TWI359026B - Pharmaceutical composition for the osteoclast rela - Google Patents

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1359026 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明爲有關對骨代謝異常症的治療及/或預防劑有用 之物質，對骨代謝異常症的治療及/或預防劑有用物質之 篩選方法，對骨代謝異常症檢査方法，及骨代謝異常症之 治療或預防方法。 【先前技術】 已知骨為維持自體形態變化與血中鈣濃度，係一經常進 行形成與回收之反復再構築的器官。正常骨具由造骨細胞 之骨形成與由破骨細胞之骨吸收平衡關係來保持一定骨量 。若骨形成與骨吸收的平衡關係失衡會造成骨質疏鬆症等 骨代謝異常症狀（Endocrinological Review 13，66-80, 1 992，Principles of Bone Biology p87-102，1996，Academic

Press, New York )。 關於骨代謝調節因子’有全身性荷爾蒙及局部性細胞激 素之許多硏究報告，由上述因子的共同作用可對骨的形成 與維持發生影響（E n d 〇 c r i η ο 1 〇 g i c a 1 R e v i e w 1 3，6 6 - 8 0， 1 992，Endocrinological Review 17，308-332，1996 ) 〇 由高 齡之骨組織的變化廣知爲骨質疏鬆症病因，其發病機制可 爲性荷爾蒙分泌降低與其受體異常 '老化基因的表達、破 骨細胞與造骨細胞之分化或功能不全等各種不同原因，難 以因高齡之生理現象理解。骨質疏鬆症可分為因雌激素分 泌降低之停經後骨質疏鬆症與因高齡之老人性骨質疏鬆症 ，爲了解發病機制與開發治療藥劑，必須對骨吸收與骨形 1359026 開發治療效果高之藥劑。 樹突細胞（dendritic cell，以下稱「DC」）為免疫系之 專門抗原提示細胞而分布在身體全體。樹突細胞專一性細 胞膜貫通蛋白質（dendritic cell-specific transmembrane protein，以下「DC-STAMP」）爲以貫通樹突細胞之細胞 膜之蛋白質由源自單核細胞DC之cDNA資料庫所選殖之 蛋白質(European Journal of Immunology 30，3 5 85-35 90, 2000 ) 。DC-STAMP之cDNA中，至今人類有1種類之報 告（GenBank收集號碼：NM_030788 )，小鼠則有含第3 個表現子之長序列（GenBank收集號碼：AB 1 09560 )，及 第3個表現子短之剪接變化株（splicing variants) ( GenBank 收集號碼：AB 1 095 6 1 )之2種類之報告。源自人之DC-STAMP及源自小鼠之DC-STAMP間胺基酸序列之相同性約 74%。由胺基酸序列之疏水性解析的結果推測DC-STAMP 有7個膜貫通組域。小鼠中第3個表現子短之剪接變化株 為欠缺第7號膜貫通組域者，以下稱DC-STAMPAT7。 至於DC-STAMP,雖有令單核貪食細胞以IL-4來不活化 則其表達上昇，而以地塞米松（dexamethasone)不活化則反 而表達減少之報告（Immun〇genetics 53，105-113，2001 ) ，但DC-STAMP和破骨細胞分化的關連至今未明。 【發明內容】 本發明之目的為提供試驗見於骨質疏鬆症、風濕性關節 炎、癌細胞之骨轉移等骨破壞等種種骨代謝異常時所特異 表達之基因、抑制破骨細胞活動之物質及骨代謝異常之預 1359026 防或治療劑的新穎方法，及抑制破骨細胞活動之物質及骨 代謝異常之預防劑及/或治療劑。 本發明者爲探尋具骨代謝異常症治療及/或預防效果之 物質，致力於破骨細胞分化、成熟及活性化功能的了解， 得知DC-STAMP與破骨細胞之分化、成熟及活性化有關， 而發現抑制DC-STAMP之表達，可抑制破骨細胞之分化， 因而完成本發明。 本發明爲提供 (1) 與DC-STAMP可專一地結合，抑制破骨細胞形成之抗體 (2) 選自序列表之序列號碼2所示胺基酸序列之蛋白質、序 列號碼4所示胺基酸序列之蛋白質及序列表之序列號碼 6所示胺基酸序列之蛋白質之至少一個蛋白質專一地結 合而抑制破骨細胞形成之抗體、 (3) 如（1)〜（2)中任一項記載之抗體，其特徵爲單株抗

Hite 體、 (4) 如（1)〜（3)中任一項記載之抗體，其特徵爲人化、 (5) 如（1)〜（4)中任一項記載之抗體，其特徵爲完全人 化抗體、 (6) 如（1)〜（5)中任一項記載之抗體，其特徵爲IgG抗 體、 (7) —種檢驗骨代謝異常之方法，含下述工程1)〜4): 1) 自被驗者採取檢體，萃取全RN A部份之工程； 2) 自正常人採取檢體，萃取全RNA部份之工程： 1359026 3)由上述工程1)之全RNA部份及由上述工程2)之全 RNA部份，測定下述a)或b)任一項記載聚核苷酸表達 量之工程； a) 自序列表之序列號碼1、3及5中一以上核苷酸序列之聚 核苷酸、 b) 自上述a)記載聚核苷酸及互補核苷酸序列的聚核苷酸及 嚴苛條件下雜交之聚核苷酸； 4)由上述工程1)之全RN A部份及由上述工程2)之全 RNA部份，由上述工程3)中測定聚核苷酸表達量之差 異，而檢驗出上述工程1)記載被驗者骨代謝異常之工程 (8) —種檢驗骨代謝異常之方法，含下述工程1)〜3): 1) 自被驗者採取之檢體，自序列表之序列號碼2、4及6中 一以上胺基酸序列，測定蛋白質表達量之工程； 2) 自正常人採取之檢體，依上述工程1)記載任一項，測定 蛋白質表達量之工程； 3) 由上述工程1 )測定蛋白質之表達量及上述工程2 )測定 該蛋白質之表達量之差異，而檢驗出被驗者骨代謝異常 之工程、 (9) 如（7)或（8)記載之方法，其特徵爲骨代謝異常爲骨 質疏鬆症、風濕性關節炎及/或癌性高鈣血症、 (10) 如（7)或（8)記載之方法，其特徵爲骨代謝異常爲 骨質疏鬆症、 (11)如（7)或（8)記載之方法，其特徵爲骨代謝異常爲 1359026 風濕性關節炎、 (12) 如（7)或（8)記載之方法，其特徵爲骨代謝異常爲 癌性高鈣血症、 (13) 如（7) 、 （9)〜（12)中任一項記載之方法，其特 徵爲聚核苷酸表達量之測定方法爲北方墨漬法、點墨漬 法、狹縫墨漬法、RT — PCR、核糖核酸酶 (Ribonuclease)保護分析法或運轉分析法、 (14) 如（7) 、（9)〜（12)中任一項記載之方法，其特 徵爲聚核苷酸表達量之測定方法爲使用源自檢體之互補 DNA群或該DNA群各DNA部分序列製作DNA基因晶 片或矩陣、 (15) 如（8)〜（12)中任一項記載之方法，其特徵爲蛋白 質表達量之測定方法爲使用與該蛋白質有專一性結合之 抗體或配體、 (16) 如（8)〜（12)中任一項記載之方法，其特徵爲蛋白 質表達量之測定方法爲使用西方墨漬法、點墨漬法、狹 縫墨漬法或固相酵素免疫定量法（ELISA法）、 (17) —種骨代謝異常之檢定用套組，係使用選自如下述1) 〜3 )群一以上者： 1)序列表之序列號碼1、3及5之一以上所示核苷酸序 列之聚核苷酸，可專一地擴增之15至30鹼基長連 續寡核苷酸引子； 2)序列表之序列號碼1、3及5之一以上所示核苷酸序 列之聚核苷酸，在嚴苛條件下雜交，檢定該聚核苷酸 ⑤ -10 - 1359026 聚核苷酸表達量之工程； 選自序列表之序列號碼1所示核苷酸序列之聚核苷酸、 序列號碼3所示核苷酸序列之聚核苷酸及序列號碼5所 示核苷酸序列之聚核苷酸群之一以上聚核苷酸，、 4)由上述工程1)之全RNA部份及由上述工程2)之全 RNA部份，由上述工程3)測定聚核苷酸表達量之差 異來分析，檢定被驗物質對骨代謝異常之治療效果及 /或預防效果的工程、 (3 1)—種對骨代謝異常有治療效果及/或預防效果之物質 篩選方法，含下述工程1)〜4): 1)自投與被驗物質之哺乳動物個體採取檢體，萃取全 RNA部份之工程； 2) 自未投與被驗物質之哺乳動物個體採取檢體，萃取 全RNA部份之工程； 3) 由上述工程1 )之全RNA部份及由上述工程2)之 全RNA部份，測定下述任一項記載之聚核苷酸或 其部分聚核苷酸表達量之工程； 選自序列表之序列號碼1所示核苷酸序列之聚核苷酸 、序列號碼3所示核苷酸序列之聚核苷酸及序列號 碼5所示核苷酸序列之聚核苷酸群之一以上聚核苷 酸、 4) 由上述工程1)之全RNA部份及由上述工程2)之 全RNA部份，由上述工程3)測定聚核苷酸表達 量之差異來分析，檢定被驗物質對骨代謝異常之治 -13 - ⑤ 1359026 療效果及/或預防效果的工程、 (3 2)—種對骨代謝異常有治療效果及/或預防效果之物質 篩選方法，含下述工程1)〜3): 1) 自有添加被驗物質至培養基培養之源自哺乳動物之培 養細胞，測定下述蛋白質或其部分聚胜肽表達量之工 程； 選自序列表之序列號碼2所示胺基酸序列之蛋白質、序 列號碼4所示胺基酸序列之蛋白質及序列號碼6所示 • 胺基酸序列之蛋白質群之一以上蛋白質、 2) 自無添加被驗物質至培養基培養之源自哺乳動物之培 養細胞，上述工程1)記載之蛋白質表達量，係使用 與該蛋白質可專一地結合之抗體或配體來測定之工 程； 3) 上述工程1)所檢定蛋白質之表達量，與上述工程2 )所檢定該蛋白質表達量之差異來分析，檢定被驗 物質對骨代謝異常之治療效果及/或預防效果的工 •程、 (33)—種對骨代謝異常有治療效果及/或預防效果之物質 篩選方法，含下述工程1)〜3): 1)自投與被驗物質之哺乳動物個體採取檢體，測定下述 蛋白質或其部分聚胜肽表達量之工程； 選自序列表之序列號碼2所示胺基酸序列之蛋白質、序 列號碼4所示胺基酸序列之蛋白質及序列號碼.6所示胺 基酸序列之蛋白質群任一項之蛋白質、 -14 - 1359026 2) 自未投與被驗物質之哺乳動物個體採取檢體，測定上 述工程1)記載之蛋白質或其部分聚胜肽表達量之工 程； 3) 由上述工程1)所檢定蛋白質之表達量，及上述工程 2)所檢定該蛋白質表達量之差異來分析，檢定被驗 物質對骨代謝異常之治療效果及/或預防效果的工程 (3 4)如（30)或（31)記載之方法，其特徵爲聚核苷酸表 達量之測定方法爲北方墨漬法、點墨漬法、狹縫墨漬 法、RT-PCR、核糖核酸酶（Ribonuclease)保護分析法 或運轉分析法、 (3 5)如（30)或（31)記載之方法，其特徵爲聚核苷酸表 達量之測定方法爲使用由動物組織或源自動物之互補 DNA群或該DNA群各DNA之部分序列製作DNA之基 因晶片或矩陣、 (3 6)如（32)或（33)記載之方法，其特徵爲蛋白質表達 量之測定方法爲使用與該蛋白質可專一地結合之抗體或 配體。 【實施方式】

本發明中，「於嚴苛條件下雜交」乃指在市售之雜交溶 液 ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech 公司製造 )中’於68 °C雜交，或使用DNA固定濾紙時，於0.Τ-ΐ ·〇Μ 氯化 鈉之存 在下， 68°C 中進行 雜交後 ，以 0,1 〜 2 倍 濃度之SSC溶液（1倍濃度SSC為含15 0mM氯化鈉，15mM ⑤, -15 - 1359026 檸檬酸鈉），於6VC洗濯則可鑑定之相同條件或相等條件下 雜交。

1 .DC-STAMP 由本發明者得知DC-STAMP在巨細胞腫瘤中專一地發現 。更由本發明者得知DC-STAMP為在源自單核細胞株分化 為破骨細胞時表達量増加。 本發明所用DC-STAMP爲自人、或非人哺乳動物（例如 天竺鼠、大鼠、小鼠、雞、兔子、猪、羊、牛、猴等）之 單核細胞、樹突細胞或骨髓細胞來直接精製使用，或使用 上述細胞之細胞膜部分而調製，DC-STAMP亦可在活體外 合成、或用基因操作在宿主細胞産生而得。基因操作具體 而言，係將DC-STAMP重組於可表達之載體後，於含轉錄 轉譯必要之酵素、基質及能量物質之溶液中合成，或將其 他原核生物或真核生物之宿主細胞轉形來表達DC-STAMP ，而得該蛋白質。 人DC-STAMP之cDNA核苷酸序列登錄在GenBank ， 其收集號碼（Accession number) 爲 NM_030788，也於序列 表之序列號碼1表示，其胺基酸序列爲序列表之序列號碼 2。小鼠DC-STAMP之cDN A核苷酸序列爲含第3表現子之 長序列，登錄在GenBank中，其收集號碼爲 AB 1 09560’ 以序列表之序列號碼3表示，其胺基酸序列爲序列表之序 列號碼4表示。小鼠DC-STAMP之第3表現子短之剪接 cDNA核苷酸序列，登錄在GenBank中，其收集號碼爲 AB1 09561，也於序列表之序列號碼5表示，其胺基酸序列 -16 - 1359026 爲序列表之序列號碼6。DC-STAMP之cDNA爲例如以表達 DC-STAMP之cDNA資料庫爲模板，用專一地擴増DC-STAMP之cDNA的引子，進行聚合酶鏈反應（以下稱「 PCR」）（Saiki，R. K.，et al.，Science, (1 988)239，487-49) ，以PCR法而取得》 與選自序列表之序列號碼1、3及5至少一以上核苷酸序 列互補核苷酸序列之聚核苷酸，在嚴苛條件下雜交，可得 有DC-STAMP同等生物活性編碼蛋白質之聚核苷酸，含 DC-STAMP之cDNA。與自人或小鼠DC-STAM基因座轉錄 之剪接變化株，在嚴苛條件下雜交，且編碼有與DC-STAMP同等生物活性之蛋白質之聚核苷酸也含於DC-STAMP 之 cDNA » 自序列表之序列號碼2、4及6至少一以上胺基酸序列中 ，有取代、減少或添加1或數個胺基酸序列，有與DC-STAMP同等生物活性之蛋白質也含於DC-STAMP之cDNA 。與自人或DC-STAMP基因座轉錄之剪接變化株所編碼胺 基酸序列或該胺基酸序列中，有取代、減少、或添加1或 數個胺基酸序列，且有與DC-STAMP同等生物活性之蛋白 質也含於DC-STAMP。 2·骨代謝異常之檢定 DC-STAMP基因若解析在人各種骨組織檢體群中基因表 達量，則破骨型多核巨細胞多數出現之骨腫瘤、臨床上所 見以含骨溶解性骨破壞為特徵（Bullough et al·, Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition, ppl7.6-17.8, Lippincott ⑧ -17 - 1359026 利用DC-STAMP基因之表達量而檢定骨代謝異常之方法 ，具體而言，含以下工程1)〜4)之方法。 1) 自被驗者採取檢體，萃取全RNA部份之工程： 2) 自正常人採取檢體，萃取全RNA部份之工程； 3) 上述工程1)中記載全RNA部份及上述工程2)記載全 RNA部份，測定DC-STAMP基因之表達量之工程； 4) 由上述工程1)之全RNA部份及由上述工程2)之全 RNA部份，在上述工程3)中測定基因表達量之差異而分 析，來檢定上述工程1)記載之被驗者骨代謝異常之工 程。 以下具體説明各工程。 a)工程1)自被驗者採取檢體，萃取全RNA部份之工程； 自檢體萃取全RNA部份時，可依適當實驗倫理基準方法 獲得之源自人之組織用RNA萃取用溶劑（例如苯酚等含有 使核糖核酸情性之作用之成分）直接溶解，或於儘量不破 壞細胞之情形下，用刮匙僅慎刮取的方法，或使用胰蛋白 酶等蛋白質分解酵素穩定地自組織萃取細胞等方法，回收 細胞後，快速進行RNA萃取工程。 RNA萃取方法，可使用硫氰酸胍·氯化絶高速離心法， 硫氰酸胍·熱苯酚法，胍-HC1，酸性硫氰酸胍•苯酚•氯 仿法（Chomczynski.P 及 Sacchi.N·，（1987)Anal· Biochem. ’ l62，1 56- 1 59)等，宜爲酸性硫氰酸胍·苯酚·氯仿法。也 可令市售RNA萃取用試劑（例如ISOGEN (日本基因公司 製造）、TRIZOL試劑（Gibco-BRL公司製造））等，依試 ⑧ -19 - 1359026 劑所附操作範本（Protocol)使用》 所得全RNA部份視需要可再精製成僅mRNA者。精製方 法無特限，例如以生物素化之寡（dT )探針吸附mRNA， 更於抗生蛋白鏈菌素固定化之常磁性粒子，利用生物素/ 抗生蛋白鏈菌素間之結合捕捉mRNA，洗淨後，溶出 mRNA，而精製mRNA。也可在寡（dT)纖維素柱吸附 mRNA，再將之溶出來精製。然而，本發明方法中，該 mRNA精製歩驟並非必要，只要能滿足偵測上述聚核苷酸 表達者則也可將全RNA部份用於其後工程。 b) 工程2)自正常人採取檢體，萃取全RNA部份之工程 於本發明中，正常人意指無骨代謝異常之人。正常人與 否，由DC-STAMP濃度測定，確認是否位於正常人値之數 値範圍來判定，也可預先調査DC-STAMP之表達量與正常 人骨代謝異常形成度之相關，而測定採自被驗者之檢體中 DC-STAMP之表達量，來判定被驗者是否爲正常人。正常 人之全RNA部份之調製可依上述工程1)同樣方法來進行 〇 c) 工程3 )為測定上述工程1 )記載之全RNA部份及上述 工程2)記載之全RNA部份中DC-STAMP基因表達量之工 程： 其中DC-STAMP基因之表達量爲含序列表之序列號碼1 所示核苷酸序列而成之聚核苷酸，或與序列表之序列號碼 1所示核苷酸序列互補之核苷酸序列而成之聚核苷酸，於 ⑤ -20 - 1359026 嚴苛條件下雜交之聚核苷酸之表達量。 DC-STAMP基因表達量之測定方法可使用固相化試料之 測定方法，或其它測定方法來進行。 (a )使用固相化試料之測定方法 (i )固相化試料 固相化試料可爲例如以下者。 (甲）基因晶片： 可使用由資料庫上之EST(expessed sequence tag)序 列或基於mRNA序列合成之反義（anti-sense)寡核苷酸被固 相化之基因晶片。此基因晶片可使用Affymetrix公司製造 之基因晶片（Lipshutz，R. J. et al·，Nature Genet. (1 999)2 1， suppliment，20-24)，並無特限，也可以已知方法來製作。 當解析源自人細胞之mRNA時，宜使用源自人者，例如 Affymetrix公司製造之人U95組或U133組。但並不僅限 於此，例如可使源自近縁種之動物。 (乙）自人、全RNA或特定組織所得全RNA製作之 cDNA或RT- PCR産物被固相化之矩陣或膜濾紙： 上述cDNA或RT-PCR産物爲以根據人之EST資料庫等 序列資訊所製作之引子施行反轉錄酵素反應及PCR來選殖 者。該cDNA與RT— PCR産物可為將預先有骨代謝異常之 人及無骨代謝異常人之間表達量相異之全RNA，以消去法 (Substraction 法；Diatchenki，L，et al, Proc · Natl. Acad. Sci. USA, (1996) 93,6025-6030 )、比較表現法法（Liang, P.，et al，Nucleic Acids Res.，（1 992) 23,3685-3690 )等來選 ⑧ 1359026 擇。矩陣及濾紙可使用市售者（例如intelligen :寶生技公 司製造等），將上述cDNA及RT— PCR産物也可用市售之 點漬機（例如GMS417 Arraye.r :寶生技公司製造等）而固 相化來製作。 (Π)探針之製作及解析 標記探針不使用特定mRNA株，係使用標記表達全 mRNA者。探針製作之出發材料可用未精製mRNA，依前 述方法精製得聚（A) + RNA。以下説明使用各種固相化試 料時，標記探針之調製方法及檢定、解析方法。 (甲）Affymetrix公司製造之基因晶片： 依Affymetrix公司製造基因晶片所付說明書（Affymetrix 公司表達解析技術手冊），製作生物素標記之cRNA探針 。再依Affymetrix公司製造基因晶片所付說明書（表達解 析技術手冊），使用Affymetrix公司製造解析裝置（Gene Chip Fluidics Station4〇0)進行雜交及解析，偵測抗生物素 蛋白（Avidin)螢光，加以分析。 (乙）微距陣： 反轉錄酵素反應中，自聚（A) + RNA製作cDNA時，檢 定cDNA用之cDNA需予以標記，使用螢光色素爲標記時 ，加入以螢光色素（例如Cy3、Cy5等）標記之d — UTP等 來使cDNA螢光標記。此時若將自被驗者採取之檢體中聚 (A ) + RNA與自正常人採取之檢體中聚（A) — RNA以不 同色素標記，則於之後的雜交操作中，可將兩者混合〜併 使用。矩陣用例如寶生技公司市售矩陣時，依其說明書進 -22 - 1359026 行雜交及洗淨，以螢光訊號檢定機（例如GMS4 18矩陣掃 描機（寶生技公司製造）等），偵測螢光訊號後，進行解 析。所使用矩陣不限於市售者，可爲自製或特別製作者。 (丙）膜濾紙： 在反轉錄酵素自聚（A) +RNA製作CDNA時，可加放射 性同位素（例如加d - CTP等以調製標記探針，依常法進 行雜交，例如用市售之濾紙製微矩陣 AtlasSystem ( Clontech公司製造）雜交及洗淨後，以解析裝置（例如 Atlas Image : Clontech公司製造等）來進行檢定及解析。 由上述（甲）〜（丙）之任一方法，皆可於同一批（lot) 固相化試料使源自人各組織探針進行雜交。此時，除使用 之探針以外之雜交之條件相同》使用螢光標記探針時，各 探針以不同螢光色素標記，則可於一固定化試料使用兩探 針混合物同時雜交而讀取螢光強度（Brown、P.0, et al.

