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TWI446922B - 結合ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ的人類抗體及其應用 - Google Patents

結合ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ的人類抗體及其應用 Download PDF

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TWI446922B
TWI446922B TW097137770A TW97137770A TWI446922B TW I446922 B TWI446922 B TW I446922B TW 097137770 A TW097137770 A TW 097137770A TW 97137770 A TW97137770 A TW 97137770A TW I446922 B TWI446922 B TW I446922B
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mesothelin
variable region
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波吉莎拉Ｌ
托以可里斯多福
楊嵐
拉歐那克戚他那
陳斌亮
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必治妥施貴寶公司
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Description

結合MESOTHELIN的人類抗體及其應用
本發明係關於結合間皮素的人類抗體及其應用。
間皮素(Mesothelin)係腹膜、胸膜與圍心體腔之間皮襯裡細胞表面上的醣蛋白。其最初由人類胰臟癌細胞株HPC-Y5加以純化並顯示有巨核細胞分化能力並因此稱為巨核細胞分化因子(megakaryocyte potentiating factor,MPF)(Yamaguchi等人(1994)J. Biol. Chem. 269 :805-808)。由HPC-Y5細胞株製備的資料庫選殖(clone)間皮素cDNA(Kojima等人(1995)J. Biol. Chem. 270 :21984-21990)。亦可利用辨別間皮瘤(mesotheliomas)之單株抗體K1選殖cDNA(Chang與Pastan(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :136-40)。結構上來說，間皮素係表現在細胞表面上的60kDa前驅聚胜肽，其經蛋白質水解處理成為31kDa脫落(shed)部分(對應於MPF)與40kDa膜結合部分(Hassan等人(2004)Clin. Cancer. Res. 10 :3937-3942)。
除了表現在正常間皮細胞上之外，間皮素係過度表現於許多類型的人類癌症中，包括所有的間皮瘤、多種卵巣與胰臟癌以及某些胃、肺與子空內膜癌。舉例而言，間皮素係表現於約70%的所有卵巣癌上、約82%的乳突漿液腺癌上、約83%的所有胰臟腺癌上與約86%的所有胰臟管腺癌(ductal pancreatic adenocarcinomas)上。
已經製備藉由同源重組破壞間皮素基因之突變小鼠。(Bera,T.K.與Pastan,I.(2000)Mol. Cell. Biol. 20 :2902-2906)。並無發現解剖、血液或生殖異常，這暗示著至少在這些小鼠中間皮素功能不是生長或生殖所必需的。
間皮素專一性交互作用於CA125(亦稱為MUC-16)，其係一種腫瘤細胞表面上呈現之似黏蛋白(mucin-like)的醣蛋白(已經確定為卵巢癌抗原)。再者，CA125對膜結合間皮素的結合可介導異型(heterotypic)細胞附著且CA125與間皮素係共同表現於晚期卵巢腺癌(ovarian adenocarcinoma)(Rump,A.等人(2004)J. Biol. Chem. 279 :9190-9198)。腹膜襯裡中的間皮素表現與卵巢癌的轉移(metastasis)形成較佳位置相關，且間皮素-CA125結合被認為可促進卵巢癌的腹膜轉移(Gubbels,J.A.等人(2006)Mol. Cancer 5 :50).
有鑑於上述，調控間皮素活性的額外試劑係受到關注的。
本揭露提供單離的單株抗體(特別係人類的)，其專一性結合間皮素並具有所欲之特性，諸如高親合力結合人類間皮素、由表現間皮素之細胞所內化(internalization)、抑制間皮素結合CA125、與/或介導抗體-依賴型細胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity,ADCC)。本發明抗體可用來例如偵測間皮素或抑制表現間皮素之細胞(例如，表現間皮素之癌症細胞)的生長。
一態樣中，本發明有關於單離的人類單株抗體或其抗原結合部分，其中抗體結合人類間皮素並呈現至少一下列特性：
(a)以1 x 10-8 M或更少的KD 結合人類間皮素；
(b)由表現間皮素之細胞所內化；
(c)抑制間皮素結合卵巢癌抗原CA125；
(d)對表現間皮素之細胞呈現ADCC；及
(e)當接合(conjugate)細胞毒素(cytotoxin)時，活體內抑制表現間皮素之細胞的生長。
抗體較佳係呈現至少兩個特性(a)、(b)、(c)、(d)與(e)。抗體更加係呈現至少三個特性(a)、(b)、(c)、(d)與(e)。抗體更加係呈現至少四個特性(a)、(b)、(c)、(d)與(e)。甚至，抗體更加係呈現所有五個特性(a)、(b)、(c)、(d)與(e)。另一較佳實施例中，抗體以5 x 10-9 M或更少的KD 結合間皮素。又另一較佳實施例中，當抗體接合細胞毒素時，抗體活體內抑制表現間皮素之腫瘤細胞的生長。
另一態樣中，本發明關於單離的人類單株抗體或其抗原結合部分，其中抗體交互競爭結合參考抗體(reference antibody)所辨別之人類間皮素上的表位(epitope)，參考抗體具有：
(a)重鏈可變區(VH )，其包括序列編號：19的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL )，其包括序列編號：22的胺基酸序列；
(b)VH ，其包括序列編號：20的胺基酸序列；及VL，其包括序列編號：23的胺基酸序列；或
(c)VH ，其包括序列編號：21的胺基酸序列；及VL，其包括序列編號：24的胺基酸序列。
上述之參考抗體在下文中分別稱為參考抗體(a)、(b)與(c)。
較佳實施例中，參考抗體包括VH ，其包括序列編號：19的胺基酸序列；與VL ，其包括序列編號：22的胺基酸序列。另一較佳實施例中，參考抗體包括VH ，其包括序列編號：20的胺基酸序列；與VL ，其包括序列編號：23的胺基酸序列。又另一較佳實施例中，參考抗體包括VH ，其包括序列編號：21的胺基酸序列；與VL ，其包括序列編號：24的胺基酸序列。
另一態樣中，本發明關於單離的單株抗體或其抗原結合部分，其包括人類VH 3-33基因或人類VH 3-7基因的產物或自其衍生之VH ，其中抗體專一性結合人類間皮素。另一態樣中，本發明關於單離的單株抗體或其抗原結合部分，其包括人類VK L6基因或人類VK A27基因的產物或自其衍生之VL ，其中抗體專一性結合人類間皮素。較佳實施例中，本發明提供單離的單株抗體或其抗原結合部分，其包括：
(a)VH ，其係人類VH 3-33基因的產物或自其衍生；與VL ，其係人類VK L6基因的產物或自其衍生；或
(b)VH ，其係人類VH 3-7基因的產物或自其衍生；與VL ，其係人類VK A27基因的產物或自其衍生；其中抗體專一性結合人類間皮素。
特定較佳抗體或其抗原結合部分(「實施例　A」)包括：
(a)重鏈可變區CDR1，其包括序列編號：1；
(b)重鏈可變區CDR2，其包括序列編號：4；
(c)重鏈可變區CDR3，其包括序列編號：7；
(d)輕鏈可變區CDR1，其包括序列編號：10；
(e)輕鏈可變區CDR2，其包括序列編號：13；及
(f)輕鏈可變區CDR3，其包括序列編號：16。
另一特定較佳抗體或其抗原結合部分(「實施例　B」)包括：
(a)重鏈可變區CDR1，其包括序列編號：2；
(b)重鏈可變區CDR2，其包括序列編號：5；
(c)重鏈可變區CDR3，其包括序列編號：8；
(d)輕鏈可變區CDR1，其包括序列編號：11；
(e)輕鏈可變區CDR2，其包括序列編號：14；及
(f)輕鏈可變區CDR3，其包括序列編號：17。
另一特定較佳抗體或其抗原結合部分(「實施例　C」)包括：
(a)重鏈可變區CDR1，其包括序列編號：3；
(b)重鏈可變區CDR2，其包括序列編號：6；
(c)重鏈可變區CDR3，其包括序列編號：9；
(d)輕鏈可變區CDR1，其包括序列編號：12；
(e)輕鏈可變區CDR2，其包括序列編號：15；及
(f)輕鏈可變區CDR3，其包括序列編號：18。
另一態樣中，本發明關於單離的單株抗體或其抗原結合部分，其包括：(a)VH ，其包括選自序列編號：19-21所構成之群組的胺基酸序列；及(b)VL ，其包括選自序列編號：22-24所構成之群組的胺基酸序列；其中抗體專一性結合人類間皮素。
一較佳組合包括：(a)VH ，其包括序列編號：19的胺基酸序列；及(b)VL ，其包括序列編號：22的胺基酸序列。
另一較佳組合包括：(a)VH ，其包括序列編號：20的胺基酸序列；及(b)VL ，其包括序列編號：23的胺基酸序列。
另一較佳組合包括：(a)VH ，其包括序列編號：21的胺基酸序列；及(b)VL ，其包括序列編號：24的胺基酸序列。
本揭露的抗體可為例如IgG1或IgG4同型(isotype)。或者，其可為抗體片段，諸如Fab、Fab’或Fab’2片段或單鏈抗體。
本揭露亦提供免疫接合體(immunoconjugate)，其包括連接至夥伴分子(partner molecule)之本揭露的抗體或其抗原結合部分。特定較佳實施例中，本發明提供免疫接合體，其包括連接至化合物細胞毒素A之本揭露的抗體或其抗原結合部分，其辨別於下文並論述於WO 2008/083312，其之揭露藉由參考資料併入本文。本發明提供下列較佳免疫接合體，其包括細胞毒素A連接至本發明之抗體，其中抗體(i)與參考抗體(a)、(b)或(c)交互競爭結合人類間皮素的表位；(ii)係根據實施例A；(iii)係根據實施例B；或(iv)係根據實施例C。某些上述抗體-夥伴分子接合體能夠被表現間皮素之細胞所內化並能夠調節ADCC。
一態樣中，上述抗體-夥伴分子接合體係透過化學連接子而接合。某些實施例中，連接子係胜肽連接子(peptidyl linker)，且在本文描述成(L4 )p -F-(L1 )m 。其他連接子包括肼與雙硫連接子(disulfide linker)，且本文中分別標示成(L4 )p -H-(L1 )m 或(L4 )p -J-(L1 )m 。除了附著至夥伴分子的連接子之外，本發明亦提供可切割連接子臂，其適合用於附著至實質上任何分子物種。
本揭露亦提供雙專一性(bispecific)分子，其包括連接至第二官能基之本揭露的抗體或其抗原結合部分，第二官能基的結合專一性不同於抗體或其抗原結合部分。
亦提供包括本揭露之抗體或其抗原結合部分、或免疫接合體或雙專一性分子以及藥學可接受載體的組合物。
本揭露亦包含編碼本揭露之抗體或其抗原結合部分的核酸分子，以及包含上述核酸之表現載體與包含上述表現載體之宿主細胞。亦提供利用包含上述表現載體之宿主細胞製備抗-間皮素抗體的方法，且其包括步驟(i)在宿主細胞中表現抗體，及(ii)自宿主細胞單離抗體。
又另一態樣中，本發明關於製備抗-間皮素抗體的方法。該方法包括：
(a)提供：(i)VH 抗體序列，其包括選自序列編號：1-3所構成之群組的CDR1序列、選自序列編號：4-6所構成之群組的CDR2序列、與/或選自序列編號：7-9所構成之群組的CDR3序列；與/或(ii)VL 抗體序列，其包括選自序列編號：10-12所構成之群組的CDR1序列、選自序列編號：13-15所構成之群組的CDR2序列CDR2序列、與/或選自序列編號：16-18所構成之群組的CDR3序列；
(b)改變VH 抗體序列與/或VL 抗體序列中至少一胺基酸殘基以產生至少一經改變之抗體序列；及
(c)將該經改變之抗體序列表現成蛋白。
另一態樣中，本發明有關於抑制表現間皮素之腫瘤細胞生長的方法，其包括以本揭露之抗體-夥伴分子接合體接觸腫瘤細胞，以便抑制腫瘤細胞的生長。表現間皮素之腫瘤細胞較佳係間皮瘤細胞、胰臟癌細胞、卵巢癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞或子宮內膜癌細胞。又其他實施例中，表現間皮素之腫瘤細胞係來自選自下列所構成之群組的癌症：間皮瘤、乳突漿液卵巢腺癌(papillary serous ovarin)、亮細胞卵巢癌(clear cell ovarian carcinoma)、混合性苗勒氏卵巢癌(mixed Mullerian ovarian carcinoma)、子宮內膜粘液性卵巢癌(endometroid mucinous ovarian carcinoma)、胰臟腺癌(pancreatic adenocarcinoma)、胰臟管腺癌、子宮狀漿液性癌(uterine serous carcinoma)、肺腺癌(lung adenocarcinoma)、肝外膽管癌(extrahepatic bile duct carcinoma)、胃腺癌(gastric adenocarcinoma)、食道腺癌(esophageal adenocarcinoma)、大腸直腸腺癌(colorectal adenocarcinoma)與乳腺癌(breast adenocarcinoma)。
另一態樣中，本發明有關於治療個體癌症的方法。該方法包括對個體施用本揭露之抗體-夥伴分子接合體，以便治療個體的癌症。治療的特定較佳癌症係間皮瘤、胰臟癌、卵巢癌、胃癌、肺癌或子宮內膜癌。又其他實施例中，即將治療之癌症係選自下列所構成之群組：間皮瘤、乳突漿液卵巢腺癌、亮細胞卵巢癌、混合性苗勒氏卵巢癌、子宮內膜粘液性卵巢癌、胰臟腺癌、胰臟管腺癌、子宮狀漿液性癌、肺腺癌、肝外膽管癌、胃腺癌、食道腺癌、大腸直腸腺癌與乳腺癌。
本揭露係關於單離的單株抗體(特別係人類的)，其結合人類間皮素並具有所欲之特性。某些實施例中，本揭露之抗體係衍生自特定的重鏈與輕鏈生殖細胞(germline)序列並/或包括特定的結構特徵(例如，包括特定胺基酸序列之CDR區)。本揭露提供單離的抗體、製造上述抗體、抗體-夥伴分子接合體、與包含上述抗體之雙專一性分子、與包含上述抗體、抗體-夥伴分子接合體或雙專一性分子之藥學組合物的方法。亦提供變體或替代物，諸如同源抗體、具有保留性修飾之抗體、經設計與修飾之抗體、抗體片段與抗體模擬物，各自進一步描述於下。本揭露亦關於利用抗體之方法(例如，偵測間皮素蛋白)以及利用本發明之抗-間皮素抗體來抑制表現間皮素之細胞(例如，腫瘤細胞)生長的方法。因此，本揭露亦提供利用本揭露之抗-間皮素抗體來治療不同類型癌症的方法，癌症例如卵巢癌、胰臟癌、胃癌、肺癌、子官內膜癌與間皮瘤。抗體、接合體、雙專一性分子、替代物或變體較佳具有一或更多這些特性：結合人類間皮素、由表現間皮素之細胞所內化、抑制間皮素結合CA125、介導對表現間皮素之細胞的ADCC及活體內抑制表現間皮素之腫瘤細胞的生長。抗體可為人類(較佳)、人類化或嵌合型。
為了更輕易了解本揭露，首先界定某些詞彙。額外的定義可於詳細描述中提出。
詞彙「間皮素(mesothelin)」包括變體、等形(isoform)、同源(homolog)、直系同源(ortholog)與旁系同源(paralog)。例如，人類間皮素蛋白專一性抗體在某些實例中會與來自人類以外物種之間皮素蛋白交叉反應(cross-react)作用。其他實施例中，抗體可完全專一於人類間皮素蛋白並不呈現物種或其他類型的交叉反應性或與來自某些其他物種(但非所有其他物種)的間皮素交叉反應(例如，與靈長類間皮素但不與小鼠間皮素交叉反應)。詞彙「人類間皮素」代表人類序列間皮素，例如基因銀行登錄號(Genbank Accession Number)NP_005814之人類間皮素的完整胺基酸序列。詞彙「小鼠間皮素」代表小鼠序列間皮素，例如基因銀行登錄號NP_061345之小鼠間皮素的完整胺基酸序列。間皮素的N-端部分亦稱為巨核細胞分化因子(MPF)。人類間皮素序列可不同於基因銀行登錄號NP_005814之人類間皮素，例如具有保留性突變或非保留區中的突變，且該間皮素與基因銀行登錄號NP_005814之人類間皮素具有實質相同的生物功能，例如結合CA125。
特定人類間皮素序列通常至少90%胺基酸序列相同於基因銀行登錄號NP_005814之人類間皮素，並包含與其他物種(例如，鼠科)之間皮素胺基酸序列相比時能確認該胺基酸序列係屬於人類之胺基酸殘基。某些實例中，人類間皮素的胺基酸序列至少95%、或甚至至少96%、97%、98%或99%相同於基因銀行登錄號NP_005814之間皮素。某些實施例中，人類間皮素序列呈現與基因銀行登錄號NP_005814之間皮素序列之間不超過10個胺基酸差異。某些實施例中，人類間皮素呈現與基因銀行登錄號NP_005814之間皮素序列之間不超過5個或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸差異。可如本文所述般確定相同性百分比。
詞彙「CA125」代表卵巢癌抗原或卵巢癌腫瘤標記，亦稱為MUC-16。詞彙「人類CA125」代表人類序列CA125，例如基因銀行登錄號NP_078966之人類CA125的完整胺基酸序列。人類CA125序列不同於基因銀行登錄號NP_078966之人類CA125，例如具有保留性突變或非保留區中的突變。特定人類CA125序列通常至少90%的胺基酸序列相同於基因銀行登錄號NP_078966之人類CA125，並包含與其他物種(例如，鼠科)之CA125胺基酸序列相比時能確認該胺基酸序列係屬於人類之胺基酸殘基。某些實例中，人類CA125至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%相同於基因銀行登錄號NP_078966之CA125的胺基酸序列。某些實施例中，人類CA125序列呈現與基因銀行登錄號NP_078966之CA125序列不超過10個胺基酸差異。某些實施例中，人類CA125呈現與基因銀行登錄號NP_078966之CA125序列不超過5個或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸差異。可如本文所述般確定相同性百分比。
詞彙「免疫反應(immune response)」意指諸如淋巴細胞、抗原呈現細胞、吞噬細胞、顆粒性白血球與上述細胞或肝臟所產生之可溶性巨分子(包括抗體、細胞激素與補體)的作用，其造成選擇性傷害、破壞或自人體移除侵入性病原體、感染病原體之細胞或組織、癌症細胞或者自我免疫或病理性發炎(如果有的話)的正常人類細胞或組織。
「信號傳遞路徑」意指不同信號傳遞分子之間的生化關係，其在由細胞之一部分至細胞之另一部分的信號傳遞中扮演某種角色。詞組「細胞表面受體(cell surface receptor)」包括能夠接受信號並傳遞信號橫跨細胞漿膜之分子與分子複合物。「細胞表面受體」之實例係人類間皮素。
詞彙「抗體」代表整個抗體與其之任何抗原結合片段(「抗原結合部分」)或單鏈。「抗體」代表包括由雙硫鍵交互連接的至少兩個重鏈(H)與兩個輕鏈(L)之醣蛋白或其抗原結合部分。各個重鏈包括重鏈可變區(本文縮寫成VH )與重鏈恆定區。重鏈恆定區係由三個區塊(domain)CH 1、CH 2與CH 3所組成。各個輕鏈包括輕鏈可變區(本文縮寫成VL )與輕鏈恆定區。輕鏈恆定區係由一個區塊CL 所組成。VH 與VL 區可進一步區分成散佈於保存較高區(稱為框架區(framework region,FR))中的高度可變化區(稱為互補決定區(complementarity determining region,CDR))。各個VH 與VL 係由三個CDR與四個FR所構成，由胺基端至羧基端之比對順序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈與輕鏈的可變區包含與抗原交互作用的結合區塊。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白對宿主組織或因子的結合，宿主組織或因子包括免疫系統的不同細胞(例如，效應子細胞)與傳統補體系統的第一補體(Clq)。
本文所用之詞彙抗體的「抗體片段」與「抗原結合部分」(或單純的「抗體部分」)代表抗體之一或更多片段，其保有專一性結合抗原(例如，間皮素)之能力。已經顯示抗體的抗原結合功能可由全長抗體的片段所執行。詞彙抗體的「抗原結合部分」包含之結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL 、VH 、CL 與CH 1區塊所構成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含兩個在樞紐區由雙硫鍵連接之Fab片段的二價片段；(iii)Fab’片段，實質上為帶有部分樞紐區之Fab(參閱FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul ed.,第3版，1993)；(iv)Fd片段，由VH 與CH 1區塊所構成；(v)Fv片段，由抗體之單臂的VL 與VH 區塊所構成；(vi)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546)，由VH 區塊所構成；(vii)單離之互補決定區(CDR)；及(viii)奈米體(nanobody)，包含單一可變區塊與兩個恆定區塊之重鏈可變區。再者，雖然Fv片段的兩個區塊VL 與VH 係由不同基因所編碼，但可利用重組方法藉由合成連接子將其連接，合成連接子可使其被製造成單一蛋白質鏈，其中VL 與VH 區成對以形成單價分子(已知為單鏈Fv(scFv)；參閱諸如Bird等人(1988)Science 242 :423-426；與Huston等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)。上述之單鏈抗體亦意圖包含於詞彙抗體的「抗原結合部分」中。利用熟悉技術人士所知的傳統技術得到這些抗體片段，並用與完整抗體相同的方式來篩選有用之片段。
「單離的抗體」代表實質沒有其他抗體(具有不同抗原專一性)之抗體(例如，實質上不帶有專一性結合其他抗原之抗體的專一性結合間皮素之單離的抗體)。然而，專一性結合間皮素之單離的抗體可能與其他抗原(例如，來自其他物種之間皮素)具有交叉反應性。再者，單離的抗體實質上不帶有其他細胞材料與/或化學物。
詞彙「單株抗體(monoclonal antibody)」或「單株抗體組合物(monoclonal antibody composition)」代表單一分子組合物之抗體分子的製備物。單株抗體組合物顯示對特定表位的單一結合專一性與親和性。
詞彙「人類抗體」代表可變區中之框架區與CDR區兩者均衍生自人類生殖細胞免疫球蛋白序列的抗體。再者，若抗體包含恆定區，則恆定區亦衍生自人類生殖細胞免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括非由人類生殖細胞免疫球蛋白序列所編碼之胺基酸殘基(諸如，試管內(in vitro )隨機或位置專一性突變所導入的突變或者活體內(in vivo )體細胞突變(somatic mutation))。然而，「人類抗體」無意包括其中已經將衍生自另一哺乳物種(例如，小鼠)之生殖細胞的CDR序列接至人類框架序列的抗體。
詞彙「人類單株抗體」代表顯示單一結合專一性之抗體，其具有其中框架區與CDR區兩者均衍生自人類生殖細胞免疫球蛋白序列之可變區。一實施例中，人類單株抗體係由融合瘤所產生，其包括得自基因轉殖非人類動物(例如，基因轉殖小鼠)之B細胞(與永生細胞融合)，其具有包括人類重鏈轉殖基因與輕鏈轉殖基因之基因體。
本文所用之詞彙「重組式人類抗體(recombinant human antibody)」包括所有藉由重組方法製備、表現、產生或單離之人類抗體，諸如(a)自動物(例如，小鼠)或融合瘤(由動物製備，詳細描述於下)單離之抗體，該動物係基因轉殖或染色體轉殖(transchromosomal)有人類免疫球蛋白基因，(b)自宿主細胞單離之抗體，該宿主細胞係經轉形(transform)以表現人類抗體(例如，轉染瘤(transfectoma))，(c)自重組、組合式人類抗體資料庫單離之抗體，及(d)藉由任何其他方法(包括剪接人類免疫球蛋白基因序列至其他DNA序列)製備、表現、產生或單離之抗體。上述之重組式人類抗體之可變區中的框架區與CDR區係衍生自人類生殖細胞免疫球蛋白序列。然而某些實施例中，上述之重組式人類抗體可接受試管內突變(或者，當應用基因轉殖有人類Ig序列之動物時，則為活體內體細胞突變)，因此重組式抗體之VH 與VL 區的胺基酸序列雖然衍生自且相關於人類生殖細胞VH 與VL 序列，但可能並不自然存在於活體內的人類抗體生殖細胞庫(repertoire)中。
詞彙「同型(isotype)」代表重鏈恆定區基因所編碼的抗體類型(諸如，IgM或IgG1)。
可交替應用詞組「辨認抗原之抗體」與「對抗原專一之抗體」與詞組「專一性結合抗原之抗體」。
詞彙「人類抗體衍生物」代表人類抗體的任何修飾形式，例如抗體與另一試劑或抗體的接合體。
詞彙「人類化抗體」代表其中已經將衍生自另一哺乳物種(例如，小鼠)之生殖細胞的CDR序列轉移至人類框架序列的抗體。可在人類框架序列內製造額外的框架區修飾。
詞彙「嵌合抗體」代表其中可變區序列衍生自一物種而恆定區序列衍生自另一物種的抗體，例如可變區序列衍生自小鼠抗體而恆定區序列衍生自人類抗體的抗體。
詞彙「抗體模擬物」代表能夠模擬抗體結合抗原之能力的分子，但不限於自然抗體結構。上述抗體模擬物的實例包括(但不限於)親合體(Affibody)、DARPin、抗運載蛋白(Anticalin)、結合聚體(Avimer)與多工體(Versabody)，其進一步描述於下文。
詞彙「夥伴分子」代表在抗體-夥伴分子接合體中接合於抗體之實體。夥伴分子的實例包括藥物、毒素、標記分子、蛋白與治療劑。
本文所用之「專一性結合人類間皮素」的抗體係意圖代表結合人類間皮素之KD 值為1 x 10-7 M或更少的抗體，較佳為5 x 10-8 M或更少，較佳為3 x 10-8 M或更少，較佳為1 x 10-8 M或更少，更佳為5 x 10-9 M或更少。
本文所用之詞彙「不實質結合」蛋白或細胞意指不結合或不以高親合力結合蛋白或細胞，即結合蛋白或細胞的KD 為1 x 10-6 M或更多，較佳為1 x 10-5 M或更多，較佳為1 x 10-4 M或更多，較佳為1 x 10-3 M或更多，更佳為1 x 10-2 M或更多。
本文所用之詞彙「Kassoc 」或「Ka 」代表特定抗體-抗原交互作用的結合率，而本文所用之詞彙「Kdis 」或「Kd 」意圖代表特定抗體-抗原交互作用的分離率。本文所用之詞彙「KD 」代表解離常數，其係由Kd 除以Ka (即，Kd /Ka )得到並表示成莫耳濃度(M)。可利用技術中習知的方法確定抗體的KD 值。確定抗體KD 的較佳方法係利用表面電漿子共振(surface plasmon resonance)，較佳係利用例如系統之生物感應器系統。
詞彙IgG抗體的「高親合力」代表抗體對目標抗原的KD 值為1 x 10-7 M或更少，較佳為5 x 10-8 M或更少，較佳為1x10-8 M或更少，較佳為5 x 10-9 M或更少，更佳為1 x 10-9 M或更少。然而，針對其他抗體同型，「高親合力」結合有所不同。例如，IgM同型的「高親合力」結合代表抗體的KD 值為10-6 M或更少，較佳為10-7 M或更少，更佳為10-8 M或更少。
詞彙「個體」包括任何人類或非人類動物。詞彙「非人類動物」包括所有的脊椎動物，例如哺乳類與非哺乳類，諸如非人類靈長類、羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類、爬蟲類等。
除非另有明示，否則詞彙「烷基(alkyl)」其本身或作為另一取代基之部分意指具有標示碳原子數(即，C1 -C10 意指一至十個碳)的直鏈、支鏈或環狀烴原子團(radical)或上述之組合，其可為完全飽和、單元不飽和或多元不飽和的並可包括二價與多價原子團。飽和烴原子團的實例包括(但不限於)諸如甲基、乙基、正丙基(n-propyl)、異丙基(isopropyl)、正丁基、三級-丁基、異丁基、二級-丁基、環己基、(環己基)甲基、環丙基甲基(cyclopropylmethyl)以及諸如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同源物與異構物。不飽和烷基基團具有一或多個雙鍵或三鍵。不飽和烷基基團的實例包括(但不限於)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基(crotyl)、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2、4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基與3-丙炔基、3-丁炔基與較高的同源物與異構物。除非另有明示，否則詞彙「烷基」亦意圖包括更詳細界定於下之那些烷基衍生物，例如「雜烷基」。限於烴基之烷基基團稱為「同烷基(homoalkyl)」。
