TWI542354B

TWI542354B - 可抑制流感病毒血球凝集素（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）的醫藥組合物及其製備方法

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Publication number: TWI542354B
Application number: TW099139584A
Authority: TW
Inventors: 闕壯群; 施信如; 張秀鳳; 陳亦翔; 胡宜忱
Original assignee: 遠東生物科技股份有限公司
Priority date: 2010-11-17
Filing date: 2010-11-17
Publication date: 2016-07-21
Also published as: JP2012106978A; US9657263B2; EP2455448A1; US20120121744A1; TW201221133A

Description

可抑制流感病毒血球凝集素(Hemagglutinin)的醫藥組合物及其製備方法

本案係關於一種可抑制流感病毒血球凝集素(Hemagglutinin)的醫藥組合物及其製備方法，尤其，係關於一種利用低溫崩解藍藻的製備方法，所獲得的提取物可有效抑制A型及/或B型流行性感冒病毒之血球凝集素與唾液酸(sialic acid)結合，進而達到抑制流行性感冒病毒感染與複製之目的。對於具有神經胺酶(Neuraminidase)抑制劑抗藥性的突變A型流行性感冒病毒，此醫藥組合物也能抑制其感染能力。

藻類的種類繁多，植物學家根據其所含的色素種類、細胞核和細胞構造的特徵，把藻類分為九大門，其中海水中的藻類稱之為海藻，海藻的植物體是多細胞體，其大小和形狀的變化很大，小者只有數毫釐，大者有如巨藻可達六十公尺長。因此，海藻由體型大小區分為微藻與巨藻兩大類型。而生長在溫帶地區的海藻，較多大型的，其海藻的植物相也較豐富；相反的，在亞熱帶和熱帶地區的海藻都較小，其海藻的植物相也較貧乏。若依所產生的色素類別，海藻可有藍藻、綠藻、褐藻和紅藻四大群。這些海藻都生長在潮間和較淺的潮下帶之岩石或礁石上。

以馬尾藻為例，分類上屬於褐藻，型態上屬於巨藻，台灣有二十餘種，為台灣產海藻中，種類和產量最多也最大型的海藻，可長到二公尺多高。馬尾藻植物體的構造也是藻類中最複雜的，有大型盤狀，或枝狀附著器外，有如高等植物之莖、枝和葉的部份，此外亦有氣泡和生殖托等器官。

以藍藻為例，藍藻是屬於微藻，屬於原核生物，又叫藍綠藻或藍細菌，種類包括有藍球藻、顫藻、螺旋藻和念珠藻。在所有藻類生物中，藍藻是最簡單、最原始的一種。藍藻是單細胞生物，沒有細胞核，但細胞中央含有核物質，通常呈顆粒狀或網狀，染色質和色素均勻的分布在細胞質中。該核物質沒有核膜和核仁，但具有核的功能，故稱其為原核。

由於藻類的型態、色素顏色與細胞構造差異性大，因此在培養的環境、藻內所含的生物活性物質均不相同，相對於各種藻類有效生物活性物質的提取方法也就有所不同，如巨藻在提取前因為其體積龐大，故應先進行切碎之步驟，而微藻由於其體積微小，因此，不需經過任何切碎之動作，但提取的困難度在於打破細胞壁以及去除胞壁外面的膠質衣，並且在提取步驟操作同時仍保有提取物中生物活性物質的活性。

微藻是存在於地球數十億年的光合生物，可利用二氧化碳作為其生物燃料，並由於富含與人類本身相當相似的胺基酸、維生素、礦物質、鈣、磷、鐵等礦物元素、β-胡蘿蔔素、泛酸、葉酸、生物素以及含有藻膽素(是藻紅素、藻藍素和別藻藍素的總稱)等，可被製造成營養價值極高的膳食補充品、食品、飲料或動物飼料的添加物。

而藍藻屬於微藻中的一種，除了具有前述微藻所具備的物質或元素，目前有研究成果指出藍藻提取液對微小病毒科(Picornaviridae)及副黏液病毒科(Paramyxoviridae)的麻疹病毒、腮腺炎病毒、人類疱診病毒及HIV病毒具有抑制效果。再者，螺旋藻又為藍藻中的一種藻類，亦富含蛋白質(佔乾重60~70%)、維生素(B₁₂和β-胡蘿蔔素含量高)、礦物質、必需胺基酸和脂肪酸，特別是γ-次亞麻油酸(GLA)含量豐富。因此，螺旋藻將成為重要的營養來源以及抑制病毒複製之藥物組合物原料來源。