Nature Genet·，（1 999)2 1，supplement，33 — 37)。 (b)其他測定方法 上述以外之偵測方法可爲例如消去選殖（Substraction Cloning)法（參照實驗醫學別冊新基因工學手冊、羊土公 司刊（1 996) ρ·32-3 5 )、比較表現（Differential Display)法 (基礎生化學實驗法4核酸’•基因實驗Π.應用編、東京化 學同人（2 00 1)， pl25-128)、用報導基因之方法（ chloramphenicol acetyl transferase (例如使用 PCAT3 -Basic載體：Promega公司製造）及β_半乳糖酶（使用例 如PPgAL-Basic: Promega公司製造）、分泌型鹼性去磷 ⑧ 1359026 酸酶（使用例如？8£八？2-8&8丨£：:(：1〇1^6<;11公司製造）、 綠色蛋光蛋白質（green — fluorescent protein)(使用例如 PEGFP - 1 : Clontech公司製造）），並無特限。 d)工程4)為上述工程1)之全RNA部份及由上述工程2 )之全RNA部份之間，依上述工程3)測定基因表達量之差 異而解析，檢定上述工程1)之被驗者之骨代謝異常的工 程。 源自正常人之檢體與源自被驗者之檢體間，解析DC-ST AMP表達量之差異，於DC-ST AMP之表達量顯著増力卩之 檢體，可判定骨代謝異常可能性高，而檢定骨代謝異常。表 達量顯著増加乃指用如Affymetrix公司之基因晶片，用 Affymetrix 公司之 microarray Suite Ver . 3 . 0 來解析時 ，DC-STAMP基因之平均差異値較源自正常人之檢體爲増 加。測定DC-STAMP基因之濃度，解析是否介於預先決定 為正常人數値範圍，若超出正常人數値範圍時則判定有骨 代謝異常，也可檢定骨代謝異常，預先調査DC-STAMP基 因之表達量與正常人骨代謝異常形成度之相關，也由測定 被驗者所採取檢體中DC-STAMP基因之表達量來判定被驗 者是否爲正常人。 (2)利用DC-STAMP之表達量（蛋白質之表達量），檢 定骨代謝異常之方法 利用DC-STAMP之表達量，檢定骨代謝異常之方法，具 體含以下工程1)〜3)之方法。 1 ) 自被驗者採取檢體，測定DC-STAMP表達量之工程 1359026 2) 自正常人採取檢體，依上述1)記載測定蛋白質表 達量之工程： 3) 分析由上述工程1)測定蛋白質之表達量及上述工; 程2)測定之該蛋白質之表達量之差異，檢定被驗者 骨代謝異常之工程。 以下具體説明各工程。 1)由工程1)被驗者採取檢體，測定DC-ST AMP表達量之 工程： (a)由檢體測定蛋白質用試料的調製 檢體視需要可予高速離心，除去不溶性物質後，調製以 下ELISA/RIA用試料及西方墨漬法用試料》 ELIS A/RIA用試料可爲例如回收之血液或骨髓組織萃取 液就此使用，或以緩衝液適當稀釋來使用。西方墨漬法用 (電泳用）試料爲例如使用血液或骨髓組織萃取液，用緩 衝液適當稀釋，以SDS-聚丙烯醯胺電泳用之含2-氫硫基 乙醇之樣品緩衝液（Sigma公司製造等）混合。點墨漬法 /狹縫墨漬法時，可使用例如回收血液或骨髓組織萃取液 本身，或用緩衝液適當稀釋，使用墨漬裝置等，而直接以 膜吸附。 (b)試料之固相化 上述所得試料中蛋白質可用專一性方法檢定，如試料予 以免疫沈澱法、利用配體結合方法等，予以沈澱、以固相 化檢定，也可將該檢出之試料固相化來進行。在蛋白質固 -25 - ⑧ 1359026 相化時’可用西方墨漬法、點墨漬法或狹縫墨漬法使用之 膜爲例如硝化纖維膜（例如Bio Rad公司製造等）、尼龍膜（ 例如 Hibond-ECL(Amersham . Pharmacia 公司製造）等）、 棉膜（例如Blot Adsorbent膜（Bio Rad公司製造）等）或 PVDF膜（例如Bio Rad公司製造等）等。 使用ELISA法/RIA法以定量蛋白質之方法，可在專用 96穴平板（例如Immunoplate maxisorp ( NUNC公司製造 )等），加入試料或其稀釋液（例如以0.05%含疊氮化鈉 之磷酸緩衝生理食鹽水（以下稱「PBS」）稀釋），在4°C 〜室溫下靜置一晚，或於37 °C下靜置1〜3小時，以令穴 內底面之蛋白質吸附並固相化。 對DC-STAMP之抗體可用常法（參照例如新生化學實驗 講座 1、蛋白質 1、P.389-397、1992 )，自 DC-STAMP 或 DC-STAMP之胺基酸序列選擇任意聚胜肽在動物中予以免 疫，採取活體內産生之抗體，精製而得。也可依已知方法 (例如 Kohler and Milstein, Nature, (1 975)256，495-497、 Kennet, R. ed.， Monoclonal Antibody, (1 9 8 0) 365-367,

Prenum Press, N.Y.)，令産生對f>C-STAMP抗體之抗體産 生細胞與黑瘤細胞融合來構築融合瘤（Hybridoma)，而得單 株抗體。 抗原DC-STAMP可令DC-STAMP基因依基因操作於宿主 細胞中産生而得。具體而言，製作可表達DC-STAMP基因 之載體，導入宿主細胞，以表達該基因，來精製表達之 DC-STAMP。或也可以表達DC-STAMP之宿主細胞或膜片斷 -26 - 1359026 爲抗原使用。 (c) DC-STAMP表達量之測定 1) DC-ST AMP表達量可以序列表之序列號碼2所示胺基 酸序列蛋白質之表達量表示。 表達量之測定可用上述抗DC-STAMP抗體依如西方墨漬 法及點/狹縫墨漬法等已知方法來測定。 2) 工程2)為自正常人採取檢體中測定上述1)記載蛋 白質之表達量的工程： 自正常人採取檢體中DC-STAMP表達量之測定可依上述 工程1)同樣方法進行$ 3) 工程3)為分析上述工程1)所測定蛋白質之表達量 及上述工程2)所測定該蛋白質之表達量之差異來檢定被 驗者骨代謝異常之工程。 分析源自正常人之檢體及源自被驗者之檢體間 DC_ STAMP表達量之差異，於DC-STAMP之表達量顯著増力□之 檢體可判定存在骨代謝異常之可能性高而檢定骨代謝異常。 測定DC-STAMP基因之濃度，解析是否介於預先決定為 正常人數値範圍，若超出正常人數値範圍時則判定有骨代 謝異常，也可檢定骨代謝異常，預先調査DC-STAMP基因 之表達量與正常人骨代謝異常形成度之相關，也由測定被 驗者所採取檢體中DC-STAMP基因之表達量來判定被驗者 是否爲正常人。 3. DC-STAMP基因及DC-STAMP之檢定 DC-STAMP基因及DC-STAMP在巨細胞腫瘤中可專一地 -27 - ⑧ 1359026 表達，源自單核細胞之細胞株在分化為破骨細胞時表達量 亦會増加β (1)利用DC-STAMP之過度表達，來解析DC-STAMP 基因及DC-STAMP之功能 DC-STAMP功能調查之方法，係由表達DC-STAMP之源 自細胞cDNA資料庫，用選殖雜交法等已知方法，取得完 整cDNA。將此完整cDNA導入至源自人細胞或源自非人哺 乳動物之細胞（例如源自天竺鼠、大鼠、小鼠、雞、兔子 、猪、羊、牛、猴細胞等）使高表達，來探討是否影響細 胞。 cDNA在動物個體內之表達方法，可以完整cDNA於病毒 載體重組，投與在動物。以病毒載體導入基因之方法，可 於例如反轉錄病毒、腺病毒、類腺病毒、疱疹病毒、牛痘 病毒、痘病病毒、脊髓灰質炎病毒等DNA病毒或rNa病 毒，令cDNA重組導入之方法。尤宜用反轉錄病毒、腺病 毒、類腺病毒或牛痘病毒。 非病毒性基因導入方法爲將表達質體對肌肉內直接投與 的方法（DNA疫苗法）、微脂粒法、脂感染法、微注射法、 磷酸鈣法、電穿孔等方法，宜爲DNA疫苗法或微脂粒法。 對培養細胞，將完整cDNA導入源自人之細胞、源自非 人哺乳動物之細胞（例如源自天竺鼠、大鼠、小鼠、雞、 兔子、猪、羊、牛、猴之細胞等）之源自單核細胞、源自 淋巴節之細胞、肌肉細胞、肝細胞、脂肪細胞或皮膚細胞 等使高表達，探討各標的細胞之功能（具體而言，破骨細 1359026 胞分化及成熟等與骨代謝關係之功能）或對細胞形態有何 影響之出現。 完整cDNA導入動物或細胞時，可於含適當促進子及形 質表達相關序列之載體重組該cDNA，令該載體在宿主細 胞進行轉形。脊椎動物細胞之表達促進子，通常使用在表 達基因上游位置之促進子、RNA剪接（Splice)部位、聚（A) 化部位、及轉錄終結序列等者，於必要時亦可使用具有複 製起點者。該表達載體之例可為如具SV40早期促進子之 pSV2dhfr ( Subram ani, S . et al.,Mol.Cell.Biol.,(1981)1,854-864)、具CMV早期促進子者、pCI— neo(Promega公司 製造）、反轉錄病毒載體pLNCX、pLNSX、pLXN、pSIR ( Clontech公司製造）、Cosmid載體pAxCw (寶生技公司 製造）等，並無特限。該表達載體可使用二乙胺乙基 (DEAE)·聚葡萄糖法(Luthman, Η · and M agnu s son，G ·， Nucleic Acids Res.，（1 983) 1 1，1295-1 308 )、磷酸鈣-DNA 共沈殿法（Graham’F.L.and Van der Eb，A_J·，Virology, (1 973) 52, 456-457)、及電穿孔法（Neumann, E.et al., EMBO J.,(1 982) 1，841 -845)等，送至源自小鼠單核細胞 RAW264.7 ( ATCC Cat. No. TIB-71 ) 、RAW264 細胞 (ECACC Cat. No. 8 5062803)、R A W-D 細胞（W at an ab e et al., J. Endocrinol., (2004) 1 80, 1 93-20 1 )、猴細胞之 COS 細胞（Gluzman，Y.，Cell, (1 98 1) 23，1 75- 1 82，ATCC : CRL-165 0)及中國黃金鼠卵巢纖維芽細胞（CHO細胞、ATCC : CCL-61)之二氫葉酸還原酶删去突變株（UrlaUb，G. and

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Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1980) 77, 4126 — 4220 )、源自人胎兒腎臟之293細胞（ATCC : CRL- 1573 )等，並無特限而得所望轉形體。 由基因操作，也可在正常動物中製作高表達目的基因之 基因轉殖動物，來探討對細胞形態有何影響出現。 (2)由 DC-STAMP表達量之抑制，而分析DC-STAMP 之功能 調查抑制DC-STAMP表達量所致破骨細胞之分化及破骨 細胞成熟對細胞形態有何影響出現，也可分析DC-STAMP 之功能。 DC-STAMP表達有抑帋IJ之物質可爲如對DC-STAMP基因 之反義核酸、siRNA等。抑制DC-STAMP功能之物質可爲 如對DC-STAMP專一結合之抗體。 是否抑制DC-STAMP之表達，或欲抑制DC-STAMP功能 時，可探討能各標的細胞所有之功能、具體而言，破骨細 胞之分化及成熟等骨代謝相關功能、或對細胞形態有何影 響。在有骨代謝異常之動物或無骨代謝異常之動物中，製 作破壞DC-STAMP基因基因剔除動物，來判定細胞及組織 之形態。 4 . DC-STAMP基因及/或DC-STAMP檢定用套組 DC-STAMP基因及/或DC-STAMP可使用含一以上如下 1 )〜5 )群之套組來檢定。 1 ) 選自序列表之序列號碼1所示核苷酸序列之聚核苷 酸、序列號碼3所示核苷酸序列之聚核苷酸及序列號 1359026 碼5所示核苷酸序列之聚核苷酸之至少任一聚核苷酸 予以專一地擴増之15至30鹼基長連續寡核苷酸引子

I 2) 選自序列表之序列號碼1所示核苷酸序列之聚核苷 酸、序列號碼3所示核苷酸序列之聚核苷酸及序列號 碼5所示核苷酸序列之聚核苷酸之至少任一聚核苷酸 在嚴苛條件下雜交，以檢定該聚核苷酸15核苷酸以 上連續之聚核苷酸探針； 3) 選自序列表之序列號碼1所示核苷酸序列之聚核苷 酸、序列號碼3所示核苷酸序列之聚核苷酸及序列號 碼5所示核苷酸序列之聚核苷酸之至少任一聚核苷酸 予固定之固相化試料； 4 ) 選自序列表之序列號碼2所示胺基酸序列之蛋白質 、序列號碼4所示胺基酸序列之蛋白質及序列號碼6 所示胺基酸序列之蛋白質之至少任一蛋白質予專一地 結合來檢定該蛋白質之抗體； 5) 可於上述4)記載之抗體結合之二次抗體。 上述1)記載之引子可依DC-STAMP基因核苷酸序列（ 序列表之序列號碼1、3及/或5所示核苷酸序列），使用 市售引子設目十軟體（例如Wisconsin GCG package Version 10·2)等，依常法設計’加以擴増。上述2)記載之探針爲 可與DC-STAMP專一性雜交之聚核苷酸，ι00〜 1 500鹼基 長’宜爲300〜600鹼基長。該類引子與探針，亦可適當加 以標記（例如酵素標記、放射性標記、螢光標記等），且 1359026 亦可附加連接子（Linker)。 上述3)記載之固相化試料，可將上述2)記載之探針於 玻璃板、尼龍膜等固相固定製得。固相化試料之製作方法 乃如上述「2·骨代謝異常之檢定」項之「（1)利用DC-STAMP基因之表達量而檢定骨代謝異常之方法」之説明， 可為例如基因晶片、cDN A矩陣、寡矩陣、膜濾紙等。 本發明之套組也可含耐熱性DNA聚合酶、dNTP ( dATP ' dCTP、dGTP、dTTP之混合物）及緩衝液。耐熱性DNA 聚合酶爲Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶（寶 酒造公司製造）、Tth DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等 。緩衝液可視使用之DNA聚合酶而選用，必要時可添加 Mg2+ 等。 上述4)及5)記載之抗體可依上述「2·骨代謝異常檢 定」項中「（2)利用DC-STAMP之表達量（蛋白質之表 達量）而檢定骨代謝異常之方法」項及「6·抗DC-STAMP 抗體之製造」項中記載之方法製作。該抗體可適當加以標 記（例如酵素標記、放射性標記、螢光標記等）。 本發明之套組可使用於 DC-STAMP基因及/或 DC-ST AMP之檢定，來判定是否有骨代謝異，也可用以篩選抑 制骨代謝異常病態進行之物質。 5·抑制向破骨細胞分化物質之篩選方法 本發明提供測定DC-STAMP基因及/或DC-STAMP之表 達量，以篩選抑制向破骨細胞分化物質之方法。 本發明又提供鑑定DC-STAMP之抑制破骨細胞分化促進 ⑧ -32 - 1359026 活性物質，來篩選對骨代謝異常症有治療效果及/或預防 效果物質之方法。 「被驗物質」爲本發明篩選方法中供調查向破骨細胞分 化之抑制活性之對象物質。被驗物質爲化合物、微生物之 代謝産物、植物及動物組織之萃取物、其衍生物或其混合 物等。降低DC-STAMP表達量所設計之核酸或其衍生物（ 含反義寡核苷酸、脂質體、dSRNA、SiRNA等）也可用為 被驗物質。被驗物質之投與量及濃度可適宜設定，或可例 如作成稀釋系列等來設定複數投與量，可以固體、液體等 適當狀態投與，可在適當緩衝液中溶解，或加安定化劑等 。用培養細胞之篩選方法時，可在培養基中添加來培養。 在培養基中添加時，可在開始培養時添加，也可在培養中 途添加，添加回數不限於1回》被驗物質存在下之培養期 間可適宜設定，宜30分〜2週，尤宜30分〜48小時。在 哺乳動物個體中投與被驗物質時，被驗物質依物性等可經 口投與、靜脈注射、腹腔內注射、經皮投與、皮下注射等 投與形態。依被驗物質之投與，選擇適當時間取得檢體》 本發明篩選方法中所用培養細胞只要爲可表達DC-ST AMP之哺乳動物細胞則可爲正常細胞、也可癌細胞等異 常増殖細胞，例如源自小鼠單核細胞RAW264.7 ( ATCC Cat. No TIB-71 ) 、RAW264 細胞（ECACC Cat. No. 8 5 062803)、R A W-D 細胞（Watanabe et al., J. Endocrinol., (2004)1 80，193-201 )、源自小鼠骨髓之初代培養細胞等， 並無特限。培養細胞之哺乳動物種宜爲如人、小鼠或其他哺 ⑧ 1359026 乳動物（天竺鼠、大鼠、雞、兔子、猪、羊、牛、猴等） ，並無特限。培養細胞宜使用可過度表達DC-STAMP之哺 乳動物細胞，例如令DC-STAMP基因與其促進子領域一起 導入，以過度表達 DC-STAMP 之 RAW264.7細胞、 RAW264細胞、RAW-D細胞等。 本發明篩選方法含不用培養細胞，在哺乳動物個體內投 與被驗物質，其後檢定自該動物個體摘出其臟器或組織細 胞中DC-STAMP基因表達之方法》基因表達之檢定對象臟 器或組織以表達DC-STAMP者爲佳，宜爲發生骨代謝異常 之組織，更宜爲骨髓。哺乳動物種類使用非人哺乳動物，宜 爲小鼠、大鼠或黄金鼠，更宜爲小鼠或大鼠。呈現骨代謝 異常之動物模型可使用卵巢摘除動物、精巢摘除動物、腫 瘤細胞殖於皮下、皮內、左心室、骨髓、靜脈或腹腔等之 擔癌動物、坐骨神經切除動物、佐劑關節炎模型動物、膠 原誘導關節炎模型動物、糖皮質激素誘發性骨質疏鬆症模 型動物、老化促進小鼠（SAMP6小鼠、Matsushita et al.， Am. J· Pathol· 125，276-283 (1986))、甲狀腺•副甲狀腺 摘除動物、副甲狀腺荷爾蒙關連胜肽（PTHrP )持續注入 動物、破骨細胞形成抑制因子（OCIF )基因剔除小鼠（ Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1 998)247，610-615)等。在牙周病之喪失齒的模型動物， 使用有過度表達DC-STAMP之動物。將所篩選被檢物質在 上述動物模型中投與，測定骨組織中破骨細胞之數目、骨 密度、骨強度或血中鈣濃度等，依骨代謝異常而變動之參 -34 - 1359026 數，而評估該被檢物質對骨代謝異常之治療效果及/或預 防效果。 本發明方法中所用培養細胞’不添加被驗物質時’添加 RANKL及TNF-α與表達DC-STAMP之可能條件可用任何 條件培養。例如已知該培養細胞為公知培養條件，而於該 條件下該細胞表達DC-ST AMP時，可以該條件培養。自哺 乳動物個體摘出臟器或組織，以檢定DC-STAMP表達時， 該動物之飼育條件也可如不添加被驗物質時能表達DC-STAMP之條件即可。 為調查被驗物質對DC-STAMP表達之影響’有測定DC-STAMP基因表達量及 DC-STAMP基因之翻譯産物 DC-STAMP之表達量之方法。抑制DC-STAMP基因、及/或 DC-STAMP表達之被驗物質爲對骨代謝異常，宜爲對骨質 疏鬆症、風濕性關節炎及/或癌性高鈣血症有治療效果及 /或預防效果之物質。 自培養細胞之全RNA萃取、測定DC-STAMP基因之表達 量、DC-STAMP表達量之測定，可依上述「2·骨代謝異常 之檢定」項記載之方法來進行。使用源自哺乳動物之培養 細胞時，必要時可在培養基中適當量添加被驗物質及 RANKL及TNF-α ，於不添加被驗物質之對照組，也適當 量添力卩RANKL及TNF-α。 (1 )用DC-STAMP基因之方法 本發明篩選方法使用以下例如源自哺乳動物之培養細胞 方法，及使用哺乳動物個體方法等。 -35 - ⑧ 1359026 (a) 用源自哺乳動物之培養細胞方法 (i)含以下工程甲）〜丙）： 甲）自有添加被驗物質之培養基培養之源自哺乳動物之 培養細胞，萃取全RNA之工程； 乙）自甲）中之全RNA，與不添加被驗物質培養之源自 哺乳動物培養細胞之全RNA間，檢定DC-STAMP基因表達 量差異之工程； 丙）自乙）記載之基因表達量差異來解析，檢定被驗物 質對骨代謝異常之治療效果及/或預防效果的工程。 (ii )含以下工程甲）〜丁）。 甲）自有添加被驗物質之培養基培養之源自哺乳動物之 培養細胞％萃取全RNA之工程； 乙）自不添加被驗物質之培養基培養之源自哺乳動物之 培養細胞，萃取全RNA之工程； 丙）由上述甲）之全RNA與乙）之全RNA，測定DC-STAMP基因表達量之工程； 丁）自上述甲）之全RNA與乙）之全RNA間，由上述 丙）測定基因表達量差異來解析，檢定被驗物質對骨代謝 異常之治療效果及/或預防效果的工程。 (b) 使用哺乳動物個體之方法 (i )含以下工程甲）〜丙）。 甲）投與被驗物質至哺乳動物個體，採取檢體，萃取全 RNA之工程； 乙）自甲）之全RNA，與不投與被驗物質至動物個體所 -36 - 1359026 採取檢體而得全RNA間，檢定DC-STAMP基因表達量差異 之工程； 丙）由上述乙）記載基因表達量差異來解析，檢定被驗 物質對骨代謝異常之治療效果及/或預防效果的工程。 (Π)含以下工程甲）〜丁）。 甲）投與被驗物質至哺乳動物個體，採取檢體，萃取全 RNA之工程； 乙）自未投與被驗物質之哺乳動物個體採取檢體，萃取 全RNA之工程； 丙）自上述工程甲）之全RNA及上述工程乙）之全RNA 間，測定DC-STAMP基因表達量之工程； 丁）由丙）記載之基因表達量差異來解析，檢定被驗物 質對骨代謝異常之治療效果及/或預防效果的工程。 (2 )用DC-STAMP之方法 利用DC-STAMP表達量的測定之篩選方法中包含以下使 用哺乳動物培養細胞之方法與使用動物個體之方法等之工 程。 (a)用源自哺乳動物之培養細胞之方法 (Ο含以下工程甲）及乙）： 甲）自有添加被驗物質之培養基培養之源自哺乳動物之 培養細胞，測定DC-STAMP表達量之工程； 乙）由甲）所測定蛋白質之表達量與不添加被驗物質培 養之哺乳動物培養細胞間，該蛋白質表達量之差異來分析 ，檢定被驗物質對骨代謝異常之治療效果及/或預防效果