詞彙「伸烷基(alkylene)」其本身或作為另一取代基之部分意指衍生自烷烴之二價原子團，其之範例(但非限於)係-CH2 CH2 CH2 CH2 -，並進一步包括描述於下之「雜伸烷基(heteroalkylene)」的那些基團。一般而言，烷基(或伸烷基)基團具有1至24個碳原子，而本發明較佳係具有10或更少碳原子的那些基團。「小型烷基(lower alkyl)」或「小型伸烷基(lower alkylene)」係通常具有八或更少個碳原子的較短鏈烷基或伸烷基基團。
除非另有明示，否則詞彙「雜烷基(heteroalkyl)」其本身或搭配另一詞彙意指由指定數目的碳原子與至少一雜原子(選自O、N、Si與S)所構成之穩定直鏈或支鏈或環狀烴原子團或上述之組合，且其中氮、碳與硫原子可選擇性被氧化而氮雜原子可選擇性季銨化(quaternized)。雜原子O、N、S與Si可置於雜烷基基團的任何內部位置或置於烷基基團附著至分子其餘部分的位置。實例包括(但不限於)-CH2 CH2 OCH3 、-CH2 CH2 NHCH3 、-CH2 CH2 N(CH3 )2 、-CH2 SCH2 CH3 、-CH2 CH2 S(O)CH3 、-CH2 CH2 S(O)2 CH3 、-CH=CHOCH3 、-Si(CH3 )3 、-CH2 CH=NOCH3 與-CH=CHN(CH3 )2 。可具有連續高達兩個雜原子，諸如-CH2 NHOCH3 與-CH2 OSi(CH3 )3 。相似地，詞彙「雜伸烷基」其本身或作為另一取代基的部分意指衍生自雜烷基之二價原子團，其之範例(但不限於)為-CH2 CH2 SCH2 CH2 -與-CH2 SCH2 CH2 NHCH2 -。針對雜伸烷基基團，雜原子亦可佔據鏈端任一或兩者(諸如，伸烷氧基(alkyleneoxy)、伸烷二氧基(alkylenedioxy)、伸烷胺基(alkyleneamino)、伸烷二胺基(alkylenediamino)等)。詞彙「雜烷基」與「雜伸烷基」包括聚(乙二醇)與其衍生物(參閱，例如Shearwater Polymers Catalog,2001)。再者，針對伸烷基與雜伸烷基連接基團，所寫連接基團之式中方向並無暗示連接基團的方向。舉例而言，式-C(O)2 R’-代表-C(O)2 R’-與-R’C(O)2 -兩者。
詞彙「小型(lower)」搭配詞彙「烷基」或「雜烷基」時代表具有1至6個碳原子的部分。
以其慣用意思來應用詞彙「烷氧基」、「烷胺基」、「烷磺醯基(alkylsulfonyl)」與「烷硫基(alkylthio)」(或硫烷氧基)，且其分別代表透過氧原子、胺基基團、SO2 基團或硫原子附著至分子其餘部分的那些烷基基團。詞彙「芳磺醯基(arylsulfonyl)」代表芳基基團透過SO2 基團附著至分子其餘部分，而詞彙「氫硫基(sulfhydryl)」代表SH基團。
一般而言，「醯基取代基(acyl substituent)」亦選自上述群組中。本文所用之詞彙「醯基取代基」代表附著至並完成羰基碳價數的基團，其直接或間接附著至本發明化合物的多環核。
除非另有明示，否則詞彙「環烷基(cycloalkyl)」與「雜環烷基(heterocycloalkyl)」其本身或搭配其他詞彙，分別代表經取代或未經取代之「烷基」與經取代或未經取代之「雜烷基」的環狀形式。此外，針對雜環烷基，雜原子可佔據雜環附著至分子其餘部分的位置。環烷基的實例包括(但不限於)環戊基、環己基、1-環己烯基、3-環己烯基、環庚基等。雜環烷基的實例包括(但不限於)1-(1,2,5,6-四氫吡啶基)、1-哌啶基(1-piperidinyl)、2-哌啶基、3-哌啶基、4-啉基(4-morpholinyl)、3-啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌基(1-piperazinyl)、2-哌基等。環狀結構的雜原子與碳原子係選擇性被氧化。
除非另有明示，否則詞彙「鹵(halo)」或「鹵素(halogen)」其本身或作為另一取代基之部分意指氟、氯、溴或碘原子。此外，例如「鹵烷基(haloalkyl)」之詞彙意圖包括單鹵烷基與多鹵烷基。例如，詞彙「鹵(C1 -C4 )烷基(halo(C1 -C4 )alkyl)」意指包括(但不限於)三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另有明示，否則詞彙「芳基」意指經取代或未經取代之多元未飽和芳香族烴取代基，其可為單環或併合於一起或共價連接之多環(較佳為1至3環)。詞彙「雜芳基」意指包含1至4個雜原子之芳基基團(或環)，雜原子係選自N、O與S，其中可選擇性氧化氮、碳與硫原子並可選擇性季銨化(quaternize)氮雜原子。雜芳基基團可透過雜原子附著至分子的其餘部分。芳基與雜芳基基團的非限制性實例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡基、2-唑基、4-唑基、2-苯基-4-唑基、5-唑基、3-異唑基、4-異唑基、5-異唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基(purinyl)、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹啉基、5-喹啉基、3-喹啉基與6-喹啉基。各個上述芳基與雜芳基環系統的取代係選自下述可接受之取代基的群組。「芳基」與「雜芳基」亦包括其中一或更多非芳香族環系統併合或結合至芳基或雜芳基系統之環系統。
為了簡潔起見，當詞彙「芳基」與其他詞彙一起應用時(諸如，芳氧基(aryloxy)、芳硫氧基(arylthioxy)、芳烷基(arylalkyl))，其包括上方界定之芳基與雜芳基環兩者。因此，詞彙「芳烷基」意圖包括其中芳基基團附著至烷基基團之那些原子團(諸如，苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，其包括其中碳原子(例如，伸甲基基團)已經由例如氧原子所取代之那些烷基基團(諸如，苯氧基甲基(phenoxymethyl)、2-吡啶氧基甲基(2-pyridyloxymethyl)、3-(1-萘氧基)丙基等)。
各個上述詞彙(諸如，「烷基」、「雜烷基」、「芳基」與「雜芳基」)包括所示原子團之經取代與未經取代形式。下方提供各種原子團類型之較佳取代基。
烷基與雜烷基原子團(包括那些時常稱為伸烷基、烯基、雜伸烷基、雜烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基與雜環烯基)的取代基一般分別稱為「烷基取代基」與「雜烷基取代基」，且其可為一或更多選自下列基團之變體(但不限於)：-OR’、=O、=NR’、=NOR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R”’、-OC(=O)R’、-C(=O)R’、-CO2 R’、-CONR’R”、-OC(=O)NR’R”、-NR”C(=O)R’、-NR’-C(=O)NR”R”’、-NR”C(=O)2 R’、-NR-C(NR’R”R’”)=NR””、-NRC(NR’R”)=NR’”、-S(O)R’、-S(O)2 R’、-S(O)2 NR’R”、-NRSO2 R’、-CN與-NO2 ，數目範圍由零至(2m’+1)，其中m’係上述原子團中的碳原子總數。R’、R”、R”’與R””各個較佳分別代表氫、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳基(例如，經1-3鹵素取代之芳基)、經取代或未經取代之烷基、烷氧基或硫烷氧基基團或芳烷基基團。例如當本發明之化合物具有超過一個R基團，當這些基團存在超過一個時將各個R基團分別選擇成各個R’、R”、R’”與R””基團。當R’與R”附著至相同氮原子時，它們可與氮原子結合形成5、6或7-員(member)環。例如，-NR’R”意圖包括(但不限於)1-吡咯烷基(1-pyrrolidinyl)與4-啉基。由上述取代基的討論，熟悉技術人士可理解詞彙「烷基」意圖包括具有碳原子結合至非氫基團之基團，諸如鹵烷基(諸如，-CF3 與-CH2 CF3 )與醯基(諸如，-C(O)CH3 、-C(O)CF3 、-C(=O)CH2 OCH3 等)。
相似於烷基原子團取代基之描述，芳基取代基與雜芳基取代基一般分別稱為「芳基取代基」與「雜芳基取代基」，並係多變且選自諸如：鹵素、-OR’、=O、=NR’、=N-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R”’、-OC(=O)R’、-C(=O)R’、-CO2 R’、-C(=O)NR’R”、-OC(=O)NR’R”、-NR”C(=O)R’、-NR’-C(=O)NR”R”’、-NR”CO2 R’、-NR-C(NR’R”)=NR’”、-S(=O)R’、-S(=O)2 R’、-S(=O)2 NR’R”、-NRSO2 R’、-CN與-NO2 、-R’、-N3 、-CH(Ph)2 、氟(C1 -C4 )烷氧基與氟(C1 -C4 )烷基，數目範圍由零至芳香環系統上開價(open valence)的總數；且其中R’、R”、R”’與R””較佳分別選自氫、(C1 -C8 )烷基與雜烷基、未經取代之芳基與雜芳基、(未經取代之芳基)-(C1 -C4 )烷基與(未經取代之芳基)氧基-(C1 -C4 )烷基。例如當本發明之化合物具有超過一個R基團，當這些基團存在超過一個時將各個R基團分別選擇成各個R’、R”、R’”與R””基團。
芳基或雜芳基環之相鄰原子上的兩個芳基取代基可選擇性由式-T-C(O)-(CRR’)q -U-之取代基取代，其中T與U分別為-NR-、-O-、-CRR’-或單鍵，而q係0至3的整數。或者，芳基或雜芳基環之相鄰原子上的兩個取代基可選擇性由式-A-(CH2 )r -B-之取代基取代，其中A與B分別為-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2 -、-S(O)2 NR’-或單鍵，而r係1至4的整數。如此形成之新環的單鍵之一可選擇性由雙鍵所取代。或者，芳基或雜芳基環之相鄰原子上的兩個取代基可選擇性由式-(CRR’)s -X-(CR”R’”)d -之取代基取代，其中s與d分別為0至3的整數，且X係-O-、-NR’-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)2 -或-S(=O)2 NR’-。取代基R、R’、R”與R’”較佳分別選自氫或經取代或未經取代之(C1 -C6 )烷基。
本文所用之詞彙「二磷酸(diphosphate)」包括(但不限於)包含兩個磷酸基團之磷酸酯。詞彙「三磷酸(triphosphate)」包括(但不限於)包含三個磷酸基團之磷酸酯。
本文所用之詞彙「雜原子」包括氧(O)、氮(N)、硫(S)與矽(Si)。
除非本文另有明示，否則符號「R」為普遍的縮寫式，其代表選自經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基與經取代或未經取代之雜環基(heterocyclyl)基團的取代基基團。
本發明不同態樣係進一步詳細描述於下列段落。
具有特定功能特性的抗-間皮素抗體
藉由特定功能特徵或特性來描述本揭露之抗體。例如，其專一性結合人類間皮素，例如細胞表面上表現之人類間皮素。本揭露之抗體較佳係以高親合力結合人類間皮素，諸如1 x 10-7 M或更少的KD 、更佳係5 x 10-8 M或更少的KD 且又更佳係1 x 10-8 M或更少的KD 。本揭露之抗-間皮素抗體結合人類間皮素並較佳呈現一或多個下列特性：
(a)以1 x 10-8 M或更少的KD 結合人類間皮素；
(b)由表現間皮素之細胞所內化；
(c)抑制間皮素對卵巢癌抗原CA125的結合；
(d)對表現間皮素之細胞呈現抗體-依賴型細胞毒性(ADCC)；及
(e)當接合至細胞毒素時活體內抑制表現間皮素之細胞的生長。
本揭露之抗體較佳係以5 x 10-8 M或.更少的KD 結合至間皮素蛋白、以3 x 10-8 M或更少的KD 結合至間皮素蛋白、以1 x 10-8 M或更少的KD 結合至間皮素蛋白、以7 x 10-9 M或更少的KD 結合至間皮素蛋白、以6 x 10-9 M或更少的KD 結合至間皮素蛋白、以5 x 10-9 M或更少的KD 結合至間皮素蛋白。可藉由例如標準BIACORE分析(參閱例如，實施例3B)來評估抗體對間皮素的結合親合力。
本發明之較佳抗體係人類單株抗體。額外或替代地，該抗體可為諸如嵌合或人類化單株抗體。
單株抗體3C10、6A4與7B1
本揭露之較佳抗體係人類單株抗體3C10、6A4與7B1，如實施例1與2所述般單離並結構上描述。3C10、6A4與7B1的VH 胺基酸序列分別顯示於序列編號：19、20與21。3C10、6A4與7B1的VL 胺基酸序列分別顯示於序列編號：22、23與24。
另一態樣中，本揭露提供包含3C10、6A4或7B1之重鏈與輕鏈CDR1、CDR2與CDR3或上述之組合的抗體。3C10、6A4與7B1之VH CDR1的胺基酸序列係分別顯示於序列編號：1-3。3C10、6A4與7B1之VH CDR2的胺基酸序列係分別顯示於序列編號：4-6。3C10、6A4與7B1之VH CDR3的胺基酸序列係分別顯示於序列編號：7-9。3C10、6A4與7B1之VL CDR1的胺基酸序列係分別顯示於序列編號：10-12。3C10、6A4與7B1之VL CDR2的胺基酸序列係分別顯示於序列編號：13-15。3C10、6A4與7B1之VL CDR3的胺基酸序列係分別顯示於序列編號：16-18。利用Kabat系統(Kabat,E. A.等人(1991)Sequences of Proteins of Im munological Interest，第5版，US Department of Health and Human Services，NIH刊物編號91-3242，之後稱為「Kabat‘242」)來描繪CDR區。
已知各個這些抗體可結合人類間皮素且抗原結合專一性主要由CDR1、CDR2與CDR3區所提供，VH CDR1、CDR2與CDR3序列以及VL CDR1、CDR2與CDR3序列可經「混合與匹配(mixed and matched)」(即，雖然各個抗體並須包含VH CDR1、CDR2與CDR3以及VL CDR1、CDR2與CDR3，但可混合與匹配來自不同抗體的CDR)以產生本揭露其他抗-間皮素結合分子。當混合與匹配VH CDR序列時，來自特定VH 序列的CDR1、CDR2與/或CDR3序列較佳係由結構相似的CDR序列所取代。同樣地，當混合與匹配VL CDR序列時，來自特定VL 序列的CDR1、CDR2與/或CDR3序列較佳係由結構相似的CDR序列所取代。熟悉技術人士可輕易理解可由本文揭露單株抗體3C10、6A4與7B1之CDR序列藉由以結構相似序列取代一或多個VH 與/或VL CDR區序列來產生新的VH 與VL 序列。
因此，另一態樣中，本揭露提供單離的單株抗體或其抗原結合部分，其包括：
(a)重鏈可變區CDR1，其包括選自序列編號：1-3所構成之群組的胺基酸序列；
(b)重鏈可變區CDR2，其包括選自序列編號：4-6所構成之群組的胺基酸序列；
(c)重鏈可變區CDR3，其包括選自序列編號：7-9所構成之群組的胺基酸序列；
(d)輕鏈可變區CDR1，其包括選自序列編號：10-12所構成之群組的胺基酸序列；
(e)輕鏈可變區CDR2，其包括選自序列編號：13-15所構成之群組的胺基酸序列；及
(f)輕鏈可變區CDR3，其包括選自序列編號：16-18所構成之群組的胺基酸序列；
其中該抗體專一性結合人類間皮素。
一較佳實施例中，抗體係根據實施例A。另一較佳實施例中，抗體係根據實施例B。又另一較佳實施例中，抗體係根據實施例C。
技術中習知CDR3區塊可單獨(與CDR1與/或CDR2區塊無關)決定抗體對同源(cognate)抗原的結合專一性，且可根據相同的CDR3序列預期產生具有相同結合專一性的多個抗體。
因此，本揭露提供包含衍生自人類或非人類動物抗體之一或多個重鏈與/或輕鏈CDR3區塊的單株抗體，其中該單株抗體能夠專一性結合人類間皮素。某些態樣中，本揭露提供包含來自非人類抗體(諸如，小鼠或大鼠抗體)之一或多個重鏈與/或輕鏈CDR3區塊的單株抗體，其中該單株抗體能夠專一性結合間皮素。某些實施例中，上述包含一或多個來自非人類抗體之重鏈與/或輕鏈CDR3區塊的本發明抗體與對應的親本非人類抗體(a)能夠競爭性結合；(b)保留功能性特徵；(c)結合相同的表位；與/或(d)具有相似的結合專一性。
其他態樣中，本揭露提供包含一或多個來自人類抗體(例如，由非人類動物取得之人類抗體)之重鏈與/或輕鏈CDR3區塊的單株抗體，其中該人類抗體能夠專一性結合人類間皮素。其他態樣中，本揭露提供包含一或多個來自第一人類抗體(例如，由非人類動物取得之人類抗體)之重鏈與/或輕鏈CDR3區塊的單株抗體，其中第一人類抗體能夠專一性結合人類間皮素，且其中來自第一人類抗體的CDR3區塊取代缺少對間皮素結合專一性之人類抗體中的CDR3區塊，以產生能夠專一性結合人類間皮素之第二人類抗體。某些實施例中，上述包含一或多個來自第一人類抗體之重鏈與/或輕鏈CDR3區塊的本發明抗體與對應之親本第一人類抗體(a)能夠競爭性結合；(b)保有功能性特徵；(c)結合相同的表位；與/或(d)具有相似的結合專一性。
具有特定生殖細胞序列的抗體
某些實施例中，本揭露之抗體包含來自特定生殖細胞重鏈免疫球蛋白基因的VH 與/或來自特定生殖細胞輕鏈免疫球蛋白基因的VL 。
例如較佳實施例中，本揭露提供單離的單株抗體或其抗原結合部分，其包括衍生自人類VH 3-33基因或人類VH 3-7基因或其之產物的VH ，其中抗體專一性結合人類間皮素。另一較佳實施例中，本揭露提供單離的單株抗體或其抗原結合部分，其包括衍生自人類VK L6基因或人類VK A27基因或其之產物的VL ，其中抗體專一性結合人類間皮素。又另一較佳實施例中，本揭露提供單離的單株抗體或其抗原結合部分，其中抗體包括衍生自人類VH 3-33基因或其之產物的VH 並包括衍生自人類VK L6基因或其之產物的VL ，其中抗體專一性結合人類間皮素。又另一較佳實施例中，本揭露提供單離的單株抗體或其抗原結合部分，其中抗體包括衍生自人類VH 3-7基因或其之產物的VH 並包括衍生自人類VK A27基因或其之產物的VL ，其中抗體專一性結合人類間皮素。
上述抗體亦具有一或多個上方詳細描述之功能性特徵，諸如高親合力結合人類間皮素、由表現間皮素之細胞所內化、抑制間皮素對CA125的結合、介導對表現間皮素之細胞ADCC的能力與/或當接合至細胞毒素時活體內抑制表現間皮素之腫瘤細胞生長的能力。
VH 與VL 分別為VH 3-33與VK L6之抗體的實例係3C10與6A4抗體。VH 與VL 分別為VH 3-7與VK A27之抗體的實例係7B1抗體。
若係由利用人類生殖細胞免疫球蛋白基因之系統取得抗體之可變區，則本文所用之包含重鏈或輕鏈可變區的人類抗體係特定生殖細胞序列的「產物」或「由其衍生」。上述系統包括以關注之抗原免疫帶有人類免疫球蛋白基因之基因轉殖小鼠或以關注之抗原篩選噬菌體上呈現的人類免疫球蛋白基因資料庫。可藉由比較人類抗體之胺基酸序列與人類生殖細胞免疫球蛋白之胺基酸序列並選擇序列最接近(即，最大的相同性%)人類抗體之序列的人類生殖細胞免疫球蛋白序列，來確認人類生殖細胞免疫球蛋白序列的「產物」或「由其衍生」之人類抗體。特定人類生殖細胞免疫球蛋白序列的「產物」或「由其衍生」之人類抗體與生殖細胞序列相比可具有胺基酸差異，這係因為例如自然存在的體細胞突變或故意導入的定點突變。然而，所選之人類抗體的胺基酸序列通常至少90%相同於人類生殖細胞免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列，並包含與其他物種生殖細胞免疫球蛋白胺基酸序列(例如，鼠科生殖細胞序列)相比時能確認該人類抗體係屬於人類之胺基酸殘基。某些實例中，人類抗體胺基酸序列至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%相同於生殖細胞免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列。一般而言，特定人類生殖細胞序列衍生之人類抗體呈現與人類生殖細胞免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列之間不超過10個胺基酸差異。某些實例中，人類抗體呈現與生殖細胞免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列之間不超過5個或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸差異。
同源抗體
又另一實施例中，包含重鏈與輕鏈可變區之本揭露抗體的胺基酸序列係同源於本文所述之較佳抗體的胺基酸序列，且其中抗體保有本揭露之抗-間皮素抗體的所欲功能特性。
例如，本揭露提供單離的單株抗體或其抗原結合部分，其包括VH 與VL ，其中：(a)VH 之胺基酸序列至少80%同源於選自序列編號：19-21所構成之群組的胺基酸序列；(b)VL 之胺基酸序列至少80%同源於選自序列編號：22-24；及(c)抗體專一性結合人類間皮素。
其他實施例中，VH 與/或VL 胺基酸序列係85%、90%、95%﹑96%、97%、98%或99%同源於上列序列。可藉由序列編號：25-27或28-30所編碼之核酸分子的突變法(諸如，定點或PCR介導之突變法)接著利用本文所述之功能性試驗來測試編碼之改變抗體是否保有功能(即，上列之功能)，來取得具有與上列序列之VH 與VL 區高度(即，80%或更高)同源之VH 與VL 區的抗體。
兩個胺基酸序列之間的同源百分比相當於兩個序列之間的相同性百分比。兩個序列之間的相同性百分比係序列共有之相同位置數目的函數(即，%同源=相同位置的#/位置的總數# x 100)，考慮間隔數目與各個間隔的長度，需要導入這些因素以最佳比對兩個序列。可利用下方非限制實例所述之數學演算法完成序列比較並確定兩個序列之間的相同性百分比。
可利用E. Meyers與W. Miller(Comput. Appl. Biosci., 4 :11-17(1988))的演算法(其已經被併入ALIGN程式(版本2.0))來確定兩個胺基酸序列之間的相同性百分比，其利用PAM120加權殘基表(weight residue table)、12的間隔長度罰分(gap length penalty)與4的間隔罰分(gap penalty)。此外，可利用Needleman與Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453(1970))演算法(其已經被併入GCG軟體組的GAP程式(可自http://www.gcg.com取得))來確定兩個胺基酸序列之間的相同性百分比，其利用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣任一，以及16、14、12、10、8、6或4的間隔加權(gap weight)與1、2、3、4、5或6的長度加權(length weight)。
本揭露之蛋白序列亦可當作「查詢序列」以對公開資料庫搜尋好例如辨別相關序列。可利用Altschul等人(1990)J. Mol. Biol. 215 :403-10的XBLAST程式(版本2.0)執行上述搜尋。可以XBLAST程式、分數=50、字長=3執行BLAST蛋白搜尋以取得與本揭露抗體分子同源的胺基酸序列。為了取得比較目的所用之間隔比對，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402所述般利用間隔BLAST。當利用BLAST與間隔BLAST程式時，可用各自程式(諸如，XBLAST與NBLAST)的默認參數。參閱www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保留性修飾之抗體
某些實施例中，本揭露之抗體包括VH (包含CDR1、CDR2與CDR3序列)與VL (包含CDR1、CDR2與CDR3序列)，其中一或多個這些CDR序列包括根據已知抗-間皮素抗體的特定胺基酸序列或其之保留性修飾，且其中抗體保有本揭露之抗-間皮素抗體的所欲功能特性。技術中已知可產生某些不會移除抗原結合的保留性序列修飾。因此，本揭露提供單離的單株抗體或其抗原結合部分，其包括VH (包含CDR1、CDR2與CDR3序列)與VL (包含CDR1、CDR2與CDR3序列)，其中：(a)VH CDR3序列包括選自序列編號：7-9之胺基酸序列所構成之群組的胺基酸序列與其之保留性修飾；(b)VL CDR3序列包括選自序列編號：16-18之胺基酸序列所構成之群組的胺基酸序列與其之保留性修飾；及(c)抗體專一性結合人類間皮素。
較佳實施例中，重鏈可變區CDR2序列包括選自序列編號：4-6之胺基酸序列所構成之群組的胺基酸序列與其之保留性修飾；而輕鏈可變區CDR2序列包括選自序列編號：13-15之胺基酸序列所構成之群組的胺基酸序列與其之保留性修飾。另一較佳實施例中，重鏈可變區CDR1序列包括選自序列編號：1-3之胺基酸序列所構成之群組的胺基酸序列與其之保留性修飾；而輕鏈可變區CDR1序列包括選自序列編號：10-12之胺基酸序列所構成之群組的胺基酸序列與其之保留性修飾。
詞彙「保留性序列修飾」代表不明顯影響或改變包含胺基酸序列的抗體之結合特徵的胺基酸修飾。上述保留性修飾包括胺基酸取代、附加與刪除。可藉由技術中已知的標準技術將修飾導入抗體，諸如定點突變法與PCR介導之突變法。保留性胺基酸取代係胺基酸殘基由具有相似側鏈之胺基酸殘基取代。技術中已經界定具有相似側鏈的胺基酸殘基家族。這些家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(諸如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈之胺基酸(諸如，天冬胺酸、麩胺酸)、未帶電極性側鏈之胺基酸(諸如，甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸﹑蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈之胺基酸(諸如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β-支鏈之胺基酸(諸如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)與芳香族側鏈之胺基酸(諸如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，本揭露之抗體的CDR區中一或多個胺基酸殘基可由來自相同側鏈家族的其他胺基酸殘基所取代，並可利用本文所述之功能性試驗來測試經改變之抗體是否保有功能。
與抗-間皮素抗體結合相同表位的抗體
另一實施例中，本揭露提供結合間皮素上由本揭露任何抗-間皮素單株抗體所辨認之表位的抗體(即，抗體具有與本揭露任何單株抗體交互競爭結合人類間皮素的能力)。較佳實施例中，交互競爭研究的參考抗體可為單株抗體3C10(其之VH 與VL 序列分別顯示於序列編號：19與22)或單株抗體6A4(其之VH 與VL 序列分別顯示於序列編號：20與23)或單株抗體7B1(其之VH 與VL 序列分別顯示於序列編號：21與24)。
可根據其在標準間皮素結合試驗(諸如，ELISA或BIAcore分析)與3C10、6A4或7B1交互競爭的能力來辨別上述交互競爭之抗體。較佳實施例中，結合人類間皮素上由3C10、6A4或7B1所辨別之相同表位的抗體係人類單株抗體。可如實施例所述般製備並單離上述人類單株抗體。
設計與修飾之抗體
可利用具有一或多個已知抗-間皮素抗體VH 與/或VL 序列之抗體作為起始材料來設計與起始抗體相比特性改變之修飾抗體而進一步製備本發明之抗體。可修飾VH 與VL 一或兩者中、一或多個CDR區中與/或一或多個框架區中的一或多個胺基酸。額外或替代地，可修飾恆定區中之殘基以改變抗體的效應子功能。
某些實施例中，CDR剪接可用來設計抗體的可變區。抗體與目標抗原的交互作用主要係透過其CDR中的胺基酸殘基。因此各個抗體之間，CDR中的胺基酸序列比起CDR外的序列較為多變。由於CDR序列負責大部分的抗體-抗原交互作用，藉由構築包括將來自特定的自然存在抗體之CDR序列剪接至來自具有不同特性之不同抗體的框架序列上的表現載體，表現模擬特定的自然存在抗體特性之重組抗體係有可能的(參閱諸如，Riechmann,L.等人(1998)Nature 332 :323-327；Jones,P.等人(1986)Nature 321:522-525；Queen,C.等人(1989)Proc. Natl. Acad. See. USA. 86 :10029-10033；Winter的美國專利號5,225,539以及Queen等人的美國專利號5,530,101、5,585,089、5,693,762與6,180,370)。
