Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

TW202421204A - 抗體—藥物結合物及其製備方法及用途 - Google Patents

抗體—藥物結合物及其製備方法及用途 Download PDF

Info

Publication number
TW202421204A
TW202421204A TW112139032A TW112139032A TW202421204A TW 202421204 A TW202421204 A TW 202421204A TW 112139032 A TW112139032 A TW 112139032A TW 112139032 A TW112139032 A TW 112139032A TW 202421204 A TW202421204 A TW 202421204A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
antibody
amino acid
acid sequence
variant
Prior art date
Application number
TW112139032A
Other languages
English (en)
Inventor
龍虎
羅順濤
田強
袁曉曦
周玥華
陳倩
胡瑞斌
羅良波
張毅濤
吳瑩
宋宏梅
譚淼
譚向陽
葛均友
Original Assignee
大陸商四川科倫博泰生物醫藥股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商四川科倫博泰生物醫藥股份有限公司 filed Critical 大陸商四川科倫博泰生物醫藥股份有限公司
Publication of TW202421204A publication Critical patent/TW202421204A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68037—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a camptothecin [CPT] or derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本申請案係關於抗體-藥物結合物及其製備方法及用途，且特定而言係關於用於治療PTK7陽性癌症之抗體-藥物結合物，包括PTK7抗體及結合至該抗體之藥物-連接體分子。在一些實施例中，該抗體經人類化，具有優異的與PTK7陽性細胞結合之活性，且可有效地將藥物遞送至PTK7陽性細胞。在一些實施例中，該藥物包括DNA拓樸異構酶抑制劑。本申請案之抗體-藥物結合物具有較佳藥物-抗體結合比率，且對肺癌、乳癌、上皮癌、卵巢癌、食道癌及諸如此類具有良好的靶向殺傷效應。因此，本申請案進一步提供製備該抗體-藥物結合物之方法及其用於治療PTK7陽性癌症之用途。

Description

抗體-藥物結合物及其製備方法及用途
本申請案係關於靶向療法之領域，且特定而言係關於用於治療PTK7陽性癌症之抗體-藥物結合物。特定而言，抗體-藥物結合物包含PTK7抗體及結合至抗體之藥物-連接體分子。在一些實施例中，抗體經人類化，具有優異的與PTK7陽性細胞結合之活性，且可有效地將藥物遞送至PTK7陽性細胞。在一些實施例中，藥物包含DNA拓樸異構酶抑制劑。本申請案之抗體-藥物結合物具有優異的藥物-抗體結合比率，且對肺癌、乳癌、上皮癌、卵巢癌及食道癌具有良好的靶向殺傷效應。因此，本申請案進一步提供製備抗體-藥物結合物之方法及其用於治療PTK7陽性癌症之用途。
癌症係現代人死亡之主要原因之一。其係由健康細胞之惡性轉型引起、由諸如染色體易位、腫瘤抑制基因及生長因子受體突變之遺傳變化，導致細胞之惡性增殖而引起之一類疾病。缺陷性細胞凋亡或程式化細胞死亡進一步促進細胞之惡性轉型，從而導致癌症。根據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)下屬之國際癌症研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)之最新評價，2020年全球新增癌症病例係19.29百萬，包括10.06百萬男性及9.23百萬女性。在2020年，全球有9.96百萬癌症死亡，包括5.53百萬男性及4.43百萬女性。在本世紀，預測癌症將超過心血管疾病，成為大多數國家過早死亡之主要原因。
PTK7 (蛋白酪胺酸激酶7)屬於受體酪胺酸激酶家族，且可能因激酶結構域突變而缺乏激酶活性。PTK7蛋白由7個細胞外免疫球蛋白結構域、跨膜結構域及細胞內酪胺酸激酶結構域構成，且其配位體係未知的。PTK7之細胞外區段可由ADAM及MT1-MMP蛋白酶裂解，產生可溶性片段，且健康人血清中游離PTK7之濃度係約12.4 ± 3.3 ng/ml；且腫瘤患者中之濃度較高，係約24.6 ± 3.8 ng/ml。
PTK7在多種實體腫瘤中表現：據報導，其在47.4%之NSCLC、45.1%之卵巢癌、28.6%之TNBC及60%之食道癌中高表現，且研究已表明，PTK7表現促進腫瘤細胞之生長，且對PTK7基因進行基因剔除降低小鼠中之腫瘤負荷。PTK7之高表現與疾病分期及淋巴結轉移呈正相關，且與存活率呈負相關。目前，正在研究PTK7靶向抗體-藥物結合物、CAR-T及其他治療方法。在臨床前研究中，將有效地殺傷具有PTK7高表現之腫瘤細胞株。該等研究在人類源性腫瘤細胞源性異種移植物(CDX)及人類源性腫瘤異種移植物(PDX)模型中顯示強腫瘤抑制活性。靶向PTK7且由Pfizer開發之ADC藥物培汀-考非妥珠單抗(Cofetuzumab Pelidotin)已在臨床I期中顯示良好的安全性及初步效能。
ADC藥物由抗體、生物活性分子及連接體構成。生物活性分子經由連接體共價結合至抗體；抗體(例如單株抗體)可特異性識別腫瘤細胞表面上之特定靶，且然後將ADC引導至癌細胞表面，並使得ADC能夠經由內吞作用進入癌細胞；且然後生物活性分子在癌細胞中釋放以在盡可能不損害正常組織細胞的情況下殺傷癌細胞。開發具有更佳靶向、親水性及內吞活性之抗體用於結合細胞毒性小分子以製備具有更大治療窗之ADC藥物將向患者提供更佳之治療選擇。
本申請案係關於用於治療PTK7陽性癌症之抗體-藥物結合物，且例示性揭示使用人類化抗體101A6HZ及64A10HZ作為靶向部分且具有由通式Ab-[M-L-E-D] x表示之結構的抗體-藥物結合物。結果表明，結合物具有更佳之藥物-抗體結合比率，且結合物具有優異的與PTK7陽性細胞結合之活性，並對PTK7陽性細胞(例如肺癌、乳癌、上皮癌、卵巢癌及食道癌細胞)具有良好的靶殺傷效應。因此，本申請案提供用於治療具有PTK7高表現之癌症之抗體-藥物結合物、包含該抗體-藥物結合物之醫藥組合物及其用於治療具有PTK7高表現之癌症之用途。 抗體-藥物結合物
在一個態樣中，本申請案提供具有顯示為式Ab-[M-L-E-D] x之結構之抗體-藥物結合物，其中： Ab係特異性結合至人類酪胺酸激酶7 (PTK7)之抗體或其抗原結合片段； M係連接至抗體或其抗原結合片段之連接體位點； L係M與E之間的連接體； E係連接L及D之結構片段； D係細胞毒性藥物片段；且 x選自1至10。