-37 - 1359026 的工程。 (ϋ)含以下工程甲）〜丙）： 甲）添加被驗物質至培養基培養，自源自哺乳動物之培 養細胞中，測定DC-ST AMP蛋白質表達量之工程； 乙）不添加被驗物質至培養基培養，自源自哺乳動物之 培養細胞中，如上述甲）記載測定蛋白質表達量之工程； 丙）如上述甲）測定蛋白質表達量，與上述乙）測定蛋 白質表達量之差異，檢定被驗物質對骨代謝異常之治療效 果及/或預防效果的工程。 (iii) 含以下工程甲）〜丙）： 甲）添加被驗物質至培養基培養，自源自哺乳動物之培 養細胞所得全蛋白質以固相化之工程； 乙）上述固相化蛋白質中，測定DC-STAMP蛋白質表達 量之工程； 丙）上述乙）所檢定DC-STAMP之表達量，相較於不添 加被驗物質至培養基培養之源自哺乳動物之培養細胞所得 全蛋白質中該蛋白質表達量之差異來分析，檢定被驗物質 對骨代謝異常之治療效果及/或預防效果的工程。 (iv) 含以下工程甲）〜戊）： 甲）添加被驗物質至培養基培養，自源自哺乳動物之培 養細胞所得全蛋白質以固相化之工程： 乙）不添加被驗物質至培養基培養，自源自哺乳動物之 培養細胞所得全蛋白質以固相化之工程；

丙）上述工程甲）記載之固相化蛋白質中，DC-STAMP 1359026 蛋白質之表達量，使用與該蛋白質可專一地結合之抗體或 配體來測定之工程； 丁）上述工程乙）記載之固相化蛋白質中，DC-STAMP 之表達量係用與該蛋白質可專一地結合之抗體或配體來測 定之工程： 戊）上述工程丙）所測定蛋白質之表達量，與上述工程 丁）所測定蛋白質表達量之差異來分析，檢定被驗物質對 骨代謝異常之治療效果及/或預防效果的工程。 (b)使用哺乳動物個體之方法 (i) 含以下工程甲）及乙）： 甲）自投與被驗物質之哺乳動物個體採取檢體，測定 DC-STAMP蛋白質表達量之工程； 乙）由上述工程甲）所測定DC-STAMP之表達量，與未 投與被驗物質之哺乳動物個體採取檢體中該蛋白質表達量 之差異來分析，檢定被驗物質對骨代謝異常之治療效果及 /或預防效果的工程。 (ii) 含以下工程甲）〜丙）： 甲）自投與被驗物質之哺乳動物個體採取檢體，DC-STAMP蛋白質之表達量係用與該蛋白質可專一地結合之抗 體或配體來測定之工程； 乙）自未投與被驗物質之哺乳動物個體採取檢體，測定 該蛋白質表達量之工程； 丙）由甲）所測定DC-ST AMP蛋白質之表達量’與乙） 所測定該蛋白質表達量之差異來分析’檢定被驗物質對骨 ⑧ -39 - 1359026 代謝異常之治療效果及/或預防效果的工程。 (iii) 含以下工程甲）〜丙）： 甲）自投與被驗物質之哺乳動物個體採取檢體中全蛋白 質予以固相化之工程； 乙）上述固相化蛋白質中，測定DC-STAMP蛋白質表達 量之工程； 丙）上述乙）所檢定DC-STAMP蛋白質表達量，與未投 與被驗物質之哺乳動物個體採取檢體中該蛋白質表達量之 差異來分析，檢定被驗物質對骨代謝異常之治療效果及/ 或預防效果的工程。 (iv) 含以下工程甲）〜戊）： 甲）自投與被驗物質之哺乳動物個體所採取檢體中全蛋 白質予以固相化之工程； 乙）自未投與被驗物質之哺乳動物個體所採取檢體中全 蛋白質予以固相化之工程； 丙）上述工程甲）記載之固相化蛋白質中，DC-STAMP 蛋白質表達量用與該蛋白質可專一地結合之抗體或配體來 測定之工程； 丁）上述乙）記載之固相化蛋白質中，DC-STAMP蛋白 質表達量用與該蛋白質可專一地結合之抗體或配體來測定 之工程； 戊）上述丙）所檢定蛋白質之表達量，與上述丁）所檢 定該蛋白質表達量之差異來分析，檢定被驗物質對骨代謝 異常之治療效果及/或預防效果的工程。