流行性感冒為濾過性病毒所引起的病症，分類上屬於正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)，依引起的血清免疫反應區分為A型、B型及C型流感，其中A型流感再以病毒表面的血球凝集素(hemagglutinin,HA)及神經胺酶(neuroaminidase,NA)分類，常見會在人群中造成傳染流行的血清型為H₁N₁及H₃N₂。

入侵宿主細胞為病毒生活史開始的重要步驟，以流感病毒(influenza virus)為例，負責此步驟的蛋白質即為血球凝集素(hemagglutinin)，當血球凝集素辨識了呼吸道內皮細胞表面的的唾液酸(sialic acid)，並且兩者結合後，就會引發胞飲作用將病毒吞噬進去，之後病毒外鞘被酵素作用破裂，釋放出RNA組成的病毒基因物質及蛋白質，最後這些物質進入細胞核內，開始病毒的複製過程。由此可見，血球凝集素應是抗流感病毒藥物開發上很重要的一個標的物，然而目前尚無抑制血球凝集素相關之藥物。

近年來引起恐慌的H₁N₁新型流感即是屬於會造成大流行及嚴重併發症的A型流感，雖然可以克流感或樂瑞沙等藥物治療或施打疫苗預防，但現有藥物屬於神經胺酶抑制劑，目前臨床上已出現具克流感抗藥性的突變A型流行性感冒病毒株，研究報告指出其中該突變的A型流行性感冒病毒是神經胺酶蛋白質序列第274位置的組胺酸(Histidine，H)產生變異。

此外，B型流感病毒所引起的症狀包括全身酸痛、發燒、喉嚨痛、咳嗽、全身無力和倦怠感等，甚至會引起支氣管炎、肺炎及腦炎等併發症。B型流感雖會引起地區性流行，但症狀通常較A型病毒溫和，但仍不可不慎。雖然臨床上多以治療A型流感的藥物治療B型流感，但研發對B型流感病毒專一的藥物將有助於抑制B型流感爆發。

美國專利公告號US7220417揭露一種褐指藻，其褐指藻屬於巨藻，提取之方法為在室溫加溶劑浸軟藻類，再於-20℃~-40℃冷凍1~7天，最後再加入溶劑並加熱，此篇專利主要應用於巨藻之提取方法，雖然有使用冷凍技術，但仍無法有效提取出有效打破細胞璧，提取出活性成分，因此再加入有機溶劑且加熱，此與本發明之低溫崩解之技術並不相同。

美國專利公告號US20090042801揭露一種含C-藻藍蛋白、異藻藍蛋白、藍藻精及其混合物所製成之藥物組合物，此專利為發明人之先前技術，該藍藻提取物所製造之藥物組合物是透過下列製備方法所取得：(a)混合有機藍藻粉及低張緩衝液；(b)於室溫以下溫度靜置過夜；(c)以分離機分離純化；(d)測定上層液之光譜及成分含量；以及(e)噴霧乾燥。其特徵在於使用0℃至18℃之低溫智備法。此為發明人透過較繁複之藍藻製備步驟，需長時間進行才能提取得到少量之有效活性物質，由於操作之系統繁複耗時費力，所取得之有效活性物質產量不大，因此發明人再次針對製備步驟進行改良，針對製備步驟之低溫崩解技術進行開發，不但簡化過去繁複之製備過程，且大大提高所提取的活性物質活性、濃度也較以往要高。

因此，藍藻中具有許多可以抑制病毒的活性物質，目前，雖然已有許多藻類的提取技術提出，但是受限於藍藻的生物特性，由於其細胞壁之構造，故若要取得細胞內部之有效活性物質必須要破壞細胞壁，傳統的破壞細胞壁方法包括煮沸、珠磨、超音波震盪等，然而這些方法都會產熱，相對的會使高活性物質失去活性，此外，亦有其他發明人選擇使用有機溶劑將細胞壁去除，但所取得之提取物質與本發明所提取之物質活性特性完全不同，生物活性及功效亦不相同。