因此，本揭露之另一實施例係關於單離的單株抗體或其抗原結合部分，其包括VH (包含CDR1、CDR2與CDR3序列，其分別包括選自序列編號：1-3、序列編號：4-6與序列編號：7-9所構成之群組的胺基酸序列)與VL (包含CDR1、CDR2與CDR3序列，其分別包括選自序列編號：10-12、序列編號：13-15與序列編號：16-18所構成之群組的胺基酸序列)。因此，上述抗體包含單株抗體3C10、6A4或7B1之VH 與VL CDR序列還可包含來自這些抗體的不同框架序列。
可由公開DNA資料庫或包含生殖細胞抗體基因序列之公開文獻取得上述框架序列。例如，人類VH 與VL 基因的生殖細胞DNA序列可在下列中發現：「Vbase」人類生殖細胞序列資料庫(可在網際網路上的www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase取得)以及Kabat‘242；Tomlinson,I. M.等人(1992)J. Mol. Biol. 227 :776-798；與Cox,J. P. L.等人(1994)Eur. J. Immunol. 24 :827-836；其各個以參考資料併入本文中。作為另一實例，可在基因銀行資料庫中發現人類VH 與VL 基因的生殖細胞DNA序列。例如，可由伴隨的基因銀行登錄號取得HCo7 HuMAb小鼠中發現的下列重鏈生殖細胞序列：1-69(NG_0010109、NT_024637與BC070333)、3-33(NG_0010109與NT_024637)與3-7(NG_0010109與NT_024637)。作為另一實例，可由伴隨的基因銀行登錄號取得HuMAb小鼠類型的HCo12小鼠中發現的下列重鏈生殖細胞序列：1-69(NG_0010109、NT_024637與BC070333)、5-51(NG-0010109與NT_024637)、4-34(NG_0010109與NT_024637)、3-30.3(CAJ556644)與(AJ406678)。人類重鏈與輕鏈生殖細胞序列的又另一來源係由IMGT(http://imgt.cines.fr)取得的人類免疫球蛋白基因資料庫。
利用技術中習知且稱為間隔BLAST(Altschul等人(1997)Nucleic Acids Research 25 :3389-3402)的一種序列相似性搜尋方法來比較抗體蛋白序列與編譯之蛋白序列資料庫。BLAST係試探演算法(heuristic algorithm)，其中抗體序列與資料庫序列之間統計上明顯的比對可能包含比對字元的高分片段對(high-scoring segment pair,HSP)。無法藉由延長或修剪改善的片段對分數稱為命中(hit )。簡單的說，轉譯VBASE起源(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php )的核苷酸序列並保留FR1到FR3框架區之間並包括FR1到FR3框架區的區域。資料庫序列的平均長度係98個殘基。移除完全符合蛋白整個長度的複製序列。以除了關掉的低複雜度濾器(low complexity filter)以外的默認標準參數與BLOSUM62的取代矩陣來利用程式blastp的BLAST搜尋蛋白過濾出最高的5個命中產生序列匹對。轉譯全部六個讀框(frame)的核苷酸序列，而將資料庫序列的匹對片段中不具有終止子的讀框視為可能命中。接著利用BLAST程式tblastx來確認，其轉譯全部六個讀框的抗體序列並將這些轉譯本與動態轉譯所有六個讀框之VBASE核苷酸序列相比。可如上述VBASE般相似地搜尋其他人類生殖細胞序列資料庫，例如得自IMGT(http://imgt.cines.fr)。
相同係抗體序列與蛋白資料庫之間在序列的整體長度上的準確胺基酸匹配。陽性(相同+取代匹配)非相同的但為BLOSUM62取代矩陣所引導的胺基酸取代。若抗體序列以同樣的相同性匹配兩個資料庫序列，則決定具有最大陽性的命中為匹配序列命中。
用於本揭露之抗體的較佳框架序列係結構相似於本揭露選擇之抗體所用的框架序列，例如相似於VH 3-33(序列編號：31)或VH 3-7(序列編號：32)框架序列與/或VK L6(序列編號：33)或VK A27(序列編號：34)框架序列。可將VH CDR1、CDR2與CDR3序列以及VK CDR1、CDR2與CDR3序列剪接至與框架序列衍生之生殖細胞免疫球蛋白基因中發現者相同序列的框架區上，或可將CDR序列剪接至包含一或多個突變(與生殖細胞序列相比)的框架區上。例如，已經在某些實例中發現突變框架區中的殘基有利於維持或提高抗原結合能力(參見諸如，Queen等人的美國專利號5,530,101、5,585,089、5,693,762與6,180,370)。
可變區修飾的另一類型係突變VH 與/或VK CDR1、CDR2與/或CDR3區中的胺基酸殘基以改善一或更多結合特性(例如，親合力)。可執行定點突變法或PCR介導之突變法以導入突變，而可如本文所述之試管內或活體內試驗評估其對抗體結合或其他關注之功能特性的影響。較佳係導入保留性修飾。突變可為胺基酸取代、附加或刪減，但較佳係取代。再者，通常不改變超過CDR區中一、二、三、四或五個殘基。
因此，另一實施例中，本揭露提供單離的抗-間皮素單株抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)VH CDR1區，其包括選自序列編號：1-3所構成之群組的胺基酸序列、或與序列編號：1-3相比具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、刪除或附加的胺基酸序列；(b)VH CDR2區，其包括選自序列編號：4-6所構成之群組的胺基酸序列、或與序列編號：4-6相比具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、刪除或附加的胺基酸序列；(c)VH CDR3區，其包括選自序列編號：7-9所構成之群組的胺基酸序列、或與序列編號：7-9相比具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、刪除或附加的胺基酸序列；(d)VL CDR1區，其包括選自序列編號：10-12所構成之群組的胺基酸序列、或與序列編號：10-12相比具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、刪除或附加的胺基酸序列；(e)VL CDR2區，其包括選自序列編號：13-15所構成之群組的胺基酸序列、或與序列編號：13-15相比具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、刪除或附加的胺基酸序列；及(f)VL CDR3區，其包括選自序列編號：16-18所構成之群組的胺基酸序列、或與序列編號：16-18相比具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、刪除或附加的胺基酸序列。
本發明設計之抗體包括已經對VH 與/或VL 中框架殘基進行修飾以例如改善抗體特性的那些抗體。通常進行上述框架修飾以減少抗體的免疫原性。一種方法係將一或多個框架殘基「回覆突變(backmutate)」成對應的生殖細胞序列。更明確地說，經歷過體細胞突變之抗體可包含與抗體衍生之生殖細胞序列不同的框架殘基。可藉由比較抗體框架序列與抗體衍生之生殖細胞序列來辨別上述殘基。
例如，表A顯示不同於生殖細胞之框架區胺基酸位置(利用Kabat編號系統)的區以及如何藉由所標示之取代將此位置回覆突變至生殖細胞：
另一類型的框架修飾包括突變框架區或甚至一或多個CDR區中的一或多個殘基以移除T細胞表位好藉此減少抗體的可能免疫原性。此方法亦稱為「去免疫(deimmunization)」且進一步詳細描述於Carr等人的美國專利申請案2003/0153043。
框架或CDR區中之修飾的另外或替代，可設計本發明之抗體在Fc區中包括修飾，通常係用於改變一或多個功能特性，諸如血清半生期、補體固定、Fc受體結合與/或抗原依賴型細胞毒性。再者，可化學修飾(例如，可附著一或多個化學基團至抗體)或修飾本發明之抗體以改變其醣化而改變一或多個功能特性。各個這些實施例係進一步詳細描述於下。Fc區中的殘基編號係Kabat的EU索引。
一實施例中，如Bodmer等人的美國專利號5,677,425所述般修飾CH1的樞紐區以便改變(即，增加或減少)樞紐區中的半胱胺酸殘基數目。上述改變可促進輕鏈與重鏈的組裝或提高或減少抗體的穩定性。
另一實施例中，突變抗體之Fc樞紐區以減少抗體的生物半生期。更明確地說，將一或多個胺基酸突變導入Fc-樞紐片段的CH2-CH3區塊接合區以致抗體具有相對於自然Fc-樞紐區塊SpA結合受損的葡萄球菌蛋白A(Staphylococcyl protein A,SpA)結合，如Ward等人的美國專利號6,165,745所述。
另一實施例中，修飾抗體以提高其生物半生期。例如，可如Ward的美國專利號6,277,375所述般導入一或多個下列突變：T252L、T254S、T256F。或者，可在CH1或CL 區中改變抗體以包含取自IgG之Fc區的CH2區塊之兩個環的回收(salvage)受體結合表位，如Presta等人的美國專利號5,869,046與6,121,022所述。
又其他實施例中，藉由以不同的胺基酸殘基取代至少一胺基酸殘基來改變Fc區以改變其效應子功能。例如，可以不同的胺基酸殘基取代一或多個胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320與322以便抗體對效應子配體-諸如Fc受體或補體的Cl成分-的親合力改變但保有親本抗體的抗原結合能力，如Winter等人的美國專利號5,624,821與5,648,260所述。
另一實施例中，可取代一或多個胺基酸殘基329、331與322以便抗體具有改變之Clq結合與/或減少或廢止之補體依賴型毒性(CDC)，如Idusogie等人的美國專利號6,194,551所述。
另一實施例中，改變胺基酸位置231與239中的一或多個胺基酸殘基以藉此改變抗體固定補體的能力。此方法係進一步描述於Bodmer等人的WO 94/29351。
又另一實施例中，修飾Fc區以提高抗體介導抗體-依賴型細胞毒性(ADCC)的能力與/或提高抗體對Fcγ受體的親合力，其藉由修飾一或多個下列位置的胺基酸：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。此方法係進一步描述於Presta的WO 00/42072。再者，已經繪製人類IgG1上針對FcγR1、FcγRII、FcγRIII與FcRn的結合位置並已經描述結合改善之變體(參閱，Shields,R.L.等人(2001)J. Biol. Chem. 276:6591-6604)。位置256、290、298、333、334與339上的特定突變係可改善對FcγRIII的結合。此外，下列組合突變係可改善FcγRIII的結合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A與S298A/E333A/K334A。
又另一實施例中，如PCT/US2008/073569(其之全文以參考資料併入)所述般藉由導入半胱胺酸殘基來修飾本發明之抗體的C-端。上述修飾包括(但不限於)在全長重鏈序列的C-端處或鄰近處取代存在之肽基酸殘基，以及將含半胱胺酸之延長導入全長重鏈序列的C-端。較佳實施例中，含半胱胺酸之延長包括序列半胱胺酸-丙胺酸-丙胺酸(由N-端至C-端)。
較佳實施例中，上述C-端半胱胺酸修飾的存在提供接合夥伴分子(諸如，治療劑或標記分子)的位置。明確地說，由於C-端半胱胺酸修飾，反應性硫醇基團的存在可利用雙硫連接子或氫硫基-反應性順丁烯二醯亞胺(maleimide)基團而用來接合夥伴分子。以此方法將抗體接合至夥伴分子可提高對特定附著位置的控制。再者，藉由在C-端或鄰近處導入附著位置，可使接合最佳化以致其減少或排除對抗體功能特性的干擾，並可簡化接合體製備的分析與品質控制。
又另一實施例中，藉由排除醣化(去醣化)或改變醣化位置來修飾抗體的醣化以提高其對其之抗原的親合力。例如，可進行一或多個胺基酸取代以便排除一或多個可變區框架醣化位置。上述去醣化可提高抗體對抗原的親合力。參閱Co等人的美國專利號5,714,350與6,350,861。改變醣化的額外方法係描述於Hanai等人的美國專利號7,214,775；Presta的美國專利號6,737,056；Presta的美國專利申請號20070020260；Dickey等人的WO 2007/084926；Zhu等人的WO 2006/089294；及RaVetch等人的WO 2007/055916；其各個全文以參考資料併入。
額外或替代地，可製造具有醣化類型改變之抗體，例如岩藻糖基(fucosyl)殘基數量減少的輕度岩藻糖化(hypofucosylated)抗體或具有增加之二分GlcNac結構的抗體。已經證明上述改變之醣化型態可提高抗體的ADCC能力。可藉由例如將抗體表現於醣化方法改變之宿主細胞來完成上述之醣修飾。例如，細胞株Ms704、Ms705與Ms709缺少岩藻糖基轉移酶基因FUT8(α(1,6)岩藻糖基轉移酶)，以致這些細胞中表現之抗體在其醣上缺少岩藻糖。參閱Yamane等人的US2004/0110704以及Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol Bioeng 87 :614-22。作為另一實例，Hanai等人的EP 1,176,195描述FUT8基因(編碼岩藻糖基轉移酶)功能性破壞的細胞株，以致上述細胞株表現之抗體呈現輕度岩藻糖化。Hanai等人亦描述將岩藻糖附著至N-乙醯葡萄胺糖(結合抗體的Fc區)酵素活性低的細胞株。Presta的WO 03/035835描述將岩藻糖附著至Asn(297)-連接醣能力降低的變異CHO細胞株Lec13細胞亦造成輕度岩藻糖化(亦可參閱Shields,R.L.等人(2002)J. Biol. Chem. 277:26733-26740)。Umana等人的WO 99/54342描述設計用以表現醣蛋白修飾之醣基轉移酶的細胞株，以致這些細胞株表現之抗體呈現增加的二分GlcNac結構與增加的抗體ADCC活性(亦可參閱Umana等人(1999)Nat. Biotech. 17 :176-180)。或者，可利用岩藻糖苷酶(fucosidase)酵素來切除抗體的岩藻糖殘基(Tarentino,A.L.等人(1975)Biochem. 14 :5516-23)。
額外或附加地，可製造醣化類型改變的抗體，其中改變係關於抗體的唾液酸化(sialyation)水平。上述改變係描述於Dickey等人的WO 2007/084926與Ravetch等人的WO 2007/055916，兩者皆以參考資料併入。例如，可應用帶有唾液酸酶的酵素反應，例如描述於US5,831,077，其以參考資料在此併入。適當酵素的其他實例係神經胺酸酶(neuraminidase)與N-醣苷酶F(N-Glycosidase F)，分別描述於Schloemer等人J. Virology,15(4),882-893(1975)與Leibiger等人Biochem J.,338,529-538(1999)。或者，可應用方法來提高唾液酸化的水平，例如藉由應用唾液酸轉移酶酵素，描述於Basset等人Scandinavian Journal of Immunology,51(3),307-311(2000)。
本發明盤計之另一抗體修飾係聚乙二醇化(pegylation)。可聚乙二醇化抗體以例如提高其生物(例如，血清)半生期。為了聚乙二醇化抗體，一般係將抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)衍生物(諸如，PEG的反應性酯類或醛類衍生物)反應。或者，透過反應性PEG分子(或類似反應性水溶聚合物)之乙醯化反應或烷化反應來執行聚乙二醇化。本文所用之詞彙「聚乙二醇」包括已經用於誘導其他蛋白的任何形式PEG，諸如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。即將聚乙二醇化之抗體可為去醣化抗體。技術中習知聚乙二醇化蛋白的方法且可用於本發明之抗體。參閱諸如Nishimura等人的EP 0 154 316與Ishikawa等人的EP 0 401 384。
抗體片段與抗體模擬物
本發明不限於傳統抗體且可透過抗體片段與抗體模擬物的應用來執行。技術中現在已經發展並習知不同種類的抗體片段與抗體模擬物技術。
區塊抗體(domain antibody,dAb)係抗體的最小功能性結合單元，對應於人類抗體的重鏈(VH)或輕鏈(VL)任一之可變區。區塊抗體的分子重大約13kDa。Domantis已經開發全長人類VH與VL dAb的一系列大與高度功能性資料庫(各個資料庫超過一百億不同的序列)，並利用這些資料庫來篩選專一於治療目標的dAb。相對於許多傳統抗體，區塊抗體可充分地表現於細菌、酵母菌與哺乳類細胞系統。可參照下列得到更詳細的區塊抗體與其製造方法：US 6,291,158、6,582,915、6,593,081、6,172,197與6,696,245；US 2004/0110941；EP 1433846、0368684與0616640；WO 2005/035572、2004/101790、2004/081026、2004/058821、2004/003019與2003/002609，各個其全文以參考資料併入本文中。
奈米體(nanobody)係抗體-衍生之治療蛋白質，其包含自然存在之重鏈抗體的獨特結構與功能特性。這些重鏈抗體包括單一可變區塊(VHH)與兩個恆定區塊(CH2與CH3)。重要的是，選殖(clone)與單離的VHH區塊為帶有原始重鏈抗體完全抗體結合能力的絕對穩定聚胜肽。奈米體與人類抗體之VH區塊具有高度同源性，並可進一步人類化而不損失任何活性。重要的是，奈米體具有低的免疫原性(immunogenic)，已經以奈米體先導化合物在靈長類研究中證實。
奈米體結合傳統抗體的優點以及小分子藥物的重要特徵。如傳統抗體一般，奈米體顯示高度目標專一性、高度目標親合力與低內在毒性。然而，如小分子藥物般，其會抑制酵素且容易進入受體裂縫。再者，奈米體相當穩定，可藉由注射以外方法施加(參見例如WO 04/041867，其全文以參考資料併入本文中)並容易製造。奈米體的其他優點包括辨別罕見或隱藏表位(因為其尺寸小)、以高親合力與選擇性結合進入蛋白質目標的凹處或活性位置(由於其獨特的3度空間)、藥物形式彈性、半生期調整以及藥物開發的容易與速度。
奈米體係由單一基因所編碼且可有效產生於幾乎全部的原核生物與真核生物宿主，諸如大腸桿菌(E. coli )(參見例如美國專利號6,765,087，其本文以參考資料併入本文中)、黴菌(諸如，麴菌(Aspergillus)或木黴(Trichoderma))與酵母菌(諸如，沙卡羅酵母(Saccharomyces)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、漢遜酵母(Hansenula)或畢赤酵母(Pichia))(參見例如美國專利號6,838,254，其全文以參考資料併入本文中)。
奈米選殖(Nanoclone)方法(參見例如WO 06/079372，其全文以參考資料併入本文中)產生針對所欲目標之奈米體，其主要係自動化高產量挑選B細胞並可用於本發明內文中。
單體(UniBody)係另一抗體片段技術，然而係根據IgG4抗體之樞紐區的移除。刪除樞紐區將造成傳統IgG4抗體尺寸實質一半的分子且該分子具有單價結合區而不是IgG4抗體的雙價結合區。如同IgG4抗體，單體係惰性且不與免疫系統交互作用，這有利於不想有免疫反應之疾病治療。單體作用係抑制或壓制(但非殺死)其結合之細胞。此外，單體結合癌症細胞不會刺激其生長。再者，由於單體係較小的，其可更好地散佈分子於較大的固體型腫瘤上並可能提高效率。單體與整個IgG4抗體以相似速率被清除且能夠以相似親合力結合其抗原。更詳細的單體可參照專利WO2007/059782，其全文以參考資料併入本文中。
親和體(Affibody)分子係根據衍生自葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A)之三個螺旋束(helix bundle)IgG-結合區塊之58-胺基酸殘基蛋白區塊的親合蛋白。此區塊已經用於建構組合式噬質體資料庫的骨架，可由此利用噬菌體呈現(phage display)技術來挑選針對所欲分子之親和體變體(Nord等人Nat Biotechnol 1997；15:772-7;Ronmark等人Eur J Biochem 2002；269:2647-55)。親和體分子的簡單、健全結構搭配其低分子量(6kDa)可使其適合多種應用，例如偵測試劑以及受體交互作用的抑制劑。更詳細的親合體與其產生方法可參照美國專利號5,831,012，其全文以參考資料併入本文中。標記之親合體亦可用於影像應用以確定等形的含量。
經設計之錨蛋白重複蛋白(Designed Ankyrin RepeatProtein,DARPin)具體化經設計之重複蛋白(Designed Repeat Protein,DRP)抗體模擬技術，其發展用來利用非-抗體聚胜肽的結合能力。重複蛋白(諸如，錨蛋白與富含白胺酸之重複蛋白)不像抗體且係出現於細胞內與細胞外到處存在的結合分子。其獨特的模組結構特徵重複結構單元(重複)堆疊在一起以形成呈現可變與模組目標結合表面的狹長重複區塊。根據此模組性，可產生具有高度差異結合專一性之聚胜肽的組合資料庫。此策略包括呈現可變表面殘基之自我相容重複的一致(consensus)設計與其隨機組裝成重複區塊。
可以非常高的產量在細菌表現系統中產生DARPin並分佈在已知最穩定蛋白之間。已經產生結合許多目標蛋白(包括人類受體、細胞激素、激酶、人類蛋白酶、病毒與膜蛋白)之高度專一、高度親合的DARPin，這包括某些親合力範圍係單一數值奈莫耳-皮莫耳的DARPin。
已經將DARPin用於許多應用中，包括ELISA、三明治式ELISA、流式細胞分析(flow cytometric analysis,FACS)、免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)、晶片應用、親合力純化或西方墨點法(Western blotting)。DARPin不僅可理想地用於妨礙蛋白-蛋白交互作用，且亦可抑制酵素。非常快速與專一地聚集於腫瘤上以及非常有利的腫瘤/血液比使得DARPin非常適合活體內診斷或治療方法。有關DARPin與DRP技術的額外資訊可發現於US 2004/0132028與WO 02/20565，兩者皆以參考資料併入。
抗運載蛋白(Anticalin)係另一種抗體模擬技術。然而，此實例中的結合專一性係衍生自脂質運載蛋白(lipocalin)，其係自然且大量表現於人類組織與體液中的小分子量蛋白家族。已經證實脂質運載蛋白可執行許多活體內與化學敏感或不溶化合物之生理傳送與儲存相關之功能。脂質運載蛋白具有健全的固有結構，其包括在蛋白一端支撐四個環的高度保留性B-桶狀結構(barrel)。這些環形成結合囊袋的入口而各個脂質運載蛋白間之結合專一性差異係由分子此部分中的結構差異所負責。
雖然保留性B-片框架所支撐之高度可變環的整體結構讓人聯想到免疫球蛋白，但脂質運載蛋白在尺寸上明顯不同於抗體，其係由160-180個胺基酸之單一聚胜肽鏈所構成且範圍係大於單一免疫球蛋白區塊。
可選殖脂質運載蛋白並設計其環區以產生抗運載蛋白。已經產生結構不同的抗運載蛋白資料庫而抗運載蛋白展示可進行結合功能的挑選與篩選，接著在原核或真核系統中表現與產生可溶蛋白以進一步分析。研究已經證實可將抗運載蛋白發展成專一於幾乎任合人類目標蛋白並可得到奈莫耳或更高範圍的結合親合力。
亦可將抗運載蛋白配置成雙目標蛋白(Duocalin)。Duocalin以一簡單產生之單體蛋白(利用標準製造處理)結合兩個單獨治療目標同時不論其兩個結合區塊的結構方向仍保有目標專一性與親合力。
透過單一分子調控多個目標係特別有利於已知包含超過單一誘發因子的疾病。再者，雙價或多價結合形式(例如，Duocalin)透過結合與聚集細胞表面受體而具有顯著的潛力於疾病中指出細胞表面分子、介導信號傳導路徑的致效(agonistic)效應或引發內化效應的提高。再者，Duocalin的高度固有穩定性可與單體抗運載蛋白相比。
關於抗運載蛋白的額外資訊可自下列得知：US 7,250,297與WO 99/16873，兩者之全文皆以參考資料併入本文中。
結合聚體(Avimer)係用於本發明內文中的另一類型抗體模擬技術。由人類細胞外受體區塊的大家族藉由試管內外顯子移換(exon shuffling)與噬菌體呈現產生具有結合與抑制特性的多區塊蛋白而形成結合聚體。已經顯示連接多個獨立結合區塊來產生結合力並造成親合力與專一性的改善(相對於傳統單一-表位結合蛋白)。其他可能優點包括在大腸桿菌中多目標-專一分子的簡單與有效率的產生、熱穩定性與對蛋白酶之抗性的改善。已經得到針對不同目標具有次奈莫耳親合力之結合聚體。關於結合聚體的額外資訊可見於US 2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756，所有其全文係以參考資料併入本文中。
多工體(Versabody)係可用於本發明之內文的另一種抗體模擬技術。多工體係3-5kDa的小蛋白，其具有>15%的半胱胺酸，其形成高度雙硫密度骨幹以取代一般蛋白具有的疏水核心。此取代造成更小、更親水(即，較不易聚集與非專一性結合)、更能抵抗蛋白酶與熱且具有較低密度T-細胞表位的蛋白，因為大部分促成MHC呈現的殘基係疏水性的。習知所有這四個特性可影響免疫原性，且預計其共同可造成免疫原性的大幅減少。
已知多工體的結構，這些抗體模擬物提供多工形式，包括多價、多專一性、不同的半生期機制、組織目標模組與抗體Fc區的缺少。再者，可在大腸桿菌中大量製造多工體，且因為其之親水性與小尺寸，多工體係高度可溶且可配置成高濃度。多工體係異常地熱穩定且提供延長的貨架壽命。關於多工體的額外資訊可見於US2007/0191272，其全文以參考資料併入本文。
上述抗體片段與模擬技術並非意圖無所不包。本發明之內文可應用許多額外技術，包括替代的聚胜肽式技術(例如，Qui等人Nature Biotechnology,25(8)921-929(2007)所列的互補決定區融合)以及核酸式技術(例如，描述於US5,789,157、5,864,026、5,712,375、5,763,566、6,013,443、6,376,474、6,613,526、6,114,120、6,261,774與6,387,620的RNA適體技術；其皆以參考資料併入本文)。
抗體物理特性
可藉由其不同物理特性來描述本揭露之抗體，以偵測與/或區別其不同類型。
本揭露之抗體可包含一或多個醣化位置於輕鏈或重鏈可變區任一者。上述醣化位置可因為抗原結合改變而造成抗體免疫原性的提高或抗體pK值的改變(Marshall等人(1972)Annu Rev Biochem 41 :673-702；Gala與Morrison(2004)J Immunol 172 :5489-94；Wallick等人(1988)J Exp Med 168 :1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12 :43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316 :452-7；Mimura 等人(2000)Mol Immunol 37 :697-706)。已知醣化發生在含有N-X-S/T序列的基序(motif)。某些實例中，較佳係具有不包含可變區醣化的抗-間皮素抗體。這可藉由選擇可變區中不包含醣化基序之抗體或突變醣化區中的殘基任一者而加以達成。
較佳實施例中，本揭露之抗體不包含天冬醯胺酸異構化位置。天冬醯胺酸的去胺化可發生於N-G或D-G序列，並造成異天冬胺酸(isoaspartic acid)殘基的產生，其將扭結導入聚胜肽鏈並減少其穩定性(異天冬胺酸效應)。
各個抗體具有獨特的等電點(pI)，其一般落在6與9.5之間的pH範圍中。IgG1抗體的pI通常落在7-9.5的pH範圍中而IgG4抗體的pI通常落在6-8的pH範圍中。推測pI位於正常範圍外的抗體在活體內狀態下具有某種程度的展開與不穩定性。因此，較佳係具有pI值落在正常範圍中之抗-間皮素抗體。這可藉由選擇pI值在正常範圍中之抗體或藉由突變帶電表面殘基任一者加以達成。
各個抗體具有獨特的熔化溫度(melting temperature)，而較高的熔化溫度代表活體內較大的整體穩定性(Krishnamurthy R與Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。一般而言，TM1 (開始展開的溫度)較佳係大於60℃、較佳係大於65℃、甚至較佳係大於70℃。可利用微差掃瞄熱卡計(differential scanning calorimetry)(Chen等人(2003)Pharm Res 20:1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett 68:47-52)或圓二色性(circular dichroism)(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci 40:343-9)來測量抗體的熔點。
較佳實施例中，挑選不會快速降解的抗體。可利用毛細管電泳(CE)與MALDI-MS來測量抗體的降解(Alexander AJ與Hughes DE(1995)Anal Chem 67:3626-32)。