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含： (1) 以下重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中CDR係根據Chothia編號系統來定義： (1a) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 11之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 12之序列之CDR-H2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 13之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 14之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 15之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 16之序列之CDR-L3或其變異體；或 (1b) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 27之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 28之序列之CDR-H2或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 29之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 30之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 31之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 32之序列之CDR-L3或其變異體； 其中(1a)及(1b)中任一者之變異體與衍生出變異體之序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，或與衍生出變異體之序列相比經歷一或若干個胺基酸之替代、缺失或添加(例如1個、2個或3個胺基酸之替代、缺失或添加)；較佳地，替代係保守替代； 或 (2) 以下重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中CDR係根據Kabat編號系統來定義： (2a) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 17之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 18或19之序列之CDR-H2或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 13之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 14之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 15之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 16之序列之CDR-L3或其變異體；或 (2b) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 33之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 34或35之序列之CDR-H2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 29之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 30之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 31之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 32之序列之CDR-L3或其變異體； 其中(2a)及(2b)中任一者之變異體與衍生出變異體之序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，或與衍生出變異體之序列相比經歷一或若干個胺基酸之替代、缺失或添加(例如1個、2個或3個胺基酸之替代、缺失或添加)；較佳地，替代係保守替代； 或 (3) 以下重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中CDR係根據IMGT編號系統來定義： (3a) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 20之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 21之序列之CDR-H2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 22之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 23之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 24之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 16之序列之CDR-L3或其變異體；或 (3b) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 36之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 37之序列之CDR-H2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 38之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 39之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 40之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 32之序列之CDR-L3或其變異體； 其中(3a)及(3b)中任一者之變異體與衍生出變異體之序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，或與衍生出變異體之序列相比經歷一或若干個胺基酸之替代、缺失或添加(例如1個、2個或3個胺基酸之替代、缺失或添加)；較佳地，替代係保守替代； 或 (4) 以下重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中CDR係根據AbM編號系統來定義： (4a) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 25之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 26之序列之CDR-H2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 13之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 14之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 15之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 16之序列之CDR-L3或其變異體；或 (4b) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 41之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 42之序列之CDR-H2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 29之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 30之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 31之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 32之序列之CDR-L3或其變異體； 其中(4a)及(4b)中任一者之變異體與衍生出變異體之序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，或與衍生出變異體之序列相比經歷一或若干個胺基酸之替代、缺失或添加(例如1個、2個或3個胺基酸之替代、缺失或添加)；較佳地，替代係保守替代。