-40 - 1359026 (3 )其他方法 在過度表達DC-STAMP之哺乳動物個體，於投與被驗物 質時及不投與時，測定經時的骨代謝異常之發生率、骨代 謝異常之程度、及/或生存率等。有投與被驗物質之哺乳動 物，可其骨代謝異常之發生率降低、骨代謝異常之程度、 及/或可提高生存率約10%以上、宜約3 0%以上、更宜約 5 0%以上時，所選擇被驗物質爲對骨代謝異常有治療及/ 或預防效果之化合物。 6 ·抗DC-STAMP抗體之製造 (1)抗原之調製 抗DC-STAMP抗體之製作中抗原爲DC-STAMP或其至少 6個連續部分胺基酸序列而成之聚胜肽、或此任意胺基酸 序列或載體加成之衍生物等。 DC-STAMP可自血球細胞或骨髓細胞直接精製使用，或 使用其細胞之細胞膜部分來調製，DC-STAMP亦可由活體 外合成，或基因操作由宿主細胞産生而得》 原核細胞宿主可例如大腸菌（Escherichia coli)及枯草 菌（Bacillus subtilis)等。將目的基因在宿主細胞內作轉 形時，可用有依宿主種類之複製物爲複製起點，含調節序 列之質體載體在宿主細胞內作轉形。載體宜爲於轉形細胞 中有表現形質（表現型）選擇性之序列。 例如當使用大腸菌爲K12株等時，載體一般用pBR322 及pUC系之質體，並無特限，可使用已知之各種菌株、及 載體。 -41 - ⑧ 1359026 促進子在大腸菌中爲色胺酸（trp)促進子、乳糖（lac) 促進子、色胺酸·乳糖（Uc)促進子、脂蛋白（lpp)促進 子、聚胜肽鏈伸張因子Tu( tufB )促進子等，使用促進子 可産生目的之聚胜肽。 枯草菌宜爲例如 207 — 25株，載體爲p TUB22 8 ( Ohmura，K. et al. (1 984) J. Biochem. 95，87-93 )等，並無 特限。與枯草菌之α -澱粉水解酶之訊號胜肽序列編碼之 DNA序列連結而得以菌體外分泌表達。 • 真核細胞之宿主細胞含脊椎動物、昆蟲、酵母等細胞， 脊椎動物細胞爲例如源自小鼠單核細胞RAW264.7 ( ATCC Cat. No TIB-71 ) 、RAW264 細胞（ECACC Cat. No. 85062803) ' RAW-D 細胞(Watanab e et al., J. Endocrinol., (2004)1 80，193-201 )、猴之細胞之 COS 細胞（Gluzman， Y.，Cell, (198 1)23, 175-182、ATCC CRL— 1650)、小鼠 繊維芽細胞NIH3T3 ( ATCC No . CRL - 1 65 8 )及中國黃 金鼠卵巢纖維芽細胞（CHO細胞、ATCC CCL — 61)之二 •氫葉酸還原酶刪去突變株（Urlaub，G· and Chasin，L. A.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA，（1980)77，4126-4220 )等，並 無特限。 脊椎動物細胞之表達促進子，通常使用在表達基因上游 位置之促進子、RNA剪接部位、聚（A)化部位、及轉錄終結 序列等者，於必要時亦可使用具有複製起點者。該表達載 體爲如有巨大細胞病毒初期促進子之P CDNA3 · 1 ( Invitrogen公司製造）、有SV40初期促進子之p SV2dh fr ⑧ 1359026 (Subramani, S. et al., Mol. Cell. Biol., (1 98 1 ) 1 , 854-864 )等，並無特限。 宿主細胞當使用COS細胞或NIH3T3細胞時，表達載體 爲有SV40複製起點，可在COS細胞或NIH3T3細胞自立 増殖，轉錄促進子、轉錄終結訊號、及RNA剪接部位。該 表達載體可使用 DEAE-聚葡萄糖法（Luthman，H. and Magnusson, G., Nucleic Acids Res., (1983)1 1，1 295-1308 ) 、磷酸銘—DNA 共沈激法（Graham, F. L· and Van der Eb， A. J·，Virology，（1 973)52，456-457 )、及電穿孔法（ Neumann, E. et al., EMBO J.，(1982)1, 841 -845 )等，送至 COS細胞、或NIH3T3細胞，而得所望轉形細胞》當使宿 主細胞爲CHO細胞時，與表達載體一起，將以具抗生物質 G418耐性標記子功能之可表達neo基因之載體，例如 PRSVneo ( Sambrook, J. et al. (1 9 8 9) : “Molecular Cloning A Laboratory Manual41 Cold Spring Harbor Laboratory, NY )及 PS V2neo ( Southern, P. J. and Berg, P., J. Mol. Appl. Genet·，（1 982) 1，327-341 )等共轉染，篩選具G418耐性之 細胞株，可得可安定産生目的聚胜肽之轉形細胞。 上述所得轉形體可依常法培養，該培養細胞內、細胞膜 上或細胞外可産生目的聚胜肽。該培養用之培養基可適宜 選擇與視所採用宿主細胞而習用之各種培養基，例如只要 為上述COS細胞，則可於RPMI1 640培養基及狄巴可修飾 必需培養基（以下簡稱「DMEM」）等培養基，必要時加入牛 胎兒血清等血清成分之培養基來使用。 -43 - ⑧ 1359026 依上述培養，轉形細胞內、細胞膜上或細胞外産生之重 組蛋白質可依利用該蛋白質物理性質及化學性質等之各種 習知分離操作法來分離•精製。該方法爲例如以習知蛋白 質沈澱劑處理、超濾、分子層析（凝膠過濾）、吸附層析 、離子交換層析、親和性層析或高速液體層析（HPLC )等 各種液體層析、透析法、或其組合。且在欲表達之目的重 組蛋白質連接由6殘基而成之組胺酸，以鎳親和性柱進行 高效率精製。組合上述方法，則可大量製造高產率、高純 度之目的聚胜肽。當上述蛋白質爲在細胞膜上産生時，可 調製細胞膜部分來分離、粗精製而得。 (2 )抗DC-STAMP單株抗體之製造 與DC-STAMP有專一性結合之抗體可爲如與DC-STAMP 有專一性結合之單株抗體，其取得方法爲如以下記載。 單株抗體之製造一般可依下述等作業工程。即 (a)當作抗原使用之活體高分子之精製、 .(b)將抗原注射至動物來免疫後，採取血液以檢定其抗 體價來決定採取脾臟之時期而調製抗體産生細胞之工程、 (c) 骨髓腫瘤細胞（以下簡稱「「黑瘤」」之調製、 (d) 抗體産生細胞與黑瘤之細胞融合、 (e) 篩選産生目的抗體之融合瘤群、 (f) 分殖至單一細胞株（選殖）、 (g) 有時爲大量製造單株抗體而培養融合瘤，或飼養將 融合瘤移植之動物、 (h) 所製造單株抗體之生理活性、及其結合專一性之檢 1359026 討、或作為標記試劑之特性之檢定等。 單株抗體之製作法可依上述工程之方法，該抗體製法並 無特限，例如可用脾細胞以外抗體産生細胞及黒瘤。 (a) 抗原之精製 抗原可使用由上述方法調製之DC-STAMP或其一部份。 由表達DC-STAMP之體細胞調製膜部分、或由表達DC-STAMP之體細胞本身，依業者周知方法，使用化學合成之 本發明蛋白質部分胜肽爲抗原。 (b) 抗體産生細胞之調製 將工程（a)所得抗原，與Freund氏完全或不完全佐劑、 或鉀明礬等助劑混合，將免疫原在實驗動物中予以免疫。 實驗動物可使用已知融合瘤製作法所用無障礙之動物。具 體例可使用如小鼠、大鼠、羊、羊、牛、馬等。基於取出 之抗體産生細胞以融合得黑瘤細胞之容易性等觀點，宜用 小鼠或大鼠爲被免疫動物。實際使用之小鼠及大鼠之系統 並無特限，當使用小鼠時，可用如各系統 A、AKR 、 BALB/c、BDP 、BA、CE、C3H 、57BL、C57BR 、C57L、 DBA 、FL、HTH 、HT1 、LP、NZB 、NZW 、RF、R III 、SJL 、SWR 、WB、129等，當使用大鼠時，可用如Low 、Lewis 、Spraque 、Daweley 、ACI 、BN、Fischer 等》 其小鼠及大鼠可購自如日本Crea、日本査爾斯河、曰本 SLC、The Jackson Laboratories等實驗動物飼育業者。後述 基因黑瘤細胞融合適合性，小鼠宜爲 BALB/c系統，大鼠 宜爲low系統爲被免疫動物。基於抗原在人及小鼠關同質 -45 - ⑧ 1359026 性之考量，宜用除去自己抗體之活體機構低下的小鼠，即 自體免疫疾病小鼠。小鼠或大鼠免疫時之週齡宜5〜12週 齡，尤宜6〜8週齡。 為以 DC-STAMP或其重組體使動物免疫，可依例如 Weir,D.M.,Handbook of Experimental Immunology Vol.I. 11. III.,Blackwell Scientific Publications, Oxford (1 987)、 Kabat, E. A. and Mayer, M. M·，Experimental Immuno- chemistry，Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois ( 1 964)等詳述記載之已知方法進行。其免疫法中，本發明 較佳具體方法爲如下。將抗原之膜蛋白部分，或表達抗原 之細胞投與至動物皮內或腹腔內。爲得高免疫效率，宜兩 者倂用，前半以皮內投與，後半或最終回以腹腔內投與而 進行則免疫效率高。抗原投與時程可依被免疫動物種類、 個體差異等而異，一般抗原投與回數爲3〜6回，投與間隔 爲2〜6週，宜投與回數3〜4回、投與間隔2〜4週。投與 回數過度増加會浪費抗原，但投與間隔太長及老化之動物 細胞，引起低活性，皆不宜。抗原之投與量可視動物種類 、個體差等而異，一般爲0.05〜5 ml，宜 0.1〜0.5ml程 度。追加免疫爲在以上抗原投與1〜6週後，宜2〜4週後 ，尤宜2〜3週後進行。其追加免疫時期晚於6週，或早於 1週，則會降低追加免疫之效果。追加免疫時抗原投與量 視動物種類而有極大差異，一般例如小鼠時爲〇.〇5〜5 ml ，0.1〜0.5 ml，尤宜0.1〜0.2 ml程度。不必要之大量投與 會降低免疫效果，對被免疫動物亦不宜。 ⑧ 1359026 自上述追加免疫1〜10日後，宜 2〜5日後，尤宜2〜3 曰後’自被免疫動物無菌取出含産生抗體細胞之脾臟細胞 或淋巴球。測定抗體效價，使用抗體效價高之動物爲産生 抗體細胞之供給源，以提高以後操作效率》 所用抗體效價之測定法可用RIA法、ELISA法、螢光抗 體法、受身血球凝集反應法等種種已知技術測定，由檢定 感度、迅速性、正確性、及操作自動化之可能性等觀點， 宜RIA法或ELISA法。 • 本發明中抗體效價中測定，可用例如ELISA法，依下述 載方法來進行。將精製或部分精製抗原在ELISA用96穴 平板等固相表面予以吸附，抗原不吸附之固相表面用與抗 原無關之蛋白質，例如以牛血清蛋白（以下稱「BS A」） 被覆，將該表面洗淨後，將第一抗體以階段稀釋之試料（ 例如小鼠血清）來接觸，令上述抗原與試料中單株抗體結 合。加入第二抗體爲酵素標記之對小鼠抗體之抗體，與小 鼠抗體結合，洗淨後，加入該酵素之基質，測定基質分解 I 基發光之吸光度變化等，算出抗體效價。 自脾臟細胞或淋巴球分離抗體産生細胞，可依已知方法 (例如 Kohler et al·，Nature, ( 1975)256，495 ; Kohler et al., Eur.J.Immnol., (1977)6,51 1, ； Milstein et al., Nature, (1 977)266，550 ; Walsh, Nature，（1977)266，495 )進行。例 如脾臟細胞時，將細胞細切細，以不銹鋼網過濾後’以 Eagle最小必須培養基（MEM )懸浮，以一般方法分離産 生抗體之細胞。 ⑧ 1359026 (C)骨髓腫瘤細胞（以下稱「黑瘤」）之調製 細胞融合用之黑瘤細胞無特限，可由已知細胞株適宜選 擇使用。基於自融合細胞選擇融合瘤之便利性的考量，宜 使用有確立選擇手續之HGPRT(次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷核糖轉 移酶）刪去突變株β即源自小鼠之X63-Ag8(X63)、NSl-Ag4/1(NS1) ' P3X63-Ag8.Ul(P3Ul) ' X 6 3 - g8.6 5 3 (X6 3.6 5 3 ) 、SP2/0-Agl4(SP2/0)、MPC1 1-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、 S149/5XXO、BU.l 等，源自大鼠之 210.RSY3.Ag.l.2_3(Y3) 等，源自人之 U266AR(SKO-007)、GM1 500 · GTG-A12(GM1 500) 、 UC729-6 、 LICR-LO W-HMy2(HMy2)、 8226AR/NIP4-1(NP41)等。其 HGPRT刪去突變株可由例如 American Type Culture Collection (ATCC)等而得。 此細胞株用適當培養基例如8-tfT鳥嘌呤培養基〔RPMI —1 64 0培養基中添加麩胺酸、2 —氫硫乙醇、慶大黴素 (gentamycin)、及小牛胎兒血清（以下稱「FCS」）之培養 基中添加 8 —吖鳥嘌呤之培養基]、：Iscove氏修飾 Dulbeccols培養基（以下稱「IMDM」）或Dulbeccols修飾 Eagle培養基（以下稱「DMEM」）作繼代培養，再將細胞 於融合前3〜4日前以正常培養基〔例如含10% FCS之 ASF104培養基（味之素公司製造）〕作繼代培養，融合當 日確保細胞數爲2xl07以上。 .(d )細胞融合 抗體産生細胞與黑瘤細胞之融合’可依已知方法（ Weir,D.M.,Handbookof Experimental Immunology Vol.I. II. ⑧ -48 - 1359026 III.,Blackwell Scientific Publications, Ox ford ( 1 9 8 7)、 Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immuno-chemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1 964)等），宜於不造成細胞生存率過度降低程度之條件 下實施。此等方法爲例如使用聚乙二醇等高濃度聚合物溶 液中，使用令抗體産生細胞與黑瘤細胞混合之化學方法、 利用電刺激之物理方法等。上述化學方法的具體例如下。 使用高濃度聚合物溶液爲聚乙二醇時之分子量為15 00〜 6000，宜 2000〜4000聚乙二醇溶液中，於 30〜40°C，宜 35〜38°C溫度，令抗體産生細胞與黑瘤細胞混合1〜10分 ，宜5〜8分。 (e )融合瘤群之篩選 上述細胞融合所得融合瘤之篩選方法無特限，通常用 HAT (次黃嘌呤·胺蝶呤♦胸腺嘧啶）篩選法〔Kohler et al.，Nature，256，495 ( 1 975) ; Milstein at al·，Nature 266, 5 50 ( 1 977)〕。此方法可有效用於無法存活於胺蝶呤之 HGPRT刪去突變株的黑瘤細胞，而得融合瘤。即將未融合 細胞及融合瘤在HAT培養基培養，篩選對胺蝶呤有抗性之 融合瘤存活株而増殖》 (f)單一細胞株之選殖 融合瘤之選殖法爲例如使用甲基纖維素法、軟瓊脂法、 限制稀釋方法等已知方法〔參照例如Barbara，B.M. and Stanley，M.S_ : Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Company，San Francisco ( 1 980 )〕。此 ⑧ 1359026 選殖法爲在平板每穴中培養於軟瓊脂培養基後收得菌落之 軟瓊脂法、使用微操縱器以分離單細胞並培養之方法、使 用細胞分離機分出單細胞之「分離-純系」等。其中特宜爲 限制稀釋方法。此方法爲在微平板中，種植以源自大鼠胎 兒之繊維芽細胞株、或正常小鼠脾臟細胞、胸腺細胞、腹 水細胞等。此外，將融合瘤以0.2〜0.5個/〇.2mL用培養 基稀釋，將稀釋之融合瘤懸浮液加至各穴O.lmL，定期（ 例如毎3日）換以約1/3新培養基，持續培養2週以増殖 融合瘤株》 各穴之抗體效價之確認，例如限制稀釋方法選殖者確認2 〜4回，以選擇具穩定抗體效價之抗DC-STAMP單株抗體 産生融合瘤株。 (g)培養融合瘤以製備單株抗體 所選擇之融合瘤予以培養，可有效製得單株抗體，培養 之前可先篩選會産生目的單株抗體之融合瘤。此篩選可依 已知方法進行。 本發明中抗體效價之測定可依例如ELIS A法，依以下方 法進行。使用精製或部分精製DC-STAMP、或DC-STAMP 表達細胞，在ELISA用96穴平板等固相表面予以吸附， 未吸附抗原之固相表面抗原以不相關蛋白質、例如牛血清 蛋白（以下稱「BSA」）被覆，將該表面洗淨後，接觸以 段階稀釋之第一抗體試料（例如融合瘤培養上清液），令 上述抗原與試料中抗DC-STAMP抗體結合。加入作為第二 抗體之有酵素標記之對小鼠抗體之抗體，而與小鼠抗體結 -50 - ⑧ 1359026 合 > 洗淨後加入該酵素之基質，測定基質分解發光吸光度 之變化等，算出抗體效價。此等篩選可在上述融合瘤選殖 之後或前進行。 上述方法所得融合瘤可於液態氮中或-80 t以下之冷凍 庫中以凍結狀態保存。 將選殖完之融合瘤，培養基自HT培養基換爲正常培養基 而培養。大量培養可用大型培養瓶作滾筒培養或玻璃旋轉 瓶（Spinner flask)培養。將大量培養之上清液以膠濾等習知 方法而精製，可得對本發明蛋白質有專一性結合之單株抗 。將融合瘤注射至同質小鼠（例如上述BALB / c )、或Nu /Nu小鼠小鼠腹膜中，以増殖融合瘤，可得含大量本發明 單株抗體之腹水。在腹腔內投與時，可在實驗前（3〜7日 前）投與2，6，10，14 -四甲基十五碳烷（pristane)等礦 物油，而得多量腹水。將融合瘤以同系統小鼠之腹腔內， 以免疫抑制劑注射，使T細胞不活性化後，20日後將1 06 〜1〇7個融合瘤株細胞用不含血清之培養基中來懸浮（ 0.5mL)，在腹腔內投與，通常腹部會膨脹，採取小鼠之腹 水。由此方法，可得較培養液中約100倍以上濃度之單株 抗體。 由上述方法所得單株抗體可依例如Weir, D.M.:Handbook of Experimental Immunology Vo 1. I，II，III, Blackwell Scientific Publications，Oxford (1 978)記載方法而精製。 即硫酸銨鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法、親和性 層析法等。此方法中，硫酸銨鹽析法以3〜4回，宜3〜6 -51 - ⑧ 1359026 回反反復操作來精製單株抗體。由此方法精製單株抗體之 產率極低。亦可由以硫酸銨分劃法1〜2回所得粗精製單株 抗體中，以1種選自凝膠過濾法、離子交換層析法、親和 性層析法等（宜用2種方法）進行，可得高純度精製及高產 率之單株抗體。硫酸銨鹽析法與他法之組合及順序爲（i)硫 酸銨鹽析法-離子交換層析法-凝膠過濾法、（ii)硫酸銨鹽 析法-離子交換層析法-親和性層析法、（iii)硫酸銨鹽析 法-凝膠過濾法-親和性層析法等，可得高純度及高產率 之單株抗體，宜上述（Hi)之組合。 簡便精製方法可用市售之單株抗體精製套組（例如 MABTrapGII 套組；Pharmacia 公司製造）等。 所得單株抗體對DC-STAMP有高抗原特異性。 (h )分析單株抗體 依下法可鑑定所得單株抗體異形及次群。鑑定方法有 Ouchterlony 法、ELISA 法或 RIA 法。Ouchterlony 方法簡 易，當單株抗體濃度低時可使用。當使用ELISA或RIA， 培養上清液可直接與抗原吸附之固相反應，使用對應各種 人免疫球蛋白形及次群之二次抗體，可鑑定單株抗體之異 形及次群。更簡易方法為也可使用市售酶套組（例如小鼠 Typer套組；BioRad公司製造）等。 蛋白質定量可依Folin- Lowry方法，及基於280 nm吸光 度〔1.4 ( OD280 )=免疫球蛋白img/mL〕來計算。 (3 )人化抗DC-STAMP抗體之製作 免疫球蛋白G (以下稱單「IgG」）組成含2個分子量約 1359026 23 000之輕聚胜肽鏈（以下稱「輕鏈」），和2個分子量 約5 00 00之重聚胜肽鏈（以下稱「重鏈」）。重鏈、輕鏈 各有約110殘基之保守胺基酸重復區域，其爲組成IgG之 基本參度空間結構單位（以下稱「組域」）。重鏈及輕鏈 各含連續4個、及2個相連組域》重鏈和輕鏈之N-端組域 較其它各抗體分子間胺基酸序列變化大，此組域稱變化組 域（Variable domain :以下稱「V 組域 j ) 。IgG 之 N-端， 因重鏈及輕鏈之V組域，因其互補性質相互連接而形成變 化區域。其它組域連接而形成共同區域。共同區域序列爲 種間特徵，例如小鼠IgG共同區域與人IgG者不同，且小 鼠IgG由人免疫系統辨識爲外來蛋白質，因此得人抗小鼠 抗體（以下稱「HAMA」）（Schroff 等人、Cancer Res.， ( 1 98 5)45，879-85 )。因此，不可重復投予小鼠抗體至人。 爲有效投予，需修飾抗體以避免引起HAMA效應，而同時 維持抗體專一性。 X-射線結晶圖譜分析數據顯示，此等組域爲由3〜5個β 鏈形成之反平行Ρ-平板，以二層重疊組合之長圓筒狀構造 。變化區域中，重鏈、輕鏈V組域中3個環可共形成抗原-結合位。各此環名爲互補決定區域（以下稱「CDR」。） ，CDR之胺基酸序列具最高變化度。變化區域不屬於CDR 者，一般可用以維持CDR結構稱「框架區域」。Kabat比 較許多變化區域之一級序列，基於序列保存性，作成其一 級序歹(J CDR及框架區域之分類表（Kabat et. al、 SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th ⑧ -53 - 1359026 edition, NIH publication, No.9 1 -3242, E.A. Kabatt et al.) 。各框架亦區分為胺基酸序列有共同特徴之數個次群。亦 發見人與小鼠之間有相對框架存在。 自此等IgG分子結構特徵之硏究，考案如下製備人化抗 體之方法。 起始硏究建議製備接合小鼠抗體之變化區域至人源之共 同區域之嵌合體抗體（參照Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 及1，685 1 -6855，（1 984))。然而，此嵌合體抗體仍含許多非 人胺基殘基，因此當長期投與時可引起HAMA反應（ Begent et a 1., B r. J. Cancer, ( 1 990)62, 487 )。 對人有表達HAMA反應可能性之降低源自非人哺乳類之 胺基酸殘基數目之方法，提議單獨令CDR部分移植至源自 人之抗體（參照 Nature, 321· 522-525,（1986))，然而，單 獨移植CDR部份一般不足維持人免疫球蛋白對抗原之活性 〇

Chothia基於X-射線結晶圖譜之數據（1 987年）發現： (a) CDR之胺基酸序列中存在與抗原直接結合之部位及維 持CDR自體構造之部位，CDR之可能3D結構可由特別樣 式區分爲數群（規範構造）、 (b) 規範（Canonical)構造之群別，不僅由CDR，亦由 框架區域部分特定位置之胺基酸種類決定（J. Mol. Biol.， (1987)196， 901-917)。 故暗示使用CDR移植法時，除了 CDR序列，部分框架區 之胺基酸殘基也須移植至人抗體（參照特表平4-502408號

-54 - 1359026 一般，有移植CDR之源自非人哺乳動物的抗體稱爲「供 給子j ，受移植CDR之人抗體稱爲「接受子」。 實施CDR-移植時須考量點為保存CDR之結構、維持人 免疫球蛋白分子活性。為達成此目的，須注意： (a) 接受子之次群之選擇； (b) 移自供給子框架區域之胺基酸之選擇。

Queen等人提議若供給子FR之胺基酸殘基符合至少一下 列基準時，則與CDR序列一起移植至決定子之設計方法（ 參照特表平4-502408號）： (a)接受子之框架區域中之胺基酸幾不見於接受子之相 同位置，而供給子之相對胺基酸常見於接受子之相同位置 (b) 該胺基酸近於一個CDR。 (c) 該胺基酸之3D模型中，有一個支鏈原子於CDR之 近3A內，可與抗原或人化抗體之CDR反應。 編碼本發明抗DC-STAMP單株抗體之重鏈及輕鏈的DNA ，可由製備産生上述抗DC-STAMP單株抗體之融合瘤細胞 調製mRNA，將mRNA由反轉錄酶轉爲其cDNA，分離各編 碼抗體之重鏈及輕鏈之DNA而得。 mRNA之萃取可用硫氰酸胍·熱.苯酚法、胍·硫氰酸 胍•鹽酸等方法進行，宜爲胍.硫氰酸胍· CsCl法。由細 胞製備mRNA，先製備全RNA，將該全RNA使用寡（dT ) 纖維素及寡（dT)乳膠珠等聚（A) +RNA精製用載體之精 -55 - 1359026 製方法，或自細胞裂解載體液使用該載體直接精製來實施 。全RNA之調製方法含鹼性蔗糖密度梯度離心（Dougherty, W. G. and Hiebert，E.，Viology，（1 980)1 01, 466-474)、硫氰 酸胍·苯酚法、硫氰酸胍.三氟鉋方法、和苯酚.SDS法 等，宜使用硫氰酸胍及CsCl方法（Chirgwin, J. M.，et al.， (1979) Biochemistry, (1979)18， 5294· 5299)。 上述所得聚（A ) +RNA可於反轉錄酶反應中作爲模板， 而得單股cDNA後，由單股cDNA可合成雙股cDNA。此方 法爲如 S1 核苷酶法（Efstratiadis，A., et al.，Cell, (1 976)7, 279-288)、Gubler-Hoffman 法（Gubler，U. and Hoffman, B. J., Gene, (1983)25, 263-269)、和 Okayama-Berg 法 (Okayama, H. and Berg, P., Mol. Cell. Biol., (1982)2, 161-170)等，本發明中，以單股cDNA爲模板之聚合酶鏈反應 (以下稱「PCR j ) (Saiki，R. K·，et al·，Science, (1988)239，487-49)來進行，宜 RT — PCR 法。 所得雙股cDNA可嵌入選殖載體，所得重組載體可導入 大腸菌等微生物來轉形，以四環酶素抗性或安苄抗性等爲 指標而篩選轉形株。大腸菌之轉形可依 Hanahan法 (Hanahan，D·，J. Mol. Biol·，（1983)166，557-580)，在由氯 化鈣及氯化鎂或RuC12所製備之感受態細胞，加入該重組 DNA載體之方法來實施。若使用質體爲載體，則質體極需 帶有如上述抗藥基因。亦可使用質體以外之選殖載體，如 λ噬菌體等。 自上述所得轉形株，爲篩選帶有cDNA編碼目的抗 ⑧ 1359026 STAMP單株抗體次單體之轉形株，可使用各種如下述方法 。當目的cDNA由RT-PCR專一地擴増時，貝ij此步驟可省 略。 (3_1)以聚合酶鏈反應篩選之方法 在目的蛋白質之胺基酸序列全部或部份爲已知時，可合 成對該胺基酸序列部份之同義 (sense)及反義（antisense )寡核苷酸引子，用此組合進行聚合酶鏈反應（Saiki，R. K·，et al.，Science, (1988)239，487-49)，擴増製得 DNA 片 斷編碼有目的抗DC-STAMP抗體重鏈或輕鏈次單體。PCR 中使用模板DNA可爲如由産生抗DC-STAMP單株抗體之 融合瘤之mRNA以反轉錄酵素反應合成之c DNA。 所合成之DNA片斷可利用市售套組等直接嵌合至質體載 體’或將該片斷標定以32P、35S或生物素等，再以此爲探 針用於菌落雜交或溶菌雜交而選出欲得之菌株》 例如本發明抗DC-STAMP單株抗體之各次單體部分胺基 酸序列之硏究方法，可用電泳及柱層等周知方法，單離各 次單體部分’宜用自動蛋白質測序機（例如島津製作所製 造之PPSQ-10)等，定出各次單體部分之N末端胺基酸序 列。 由上述製得之適當轉形株採集抗DC-STAMP單株抗體蛋 白質之各次單體之編碼cDNA方法，可依已知方法 (Maniatis, T., et al. (1982) in "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory，NY.)來 實施。例如由細胞分離相當載體DNA之部分，由該質體 -57 - ⑧ 1359026 DNA可切出編碼欲得次單體區域之DNA領域。 (3—2)用合成寡核苷酸探針之篩選法 在目的蛋白質之胺基酸序列全部或部份爲已知時（該序 列只要為具複數個連續特異序列，則目的蛋白質之如何領 域亦可），合成對該胺基酸序列之寡核苷酸（此時可採用 由密碼使用頻率參考推測得之核苷酸序列，或組合核苷酸 序列之複數個核苷酸序列、若為後者時也可含肌核苷而減 少其種類），以此為探針（32P、35S或生物素等標記）， 將轉形株DNA與變性固定之硝化纖維素濾紙進行雜交，選 別陽性株。 所得DNA序列之決定可用例如Maxam — Gilbert之化學 修飾法 （Maxam, A.M.and Gilbert,W.,Methods in

Enzymology，（1 980)65，499-576)或二去氧核苷酸鏈終結法 (Messing，J. and Vieira, J.，Gene (1982)19，269-276)等來實 施。 近年，普遍使用螢光色素之自動鹼基序列決定系統（例 如 Parkin Elmer 公司製造之 Sequence Robot "CATALYST 8〇〇"及型號3 73ADNA測序機等）。 利用此系統可有效及安全地決定DNA核苷酸序列。自所 決定本發明DNA之核苷酸序列，及重鏈及輕鏈之N末端胺 基酸序列，可決定本發明單株抗體重鏈及輕鏈之全胺基酸 序列。 人免疫球蛋白之重鏈及輕鏈分爲變化區域及共同區域， 變化區域爲互補性決定領域（以下稱「CDR」；重鏈•輕 -58 -

CD 1359026 鏈各參個）及其隣接框架區域（重鏈•輕鏈各4個）。 共同區域之胺基酸序列與抗原種類無關，在免疫球蛋白 次群爲相同之抗體間為共通。變化區域，特爲CDR之胺基 酸序列爲各抗體所固有，依多數抗體胺基酸的序列數據比 較的硏究指出，CDR的位置與框架序列的長度，於同屬相 同次群抗體之次單位間略類似（Kabat, E. A., et al.，in "Sequence of Proteins of Immunological Interest Vol.II": U . S . Department of Health and Human Services, (1 99 1))。 因此例如由抗DC-STAMP單株抗體重鏈及輕鏈各胺基酸序 列與已知之胺基酸序列數據之比較，可決定各胺基酸序列 CDR與框架區域及共同區域位置。且FRHi、即重鏈最N 末端框架區域的鏈長，通常短於30胺基酸，例如該框架區 域最小可爲18胺基酸（前述Kabat et al. ) »故本發明抗 體中，於不損及抗DC-STAMP抗體的功能下，重鏈N末端 框架區域的鏈長可爲18胺基酸以上，30胺基酸以下，宜 3 〇胺基酸。 又可令上述所決定輕鏈或重鏈之各CDR相同之胺基酸序 列’或含其中連續部分胺基酸序列之胜肽，經人爲修飾使 該CDR近於抗DC-STAMP抗體分子中形成之立體構造，則 可具單獨對DC-STAMP結合活性〔參照例如美國專利第 5331573號公報〕。故此類修飾、與CDR相同之胺基酸序 列、及含其中連續部分之胺基酸序列之胜肽，亦包含於本 發明之分子。 胺基酸序列中欠缺任意一或二以上之胺基酸之改變體的 -59 - 1359026 製作，可依卡匣（cassatte)變異法（參照岸本利光、“新生化 學實驗講座2 ·核酸III重組DNA技術” 242-25 1 )等施行 〇 此各種DNA可依如磷化物參醋法（Hunkapiller，M., et al.， Nature (1984)310，105-111)等常法，由核酸化學合成而製 造。相對於目的胺基酸之密碼爲已知，可選用任何適當密 碼，例如使用基於宿主密碼運用頻率，依常法而選用密碼 。改變部份該核苷酸序列密碼可依常法，利用合成寡核苷 酸引子編碼欲得修飾密碼，依標準定位突變方法（site specific mutagenesis ) ( Mark, D. F., et al.，Proc. Natl.