因此，要能有效打破細胞壁並提取藍藻內物質之活性一直是該領域極欲克服之難題，因此在極為具有挑戰性的技術瓶頸中，本發明研發具有能提取出更多樣性、更完整高生物活性物質的藍藻提取物，並且該藍藻提取物具有抑制突變的A型流行性感冒病毒與B型流感病毒感染與複製的藥物，對於現在大環境具有非常急迫的需求，因為此發明之藍藻提取物可製造成有效藥物，將有助於全球治療與預防流行性感冒病毒擴散與傳染。

本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案「可抑制流感病毒血球凝集素(Hemagglutinin)的醫藥組合物及其製備方法」，能有效，且能夠克服先前技術的不足，以下為本案之簡要說明。

為了克服先前技術中提取具有高活性物質的藍藻提取液之困難，尤其要避免高溫的加熱使得提取液中之高活性物質尚失功能，並且全程不使用有機溶劑以避免毒性溶劑的殘留，確保提取物質具有高度食用安全性；因此，本發明以新穎的低溫崩解提取方法製備出藍藻(或螺旋藻)提取物，可有效抑制A型流行性感冒病毒、A型流行性感冒病毒抗藥性突變種、及B型流感病毒之感染與複製。

本發明提出一種低溫崩解藍藻的製備方法，包括下列步驟：(a)將藍藻與非有機溶液混合形成為一含藍藻的懸浮溶液；(b)將該含藍藻的懸浮溶液以低於0℃以下的溫度冷凍，形成一冷凍塊，再於低溫中融解該冷凍塊，重複此步驟兩次以上；(c)分離該冷凍塊融解後之藍藻渣和藍藻提取液；以及(d)收集分離後之提取液，其中，所收集之提取液為包含生物活性物質之藍藻提取液。

較佳地，藍藻可為螺旋藻。

較佳地，該非有機溶液之重量為2倍以上之該藍藻之重量。

較佳地，該非有機溶液可為水、低張溶液、緩衝液或生理食鹽水。

較佳地，步驟(b)之冷凍溫度低於-10℃，或者步驟(b)之冷凍溫度介於-10℃~-30℃。而步驟(b)之融解溫度介於0℃~4℃。

較佳地，該生物活性物質係選自由異藻藍蛋白、含硫多醣體、C-藻藍蛋白及其混合物所組成之群組。

較佳地，前述方法還包括濃縮步驟，係將藍藻提取液進行濃縮，獲得濃縮藍藻提取液。

較佳地，前述方法還包括乾燥步驟，係將藍藻提取液形成粉末狀。

本發明另提出一種抑制A型和B型流行性感冒病毒感染與複製的醫藥組合物，該醫藥組合物係由低溫崩解的製備方法所得到的藍藻提取液。

較佳地，該有效量之醫藥組合物包含選自由異藻藍蛋白、含硫多醣體、C-藻藍蛋白及其混合物所組成之群組。

較佳地，該A型流行性感冒病毒進一步包含突變的A型流行性感冒病毒，該突變的A型流行性感冒病毒係指對克流感產生抗藥性的病毒。

較佳地，該醫藥組合物適用於預防或治療流行性感冒。

較佳地，前述的醫藥組合物更包含一種醫藥可接受載劑。

較佳地，該載劑為賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑或香料。

較佳地，該醫藥組合物為一粉末、一顆粒、一液體、一膠體或一膏體。

較佳地，該醫藥組合物被製造為一藥品、一食品、一飲料、一膳食補充品或一動物飼料的添加物。

較佳地，該醫藥組合物係透過口服、經皮吸收、注射或吸入之方式進行傳輸。

較佳地，該醫藥組合物係傳輸至一哺乳動物。

較佳地，該哺乳動物為人類。

本發明另提出一種一種抑制A型和B型流行性感冒病毒感染與複製的方法，包括下列步驟：提供一藍藻提取液；及將該藍藻萃取液與該病毒接觸；其中，該藍藻提取液係由專利範圍第1項的製備方法所得到的藍藻提取液。

較佳地，其中該藍藻提取液包含選自由異藻藍蛋白、含硫多醣體、C-藻藍蛋白及其混合物所組成之群組。

本案所提出之「可抑制流感病毒血球凝集素(Hemagglutinin)的醫藥組合物及其製備方法」將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。