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含： (a) 顯示為SEQ ID NO: 1之VH或其變異體，及/或顯示為SEQ ID NO: 2之VL或其變異體； (b) 顯示為SEQ ID NO: 3之VH或其變異體，及/或顯示為SEQ ID NO: 4之VL或其變異體；或 (c) 顯示為SEQ ID NO: 5之VH或其變異體，及/或顯示為SEQ ID NO: 6之VL或其變異體； (d) 顯示為SEQ ID NO: 7之VH或其變異體，及/或顯示為SEQ ID NO: 8之VL或其變異體； (e) 顯示為SEQ ID NO: 9之VH或其變異體，及/或顯示為SEQ ID NO: 10之VL或其變異體； 其中變異體與衍生出變異體之序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，或與衍生出變異體之序列相比經歷一或若干個胺基酸之替代、缺失或添加(例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸之替代、缺失或添加)；且較佳地，替代係保守替代。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段進一步包含： (a) 人類免疫球蛋白重鏈恆定區(CH)或其變異體，其中與衍生出變異體之野生型序列相比，變異體具有一或多個胺基酸之替代、缺失或添加(例如，至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸之替代、缺失或添加；例如，1個、2個、3個、4個或5個胺基酸之替代、缺失或添加)；及 (b) 人類免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)或變異體，其中與衍生出變異體之野生型序列相比，變異體具有一或多個胺基酸之替代、缺失或添加(例如至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸之替代、缺失或添加；例如，1個、2個、3個、4個或5個胺基酸之替代、缺失或添加)。
在一些實施例中，重鏈恆定區係IgG重鏈恆定區，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區，例如人類IgG1重鏈恆定區或人類IgG4重鏈恆定區。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含顯示為SEQ ID NO: 43之重鏈恆定區(CH)或其變異體，且與SEQ ID NO: 43相比，變異體具有至多20個胺基酸之保守替代(例如，至多15個、至多10個或至多5個胺基酸之保守替代；例如，1個、2個、3個、4個或5個胺基酸之保守替代)； 在一些實施例中，輕鏈恆定區係κ輕鏈恆定區。在一些實施例中，抗體或其抗原結合區域包含顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)或其變異體，且與SEQ ID NO: 44相比，變異體具有至多20個胺基酸之保守替代(例如，至多15個、至多10個或至多5個胺基酸之保守替代；例如，1個、2個、3個、4個或5個胺基酸之保守替代)。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含顯示為SEQ ID NO: 43或45之重鏈恆定區(CH)，及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含： (1) 包含顯示為SEQ ID NO: 1之VH序列及顯示為SEQ ID NO: 43之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含顯示為SEQ ID NO: 2之VL序列及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈； (2) 包含顯示為SEQ ID NO: 3之VH序列及顯示為SEQ ID NO: 43或45之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含顯示為SEQ ID NO: 4之VL序列及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈； (3) 包含顯示為SEQ ID NO: 5之VH序列及顯示為SEQ ID NO: 43之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含顯示為SEQ ID NO: 6之VL序列及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈； (4) 包含顯示為SEQ ID NO: 7之VH序列及顯示為SEQ ID NO: 43之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含顯示為SEQ ID NO: 8之VL序列及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈；或 (5) 包含顯示為SEQ ID NO: 9之VH序列及顯示為SEQ ID NO: 43之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含顯示為SEQ ID NO: 10之VL序列及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈。
在抗體-藥物結合物中，細胞毒性藥物可經由連接體(如本申請案中所顯示之「M-L-E」片段)連接至抗體或抗原結合片段。
在一些實施例中，M係 ，其中環A係5-6員脂族雜環或5-20員芳族環系統，且脂族雜環及芳族環系統視情況地經一或多個選自由以下組成之群之成員取代：側氧基(=O)、鹵素、氰基、胺基、羧基、巰基及C 1-6烷基；且M 1選自單鍵、C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基及C 2-20伸炔基。
在一些實施例中，M係 ，其中環A係5員脂族雜環、6員芳族雜環或經由單鍵連接一個以上之6員芳族雜環及苯環形成之多環，且脂族雜環視情況地經一或多個選自由以下組成之群之成員取代：側氧基(=O)、鹵素及C 1-4烷基；且M 1選自單鍵、C 3-10伸烷基、C 3-10伸烯基及C 3-10伸炔基。
在一些實施例中，M係 ，其中環A選自 、 、 及 ；且M 1選自單鍵、C 5-8伸烷基、C 5-8伸烯基及C 5-8伸炔基。
在一些實施例中，M選自以下結構： 及 。
在一些實施例中，M選自以下結構： 。
在一些實施例中，L選自包含以下中之一或多者之結構：C 1-6伸烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、Val、Cit、Phe、Lys、Lys(COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) sOCH 3)、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Ala-Ala-Ala、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO: 48)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 49)、Gly-Gly-Val-Ala (SEQ ID NO: 50)、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 51)、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ，其中R’表示氫、C 1-6烷基或含有-(CH 2CH 2O)r-之烷基；r選自1-10之整數；且s選自1-20之整數。
在一些實施例中，L選自包含以下中之一或多者之結構：C 1-6伸烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、Val、Cit、Phe、Lys、Lys(COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) sOCH 3)、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Ala-Ala-Ala、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO: 48)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 49)、Gly-Gly-Val-Ala (SEQ ID NO: 50)、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 51)、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ，其中R’表示氫、C 1-6烷基或含有-(CH 2CH 2O)r-之烷基；r選自1-10之整數；且s選自1-20之整數。