Acad. Sci. USA，（1984)8 1，5662-5666 )等而進行。 DNA是否可與本發明抗DC-STAMP單株抗體之重鏈或輕 鏈之編碼DNA雜交，可將該DNA依随機引子法（Random Priming ； Feinberg, A.P. and Vogelstein， B., Anal. biochem·，（ 1 983) 1 3 2，6-13)及缺口 翻譯法（Maniatis, T·，et al., in "Molecular Cloning A laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory，NY. ,( 1 982))等，用〔a— 32P〕 dCTP等標定探針DNA，依以下述載實驗來進行。 將待調査之DNA在例如硝纖維素膜及尼龍膜等吸附，必 要時予以鹼化變性等處理，以加熱或紫外線等而固相化。 將膜浸在含6xSSC ( lxSSC爲0.15M氯化鈉、0.015M檸檬 酸三鈉溶液）及5%登哈特（Denhart)溶液、0.1%十二基硫 酸鈉（SDS)之雜交溶液中，於55°C下保持4小時以上， 將先前調製之探針加入在同樣雜交溶液中至最終比活性爲 ⑧、 1359026 lxl06CPm/mL，於60°C下過夜。將膜於室溫下以6xSSC 洗淨5分（數回），再以2xSSC洗淨20，進行顯影。 利用上述等方法，可自任意cDNA資料庫或基因資料庫 ，單離與編碼本發明人化抗DC-STAMP抗體之重鏈或輕鏈 之 DNA 雜交之 DNA (Maniatis，T.，et al·，in "Molecular Cloning A laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory，NY.，（1 982))。 上述所得各DNA重組於表達載體來導入原核生物或真核 生物之宿主細胞中，以在宿主細胞表達各基因。表達方法 可依上述「6 ·抗DC-STAMP抗體之製造」中「（1)抗原 之調製」記載之方法而進行。 轉形體之細胞內或細胞外所産生之含抗DC-STAMP抗體 蛋白質之部分，可利用該蛋白質物理的性質及化學的性質 ，以習知蛋白質分離操作法而分離·精製。該方法具體而 言，可採用例如習知蛋白質沈澱劑處理、超濾、分子層析 (凝膠過濾）、吸附層析、離子交換層析、親和性層析或 高速液體層析（HPLC )等各種層析、透析法、及其組合等 將抗DC-STAMP小鼠單株抗體予以人化時，可將已決定 CDR序列全體及FR序列部份之胺基酸殘基移植至人抗體 ，來設計變化區域之胺基酸序列之必要。此設計依以下方 法。 於設計人化時，接受子次群之選擇指針爲：（a)使用有 天然胺基酸序列之已知人抗體重鏈、輕鏈之天然組合、 -61 - ⑧ 1359026 (b)保存重鏈、輕鏈次群之組合，該重鏈、輕鏈各源自 不同的人抗體，與供給者重鏈、輕鏈之胺基酸序列有高度 同-性胺基酸序列，或使用同質（Consensus)序列之任意選 擇。本發明可依上述指針，或與上述相異之方法，如採用 (Ο不考慮次群之組合，自人抗體一級序列資料庫中，篩 選與供給者FR有最高同一性之重鏈、輕鏈FR之方法》在 此篩選方法，供給子與接受子於FR部份之胺基酸有至少 70%胺基酸相同性。依此策略，可降低由供給子移植胺基 酸殘基數目，因而減少引起HAMA反應。 由抗體分子一次元序列預測三次元構造之操作（以下稱 「分子模型」）之準確性有限，不常存於供給子次群之胺 基酸殘基之角色無法充分特定。如依Queen等人之方法， 在此種位置欲判斷應選擇供給子、接受子之那一胺基酸殘 基則一般很困難。依（c)之選擇法，可顯著降低這種判斷之 機會。 本發明者提供為維持供給子之CDR構造及功能之重要供 給子之源自FR之胺基酸之新穎鑑定方法、來更改良此人化 之方法。 選擇輕鏈、重鏈等人接受子分子後，供給子FR移植胺基 酸殘基之選擇方法如下。 若將供給子與接受子之胺基酸序列並排而在兩者之FR之 對應位置胺基酸殘基相異時，須決定該選擇那一殘基之必 要，但在此選擇須選擇不損及源自供給子之CDR之三次元 構造之必要。 -62 - 1359026

Queen等人在前述特表平4- 502408號中，提唱FR上之 胺基酸殘基若有一以上之如下特性時，則與CDR序列一起 移植至接受子之方法： 1) 接受子人FR領域中之胺基酸幾不發現於接受子同一 位置，而供給子相對胺基酸常見於接受子同一位置； 2) 該胺基酸近於一個CDR : 3) 該胺基酸於三次元免疫球蛋白3D模型中，CDR之約 3A以內有支鏈原子，可與抗原或人化抗體CDR反應。 • 上述2)所示殘基常有3)之特質，因此，本發明中省略 2)，並加入2個新要件。即本發明中，與CDR —起移植 之供給子FR上之胺基酸殘基具有如下要件時，自供給子 FR移植該胺基酸殘基： a) 接受子之FR中胺基酸少見於接其位置，而供給子相 對胺基酸常見於該位置； b) 該胺基酸在3D構造模型中，CDR構成胺基酸原子與 抗原或移植CDR環有相互作用； ® c)該位置爲規範群決定殘基； d)該位置構成重鏈及輕鏈之接觸面。 關於要件a)，依前述Kabat，當其見於同次群抗體之同 一位置90%以上之胺基酸者稱爲「常見」，當見於低於10 %之胺基酸者稱爲「少見j 。 關於要件c)，是否爲「該位置爲規範群決定殘基」，可 依前述Chothia而決定》 關於要件b) 、d)，需預先進行抗體變化區域之分子模 ⑧ -63 - 1359026 型。分子模型所用軟體可使用任何市售者，宜用AbM( Oxford Molecular 公司製造）。 分子模型預測準確性有限，本發明中，可分參照種種抗 體變化區域之X線結晶解析的實驗結果，將自分子模型所 得構造預測之確實性區別為2階段。 本發明中，當使用AbM等分子模型用軟體而構建之變化 區域3次元構造中，2個原子依凡得瓦力預測，當2個原 子距離低於凡得瓦半徑加0.5A總和時，其會相互接觸。當 主鏈及支鏈之醯胺氮和羰基氧等極性原子間距離低於2.9A (氫鍵平均長度）加0.5 A，則推定其間存在氫鍵^此外， 當2個異性原子距離低於2.85 A加0.5A，則推定其間形成 離子配對。 此外，由種種抗體變化區域之X線結晶構造解析的實驗 結果，可測定常與CDR接觸之FR位置，其與次群無關， 輕鏈爲 1、2、3、4、5、23、35、36、46、48、49、58、 69、71、88 之位置、重鏈爲 2、4、27、28、29、30、36、 38 、 46 、 47 、 48 、 49 、 66 、 67 、 69 、 71 ' 73 、 78 、 92 、 93 、94、103爲位置（上述胺基酸號碼係依Kabat.等人之定 義。此號碼系統亦用於後敘）。以分子模型分析時，此位 置之胺基酸殘基可與已知抗體2/3變化區域中CDR之胺基 酸殘基接觸。基此發現，b)之「該胺基酸在3D構造模型 中，CDR構成胺基酸原子與抗原或移植CDR環有相互作用 j乃指如下要件。 在分子模型中，FR可與CDR接觸之FR位置，在X線結 ⑧ -64 - 1359026 晶圖譜解析實驗中與預測FR與CDR接觸位置爲一致時， 則移植供給子之胺基酸基爲優先。 於任何其它例子中，則不需考慮要件b )。 d)之「該位置可構成重鏈及輕鏈之接觸面」乃指以下要 件。由種種抗體變化區域之X線結晶構造解析的實驗結果 ，可知輕鏈爲36、38、43、44、46、49、87、98號之胺基 酸殘基，重鏈爲37、39、45、47、91、103、104號之胺基 酸殘基，有高頻度地重鏈-輕鏈間之接觸。在分子模型中 ，當預測涉及於重鏈-輕鏈間接觸，其位置與上述位置一 致時，則移植供給子胺基酸爲優先。於任何其它例子中， 則不需考慮要件d )。 本發明之人化抗DC-STAMP抗體之重鏈及輕鏈變化區域 所編碼之DNA，可依以下述載方法製造。 例如60〜70核苷酸，將自該DNA部分核苷酸序列之複 數聚核苷酸片斷，與同義側及反義側相互不同經化學合成 ，將其後各聚核苷酸片斷煅合（anneal)，由DNA粘合酶粘 合，而得有所望人化抗DC-STAMP抗體重鏈及輕鏈變化區 域所編碼之DNA。 別法為令編碼接受子全部變化區域之胺基酸序列之DNA 由人淋巴細胞分離，在編碼CDR之領域，用業者周知方法 進行核苷酸取代，導入限制酶切斷序列。以相對限制酶切 斷該領域後，合成編碼供給子CDR之核苷酸序列，以DN A 粘合酶粘合，得編碼所望人化抗DC-STAMP抗體重鏈及輕 鏈變化區域之DNA。

-65 - 1359026 本發明中，宜以下述之重疊延伸PCR技術（參照Horton 等人，Gene, 21 61-68，（1989))，而得編碼所望人化抗 DC-STAMP抗體重鏈及輕鏈之變化區域之DNA。 即將編碼所望2種之胺基酸序列之2種DNA各名爲（a )及（B)。將（A)之5’區域煅合之20〜40核苷酸之同 義引子（以下此引子稱（C))及（B)之3’區域煅合之 20〜40核苷酸之反義引子（以下此引子稱（D))予以化 學合成。將（A)之3’區域20〜30核苷酸與（B)之5, 區域20〜30核苷酸予以連結，合成嵌合型同義引子（以下 此引子稱（E))及其互補反義引子（以下此引子稱（f) )。以含（A)之適當載體DNA爲基質，用同義引子（C )及嵌合型反義引子（F)進行PCR，得（A) 3,端上添加 (B) 5’端20〜30核苷酸之DNA (所得DNA稱（G))。 同樣地’以含（B)之適當載體DNA爲基質，用反義引子 (D)及嵌合型同義引子（E)進行PCR，得（B ) 5,端上 添加（A) 3’端20〜30核苷酸之DNA (所得DNA稱（H) )。所得（G)及（H)各帶有（G)3’端40〜60核苷酸 及（H) 5’端40〜60核苷酸之互補核苷酸序列。擴増反 應可使用含（G )及（Η )混合物而進行PCR，於第一個變 性步驟中（G)及（Η)成爲單股，其後煅合反應中DNA 殆全轉爲原形’但部份DNA因互補核苷酸序列領域煅合而 形成異源DN Α雙股。此後之延長反應，將突出之單股部分 予以修復，得（A)與（B)連結之嵌合型DNA (以下此 DNA稱（I)) 。（I)之基質可使用同義引子（C)與反義 1359026 引子（D)以PCR進行，擴増而得（I)。本發明中，編碼 抗人DC-STAMP小鼠單株抗體重鏈及輕鏈之CDR領域的 DNA，及編碼人免疫球蛋白IgG之FR領域的DNA，及編 碼人免疫球蛋白IgG分泌訊號之DNA，可以按情況由（A )及（B)施行上述連結反應。 對於目的胺基酸之密碼爲已知，可任意選用，例如考慮 使用基於宿主密碼運用頻率，依常法而選用密碼。改變部 份該核苷酸序列密碼可依常法，利用編碼欲修飾之合成寡 核苷酸而成之引子，依位置特定突變方法（site specific mutagenesis ) ( Mark, D. F., et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA，（ 1 9 84)8 1，5662-5666)等而進行。故化學合成各引子 時，可在設計各引子使引進預先點突變，而得編碼所望抗 DC-STAMP抗體重鏈及輕鏈變化區域之DNA。 將所彳寻本發明各DNA嵌入至表達載體，用以轉形原核生 物或真核生物宿主細胞。此表達載體一般含適當促進子及 基因表達相關序列，而使DNA於宿主細胞表達。 由上述方法易於製造高產率及高純度之重組抗DC-STAMP抗體。 (4)抗DC-STAMP完全人化抗體之製作 完全人化抗體係指有源自人染色體抗體基因序列之人抗 體。抗DC-STAMP完全人化抗體爲使用含有人抗體Η鏈及 L鏈基因之人染色體片斷之産生人抗體小鼠的方法（ Tomizuka, K.et al., Nature Genetics, (1977)16，1 3 3-143 ； Kuroiwa，Y.et.al., Nuc. Acids Res., (1998)26, 3447-3448 ；

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Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects,(1 999) 1 0, 6 9-73 (Kitagawa, Y.,Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers ； Tomizuka, K.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000)97, 722-727 )，由人抗體資料庫以噬菌體展示（phage display) 取得源自人抗體之方法（Wormstone， I. M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002)43 (7)， 2 3 01 -8 : Carmen, S. et. a 1., Briefings in Functional

Genomics and Proteomics,(2002)1 (2), 1 8 9-203 ；

Siri wardena, D. et.al·，Opthalmology, (2002)109 (3), 42 7-431等）而製得。 所製作人抗DC-STAMP抗體爲DC-STAMP有專一結合之 確認方法，宜使用例如爲評估小鼠免疫時抗體效價所進行 之ELISA法。 7 .含有抗DC-STAMP抗體之醫藥 由上述「6.抗DC-STAMP抗體之製造」記載方法所得抗 DC-STAMP抗體中，可得中和DC-STAMP生物活性之抗體 〇此中和DC-STAMP生物活性之抗體，具有活體內DC-STAMP生物活性，β卩可抑制破骨細胞之分化及/或成熟化 ，故可作爲醫藥，即破骨細胞分化異常起因之骨代謝異常 症之治療劑。 由活體外抗DC-STAMP抗體之DC-STAMP生物活性之中 和活性可由例如在DC-STAMP過度表達細胞中，測定細胞 之破骨細胞分化之抑制活性。例如培養有過度表達DC- -68 - ⑧ 1359026 、維生素κ2 (mentrenone)及鈣製劑等，但無特限。依骨 代謝異常之狀態及所期治療程度，可將2、3或其以上種類 之藥劑投與，也可將這些藥劑封入同一製劑中來一起供給 。這些藥劑與抗DC-STAMP抗體之基因也可封入同一製劑 中來一起供給。這些藥劑也可以治療用套組封入來一起供給 〇這些藥劑與抗DC-STAMP抗體也可分別供給。由基因治療 投與時，蛋白質性之骨疾病治療劑之基因與抗DC-STAMP 抗體之基因可同時或分別揷入促進子領域之下流，而導入 分別或同一載體》 對於抗DC-STAMP抗體或其片段結合骨疾病治療劑，則 可製造如 M.C.Garnet 「Targeted drug conjugates: principles and progress 」 ， Advanced Drug Delivery

Reviews，（200 1 )53，171-216記載之標的型藥物複合體。對 此目的，除抗體分子之外，只要不完全消失破骨細胞之認 識性，則任何抗體片段皆可適用、例如Fab、F(ab’）2、FV 等片段，本發明中可同樣使用抗體及該片段。抗DC-STAMP抗體或該抗體片段與骨疾病治療劑之結合樣式可爲 如 M.C.Garnet「Targeted drug conjugates: principles and progress」，Advanced Drug Delivery Reviews，（2001 )53, 171-2 16 、 G.T.Hermanson 「Bio conjugate Techniques j

Academic Press, California (1996) ' Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science ( 1 995)1 22，5 5 - 1 23 等記載之種種形態 。即抗DC-STAMP抗體與骨疾病治療劑以化學直接或寡胜