實施例1：低溫崩解藍藻的製備方法

實施例1以藍藻中的螺旋藻粉作為實驗材料。參閱第8圖之步驟流程，步驟101：在改良式的藻類製備方法中，首先將螺旋藻粉加入非有機溶液中如純水、低張溶液、緩衝液或生理食鹽水至螺旋藻粉與純水重量比為1：2~1：10，充分攪拌均勻。步驟102：接著，將此螺旋藻懸浮溶液分裝置適當容積的離心瓶中，並將螺旋藻懸浮溶液置於0℃以下的冷凍庫或是利用乾冰使其螺旋藻懸浮液快速結成凍塊狀，其中最好的溫度為-10℃~-80℃，在冷凍8~24小時之後，在低溫下緩緩解凍該冷凍塊，回融的溫度可控制在0℃~4℃緩慢回溫，進一步可利用振動、攪拌…等方式協助凍塊回融。依序重複前述的冷凍崩解步驟，將螺旋藻懸浮溶液冷凍及低溫解凍步驟重複2次或2次以上，步驟103：將回融後的懸浮液置於離心瓶中高速離心1小時；分離藻渣及螺旋藻提取液。步驟104：收集分離後之提取液，其中，所收集之提取液為包含生物活性物質之螺旋藻提取液。

依據提取液未來產品使用的需求，如欲製高濃度之濃縮液，可使用多種濃縮方式進行濃縮，如旋轉濃縮儀或使用減壓濃縮法，以低溫低壓方式進行。將溫度範圍設定在20~40℃，壓力範圍設定為15000~50000毫米汞柱，當持續至少8小時，可得到濃縮液。如產品型態為錠劑、粉狀，可再進一步進行將所獲得的濃縮液再進行冷凍乾燥，最後會形成一粉末產物，任何型態的產物中均含有高濃度、高活性的C-藻藍蛋白、異藻藍蛋白及含硫多醣體等成分。將所收集之提取物進行(1)成分純度之測定、(2)生菌數及(3)含水量之測定，以作為品管之標準規格。所獲得的提取物品管之標準規格為：(1)成分純度A620/A280>0.6、A651/A620=0.3~0.5及A670/A620<0.12(以紫外光-可見光分光光譜儀偵測吸光光譜200~700nm)，(2)生菌數為<1×10⁵cfu/g，(3)含水量<7%。

所屬技術領域中具有通常知識者亦可使用微藻或藍藻，並應用前述的低溫低壓方法製備出提取物。

實施例2：不同製備方法之藍藻提取物及不同來源之藍藻提取物其有效成分抑制流感病毒能力之比較

實施例2以藍藻中的螺旋藻作為實驗材料。由於欲瞭解不同製備方法產出的螺旋藻提取物及不同來源之螺旋藻提取物，其中成份組成與抑制流感病毒能力之相關性將以高效液相層析儀(HPLC)分析及病毒中和試驗來進行。

高效液相層析儀(HPLC)分析，以分析管柱選用Gel filtration(Shodex KW-803)，以1×PBS buffer為流動相，流速為1ml/min。HPLC儀器規格為Detector：ECOMLCD2083；Pump：ECOMLCP4100；Fixed Syringe：SLC-1F-25。將螺旋藻提取物以1×PBS buffer回溶成濃度50mg/ml，取200μl進行HPLC分析，觀測波長為220nm。

另外利用病毒中和試驗分析抑制病毒能力。在96孔盤的每個well中加入130μl之PBS。在第一排的上四孔(A1~D1)中加入130μl的螺旋藻提取物，接著取130μl往右依序做2倍的序列稀釋至第10排(A10~D10)，再由第一排的下四排(E13~H13)接著做序列稀釋至E22~H22。取150μl的稀釋病毒液至MDCK cell的96孔盤；而A11~H11為cell control的位置，則加入150μl不含FBS之DMEM；A1~A10及H13~H22為drug control的位置，亦加入150μl不含FBS之DMEM。置於5% CO₂之35℃培養箱中培養1小時。由drug dilution plate取50μl混合液至相對應的well中，再置回培養箱培養64小時。最後用100μl的10%福馬林固定細胞1小時，再以0.1%結晶紫染色15分鐘。以酵素免疫微盤分析儀(ELISA Reader)在570nm讀取吸光值。再利用公式求IC₅₀。

利用低溫崩解法(圖9a)和一般藻類提取較常使用的方法比較，如低溫超因波震盪法(圖9b)和熱水煮沸法(圖9c)製備的螺旋藻提取物以HPLC分析後，可以看出本發明製程(低溫崩解) 所產出的螺旋藻提取物大致分為3個主要波峰，而其他兩種製備方法產出之螺旋藻提取物則成份複雜，因此由HPLC分析的結果明顯可以看到所萃取出來的藍藻提取液成份明顯不同。進一步將這些混合物進行病毒中和試驗測定，由IC₅₀的數據顯示，本發明低溫崩解製程所製造產出之螺旋藻提取液具有最好的抑制流感病毒的效果(如下表)。