另一較佳實施例中，挑選具有極小聚集效應的抗體，聚集效應會導致觸發多餘的免疫反應與/或改變或不利藥物動力特性。一般而言，抗體能接受25%或更少、較佳係20%或更少、甚至較佳係15%或更少、甚至較佳係10%或更少與甚至較佳係5%或更少的聚集。可藉由許多技術測量聚集，包括尺寸排除管柱(size-exclusion column,SEC)、高效液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)與光散射。
設計抗體的方法
如上所述，具有已知VH 與VL 序列之抗-間皮素抗體可用來產生新的抗-間皮素抗體，可藉由修飾VH與VL序列或附著至其之恆定區。因此本揭露之另一態樣中，已知抗-間皮素抗體(諸如，3C10、6A4或7B1)的結構特徵係用來產生結構相關之抗-間皮素抗體，其保有本揭露之抗體的至少一功能特性，例如結合人類間皮素。舉例而言，可將已知抗-間皮素抗體之一或多個CDR區或其突變與已知框架區與/或其他CDR重組式結合以產生上述本揭露的額外、重組式設計之抗-間皮素抗體。其他類型的修飾包括先前段落描述之那些修飾。設計方法的起始材料係一或多個本文提供的VH 與/或VL 序列、或其一或多個CDR區。為了產生設計之抗體，並非必需實際製備(即，表現成蛋白)具有一或多個本文提供之VH 與/或VL 序列或其一或多個CDR區的抗體。反之，序列中所含之資訊係當作起始材料以產生衍生自原本序列之「第二代」序列並接著製備「第二代」序列並表現成蛋白。
因此另一實施例中，本揭露提供製備抗-間皮素抗體之方法，其包括：
(a)提供：(i)VH 抗體序列，其包括選自序列編號：1-3所構成之群組的CDR1序列、選自序列編號：4-6所構成之群組的CDR2序列與/或選自序列編號：7-9所構成之群組的CDR3序列；與/或(ii)VL 抗體序列，其包括選自序列編號：10-12所構成之群組的CDR1序列、選自序列編號：13-15所構成之群組的CDR2序列與/或選自序列編號：16-18所構成之群組的CDR3序列；
(b)改變VL 抗體序列與/或VL 抗體序列中至少一胺基酸殘基以產生至少一改變之抗體序列；及
(c)將改變之抗體序列表現成蛋白。
標準分子生物技術可用來製備與表現改變之抗體序列。
某些實施例中，可隨機或選擇性沿著所有或部分的抗-間皮素抗體編碼序列導入突變，並可篩選得到之經修飾的抗-間皮素抗體本文所述之結合活性與/或其他功能特性。技術中已經描述過突變方法。例如Short的WO 02/092780描述利用飽和突變法、合成式接合組合法或上述之組合產生與篩選抗體突變的方法。或者，Lazar等人的WO 03/074679描述利用電腦篩選方法以使抗體之生理化學特性最佳化的方法。
編碼本發明之抗體的核酸分子
本揭露另一態樣係關於編碼本揭露之抗體的核酸分子。核酸可存在於整個細胞、細胞裂解物中，或是於部分純化或實質純化形式中。當清除其他細胞組成或其他污染物(例如，其他細胞核酸或蛋白質)時，核酸係「單離的(isolated)」或「成為實質純化」，其係藉由標準技術，包括鹼性/SDS處理、CsCl條帶化(banding)、管柱層析法(column chromatography)、瓊脂醣凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)與其他技術中習知的技術。參見F. Ausubel等人，ed. (1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本發明之核酸可為諸如DNA或RNA且可包含或可不包含內子序列。較佳實施例中，核酸係cDNA分子。
可利用標準分子生物技術取得本揭露之核酸。針對融合瘤(例如，如自進一步描述於下帶有人類免疫球蛋白基因之基因轉殖小鼠製備的融合瘤)表現之抗體，可藉由標準PCR擴增反應或cDNA選殖技術得到編碼融合瘤所製之抗體的輕鏈與重鏈cDNA。針對由免疫球蛋白基因資料庫得到之抗體(例如，利用噬菌體呈現技術)，可自基因資料庫重新取得編碼抗體之核酸。
較佳之核酸分子係那些編碼3C10、6A4或7B1單株抗體之VH 與VL 序列的核酸分子。編碼3C10、6A4或7B1之VH 序列的DNA序列分別顯示於序列編號：25-27。編碼3C10、6A4或7B1之VL 序列的DNA序列分別顯示於序列編號：28-30。
一但取得編碼VH 與VL 片段的DNA片段，可藉由標準重組DNA技術進一步操作這些DNA片段。例如，將可變區基因轉換至全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFV基因。這些操作中，將VL -或VH -編碼DNA片段操作性連接至編碼另一蛋白(諸如，抗體恆定區或可彎曲連接子)的另一DNA片段。本文所用之詞彙「操作性連接(operatively linked)」意指連接兩個DNA片段以致其所編碼之胺基酸序列包持同一讀框(in-frame)。
可藉由操作性連接VH -編碼DNA至編碼重鏈恆定區(CH1、CH2與CH3)之DNA分子而將編碼VH 區的單離DNA轉換成全長重鏈基因。技術中已知人類重鏈恆定區基因序列(參閱例如，Kabat‘242)而可藉由標準PCR擴增法取得包含這些區的DNA片段。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳係IgG1或IgG4恆定區。針對Fab片段重鏈基因，可將VH -編碼DNA操作性連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之DNA分子。
可藉由操作性連接VL -編碼DNA至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子而將編碼VL 區的單離DNA轉換成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。技術中已知人類輕鏈恆定區基因序列(參閱例如，Kabat‘242)而可藉由標準PCR擴增法取得包含這些區的DNA片段。較佳實施例中，輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。
為了產生scFv基因，將VH -與VL -編碼DNA片段操作性連接至編碼可彎曲連接子(例如，編碼胺基酸序列(Gly4 -Ser)3 )之另一片段，以致可將VH 與VL 序列表現成連續單鏈蛋白，且藉由可彎曲連接子連接VL 與VH 區(參閱諸如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；Huston等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty等人(1990)Nature 348:552-554)。
本揭露之單株抗體的製造
本揭露之單株抗體(mAb)可藉由多種技術加以製造，包括Kohler與Milstein(1975)Nature 256:495的體細胞雜合技術。雖然體細胞雜合步驟係較佳的，但原則上可應用其他技術，例如B淋巴細胞的病毒或致癌基因(oncogenic)轉形。
製備融合瘤的較佳動物系統係鼠科系統。小鼠中的融合瘤製造係建立非常良善的步驟。技術中習知單離用於融合之免疫脾臟細胞的免疫步驟與技術。亦習知融合夥伴(例如，鼠科骨髓癌細胞)與融合步驟。
可根據如上所述製備之非人類單株抗體的序列來製備本揭露之嵌合或人類化抗體。可自關注之非人類融合瘤取得編碼重鏈與輕鏈免疫球蛋白之DNA，並利用標準分子生物技術加以設計以包含非鼠科(例如，人類)免疫球蛋白序列。例如為了產生嵌合抗體，可將鼠科可變區連結至人類恆定區(參見，例如給予Cabilly等人的美國專利號4,816,567)。為了產生人類化抗體，可將鼠科CDR區插入人類框架(參見，諸如給予Winter的美國專利號5,225,539，以及給予Queen等人的美國專利號5,530,101、5,585,089、5,693,762及6,180,370)。
抗體較佳係人類單株抗體。可利用帶有部分人類免疫系統(而不是小鼠系統)的基因轉殖或染色體轉殖小鼠加以產生。這些基因轉殖與染色體轉殖小鼠包括分別稱為HuMAb與KM的小鼠，且在本文中共同稱為「人類Ig小鼠」。
HuMAb類型的小鼠(,Inc.)包含人類免疫球蛋白基因微小基因座(miniloci)，其編碼未重整之人類重鏈(μ與γ)與κ輕鏈免疫球蛋白序列，以及使內源性μ與κ鏈基因座失去活性之目標突變(參見，例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859)。因此，小鼠呈現減少表現的小鼠IgM或κ，而回應免疫作用，導入之人類重鏈與輕鏈轉殖基因進行類型轉換(class switching)與體細胞突變以產生高親合力之人類IgGκ單株抗體(Lonberg,N.等人(1994)同上之文獻；回顧於Lonberg,N. (1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg,N.與Huszar,D. (1995)Intern. Rev. Immunol. 13:65-93；以及Harding,F.與Lonberg,N. (1995)Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546)。HuMAb類型小鼠的製備與應用以及上述小鼠所帶之基因體修飾係進一步描述於Taylor,L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等人(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillon等人(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等人(1993)EMBO J. 12:821-30；Tuaillon等人(1994)J. Immunol. 152:2912-2920；Taylor,L.等人(1994)International Immunology 6:579-591；以及Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851，所有其之全文係以參考資料明確地併入本文中。進一步參照全部給予Lonberg與Kay的美國專利號5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299以及5,770,429；給予Surani等人的美國專利號5,545,807；全部給予Lonberg與Kay的PCT公開號WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884與WO 99/45962；以及給予Korman等人的WO 01/14424。亦可應用帶有人類λ輕鏈基因之基因轉殖小鼠，例如Bruggemann的WO 00/26373中所述者。例如，可將帶有人類λ輕鏈轉殖基因之小鼠與帶有人類重鏈轉殖基因(例如，HCo7)與選擇性亦帶有人類K輕鏈轉殖基因(例如，KCo5)之小鼠雜交以產生帶有人類重鏈與輕鏈轉殖基因兩者之小鼠(參閱例如，實施例　1)。
另一實施例中，可利用轉殖基因與轉殖染色體上帶有人類免疫球蛋白序列的小鼠(例如，帶有人類重鏈轉殖基因與人類輕鏈轉殖染色體之小鼠)產生本揭露之人類抗體。此小鼠於本文中稱為品種或類型，並詳細描述於給予Ishida等人的WO 02/43478。
再者，技術中可取得表現人類免疫球蛋白基因之替代基因轉殖動物系統並可用來取得本揭露之抗-間皮素抗體。例如，可應用稱為Xenomouse(Abgenix,Inc.)的替代基因轉殖系統；上述小鼠描述於諸如給予Kucherlapati等人的美國專利號5,939,598、6,075,181、6,114,598、6,150,584以及6,162,963。
再者,技術中可取得表現人類免疫球蛋白基因的替代染色體轉殖動物系統,並可用來產生本揭露之抗-間皮素抗體。例如,可應用稱為「TC小鼠」之帶有人類重鏈轉殖染色體與人類輕鏈轉殖染色體兩者之小鼠；上述小鼠描述於Tomizuka等人(2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA97:722-727。再者，技術中已經揭露帶有人類重鏈與輕鏈轉殖染色體的牛(Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20:889-894以及WO 2002/092812)。
亦可利用篩選人類免疫球蛋白基因之資料庫的噬菌體呈現方法來製備本揭露之人類單株抗體。參見，諸如給予Ladner等人的美國專利號5,223,409、5,403,484及5,571,698；給予Dower等人的美國專利號5,427,908與5,580,717；給予McCafferty等人的美國專利號5,969,108與6,172,197；以及給予Griffiths等人的美國專利號5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915及6,593,081。
亦可利用SCID小鼠製備本揭露之人類單株抗體，SCID小鼠中已經重新組成人類免疫細胞以致可在免疫後產生人類抗體反應。上述小鼠描述於諸如給予Wilson等人的美國專利號5,476,996與5,698,767。
另一實施例中，如Buechler等人的US 6,794,132所述般，利用人類Ig小鼠與噬菌體呈現技術之組合來製備人類抗-間皮素抗體。更明確地說，方法首先包括藉由以一或多個間皮素抗原免疫小鼠以引起人類Ig小鼠(諸如，HuMab Mouse或KM小鼠品種的那些小鼠)中的抗-間皮素抗體反應，接著自小鼠淋巴細胞單離編碼人類抗體鏈之核酸並將這些核酸導入呈現載體(例如，噬菌體)以提供呈現組的資料庫。因此，各個資料庫成員包括編碼人類抗體鏈之核酸而各個抗體鏈係由呈現組所呈現。接著以間皮素蛋白篩選資料庫以單離專一性結合間皮素之資料庫成員。接著藉由標準方法單離與定序所選之資料庫成員的核酸嵌入物以確定所選之間皮素結合者之輕鏈與重鏈可變序列。可藉由標準重組DNA技術(例如，將可變區選殖入帶有人類重鏈與輕鏈恆定區之表現載體，以致VH 區操作性連接至CH 區而VL 區操作性連接至CL 區)將可變區轉換成全長抗體鏈。
人類Ig小鼠的免疫作用
當應用人類Ig小鼠來產生本揭露之人類抗體時，可用間皮素抗原與/或重組間皮素蛋白的純化或濃縮製備物、表現間皮素蛋白之細胞、或間皮素融合蛋白來免疫上述小鼠，描述於Lonberg,N.等人(1994)Nature 368(6474):856 859；Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851；及WO 98/24884與WO 01/14424。小鼠在第一次注入時較佳係6-16周大。例如，間皮素抗原的純化或重組製備物(5-50μg)可以腹膜內與/或皮下來免疫人類Ig小鼠。最佳地是，用來引起本揭露之抗體的免疫原(immunogen)係間皮素融合蛋白，其包括間皮素蛋白的細胞外區塊在其N-端融合至非-間皮素聚胜肽(例如，His標記)(參閱例如，實施例　1)。
產生結合人類間皮素之完整人類單株抗體的詳細步驟係描述於實施例　1。不同抗原的累積實驗已經顯示當首先以完全佛氏(Freund's)佐劑中之抗原腹膜內(IP)免疫，接著以不完全佛氏佐劑中之抗原每隔一周IP免疫(總數高達6)時，HuMAb小鼠類型之基因轉殖小鼠的反應。除了佛氏外之佐劑(例如，RIBI佐劑)亦是有效的。此外，發現不存在佐劑的整體細胞係高度免疫原性的。可用眼窩後取血(retroorbital bleed)得到的血漿樣本來監測整個免疫步驟過程中的免疫反應。可藉由ELISA篩選血漿，而具有足夠力價(titer)之抗-間皮素人類免疫球蛋白的小鼠可用於融合。可例如在犧牲且移除脾臟前3天以抗原靜脈內補強(boost)小鼠。預期各個免疫作用需要執行2-3次融合。各個抗原通常免疫6與24個之間的小鼠。通常係使用HCo7與HCo12品系兩者。此外，可將HCo7與HCo12兩者轉殖基因一起培育成為具有兩個不同人類重鏈轉殖基因(HCo7/HCo12)的單一小鼠。替代或額外地，可應用KM品系。
產生製造本發明之人類單株抗體的融合瘤
為了產生製造本揭露之人類單株抗體的融合瘤，可自免疫小鼠單離脾細胞與/或淋巴結細胞，並與適當的永生化細胞株(例如，小鼠骨髓癌細胞株)融合。可針對抗原-專一性抗體之產生來篩選得到之融合瘤。例如，來自經免疫小鼠之脾臟淋巴細胞的單一細胞懸浮物可以50%PEG與六分之一數目的P3X63-Ag8.653無分泌小鼠骨髓癌細胞(ATCC,CRL 1580)融合。或者，來自經免疫小鼠之脾臟淋巴細胞的單一細胞懸浮物可利用電融合方法加以融合，其利用CytoPulse大腔室細胞融合電穿孔器(CytoPulse Sciences,Inc.,Glen Burnie Maryland)。可將約2 x 105 個細胞平鋪(plate)於平坦底部微量滴定盤中，接著培養於選擇性培養基中兩個星期，培養基包含20%胎克隆血清(fetal Clone Serum)、18%「653」調節培養基、5%歐瑞金(origen)(IGEN)、4mM L-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉、5mM HEPES、0.055mM 2-巰基乙醇、50單位/毫升青黴素(penicillin)、50毫克/毫升鏈黴素(streptomycin)、50毫克/毫升健達黴素(gentamycin)及1X HAT(Sigma；在融合24小時後加入HAT)。大約兩周後，可將細胞培養於以HT取代HAT之培養基中。接著可藉由ELISA針對人類單株IgM與IgG抗體篩選各個小孔(well)。一但發生大量的融合瘤生長，通常培養基可在10-14天後發覺。可重新平鋪、再次篩選抗體分泌融合瘤，且若仍對人類IgG呈現陽性，將單株抗體以限數稀釋(limiting dilution)次選殖(subclone)至少兩次。接著可在試管內培養穩定的次選殖株以產生小量抗體於組織培養基用於特徵描述。
為了純化人類單株抗體，可將選擇之融合瘤生長於兩升旋轉角瓶用於單株抗體純化。在以蛋白質A-瓊脂糖凝膠(sepharose)(Pharmacia,Piscataway,N.J.)親合層析之前可過濾並濃縮懸浮物。可藉由凝膠電泳與HPLC檢查析出之IgG部分以確保純度。可將緩衝液換成PBS，且可藉由OD280利用1.43消光係數確定濃度。可將單株抗體分裝並儲存於-80℃下。
產生製造本發明之單株抗體的轉染瘤
亦可在宿主細胞轉染瘤中產生本揭露之抗體，其利用例如技術中習知的重組DNA技術與基因轉染方法之組合(例如，Morrison，S. (1985)Science229:1202)。
例如，為了表現抗體或其抗體片段，可藉由標準分子生物技術(諸如，利用表現關注之抗體的融合瘤之PCR擴增作用或cDNA選殖)取得編碼部分或全長輕鏈與重鏈的DNA，並可將DNA插入表現載體中以致基因操作性連接至轉錄與轉譯控制序列。本文中之詞彙「操作性連接」意圖代表抗體基因連接於載體中，以致載體內的轉錄與轉譯控制序列適用於其調控抗體基因之轉錄與轉譯的預期功能。選擇與應用之表現宿主細胞相容之表現載體與表現控制序列。可將抗體輕鏈基因與抗體重鏈基因插入不同載體，或者較一般地，將兩者基因插入相同表現載體中。藉由標準方法(諸如，連接抗體基因片段與載體的互補限制位置，或者若不存在限制位置則用鈍端連接)將抗體基因插入表現載體中。本文描述之抗體的輕鏈與重鏈可變區可用來產生任何抗體同型的全長抗體基因，藉由將其插入已經編碼所欲之同型的重鏈恆定區與輕鏈恆定區之表現載體，以致VH 片段操作性連接至載體內的CH 片段而VL 片段操作性連接至載體內的CL 片段。額外或替代地，重組表現載體可編碼促進自宿主細胞分泌抗體鏈之單一胜肽。可將抗體鏈基因選殖入載體以便單一胜肽同一讀框(in-frame)地連接至抗體鏈基因的胺基端。單一胜肽可為免疫球蛋白信號胜肽或異源性信號胜肽(即，來自非免疫球蛋白蛋白質之信號胜肽)。
除了抗體鏈基因，本揭露之重組表現載體帶有控制宿主細胞內抗體鏈基因之表現的調節序列。詞彙「調節序列(regulatory sequence)」意圖包括控制抗體鏈基因轉錄或轉譯之啟動子(promoter)、增強子(enhancer)與其他表現控制片段(例如，聚腺嘌呤訊息(polyadenylation signal))。上述調節序列係描述於例如Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))。熟悉技術人士可以理解表現載體的設計(包括調節序列的挑選)可取決於諸如即將轉形之宿主細胞的選擇、所欲之蛋白質表現程度等因子。用於哺乳類宿主細胞表現的較佳調節序列包括引導哺乳細胞中高水平蛋白表現之病毒片段，諸如衍生自巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)、猿猴病毒(Simian Virus40,SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))與多瘤病毒(polyoma)。或者，可應用非病毒調節序列，諸如泛素(ubiquitin)啟動子或p-球蛋白(globin)啟動子。再者，由不同來源序列構成之調節片段，例如SRα啟動子系統，其包含來自SV40早期啟動子的序列以及第1型人類T細胞白血病病毒的長端點重複(long terminal repeat)(Takebe,Y.等人(1988)Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
除了抗體鏈基因與調節序列之外，本揭露之重組表現載體帶有額外的序列，諸如調節宿主細胞中載體複製的序列(例如，複製起始點)與可篩選之標記基因。可篩選之標記基因促進篩選已經將載體導入其中之宿主細胞(參見，諸如Axel等人的美國專利號4,399,216、4,634,665與5,179,017)。舉例而言，可篩選之標記基因一般可將藥物(諸如，G418、效高黴素(hygromycin)或滅殺除癌(methotrexate))抗性給予已經導入載體之宿主細胞。較佳的可篩選之標記基因包括二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)基因(用於以滅殺除癌篩選/擴增之dhfr- 宿主細胞)與抗新微素基因(neo)(用於G418篩選)。
為了輕鏈與重鏈的表現，可將編碼重鏈與輕鏈之表現載體轉染入宿主細胞。詞彙「轉染(transfection)」的不同形式意圖包括通常用於將外源性DNA導入原核或真核宿主細胞的許多不同技術，諸如電穿孔、鈣-磷酸沉澱法(calcium-phosphate precipitation)、DEAE-葡聚糖(dextran)轉染等。雖然理論上可將本揭露之抗體表現於原核或真核宿主細胞任一者，但是於真核細胞(較佳為哺乳類宿主細胞)中表現抗體係最佳的，因為上述真核細胞比起原核細胞較有可能組合並分泌適當摺疊與免疫活性之抗體。
表現本揭露之重組抗體的較佳哺乳類宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)細胞(包括dhfr- CHO細胞，描述於Urlaub與Chasin,(1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220；與DHFR可篩選標記一起使用，例如描述於R. J. Kaufman與P. A. Sharp(1982)J. Mol. Biol. 159:601-621)、NSO骨髓癌細胞、COS細胞與SP2細胞。明確地說，與NSO骨髓癌細胞一起應用之另一較佳表現系統係GS基因表現系統，揭露於WO 87/04462(給予Wilson)、WO 89/01036(給予Bebbington)與EP 338,841(給予Bebbington)。當將編碼抗體基因的重組表現載體導入哺乳類宿主細胞時，可藉由培養宿主細胞一段時間來產生抗體，該段時間足以讓宿主細胞內的抗體表現，或者更佳為讓抗體分泌至生長宿主細胞的培養基中。可利用標準蛋白純化方法自培養基中取得抗體。
結合抗原之抗體的特性描述
可藉由例如標準ELISA來試驗本發明之抗體對人類間皮素的結合。簡短的說，以1μg/mL於PBS中之純化與/或重組的間皮素蛋白(參閱例如，實施例1)塗覆微量滴定盤，並接著以PBS中5%的牛血清白蛋白阻斷。將抗體的稀釋物(例如，間皮素-免疫小鼠之血清的稀釋物)加入各個小孔並在37℃下培養1-2小時。以PBS/Tween清洗盤並接著在37℃下以接合鹼性磷酸酶之二級試劑(例如針對人類抗體，山羊-抗-人類IgG Fc-專一性多株試劑)培養1小時。清洗之後，以pNPP基質(1mg/mL)讓盤顯影，並在405-650的OD下分析。較佳係利用顯影最高力價的小鼠於融合。
上述ELISA試驗亦可用來篩選顯示與間皮素蛋白具有陽性反應性的融合瘤。將以高結合力(avidity)與/或親合力結合間皮素蛋白之融合瘤次選殖並進一步描述。可挑選保有與親本細胞之反應性(藉由ELISA)且來自各個融合瘤之一選殖株，來製造儲存於-140℃下的5-10瓶細胞銀行以及抗體純化。
為了純化抗-間皮素抗體，可將選擇之融合瘤生長於兩升旋轉角瓶用於單株抗體純化。在以蛋白質A-瓊脂糖凝膠(Pharmacia,Piscataway,N.J.)親合層析之前可過濾並濃縮懸浮物。可藉由凝膠電泳與HPLC檢查析出之IgG部分以確保純度。可將緩衝液換成PBS，且可藉由OD280利用1.43消光係數確定濃度。可將單株抗體分裝並儲存於-80℃下。
為了確定選擇之抗-間皮素單株抗體是否結合獨特的表位，利用商業上可取得之試劑(Pierce,Rockford,IL)生物素化(biotinylate)各個抗體。利用未標記之單株抗體與生物素化單株抗體之競爭性研究係利用上述之間皮素蛋白塗覆的ELISA盤加以執行。可以鏈黴-卵白素-鹼性磷酸酶(strep-avidin-alkaline phosphatase)探針偵測生物素化mAb結合。
為了確定純化之抗體的同型，可利用專一於特定同型之試劑來執行同型ELISA。例如，為了確定人類單株抗體的同型，可在4℃下以1μg/mL的抗-人類免疫球蛋白塗覆微量滴定盤的孔整晚。以1% BSA阻斷之後，使盤與1μg/mL或更少的試驗單株抗體或純化之同型對照組在室溫下反應一至兩小時。接著讓孔與人類IgG1或人類IgM-專一性鹼性磷酸酶-接合探針任一者反應。如上述般顯影與分析盤。
亦可藉由西方墨點法試驗抗-間皮素人類IgG與間皮素抗原的反應性。簡單地說，製備間皮素抗原並進行十二烷基硫酸鈉聚丙醯胺(polyacrylamide)凝膠電泳。將分開的抗原轉移至硝化纖維膜，以10%胎牛血清阻斷，並以即將試驗之單株抗體探查。利用抗-人類IgG鹼性磷酸酶偵測人類IgG結合並以BCIP/NBT基質片(Sigma Chem. Co.,St. Louis,MO.)顯影。
亦可藉由監控抗體對表現間皮素蛋白之細胞的結合(例如，藉由流式細胞技術)來確定本揭露之抗體的結合專一性。可應用自然表現間皮素蛋白之細胞或細胞株(諸如，OVCAR3、NCI-H226、CFPAC-1或KB細胞)或是以編碼間皮素之表現載體轉染以致間皮素表現於細胞表面上之細胞株(例如，CHO細胞株)。轉染蛋白可包括標記(諸如，myc-標記或his-標記)，較佳係位在N-端以便利用針對標記之抗體偵測。可藉由以抗體培養經轉染之細胞並偵測結合之抗體以確定本揭露之抗體對間皮素蛋白的結合。抗體對轉染之蛋白上標記的結合可當作陽性對照。
雙專一性分子
另一態樣中，本揭露描述包括本揭露之抗-間皮素抗體或其之片段連接至另一功能性分子(諸如，另一胜肽或蛋白(例如，另一抗體)、結合模擬物或受體的配體)的雙專一性(bispecific)分子，其結合至少兩個不同結合位置或目標分子。本揭露之抗體事實上可連接至超過一個其他功能分子，以產生結合超過兩個不同結合位置與/或目標分子的多專一性(multispecific)分子。上述多專一性分子亦意圖被包含於本文所用之詞彙「雙專一性分子」內。連接可藉由化學耦接、基因融合、非共價連結或其他。
因此，本揭露包括雙專一性分子，其包括至少一針對間皮素之第一結合專一性與針對第二目標表位之第二結合專一性。本揭露之特定實施例中，第二目標表位係Fc受體，諸如人類FcγRI(CD64)或人類Fcα受體(CD89)。因此，本揭露包括雙專一性分子，其能夠結合至FcγR或FcαR表現效應子細胞兩者(諸如，單核球(monocyte)、巨噬細胞或多形核細胞(polymorphonuclear cell,PMN))，並結合表現間皮素蛋白之目標細胞。這些雙專一性分子將間皮素表現細胞指向效應子細胞並觸發Fc受體介導效應子細胞活性，諸如間皮素表現細胞的胞噬作用、ADCC、細胞激素釋出或超氧陰離子的產生。
當雙專一性分子係多專一性，除了抗-Fc結合專一性與抗-間皮素結合專一性之外，該分子可更包括第三結合專一性。一實施例中，第三結合專一性係抗-增強因子(enhancement factor,EF)部分，例如結合牽涉於細胞毒性活性之表面蛋白的分子，並因此提高對目標細胞的免疫反應。「抗-增強因子部分」可為結合已知分子(諸如，抗原或受體)之抗體、功能性抗體片段或配體，並藉此造成Fc受體或目標細胞抗原結合決定因素效應的增強。「抗-增強因子部分」可結合Fc受體或目標細胞抗原。或者，抗-增強因子部分可結合不同於第一與第二結合專一性結合之實體。例如，抗-增強因子部分可結合細胞毒性T-細胞(諸如，透過CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1)或造成對目標細胞之免疫反應提高的其他免疫細胞。