在一些實施例中，L係由選自以下之一或多者構成之結構：C 1-6伸烷基、-NH-、Val、Cit、Phe、Lys、Lys(COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) sOCH 3)、Gly、Val-Cit、Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO: 48)、 、 、 、 、 、 、 及 ，其中s係選自1-20之整數。
在一些實施例中，L選自包含以下中之一或多者之結構：C 1-6伸烷基、-NH-、Val、Cit、Phe、Lys、Lys(COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) sOCH 3)、Gly、Val-Cit、Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO: 48)、 、 、 、 、 、 及 ；其中s選自1-20之整數。
在一些實施例中，L選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ； 其中s係選自1至20之整數。
在一些實施例中，L選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ； 其中s選自1-20之整數。
在一些實施例中，L選自以下結構： 、 、 、 、 及 。
在一些實施例中，L選自以下結構： 、 、 、 及 。
在一些實施例中，L選自以下結構： 、 、 及 。
在一些實施例中，L選自以下結構： 、 及 。
在一些實施例中，E係單鍵、-NH-CH 2-、-NH-CH 2-O-CH 2-CO-、 、 、 、 或 。
在一些實施例中，E係單鍵、-NH-CH 2-、-NH-CH 2-O-CH 2-CO-、 、 或 。
在一些實施例中，E係-NH-CH 2-、 或 。
在一些實施例中，E係-NH-CH 2-或 。
在一些實施例中，M選自以下結構： 及 ； L選自以下結構： 、 、 、 及 ； E係-NH-CH 2、 或 。
在一些實施例中，M選自以下結構： 及 ； L選自以下結構： 、 、 及 ； E係-NH-CH 2、 或 ， 在一些實施例中， 選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。
在一些實施例中， 選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。
在一些實施例中， 選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 及 。
在一些實施例中， 選自以下結構： 、 、 、 、 、 及 。
在一些實施例中，細胞毒性藥物選自微管蛋白抑制劑、DNA嵌入劑、DNA拓樸異構酶抑制劑及RNA聚合酶抑制劑。在一些實施例中，微管蛋白抑制劑係奧瑞他汀(auristatin)化合物或類美登素(maytansinoid)化合物。在一些實施例中，DNA嵌入劑係吡咯并苯并二氮呯(PBD)。在一些實施例中，DNA拓樸異構酶抑制劑係拓樸異構酶I抑制劑(例如，喜樹鹼(camptothecin)、羥基喜樹鹼、9-胺基喜樹鹼、SN-38、伊立替康(irinotecan)、托泊替康(topotecan)、貝洛替康(belotecan)或盧比替康(rubitecan))或拓樸異構酶II抑制劑(例如，多柔比星(doxorubicin)、PNU-159682、倍癌黴素(duocarmycin)、道諾黴素(daunorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)或依托泊苷(etoposide))。在一些實施例中，RNA聚合酶抑制劑係α-瓢菌素(α-amanitin)或其醫藥學上可接受之鹽、酯或類似物。
本申請案中所揭示之細胞毒性藥物通常含有多個官能基，例如羥基(-OH)、羧基(-COOH)、硫氫基(-SH)、一級胺(-NH 2)、二級胺(-NR AH)或三級胺基(-NR BR C)，且R A、R B及R C在本文中僅表示N上之非氫取代基；且細胞毒性藥物可經由該等官能基連接至結合物中之連接體。
在一些實施例中，細胞毒性藥物經由其上之-OH、-SH、一級胺基、二級胺基或三級胺基連接至抗體-藥物結合物中之E。
在一些實施例中，細胞毒性藥物係 。
在一些實施例中，細胞毒性藥物選自以下式I及式II： 其中，R 1及R 2各自獨立地選自由C 1-6烷基及鹵素組成之群； R 3選自由H及-CO-CH 2OH組成之群； R 4及R 5各自獨立地選自由H、鹵素及羥基組成之群；或R 4及R 5與其所連接之碳原子一起形成5至6員含氧雜環； R 6選自由氫及-C 1-4伸烷基-NR aR b組成之群； R 7選自由H、C 1-6烷基及-C 1-4伸烷基-NR aR b組成之群； 其中，在每次出現時，R a及R b各自獨立地選自由以下組成之群：H、C 1-6烷基、-SO 2-C 1-6烷基及-CO-C 1-6烷基。
在一些實施例中，細胞毒性藥物選自以下式I及式II： R 1及R 2獨立地選自C 1-6烷基及鹵素； R 3選自H及-CO-CH 2OH； R 4及R 5獨立地選自H、鹵素及羥基；或R 4及R 5連接至相關碳原子以形成5-6員含氧雜環； R 6選自氫或-C 1-4伸烷基-NR aR b； R 7選自C 1-6烷基及-C 1-4伸烷基-NR aR b； 其中R a及R b在每次出現時獨立地選自H、C 1-6烷基、-SO 2-C 1-6烷基及-CO-C 1-6烷基。
在一些實施例中，細胞毒性藥物選自以下化合物： 及 。
在一些實施例中，細胞毒性藥物選自以下化合物： 及 。
根據本申請案，在細胞毒性藥物連接至連接體後獲得之細胞毒性藥物之相應片段係式Ab-[M-L-E-D] x中之D。在一些實施例中，D係藉由自細胞毒性藥物上之-OH、-NH 2或二級胺基失去一個H而獲得之單價結構。
在一些實施例中，D選自以下結構： 及 。
在一些實施例中，抗體-藥物結合物選自ADC A-01至ADC A-26、ADC B-01至ADC B-06及ADC C-01，如下所示： ADC A-01 、 ADC A-02 、 ADC A-03 、 ADC A-04 、 ADC A-05 、 ADC A-06 、 ADC A-07 、 ADC A-08 、 ADC A-09 、 ADC A-10 、 ADC A-11 、 ADC A-12 、 ADC A-13 、 ADC A-14 、 ADC A-15 、 ADC A-16 、 ADC A-17 、 ADC A-18 、 ADC A-19 、 ADC A-20 、 ADC A-21 、 ADC A-22 、 ADC A-23 、 ADC A-24 、 ADC A-25 、 ADC A-26 ADC B-01 、 ADC B-02 、 ADC B-03 、 ADC B-04 、 ADC B-05 、 ADC B-06 及 ADC C-01 。
每一抗體-藥物結合物中之HA表示顯示為SEQ ID NO: 1、3、5、7或9之VH及顯示為SEQ ID NO: 2、4、6、8或10之VL的抗體或抗原結合片段，例如顯示為SEQ ID NO: 3之VH及顯示為SEQ ID NO: 43或45之CH、顯示為SEQ ID NO: 4之VL及顯示為SEQ ID NO: 44之CL的抗體或抗原結合片段；且 表示抗體或抗原結合片段中之硫氫基及連接體之特定連接模式。