整合病毒中和試驗與HPLC圖譜的比較，三種螺旋藻製備方法的結果其最大差異在於第一個波峰的含量，推測其第一個波峰含有高濃度、高活性的C-藻藍蛋白、異藻藍蛋白及含硫多醣體等主要有效成分(圖9a)。

不同來源的螺旋藻，經過本發明製程(低溫崩解)提取後，比較螺旋藻提取物(圖9a)與它牌螺旋藻粉-1(圖10a)、它牌螺旋藻粉-2(圖10b)的HPLC圖譜及IC50(如下表)。

顯示經由低溫崩步驟萃取得到的螺旋藻提取物與不同來源的藻粉材料它牌螺旋藻粉-1(圖10a)、它牌螺旋藻粉-2(圖10b)，均有明顯的病毒抑制效果，所以，這結果顯示不同提取的流程所提取得到的藍藻提取液組成對於抑制病毒功效極大。

實施例3：含有C-藻藍蛋白、異藻藍蛋白及含硫多醣體等成分之螺旋藻提取物之動物毒理試驗

將含有C-藻藍蛋白、異藻藍蛋白及含硫多醣體等成分之螺旋藻提取物依據「國際經濟合作與發展組織(OECD)425口服急性毒理試驗規範」進行極限劑量毒性試驗，口服測試藥物(對照組)濃度為5000mg/kg。結果發現本發明的螺旋藻提取物之50%致死劑量(median lethal dose,LD₅₀)大於5000mg/kg。另外依據國際OECD407規範，以SD大鼠以灌食方式給予本發明之螺旋藻提取物(劑量：3000mg/kg/day)，進行連續28天亞急毒測試。實驗結果顯示：在大鼠連續口服螺旋藻提取物28天後並無任何毒性與副作用產生。

實施例4：含有C-藻藍蛋白、異藻藍蛋白及含硫多醣體等成分之螺旋藻提取物抑制A型流感病毒株與B型流感病毒株感染之動物試驗

接著，以含有C-藻藍蛋白、異藻藍蛋白及含硫多醣體等成分的螺旋藻提取物進行「抗流感藥物之動物療效試驗」，發現劑量範圍介於25~100mg/kg/day的螺旋藻提取物皆可提高受流感病毒感染之BALB/c雌性小鼠存活率，實驗結果亦發現在感染流感病毒前給藥，則具有較良好的療效。詳細實驗及結果如下所述。

首先，在點鼻施予A型流感病毒(influenza A WSN virus,H₁N₁)前4小時餵食一次本發明的螺旋藻提取物給5週齡BALB/c雌性小鼠，之後再將3.4×10⁴pfu的A型流感病毒點鼻施予於小鼠，感染A型流感病毒6小時後再餵食一次螺旋藻提取物。之後每天灌食2次，持續5天，並比較服用劑量25mg/kg/day螺旋藻提取物組與病毒控制組(僅施予H₁N₁病毒)之結果。請參閱第1圖，為以本發明螺旋藻提取物治療受A型流感病毒感染BALB/c小鼠後之小鼠體重變化示意圖。在第1圖中，病毒控制組在實驗第8天造成小鼠全部死亡，然而只要給予25mg/kg/day之螺旋藻提取物，即可對感染A型流感病毒之小鼠產生保護效果。BALB/c小鼠於實驗初期略有發病的輕微症狀，伴隨著體重減輕的現象，但是均可逐漸地恢復健康，體重也都明顯回升。

在另一實驗中，同樣在點鼻施予B型流感病毒前4小時餵食一次本發明的螺旋藻提取物給5週齡BALB/c雌性小鼠，之後再將3.5×10⁵pfu的B型流感病毒點鼻施予於小鼠，感染B型流感病毒6小時後再餵食一次螺旋藻提取物。之後每天灌食2次，持續5天，並比較服用劑量25mg/kg/day螺旋藻提取物組與病毒控制組(僅施予B型流感病毒)之結果。請參閱第2圖，為以本發明螺旋藻提取物治療受B型流感病毒感染BALB/c小鼠後之小鼠體重變化示意圖。在第2圖中，相對於病毒控制組在第9天造成50%的實驗老鼠死亡，造成該組平均體重曲線在第9天急速上升，餵食25mg/kg/day之螺旋藻提取物可對感染B型流感病毒之BALB/c小鼠造成明顯之保護效果，所以存活率為100%，而且臨床症狀減輕許多。