一實施例中，本揭露之雙專一性分子包括至少一抗體或其之抗體片段的結合專一性，包括諸如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、Fd、dAb或單鏈Fv。抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體或其之任何極小片段，例如Ladner等人的US 4,946,778描述之Fv或單鏈構築體，將其之內文以參考資料明確地併入。
一實施例中，針對Fcγ受體的結合專一性係由單株抗體所提供，其之結合並不受到人類免疫球蛋白G(IgG)的阻斷。本文所用之詞彙「IgG受體」代表位於染色體1上八個γ-鏈基因任何一個。這些基因編碼總共十二個跨膜或可溶解的受體等形(isoform)，其分類成三個Fcγ受體類型：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)與FcγRIII(CD16)。一較佳實施例中，Fcγ受體係人類高親合力FcγRI。人類FcγRI係72kDa分子，其顯示對單體IgG(108 -109 M-1 )的高親合力。
某些較佳抗-Fcγ單株抗體之生產與特性描述係描述於給予Fanger等人的WO 88/00052以及美國專利號4,954,617，其以參考資料全部併入本文中。這些抗體結合FcγRI、FcγRII或FcγRIII之表位，其位置不同於受體的Fcγ結合位置，因此其之結合實質上不受到IgG生理水平所阻斷。用於本揭露之專一性抗-FcγRI抗體係mAb22、mAb 32、mAb 44mAb 62與mAb 197。可自美國菌種中心(American Type Culture Collection)以ATCC登錄號HB9469取得產生mAb 32之融合瘤。其他實施例中，抗-Fcγ受體抗體係單株抗體22的人類化形式(H22)。H22抗體之生產與特性描述係描述於Graziano,R.F.等人(1995)J. Immunol 155(10):4996-5002以及給予Tempest等人的WO 94/10332。將H22抗體產生細胞株寄存於美國菌種中心命名成HA022CL1且登錄號係CRL 11177。
又其他較佳實施例中，針對Fc受體的結合專一性係由結合人類IgA受體之抗體所提供(例如，Fc-α受體(FcαRI(CD89))，其之結合較佳係不受到人類免疫球蛋白A(IgA)的阻斷。詞彙「IgA受體」意圖包括位於染色體19之一α-基因(FcαRI)的基因產物。已知此基因編碼許多不同接合之跨膜等形，由55至110kDa。FcαRI(CD89)係基本上表現於單核球/巨噬細胞嗜酸性(eosinophilic)與中性(neutrophilic)顆粒性白血球上，但不表現於非效應子細胞族群上。FcαRI對IgA1與IgA2兩者的親合力中等(~5x107 M-1 )，當暴露於細胞激素(諸如，G-CSF或GM-CSF)時提高(Morton,H.C.等人(1996)Critical Reviews in Immunology 16:423-440)。在IgA配體結合區塊以外結合FcαRI的四個FcαRI-專一性單株抗體(標為A3、A59、A62與A77)已經描述於Monteiro,R.C.等人(1992)J.Immunol. 148:1764。
FcαRI與FcγRI係用於本揭露之雙專一性分子的較佳促發受體，因為其(1)主要表現於免疫效應子細胞，諸如單核球、PMN、巨噬細胞與樹突細胞；(2)高水平表現(例如，每個細胞5,000-100,000)；(3)細胞毒性活性的中介物(諸如，ADCC、胞噬作用)；及(4)抗原介導之提高抗原呈現，包括自體抗原、指向它們。
雖然較佳係人類單株抗體，但可用於本揭露之雙專一性分子的其他抗體係鼠科、嵌合與人類化單株抗體。
可利用技術習知方法接合組成結合專一性(諸如，抗-FcR與抗-間皮素結合專一性)來製備本揭露之雙專一性分子。例如，可分別產生雙專一性分子的各個結合專一性並接著將其彼此接合。當結合專一性係蛋白或胜肽時，可應用多種耦合或交聯劑以便共價接合。交聯劑的實例包括蛋白A、碳二醯亞胺(carbodiimide)、N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯-硫乙酸酯(N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate,SATA),5,5'-二硫雙(2-硝苯甲酸)(DTNB)、o-苯二順丁烯二醯亞胺(o-phenylenedimaleimide,oPDM)、N-琥站醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(N-succinimidy1-3-(2-pyridyldithio)propionate,SPDP)與磺琥珀醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-甲酸酯(sulfosuccinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohaxane-1-carboxylate,sulfo-SMCC)(參閱諸如，Karpovsky等人(1984)J. Exp. Med. 160:1686；Liu,MA等人(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。其他方法包括描述於Paulus(1985)Behring Ins. Mitt. NO. 78,118-132；Brennan等人(1985)Science 229:81-83與Glennie等人(1987)J. Immunol. 139:2367-2375)中之那些方法。較佳之接合劑係SATA與sulfo-SMCC，兩者皆可自Pierce Chemical Co. (Rockford,IL)取得。
當結合專一性係抗體時，可透過兩個重鏈之C-端樞紐區的氫硫基鍵結來接合。特定較佳實施例中，接合之前樞紐區係經修飾以包含奇數個氫硫基殘基(較佳係一個)。
或者，可將兩個結合專一性編碼於相同載體並表現與組合於相同宿主細胞。此方法特別有用於雙專一性分子係mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab')2 或配體x Fab融合蛋白。本揭露之雙專一性分子可為包含一單鏈抗體與結合決定位之單鏈分子或包含兩個結合決定位之單鏈雙專一性分子。雙專一性分子可包括至少兩個單鏈分子。製備雙專一性分子之方法係描述於諸如美國專利號5,260,203、5,455,030、4,881,175、5,132,405、5,091,513、5,476,786、5,013,653、5,258,498與5,482,858，其所有藉由參考資料明確地併入本文中。
雙專一性分子結合其專一目標可藉由下列方式確認，諸如ELISA、放射性免疫試驗(RIA)、FACS分析、生物試驗(例如，生長抑制)或西方墨點法。各個這些試驗通常利用對關注之複合體專一的標記試劑(例如，抗體)來偵測關注之蛋白-抗體複合體的存在。例如，可利用酵素-連結抗體或抗體片段(辨別並專一性結合抗體-FcR複合體)來偵測FcR-抗體複合體。或者，可利用許多其他免疫試驗的任何一種來偵測複合體。例如，可放射性標記抗體並用於放射性免疫試驗(RIA)(參見，諸如Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,March,1986，其以參考資料併入本文中)。可藉由諸如γ計數器或閃爍計數器或自動放射顯影術(autoradiography)之方法應用來偵測放射性同位素。
接合體
另一態樣中提供抗體-夥伴分子接合體，其中夥伴分子藉由化學連接子(有時本文簡單稱為「連接子」)接合至本發明之抗體。夥伴分子可為治療劑或標記。治療劑可為諸如細胞毒素、非-細胞毒性藥物(例如，免疫抑制劑)、放射性劑、另一抗體或酵素。夥伴分子較佳係細胞毒素。標記可為任何產生可偵測信號之標記(諸如，同位素標記、螢光標記)或對基質催化可偵測修飾之酵素。抗體提供指向功能：藉由結合至發現其抗原之目標組織或細胞，抗體帶領接合體至目標組織或細胞。在那處切割連接子而釋放夥伴分子去執行其所欲之生物功能。某些實例中，接合體進入目標細胞並在其中發生切割。
連接子
某些實施例中，連接子係肽基(peptidyl)連接子，本文標示成(L4 )p -F-(L1 )m 。其他連接子包括胼與雙硫連接子，本文分別標示成(L4 )p -H-(L1 )m 與(L4 )p -J-(L1 )m 。F、H與J分別為肽基、胼與雙硫部分，其可經切割而自抗體釋出夥伴分子，而L1 與L4 係連接子基團。F、H、J、L1 與L4 與下標p與m係更加完整地界定於後。這些與其他連接子的製備與利用係描述於WO 2005/112919，其揭露以參考資料併入本文中。
抗體-夥伴分子接合體中肽基與其他連接子的應用係描述於US 2006/000408、2006/0024317與2006/0247295；US 6,989,452、7,087,800與7,129,261；WO 2007/051081、2007/038658、2007/059404與2007/089100，所有皆以參考資料併入本文中。
額外的連接子描述於US 6,214,345、2003/0096743與2003/0130189；de Groot等人，J. Med. Chem. 42,5277(1999)；de Groot等人，J. Org. Chem. 43,3093(2000)；de Groot等人，J. Med. Chem. 66,8815,(2001)；WO 02/083180；Carl等人，J. Med. Chem. Lett. 24,479,(1981)；Dubowchik等人，Bioorg & Med. Chem. Lett. 8,3347(1998)，其揭露以參考資料併入本文中。
除了連接抗體與夥伴分子之外，連接子可給予夥伴分子穩定性、降低其活體內毒性、或有利地影響其之藥物動力學、生體利用率與/或藥效學(pharmacodynamics)。通常一但將接合體送入其作用位置，較佳係切割連接子來釋放夥伴分子。亦較佳的是連接子係無蹤跡的，以致一但自夥伴分子上移除(例如，活化過程中)後，無殘留連接子存在的蹤跡。
另一實施例中，連接子的特徵係其可於目標細胞中或接近目標細胞的位置被切割，例如夥伴分子的治療作用或標記活性位置。上述切割可為自然中的酵素方式。此特徵有助於減少夥伴分子的全身性活化、減少毒性與全身性副作用。酵素切割的較佳可切割基團包括胜肽鍵、酯鍵結與雙硫鍵結，諸如上述之F、H與J部分。其他實施例中，連接子對pH敏感且可透過pH的改變而被切割。
一重要態樣係控制連接子切割速度的能力。通常樂見切割迅速的連接子。然而某些實施例中，較佳為切割較慢的連接子。例如，持續釋放配方或具有快速釋放與慢速釋放成分兩者的配方中，提供切割較慢的連接子係有用的。上列之WO 2005/112919揭露可經設計而以非常快至非常慢的速度範圍內切割之胼連接子。
當接合體在循環時(即，到達目標組織或細胞之前)，連接子亦可用於穩定夥伴分子對抗降解。此特徵提供明顯的優勢，因為上述穩定造成夥伴分子之循環半生期的延長。連接子亦用於減弱夥伴分子的活性以致接合體在循環時係相對良性的，但夥伴分子於所欲作用位置活化後具有所欲之效應，例如細胞毒性。對於治療劑接合體而言，連接子的此特徵用於改善試劑的治療指數。
除了可切割之胜肽、肼或雙硫基團(分別為F、H或J)之外，可視情況在夥伴分子與F、H或J之間導入一或更多連接子基團L1 。這些連接子基團L1 亦可描述成間隔基團並包括至少兩個官能基。取決於下標m的數值(即，L1 基團存在的數目)與特定基團L1 的位置，基團L1 的化學官能基可視情況結合至夥伴分子F、H或J的化學官能基或是另一連接子基團L1 (若存在超過一個L1 )。間隔基團L1 的適當化學官能基之實例包括羥基、巰基、羰基、羧基、胺基、酮、醛與巰基基團。
連接子L1 可為經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基或經取代或未經取代之雜烷基基團。一實施例中，烷基或芳基基團可包括1至20個之間的碳原子。其亦可包括聚乙二醇部分。
示範性基團L1 包括諸如6-胺基己醇、6-巰基己醇、10-羥基癸酸、甘胺酸與其他胺基酸、1,6-己二醇、β-丙胺酸、2-胺基乙醇、半胱胺(2-胺基乙硫醇)、5-胺基戊酸、6-胺基己酸、3-馬來醯亞胺基苯甲酸(3-maleimidobenzoic acid)、酞內酯、α-經取代之酞內酯、羰基基團、胺基酯(aminal ester)、核酸、胜肽等。
基團L1 的一個功能係視情況提供F、H或J與夥伴分子之間的空間分隔，免得夥伴分子干擾(諸如，透過空間或電子效應)F、H或J的切割化學作用。基團L1 亦可用於將額外的分子質量與化學官能基導入接合體。一般而言，額外的質量與官能基將影響接合體的血清半生期與其他特性。因此，透過小心篩選間隔基團，可產生血清半生期不同的接合體。一或更多連接子L1 可選擇性為如下所述之自我犧牲(self-immolative)基團。
下標m係選自0、1、2、3、4、5與6之整數。當存在多個L1 基團時，其可相同或不同。
L4 係連接子部分，其視情況提供F、H或J與抗體之間的空間分隔，免得F、H或J干擾抗體結合抗原或避免抗體干擾F、H或J的切割化學作用。L4 較佳係利用包含該部分之連接子給予接合體提高的溶解度或降低的聚集特性或修飾接合體的水解速度。如L1 的實例般，L4 選擇性為自我犧牲基團。一實施例中，L4 部分係經取代之烷基、未經取代之烷基、經取代之芳基、未經取代之芳基、經取代之雜烷基或未經取代之雜烷基，任何上述基團可為直鏈、支鏈或環形。取代基可為諸如小型(C1 -C6 )烷基、烷氧基、烷硫基、烷胺基或二烷胺基。某些實施例中，L4 包括非環形部分。另一實施例中，L4 包括正電或負電胺基酸聚合物，諸如聚離胺酸或聚精胺酸。L4 可包括例如聚乙二醇部分的聚合物。此外，L4 連接子可包括諸如聚合物成分與小分子部分兩者。
較佳實施例中，L4 包括聚乙二醇(PEG)部分。L4 的PEG部分可介於1至50單元長。PEG較佳係具有1-12個重複單元，更佳為3-12個重複單元，更佳為2-6個重複單元，更佳為3-5個重複單元，最佳為4個重複單元。L4 可僅由PEG部分組成，或者其亦可包含額外的經取代或未經取代之烷基或雜烷基。將PEG結合成L4 部分的一部分有用於增加複合物的水溶解性。此外，PEG部分減少將藥物接合至抗體之過程中可能發生的聚集程度。
下標p係0或1，即L4 的存在係選擇性的。當存在時，L4 具有至少兩個官能基，一個官能基視情況結合至化學官能基F、H或J，而另一官能基結合至抗體。基團L4 的適當化學官能基之實例包括羥基、巰基、羰基、羧基、胺基、酮、醛與巰基基團。因為通常係透過氫硫基基團(諸如，經由未氧化之半胱胺酸殘基、以亞胺基硫烷(iminothiolane)將含氫硫基之延長附加至離胺酸殘基、或還原雙硫鍵結)、胺基基團(例如，經由離胺酸殘基)、醛基(例如，經由氧化醣苷側鏈)或羥基基團(例如，經由絲胺酸殘基)接合抗體，附著抗體的較佳化學官能基係與上述基團反應的那些官能基，諸如順丁烯二醯亞胺、氫硫基、醛、肼、半卡肼、與羧基基團。較佳係抗體上氫硫基與L4 上的順丁烯二醯亞胺基團的組合。
某些實施例中，L4 包含
直接附著至(AA1 )c 的N-端。R20 係選自H、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基與醯基之一者。各個R25 、R25’ 、R26 與R26’ 分別選自H、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基與經取代或未經取代之雜環烷基；而s與t分別為1至6的整數。R20 、R25 、R25’ 、R26 與R26’ 較佳為疏水性的。某些實施例中，R20 係H或烷基(較佳係未經取代之小型烷基)。某些實施例中，R25 、R25’ 、R26 與R26’ 分別為H或烷基(較佳係未經取代之C1 -C4 烷基)。某些實施例中，R25 、R25’ 要R26 與R26’ 均係H。某些實施例中，t係1而s係1或2。
胜肽連接子(F)
如上所述，本發明之肽基連接子可由通式：(L4 )p 一F一(L1 )m 代表，其中F代表包含肽基部分的部分。一實施例中，F部分包括選擇性的額外自我犧牲連接子L2 與羰基基團，對應於式
的接合體。
此實施例中，L1 、L4 、p與m係界定於上。X4 係抗體而D係夥伴分子。下標o係0或1而L2 若存在的話則代表自我犧牲連接子。AA1 代表一或更多自然胺基酸與/或非自然α-胺基酸；c係1至20間之整數。某些實施例中，c係於2至5之範圍內或者c係2或3。
式(a)中，AA1 在其胺基端係直接連接至L4 ，或當L4 不存在時係直接連接至X4 。某些實施例中，當L4 存在時，L4 不包括直接附著至(AA1 )c 之N-端的羧基醯基基團。
另一實施例中，F部分包括胺基基團與選擇性間隔基團L3 且不存在L1 (即m係0)，相對於式(b)：
的接合體。
此實施例中，X4 、D、L4 、AA1 、c與p係界定於上。下標o係0或1。L3 若存在的話係間隔基團，其包括一級或二級胺類或羧基官能基，且不是L3 的胺類與D的懸垂羧基官能基形成醯胺鍵便是L3 的羧基與D的懸垂胺類官能基形成醯胺鍵。
自我犧牲連接子
自我犧牲連接子係雙官能化學部分，其能共價連接兩個分隔之化學部分成為正常穩定的三部分子，藉由酵素切割自三部分子釋出一分隔化學部分；且酵素切割之後，同時自分子的剩餘部分切割以釋出另一間隔的化學部分。根據本發明，自我犧牲間隔係在其一端共價連接至胜肽部分並在其另一端共價連接至藥物部分(其來源可抑制藥物活性)的化學反應位置，以便間隔並共價連接胜肽部分與藥物部分成為三部分子，其在目標酵素不存在下係穩定且藥物非活性，但其可藉由上述目標酵素在共價連接間隔部分與胜肽部分之鍵結上酵素切割，因此造成自三部分子釋出胜肽部分。上述酵素切割接著將活化間隔部分的自我犧牲特性並開始自主切割共價連接間隔部分與藥物部分之鍵結，因此造成釋放藥物活性形式的藥物。參見諸如Carl等人，J. Med. Chem.,24(3),479-480(1981)；Carl等人，WO 81/01145(1981)；Toki等人，J. Org. Chem. 67,1866-1872(2002)；Boyd等人，WO 2005/112919；及Boyd等人，WO 2007/038658，其揭露以參考資料併入本文中。
一特定較佳的自我犧牲間隔可由式(c)：
所代表。
胺基苄基基團之芳香環可經一或更多「K」基團取代。「K」基團係芳香環上的取代基，其取代以其他方式附著環結構部分之四個非取代碳之一的氫。「K」基團可為單一原子(例如，鹵素)或可為多原子基團，諸如烷基、雜烷基、胺基、硝基、羥基、烷氧基、鹵烷基與氰基。各個K分別選自下列所構成之群組：經取代之烷基、未經取代之烷基、經取代之雜烷基、未經取代之雜烷基、經取代之芳基、未經取代之芳基、經取代之雜芳基、未經取代之雜芳基、經取代之雜環烷基、未經取代之雜環烷基、鹵素、NO2 、NR21 R22 、NR21 COR22 、OCONR21 R22 、OCOR21 與OR21 ，其中R21 與R22 分別選自下列所構成之群組：H、經取代之烷基、未經取代之烷基、經取代之雜烷基、未經取代之雜烷基、經取代之芳基、未經取代之芳基、經取代之雜芳基、未經取代之雜芳基、經取代之雜環烷基與未經取代之雜環烷基。示範性K取代基包括(但不限於)F、Cl、Br、I、NO2 、OH、OCH3 、NHCOCH3 、N(CH3 )2 、NHCOCF3 與甲基。而「Ki 」的i係0、1、2、3或4的整數。一較佳實施例中，i係0。
上述結構之醚類氧原子係連接至羰基基團。由NR24 官能基進入芳香環的線表明胺類官能基可結合至形成環且不被-CH2 -O-基團取代之五個碳的任何一個。X的NR24 官能基較佳係在相對-CH2 -O-基團的對位共價結合至芳香環。R24 係選自H、經取代之烷基、未經取代之烷基、經取代之雜烷基與未經取代之雜烷基所構成群組之一者。特定實施例中，R24 係氫。
一實施例中，本發明提供上式(a)的胜肽連接子，其中F包括結構：
其中R24 、AA1 、K、i與c係界定於上。
另一實施例中，上式(a)的胜肽連接子包括-F-(L1 )m -，其包括結構：
其中R24 、AA1 、K、i與c係界定於上。
某些實施例中，自我犧牲間隔L1 或L2 包括
其中各個R17 、R18 與R19 分別選自H、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基與經取代或未經取代之芳基，且w係0至4的整數。某些實施例中，R17 與R18 分別係H或烷基(較佳係未經取代之C1 -C4 烷基)。R17 與R18 較佳係C1 -C4 烷基，諸如甲基或乙基。某些實施例中，w係0。實驗上已發現此特定自我犧牲間隔環化相當快。
某些實施例中，L1 或L2 包括
其中R17 、R18 、R19 、R24 與K係界定於上。
間隔基團
間隔基團L3 之特徵係其包括一級或二級胺類或羧基官能基，且不是L3 基團之胺類與D之懸垂羧基官能基形成醯胺鍵便是L3 的羧基與D之懸垂胺類官能基形成醯胺鍵。L3 可選自下列所構成之群組：經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基或經取代或未經取代之雜環烷基。較佳實施例中，L3 包括芳香基團。L3 更佳係包括苯甲酸基團、苯胺基團或吲哚基團。可作為-L3 -NH-間隔之結構的非限制性實例包括下列結構：
其中Z係選自O、S與NR23 之一者，而其中R23 係選自H、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基與醯基之一者。
一但切割本發明包含L3 之連接子後，L3 部分保持附著於藥物D。因此，L3 部分係經挑選以致其附著至D不會明顯影響D的活性。另一實施例中，藥物D本身的一部分作為L3 間隔。例如一實施例中，藥物D係都卡黴素衍生物，其中藥物的一部分作為L3 間隔。上述實施例的非限制實例包括那些其中NH2 -(L3 )-D的結構選自下列所構成之群組：
與其中Z係o、S或NR23 ，其中R23 係H、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基或醯基；而各個結構上的NH2 基團與(AA1 )c 反應以形成-(AA1 )c -NH-。
胜肽序列(AA1 )c
基團AA1 代表單一胺基酸或由醯胺鍵結結合在一起之複數個胺基酸。胺基酸可為自然胺基酸與/或非自然α-胺基酸。其可為L或D型態。一實施例中，應用至少三個不同胺基酸。另一實施例中，僅應用兩個胺基酸。
詞彙「胺基酸」代表自然存在與合成的胺基酸，以及功能相似自然存在胺基酸的胺基酸類似物與胺基酸模擬物。自然存在胺基酸係由基因密碼所編碼的那些胺基酸以及後來經修飾之那些胺基酸，諸如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、瓜胺酸與O-磷絲胺酸。胺基酸類似物代表與自然存在胺基酸具有相同基本化學結構的化合物，即結合至氫、羧基基團、胺基基團與R基團之α碳，諸如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。上述類似物具有經修飾之R基團(例如，正白胺酸)或經修飾之胜肽骨幹，但仍保有與自然存在胺基酸相同的基本化學結構。可明確應用之一胺基酸係瓜胺酸，其為精胺酸之前驅物並涉及肝臟中的尿素合成。胺基酸模擬物代表結構與胺基酸的普遍化學結構不同但功能相似於自然存在胺基酸的化學化合物。詞彙「非自然胺基酸」意圖代表上述二十個自然存在之胺基酸的「D」立體化學形式。進一步理解詞彙非自然胺基酸包括自然胺基酸的同源物以及自然胺基酸的合成修飾型。合成修飾型包括(但不限於)具有減短或加長至多兩個碳原子之伸烷基鏈的胺基酸；包括選擇性取代之芳基基團的胺基酸；及鹵化基團(較佳為鹵化烷基與芳基基團)所構成之胺基酸。當胺基酸附著至本發明之連接子或接合體時，其形式為「胺基酸側鏈」，其中胺基酸的羧酸基團已經由酮基(C(O))基團所取代。因此舉例而言，丙胺酸側鏈係-C(O)-CH(NH2 )-CH3 等等。
胜肽序列(AA1 )c 功能上係單一胺基酸(當c=1)的醯胺化(amidification)殘基或係由醯胺鍵連接之複數個胺基酸。胜肽序列(AA1 )c 較佳係經選擇用於酵素催化分割，係藉由生物系統中關注之位置的酵素。例如，針對被指向細胞但未被細胞內化的接合體，挑選可由細胞外間質中之蛋白酶(例如，鄰近死亡細胞釋放的蛋白酶或腫瘤相關蛋白酶)所切割之胜肽，以致於細胞外切割胜肽。針對經設計由細胞所內化之接合體，序列(AA1 )c 較佳係經選擇由內體或溶體蛋白酶所切割。胜肽內的胺基酸數目範圍係1至20；但較佳係1-8個胺基酸、1-6個胺基酸或1、2、3或4個胺基酸構成(AA1 )c 。技術中習知易於由特定酵素或酵素種類切割之胜肽序列。
(AA1 )c 較佳包含蛋白酶切割位置的胺基酸序列(「切割辨別序列(cleavage recognition sequence)」)。技術中習知許多蛋白酶切割序列，參見諸如Matayoshi等人，Science 247:954(1990)；Dunn等人，Meth. Enzymol. 241:254(1994)；Seidah等人，Meth. Enzymol. 244:175(1994)；Thornberry,Meth. Enzymol. 244:615(1994)；Weber等人，Meth. Enzymol. 244:595(1994)；Smith等人，Meth. Enzymol. 244:412(1994)；Bouvier等人，Meth. Enzymol. 248:614(1995),Hardy等人，in A myloid ProteinPrecursor in Development, Aging, and Alzheimer'sDisease, ed. Masters et αl.pp.190-198(1994)。
較佳實施例中，根據被溶體蛋白酶切割的能力來挑選胜肽序列(AA1 )c ，溶體蛋白酶的非限制性實例包括細胞自溶酵素(cathepsins)B、C、D、H、L與S。胜肽序列(AA1 )c 較佳係能藉由細胞自溶酵素B於試管內切割。
另一實施例中，根據其被腫瘤相關蛋白酶(例如，腫瘤細胞周圍於細胞外發現之蛋白酶)切割的能力來挑選胜肽序列(AA1 )c ，腫瘤相關蛋白酶之實例包括甲拌磷寡肽酶(thimet oligopeptidase,TOP)與CD10。其他實施例中，序列(AA1 )c 係經設計由尿激脢(urokinase)或胰蛋白酶(tryptase)選擇性切割。
適於用於本發明之接合體的胜肽序列之適當(但非限制)實例包括Val-Cit、Cit-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala﹑Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(序列編號：40)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(序列編號：41)與Gly-Phe-Leu-Gly(序列編號：42)Val-Ala、Leu-Leu-Gly-Leu(序列編號：43)、Leu-Asn-Ala與Lys-Leu-Val。較佳的胜肽序列係Val-Cit與Val-Lys。
另一實施例中，最靠近藥物部分的胺基酸係選自下列所構成之群組：Ala、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr與Val。又另一實施例中，最靠近藥物部分的胺基酸係選自下列所構成之群組：Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr與Val。
熟悉技術人士可輕易評估胜肽序列配置而不需過度實驗便可確定其於本發明中的效用。參見諸如Zimmerman,M.等人，(l977)Analytical Biochemistry 78:47-5l；Lee,D.等人，(1999)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9:1667-72；及Rano,T.A.等人，(1997)Chemistry and Biology 4:149-55。
本發明之接合體可選擇性包含二或更多連接子。這些連接子可相同或不同。例如，肽基連接子可用於連接藥物至配體而第二肽基連接子可將診斷劑附著至複合物。額外連接子的其他應用包括連接分析劑、生物分子、目標試劑以及可偵測標記至抗體-夥伴複合物。
胼連接子(H)
另一實施例中，本發明之接合體包括胼自我犧牲連接子，其中接合體具有結構：
其中D、L1 、L4 、p、m與X4 係界定於上並進一步描述於本文中，而H係包含結構:
之連接子，其中n1 係1-10的整數；n2 係0、1或2；各個R24 係分別選自下列所構成之群組中的一者：H、經取代之烷基、未經取代之烷基、經取代之雜烷基與未經取代之雜烷基；而I不是鍵結(即，骨架之碳與鄰近氮間之鍵結)就是：
其中n3 係0或1，但當n3 係0時n2 便不是0；而n4 係1、2或3。