在一些實施例中，抗體-藥物結合物選自ADC A-01至ADC A-25、ADC B-01至ADC B-06及ADC C-01，如下所示： ADC A-01 、 ADC A-02 、 ADC A-03 、 ADC A-04 、 ADC A-05 、 ADC A-06 、 ADC A-07 、 ADC A-08 、 ADC A-09 、 ADC A-10 、 ADC A-11 、 ADC A-12 、 ADC A-13 、 ADC A-14 、 ADC A-15 、 ADC A-16 、 ADC A-17 、 ADC A-18 、 ADC A-19 、 ADC A-20 、 ADC A-21 、 ADC A-22 、 ADC A-23 、 ADC A-24 、 ADC A-25 、 ADC B-01 、 ADC B-02 、 ADC B-03 、 ADC B-04 、 ADC B-05 、 ADC B-06 、 ADC C-01 。
每一抗體-藥物結合物中之HA表示顯示為SEQ ID NO: 1、3、5、7或9之VH及顯示為SEQ ID NO: 2、4、6、8或10之VL的抗體或抗原結合片段，例如顯示為SEQ ID NO: 3之VH及顯示為SEQ ID NO: 43或45之CH、顯示為SEQ ID NO: 4之VL及顯示為SEQ ID NO: 44之CL的抗體或抗原結合片段；且 表示抗體或抗原結合片段中之硫氫基及連接體之特定連接模式。
在本文所揭示之抗體或抗體-藥物結合物之某些實施例中，重鏈恆定結構域可包含C末端離胺酸或缺少C末端離胺酸或C末端甘胺酸-離胺酸二肽。在本文所揭示之抗體或抗體-藥物結合物之某些實施例中，抗體可變結構域之N末端胺基酸可環化成焦麩胺酸鹽。在本文所揭示之抗體或抗體-藥物結合物之某些實施例中，抗體可變結構域之N末端胺基酸可環化成焦麩胺酸。
在某些實施例中，本文所揭示之抗體或抗原結合片段包括特異性結合抗原之抗體或抗原結合片段，且可包括可在宿主細胞(例如CHO細胞)中重組表現時或在純化/儲存期間發生之其轉譯後修飾(例如重鏈中之C末端離胺酸剪切、麩醯胺酸或麩胺酸轉化成焦麩胺酸鹽或焦麩胺酸)。
因此，組合物可包含抗體-藥物結合物種類之群體，其中每一種類可獨立地包含C末端離胺酸，缺少C末端離胺酸，缺少C末端甘胺酸-離胺酸及/或包含N末端麩醯胺酸或麩胺酸或N末端胺基酸環化成焦麩胺酸鹽。在某些實施例中，組合物可包含抗體-藥物結合物種類之群體，其中每一種類可獨立地包含C末端離胺酸，缺少C末端離胺酸，缺少C末端甘胺酸-離胺酸及/或包含N末端麩醯胺酸或麩胺酸或N末端胺基酸環化成焦麩胺酸。
因此，在具體實施例中，本發明進一步提供包含本文所揭示之ADC之組合物，其中組合物中之主要ADC種類包含(i)重鏈C末端缺少離胺酸殘基之抗體；(ii)重鏈N末端係麩醯胺酸、麩胺酸、焦麩胺酸鹽或焦麩胺酸之抗體；或(iii)重鏈C末端缺少離胺酸殘基且重鏈N末端係麩醯胺酸、麩胺酸、焦麩胺酸鹽或焦麩胺酸之抗體。
在具體實施例中，本發明進一步提供包含本文所揭示之ADC之組合物，其中組合物中之主要ADC種類包含重鏈C末端缺少離胺酸殘基且重鏈N末端係焦麩胺酸鹽或焦麩胺酸之抗體。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體經遺傳改造以包含抗體內所定義位置之胺基酸之一或多個半胱胺酸或離胺酸殘基或非典型胺基酸取代。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體經遺傳改造以包含抗體內所定義位置之胺基酸之一或多個半胱胺酸或非典型胺基酸取代。該等半胱胺酸殘基或非典型胺基酸殘基隨後可經由半胱胺酸殘基之硫氫基或非典型胺基酸之反應基結合至藥物-連接體。因此，本發明之抗體-藥物結合物可包含半胱胺酸殘基或非典型胺基酸殘基對抗體重鏈或輕鏈中之胺基酸之一或多個取代，該半胱胺酸殘基或非典型胺基酸殘基隨後結合至本文所揭示之藥物-連接體。在具體實施例中，可經取代之胺基酸位置選自重鏈恆定結構域之位置152、153、171、172、173及375 (根據Eu編號方案編號)及輕鏈恆定結構域之位置165及168 (自N末端之胺基酸1開始編號)。在具體實施例中，半胱胺酸可取代重鏈恆定結構域之位置152、153、171、172、173及375 (根據Eu編號方案編號)及輕鏈恆定結構域之位置165及168 (自N末端之胺基酸1開始編號)中之一或多者處之胺基酸。在具體實施例中，抗體-藥物結合物包含結合至本文所揭示之藥物-連接體之S375C胺基酸取代。在具體實施例中，抗體包含各自結合至本文所揭示之藥物-連接體之S375C胺基酸取代及E152C胺基酸取代。在具體實施例中，抗體包含各自結合至本文所揭示之藥物-連接體之S375C胺基酸取代及S168C胺基酸取代。 組合物
在另一態樣中，本申請案提供如本文所述之抗體-藥物結合物(ADC)之組合物。此組合物可包含複數個如本文所述之ADC，其中每一ADC包含如本文所述之藥物-連接體。因此，組合物之特徵可在於介於約1至約10范圍內之「藥物對抗體」比率(DAR)。確定DAR之方法為熟習此項技術者所熟知且包括使用反相層析或HPLC-MS之方法。
在一些實施例中，藥物-抗體結合物之DAR值(藥物-抗體結合比率)係1-10，例如：1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、6-7、6-8、6-9、6-10、7-8、7-9、7-10、8-9、8-10或9-10，較佳地1-8，較佳地3-9，例如3.0-3.5、3.0-4.0、3.0-4.5、3.0-5.0、3.0-5.5、3.0-6.0、3.5-4.0、3.5-4.5、3.5-5.0、3.5-5.5、3.5-6.0、3.5-6.5、3.5-7.0、3.5-7.5、3.5-8.0、4.0-4.5、4.0-5.0、4.0-5.5、4.0-6.0、4.0-6.5、4.0-7.0、4.0-7.5、4.0-8.0、4.5-5.0、4.5-5.5、4.5-6.0、4.5-6.5、4.5-7.0、4.5-7.5、4.5-8.0、5.0-5.5、5.0-6.0、5.0-6.5、5.0-7.0、5.0-7.5、5.0-8.0、5.5-6.0、5.5-6.5、5.5-7.0、5.5-7.5、5.5-8.0、6.0-6.5、6.0-7.0、6.0-7.5、6.0-8.5、6.5-7.0、6.5-7.5、6.5-8.5、7.0-7.5、7.0-9.0或7.5-9.0。 藥物-連接體
熟習此項技術者應理解，本申請案中所述之抗體-藥物結合物可以模組化方式製備。舉例而言，獲得呈游離形式之「藥物-連接體」 (其可理解為M’-L-E-D，其中M’係M共價連接至抗體或其抗原結合片段之前之結構形式)，且然後將呈游離形式之『藥物-連接體』共價連接至抗體或其抗原結合片段以獲得本申請案之抗體-藥物結合物。相應地，經由取代反應(例如，去除-SO 2Me或-Br及其上之類似結構)或經由加成反應及其他方式，將呈游離形式之『藥物-連接體』中之M’連接至抗體或其抗原結合片段上之一或多個硫氫基(-SH)、胺基(-NH 2)或羧基(-COOH)。
在另一態樣中，本發明提供藥物-連接體，其具有顯示為式M’-L-E-D之結構，其中 M’係 ，且Lg係用於親核取代反應之離去基團(例如，鹵素、甲磺醯基、氟苯酚或 )或羥基(-OH)、硫氫基(-SH)或胺基(-NH 2)；或Lg與環A上之相鄰原子形成不飽和雙鍵；環A係5-6員脂族雜環或5-20員芳族環系統，且脂族雜環及芳族環系統視情況地經一或多個選自以下之基團取代：側氧基(=O)、鹵素、氰基、胺基、羧基、硫氫基及C 1-6烷基；且M 1選自單鍵、C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基及C 2-20伸炔基；且 L、E及D結構係根據上述抗體-藥物結合物中之任一者來定義。
在一些實施例中，M'係 ，Lg係甲磺醯基，或Lg及環A上之相鄰原子形成碳-碳雙鍵；環A係5員脂環族雜環、6員雜芳族環或經由單鍵連接一個以上之6員雜芳族環及苯環形成之多環，且脂環族雜環視情況地經一或多個選自以下之基團取代：側氧基(=O)、鹵素及C 1-4烷基；且M 1選自單鍵、C 3-10伸烷基、C 3-10伸烯基及C 3-10伸炔基。
在一些實施例中，M’係 ， 選自 、 、 及 ；且M 1選自單鍵、C 5-8伸烷基、C 5-8伸烯基及C 5-8伸炔基。
在一些實施例中，M’選自 及 。
在一些實施例中，M’係 。
在一些實施例中，呈游離形式之「藥物-連接體」選自A-01至A-26、B-01至B-06及C-01，如下所示： A-01： ， A-02： ， A-03： ， A-04： ， A-05： ， A-06： ， A-07： ， A-08： ， A-09： ， A-10： ， A-11： ， A-12： ， A-13： ， A-14： ， A-15： ， A-16： ， A-17： ， A-18： ， A-19： ， A-20： ， A-21： ， A-22： ， A-23： ， A-24： ， A-25： ， A-26： ， B-01： ， B-02： ， B-03： ， B-04： ， B-05： ， B-06： ， C-01： 。
