至具有該胺基酸序列SEQ ID NO：03之多肽，及/或ii)在1μg/mL下不會結合至全長人類Tau(SEQ ID NO：01)，及/或iii)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之全長人類Tau(SEQ ID NO：02)，及/或iv)特異性結合至在位置422處之絲胺酸處磷酸化之人類Tau(SEQ ID NO：02)之聚集體。
如請求項1或2之人類化抗體，其中該抗體具有以下之EC₅₀值a)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：03之人類Tau(pS422)片段為6ng/mL或6ng/mL以下，及/或b)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之全長人類Tau(pS422)為4.5ng/mL或4.5ng/mL以下，及/或c)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：02之人類Tau(pS422)的聚集體為30ng/mL或30ng/mL以下，及/或 d)對具有胺基酸序列SEQ ID NO：01且具有胺基酸突變S422A之人類Tau為125ng/mL或125ng/mL以下。
如請求項1或2之人類化抗體，其中該抗體特異性結合至人類Tau(pS422)(SEQ ID NO：02)且不會結合至人類Tau(SEQ ID NO：01)。
如請求項1或2之人類化抗體，其中該抗體為a)人類子類別IgG1之全長抗體，或b)人類子類別IgG4之全長抗體，或c)具有突變L234A、L235A及P329G之人類子類別IgG1之全長抗體，d)具有突變S228P、L235E及P329G之人類子類別IgG4之全長抗體，e)在兩條重鏈中均具有該等突變L234A、L235A及P329G且在一條重鏈中具有突變T366W及S354C且在相應另一重鏈中具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類別IgG1之全長抗體，f)在兩條重鏈中均具有該等突變S228P、L235E及P329G且在一條重鏈中具有該等突變T366W及S354C且在相應另一重鏈中具有該等突變T366S、L368A、Y407V及Y349C之人類子類別IgG4之全長抗體。
一種醫藥調配物，其包含如請求項1至7中任一項之人類化抗體及醫藥學上可接受之載劑。
如請求項8之醫藥調配物，其進一步包含抗人類α突觸核蛋白抗體或抗Aβ抗體。
一種如請求項1至7中任一項之人類化抗體的用途，其用於製造藥劑。
如請求項10之用途，其中該藥劑用於治療阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)。
如請求項10或11之用途，其中該藥劑用於治療前驅性阿茲海默氏病。
如請求項10或11之用途，其中該藥劑用於治療輕度阿茲海默氏病。
如請求項10或11之用途，其中該藥劑用於減輕Tau(pS422)誘發之神經退化。
如請求項10或11之用途，其中該藥劑用於維持認知及功能。
如請求項10或11之用途，其中該藥劑用於減慢認知及功能減退速率。
一種如請求項1至7中任一項之人類化抗人類Tau(pS422)抗體的用途，其用於製造供減輕Tau(pS422)誘發之神經退化用的藥劑。