-70 - 1359026 肽等間隔子仲介之樣式，如與適當藥物載體仲介結合之樣 式。藥物載體可如脂粒及水溶性高分子。此藥物載體仲介 之樣式具體例爲包含抗體及骨疾病治療劑之脂粒，該脂之 混粒與抗體之結合樣式，及骨疾病治療劑與水溶性高分子 (分子量1000〜100000之化合物）之化學直接或寡胜肽等 間隔子（spacer)仲介之結合，如該水溶性高分子中與抗體結 合之樣式。抗體（或該片段）與骨疾病治療劑、脂粒及水 溶性高分子等藥物載體之結合可依如G.T.Hermanson「 Bioconjugate Techniques 」 Academic Press, California (1 996)、Putnam and J. Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity j Advances in Polymer Science ( 1 995)1 22, 55- 123記載之方法等業者周知方法而實施。骨 疾病治療劑之脂粒包含如 D.D.Lasic「Liposomes: From Physics to Applications」，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam (1 993)等記載之方法等業者周知方法而實 施。骨疾病治療劑之水溶性高分子之結合可依D. Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science (1995)122，5 5-123 記載方法等業者周知方法而實施。抗體（或該片段）與蛋 白質性骨疾病治療劑（或該片段）之複合體，可依上述方 法基因工程等業者周知方法而實施。 本發明提供含治療有效量之抗DC-STAMP抗體及藥理容 許稀釋劑、載體、可溶化劑、乳化劑、保存劑及/或補助 劑之醫藥組成物。 @ -71 - 1359026 鹽形成對離子、苄烷氯化銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、 苯乙醇、對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、洗必太、山 梨酸或過氧化氫等防腐劑、甘油、丙二醇或聚乙二醇等溶 劑、甘露糖醇或山梨糖醇等氣溶膠、懸浮劑、山梨聚糖酯 、聚山梨酯20及聚山梨酯80等聚山梨酯、三硝基甲苯（ triton)、胺丁三醇（tromethamine )、卵磷脂或膽固醇等 界面活性劑、蔗糖及山梨糖醇等安定化増強劑、氯化鈉、 氯化鉀及甘露糖醇·山梨糖醇等彈性増強劑、輸送劑、稀釋 劑、賦形劑、及/或藥學上補助劑。此製劑用物質之添加 量爲抗DC-STAMP抗體重量〇.〇1〜1〇〇倍，特宜爲〇」〜】〇 倍◊製劑中較佳醫藥組成物之組成可視業者，依疾病、適用 投與途徑等而決定。 醫藥組成物中賦形劑及載體可爲液體或固體。適當賦形劑 及載體爲注射用水或生理食鹽水、人工腦脊髓液等非經口 投與通常用物質。可用中性生理食鹽水及含血清蛋白之生理 食鹽水爲載體。醫藥組成物可含PH7.0〜8.5 Tris緩衝液及 pH4.0〜5.5乙酸緩衝液及山梨糖醇等其他化合物。本發明醫 藥組成物爲含有抗DC-STAMP抗體之醫藥組成物，及含抗 DC-STAMP抗體及一以上骨疾病治療劑之醫藥組成物，本 發明醫藥組成物可選擇適當純度組成爲適當藥劑，得凍乾 品或液體。含抗DC-STAMP抗體之醫藥組成物及含抗DC-STAMP抗體及一以上抗骨代謝異常治療藥劑之醫藥組成物 ，可用蔗糖等適當賦形劑以得凍乾品。 本發明醫藥組成物可調製成非經口投與用或經口由消化 -73 - ⑧ 1359026 管吸收用。製劑之組成及濃度可依投與方法而決定，本發明 醫藥組成物中，抗DC-STAMP抗體對DC-STAMP之親和性 ，即對DC-STAMP之解離定數（Kd値），有高親和性（ Kd値低），在人之投與量低時即可發揮藥效，基於此結 果可決定本發明醫藥組成物在人之投與量。當投與人型抗 DC-STAMP抗體至人時，投與量爲約0.1〜lOOmg/ k g，1 〜30日投與1回。 本發明醫藥組成物形態爲含點滴之注射劑、栓劑、經鼻 劑、舌下劑、經皮吸收劑等。 8·直接相互作用物質之探討 本發明之另一形式爲包含爲製得對DC-STAMP活性抑制 物質，以該蛋白質立體構造爲基礎之藥物設計的方法。此 類方法爲已知之推理藥物設計法、利用以硏發酵素活性等 功能，與配體、輔助因子、或DN A結合等效率來抑制活性 的化合已，例如已上市之作爲抗HIV劑之蛋白酶抑制劑。 本發明DC-STAMP參次元構造解析中可利用X光結晶解析 與核磁共振法等一般習知方法。DC-STAMP功能抑制物質 的硏發探索亦可有效利用電腦藥物設計（CADD )來設計》 此例如風濕性關節炎治療新穎基因組新藥，已知抑制AP -1功能之低分子化合物（國際專利申請公開W099/58515 號）等。由此等方法，得與DC-STAMP直接結合，或抑制 DC-STAMP與其他因子相互作用，而抑制DC-STAMP功能 之物質。 本發明另一目的爲關於與本發明DC-STAMP結合之聚胜 ⑧ -74 - 1359026 肽，即DC-STAMP合夥蛋白質。亦即本發明爲關於調節 DC-STAMP活性之合夥蛋白質的篩選方法》 此篩選方法之一爲在DC-STAMP中與被驗蛋白質試料接 觸，選擇與DC-STAMP結合之蛋白質的工程。此等方法爲 例如用精製DC-STAMP，與結合蛋白質作親和性精製。具 體之方法如將DC-STAMP與6個組胺酸序列之親和性標記 融合，將之與細胞萃取液（預先通入鎳-洋菜糖柱，通過此 柱之劃分），於4°C下培養12小時，然後於該混合物中加入 另外鎳-洋菜糖載體於4°C下培養1小時。將鎳-洋菜糖載體 以洗淨緩衝液洗淨後，加入l〇〇mM咪唑，將與DC-STAMP 專一性結合之細胞萃取液中蛋白質溶離精製，決定其結構 。依此，可精製與DC-STAMP直接結合之蛋白質，及不具 與DC-STAMP結合活性，但次單位與DC-STAMP直接結合 蛋白質形成複合體之間接與DC-STAMP結合之蛋白質（實 驗醫學別冊、生物科技手冊系列5「轉錄因子硏究法」215 -2 1 9 (羊土公司刊））。 其他方法可爲遠西方墨漬法（Far Western Blot)(實驗醫 學別冊、「新基因工學手冊」76 — 81(羊土公司刊））及 使用酵母菌與哺乳類動物細胞之二雜交系統法（實驗醫學 別冊、「新基因工學手冊」66 — 75 (羊土公司刊）、「 Chechmate ·哺乳類.二雜交系統」（Promega公司製造） )進行選殖，但不限於此類方法。 依此，爲得與DC-STAMP直接或間接相互作用之合夥蛋 白質cDNA，可利用DC-STAMP與該合夥蛋白質相互作用

-75 - 1359026 之抑制物質進行功能篩選。具體而言，例如將DC-ST AMP 與麩胱甘硫轉移酶製成融合蛋白質，於抗麩胱甘硫轉移酶 抗體被覆之微平板結合後，將生物素化之該合夥蛋白質與 該融合蛋白質接觸，利用與該融合蛋白質結合之抗生蛋白 鏈菌素化鹼性去憐酸酶檢測。於添加生物素化之該合夥蛋 白質時，加入被驗物質，選擇融合蛋白質與該合夥蛋白質 結合促進或抑制物質。由此方法，可得與融合蛋白質直接 作用之物質或與該合夥蛋白質直接作用之物質。 於融合蛋白質與該合夥蛋白質間接結合，有其他任何因 子介入時，例如含該因子細胞萃取液存在下，以上述相同 測定方法施行。該情形下，則亦可能選擇對該因子作用之 物質。 所得合夥蛋白質，具促進DC-STAMP功能活性時，依已 記載應用DC-STAMP基因表達載體試驗方法，可進行可作 爲骨代謝異常治療劑、例如骨質疏鬆症治療劑候補物質之 篩選。所得合夥蛋白質具抑制DC-STAMP功能活性時，此 等抑制因子所編碼核苷酸序列之聚核苷酸，可作爲骨代謝 異常基因治療用。 此等聚核苷酸可例如鑑定抑制因子之胺基酸序列分析， 合成將該胺基酸序列所編碼之核苷酸序列而成之寡核苷酸 探針來進行cDNA庫與基因組庫之篩選而得。具DC-STAMP功能抑制活性之胜肽，若選自逢機合成之人工胜肽 庫時，該DNA可化學合成該胜肽胺基酸序列所編碼之核苷 酸序列。

-76 - 1359026 基因治療係以編碼有該抑制因子之基因，在例如病毒載 體中重組，將有該重組病毒載體之病毒（無毒化者）在患 者予以感染。在患者體內可産生抗骨破壞因子，有抑制破 骨細胞分化之功能，而可治療骨代謝異常。 基因治療劑在細胞內導入之方法，可利用病毒載體之基 因導入方法、或非病毒性基因導入方法（日經科學，1 994年 4月號，20-45頁、實驗醫學増刊，12(1 5)(1994)、實驗醫學別 冊「基因治療基礎技術j，羊土公司（1996 ))。 以病毒載體作基因導入方法爲例如反轉錄病毒、腺病毒 、類腺病毒、泡疹病毒、牛痘病毒、水痘病毒、小兒麻痺 病毒、Sindbis病毒等DNA病毒或RNA病毒，將編碼DC-STAMP抑制因子或其變異體之重組DNA導入等。宜用反 轉錄病毒、腺病毒、類腺病毒、牛痘病毒之方法。非病毒 性之基因導入方法爲如將表達質體直接投與至肌肉內之方 法（DNA疫苗法）、微脂粒法、脂感染法、微注射 (Microinjection)法、磷酸鈣法、電穿孔（Electroporation)法 等’特宜爲DNA疫苗法、微脂粒法。 以基因治療劑實際作爲醫藥使用者，可將DNA直接導X 體內之活體內（in vivo )法，或自人等取出細胞至體外以 DNA導入該細胞，再將該細胞植入體內之活體外法（ex vivo)(日經科學，1 994年4月號，20-45頁、月刊藥事 ，36(1)，23-48( 1994)、實驗醫學増刊，1 2 ( 1 5)(1 994))。 例如’該基因治療劑以活體內投與時，可依疾病、症狀 等，自靜脈、動脈、皮下、皮內、肌肉內等，以適當投與 -77 - 1359026 射 △口 注融 般膜 1 或 依粒 可脂 劑微 療爲 治。 因體 基載 該用 時入 與加 投可 法亦 內時 體要 活必 ο ， 與行 投施 徑等 途劑 微脂粒（仙台病毒-微脂粒等）形態時，可爲懸浮劑、冷凍劑 、離心濃縮冷凍劑等微脂粒製劑。 將與序列表之序列號碼1所示核苷酸序列，與其互補之 核苷酸序列或與該序列部分序列互補之核苷酸序列，作爲 反義治療使用。反義分子爲選自與序列表之序列號碼1、3 及5所示核苷酸序列之核苷酸序列部份互補，通常爲15〜 30寡核苷酸之DNA，或其磷醯硫代酸酯，膦酸甲酯或嗎啉 基衍生物等安定DNA衍生物，2’ _0—院基RNA等安定 RN A衍生物。此等反義分子可以例如微量注入、或利用有 反義序列之載體而表達等，以本發明技術範圍中習知方法 導入細胞。此等反義療法，可增加由序列表中序列號碼1 所示核苷酸序列所編碼蛋白質之活性，而作爲治療疾病。 亦可用雙股之短鏈RNA ( siRNA )等方法（Genes and Developments、2001 年 1 月 15 曰、第 15 卷、第 2 號、 P.188- 200)。例如製作對DC-STAMP基因之siRNA，可 用文獻記載方法導入，在DC-STAMP過度表達所引起骨代 謝異常爲起因疾病之治療劑》 含有上述反義寡核苷酸及/或siRNA之醫藥組成物可與 醫藥容許載體混合等已知方法製造。含反義寡核苷酸之醫 藥載體及製造方法可如 Applied Antisense Oligonucleotide Technology( 1998 Wiley — Liss、Inc.)記載。含反義寡 核苷酸及/或siRNA之製劑，可單獨或可混合適當藥理容 -78 - ⑧ 1359026 許賦形劑、稀釋劑等，以錠劑、膠囊劑 糖漿劑等口服，或以注射劑、栓劑與貼 外用劑等非經口服。此製劑爲用賦形劑 、葡萄糖、甘露糖或山梨糖等糖衍生物 薯澱粉、-澱粉、糊精等澱粉衍生物 維素衍生物；阿拉伯膠：葡聚糖：聚三 形劑；及輕質矽酐、合成矽酸鋁、矽酸 矽酸鹽衍生物；磷酸氫鈣等磷酸鹽；碳 酸鈣等硫酸鹽等無機系賦形劑）、滑劑 脂酸鈣或硬脂酸鎂等硬脂酸金屬鹽；滑 膠、鯨蠟等蠟類；硼酸；硼酸；己二酸 ;乙二醇；富馬酸；苯甲酸鈉；DL白肢 或十二基硫酸鎂等十二基硫酸鹽；矽酐 酸類；及上述澱粉衍生物結合劑（ 、羥丙基甲基纖維素、乙烯吡咯啶酮、 賦形劑之化合物）、崩散劑（例如低取 、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣、內 素鈉等纖維素衍生物；羧甲基澱粉、羧 聚乙烯吡咯啶酮等化學改質之澱粉•纖 (例如膨土、矽酸鎂鋁等膠狀粘土；氫 等金屬氫氧化物；十二基硫酸鈉、硬脂 活性劑；苄烷氯化銨等陽離子界面活性 醚、聚氧伸乙山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖 界面活性劑）、安定劑（對羥苯甲酸甲 、顆粒劑、散劑或 劑等非經口服，或 (例如乳糖、白糖 :玉米澱粉、馬鈴 ;結晶纖維素等纖 葡萄糖等有機系賦 鈣、偏矽酸鋁鎂等 酸鈣等碳酸鹽；硫 (例如硬脂酸、硬 石；膠狀矽石；蜂 :硫酸鈉等硫酸鹽 酸；十二基硫酸鈉 、矽酸水合物等矽 例如羥丙基纖維素 聚乙二醇、及上述 代度羥丙基纖維素 部交聯羧甲基纖維 甲基澱粉鈉、交聯 維素類）、乳化劑 氧化鎂、氫氧化鋁 酸鈣等陰離子界面 劑；及聚氧伸乙烷 脂肪酸酯等非離子 酯、對羥苯甲酸丙 -79- 1359026 ，特爲16— 18個碳原子，飽和（14 一 18個碳原子鏈內部 無雙鍵）。代表性磷脂質包含磷脂醯膽鹼、二·十六醯磷脂 醯膽鹼及二-十八醯磷脂醯膽鹼。 包含脂粒之膠質系之標的化可爲被動或自動。被動之標 的化可利用將含有竇狀毛細血管之臟器向網內系細胞分布 之脂粒本來之傾向來達成。自動標的化有例有將病毒之蛋 白質被覆（Morishita et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA， (1 993)90，8474 )、單株抗體（或其適當結合部分）、糖、 糖脂質或蛋白質（或其適當寡胜肽片段）等特定之配體向 脂粒結合、或爲達成向天然存在之局部存在部位以外之臟 器及細胞型分布而改變脂粒之組成來修飾脂粒之手法等。 標的化之膠質系之表面可以種種方式修飾。在以脂粒標的 之輸送系，爲維持與脂質雙重層之緊密匯合中標的配體， 可向脂粒之脂質雙重層吸入脂質基。爲將脂質鏈與標的配 體結合，可使用種種連結基。本發明寡核苷酸之輸送在所 望細胞上與支配地呈現之特定細胞表面分子結合之標的配 體可爲例如（1)輸送與由所望細胞支配的表達之特定細胞 受體結合之荷爾蒙、成長因子或其適切之寡胜狀片段、或 (2)與標的細胞上支配的呈現之抗原性表位專一性地結合 之多株抗體或單株抗體，或其適當片段（例如FAB ; F ( AB·) 2 ) 。2種或其以上之生物活性劑可與單一脂粒內部 複合而投與。亦可追加使內容物細胞內安定性及/或標的 化提高之藥劑至膠質分散系。 使用量可視症狀、年齡等而異，經口投與時，每回下限 1359026 lmg (宜 30mg)、上限 2000mg (宜 15 OOmg ) ’ 注射時， 每回下限 0.1 mg (宜 5mg )、上限 1 OOOmg (宜 5 OOmg ) > 經皮下注射、肌肉注射或靜脈注射而投與。 以下由實施例具體地説明本發明，但本發明並不限於實 施例。下述實施例中有關基因操作之各操作無特限，可依 Molecular Cloning ( Sambrook，J.，Fritsch，E.F.及 Maniatis， T.著，Cold SpringHarbor Laboratory Press > 1989 年刊）之 方法進行，在使用市售之試劑及套組時，可依市售品指示 書進行。 〔參考例1〕RAW-D細胞及RAW-N細胞之構築 a)限界稀釋培養法而取得RAW-D細胞及RAW-N細胞 已知將源自小鼠單核細胞株RAW264.7以可溶性RANKL 刺激，可强力誘導酒石酸耐性酸去磷酸酶（以下稱「TRAP 」）及組織蛋白酶（cathepsiiOK等破骨細胞分化標記基因之 表達（Hsu et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，（1999)96, 3540-3545 )。因此，RAW264.7 細胞以 RANKL 刺激，則 向破骨細胞分化誘導。自RAW264.7細胞之母株RAW264 細胞，對RANKL及TNF-ct有強力感受性，試由此刺激取 得破骨細胞分化次株細胞（Watanabe et al.，J_ Endocrinol.， (2004)1 80，1 93-201 ) 。RAW264 細胞爲購自 European

Collection of Cell Culture (目錄號碼 85062803)。將 RAW264細胞用含10%牛胎兒血清之α -MEM培養基，依常 法以限界稀釋在96穴平板中按種100//1。培養10〜14日 ，採取形成之選殖株。將各選殖株以含10%牛胎兒血清之 ⑧ -82 - 1359026 α -MEM培養基調製得4.5x1 04細胞/ml，在96穴平板中接 種1 50从1/穴，添加人R AN KL (Pep ro Tech公司製造）終 濃度20 ng/ml及人TNF- a ( Pepro Tech公司製造）終濃度 1 ng/ml »培養 3日後，用白血球酸式磷酸酯酶套組（ Sigma公司製造），依所附說明書進行TRAP染色，確認 有無形成TRAP陽性多核破骨細胞。此一連之依限界稀釋 培養法之選殖操作可就各選殖重複2回。 結果，取得由RANKL及TNF-α刺激有效令破骨細胞分 化之RAW-D細胞，及由RANKL及TNF- β刺激完全不使 破骨細胞分化之RAW-N細胞。 b )由TRAP染色對RAW-D細胞及RAW-N細胞破骨細胞 分化指向性之探討 將RAW-D細胞及RAW-N細胞，用RANKL及TNF-α對 破骨細胞有誘導作用之物質刺激時之反應進行調査。將 RAW-D、RAW-N及 RAW264在含 10%牛胎兒血清之α -MEM培養基調製得4.5x1 04細胞/ml後，在96穴平板中接 種150#1/穴，添加人TNF-α (Pepro Tech公司製造）終 濃度1 ng/ml、人RANKL ( Pepro Tech公司製造）終濃度 10、20、40、80 ng/ml。培養3日後，用白血球酸式磷酸 酯酶套組（Sigma公司製造），依所附說明書進行TRAP 染色，計測所形成TRAP陽性多核破骨細胞數。結果， RAW-D可依所添加RANKL濃度，而形成TRAP陽性多核 破骨細胞（第1圖）。此外、RAW-N及母株細胞RAW264 中，添加RANKL並不造成TRAP陽性破骨細胞形成。 ⑧ -83 - 1359026 〔實施例1〕RAW-D及RAW-Ν中，小鼠DC-STAMP之 mRNA表達（北方墨漬法解析） a) 全RNA之萃取 將RAW-D細胞及RAW-Ν細胞，含10%牛胎兒血清之α-ΜΕΜ培養基調製得7x1 04細胞/ml，在24穴平板接種500 // 1/穴，添加人RANKL ( Pepro Tech公司製造）終濃度20 ng/ml、人 TNF-α (Pepro Tech 公司製造）終濃度 2 ng/ml 及小鼠ΜΙΡ-1α (Pepro Tech公司製造）終濃度1 ng/ml， 培養3日。同樣地，亦進行未添加RANKL ( Pepro Tech公 司製造）、人TNF-α及小鼠ΜΙΡ-1α之培養。 培養終了後，用全RNA萃取用試劑（Trizol試劑：因比 多建（Invitrogen)公司製造），依所附說明書，將在各條件 培養之RAW-D及RAW-Ν萃取全RNA。將回收之全RNA 貯於-8 0 °C。 b) 全RNA之電泳及墨漬 將回收之全RNA在RNA試料緩衝液（lxMOPS緩衝液（ lxMOPS 緩衝液含 20 mMMOPS、8 mM 乙酸鈉、1 mMEDTA )、50%甲醯胺、18 μ g/ml溴苯酚藍、5.8%甲醛、5%甘油 )調製得0.5# g/μ 1 ’於65 °C下加熱15分，於冰上急冷5 分。將試料液20 a 1在含甲醛之電泳用1%瓊脂糖膠（lx MOPS緩衝液、1.2%瓊脂（Sigma公司製造）、6%甲醛） 穴中注入並電泳》電泳爲在含lxMOPS緩衝液之電泳層中 ，於100V下通電約3小而進行》 電泳終了後、瓊脂糖膠中RNA以毛細管轉移法（ 1359026