在一些實施例中，呈游離形式之「藥物-連接體」選自A-01至A-25、B-01至B-06及C-01，如下所示： A-01： ， A-02： ， A-03： ， A-04： ， A-05： ， A-06： ， A-07： ， A-08： ， A-09： ， A-10： ， A-11： ， A-12： ， A-13： ， A-14： ， A-15： ， A-16： ， A-17： ， A-18： ， A-19： ， A-20： ， A-21： ， A-22： ， A-23： ， A-24： ， A-25： ， B-01： ， B-02： ， B-03： ， B-04： ， B-05： ， B-06： ， C-01： 。 醫藥組合物
在另一態樣中，本申請案提供醫藥組合物，其包含前述任一者之抗體-藥物結合物，視情況地前述任一者之藥物-連接體，及一或多種醫藥佐劑。
本文所述之抗體-藥物結合物通常係與用於非經腸使用之醫藥學上可接受之非經腸媒劑(例如濃注注射、靜脈內注射、腫瘤內注射及諸如此類)一起以單位可注射形式調配。視情況地，具有期望純度之抗體-藥物結合物係以凍乾物或溶液形式與醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、賦形劑或穩定劑混合(Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980)，第16版，Osol, A.編輯)。本文所述之抗體-藥物結合物或包含抗體-藥物結合物之醫藥組合物可藉由適於欲治療個體之任一途徑來投與。 用途
本文所述之抗體-藥物結合物或其醫藥組合物可用於治療多種疾病或病症，例如具有PTK7高表現之癌症，包括實體腫瘤或血液惡性病，例如肺癌、乳癌、上皮癌(例如皮膚鱗狀細胞癌及口腔鱗狀細胞癌)、卵巢癌、食道癌(例如食道鱗狀細胞癌)及諸如此類。
因此，本申請案提供抗體-藥物結合物、藥物-連接體或包含其之醫藥組合物之用途，其用於製備用來治療具有PTK7高表現之癌症的藥物。
同時，本申請案亦提供治療具有PTK7高表現之癌症之方法，該方法包括以下步驟：向有需要之個體投與有效量之前述任一者之抗體-藥物結合物、藥物連接體或包含其之醫藥組合物。 定義
除非下文另有定義，否則如本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習此項技術者通常所理解相同之含義。提及本文所用之技術欲指此項技術中通常所理解之技術，包括為熟習此項技術者顯而易見之技術之彼等變化形式或等效技術之替代。另外，本文所用之實驗室操作步驟(例如基因體學、核酸化學及分子生物學)皆係各別領域中廣泛使用之常規步驟。儘管認為熟習此項技術者充分理解以下術語，但闡述以下定義以更好地解釋本發明。
術語「抗體」通常係指由兩對多肽鏈(每對具有一條輕鏈(LC)及一條重鏈(HC))構成之免疫球蛋白分子。抗體之輕鏈可分類為卡帕(kappa，κ)及拉姆達(lambda，λ)輕鏈。重鏈可分類為μ、δ、γ、α或ε，且抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈中，可變區及恆定區藉由具有約12個或更多個胺基酸之「J」區連接，且重鏈進一步包含具有約3個或更多個胺基酸之「D」區。每一重鏈包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區(CH)。重鏈恆定區由3個結構域(CH1、CH2及CH3)構成。每一輕鏈包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。輕鏈恆定區由一個結構域CL構成。恆定結構域並不直接參與抗體與抗原之間的結合，但顯示多種效應功能，例如調介免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統之各個細胞(如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q))之結合。VH及VL區域亦可細分成具有高可變性之區域(稱為互補決定區(CDR))，其間間雜有更保守之區域，稱為框架區(FR)。每一VH及每一VL由3個CDR及4個FR構成，其自胺基末端至羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。每一重鏈/輕鏈對之可變區(VH及VL)分別形成抗原結合位點。每一區域或結構域中胺基酸之配置係根據此項技術中已知之各個編號系統。
術語「互補決定區」或「CDR」係指抗體可變區中負責抗原結合之胺基酸殘基。重鏈及輕鏈之可變區各自包含三個CDR，命名為CDR1、CDR2及CDR3。該等CDR之確切邊界可根據此項技術中已知之各個編號系統來定義，例如如根據Kabat編號系統(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)、Chothia編號系統(Chothia及Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917；Chothia等人(1989) Nature 342:878-883)、IMGT編號系統(Lefranc等人，Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003)或AbM編號系統(Martin ACR, Cheetham JC, Rees AR (1989) Modelling antibody hypervariable loops: A combined algorithm. Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272)來定義。對於給定抗體，熟習此項技術者將容易地鑑別根據每一編號系統定義之CDR。另外，不同編號系統之間的對應性為熟習此項技術者所熟知(如，參考Lefranc等人，Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003)。
在本發明中，抗體或抗原結合片段中之CDR可根據此項技術中已知之各個編號系統來定義，如例如根據Kabat、Chothia、IMGT或AbM編號系統來定義。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段中所含之CDR係根據Chothia編號系統來定義。
可使用在www.bioinf.org.uk : Prof. Andrew C.R. Martin之小組中揭示且在下文再現之以下一般規則來定義抗體序列中之CDR，該抗體序列包括與包含抗體結合之抗原中之抗原決定基之胺基酸特異性相互作用的彼等胺基酸。很少有實例表明該等通常恆定之特徵不會出現；然而，Cys殘基係最保守之特徵。
環 Kabat AbM Chothia1 Contact2 IMGT
L1 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36 L27--L32
L2 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55 L50--L52
L3 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96 L89--L97
H1 H31--H35B (Kabat編號)3 H26--H35B H26--H32..34 H30--H35B H26--H35B
H1 H31--H35 (Chothia編號) H26--H35 H26--H32 H30--H35 H26--H33
H2 H50--H65 H50--H58 H52--H56 H47--H58 H51--H56
H3 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101 H93--H102