一實施例中，苯環上的取代係對位取代。較佳實施例中，n1 係2、3或4或者n1 係3。較佳實施例中，n2 係1。較佳實施例中，I係鍵結(即，骨架之碳與鄰近氮間之鍵結)。一態樣中，胼連接子H可於切割後形成6-員自我犧牲連接子，例如當n3 係0而n4 係2時。另一態樣中，肼連接子H可於切割後形成兩個5-員自我犧牲連接子。又其他態樣中，切割後H形成5-員自我犧牲連接子、H形成7-員自我犧牲連接子或H形成5-員自我犧牲連接子與6-員自我犧牲連接子。切割速率受到切割後形成之環的尺寸所影響。因此，取決於所欲之切割速率，可選擇切割後將形成之環的適當大小。
另一肼結構H具有結構：
其中q係0、1、2、3、4、5或6；而各個R24 係分別選自下列所構成之群組：H、經取代之烷基、未經取代之烷基、經取代之雜烷基與未經取代之雜烷基。此肼結構亦可形成五-員、六-員或七-員環並可添加額外的成分以形成多環。
不同肼連接子的製備、切割化學作用與環化動力學係揭露於WO 2005/112919，其揭露以參考資料併入本文中。
雙硫連接子(J)
又一實施例中，連接子包括酵素可切割之雙硫基團。一實施例中，本發明提供具有根據式(d)：
之結構的細胞毒性抗體-夥伴化合物，其中D、L1 、L4 、p、m與X4 係界定於上並進一步描述於本文中，而J係包括結構：
之基團的雙硫連接子，其中各個R24 係分別選自下列所構成之群組：H、經取代之烷基、未經取代之烷基、經取代之雜烷基與未經取代之雜烷基；各個K係分別選自下列所構成之群組：經取代之烷基、未經取代之烷基、經取代之雜烷基、未經取代之雜烷基、經取代之芳基、未經取代之芳基、經取代之雜芳基、未經取代之雜芳基、經取代之雜環烷基、未經取代之雜環烷基、鹵素、NO2 、NR21 R22 、NR21 COR22 、OCONR21 R22 、OCOR21 與OR21 ，其中R21 與R22 係分別選自下列所構成之群組：H、經取代之烷基、未經取代之烷基、經取代之雜烷基、未經取代之雜烷基、經取代之芳基、未經取代之芳基、經取代之雜芳基、未經取代之雜芳基、經取代之雜環烷基與未經取代之雜環烷基；i係0、1、2、3或4的整數；而d係0、1、2、3、4、5或6的整數。
雙硫連接子的芳香環可由一或更多「K」基團所取代。「K」基團係芳香環上的取代基，其取代以其他方式附著至環結構部分的四個未經取代碳之一的氫。「K」基團可為單一原子(例如，鹵素)或可為多原子基團，諸如烷基、雜烷基、胺基、硝基、羥基、烷氧基、鹵烷基與氰基。示範性K取代基分別包括(但不限於)F、Cl、Br、I、NO2 、 OH、OCH3 、NHCOCH3 、N(CH3 )2 、NHCOCF3 與甲基。而「Ki 」的i係0、1、2、3或4的整數。一較佳實施例中，i係0。
較佳實施例中，連接子包括下式：
之酵素可切割的雙硫基團，其中L4 、X4 、p與R24 係描述於上，而d係0、1、2、3、4、5或6。特定實施例中，d係1或2。
更特定的雙硫連接子係顯示於下式：
d較佳係1或2而各個K係H。
另一雙硫連接子係顯示於下式：
d較佳係1或2而各個K係H。
不同實施例中，雙硫係與胺成直角。另一特定實施例中，a係0。較佳實施例中，R24 係分別選自H與CH3 。
雙硫連接子(例如，描述於上之那些)的製備與化學作用係揭露於WO 2005/112919，其揭露以參考資料併入本文中。
關於細胞毒素、連接子與接合治療劑至抗體的其他方法之類型的進一步討論，亦可參閱US 7,087,600、US 6,989,452、US 7,129,261；US 2006/0004081、US 2006/0247295；WO 02/096910、WO 2007/051081、WO 2005/112919、WO 2007/059404；PCT申請號PCT/US2008/054362；Saito,G.等人(2003)Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215；Trail等人(2003)Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337；Payne.(2003)Cancer Cell 3:207-212；Allen(2002)Nat. Rev. Cancer 2:750-763；Pastan與Kreitman(2002)Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091；Senter與Springer(2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264，其各個全文以參考資料併入本文中。
作為夥伴分子之細胞毒素
一態樣中，本發明特徵係接合至夥伴分子之抗體，夥伴分子諸如細胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性毒素。上述接合體亦可稱為「免疫毒素」。細胞毒素或細胞毒性劑包括任何對細胞有害(例如，殺死)的試劑。
本發明之夥伴分子的實例包括紫杉醇(taxol)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短桿菌素D(gramicidin D)、溴化乙啶(ethidium bromide)、吐根鹼(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、文克斯汀(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、道諾魯比辛(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睪固酮(1-dehydrotestosterone)、葡萄糖皮質素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、特他卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)與嘌呤黴素(puromycin)以及上述之類似物或同系物。夥伴分子的實例亦包括諸如抗代謝物(諸如，滅殺除癌、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺(5-fluorouracildecarbazine))、烷化劑(諸如，二氯甲基二乙酸(mechlorethamine)、沙奧特帕氮芥苯丁酸(thioepachlorambucil)、氮芥苯丙胺酸(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)與洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環磷醯胺(cyclothosphamide)、補束芬(busulfan)、微管裂解素(tubulysin)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈脲佐菌素(streptozotocin)、絲裂黴素C與順鉑(cisplatin))、蒽環類(諸如，道諾魯比辛(前道諾霉素(daunomycin))與多柔比星)、抗生素(諸如，放線菌素D(dactinomycin)(前放線菌素)、博萊黴素(bleomycin)、光神霉素與安曲霉素(anthramycin,AMC))與抗有絲分裂劑(諸如，文克斯汀與長春鹼)。可接合至本發明抗體之夥伴分子的其他較佳實例包括卡利奇黴素(calicheamicin)、美登素(maytansine)與澳洲抗原(auristatin)以及上述之衍生物。
夥伴分子的較佳實例係CC-1065與結構相關之都卡黴素的類似物與衍生物。即便有效且廣泛的抗癌活性，但是因為其實驗動物的延遲死亡所以CC-1065無法用於人類，這促進搜尋較佳治療指數的類似物與衍生物。
技術中習知CC-1065與都卡黴素的許多類似物與衍生物。已經重新探討許多化合物之結構、合成與特性的研究。參見諸如Boger等人，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:1438(1996)；與Boger等人，Chem. Rev. 97:787(1997)。其他關於CC-1065類似物或衍生物的揭露包括：US 5,101,038、US 5,641,780、US 5,187,186、US 5,070,092、US 5,703,080、US 5,070,092、US 5,641,780、US 5,101,038、US 5,084,468、US 5,739,350、US 4,978,757、US 5,332,837與US 4,912,227；WO 96/10405；以及EP 0,537,575 A1。
特定較佳態樣中,夥伴分子係具有根據下式(e)：
之結構的CC-1065/都卡黴素類似物,其中環系統A係選自經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基與經取代或未經取代之雜環烷基基團之一者。示範性環系統A包括苯基與吡咯。
符號E與G分別係選自H、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基、雜原子、單鍵，或者E與G係選擇性連結以形成選自經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基與經取代或未經取代之雜環烷基之環系統。
符號X代表選自O、S與NR23 之一者。R23 係選自H、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基與醯基之一者。
符號R3 代表選自(=O)、SR11 、NHR11 與OR11 之一者，其中R11 係H、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基、單磷酸、二磷酸、三磷酸、磺酸、醯基、C(O)R12 R13 、C(O)OR12 、C(O)NR12 R13 、P(O)(OR12 )2 、C(O)CHR12 R13 、SR12 或SiR12 R13 R14 。符號R12 ﹑R13 與R14 分別代表H、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基與經取代或未經取代之芳基，其中R12 與R13 與其附著之氮或碳原子一起選擇性連結以形成具有4至6員的經取代或未經取代之雜環烷基環系統，選擇性包含二或更多雜原子。
R4 ﹑R4 ’﹑R5 與R5 ’係分別選自H、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜環烷基、鹵素、NO2 、NR15 R16 、NC(O)R15 、OC(O)NR15 R16 、OC(O)OR15 、C(O)R15 、SR15 、OR15 、CR15 =NR16 與O(CH2 )n N(CH3 )2 之一者，其中n係1至20的整數，或者任何R4 、R4 ’、R5 與R5 ’的鄰近配對與其附著之碳原子一起連結以形成具有4至6員的經取代或未經取代之環烷基或雜環烷基環系統。R15 與R16 分別代表H、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜環烷基與經取代或未經取代之肽基，其中R15 與R16 以及其附著之氮原子選擇性連接以形成具有4至6員的經取代或未經取代之雜環烷基環系統，選擇性包含二或更多雜原子。一示範性結構係苯胺。
R3 、R4 、R4 ’、R5 與R5 ’之一連結細胞毒素至本發明的連接子或酵素可切割結構(如本文所述)，例如連至L1 或L3 (若存在的話)或連至F、H或J。
R6 係存在或不存在的單鍵。當R6 存在時，R6 與R7 係連結以形成環丙基環。R7 係CH2 -X1 或-CH2 -。當R7 係-CH2 -時，其係環丙烷環之部分。符號X1 代表例如鹵素(諸如，Cl、Br或F)之脫離基。以不違反化學價原則之方式來解釋R6 與R7 的組合。
X1 可為任何脫離基。有用的脫離基包括(但不限於)鹵素、疊氮化物、磺酸酯(諸如，烷磺醯基、芳磺醯基)、金羊離子(oxonium ion)、烷基過氯酸(alkyl perchlorate)、氨基烷烴磺酸酯(ammonioalkanesulfonate ester)、烷基氟磺酸與氟化化合物(諸如，三氟甲磺酸酯(triflate)、全氟丁基磺酸酯(nonaflate)、三氟乙基磺酸酯(tresylate))等。可當作脫離基之特定鹵素係F、Cl與Br。
六-員環中的曲線代表環具有一或更多的不飽和程度，且其可為芳香族。因此，例如那些下述之環結構與相關結構係位於式(f)：
之範圍內。
一實施例中，Rll 包括部分X5 ，其不自我環化且連接藥物至L1 或L3 (若存在的話)或至F、H或J。部分X5 較佳係可利用酵素切割且一旦切割後，可提供活性藥物。作為實例，R11 可具有下列結構(右側耦接至藥物的剩餘部分)：
某些實施例中，至少一R4 、R4 ’、R5 與R5 ’連接該藥物至L1 (若存在的話)或至F、H、J或X2 ，而R3 係選自SR11 、NHR11 與OR11 。R11 係選自-SO(OH)2 、-PO(OH)2 、 -AAn 、-Si(CH3 )2 C(CH3 )3 、-C(O)OPhNH(AA)m 、
以及上述藥學可接受之鹽類，其中n係1至10範圍內的任意整數，m係1至4範圍內的任意整數，p係1至6範圍內的任意整數，而AA係任何自然或非自然胺基酸。當式(e)的化合物透過R4 、R4 ’﹑R5 或R6 而接合，R3 較佳包括可切割之阻擋基團，其存在可阻礙化合物的細胞毒性活性，但其在預期作用位置的條件下係可切割的，其機制不同於接合細胞毒素至抗體之連接子的切割作用。此方式中，若血漿中的接合體有偶然的切割，則阻擋基團減弱釋出之細胞毒素的細胞毒性。例如，若接合體具有腙或雙硫連接子，那麼阻擋基團可為酵素可切割之醯胺。或者若連接子係可藉由蛋白酶切割之肽基，那麼阻擋基團可為羧基酯酶(carboxyesterase)可切割之酯或胺甲酸酯。
例如較佳實施例中，D係具有結構(j)：
之細胞毒素。
此結構中，R3 、R6 、R7 、R4 、R4 ，、R5 、R5 ，與X係描述於上式(e)。Z係選自O、S與NR23 之一者，其中R23 係選自H、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基與醯基之一者。
R1 係H﹑經取代或未經取代之小型烷基、C(O)R8 或CO2 R8 ，其中R8係選自NR9 R10 與OR9 之一者，其中R9 與R10 係分別選自H、經取代或未經取代之烷基與經取代或未經取代之雜烷基之一者。
R1’ 係H、經取代或未經取代之小型烷基或C(O)R8 ，其中R8係選自NR9 R10 與OR9 之一者，其中R9 與R10 係分別選自H、經取代或未經取代之烷基與經取代或未經取代之雜烷基之一者。
R2 係H、或經取代或未經取代之小型烷基、或未經取代之雜烷基、或氰基、或烷氧基；而R2’ 係H、或經取代或未經取代之小型烷基、或未經取代之雜烷基。
R3 ﹑R4 ﹑R4， 、R5 或R5’ 之一連接細胞毒素至L1 或L3 (若存在的話)或至F、H或J。
進一步實施例具有式：
此結構中，A、R6 、R7 、X、R4 、R4 、R5 與R5 係描述於上式(e)。Z係選自O、S與NR23 之一者，其中R23 係H﹑經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基與醯基之一者；R34 係C(=O)R33 或C1 -C6 烷基，其中R33 係選自H、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜環烷基、鹵 素、NO2 、NR15 R16 、NC(O)R15 、OC(O)NR15 R16 、OC(O)OR15 、C(o)R15 、SR15 、OR15 、CR15=NR16 與O(CH2 )n N(CH3 )2 ，其中n係1至20的整數。R15 與R16 分別代表H、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜環烷基與經取代或未經取代之肽基，其中R15 與R16 與其附著之氮原子選擇性連結以形成具有4至6員的經取代或未經取代之雜環烷基環系統，其選擇性包括二或更多雜原子。
A較佳係經取代或未經取代之苯基、或經取代或未經取代之吡咯。再者，本文對R11 描述的任何取代基篩選亦適用於R33 。
作為夥伴分子之標記
當夥伴分子係標記時，其可為具有或產生可偵測之物理或化學特性(藉此於特定組織或細胞中表示其之存在)的任何部分。已經在免疫試驗、生醫研究與醫療診斷領域中充分發展標記(有時亦稱為報導基團)。標記可藉由下列方式偵測：光譜、光化學、生物化學、免疫化學、電子、光學或化學方法。實例包括磁珠(例如，DYNABEADSTM )、螢光色素(諸如，螢光素異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate)、德克薩斯紅(Texas red)、若丹明(rhodamine)等)、放射性同位素(諸如，3 H、125 I、35 S、14 C或32 P)、酵素(諸如，山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酸脢(alkaline phosphatase)以及常用於ELISA中之其他酵素)以及比色標記，諸如膠體金(colloidal gold)或有色玻璃或塑膠珠(諸如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)。
標記較佳係選自下列所構成之群組的一者：放射性同位素、螢光劑、螢光劑前驅物、發色團、酵素以及上述之組合。適當酵素的實例係山葵過氧化酶、鹼性磷酸脢、β-半乳糖苷酶與葡萄糖氧化酶。螢光劑包括螢光素(fluorescein)與其衍生物、若丹明與其衍生物、丹磺基(dansyl)、繖形酮(umbelliferone)等。化學發光化合物包括螢光素(luciferin)與2,3-二氫酞口井二酮(2,3-dihydrophthalazinedione)，例如魯米諾(luminol)。可用之不同標記或信號產生系統的回顧，參見美國專利號4,391,904。
可藉由非直接方式附加標記：配體分子(例如，生物素)係共價結合至抗體。配體接著結合至另一分子(例如，鏈黴卵白素(streptavidin))，其本身係可偵測的或者共價結合至信號系統，諸如可偵測之酵素、螢光化合物或化學發光化合物。
接合體的實例
適合接合至本發明抗體之夥伴分子-連接子組合的特定實例如下所示：
上述化合物中，當下標r存在於式中時，其係0至24範圍內的整數。R不論出現於何處，係
各個上述化合物具有順丁烯二醯亞胺(maleimide)基團並準備好透過其上的氫硫基基團接合至抗體。
亦可藉由其他類型的化學官能基(如上方雙專一性分子文中所述)來造成接合至本發明之抗體。
藥學組合物
另一態樣中，本揭露提供包含與藥學可接受載體一起配置之本揭露單株抗體或其之抗原結合部分之一或組合的藥學組合物。
本揭露之藥學組合物亦可結合治療一起施用，即與其他試劑結合。例如，組合式治療可包括結合至少一其他抗-癌劑之本揭露的抗-間皮素抗體。可用於組合式治療之治療劑實例係更加詳細描述於下。
本文所用之「藥學可接受載體」包括任何與全部生理相容之溶劑、散佈媒介、塗層、抗細菌與抗真菌劑、等張與吸收延遲劑等。載體較佳係適合靜脈內、肌肉內、皮下、非腸胃、脊髓或表皮施加(諸如，藉由注射或注入)。取決於施加路徑，可用材料塗覆活性化合物(即，抗體、免疫接合體或雙專一性分子)以保護化合物免受會使化合物失去活性之酸與其他自然狀況的作用。
本揭露之藥學化合物可包括一或更多藥學可接受鹽類。「藥學可接受鹽類」代表保留原本化合物所欲之生物活性且不給予任何不欲之毒物影響之鹽類。上述鹽類的實例包括酸加成鹽(acid addition salt)與鹼加成鹽(base addition salt)。酸加成鹽包括那些衍生自無毒無機酸，諸如氫氯酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等之鹽類；以及衍生自無毒有機酸，諸如脂肪族單-與雙羧酸、苯基-取代之烷酸、羥基烷酸、芳香酸、脂肪族與芳香族硫酸等之鹽類。鹼加成鹽包括那些衍生自鹼土金屬，諸如鈉、鉀、鎂、鈣等之鹽類；以及衍生自無毒有機胺類，諸如N,N'-二苄基伸乙二胺(N,N'-dibenzylethylenediamine)、N-甲基葡萄胺(N-methylglucamine)、氯普魯卡因、膽鹼(cho1ine)、二乙醇胺、伸乙二胺、普魯卡因等之鹽類。
本揭露之藥學組合物亦可包括藥學可接受抗氧化劑。藥學可接受抗氧化劑的實例包括(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、鹽酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、偏二亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸棕櫚酸酯(ascorbyl palmitate)、丁羥甲醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂(lecithin)、五倍子酸丙酯(propyl gallate)、α-生育酚等；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、伸乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可用於本揭露之藥學組合物的適當水性與非水性載體的實例包括水、乙醇、聚醇(諸如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、及其適當混合物、植物油(例如，橄欖油)及可注射之有機酯(例如，油酸乙酯)。可藉由利用塗覆材料(例如，卵磷脂)、藉由維持必須的微粒尺寸(分散劑的例子中)及藉由利用界面活性劑來維持適當的流動。
這些組合物亦可包含佐劑，諸如防腐劑、潤濕劑、乳化劑與分散劑。可藉由上文之殺菌步驟與包含不同抗細菌與抗真菌劑兩者來確保避免微生物的存在，抗細菌與抗真菌劑諸如羥苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、酚、山梨酸等。亦樂見包括等張劑，諸如糖、氯化鈉等。此外，可藉由包括延遲吸收之劑(諸如，單硬脂酸鋁以及明膠)得到可注射藥學形式的延長吸收。
藥學可接受載體包括用於即興製備無菌可注射溶液或分散液之無菌水溶液或分散液與無菌粉末。技術中習知利用上述媒介與試劑於藥學活性物質。除了與活性化合物不相容之任何傳統媒介或試劑，可考慮將其用於本揭露之藥學組合物中。亦可將輔助活性化合物併入組合物中。
治療組合物一般在製造與儲存狀態下並須無菌且穩定。可將組合物配置成適合高藥物濃度的溶液、微乳液、脂質體或其他有條理結構。載體可為溶劑或分散媒介，其包括諸如水、乙醇、聚醇(諸如，甘油、丙二醇與液態聚乙二醇等)及上述適當的混合物。可藉由利用塗覆材料(例如，卵磷脂)、藉由維持必須的微粒尺寸(分散劑的例子中)及藉由利用界面活性劑來維持適當的流動。許多實例中，較佳係包括等張劑(諸如，糖、多元醇(諸如，甘露醇、山梨醇)或氯化鈉)。
可藉由微過濾來製備無菌可注射溶液。一般而言，藉由將活性化合物併入無菌載體來製備分散液，無菌載體包含基本分散媒介與來自上述列舉那些的所須其他成分。用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的實例中，較佳的製備方法係真空乾燥與冷凍乾燥(凍乾法)，其自活性成分加上任何額外所欲成分之先前無菌過濾溶液產生上述之粉末。
與攜帶材料結合以產生單一劑型之活性成份量將取決於治療之個體與特定的施加模式而改變。與攜帶材料結合以產生單一劑型之活性成份量一般而言係產生治療效果之組合物量。一般而言，在100%下，此活性成分量之範圍係約0.01%至約99%，較佳係約0.1%至約70%、更佳係約1%至約30%的活性成分與藥學可接受載體結合。
劑量方案係經調整以提供最佳所欲之反應(例如，治療反應)。例如，可施加單一大藥丸、可隨著時間施加許多分割之劑量、或者可隨著治療情況的急迫性所示按比例減少或增加。特別有利將非腸胃組合物配置成劑量單元型式，其容易施加且劑量均勻。本文所用之劑量單元型式代表適合即將治療之個體的單一劑量的物理分離單元；各個單元包含預定數量之活性化合物(經計算以產生所欲治療效果)以及所需之藥學載體。本揭露劑量單元型式之說明書係規定於並直接取決於(a)活性化合物的獨特特性與即將達成之特定治療效果，及(b)化合治療個體感受性之上述活性化合物技術固有的限制。
關於本發明抗體的施加，劑量範圍係約0.0001至100mg/kg(宿主體重)、更通常係0.01至5mg/kg(宿主體重)。諸如，劑量可為0.3mg/kg(宿主體重)、1 mg/kg(宿主體重)、3mg/kg(宿主體重)、5mg/kg(宿主體重)或10mg/kg(宿主體重)或1-10mg/kg範圍內。示範性治療方案規定每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每月一次、每三個月一次或每三至六個月一次施加。較佳劑量方案包括1mg/kg(宿主體重)或3mg/kg(宿主體重)透過靜脈內施加，前提是抗體係利用下列劑量排程之一：(i)每四週六次劑量，接著每三個月；(ii)每三週；(iii)一次3mg/kg(宿主體重)接著每三週1mg/kg(宿主體重)。
某些方法中，同時施加具有不同結合專一性之二或更多單株抗體，其中各個施加抗體之劑量落於所示範圍內。通常在多個時機上施加抗體。單一劑量間之間隔可為諸如每週、每月、每三個月或每年。如藉由測量患者內針對目標抗原之抗體血液水平所示般，間隔亦可係不規律的。某些方法中，劑量係經調整以達成約1-1000μg/ml的血漿抗體濃度，且在某些方法中係約25-300μg/ml。
或者，可以持續釋出配方施加抗體，其中僅需較低頻率的施加。劑量與頻率取決於患者內抗體的半生期而改變。一般而言，人類抗體顯示最長的半生期，接著為人類化抗體、嵌合抗體與非人類抗體。施加的劑量與頻率可取決於治療係預防性或治療性而改變。預防性應用中，在長時間中以相當不常之間隔施加相對低劑量。某些患者持續接受治療以讓其生活安寧。治療應用中，有時需要相對短間隔之相對高劑量直到減少或終止疾病的進展，而較佳係直到患者顯示疾病症狀部分或完全改善。此後，可對患者施加預防性方案。
用於預防與/或治療與不正常細胞增殖相關之疾病，施加化合物的較佳循環濃度係約0.001μM至20μM，較佳係約0.01μM至5μM。
本文所述化合物的病患口服劑量通常範圍係約1毫克/天至約10,000毫克/天，更佳係約10毫克/天至約1,000毫克/天，且最佳係約50毫克/天至約500毫克/天。以患者體重來表示，劑量通常範圍係約0.01至約150毫克/公斤/天，更佳係約0.1至約15毫克/公斤/天，且最通常係約1至約10毫克/公斤/天，諸如5毫克/公斤/天或3毫克/公斤/天。
至少某些實施例中，延緩或抑制腫瘤生長的患者劑量可為1μmol/公斤/天或更少。例如，患者劑量可為0.9、0.6、0.5、0.45、0.3、0.2、0.15或0.1μmol/公斤/天或更少(代表藥物的莫耳)。較佳係當以每天劑量施加抗體-藥物接合體至少五天的週期時可延緩腫瘤生長。
本揭露之藥學組合物中活性成分的實際劑量水平可經改變以得到有效達到對特定患者所欲之治療反應的活性成分量、組合物與施加模式，而不會對患者有毒。選擇之劑量水平將取決於許多藥學動力因子，包括特定組合物、或其之酯類、鹽類或醯胺之活性；施加路徑；施加時間；應用之特定化合物的分泌速率；治療持續時間；其他藥物；搭配所用之特定組合物的化合物與/或材料；患者的年紀、性別、重量、狀況、一般健康與先前醫療史；及醫療領域習知的類似因子。
本揭露之抗-間皮素抗體的「治療有效劑量」較佳係造成疾病症狀嚴重度的減少、無疾病症狀時間的頻率與持續時間的增加、或避免疾病折磨導致的損傷或殘疾。例如針對腫瘤治療，相對於未治療個體，「治療有效劑量」較佳係抑制腫瘤生長至少約20%、較佳係至少約40%、更佳係至少約60%、又更佳係至少約80%。可在預估人類腫瘤中之效力的動物模式系統評估化合物抑制腫瘤生長的能力。或者，可藉由檢驗化合物抑制細胞生長的能力來評估組合物的特性，上述抑制可藉由熟悉技術人士所知的試驗於試管內測量。治療化合物的治療有效量可減少腫瘤尺寸、或改善個體內的症狀。熟悉技術之人士可根據下列因子而確定上述劑量：諸如個體尺寸、個體症狀的嚴重性及所選之特定組合物或施加路徑。
可利用一或更多技術中習知的不同方法透過一或更多施加路徑來施加本揭露之組合物。熟悉技術人士可理解施加路徑與/或模式取決於所欲結果而改變。本揭露之抗體的較佳施加路徑包括靜脈內、肌肉內、真皮內、腹膜內、皮下、脊髓或其他非腸胃施加路徑(諸如，注射或注入)。本文所用之詞組「非腸胃施加」意指除了腸道與局部施加外的施加模式，通常係藉由注射且包括(不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、脊髓膜內(intrathecal)、囊內(intracapsular)、眼窩內(intraorbital)、心臟內、真皮內、腹膜內、經氣管(transtracheal)、皮下、表皮下、關節內、囊下(subcapsular)、蛛網膜下(subarachnoid)、脊椎內、硬膜上(epidural)與胸骨內注射與注入。