Maniatis, T. et al., in "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY, (1 982))，轉 移至尼龍膜（HybondN+、Amersham. Pharmacia公司製造 )過夜（轉移用溶液爲20xSSC) »將膜以2xSSC洗淨5分 ’風乾’以父叉連結用紫外線照射裝置（Stratalinker 2400 、Strategene公司製造）之紫外線照射（300 mJ/cm2 )以固 定 RNA。 c)探針之調製 將小鼠DC-STAMPA T7 cDNA (序列表之序列號碼：5、 GenBank收集號碼：AB1 09561 )之核苷酸號碼457〜1208 所示核苷酸序列，在pGEM-T Easy載體（Promega公司製 造）ΤΑ選殖部位中揷入得質體DNA，利用ΤΑ選殖部位附 近之Ncol部位，以Ncol (寶酒造）切割得直鏈狀DNA。 使用DIG RNA labeling mix (Roche診齡公司製造）及SP6 RNA聚合酶（Roche診斷公司製造），依所附說明書進行 ，以DIG ( digoxigenin)標記調製反義RNA探針。將此探 針調製液中添加20單位之RNase-游離 DNase I( Roche 診斷公司製造），分解模板DNA。所調製之RNA探針相當 於序列表之序列號碼3 (小鼠DC-STAMP cDNA)核苷酸號 碼457〜1078及1 247〜1376序列，可用以檢定DC-ST AMP 及 DC-STAMPAT7 二者之 mRNA。 d )雜交 將 b)所作成膜在 6 ml雜交溶液（DIG Easy Hyb Granules，依所附說明書於再蒸餾水中溶解：Roche診斷 ⑧ -85 - 1359026 公司製造）中’在65 °C下培養15分（預雜交）後，在含 DIG標記RNA探針之6 ml雜交溶液中，於65。(：下培養16 小時。其後，將膜在含2xSSC、0.1%SDS溶液中，於室溫 下洗淨5分（2回），再於含〇_5xSSC，0.1%SDS溶液中，於 65 °C洗淨30分（2回）。再將膜在Blocking溶液（Blocking reagent，依所附說明書，於馬來酸緩衝液溶解·· Roche診 斷公司製造）中處理30分後，以含鹼性去磷酸酶標記抗 digoxigeninFab 片斷（ 0.075 單位/ml) (Roche 診斷公司 製造）之Blocking溶液處理30分。以洗淨緩衝液（5 mM 馬來酸緩衝液 pH7.5、150 mM NaCl、0.3% Tween 20)洗 淨15分，洗淨3回，添加發光基質CDP-Star ( Roche診 斷公司製造），以發光分析機（富士軟片公司製造、LAS-1000 plus)進行解析。 由其結果，RAW-D在不添加RANKL及TNF- α時，則不 表達小鼠DC-STAMP，當添加RANKL及TNF-α時，小鼠 DC-STAMP之表達量有顯著地增加（第2圖）。更添加 ΜΙΡ-1α，小鼠DC-STAMP之表達量亦不增加。 RAW-N則不管有無添加RANKL及TNF- a，皆不表達 DC-STAMP。對照組係同法求出小鼠甘油醛-3-磷酸鹽去氫 酶（GAPDH )之表達量。 〔實施例2〕RAW-D中小鼠DC-STAMP之mRNA表達（ RT-PCR 解析） 將RAW-D以含10%牛胎兒血清之α-ΜΕΜ培養基調製7χ 1〇4細胞/m卜種於24穴平板500 // 1/穴，加入人RANKL (

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Pepro Tech公司製造）至終濃度20 ng/ml、人TNF-α ( Pepro Tech公司製造）至終濃度2 ng/ml及小鼠ΜΙΡ-1 α ( Pepro Tech公司製造）至終濃度1 ng/ml，培養0、4、8 ' 16、32、48、72 小時。 添加全RNA萃取用試劑（Trizol試劑：因比多建公司製 造），依所附說明書進行，在各培養時點萃取RAW-D之全 RNA。所回收全RNA貯於-80°C直到使用。用1 V g全RNA 及 1 // 1 oligo(dT)18 引子（0.5/z g/y 1)在水 11 /z 1 中，於 7 0°C加熱10分後，在4°C保溫。此溶液中加4 a 1 5xlst Strand緩衝液（因比多建公司製造）、1//1 10mM dNTPs、 2/zl 0.1M 二硫蘇糖醇、1//1 Superscript II 反轉錄酵素（ 200U//Z1、因比多建公司製造）、l/zl水，使全量爲20仁1 ，於42°C反應1小時後，於70°C加熱10分而在4°C保溫 〇 將所製作單股cDNA，用以下引子之組合予以擴増。 PCR條件： 小鼠DC-STAMP及小鼠DC-STAMPA T7擴増用引子： 5’-aaaacccttg ggctgttctt-3’（ mDC-STAMP-F :序列表之序 列號碼7) 及 5’-cttcgcatgc aggtattcaa-3’（ mDC-STAMP-R :序列表之 序列號碼8 )、 小鼠組織蛋白酶K擴増用引子： 5’-gagggccaac tcaagaagaa-3’（mcatK-F:序列表之序列號 1359026 碼9) 及 5’-gccgtggcgt tatacataca-3’（mcatK-R:序列表之序列號 碼 10 )、 小鼠TRAP擴増用引子： 5’-cagctgtcct ggctcaaaa-3’（mTRAP-F:序列表之序列號 碼1 1 ) 及 5’-acatagccca caccgttctc-3’（mTRAP-R:序列表之序列號 碼 1 2 )、 小鼠GAPDH擴増用引子： 5’-aaacccatca ccatcttcca-3’（mGAPDH-F:序列表之序列 號碼1 3 ) 及 5’-gtggttcaca cccatcacaa-3’（mGAPDH-R:序列表之序列 號碼14)。 使用加熱循 _器（GeneAmp PCR System 9700、Perkin Elmer日本· Applied Biosystem公司事業部製造），依以 下條件進行PCR。反應中使用鈾Taq DNA聚合酶（因比多 建公司製造）。加入各8 pmol之引子、20 ng單股cDNA 、0·5μ1 之 10x 反應緩衝液、0_2/zl 之 50 mM MgCh、〇·4 仁 1 之各 2.5 mM dNTP、0.05#1 之 5 單位/#1 Taq DNA 聚 合酶，以蒸餾水調製得5 μ 1反應液。將反應液在94°C加熱 2分、94°C加熱〇·5分、65t加熱1分、72°C加熱1分之溫 ⑧ -88 - 1359026 度下，循環操作30回後，於72 °C加熱10分，貯於4°C。 將全反應液在2.0%瓊脂糖膠進行電泳。 DC-STAMP基因之表達在添加RANKL、TNF - α及MIP-1 α ’ 8小時後開始表達上昇，表達量上昇持續72小時（第 3圖）》第3個表現子（Exon)短之剪接變化株之DC-STAMP △ T7 ’在RANKL、TNF- α及ΜΙΡ-1 α添加16小時後表達 增加。已知爲破骨細胞標記分子之組織蛋白酶Κ及TRAP 基因，也於16小時後表達增加。第3圖中，上側數値爲添 加RANKL、TNF-α及ΜΙΡ-1α後經過之小時數，右側爲各 基因以PCR反應擴増産物之大小以鹼基對長度表示。 〔實施例3〕源自小鼠骨髓之初代培養細胞中小鼠DC-STAMP 之 mRNA 表達（RT-PCR 解析） 將源自小鼠骨髓之初代培養細胞，在活性型維生素〇3存 在下培養，可出現多數 TRAP陽性多核破骨細胞（ Takahashi et al., Endocrinology, (1 988) 1 22, 1 373- 1 382 ) ° 將6週齡雄性DDY小鼠以乙醚麻醉下頸椎脫臼而安樂死 ，取出大腿骨及脛骨。除去軟組織後，在大腿骨或脛骨兩 端切除，用25號注射針之注射筒，用不含血清之α -MEM 培養基自骨髓中注入，採取骨髓細胞。計測細胞數後，用 含15%牛胎兒血清之α-ΜΕΜ培養基調製2xl06細胞/ml， 置於24穴平板中500 y 1/穴，添加活性型維生素D3 (

Biomol公司製造）終濃度ΐχΐ(Γ8 Μ，培養1、3、5、6日 〇 用全RNA萃取用試劑（Trizol試劑：因比多建公司製造 ⑧ -89 - 1359026 )，依所附說明書進行，在各培養時點萃取細胞之全Rna 。所回收全RNA貯於-80°C直到使用。 RT-PCR 反應可用 RNA LA PCR 套組（AMV)Verl .1 (寶生 技薬品公司製造）來進行。加2#1 2 5mM MgCl2、1 v 1 10x RNA PCR 緩衝液、1 /2 1 dNTP Mix(各 lOmM)、0.25 μ 1 RNase 抑制劑（40 U//z 1)、0.5 /z 1 反轉錄酵素（5 U/ μ 1 ) 、0.5//1 Oligo dT 銜接引子（2.5 p mo 1///1)、1// g 全 RNA， 以無RNase之水調製lOjc/1之反應液。將反應液在5 0°C加 熱25分後，於99〇C加熱5分，在4°C保溫。將此單股 cDNA依實施例2記載之引子之組合予以擴増。 使用加熱循環器（GeneAmp PCR S y stem 9 7 00 )，依以 下條件進行RT-PCR。將含cDNA之反應液5 /z 1中，加1.5 "1251111^1^§(：12、2"110><1^?。11緩衝液11(]^£2+游離） 、0.125 // 1 Takara LA Taq (5 U/ # 1)、引子組（終濃度各 l/ζΜ)，以再蒸餾水作成25//1，調製反應液。將反應液 在94°C加熱2分後、94°C下30秒、60°C下30秒、72°C下 30秒之溫度循環25回，在4°C保溫。其後，將反應液9/z 1 在2.0 %瓊脂糖膠中電泳。 結果，DC-STAMP基因於活性型維生素D3添加第1日僅 少表達，但單核之破骨細胞前驅細胞形成之第3日有顯著 表達’在多核化盛行之第5、6曰也維持顯著之表達（第4 圖）。 DC-STAMPAT7之DC-STAMP表達量雖低，但表達量之 變化呈如同DC-STAMP之時間經過。第4圖中，上側數値

-90 - 1359026 爲活性型維生素D3添加後經過之日數。 〔實施例4〕兔子抗小鼠DC-STAMP多株抗體之製作 在小鼠DC-STAMP胺基酸序列（序列表之序列號碼：4 ; GenBank收集號碼：AB 1 09560 )中，於第6號至第7號膜 貫通組域間位置，以由胺基酸號碼3 30〜343所示胺基酸序 列之胜肽為基礎，試製小鼠DC-STAMP蛋白質部分胜肽。 合成於前述序列之N端加1個半胱胺酸殘基之部分胜肽： Cys Ser Leu Pro Gly Leu Glu Val His Leu Lys Leu Arg Gly Glu (序列表之序列號碼：15 ) 將此胜肽以抗原刺激性載體蛋白質（即KLH ;無脊椎動物 之血氰蛋白），由MBS (馬來醯亞胺-苄醯氧丁二醯亞胺） 法，作成複合體後在兔子免疫，依常法得兔子抗血清。將 此抗血清用免疫使用部分胜肽製得之胜肽親和性柱來精製 ，得兔子抗小鼠DC-STAMP多株抗體。因DC-STAMPAT7 (GenBank收集號碼AB 1 0956 1 )也具有此胜肽序列，故本 抗體與DC-STAMP及DC-STAMP △ T7之兩方結合。將此胜 肽序列與人DC-STAMP胺基酸序列（序列表之序列號碼： 2、GenBank收集號碼：NM_030788 )中胺基酸號碼330〜 3 43所示序列相比較，則因334號之Leu (小鼠）僅爲於 Phe (人），341號之Arg (小鼠）變化爲His (人），故 本抗體與人DC-STAMP結合可能性高。 〔實施例5〕源自新生仔小鼠脛骨之破骨細胞之免疫染色 a)源自新生仔小鼠脛骨破骨細胞之採取 自1日齡DDY小鼠取出脛骨，除去軟組織後，以含15% 1359026 牛胎兒血清之α -MEM培養基中，用解剖用剪刀切割成碎 肉狀。快速混合使細胞懸浮，種於Chamber slide ( Nalge • Nunc In tern at i o nal公司製造）。培養1小時後，使用玻 片接種之多核細胞爲破骨細胞。 b)免疫染色中DC-STAMP蛋白質之表達 將a)所得破骨細胞用4%對甲醛溶液，於室溫進行固定 反應20分，以磷酸緩衝液（pH7.4)洗淨4回後，以含3% 羊血清之磷酸緩衝液（PH7.4 )，於室溫下阻斷 (Bl〇Cking)30分。移除阻斷液後，添加實施例4中製作之 含兔子抗小鼠DC-STAMP多株抗體lOjtzg/ml磷酸緩衝液（ 含1 %馬血清），於室溫反應30分。以未免疫之兔子IgG抗 體（DAKO公司製造）爲陰性對照，依同樣操作。以含1% 馬血清之磷酸緩衝液洗淨4回，用生物素化羊抗兔子IgG 抗體（Vector· Laboratories公司製造）爲二次抗體，於室 溫下反應30分。以磷酸緩衝液洗淨4回，用ABC-AP套組 (Vector . Laboratories公司製造），依所附說明書，進行 呈色反應。其結果，因與抗DC-STAMP抗體反應之破骨細 胞中有強染色，故顯示源自新生仔小鼠脛骨之破骨細胞中 有DC-STAMP之表達。使用陰性對照之對照組抗體時，破 骨細胞全不被染色。 〔實施例6〕新生仔小鼠下顎骨組織之免疫染色 a)新生仔小鼠下顎骨組織標本之製作 將1日齡DDY小鼠予以乙醚麻醉，以含4%對甲醛之磷 酸緩衝液（pH 7.4 )自左心室注入以灌流固定。取出下顎 ⑧ -92 - 1359026 骨，在前述含4%對甲醛之磷酸緩衝液（PH 7.4)中浸漬’ 於41下予以固定反應12小時，以磷酸緩衝液洗淨3回後 ，再於4°C磷酸緩衝液洗淨過夜。用i〇%edta (伸乙二胺 四乙酸），於4°C進行1週之脫灰反應。以含30%蔗糖之 磷酸緩衝液於4°C洗淨過夜，用OCT化合物（Sakura Fine tec公司製造）來包埋，用含有乾冰之異戊烷凍結。將所製 作包埋塊用切片機（Leica公司製造）切成10//m薄片， 製作下顎骨組織切片。 b)免疫染色中DC-STAMP蛋白質之表達 將a)所製作下顎骨組織切片，風乾除去水分後，以含 0.3%過氧化氫之甲醇在室溫反應30分，以除去內因性過 氧酶活性。以磷酸緩衝液洗淨3回後（室溫·各5分）， 用含10%驢血清之磷酸緩衝液，在室溫反應30分來阻斷 。移除阻斷液後，添加含實施例所製作兔子抗小鼠DC_ STAMP多株抗體1〇4£/1111之磷酸緩衝液（含2%驢血清）， 於濕潤箱中在4 °C反應過夜。以未免疫兔子IgG抗體（ DAKO公司製造）爲陰性對照，依同樣操作。以磷酸緩衝 液洗淨3回後（室溫•各5分），用生物素化驢抗兔子 IgG 抗體（Jackson · Immuno Research · Laboratories 公司 製造）以磷酸緩衝液稀釋200倍作爲二次抗體，於室溫反 應1小時，以磷酸緩衝液洗淨3回後（室溫•各5分）， 與將過氧酶標記抗生蛋白鏈菌素複合體（DAKO公司製造 )以蒸餾水稀釋300倍者在室溫反應30分。以磷酸緩衝液 洗淨3回後（室溫·各5分），力□ DAB受質套組（Vector 1359026 • Laboratories公司製造），依所附說明書，進行呈色反應 。由此結果，可與抗DC-STAMP抗體反應之下顎骨組織切 片，只在破骨細胞中有強染色，顯示源自新生仔小鼠下顎 骨之破骨細胞中有DC-ST AMP之表達。使用陰性對照之對 照組抗體時，細胞不被染色。 〔實施例7〕RAW-D細胞之siRNA抑制破骨細胞分化 a )對小鼠DC-STAMP基因之siRNA的製作 在同義鏈、反義鏈各3’端上添加尿核苷2鹼基（UU)， 各小鼠 DC-STAMP siRNA 用 Silencer siRNA 套組（Ambion 公司製造），依所附說明書進行轉錄。siRNA調製所必需 模板寡DNA系如下。 製作對第3表現子5’側（於由人DC-STAMP cDNA序列 所推測胺基酸序列，相當於第7膜貫通領域）之siRNA及 加入變異之siRNA，再用如下模板寡DNA之組合。 siRNA #1 35 模板： 5’-aatactagga ttgttgtctt ccctgtctc-3’（mDC-STAMP-#135-AS :序列表之序列號碼16) 及 5 ’-aagaagacaa caatcctagt acctgtctc-3’（mDC-STAMP-#135-S:序列表之序列號碼17)、 變異siRNA #135模板： 5 *-aatactagga gcgttgtctt ccctgtctc-3* ( mDC - S T AMP-# 1 3 5 -Mut-AS :序列表之序列號碼18'核苷酸號碼11由t變爲g ，12由t變爲c) 1359026 及 5，-aagaagacaa cgctcctagt acctgtctc-3’ ( mDC-STAMP-#135-Mut-S :序列表之序列號碼19、核苷酸號碼12所示 核苷酸由a變爲g，13所示核苷酸由a變爲c)。 第3表現子中上述siRNA(#135)部分之3’側位置，對小 鼠DC-STAMP特有cDNA序列部分之siRNA及變異siRNA 之製作，用如下模板寡DNA之組合。 siRNA *6 模板：

5 *-aattctcgtg tcagtctcct tcctgtctc-3* ( mDC-ST AMP-*6-AS :序列表之序列號碼20) 及 55 -aaaaggagac tgacacgaga acctgtctc-3，( mDC-STAMP-*6- S :序列表之序列號碼2 1 )、 變異siRNA *6模板： 5’-aattctcgta ccagtctcct tcctgtctc-3，（ mDC-STAMP-*6-Mut-AS :序列表之序列號碼22、核苷酸號碼9所示核苷酸 由g變爲a，10所示核苷酸由t變爲c) 及 5’-aaaaggagac tggtacgaga acctgtctc-3’（ mDC-STAMP-*6_ Mut-S :序列表之序列號碼23、核苷酸號碼13所示核苷酸 由a變爲g，核苷酸號碼14所示核苷酸由c變爲t) b ) RAW-D細胞之siRNA所抑制破骨細胞分化 將RAW-D在含10%牛胎兒血清之α -MEM培養基調製得 4.5x1 04細胞/ml，接種在96穴平板80// 1/穴。次日換成 1359026 OPTI-MEM I培養基（因比多建公司製造）80y，將a)製 作之DC-STAMP siRNA及變異siRNA調製得終濃度0.1、1 、5nM，用siPORT Lipid(Ambion公司製造）爲轉染試劑 ，依所附說明書進行細胞轉染（添加20 #1)。再者，以不 含siRNA，有轉染試劑者爲對照組（Mock)。在C02培養 箱中轉染4小時後，添加含人RANKL ( Pepro Tech公司製 造）40 ng/ml、人 TNF-α (Pepro Tech 公司製造）2 ng/ml 及20 %牛胎兒血清之α-Μ EM培養基100/zl。培養3日後 ，用白血球酸式磷酸酯酶套組（Sigma公司製造），依所 附說明書進行TRAP染色，計測所形成TRAP陽性多核破 骨細胞數。DC-STAMP siRNA#135添加濃度爲 0.1、1、 5nM之濃度，當添加變異siRNA #135時可有效地抑制破骨 細胞之形成。當變異siRNA之添加濃度爲5nM時，對破 骨細胞形成有些許抑制效果，當變異 siRNA添加濃度爲 0.1、InM時，對破骨細胞形成有抑制效果。結果，與 Mcok對照組（siRNA濃度=OnM )及負對照組中變異 siRNA 相比，DC-STAMP siRNA 與由 RANKL 及 TNF-α 引 發之RAW-D中TRAP陽性多核破骨細胞形成有濃度依存度 地抑制（第5圖A、第5圖B )。因siRNA可抑制DC-STAMP基因之表達，而抑制RAW-D中破骨細胞之分化， 顯示DC-STAMP爲破骨細胞分化之必需因子》 〔實施例8〕小鼠DC-STAMP開放讀架（ORF)cDNA株之 取得

a )自RAW-D萃取全RNA

-96 - 1359026 將RAW-D在含10%牛胎兒血清之α -MEM培養基中調製 7xl04細胞/ml，置於24穴平板中500μ1/穴，加人RANKL (Pepro Tech 公司製造）終濃度 20 ng/ml、人 TNF-α ( Pepro Tech公司製造）終濃度2 ng/ml及小鼠ΜΙΡ-1α ( PeproTech公司製造）終濃度1 ng/ml，培養3日。 添加全RNA萃取用試劑（Trizol試劑：因比多建公司製 造），使用說明書，自RAW-D萃取全RNA。所回收全 RNA在-80°C下保存。 b) 首股cDNA之合成 將 lgg 全 RNA 及 1//1 〇lig〇(dT)18 引子（0.5//g/gl) 在水 1 1 A 1中，於70°C加熱10分後，於4°C保溫。在溶 液中加4 # 1 5x1 st Strand緩衝液（因比多建公司製造）、1 β 1 1 OmM dNTPs > 2 β \ 0.1Μ 二硫蘇糖醇、1 仁 1