1該等編號方案中之一些(尤其對於Chothia環)端視所檢查之個別出版物而變化。 2任一編號方案可用於該等CDR定義，只是Contact編號方案使用Chothia或Martin (增強的Chothia)定義。 3在使用Kabat編號慣例編號時，Chothia CDR-H1環之末端端視環之長度在H32與H34之間變化。(此乃因Kabat編號方案將插入置於H35A及H35B處。) 若H35A及H35B皆不存在，則環在H32處結束 若僅存在H35A，則環在H33處結束 若H35A及H35B皆存在，則環在H34處結束
VH之整個胺基酸序列通常係根據Kabat來編號，而可變區內之三個CDR可根據上文所提及編號方案中之任一者來定義。在具體實施例中，VH中胺基酸位置之編號可為連續的，自胺基酸位置1開始且持續連續至序列末端或根據Kabat。除非另有說明，否則本文VH及VL中之胺基酸位置係根據連續編號來定義。
重鏈恆定結構域中胺基酸位置之編號可為連續的，自胺基酸位置1開始且持續連續至序列末端或根據Eu編號。IgG1重鏈恆定結構域胺基酸序列具有連續編號為1至330之330個胺基酸。根據Eu編號之相應序列自位置編號118開始且在位置編號447結束。除非另有說明，否則本文重鏈及輕鏈中之胺基酸位置係根據連續編號來定義。
術語「框架區」或「FR」殘基係指抗體可變區中除如上文所定義之CDR殘基外之彼等胺基酸殘基。
術語抗體之「抗原結合片段」係指抗體片段之多肽，例如全長抗體片段之多肽，其保留與全長抗體結合之相同抗原特異性結合之能力，及/或與全長抗體競爭與抗原之特異性結合，該全長抗體亦稱為「抗原結合片段」。通常，參考Fundamental Immunology，第7章(Paul, W.編輯，第2版，Raven Press, N.Y. (1989)，其全文出於所有目的皆以引用方式併入本文中。抗體之抗原結合片段可藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶或化學裂解來產生。抗原結合片段之非限制性實例包括Fab片段、Fab’片段、F(ab)' 2片段、F(ab)' 3片段、Fd、Fv、scFv、二scFv、(scFv) 2、二硫鍵穩定之Fv蛋白(「dsFv」)、單結構域抗體(sdAb，奈米抗體)及相似多肽，其包含足以實現與多肽之抗原特異性結合能力的抗體之至少一部分。抗體之經改造變異體匯總於Holliger等人，2005; Nat Biotechnol, 23: 1126-1136中。
術語「Fd」意指由VH及CH1結構域構成之抗體片段；術語「dAb片段」意指由VH結構域構成之抗體片段(Ward等人，Nature 341:544 546 (1989))；術語「Fab片段」意指由VL、VH、CL及CH1結構域構成之抗體片段；術語「F(ab’) 2片段」意指包含藉由鉸鏈區上之二硫橋連接之兩個Fab片段之抗體片段；術語「Fab’片段」意指在還原連接F(ab’) 2片段中之兩個重鏈片段之二硫鍵後獲得之片段，且所獲得之片段由輕鏈及重鏈之完整Fd片段(由VH及CH1結構域構成)構成。
術語「Fv」意指由抗體單臂之VL及VH結構域構成之抗體片段。Fv片段通常視為能夠形成完整抗原結合位點之最小抗體片段。通常認為，六個CDR實現與抗體之抗原結合特異性。然而，亦可使用一個可變區(例如Fd片段，其僅含特異性針對抗原之三個CDR)來識別及結合抗原，儘管其親和力可能低於完整結合位點。
術語「Fc」意指經由二硫鍵將抗體第一重鏈之第二及第三恆定區結合至第二重鏈之第二及第三恆定區形成之抗體片段。抗體之Fc片段具有多種不同之功能，但並不參與抗原結合。
術語「scFv」係指包含VL及VH結構域之單一多肽鏈，其中VL及VH藉由連接體連接(參見例如Bird等人，Science 242:423-426 (1988)；Huston等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)；及Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg及Moore編輯，Springer-Verlag, New York，第269-315頁(1994))。此類scFv分子可具有一般結構：NH 2-VL-連接體-VH-COOH或NH 2-VH-連接體-VL-COOH。先前技術中之適宜連接體包含重複GGGGS (SEQ ID NO:55)胺基酸序列或其變異體。舉例而言，可使用具有胺基酸序列(GGGGS) 4(SEQ ID NO:56)之連接體，且亦可使用其變異體(Holliger等人(1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448)。適用於本發明之其他連接體闡述於Alfthan等人(1995), Protein Eng. 8:725-731；Choi等人(2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106；Hu等人(1996), Cancer Res. 56:3055-3061；Kipriyanov等人(1999), J. Mol. Biol. 293:41-56；及Roovers等人(2001), Cancer Immunol中。在一些情形下，在scFv之VL與VH之間可能存在二硫鍵。在某些實施例中，VH及VL結構域可以任一適宜排列彼此相對定位。舉例而言，包含NH 2-VH-VH-COOH及NH 2-VL-VL-COOH之scFv。
術語「單結構域抗體(sdAb)」具有熟習此項技術者通常理解之含義，其係指由單一單體可變抗體結構域(如單一重鏈可變區)構成之抗體片段，且此類抗體片段保留與全長抗體結合之相同抗原特異性結合之能力(Holt, L.等人，Trends in Biotechnology, 21(11):484-490, 2003)。單結構域抗體亦稱為奈米抗體。
上述每一抗體片段保留與全長抗體結合之相同抗原特異性結合之能力，及/或與全長抗體競爭與抗原之特異性結合。
在本文中，除非另有說明，否則在提及術語「抗體」時，其不僅包括完整抗體，且亦包括抗體之抗原結合片段。
抗體之抗原結合片段(如上述抗體片段)可使用熟習此項技術者已知之習用技術(如重組DNA技術或酶或化學裂解方法)自給定抗體(如本發明提供之抗體)獲得，且以與完整抗體相同之方式篩選抗體之抗原結合片段之特異性。
術語「鼠類抗體」係指藉由以下方法獲得之抗體：融合經免疫小鼠之B細胞及骨髓瘤細胞，篩選可永生並分泌抗體之鼠類雜交融合細胞，且然後實施篩選、抗體製備及抗體純化；或係指在抗原侵入小鼠身體後，藉由B細胞分化及增殖形成之漿細胞分泌之抗體。
術語「人類化抗體」係指經遺傳改造之非人類抗體，其胺基酸序列已經修飾以增加與人類抗體之序列同源性。通常，人類化抗體之CDR區域中之全部或一部分衍生自非人類抗體(供體抗體)，且非CDR區域(例如可變區FR及/或恆定區)中之全部或一部分衍生自人類免疫球蛋白(受體抗體)。人類化抗體通常保留供體抗體之預期特性，包括(但不限於)抗原特異性、親和力、反應性、增強免疫細胞活性之能力、增強免疫反應之能力及諸如此類。供體抗體可為具有期望特性(例如，抗原特異性、親和力、反應性、增強免疫細胞活性之能力及/或增強免疫反應之能力)之小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物(如食蟹猴)抗體。
如本文所用之術語「一致性」係指兩個多肽之間或兩個核酸之間的序列匹配。當兩條欲比較序列中之位置經相同鹼基或胺基酸單體次單元佔據(例如，兩個DNA分子中每一者中之位置經腺嘌呤佔據，或兩個多肽中每一者中之位置經離胺酸佔據)時，該等分子在該位置係相同的。兩條序列之間的「一致性百分比」係指藉由下式獲得之函數：兩條序列共用之匹配位置數/欲比較位置數 × 100。舉例而言，若在兩條序列之10個位置中存在6個匹配，則兩條序列具有60%一致性。舉例而言，DNA序列CTGACT及CAGGTT總共具有50%一致性(在總共6個位置中存在3個匹配)。通常，在比對兩條序列以達成最大一致性時實施比較。此比對可藉由使用例如Needleman等人(1970) J. Mol. Biol.48：443-453所提出之方法達成，且通常藉由電腦程式(例如Align程式(DNAstar, Inc.))來實施。兩條胺基酸序列之間的一致性百分比亦可經由整合至ALIGN程式(2.0版)之E. Meyers及W. Miller (Comput. Appl Biosci., 4:11-17 (1988))算法、藉由使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4來確定。另外，兩條胺基酸序列之間的一致性百分比可經由整合至GCG軟體包(可在www.gcg.com上獲得)中之GAP程式中之Needleman及Wunsch (J MoI Biol. 48:444-453 (1970))算法、藉由使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣及空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來確定。