或者，可透過非-非腸胃路徑施加本揭露之抗體，諸如局部、表皮或黏膜施加路徑(諸如，鼻內、口腔、陰道、直腸、舌下或局部)。
可用能保護化合物抵抗快速釋出之載體製備活性化合物，諸如控制釋出之配方，包括植入物、皮膚貼片與微粒膠囊式傳送系統。可應用生物可分解、生物相容之聚合物，諸如乙烯醋酸乙烯(ethylene vinyl acetate)、聚酸酐(polyanhydride)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、膠原、聚原酸酯(polyorthoester)與聚乳酸。許多製備上述配方之方法係有專利或通常為熟悉技術人士所習知。參見，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R. Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可用技術中習知的醫療裝置施加治療組合物。例如，可用無針皮下注射裝置施加本揭露之治療組合物，諸如描述於US 5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556的裝置。可用於本揭露之植入物與模組的實例包括：US 4,487,603，其揭露可植入之微注入泵，用經控制之速率分散藥物；US 4,486,194，其揭露透過皮膚施加藥物之治療裝置；US 4,447,233，其揭露以準確注入速率來傳送藥物之藥物注入泵：US 4,447,224，其揭露可變流速、可植入之注入設備，用於連續藥物輸送；US 4,439,196，其揭露具有多腔室隔間之滲透性藥物傳送系統；以及US 4,475,196，其揭露滲透性藥物傳送系統。這些專利以參考資料併入本文中。熟悉技術人士已知許多其他植入物、傳送系統與模組。
本揭露之抗體可經配置以確保活體內適當的分佈。例如，血腦障壁(BBB)排除許多高度親水性化合物。為了確保本揭露之治療化合物跨越BBB(若想要的話)，可將其配置於例如脂質體中。關於製造脂質體之方法，參見例如US 4,522,811、5,374,548與5,399,331。脂質體可包括一或更多部分，其係選擇性傳送進入特定細胞或器官以藉此提高目標藥物傳送(參見，例如Ranade(1989)J. Clin. Pharmacol. 29:685)。示範性目標部分包括葉酸或生物素(參見，例如給予Low等人的US 5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人(1988)Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗體(Bloeman等人(1995)FEBS Lett. 357:140；Owais等人(1995)Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；介面活性蛋白(surfactant protein)A受體(Briscoe等人(1995)Am. J. Physiol. 1233:134)；p120 (Schreier等人(1994)J. Biol. Chem. 269:9090)；亦參見Keinanen與Laukkanen(1994)FEBS Lett. 346:123；Killion與Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
本發明之應用與方法
本發明之抗體(特別係人類抗體)、抗體組合物、抗體-夥伴分子接合體組合物與方法具有許多試管內與活體內診斷與治療應用，其包括間皮素所介導之異常的診斷與治療。例如，可將這些分子施加至培養中之細胞(試管內或活體外)或至人類個體以治療、預防並診斷多種異常。本文所用之詞彙「個體」意圖包括人類與非人類動物。非人類動物包括所有的脊椎動物(例如，哺乳類與非哺乳類)，諸如非人類靈長類、羊、狗、貓、牛、馬、雞、兩棲類與爬蟲類。較佳之個體包括具有間皮素活性所介導之異常的人類患者，特別係具有與變異間皮素表現相關之異常的人類患者。當與另一試劑共同施加針對間皮素的抗體-夥伴分子接合體時，可以任何順序或同時施加這兩者。
已知本發明之抗體專一性結合間皮素，本發明之抗體可用來專一性偵測間皮素表現，再者，可透過免疫親合純化來純化間皮素。
一實施例中，本發明之組合物可用來偵測間皮素水平，其之水平接著可與某些疾病症狀連結。或者，組合物可用來抑制或阻礙間皮素功能，其接著可被連結至某些疾病症狀的預防與改善，藉此暗示間皮素為疾病的中介物。這可藉由讓樣本與對照樣本和抗-間皮素抗體在允許抗體與間皮素之間形成複合物的條件下接觸而加以達成。在樣本與對照中偵測並比較抗體與間皮素之間形成的複合物。
另一實施例中，可首先試驗本發明之組合物與試管內治療或診斷應用相關之結合活性。例如，可利用技術中習知的流式細胞試驗來試驗本發明之組合物。
本發明之組合物具有間皮素相關之疾病的額外治療與診斷應用。例如，免疫接合體可用來活體內或試管內引發下列生物活性：抑制表現間皮素之細胞的生長與/或殺死之；在人類效應子細胞存在下介導表現間皮素之細胞的胞噬作用或ADCC；或阻礙間皮素配體結合間皮素。
特定實施例中，組合物係用來活體內治療、預防或診斷不同的間皮素相關之疾病。間皮素相關之疾病的實例尤其包括卵巢癌、胰臟癌、胃癌、肺癌、子官癌、子官內膜癌、膽道癌、胃/食道癌、大腸直腸癌與乳癌。
本發明之組合物可包括試劑，尤其包括抗-腫瘤劑，諸如多柔比星(艾黴素(adriamycin))、順鉑、博萊黴素硫酸鹽(bleomycin sulfate)、卡氮芥(carmustine)，氮芥苯丁酸與環磷醯胺與羥脲，其本身僅在對患者有毒或次有毒的水平下有效。以100毫克/公斤劑量每四週一次靜脈內施加順鉑而以60-75毫克/毫升劑量每21天一次靜脈內施加艾黴素。共同施加本發明之人類抗-間皮素抗體或其抗原結合片段與化學治療劑提供兩個抗癌症劑，其透過不同機制運作而對人類腫瘤細胞產生細胞毒性效應。上述共同施加可解決起因於藥物抗性發展或腫瘤細胞的抗原性改變(使其不與抗體反應)的問題。
本發明之雙專一性與多專一性分子亦可用來調控效應子細胞上的FcγR或FcγR水平，諸如藉由覆蓋與排除細胞表面上的受體。抗-Fc受體的混合物亦可用於此目的。
具有補體結合位置(諸如，結合補體之IgG1、-2或-3或IgM的部分)的本發明組合物亦可在補體存在下應用。一實施例中，可藉由加入補體或含有補體之血清補充以本發明之結合試劑與適當效應子細胞活體外處理之一群細胞(包含目標細胞)。可藉由補體蛋白的結合來改善塗覆有本發明結合試劑之目標細胞的胞噬作用。另一實施例中，亦可藉由補體來裂解塗覆有本發明之組合物(諸如，人類抗體、多專一性與雙專一性分子)的目標細胞。又另一實施例中，本發明之組合物不會活化補體。
本發明之組合物亦可與補體一同施加。因此，本揭露提供之組合物包括人類抗體、多專一性或雙專一性分子與血清或補體。當補體位於相當接近人類抗體、多專一性或雙專一性分子時，這些組合物係有利的。或者，可分別施加本發明之人類抗體、多專一性或雙專一性分子與補體或血清。
包含本發明之抗體組合物與使用指示的套組亦位於本發明範圍內。套組可更包括一或更多.額外試劑，諸如免疫抑制劑、細胞毒性劑或放射性毒性劑，或是一或更多額外的本發明人類抗體(例如，具有互補活性之人類抗體，其與第一人類抗體可結合間皮素抗原中不同之表位)。
因此，以本發明之抗體組合物治療之患者可額外施加(早於、同時或本發明之組合物施加之後)另一治療劑(諸如，細胞毒性或放射性毒性劑)，其可提高或擴大組合物的治療效果。
其他實施例中，可額外地以調控(諸如，提高或抑制)Fcγ或Fcγ受體之表現或活性的試劑處理個體，例如藉由以細胞激素處理個體。以多專一性分子處理過程中施加的較佳細胞激素包括顆粒性白血球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、顆粒性白血球-巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)與腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor， TNF)。
特定實施例中，本發明提供偵測樣本中間皮素抗原存在或測量間皮素抗原量的方法，其包括在允許抗體或其部分與間皮素之間形成複合體的情況下，以人類單株抗體或其抗原結合部分(專一性結合間皮素)接觸樣本與對照樣本。接著偵測到複合體的形成，其中樣本相對於對照樣本間之複合體形成中的差異表示樣本中間皮素抗原的存在。
其他實施例中，本發明提供個體中間皮素介導之異常的治療方法，間皮素介導之異常諸如卵巢癌、胰臟癌、胃癌、肺癌、子官癌、子官內膜癌、膽道癌、胃/食道癌、大腸直腸癌與乳癌。
又另一實施例中，本發明之免疫接合體可藉由連接上述夥伴分子至抗體而用於使分子與表現間皮素之細胞結夥。例如，抗-間皮素抗體可接合至US6,281,354、6,548,530、2003/0050331、2003/0064984、2003/0073852與2004/0087497、或WO 03/022806中描述的任何毒性化合物。因此，本發明亦提供活體外或活體內定位表現間皮素之細胞的方法，例如以可偵測標記(諸如，放射性同位素、螢光化合物、酵素或酵素輔助因子)。或者，免疫接合體可藉由指向接合至間皮素-結合抗體之細胞毒素或放射性毒素而用來殺死具有間皮素細胞表面受體之細胞。
有鑒於間皮素與某些腫瘤的結合，本發明提供抑制表現間皮素之腫瘤細胞生長的方法，其包括以本揭露之抗-間皮素抗體接觸腫瘤細胞以便抑制腫瘤細胞的生長。較佳實施例中，抗體係接合至治療劑，例如細胞毒素。特定較佳實施例中，表現間皮素之腫瘤細胞係間皮瘤細胞，或是與卵巢癌、胰臟癌、胃癌、肺癌、子官癌、子官內膜癌、膽道癌、胃/食道癌、大腸直腸癌與乳癌相關之腫瘤細胞。其他較佳實施例中，表現間皮素之腫瘤細胞係間皮瘤細胞、胰臟癌細胞、卵巢癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞或子宮內膜癌細胞。又其他實施例中，腫瘤細胞係來自下列所構成之群組的癌症：間皮瘤、乳突漿液卵巢腺癌、亮細胞卵巢癌、混合性苗勒氏卵巢癌、子宮內膜粘液性卵巢癌、胰臟腺癌、胰臟管腺癌、子宮狀漿液性癌、肺腺癌、肝外膽管癌、胃腺癌、食道腺癌、大腸直腸腺癌與乳腺癌。
再者另一態樣中，抗-間皮素抗體與其抗體藥物接合體可用來治療個體中的癌症。因此，本發明提供治療個體中癌症的方法，其包括對個體施加本揭露之抗體以便治療個體中的癌症。例如特定較佳實施例中，抗體可用來治療間皮瘤、卵巢癌或胰臟癌。其他較佳實施例中，抗體係用來治療間皮瘤、胰臟癌、卵巢癌、胃癌、肺癌或子官內膜癌。又其他實施例中，抗體係用來治療選自下列所構成之群組的癌症：間皮瘤、乳突漿液卵巢腺癌、亮細胞卵巢癌、混合性苗勒氏卵巢癌、子宮內膜粘液性卵巢癌、胰臟腺癌、胰臟管腺癌、子宮狀漿液性癌、肺腺癌、肝外膽管癌、胃腺癌、食道腺癌、大腸直腸腺癌與乳腺癌。
抗體可單獨或搭配其他癌症治療(諸如手術與/或輻射)與/或其他抗-腫瘤劑(例如，上方所列與所述之抗-腫瘤劑)一起應用，抗-腫瘤劑包括化學治療藥物與其他抗-腫瘤抗原之抗體，諸如那些結合CD20、Her2、PSMA、Campath-1、EGFR等之抗體。
可選擇性將間皮素抗體結合免疫原性劑，例如包括癌症細胞、純化之腫瘤抗原(包括重組蛋白、胜肽與醣分子)、細胞與以編碼免疫刺激細胞激素之基因轉染的細胞之疫苗(He等人(2004)J.Immμnol.173：4919-28)。已經設計許多對抗腫瘤之疫苗的實驗性策略(參閱Rosenberg，S.,2000,Development of Cancer Vaccines,ASCOEducational Book Spring：60-62；Logothetis,C.,2000,ASCO Educational Book Spring：300-302；Khayat,D.2000,ASCO Educational Book Spring：414-428；Foon,K.2000,ASCo Educational Book Spring：730-738；亦參閱Restifo,N.與Sznol,M.,Cancer Vaccines,Ch. 61,pp．3023-3043 in DeVita,V.et al.(eds.),1997,Cancer：Principles and Practice of oncology，第五版)。這些策略之一者中，利用自體(autologous)或異體(allogeneic)腫瘤細胞製備疫苗。已經顯示當腫瘤細胞經轉導以表現GM-CSF時，這些細胞疫苗係最有效的。已經顯示GM-CSF為腫瘤疫苗之抗原呈現的可能活化劑(Dranoff等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA.90：3539-43)。
其他腫瘤疫苗可包括來自與人類癌症有關之病毒的蛋白，病毒諸如人類乳突病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV與HCV)與卡波西氏疱疹肉瘤病毒(Kaposi's Herpes Sarcoma Virus,KHSV)。可用於腫瘤疫苗之另一腫瘤專一性抗原形式係純化之熱休克蛋白(HSP)，其係自其本身之腫瘤組織單離。這些熱休克蛋白包含來自腫瘤細胞之蛋白片段且這些HSP在傳送至抗原呈現細胞以引發腫瘤免疫上係高度有效率的(Suot,R & Srivastava,P(1995)Science 269:1585-1588；Tamura,Y.等人(1997)Science 278:117-120)。
樹突細胞(DC)係可能的抗原呈現細胞，其可用來啟動抗原-專一性反應。可在活體外產生DC並負載不同蛋白與胜肽抗原以及腫瘤細胞萃取物(Nestle,F.等人(1998)Nature Medicine 4:328-332)。亦可藉由基因方法轉導DC以表現這些腫瘤抗原。為了免疫目的，亦已經將DC直接與腫瘤細胞融合(Kugler,A.等人(2000)Nature Medicine 6:332-336)。作為接種方法，DC免疫可有效地與抗-間皮素抗體治療結合以活化抗-腫瘤反應。
亦可將抗-間皮素抗體的應用與標準癌症治療結合。抗-間皮素抗體治療可有效地與化學治療方案結合。這些實例中，有可能可減少施加之化學治療劑的劑量(Mokyr,M.等人(1998)Cancer Research 58:5301-5304)。可造成與抗-間皮素抗體治療協力的其他組合治療係放射線、手術與荷爾蒙剝奪。血管新生抑制劑亦可與抗-間皮素抗體治療結合。
抗-間皮素抗體治療亦可搭配雙專一性抗體而應用，雙專一性抗體將Fcα或Fcγ受體-表現效應子細胞指向腫瘤細胞(參閱諸如，US5,922,845與5,837,243)。例如，已經應用抗-Fc受體/抗腫瘤抗原(例如，Her-2/neu)之雙專一性抗體將巨噬細胞指向腫瘤位置。這種指向反應可更有效地活化腫瘤專一性反應。或者，可藉由應用結合腫瘤抗原與樹突細胞專一性細胞表面標記之雙專一性抗體將抗原直接傳送至DC。
腫瘤藉由許多不同機制迴避宿主免疫監察。許多這些機制可由腫瘤所表現之免疫抑制蛋白的去活性所克服。這些包括TGF-β(Kehr1,J.等人(1986)J. Exp. Med. 163:1037-1050)、IL-10(Howard,M. & O'Garra,A.(1992)Immunology Today 13:198-200)與Fas配體(Hahne,M.等人(1996)Science 274:1363-1365)。各個這些實體的抗體可搭配抗-間皮素而應用以中和免疫抑制劑的效應並有利於宿主的腫瘤免疫反應。
可用來活化宿主免疫反應之其他抗體可搭配抗-間皮素而應用。這些包括樹突細胞表面上的分子，其活化DC功能與抗原呈現。抗-CD40抗體能夠有效地取代T細胞輔助活性(Ridge,J.等人(1998)Nature 393:474-478)並可與抗-間皮素抗體結合而使用(Ito,N.等人(2000)Immunobiology 201(5)527-40)。諸如CTLA-4(例如，美國專利號5,811,097與6,984,720)、OX-40(Weinberg,A.等人(2000)Immunol 164:2160-2169)、4-1BB(Melero,I.等人(1997)Nature Medicine 3：682-685(1997)、ICOS(Hutloff,A.等人(1999)Nature 397:262-266)、PD-1與/或PD-L1的T細胞共同刺激分子抗體亦可提供提高的T細胞活化水平，並因此導致T細胞活化抗體可搭配本發明之抗-間皮素抗體而應用。
目前係利用骨髓移植來治療多種造血源的腫瘤。雖然移植物對抗宿主之疾病係此種治療的一種後果，但可自移植物對抗腫瘤反應取得治療好處。因此，抗-間皮素抗體治療可搭配骨髓移植而應用成腫瘤治療方案的一部分。
本揭露進一步由下列實施例(其不應被視為進一步限制)所描述。本說明書所列舉的所有圖示與所有參考文獻﹑基因銀行序列、專利與專利申請公開案之內容係以參考資料明確地併入本文中。
實施例1：產生對抗間皮素蛋白之人類單株抗體
如下述般利用表現人類抗體基因之基因轉殖小鼠產生抗-間皮素人類單株抗體。
抗原
可溶的間皮素融合蛋白係用作免疫反應的抗原。可溶的融合蛋白係由40kD部分的間皮素(其透過自然間皮素中的GPI-連結與膜相連)在其C-端連接His標記所構成。本文稱此融合蛋白為「人類間皮素-his融合蛋白」。藉由標準重組方法產生融合蛋白並表現於轉染之CHO細胞，其分泌可溶的融合蛋白進入培養懸浮液。可自Invitrogen(Cat #11619-012)取得用於轉染之CHO宿主細胞。純化分泌之可溶的融合蛋白以用作免疫原。再者，將來自分泌人類間皮素-his融合蛋白之轉染CHO細胞的懸浮液用於ELISA試驗以便篩選HuMAb(進一步描述於下)。
基因轉殖小鼠
利用來自HCo7 x HuMab MouseTM 類型之基因轉殖小鼠的人類λ品系(「Hco7 x hu小鼠」)的小鼠製備人類間皮素的完整人類單株抗體。此品系中，已經如Chen等人(1993)EMBO J. 12:811-820所述般同源地破壞內源性小鼠κ輕鏈基因，並已經如WO 2001/09187之實施例1所述般同源地破壞內源性小鼠重鏈基因。再者，此小鼠品系帶有人類κ輕鏈轉殖基因KCo5，描述於Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851;帶有包含大部分人類λ輕鏈基因座的酵母菌人造染色體(YAC)，描述於WO 2000/26373;及人類重鏈轉殖基因HCo7，描述於US 5,545,806、5,625,825與5,545,807。
小鼠的免疫作用
為了產生人類間皮素的完整人類單株抗體，以純化之人類間皮素-his融合蛋白免疫HCo7 x hu小鼠。一般的免疫方案係描述於Lonberg,N.等人(1994)Nature 368(6474):856-859；Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851與WO 98/24884。小鼠在第一次注入抗原時係3-4月大。純化之重組人類間皮素-his抗原製備物(10μg，自表現融合蛋白之轉染哺乳類細胞純化)係用來腹膜內與皮下免疫小鼠。以1：1混合抗原與RIBI佐劑(Sigma Cat#M6536)。
以每週之間隔免疫小鼠9次。藉由眼窩後取血監控免疫反應。以非直接的ELISA分析(如下所述)篩選血漿，而具有最高力價(titer)之抗-人類間皮素人類IgG的小鼠可用於融合。小鼠可在犧牲且移除脾臟前2與3天藉由靜脈內(IV)與腹膜內(IP)注射可溶的抗原接受最後的補強(boost)。
產生抗-人類間皮素人類單株抗體之小鼠的挑選
為了挑選產生高力價之抗-間皮素抗體的Hco7 x hu小鼠，如下般利用非直接ELISA試驗來監控血清抗體力價。His-標記抗體塗覆之微量滴定盤(Novagen Cat. #71184)與水化合並以300μL/孔的1% BSA/DPBS阻斷10至15分鐘。數次清洗之後，加入最大力價信號之分泌人類間皮素-his融合蛋白之CHO細胞的懸浮液(50μl/孔)並培養1小時。以DPBS/Tween清洗盤之後，將來自間皮素免疫之小鼠的血漿稀釋物(開始為1：50稀釋並連續以1：2稀釋11次)加入各個小孔並培養1小時。以DPBS/Tween清洗盤並以與山葵過氧化酶接合之山羊-抗-人類IgG多株抗體(Jackson ImmunoResearch Labs Cat. #115-036-098)培養1小時。接著加入ABTS(2,2’-次偶氮基-雙[3-乙基苯噻唑啉6-磺酸])基質(Sigma Cat.#S9941)並在OD 415nm下分光光度式地分析盤。將力價界定成產生背景OD兩倍之OD的血清稀釋。利用Excel範本計算力價。將發展出最高力價之抗-人類間皮素抗體的小鼠用於融合。如下所述般執行融合並利用兩個不同ELISA試驗形式(亦如下所述)試驗融合瘤懸浮液的抗-人類間皮素活性。
產生間皮素蛋白人類單株抗體之融合瘤的生成
將自高力價HCo7 x hu小鼠單離之小鼠脾細胞與小鼠骨髓癌融合夥伴以電場式電融合利用Cyto Pulse大腔室細胞融合電穿孔器(Cyto Pulse Sciences,Inc.,Glen Burnie,MD)加以融合。將來自免疫小鼠之脾臟淋巴細胞的單細胞懸浮物與相同數量的P3X63 Ag8.6.53(ATCCCRL 1580)非分泌性小鼠骨髓癌細胞融合。以2.0 x 104 細胞/孔將得到之細胞鋪於平坦底部微量滴定盤中之選擇性DMEM培養基內，培養基包含高葡萄糖(Cellgro#10-013-CM)與10%胎牛血清(Hyclone#SH30071.03)，並補充有B-巰乙醇(1000X,Gibco #21985-023)、7mMHEPES(Cellgro 25-060-Cl)、額外的2mM L-麩醯胺酸(Cellgro 25-005-Cl)、HAT(50X,Sigma #H-0262)、5%融合瘤選殖因子(Hybridoma Cloning Factor,Bioveris #210001)、10%P388DI(ATCC#CRL TIB-63)條件培養基與青黴素-鏈黴素(100x,Cellgro #30-002-CI)。約7天後，以包含HT之培養基(Cellgro #25-047-CI)取代某些包含HAT之培養基。
10至12天之後，以直接ELISA試驗含有人類IgG/人類κ輕鏈或人類IgG/人類λ輕鏈抗體之孔來篩選各個孔。直接ELISA形式中，以2.5μg/mL之50μl/孔的山羊抗-人類IgG F(ab’)2 Fc片段專一性(Jackson ImmunoResearch Labs,Cat. #109-006-098)培養微量滴定盤1小時，並接著以300μL/孔的1%BSA/DPBS阻斷15分鐘。移除阻斷緩衝液並加入融合盤的懸浮液(50μL/孔)且培養1小時。以DPBS/Tween清洗盤並接著以接合山葵過氧化酶之山羊-抗-人類κ輕鏈多株抗體(Bethy1 Cat. ＃A80-115P)或接合山葵過氧化酶之山羊-抗-人類λ輕鏈多株抗體(Biosource Cat. #10904)培養1小時。清洗之後，以ABTS基質顯影盤並在OD 415nm下分光光度式地分析。挑選提高之OD＞0.75的孔進一步分析。
將來自人類IgG/人類κ輕鏈或人類IgG/人類λ輕鏈抗體陽性孔的融合瘤細胞轉移至24-孔盤。數天後，利用非直接ELISA來辨別專一於人類間皮素之人類IgG抗體產生融合瘤而再度篩選各個孔之細胞懸浮物專一性。用於融合瘤第二次篩選之非直接ELISA方案與上述試驗Hco7xhu小鼠中血清抗體力價方案相同，除了樣本懸浮物係來自人類IgG/人類κ或人類IgG/人類λ陽性培養基。
藉由連續稀釋與兩次篩選來選殖融合瘤。在選殖前利用過度生長之24-孔培養基的懸浮物執行多種特性試驗(描述於下方實施例中)。選出十個抗體並利用試管內選殖產生與純化之抗體證實其之特性。選出三個抗體3C10(原始殖株名稱：1382.210.3C10.1.6)、6A4(原始殖株名稱：1382.210.6A4.1.6)與7B1(原始殖株名稱：1382.210.7B1.2.18)用於定序與進一步分析。
實施例2：抗體3C10、6A4與7B1的結構特徵
利用標準DNA定序技術定序編碼3C10、6A4與7B1殖株(如實施例1所述)表現之mAb重鏈與輕鏈可變區之cDNA序列，並藉由標準蛋白化學分析描述表現之蛋白特徵。發現所有這三個殖株表現包含IgG1重鏈與K輕鏈之抗體。
3C10之VH 的核苷酸與胺基酸序列係顯示於第1A圖且分別為序列編號：25與19。3C10之KVL的核苷酸與胺基酸序列係顯示於第1B圖且分別為序列編號：28與22。
3C10重鏈免疫球蛋白序列與已知的人類生殖細胞免疫球蛋白重鏈序列之比較顯示3C10重鏈利用來自人類生殖細胞VH 3-33之VH 片段、來自人類生殖細胞D3-10之D片段與來自人類生殖細胞JH 4B之JH片段。利用CDR區決定之Kabat系統對3C10 VH 序列的進一步分析導致重鏈CDR1、CDR2與CDR3區的描述顯示於第1A圖且分別為序列編號：1、4與7。
3C10輕鏈免疫球蛋白序列與已知的人類生殖細胞免疫球蛋白輕鏈序列之比較顯示3C10K輕鏈利用來自人類生殖細胞VK. L6之VK 片段與來自人類生殖細胞JK 4之JK 片段。利用CDR區決定之Kabat系統對3C10VK 序列的進一步分析導致輕鏈CDR1、CDR2與CDR3區的描述顯示於第1B圖且分別為序列編號：10、13與16。
6A4之VH 的核苷酸與胺基酸序列係顯示於第2A圖並分別為序列編號：26與20。6A4之VL 的核苷酸與胺基酸序列係顯示於第2B圖並分別為序列編號：29與23。
6A4重鏈免疫球蛋白序列與已知的人類生殖細胞免疫球蛋白重鏈序列之比較顯示6A4重鏈利用來自人類生殖細胞VH 3-33之VH 片段、來自人類生殖細胞D3-10之D片段與來自人類生殖細胞JH4B之JH片段。利用CDR區決定之Kabat系統對6A4VH 序列的進一步分析導致重鏈CDR1、CDR2與CDR3區的描述顯示於第2A圖且分別為序列編號：2、5與8。
6A4輕鏈免疫球蛋白序列與已知的人類生殖細胞免疫球蛋白輕鏈序列之比較顯示6A4k輕鏈利用來自人類生殖細胞VK L6之Vk 片段與來自人類生殖細胞JK4之JK 片段。利用CDR區決定之Kabat系統對6A4Vk 序列的進一步分析導致輕鏈CDR1、CDR2與CDR3區的描述顯示於第2B圖且分別為序列編號：11、14與17。
7B1之VH 的的核苷酸與胺基酸序列係顯示於第3A圖並分別為序列編號：27與21。7B1之VL 的核苷酸與胺基酸序列係顯示於第3B圖並分別為序列編號：30與24。
7B1重鏈免疫球蛋白序列與已知的人類生殖細胞免疫球蛋白重鏈序列之比較顯示7B1重鏈利用來自人類生殖細胞VH 3-7之VH 片段、來自人類生殖細胞D3-10之D片段與來自人類生殖細胞JH6B之JH片段。利用CDR區決定之Kabat系統對7B1VH 序列的進一步分析導致重鏈CDR1、CDR2與CDR3區的描述顯示於第3A圖且分別為序列編號：3、6與9。
7B1輕鏈免疫球蛋白序列與已知的人類生殖細胞免疫球蛋白輕鏈序列之比較顯示7B1 κ輕鏈利用來自人類生殖細胞VK A27之Vk 片段與來自人類生殖細胞 JK2之JK 片段。利用CDR區決定之Kabat系統對7B1 Vk 序列的進一步分析導致輕鏈CDR1、CDR2與CDR3區的描述顯示於第3B圖且分別為序列編號：12、15與18。
第4圖顯示3C10與6A4重鏈可變胺基酸序列(分別為序列編號：19與20)與生殖細胞VH 3-33編碼之胺基酸序列(序列編號：31)的比對。描繪出CDR1、CDR2與CDR3區。
第5圖顯示3C10與6A4K輕鏈可變胺基酸序列(分別為序列編號：22與23)與生殖細胞VK L6編碼之胺基酸序列(序列編號：33)的比對。描繪出CDR1、CDR2與CDR3區。
第6圖顯示7B1重鏈可變胺基酸序列(序列編號：21)與生殖細胞VH 3-7編碼之胺基酸序列(序列編號：32)的比對。描繪出CDR1、CDR2與CDR3區。
第7圖顯示7B1K輕鏈可變胺基酸序列(序列編號：24)與生殖細胞VK A27編碼之胺基酸序列(序列編號：34)的比對。描繪出CDR1、CDR2與CDR3區。
利用標準重組DNA技術可將3C10、6A4與7B1可變區轉換成任何所欲同型之全長抗體。例如，可將編碼VH 與VL 區之DNA選殖入帶有重鏈與輕鏈恆定區之表現載體，以便可變區操作性連接至恆定區。或者，可用不同載體來表現全長重鏈與全長輕鏈。適合用於產生全長抗體之表現載體的非限制實例包括Black之US 2005/0153394所述的pIE載體。
實施例3：間皮素單株抗體之結合特性的描述
此實施例中，藉由流式細胞技術來檢驗mAb 3C10、6A4與7B1對細胞表面間皮素的結合。再者，藉由BIACORE分析來分析對間皮素的結合動力學。
A.流式細胞研究
為了測試抗體結合細胞表面間皮素蛋白的能力，將抗體與四個不同表現間皮素之細胞培養：OVCAR3(ATCC名稱HTB-161，人類卵巢癌細胞株)、NCI-H226(ATCC名稱CRL-5826，人類肺衍生之間皮瘤)、CFPAC-f(ATCC名稱CRL-1918，人類胰臟癌細胞株)與KB(ATCC名稱CCL-17，人類口腔癌細胞株)。針對流式細胞研究，以冷的1x PBS+0.1% BSA稀釋3C10、6A4與7B1單株抗體至40μg/mL。針對結合反應，將50μl稀釋之抗體溶液加至含有4x105 細胞之50μl細胞懸浮液並在冰上培養混合物30-60分鐘。接著以1x PBS+0.1% BSA清洗細胞三次。加入1：50稀釋之R-藻紅素-標記的山羊抗-人類IgG Fγ F(ab)2片段(Jackson Immuno Research Labs,Cat.#109-116-098)並在冰上培養混合物1小時，接著以冷的1x PBS+0.1% BSA清洗兩次。最後清洗之後，將200μl冷的1x PBS+0.1%BSA加入各個溶液並藉由FACS執行抗體結合的分析。