Superscript. II反轉錄酵素（ 200U/jt/l、因比多建公司製造 )、1 // 1水，全量爲20# 1，於42°C反應1小時後，於70 °C加熱10分後，於保溫。 c) PCR反應 爲令小鼠 DC-STAMP 及 DC-STAMPAT7 之 ORF cDNA 用 PCR擴増之引子，依常法合成如下序列之寡核苷酸： 5’-tttgtcgaca tgaggctctg gaccttgggc accagtattt t-3’ ( mDC-STAMP-cDNA-F :序列表之序歹IJ號碼24 ) 及 5 ’-tttgcggccg ctcatagatc atcttcattt gcagggattg t-3’ ( mDC-STAMP —cDNA-R :序列表之序列號碼25 )。 -97 - 1359026 用此引子之組合，以加熱循環器（GeneAmp PCR System 9700 )，依以下條件進行PCR。引子（終濃度各l.OyM) 、5/zl 10x Pyrobest PCR緩衝液（寶酒造公司製造）、4 仁1 2.5mM dNTPs、1# 1 cDNA (b)製作、以再蒸餾水作成 50 μ 1。添加 0.5 jc/ 1 之 5U/# 1 Pyrobest DNA 聚合酶（寶酒 造公司製造），調製反應液。將此反應液在94°C加熱2分 後、94°C下0.5分、60°C下〇.5分、72°C下5分之溫度，循 環30回後，在72°C加熱10分，於4°C保溫》 d) pCI-neo載體之選殖 將 c)所得 PCR 反應液全量以 QIAquick PCR Purification 套組（Qiagen公司製造），依說明書而精製。將所得片段 以限制酶Sail及Notl切割後，使用已以同樣Sail及Notl 切割之 pCI-neo ( Promega公司製造），以 DNA粘接 (Ligation)套組 Ver.l (寶酒造公司製造）進行粘接，在 大腸菌XLl-Blue MRF’（ Strategene公司製造）轉形。自所 得大腸菌選殖，單離保有質體pCI-neo-小鼠DC-STAMP之 形質轉形之大腸菌。 將所得質體中揷入之ORF cDNA全核苷酸序列，用DNA 測序機（Perkin Elmer 日本· Applied Biosystem 事業部公 司製造ABI Prism 310 DNA測序機）來解析之結果，確定 序列表之序列號碼26所示序列。其核苷酸序列舆於NCBI GeneBank資料庫中以「小鼠DC-STAMP」（登錄號碼： AB 1 09560 )所登錄序列ORF編碼領域相同，該核苷酸序列 編碼之胺基酸序列（序列表之序列號碼27 )與小鼠DC- -98 - 1359026 STAMP之胺基酸序歹IJ爲100%—致。 〔實施例9〕強制表達小鼠DC-STAMP蛋白，對RAW-D 細胞破骨細胞分化之影響

實施例 8所得pCI-neo-小鼠DC-STAMP質體因在源自 pCI-neo之CMV促進子支配下連結小鼠DC-STAMP之ORF 序列，故將質體導入宿主則可表達小鼠DC-STAMP蛋白質 〇 上述表達質體RAW-D之基因導入（暫時•轉染）可用 DEAE-聚葡萄糖法進行。 將pCI-neo-小鼠DC-STAMP或空pCI-neo載體各3从g中 ，添加 1 〇mg/ml DEAE-聚葡萄糖溶液（Promega公司製造 )50/zl及OPTI-MEMI (因比多建公司製造）950仁1來混 合，調製轉染溶液。 用不含血清之a -MEM ( 10ml)洗淨2回（200xg、離心5 分），將RAW-D (3.0x106個）在上述轉染溶液（1ml)中 懸浮。在C02培養箱中（37°C )保溫30分後，用不含血清 之〇：-MEM(10ml)洗淨1回（200xg、離心5分）後，再 以含5%牛胎兒血清之a -MEM ( 10ml)洗淨1回。在200χ g離心10分以得細胞製粒，於含10%牛胎兒血清之α -MEM ( 2ml )再懸浮。細胞濃度用血球計算板來測定，調製 4·5χ104個/ml之細胞濃度，種於96穴平板0.15ml/穴，添 加人RANKL ( Pepro Tech公司製造）終濃度20 rig/mi、人 TNF- a ( Pepro Tech公司製造）終濃度1 ng/ml，或不添加 下培養3日後，用白血球酸式磷酸酯酶套組（Sigma公司 ⑧ 1359026 製造），依所附說明書進行TRAP染色，計測所形成TRAP 陽性多核破骨細胞數。結果顯示，在無RANKL、TNF- α存 在下，強制表達小鼠DC-STAMP蛋白質，並無法引發 TRAP陽性多核破骨細胞，在RANKL、TNF - α存在下，與 對照組即將空pCI-neo載體在RAW-D中基因導入時相比， 強制表達小鼠DC-STAMP蛋白質可有效促進TRAP陽性多 核破骨細胞之形成（第6圖）。因此顯示DC-STAMP爲破 骨細胞分化之促進因子。 〔實施例10〕添加抗小鼠DC-STAMP多株抗體對RAW-D細胞破骨細胞分化之影響 使用實施例4製作之兔子抗小鼠DC-STAMP多株抗體， 探討對RAW*D破骨細胞分化之影響。 將RAW-D用合10%牛胎兒血清之α -MEM培養基調製 4.5xl04細胞/ml，種於 96穴平板 150/z 1/穴，添加人 RANKL ( Pepro Tech 公司製造）終濃度 20 ng/mbATNF-α ( Pep r o Tech公司製造）終濃度1 ng/ml。在細胞培養上 清中，添加實施例4製作之兔子抗小鼠DC-STAMP多株抗 體終濃度〇'5、10、20#g/ml，培養3日後，用白血球酸 式磷酸酯酶套組（Sigma公司製造），依所附說明書進行 TRAP染色，計測所形成TRAP陽性多核破骨細胞數。結果 顯示，所添加抗小鼠DC-STAMP多株抗體，可依其用量抑 制TRAP陽性多核破骨細胞之形成（第7圖）。相較於不 添加抗小鼠DC-STAMP多株抗體，添加抗體10# g/ml以上 者，可顯著地抑制破骨細胞之形成。

-100 - 1359026 因與DC-STAMP及DC-STAMPAT7專一性結合之抗體抑 制RAW-D中TRAP陽性多核破骨細胞之形成，故暗示DC-STAMP及DC-ST AMP ΔΤ7與破骨細胞分化有深切關連。 〔實施例1 1〕添加抗小鼠DC-STAMP多株抗體’對源自 小鼠骨髓之初代培養細胞之破骨細胞分化的影響 將6週齡雄性DDY小鼠於乙醚麻醉下，予以頸椎脫臼而 安樂死，取出大腿骨及脛骨。除去軟組織後，在大腿骨或 脛骨兩端切除，用25 gauge注射針之注射筒，將不含血清 之α -MEM培養基自骨髓中注入，採取骨髓細胞。計測細 胞數後，用含15%牛胎兒血清之α -MEM培養基調製2x1 06 細胞/m卜置於24穴平板中5 00 /zl/穴，添加活性型維生素 D3 ( Biomol公司製造）終濃度1χ10_8 Μ。在細胞培養上清 液中，添加實施例4製作之兔子抗小鼠DC-ST AMP多株抗 體終濃度〇、5、10、20/zg/ml，培養6日後，用白血球酸 式磷酸酯酶套組（Sigma公司製造），依所附說明書進行 TRAP染色，計測所形成TRAP陽性多核破骨細胞數。由其 結果，所添加抗小鼠DC-STAMP多株抗體，可依其用量抑 制TRAP陽性多核破骨細胞之形成（第8圖）。與添加抗 小鼠DC-STAMP多株抗體場合相比，添加5 // g/ml及20私 g/ml濃度之抗體時具有效之抑制力。因此，由與DC-STAMP及DC-STAMP △ T7有專一性結合抗體，可抑制小鼠 骨髓細胞之TRAP陽性多核破骨細胞形成，可知DC-STAMP及DC-STAMP △ T7，除對RAW-D等細胞株外，亦 與活體相近之初代培養細胞的破骨細胞分化有關。 1359026 〔實施例12〕添加抗小鼠DC-STAMP多株抗體對骨吸收 窩形成之影響 將源自小鼠大腿骨及脛骨之細胞，於活性型維生素D3存 在下，在象牙切片上培養，觀察破骨細胞對象牙表面之侵 触，形成蟲餽狀之骨吸收高（pit) (Takada et al·，Bone and Mineral 17, 347-359 (1992))。 將14日齡ICR小鼠（雌雄不拘）於乙醚麻醉下予以頸椎 脫臼而安樂死，取出大腿骨及脛骨。除去軟組織後，於含 10%牛胎兒血清之DMEM培養基lml，在直徑60mm皿中 ，骨以剪刀切成粥狀。移至15ml離心管，加含10%牛胎 兒血清之DMEM培養基10ml。以振動混合（MS機器）攪 拌30秒後，靜置2分。回收上清液，計測細胞數後，以含 10%牛胎兒血清之DMEM培養基調製得lxl 07細胞/ml，敷 以厚150〜20 0 # m，直徑6mm象牙切片（吳羽化學工業製 作）之96穴平板中1〇〇 μ 1/穴’在C02培養箱中培養4小 時。換以含10%牛胎兒血清之DMEM培養基200#1，添加 活性型維生素D3 ( Sigma公司製造）終濃度lxl 0_8 Μ (得 非添加群）。由細胞培養上清’添加實施例4製得之兔子 抗小鼠DC-STAMP多株抗體終濃度0、2、6、20# g/ml， 培養4日。培養終了後，將有象牙之平板除去培養上清液 ，加蒸餾水洗淨1回’再加新的蒸飽水。用手馬達（東京 中井公司製造）接續之磨刷（多賀谷製作所製造），將象 牙切片上附著之細胞剝離。以蒸餾水洗淨2回後，將象牙 表面上形成之骨吸收窩以酸蘇木精液（Sigma公司製造）

-102 - 1359026

染色13分，以蒸餾水洗淨2回》將象牙切片反相，於顯微 鏡下計測骨吸收窩之面積。測定骨吸收窩總面積之方法可 用顯微鏡接目鏡之微計數器（10x10 mass)，計數存在骨 吸收窩之總網數，得骨吸收窩面積。結果，添加活性型維 生素D3在象牙切片上形成多數骨吸收窩，但同時添加抗小 鼠DC-STAMP多株抗體時，可依其用量而抑制骨吸收窩形 成（第9圖）。因此，與DC-STAMP及DC-STAMP △ T7專 一結合之抗體抑制由源自小鼠大腿骨·脛骨之破骨細胞之 骨吸收窩形成，暗示DC-STAMP及DC-STAMPAT7對破骨 細胞骨吸收活性之調節也有關。 〔實施例13〕巨細胞腫瘤組織中人DC-STAMP基因之表 達

巨細胞腫瘤（Giant cell tumor ; GCT)爲組織學上多數出 現破骨型多核巨細胞之骨腫瘤，特徵爲臨床所見之骨溶解 性之骨破壞（Bullough et al.，Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition, 17.6-17.8, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1992))。就有與人 DC-STAMP 基因部 分重複之核苷酸序列之EST探針（Affymetrix Genechip HG-U133 probe 221266_s_at : Affymetrix 公司製造），用 GeneLogic 公司製造之資料庫（Genesis 2003 Release 2.0) ，進行GCT組織表達形式作解析。又就破骨細胞分化有重 要角色之 RANK ( Affymetrix Genechip HG-U133 probe 207037_at : Affymetrix 公司製造）及 RANKL ( Affymetrix Genechip HG-U133 probe 2 1 0643_at: Affymetrix 公司製造 -103 - 1359026 )，更就破骨細胞分化標記組織蛋白酶K( Affymetrix Genechip HG-U133 probe 2 024 5 0_s_at ： Affymetrix 公司 製造）及 TRAP ( Affymetrix Genechip HG-U133 probe 204638_at : Affymetrix公司製造）之EST探針，也同樣地 進行GCT組織表達形式作解析。 正常骨組織9例、GCT組織14例、GCT以外骨腫瘤組織 10例中，作表達量之比較，相較於正常組織，GCT組織中 RANK及RANKL之轉錄有特異地亢進（第10圖A)。反 觀，骨吸收之亢進未必引起之GCT以外之骨腫瘤組織，則 相較於GCT，其RANK及RANKL之轉錄顯然較低，與正 常組織有同等之表達量，暗示在GCT爲可促進破骨細胞形 成及活性化之環境。比較組織蛋白酶K及TRAP表達量， GCT有顯著較高之轉錄（第10圖B)，暗示有骨吸收活性 之破骨細胞多數出現。同樣地，比較DC-ST AMP之轉錄量 ，與RANK、RANKL、組織蛋白酶K及TRAP相同，在 GCT有特異高之轉錄（第11圖）。因此，在GCT等骨吸 收亢進之人病徵中，也與DC-STAMP有關連。 〔實施例14〕添加抗小鼠DC-STAMP多株抗體對人破骨 細胞形成之影響 將人末梢血單核球 （Human Peripheral Blood Mononuclear Cell ； HPBMC )，在 M-CSF 及地塞米松 (dexamethasone)存在下，以RANKL刺激，以形成TRAP陽 性多核破骨細胞（Matsuzaki et al·，Biochem. Biophys. Res. Commun.，（ 1 998)246，199-204 )。將購自寶生技公司之 -104 - 1359026 HPBMC，以含10%牛胎兒血清之a -MEM培養基調製成5x 1〇6細胞/1111後，種植於96穴平板中10(^1/穴，添加人]\4-CSF ( RandD- Systems公司製造）終濃度200ng/m卜地塞 米松（和光純藥工業公司製造）終濃度lxl(T7 Μ及人 RANKL ( Pepro Tech公司製造）終濃度100 ng/ml調製之 培養基（200 // 1/穴）（也準備RANKL非添加群）。此細胞培 養上清液中，添加實施例4中製得之兔子抗小鼠DC_ STAMP多株抗體終濃度0、2、6// g/ml。培養4、7、1 1日 後，換培養基並添加檢體，培養13日後，用白血球酸式磷 酸酯酶套組（Sigma公司製造），依所附說明書進行TRAP 染色，計測所形成TRAP陽性多核破骨細胞數。由此結果 ，RANKL刺激可形成多數破骨細胞，所添加抗小鼠DC-STAMP多株抗體，可依其用量抑制TRAP陽性多核破骨細 胞之形成（第12圖）。因此，抗小鼠DC-STAMP抗體， 對HPBMC可抑制TRAP陽性多核破骨細胞形成，可知DC-STAMP除對小鼠外，亦强烈暗示與人破骨細胞分化有關。 産業上利用可能性 本發明可得以抑制破骨細胞活動爲作用機序之骨代謝異 常預防劑及/或治療劑。 序列表之敘述 序列號碼15-人工序列之説明：小鼠DC-STAMP合成部 分胜肽 序列號碼16」人工序列之説明：小鼠DC-STAMP模板 DNA1

Claims (1)

100. . 4. 2^· L_ 修正本 公告本 第094 1 03893號「以破骨細胞關連蛋白質爲標的之醫藥組成 物j專利案 (20Π年4月25日修正） 十、申請專利範圍： 1. 一種骨代謝異常治療用之醫藥組成物，其特徵爲含有與序 列表之序列號碼1 5所示胺基酸序列之蛋白質專一性結合 ，而抑制破骨細胞之形成之抗體。 2. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中抗體爲單株抗 體。 3. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中抗體爲人化抗 體。 4. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中抗體爲完全人 化抗體。 5. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中抗體爲IgG抗 體。 6 .如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中含有至少任一 種選自雙磷酸鹽、活性型維生素D3、抑鈣素及其衍生物 、雌二醇等荷爾蒙製劑、SERMs (選擇性雌激素受體調控 劑）、依普黃酬（ipriflavone)、維生素 K2 ( mentrenone) 、鈣製劑、PTH(副甲狀腺荷爾蒙）製劑、非類固醇性抗炎 症劑、抗TNF α抗體、抗PTHrP(副甲狀腺荷爾蒙-相關蛋 白質）抗體、IL-1受體拮抗劑、抗RANKL抗體及〇CIF( 破骨細胞形成抑制因素）所構成之群組》 7.如申請專利範圍第1至6項中任一項之醫藥組成物，其中 13^9026 修正本 骨代謝異常爲骨質疏鬆症、風濕性關節炎或癌性高鈣血症 〇 8. 如申請專利範圍第1至6項中任—項之醫藥組成物，其中 骨代謝異常爲骨質疏鬆症》 9. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之醫藥組成物，其中 骨代謝異常爲風濕性關節炎。 10. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之醫藥組成物，其中 骨代謝異常爲癌性高鈣血症。

-2- 1359026 式 圖 第 5000 公告本 「2010牛1ϋ月2SH修止7 Μ月 <日修(更)正本 淼锃暴培咏担豳dvaictl_醐细 00 40 00 ο 3 00 200 00 00 1* ο -,RAW-D 丁國Τ RAW 一 Ν RAW264母株細胞 10 20 40 80 10 20 40 80 10 20 40 80 RANKL濃度（ng/ml) l/l2 1359026 第2圖 1 2 3 4 5

-原點 -28S核糖RNA (4.7kb) =DC-STAMP _ 18S核糖RNA (1,9kb)

-GAPDH

1: RAW-N無刺激 2: RAW-D無刺激 3: RAW-N RANKL、TNF-a 朿!j激 4： RAW-D RANKL、TNF-α 朿丨]激 5: RAW—D RANKU ΤΝΡ* α、M1P-1 a 朿激 2Ί2 i 1359026 第3圖 0 4 8 16 32 48 72 小時 DC-STAMP * DC—STAMPZ]丁7 一

-399 KB -231 K巳

Cathepsin K TRAP GAPDH

-203 KB -218 KB

-198 KB

3/12 1359026 第4圖 DC-STAMP -DC-STAMPzjT7 ~ GAPDH

4/12 1359026 第5圖 截留患越咏^illdvyi仕_槲班 ο 00500050

0.1 (B) siRNA 濃度(nM) * P < 0.05、林 P〈 0.01 vs. 0 nM ο o o o)0 ,0ο ο50 0 5 0 5 2 11

if °· siRNA 濃度(nM) * P < 0.05、*** P < 0.001 vs. Ο nM 5/12 1359026 61 sfrp 0 /1 > ,0o o o o 0 8 6 4 2截涅粜越咏起iddvai-B-MIli!^ *** ~r *林 P < 0Ό01 o pCI-neo pCI-neo- pCI-neo pCI-neo-DC-STAMP DG-STAMP RANKU TNF-a 無添加 RANKU TNF-a 添加 6/12 1359026 第7圖

鋪倕羅培谕itiiidvaifl-MI槲细

** *林x Ο 5 10 20 抗DG-STAMP抗體（jLi g/ml) 林 P < 0.01 *林 P < 0.001 7/12 / 1359026 第8圖 親涅果想咏趔醒1<0:1旮堋鹏海

抗DC-STAMP抗體（"g/ml) * P < 0.05 ** P < 0.01 8/12 1359026 圖9 第 2 0 0 0 0 0 0 8 6 4 2 .^1 i酹阻肫荽®Ι#-Β-ΜΙ«5? I- I— τ VD3 1 X10'8 - 抗DC-STAMP抗體 0 Ο + 2 + 6 + 9/12 1359026 第10圖

林♦ P < 0.001 vs.正常骨組織 ## P < O.Ot, ### P < 0.001 vs. GCT tOOOOr □組織蛋白酶Km TRAP s (埘傲)《糊m図棚 ο ο ο ϋ o o o01 o o o o 8 6 4 2 T • t »1 ### 正常骨組織 GCT GCT以外骨腫瘤 (n=9) (n=14) (n=10) *** P < 0.001 vs.正常骨組織 ### P < 0.001 vs. GCT 10/12 1359026

第11圖 □ DC-STAMP (埘铂)_糊谳因棚 000000 # ##- 正常骨組織 GCT GCT以外骨腫瘤 (n=9) (n=14) (n=10) *** P < 0.001 vs.正常骨組織 ### P < 0.001 vs. GCT 11/12 1359026 圖12ml 親涯堤逛椒担醛dvi β獺班迪

RANKL 100 ng/ml 一 + + + 抗DC-STAMP抗體 0 0 2 6 (^ g/ml) 12/12