而服用克流感(Tamiflu ^®)雖可使小鼠100%存活，但卻產生如體重顯著下降、咳嗽、毛髮凌亂無光澤、活動力降低均無改善的臨床症狀。相對於本發明含有C-藻藍蛋白、異藻藍蛋白及含硫多醣體等成分的螺旋藻提取物可有效治療受A型流感病毒或B型流感病毒感染的小鼠，使其維持存活率及體重，並且不發生咳嗽、毛髮凌亂無光澤、活動力降低等顯著臨床症狀。

實施例5：確認含有C-藻藍蛋白、異藻藍蛋白及含硫多醣體等成分之螺旋藻提取物可抑制A型流感病毒與B型流感病毒株之血球凝集素(HA)與唾液酸(sialic acid)結合

由於流感病毒表面的血球凝集素能與含唾液酸(sialic acid)的受體物質進行特異性結合，而紅血球外膜上即具有這類唾液酸受體物質，當一定量的流感病毒和適當比例的紅血球混合後，就會因為結合而產生血球凝集現象。若是加入的物質或抗體可干擾流感病毒和紅血球的結合，就可觀察到血球凝集被抑制的現象。請參閱第3圖，為以本發明螺旋藻提取物進行血球凝集抑制試驗(Hemagglutinin Inhibition Test，HAI)之示意圖。在第3圖中，螺旋藻提取物可有效抑制A型及B型流感病毒的血球凝集素造成的血球凝集現象，表示螺旋藻提取物具有阻礙血球凝集素與唾液酸作用的能力。根據流感病毒在宿主細胞複製、增殖的週期可知，螺旋藻提取物可於流感病毒感染宿主細胞的前中期進行有效抑制。

實施例6：預防流感之試驗

根據先前實施例結果顯示：螺旋藻提取物可於流感病毒感染宿主細胞的前中期進行有效抑制，所以進行感染病毒前服用螺旋藻提取物，感染後即不再給與螺旋藻提取物之預防試驗。首先，讓4週齡的BALB/c雌性小鼠口服不同劑量之螺旋藻提取物連續7天後，再感染A型流感病毒(第4圖)或B型流感病毒，之後停止給予螺旋藻提取物，觀察小鼠的體重變化及感染臨床症狀。預先口服100mg/kg/day螺旋藻提取物的小鼠對A型流感病毒或B 型流感病毒之感染均可使存活率達到100%，體重方面緩慢增加(第4a圖)，沒有一般感染後體重下降的問題，同時亦可顯著減輕感染流感病毒之小鼠的臨床症狀(第4b圖)。臨床症狀0代表「無明顯異常症狀」；臨床症狀1代表「出現呼吸異常」；臨床症狀2代表「出現呼吸異常及毛髮粗糙」；臨床症狀3代表「出現呼吸異常及毛髮粗糙及可觀察之活動力下降」。尤其，本發明的螺旋藻提取物對預防感染A型流感病毒的效果明顯優於克流感。第4a圖中，克流感組於第9及第12天各有一隻小鼠死亡，死亡率總計為33%，病毒感染組在第11、13、15天各有一隻小鼠死亡，死亡率總計為50%，螺旋藻提取物組沒有任何小鼠死亡。

實施例7：抑制對克流感具抗藥性之A型流感病毒及2009年A型H1N1新流感病毒

由於目前已發現對克流感具有抗藥性的A型病毒株，該突變的A型流行性感冒病毒的神經胺酶(neuraminidase,NA)蛋白質序列第274位置的組胺酸(H)產生變異，因此尋找替代克流感的藥物即具相當急迫性。請參閱第5圖，為本發明的螺旋藻提取物對克流感抗藥性的A型病毒株之抑制示意圖。在第5圖中，1.5~3.0mg/ml的螺旋藻提取物可抑制突變的A型流行性感冒病毒的病毒斑形成，表示螺旋藻提取物可應用於治療突變的A型流行性感冒病毒，尤其是對克流感產生抗藥性的A型流感病毒株，該病毒突變之位置位於神經胺酶(neuraminidase,NA)蛋白質序列第274位置的組胺酸(H)。而且當螺旋藻提取物濃度為3.0mg/ml時，螺旋藻提取物可抑制多種流感病毒株(第6圖)。在第7圖中，螺旋藻提取物及其不同成分抑制不同流感病毒株之示意圖。結果顯示螺旋藻提取物及其成分C-藻藍蛋白、異藻藍蛋白及含硫多醣體對於不同流感病毒株之50%抑制濃度，在濃度低於2.5mg/ml就有抑制效果。另外也測試螺旋藻提取物及其成分C-藻藍蛋白及含硫多醣體對於2009年A型H1N1新流感病毒之抑制能力，在濃度低於1.0mg/ml就有50%抑制效果。