將流式細胞分析的結果概述於下表1，其顯示對四個不同細胞株結合的EC50 。結果顯示所有三個單株抗體有效地結合細胞表面之人類間皮素。
B.　BIACORE分析
藉由BIAcoreTM 利用捕獲方法來檢驗3C10、6A4與7B1抗體對重組可溶之間皮素his-融合蛋白的結合。3C10、6A4與7B1抗體各自分別由以高密度(4000RU)塗覆在C M5晶片之蛋白G(Pierce,Rockford,IL)所捕獲。根據製造商所建議之標準固定步驟來執行塗覆。在3C10、6A4或7B1純化之抗體被捕獲在蛋白G上之後，以25μL/mL之流速將重組人類間皮素His-融合蛋白之連續濃度(450、225、112.5、56與28nM)注入捕獲之抗體上2分鐘。讓抗原分開8分鐘。在晶片上進行同型對照組並將資料用來減去非專一性結合。在Biacore 2000或3000表面電漿子共振儀器上利用BIAcore Control軟體v4.01執行所有分析。利用BiaEvaluation V4.01軟體分析數據。
結果顯示於下表2。3C10、6A4與7B1的BIAcore結果證實流式細胞技術的結果，所有三個抗體能夠以高親合力結合人類間皮素。
為了研究3C10、6A4與7B1mAb結合的表位，以BIAcore執行表位結合分析。利用標準胺類耦合化學作用與Biacore提供之套組，將3C10與7B1 m Ab透過一級胺類共價連接至CM5晶片(羧甲基葡聚糖塗覆之晶片)。將抗體-抗原複合體之混合物流過固定之抗體。抗體濃度係兩倍連續稀釋於50與500nM之間。間皮素濃度係介於22與44nM之間。在注入前預先培養抗體與間皮素至少1小時。以6μ1/分之流速注入抗體-抗原混合物(15uL)。具有部分重疊表位之抗體將競爭抗原(抗體濃度提高，反應減少)而那些具有不同表位之抗體將同時結合抗原(抗體濃度提高，反應提高)。結果係3C10mAb與先前描述之小鼠抗-間皮素mAbK1結合相同(或非常相似)的表位。7B1mAb結合不同於3C10與K1之表位。6A4mAb能夠阻礙3C10與6A4兩者結合重組間皮素。
實施例4：間皮素單株抗體之穩定性的描述
此實施例中，如下般於化學展開(unfolding)與熱穩定分析中檢驗mAb3C10、6A4與7B1的穩定性。
藉由螢光光譜測量化學變性(denaturation)的中點來比較抗-間皮素單株抗體之穩定性。在配有Micromax盤判讀器(SPEX,Edison,NJ)之SPEX Fluorolog 3.22上執行化學變性的螢光測量。在已經置於PBS緩衝液中16種不同濃度(0至6Molar)胍鹽酸鹽(GdHCL)中平衡20小時之抗體樣本上執行測量。在黑、小體積、不結合表面之384-孔盤(Corning,Acton,MA)中進行測量且於12μL孔體積中需要1μM抗體。在280nm下激發螢光並在320與400nm之間測量放射光譜。掃描速度係1秒/nm且將狹縫設為5nm帶通(bandpass)。利用PBS進行緩衝液空白組並自動由數據中扣除。利用GraphPad Prism軟體將數據符合兩階段變性模式。表現成GdHCl莫耳濃度之展開中點的結果顯示於下表3中。
藉由抗體熔化溫度之熱量分析來確定抗-間皮素單株抗體之熱穩定性。
在結合有自動取樣機之VP-Capillary DSC微差掃描微熱量平台(MicroCal LLC,Northampton,MA,USA)上執行熔化溫度(Tm )的熱量測量。以0.25mg/mL濃度由1℃/分的速度加熱(30至95℃)樣本取得抗體上的變性數據。抗體樣本存在於磷酸緩衝鹽水(PBS)pH 7.4中。藉由比較將相同緩衝液用於參考細胞以取得莫耳熱容。基線校正觀察之溫度記錄圖並利用軟體origin v7.0根據非2階段模式分析正規化之數據。表現成觀察之抗體熔融端點指示溫度(℃)之結果係顯示於下表4中。
上方結果指出3C10、6A4與7B1抗體具有所欲之化學與熱穩定特性。
實施例5：間皮素抗體的內化
此實施例中，如下般檢驗3C10、6A4與7B1抗體由表現間皮素之細胞所內化的能力。
第一個連續分析中，Hum-ZAP試驗係用來檢驗抗體內化作用。Hum-ZAP試驗(其之套組可自Advanced Targeting Systems,San Diego,CA商業上取得)中，使抗-間皮素抗體與表現間皮素之細胞以及接合有毒素肥皂草素(saporin)(核醣體去活性蛋白)之山羊抗-人類IgG抗體反應。一但內化一級抗-間皮素抗體，二級肥皂草素接合之抗體亦進入細胞，造成蛋白合成抑制與2-4天後的最終細胞死亡。
更明確地說，將細胞培養基中的細胞稀釋成5x104 細胞/mL。將50μl的稀釋細胞加入平底96孔組織培養盤的各個孔中並在37°C、5% CO2 培養器中培養整夜。以培養基稀釋抗體至4μg/mL與0.4μg/mL的濃度。將25μl的稀釋抗體加入培養之細胞以致最終的抗體濃度係1μg/mL與0.1μg/mL。加入25μl的8μg/mL Hum-zap試劑前培養細胞與抗體10分鐘。在37°C、5% CO2 下培養混合物72小時。將100μl的Celltiter-Glo(存活染劑)加入各個孔並輕微旋轉2分鐘。室溫下10分鐘之後，在Promega Veritas Microplate Luminator上讀取盤。
利用表現間皮素之細胞株NCI-H226、CFPAC-1與KB(描述於實施例3中)作為目標細胞以及經轉染而透過GPI-連接表現間皮素於細胞表面上之CHO細胞(CHO-間皮素)來執行Hum-ZAP試驗。結果係定性地表現於下表5中。
Hum-ZAP試驗結果顯示6A4抗體由全部四個細胞株所內化。3C10與7B1抗體亦由CHO-間皮素細胞所內化。再者，3C10抗體由KB細胞所內化，然而比起其他兩個抗體，7B1抗體無法充分由KB細胞所內化。
第二連續分析中，利用免疫螢光試驗進一步檢驗NCI-H226細胞株對6A4抗體的內化。此試驗中，將NCI-H226增長至80%匯集(confluency)。以細胞分離緩衝液(Cell Stripper)將附著細胞升起並將1.35 x 106 細胞轉移至15ml圓錐形管並以FACS緩衝液(PBS+2%胎牛血清)清洗一次。在4℃下以20μg/mL的6A4抗體於450μL體積的FACS緩衝液(PBS+2%胎牛血清)中培養細胞30分鐘並接著以冷的FACS緩衝液清洗。接著在4℃下以20μg/mL的偵測抗體(接合若丹明之山羊抗-人類IgG抗體)於FACS緩衝液中對細胞染色30分鐘，接著以冷的FACS緩衝液清洗。將此受體/抗體複合物進一步重新懸浮於450μL FACS緩衝液中，並在37℃/5% CO2 下培養細胞特定時間(0、5、10、15、30、60、120分與整夜)以允許內化作用。特定時間點上，將相當於150,000細胞的50μL等量樣本(aliquot)轉移進入96-孔盤並以對細胞表面染色之麥胚凝集素(wheat germ agglutinin)-Alexa Fluor 488接合體(Invitrogen,Cat. #W11261)染色。在冰上以10μg/mL WGA於FACS緩衝液中培養細胞等量樣本30分鐘，接著以FACS緩衝液清洗。最終，以FACS緩衝液清洗細胞並藉由加入2%三聚甲醛而固定細胞，並藉由螢光顯微鏡分別利用激發/放射波長495/519與554/570進行針對Alexa488與若丹明的相關免疫螢光分析。結果確實6A4mAb可有效地由NCI-H226細胞所內化。
實施例6：藉由抗-間皮素mAb抑制間皮素結合CA125
為了試驗抗-間皮素抗體抑制間皮素結合CA125的能力，進行試管內異型細胞附著試驗。此試驗中，檢驗抗體抑制OVCAR3細胞(表現CA125之卵巢癌細胞株)附著CHO-間皮素(經轉染可表現間皮素於其細胞表面上之CHO細胞)的能力。OVCAR3細胞(進一步描述於實施例3中)附著至CHO-間皮素細胞係由間皮素與CA125之交互作用所介導。
為了試驗間皮素/CA125交互作用的抗體抑制，在實驗前24小時以4 x 104 細胞/200μl每孔的密度將OVCAR細胞置於96-孔盤中以取得次匯集的細胞培養。24小時後，移除培養基並將含有1%牛血清蛋白(BSA)之新鮮培養基配上10μg/mL的抗體(3C10、7B1、6A4、同型對照或無抗體)加入孔中。在37℃下以5% CO2 培養細胞30分鐘。以Calcein AM(5μM用於6 x 106 細胞/mL)培養CHO-S(親本細胞)與CHO-間皮素細胞30分鐘，以培養基清洗並加至OVCAR培養基且在37°C下培養60分鐘。
培養之後，以PBS清洗樣本4次以移除未附著之細胞。藉由加入100μl/孔PBS並以Synergy-HT螢光讀取機在494nm/517nm下讀取盤來測量附著之細胞。
結果描述於第8圖中。結果顯示OVCAR3細胞在抗體不存在下附著至CHO-間皮素細胞，但不附著至對照CHO-S細胞(沒有表現間皮素於其細胞表面上)。再者，相對於對照抗體(DT)，3C10mAb或6A4mAb的存在分別造成約68.7%或84.8%的細胞附著抑制。相對地，7B1mAb沒有呈現抑制間皮素與CA125交互作用的能力，暗示著7B1在間皮素上結合的表位(不同於3C10與6A4表位)不會阻礙間皮素-CA125交互作用區。
實施例7：抗體-依賴型細胞毒性
為了確定抗體6A4在效應子細胞存在下透過抗體-依賴型細胞毒性(ADCC)殺死表現間皮素之細胞的能力，應用螢光細胞毒性試驗。將經轉染以表現間皮素的40kD膜相關部分於其細胞表面上之CHO細胞(CHO-間皮素細胞)當作目標細胞。
如下述般由全血製備人類效應子細胞。藉由標準Ficoll-Paque分離方法自肝素化全血純化人類週邊血液單核細胞。將細胞重新懸浮於包含10% FBS(熱去活性)與200U/mL之人類IL-2的RPMI1640培養基中並在37°C下培養整夜。隔天，收集細胞並在培養基中清洗四次並以2 x 107 細胞/mL重新懸浮。以2.5μl BATDA針對每個1 x 106 目標細胞/mL的BATDA試劑(Perkin Elmer,Wellesley,MA)在37。C下培養20分鐘來製備目標CHO-間皮素細胞。清洗目標細胞四次、旋轉下來並產生1x105 細胞/mL的最終體積。
利用下述之Delfia螢光放射分析來試驗CHO-間皮素細胞對人類抗-間皮素6A4單株抗體之抗體專一性ADCC。以50μl的效應子細胞(106 細胞/孔)與50μl的抗體(10ug/mL，最終濃度)培養CHO-間皮素細胞(100μl的標記目標細胞，104 細胞/孔)。分析中應用1：100的目標/效應子比例。所有研究中，應用人類IgG1同型對照為陰性對照。在2000rpm下將細胞旋轉下來並在37。C下培養1小時。接著收集懸浮液接受離心，並將20μ1的懸浮液轉移至平坦底部盤，加入180μl的Eu溶液(Perkin Elmer,Wellesley,MA)並在RubyStar讀取機(BMG Labtech)中讀取。如下述般計算%裂解：(樣本釋出-自發釋出*100)/(最大釋出-自發釋出)，其中自發釋出係包含目標細胞與效應子細胞之孔的螢光而最大釋出係包含標細胞並已經由2% Triton-X處理過之孔的螢光。
結果係概述於下表6中，其以nM顯示EC50 。
結果顯示6A4單株抗體呈現針對表現間皮素於其細胞表面上之細胞株的ADCC活性。
實施例8：藉由抗-間皮素mAb 6A4活體內抑制腫瘤生長
此實施例中，檢驗6A4 mAb(不論是裸露(naked)抗體或細胞毒素接合體)在小鼠模式中活體內抑制腫瘤生長的能力。6A4的細胞毒素接合體在此稱為6A4-細胞毒素A，其係由連接細胞毒素A之6A4抗體所構成。細胞毒素A細胞毒素與其製備係進一步描述於WO 2008/083312，其全文以參考資料明確地併入本文中。如下述般製備6A4-細胞毒素A接合體：將抗體6A4濃縮至約5mg/mL，交換緩衝液至100mM磷酸緩衝液、50mM NaCl、2mM DTPA pH 8.0，並在室溫下藉由加入8-10倍莫耳的超量2-亞胺基硫烷(2-Imminothiolane)硫醇化(thiolate)60分鐘。硫醇化之後，將抗體交換緩衝液至50mM HEPES緩衝液，其含有5mM甘胺酸、2mM DTPA與0.5%普維酮(Povidone)(10K)pH 5.5。藉由4,4’-二硫二吡啶(4,4’-dithiodipypridine)測量324nM下釋出之硫吡啶(thiopyridine)定量硫醇化。以3：1莫耳比例的藥/硫醇加入含有藥物細胞毒素A之順丁烯二醯亞胺來達成接合作用。在室溫下培養60分鐘，接著加入10：1莫耳比例的N-乙基順丁烯二醯亞胺(N-ethylmaleimide,NEM)/硫醇至反應混合物。在NEM存在下培養之後，藉由尺寸排除層析於Sephacryl-200管柱上純化得到之接合體，管柱中流動50mM HEPES、5mM甘胺酸、100mM NaCl，pH6.0。聚集包含單體抗體接合體之部分並藉由超過濾濃縮。藉由在280與340nm下測量吸光值來確定抗體接合體濃度與取代比例。
細胞毒素A具有下方顯示之結構：
熟悉技術人士可理解雖然應用詞彙「細胞毒素」，但顯示之結構實際上包括細胞毒素本身(夥伴分子)與連接子部分(用以連接細胞毒素至抗體)兩者，且在接合體切割後，毒素以前藥形式釋出並接著水解成毒素本身。因此嚴格來說，本發明之接合體中的夥伴分子可視為前藥形式或細胞毒素本身任一。
第一連續分析中，檢驗6A4與6A4-細胞毒素A對小鼠異種移植模式中之NCI-H226細胞(肺衍生之間皮瘤；ATCC名稱CRL-5826)生長的影響。此異種移植模式中，SCID小鼠(CB17，來自Taconic,Germantown,NY)被植入9 x 106 NCI-H226細胞/小鼠並讓NCI-H226細胞生長36天。第40天時，平均腫瘤體積係87mm3 ，隨機取出小鼠並以6A4(10mg/kg或30mg/kg)或6A4-細胞毒素A接合體(0.1μmole/kg)搭配對照組腹膜內(i.p.)處理，對照組有：僅有載體(PBS，Q3Dx4)、同型-匹配人類IgG1抗體(4A3)或連接至細胞毒素A細胞毒素之同型-匹配人類IgG1抗體(同型-細胞毒素A)。
在第40、43、47與51天施加6A4抗體與其對照組。在第40與64天施加6A4-細胞毒素A接合體與其對照組。以定期間隔測量腫瘤體積直到第105天。第9A與9B圖分別顯示以僅有載體、6A4-細胞毒素A(0、1μmole/kg)、同型-細胞毒素A(0.1 μmole/kg)、未接合之6A4與未接合之同型對照(4A3)處理之小鼠中的平均腫瘤體積與中位腫瘤體積。如同預測，已知本研究所用之小鼠異種移植模式係免疫不全(immuno-compromised)並因此不預期.能進行健全的ADCC反應，以裸露6A4抗體處理並無顯示對NCI-H226腫瘤細胞體積的效應(即，並無抑制腫瘤生長)。相對地，以6A4-細胞毒素A接合體處理明顯地抑制腫瘤生長，如第9A與9B圖所示。
第二連續分析中，檢驗6A4與6A4-細胞毒素A對小鼠異種移植模式中HPAC細胞(人類胰臟腺癌；ATCC名稱CRL-2119)生長的效應。將HPAC細胞(5x106 細胞/小鼠)植入CB17 SCID小鼠並讓其生長8天。第8天時，平均腫瘤體積係96mm3 ，隨機取出小鼠並以6A4(10mg/kg或30 mg/kg)或6A4-細胞毒素A接合體(0.15μmole/kg)搭配對照組腹膜內(i.p.)處理，對照組有：僅有載體(PBS，Q3Dx4)、同型-匹配人類IgGl抗體(4A3；30mg/kg)或連接至細胞毒素A細胞毒素之同型-匹配人類IgG1抗體(2A10-細胞毒素A；0.15μmble/kg)以及未接合之6A4(8mg/kg)或等量蛋白劑量的未接合之同型對照(2A10；8.7mg/kg，SD)。以Q3DX4(每三天一次，共四次)的劑量方案施加6A4抗體與其對照。以單一劑量(SD)的劑量方案施加6A4-細胞毒素A接合體與其對照。以定期間隔測量腫瘤體積直到第57天。
結果係顯示於第10A 與10B圖中。第10A 與10B圖分別顯示以僅有載體、6A4-細胞毒素A(0.15μmole/kg)、同型-匹配接合體(2A10-細胞毒素A；0.15μmole/kg)、重量相同的未接合之6A4(8mg/kg)、等量蛋白劑量的未接合之同型對照(2A10；8.7mg/kg)、裸露的6A4(10mg/kg或30mg/kg)或同型-匹配IgG1裸露mAb(4A3；30mg/kg)處理之小鼠中的平均腫瘤體積與中位腫瘤體積。數據指出以裸露的6A4抗體處理造成HPAC腫瘤細胞生長的抑制，即便不預期小鼠異種移植模式能發動健全的ADCC反應。再者，如同先前實施例的例子般，顯示以6A4-細胞毒素A接合體處理非常有效於抑制HPAC腫瘤細胞的生長。
第三連續分析中，檢驗6A4-細胞毒素A對小鼠異種移植模式中卵巢癌衍生之OVCAR3細胞(ATCC名稱HTB-161)生長的影響。此異種移植模式中，CB17 SCID小鼠被植入5x106 OVCAR3細胞/小鼠並讓OVCAR3細胞生長42天。第42天時，平均腫瘤體積係約100mm3 。以0.1或0.3μmo1e/kg劑量的6A4-細胞毒素A接合體腹膜內(i.p.)處理小鼠。作為對照，以僅有載體(PBS，Q3Dx4)或者0.1或0.3μmole/kg的連接至細胞毒素A之同型-匹配人類IgG1抗體處理小鼠。
在第42、96、132與176天施加6A4-細胞毒素A接合體與其對照。如第11圖所示，以6A4-細胞毒素A接合體處理明顯抑制腫瘤生長。針對0.3μmol/kg劑量的6A4-細胞毒素A，可在整個此實施例中(包括第176天的最終劑量)控制腫瘤生長。以0.1μmol/kg劑量的6A4-細胞毒素A可控制腫瘤生長直到第150天。同型對照無法有效地控制腫瘤(數據未顯示)。
總結，6A4抗體的細胞毒素接合體(劑量0.1-0.15μmole/kg)明顯地在三種不同異種移植小鼠模式中活體內抑制腫瘤生長。
實施例9：非-岩藻糖化6A4所介導之ADCC
此實施例中，顯示非-岩藻糖化6A4(6A4nf)抗體係肺與卵巢癌中ADCC的有效中介物。Delfia螢光放射分析顯示非-岩藻糖化6A4在效應子細胞存在下透過ADCC殺死表現間皮素之H226(NSCLC)與OVCAR3(卵巢癌)細胞。首先，如下述般由全血製備人類效應子細胞：藉由標準Ficoll-Paque分離方法自肝素化全血純化人類週邊血液單核細胞。將細胞重新懸浮於包含10%FBS(熱去活性)與200U/mL之人類IL-2的RPMI1640培養基中並在37℃下培養整夜。隔天，收集細胞並在培養基中清洗四次並以2x107 細胞/mL重新懸浮。
接著，藉由以BATDA試劑(Perkin Elmer,Wellesley,MA)培養來製備標記之H226或OVCAR3細胞。再來，將目標細胞與效應子細胞及抗體混合。以50μl的效應子細胞(106 細胞/孔)與50μl的抗體(10μg/mL，最終濃度)培養100μl的標記目標細胞(104細胞/孔)。分析中應用1：100的目標/效應子比例。應用人類IgGl(HuIgG1)同型對照為陰性對照。再來，定量細胞裂解。在2000rpm下將細胞旋轉下來並在37°C下培養1小時。接著收集懸浮液接受離心，並將20μl的懸浮液轉移至平坦底部盤。加入180μl的Eu溶液(Perkin Elmer,Wellesley,MA)並在RubyStar讀取機(BMG Labtech)中讀取。如下述般計算%裂解：(樣本釋出-自發釋出*100)/(最大釋出-自發釋出)，其中自發釋出係包含目標細胞與效應子細胞之孔的螢光而最大釋出係包含標細胞並已經由2%Triton-X處理過之孔的螢光。利用非-岩藻糖化6A4在OVCAR3細胞(第12a圖)與H226細胞(第12b圖)上發現ADCC活性的明顯提高。
實施例10：非-岩藻糖化6A4活體內抑制腫瘤生長
另一實施例中，6A4nf搭配吉西他濱(Gemcitabine)明顯減緩小鼠異種移植模式中H226細胞的生長。CB17 SCID小鼠被植入9x106 H226細胞/小鼠並讓其生長。第23天時，平均腫瘤體積係約100mm3 。隨機取出小鼠並以6A4nf、80mg/kg的吉西他濱、6A4nf配上吉西他濱的組合、載體對照或IgG1同型對照腹膜內處理小鼠。以10mg/kg或30mg/kg任一施加6A4nf。H226生長係由6A4nf配上吉西他濱的所有組合所抑制。當以30mg/kg施加6A4nf搭配吉西他濱時達到最大抑制且可聯想到劑量依賴型效應。
實施例11：腫瘤細胞上的間皮素表現
利用抗體6A4之免疫組織化學係用來顯示其結合人類腫瘤並確定腫瘤中間皮素表現範圍的能力。6A4係預先與FITC-標記之山羊抗人類Fab(Jackson # 109-097-003)複合以致6A4的最終濃度係6ug/mL。接著以標準IHC方法應用此複合物以確定結合。顯示6A4可結合卵巢癌、胰臟癌、肺癌、間皮瘤與頭頸癌。6A4的額外實施例結合包括來自會厭軟骨、喉、唾腺、舌頭與扁桃腺組織之癌的頭頸癌。
實施例12：6A4-細胞毒素A對食蟹彌猴(Cynomologus Monkey)無毒
顯示6A4-細胞毒素對食蟹彌猴無毒。這些動物顯示與人類相似的間皮素表現型態。再者，6A4抗體以與其對人類間皮素蛋白相同的親合力結合食蟹彌猴間皮素蛋白。因此，食蟹彌猴適合用來評估6A4-細胞毒素A對目標的毒性。
將6A4-細胞毒素A對兩隻雄性兩隻雌性食蟹彌猴靜脈內給藥。在第1天與第15天給予兩劑0.4μmol/kg。觀察動物行為改變、毒性徵候並抽血分析。動物並無顯示中毒效應的徵候。
在第4、3、7、14、21與28天時抽血並測量多種參數。發現在白血球細胞、紅血球細胞、血小板、網狀紅血球(reticulocyte)、嗜中性球(neutrophil)百分比、淋巴球百分比、單核球百分比、嗜酸性球(eosinophil)百分比、嗜鹼性球(basophile)百分比、未染色細胞百分比、血紅素、血球比容(hematocrit)、平均血球體積(mcv)、平均血球血紅素(mch)、平均血球血紅素濃度(mchc)、凝血原時間(protime)、活化之部分凝血原(apt)、白蛋白、整體蛋白、球蛋白、膽紅素、尿素氮、肌酸酐(creatinine)、鹼性磷酸酶、丙胺酸轉移酶、天冬胺酸轉移酶、麩氨酸轉移酶、葡萄糖、膽固醇、鈣、氯、磷、鉀、鈉與三甘油酯(triglyceride)中沒有明顯改變。
之後在第28天驗屍中，在下列器官中沒有發現藥物相關改變：腎上腺、主動脈、胸骨、腦、盲腸、結腸、十二指腸、食管、眼睛、光學神經、股骨、膽囊、心臟、迴腸、空腸、腎臟、淋巴結、肝臟、mes、肺臟、乳腺、坐骨神經、卵巢、胰臟、腦垂體、副甲狀腺、直腸、唾腺、皮膚、骨骼肌、脾臟、胃、甲狀腺、胸腺、脊髓、氣管、膀胱、子宮、陰道、子宮頸、注射部位(injection site)、輸卵管、輸尿管與派氏斑(peyer’s patches)。
第1A圖顯示3C10人類單株抗體之VH 的核苷酸(序列編號：25)與胺基酸序列(序列編號：19)。描繪出CDR1(序列編號：1)、CDR2(序列編號：4)與CDR3(序列編號：7)區。
第1B圖顯示3C10人類單株抗體之VL 的核苷酸(序列編號：28)與胺基酸序列(序列編號：22)。描繪出CDR1(序列編號：10)、CDR2(序列編號：13)與CDR3(序列編號：16)區。
第2A圖顯示6A4人類單株抗體之VH的核苷酸(序列編號：26)與胺基酸序列(序列編號：20)。描繪出CDR1(序列編號：2)、CDR2(序列編號：5)與CDR3(序列編號：8)區。
第2B圖顯示6A4人類單株抗體之VL 的核苷酸(序列編號：29)與胺基酸序列(序列編號：23)。描繪出CDR1(序列編號：11)、CDR2(序列編號：14)與CDR3(序列編號：17)區。
第3A圖顯示7B1人類單株抗體之VH 的核苷酸(序列編號：27)與胺基酸序列(序列編號：21)。描繪出CDR1(序列編號：3)、CDR2(序列編號：6)與CDR3(序列編號：9)區。
第3B圖顯示7B1人類單株抗體之VL 的核苷酸(序列編號：30)與胺基酸序列(序列編號：24)。描繪出CDR1(序列編號：12)、CDR2(序列編號：15)與CDR3(序列編號：18)區。
第4圖顯示3C10之VH 的胺基酸序列(序列編號：19)與6A4之VH 的胺基酸序列(序列編號：20)與人類生殖細胞VH 3-33胺基酸序列(序列編號：31)的比對。
第5圖顯示3C10之VL 的胺基酸序列(序列編號：22)與6A4之VL 的胺基酸序列(序列編號：23)與人類生殖細胞Vk L6胺基酸序列(序列編號：33)的比對。
第6圖顯示7B1之VH 的胺基酸序列(序列編號：21)與人類生殖細胞VH 3-7胺基酸序列(序列編號：32)的比對。
第7圖顯示7B1之V」的胺基酸序列(序列編號：24)與人類生殖細胞Vk A27胺基酸序列(序列編號：34)的比對。
第8圖顯示OVCAR3卵巢癌細胞附著試驗的結果。
第9A與9B圖顯示利用NCI-H226(肺間皮瘤)異種移植小鼠模式之活體內研究的結果。
第10A 與10B圖顯示利用HPAC(人類胰臟癌)異種移植小鼠模式之活體內研究的結果。
第11圖係本發明之免疫接合體在卵巢癌小鼠異種移植模式中減少卵巢癌腫瘤體積的圖示。
第12圖顯示本發明之非-岩藻糖化抗體對卵巢癌細胞(OVCAR3細胞，第12a圖)與NSCLC細胞(H226細胞，第12b圖)的ADCC。

Claims (13)

  1. 一種單離的單株抗體或其之一抗原結合部分，其中該抗體是結合人類間皮素(mesothelin)並包括下列的人類抗體：(a)一重鏈可變區CDR1，其包括序列編號：2；(b)一重鏈可變區CDR2，其包括序列編號：5；(c)一重鏈可變區CDR3，其包括序列編號：8；(d)一輕鏈可變區CDR1，其包括序列編號：11；(e)一輕鏈可變區CDR2，其包括序列編號：14；及(f)一輕鏈可變區CDR3，其包括序列編號：17；或(a’)一重鏈可變區CDR1，其包括序列編號：3；(b’)一重鏈可變區CDR2，其包括序列編號：6；(c’)一重鏈可變區CDR3，其包括序列編號：9；(d’)一輕鏈可變區CDR1，其包括序列編號：12；(e’)一輕鏈可變區CDR2，其包括序列編號：15；及(f’)一輕鏈可變區CDR3，其包括序列編號：18。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗體或其之抗原結合部分，其包括：(a)一重鏈可變區CDR1，其包括序列編號：2；(b)一重鏈可變區CDR2，其包括序列編號：5；(c)一重鏈可變區CDR3，其包括序列編號：8；(d)一輕鏈可變區CDR1，其包括序列編號：11； (e)一輕鏈可變區CDR2，其包括序列編號：14；及(f)一輕鏈可變區CDR3，其包括序列編號：17。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之抗體或其之抗原結合部分，其包括：(a)一重鏈可變區CDR1，其包括序列編號：3；(b)一重鏈可變區CDR2，其包括序列編號：6；(c)一重鏈可變區CDR3，其包括序列編號：9；(d)一輕鏈可變區CDR1，其包括序列編號：12；(e)一輕鏈可變區CDR2，其包括序列編號：15；及(f)一輕鏈可變區CDR3，其包括序列編號：18。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之抗體或其之抗原結合部分，其包括：(a)一包括序列編號：20之胺基酸序列的重鏈可變區及；(b)一包括序列編號：23之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  5. 如申請專利範圍第1項或第3項所述之抗體或其之抗原結合部分，其包括：(a)一包括序列編號：21之胺基酸序列的重鏈可變區及；(b)一包括序列編號：24之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  6. 一種組合物，其包括如申請專利範圍第1至5項中任何一項之抗體或其之抗原結合部分與一藥學可接受載體。
  7. 一種抗體-夥伴分子接合體(conjungate)，其包括申請專利範圍第1至5項任何一項之抗體或其抗原結合部分與一夥伴分子，其中該夥伴分子係一藉由一化學連接子接合至該抗體的治療劑。
  8. 一種申請專利範圍第7項之抗體-夥伴分子接合體的應用，該應用係用於製造一藥物，而該藥物係用於治療一特徵為表現間皮素之細胞的癌症。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之應用，其中該癌症係一間皮瘤、一胰臟癌、一卵巢癌、一胃癌、一肺癌或一子官內膜癌。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之應用，其中該癌症係選自下列所構成之群組：間皮瘤、乳突漿液卵巢腺癌、亮細胞卵巢癌、混合性苗勒氏卵巢癌、子宮內膜粘液性卵巢癌、胰臟腺癌、胰臟管腺癌、子宮狀漿液性癌、肺腺癌、肝外膽管癌、胃腺癌、食道腺癌、大腸直腸腺癌與乳腺癌。
  11. 一種單離的核酸分子，其編碼如申請專利範圍第1至5項中任何一項之抗體或其之抗原結合部分。
  12. 一種表現載體，其包括如申請專利範圍第11項之核酸分子。
  13. 一種宿主細胞，其包括如申請專利範圍第12項之表現載體。
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