綜上所述，本發明以低溫崩解方法製備出的含有C-藻藍蛋白、異藻藍蛋白及含硫多醣體等成分之高生物活性螺旋藻提取物，可有效抑制B型流感病毒之感染與複製，且對實驗動物具有保護效果及減輕臨床症狀。再者，含有C-藻藍蛋白、異藻藍蛋白及含硫多醣體等成分的螺旋藻(或藍藻)提取物亦可抑制突變的A型流行性感冒病毒或對克流感產生抗藥性的A型流感病毒株之活性。

由於目前市面上亦已經存在藍藻的產品，因此，依據本發明低溫崩解所提取之含有C-藻藍蛋白、異藻藍蛋白及含硫多醣體等成分之高生物活性螺旋藻提取物可依產品設計之應用，如食品、飲料、膳食補充品或動物飼料的添加物及醫藥品，加工製作成不同的產品型態，如粉末狀、顆粒狀、液狀、膠體狀或膏體狀；因此，使用者或是動物可藉由口服、注射、吸入或經皮吸收方式使用。

與先前技術的前案相較，本發明的製備方法及藥物組合物具有新穎性及顯著的進步性。本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由本領域技術人員做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。

第1圖為以本發明螺旋藻提取物治療受A型流感病毒感染BALB/c小鼠後之小鼠體重變化示意圖。

第2圖，為以本發明螺旋藻提取物治療受B型流感病毒感染BALB/c小鼠後之小鼠體重變化示意圖。

第3圖，為以本發明螺旋藻提取物進行血球凝集抑制試驗HAI之示意圖。

第4a圖為預先口服100mg/kg/day螺旋藻提取物的BALB/c小鼠受A型流感病毒感染後之小鼠體重變化示意圖。

第4b圖為預先口服100mg/kg/day螺旋藻提取物的BALB/c小鼠受A型流感病毒感染後之臨床症狀示意圖。

第5圖為本發明的螺旋藻提取物對克流感抗藥性的A型流感病毒株之抑制示意圖。

第6圖為不同濃度之螺旋藻提取物抑制不同種流感病毒之病毒斑形成量示意圖。

第7圖為螺旋藻提取物及其不同成分抑制不同流感病毒株之示意圖。

第8圖為一種低溫崩解藍藻的製備方法之流程圖。

第9(a)圖為低溫崩解法之螺旋藻提取物有效成分HPLC分析圖。

第9(b)圖為低溫超音波震盪法之螺旋藻提取物有效成分HPLC分析圖。

第9(c)圖為熱水煮沸法之螺旋藻提取物有效成分HPLC分析圖。

第10(a)圖為它牌螺旋藻粉-1之螺旋藻提取物有效成分HPLC分析。

第10(b)圖為它牌螺旋藻粉-2之螺旋藻提取物有效成分HPLC分析及抑制病毒能力之相關性。

Claims

一種藍藻提取液作為製備抑制A型和B型流行性感冒病毒感染與複製之醫藥組合物的用途，其中，該藍藻提取液係以低溫崩解方法所得到的藍藻提取液；其中，所述低溫崩解方法包含下列步驟：(a)將藍藻與水溶液混合形成為一含藍藻的懸浮溶液；(b)將該含藍藻的懸浮溶液以0℃以下的溫度冷凍，形成一冷凍塊，再於0℃~4℃中融解該冷凍塊，重複此步驟兩次以上；(c)分離該冷凍塊融解後之藍藻渣和提取液；以及(d)收集分離後之該藍藻提取液。
如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該藍藻提取液包含選自由異藻藍蛋白、含硫多醣體、C-藻藍蛋白及其混合物所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該醫藥組合物可為保健食品或營養品。