術語「保守替代」意指不會不利地影響或改變包含胺基酸序列之蛋白質/多肽之預期特性之胺基酸替代。舉例而言，保守替代可藉由此項技術中已知之標準技術(例如位點定向誘變及PCR介導之誘變)引入。保守胺基酸替代包括用具有相似側鏈之胺基酸殘基替代胺基酸殘基，例如用在物理或功能上類似於相應胺基酸殘基(例如具有相似之大小、形狀、電荷、化學特性，包括形成共價鍵或氫鍵之能力)之殘基替代。此項技術中已定義具有相似側鏈之胺基酸殘基之家族。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸及組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸及麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸及色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸及甲硫胺酸)、具有β-分枝側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸及異白胺酸)及具有芳族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及組胺酸)。因此，相應胺基酸殘基較佳地經來自同一側鏈家族之另一胺基酸殘基替代。用於鑑別胺基酸保守替代之方法為此項技術中所熟知(參見例如，Brummell等人，Biochem. 32:1180-1187 (1993)；Kobayashi等人，Protein Eng. 12(10):879-884 (1999)；及Burks等人，Proc. Natl Acad. Set USA 94:412-417 (1997)，該等文獻以引用方式併入本文中)。
本文所涉及之20種習用胺基酸之編譯遵循習用用法。參見例如Immunology-A Synthesis (第2版，E. S. Golub及D. R. Gren編輯，Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))，其以引用方式併入本文中。在本發明中，胺基酸通常顯示為此項技術中所熟知之單字母或三字母縮寫。舉例而言，丙胺酸可顯示為A或Ala。
本文之術語「包括」、「包含」、「具有」、「含有」或「涉及」及其其他變化形式具有包涵性或開放性且並不排除其他未列出之要素或方法步驟。
術語「烷基」意指藉由自直鏈或具支鏈烴基失去一個氫原子獲得之基團，例如「C 1-20烷基」、「C 1-10烷基」、「C 1-6烷基」、「C 1-4烷基」及「C 1-3烷基」。特定實例包括(但不限於)：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、異己基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1,2-二甲基丙基等。
術語「伸烷基」意指藉由自直鏈或具支鏈烴基失去兩個氫原子獲得之基團，例如「C 1-20伸烷基」、「C 1-10伸烷基」、「C 3-10伸烷基」、「C 5-8伸烷基」、「C 1-6伸烷基」、「C 1-4伸烷基」及「C 1-3伸烷基」。特定實例包括(但不限於)：亞甲基、伸乙基、1,3-伸丙基、1,4-伸丁基、1,5-伸戊基、1,6-伸己基或諸如此類。
術語「伸烯基」係指藉由自含有至少一個碳-碳雙鍵之直鏈或具支鏈烴基失去兩個氫原子獲得之二價基團，包括例如「C 2-20伸烯基」、「C 3-10伸烯基」、「C 5-8伸烯基」等。實例包括(但不限於)：伸乙烯基、1-伸丙烯基、2-伸丙烯基、1-伸丁烯基、2-伸丁烯基、1,3-伸丁二烯基、1-伸戊烯基、2-伸戊烯基、3-伸戊烯基、1,3-伸戊二烯基、1,4-伸戊二烯基、1-伸己烯基、2-伸己烯基、3-伸己烯基、1,4-伸己二烯基及諸如此類。
術語「伸炔基」係指藉由自含有至少一個碳-碳三鍵之直鏈或具支鏈烴基失去兩個氫原子獲得之二價基團，包括例如「C 2-20伸炔基」、「C 3-10伸炔基」及「C 5-8伸炔基」。實例包括(但不限於)：伸乙炔基、1-伸丙炔基、2-伸丙炔基、1-伸丁炔基、2-伸丁炔基、1,3-伸丁二炔基、1-伸戊炔基、2-伸戊炔基、3-伸戊炔基、1,3-伸戊二炔基、1,4-伸戊二炔基、1-伸己炔基、2-伸己炔基、3-伸己炔基、1,4-伸己二炔基等。
術語「雜脂環族環」係指含有至少一個選自N、O及S之環成員之飽和或部分飽和之環狀結構。特定實例包括(但不限於) 5-6員脂族雜環、5-6員含氮脂族雜環、5-6員含氧脂族雜環等，例如四氫呋喃、吡咯啶、六氫吡啶、四氫哌喃等。
術語「雜芳族環」係指含有至少一個選自N、O及S之環成員之芳族環結構。特定實例包括(但不限於) 5-6員芳族雜環、5-6員含氮芳族雜環、5-6員含氧芳族雜環等，例如呋喃、噻吩、吡咯、噻唑、異噻唑、噻二唑、噁唑、異噁唑、噁二唑、咪唑、吡唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、1,2,3-噁二唑、1,2,4-噁二唑、1,2,5-噁二唑、1,3,4-噁二唑、吡啶、嘧啶、嗒嗪、吡嗪、1,2,3-三嗪、1,3,5-三嗪、1,2,4,5-四嗪等。
術語「芳族環系統」係指包含至少一個芳族環(如苯環)或雜芳族環(如嘧啶環)之單環或多環系統，兩個或更多個芳族環及/或雜芳族芳族環可形成稠合環或可藉由單鍵連接(例如二嘧啶基苯基等)，且芳族環系統可為二價或更高之價態(如三價或四價)，例如5-20員芳族環系統。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張於2023年9月28日提出申請之中國申請案第202311284321.4號及於2022年10月14日提出申請之中國申請案第202211263034.0號的權益，該等申請案中每一者之揭示內容之全文皆以引用方式併入本文中。 序列表
本申請案含有電腦可讀序列表，其已以XML檔案格式與本申請案一起提交，該序列表之整個內容之全文皆以引用方式併入本文中。與本申請案一起提交之序列表XML檔案命名為「14463-051-228_SEQ_LISTING.xml」，創建於2023年9月14日，且大小係63,238個位元組。
以下特定實施例之描述將進一步說明本發明，但不限制本發明。熟習此項技術者可在不背離本發明之基本思想及範圍的情況下根據本發明之教示作出各種修改或改良。
關於本發明中所涉及序列之資訊闡述於下表中：
序列編號 序列名稱 序列資訊
1 101A6 VH胺基酸序列 EVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYYLSWVRQPPGKALEWLALIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDSSQSILYLQMDALRAEDSATYYCARDTLAAYWGQGTSVTVSS
2 101A6 VL胺基酸序列 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSFTCKASQDVGSAVIWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLEIK
3 101A6HZ/101A6HZm VH胺基酸序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYLSWVRQAPGKGLEWLALIRNKANGYTTEYAASVKGRFTISRDSSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDTLAAYWGQGTLVTVSS
4 101A6HZ/101A6HZm VL胺基酸序列 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQDVGSAVIWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSSYPLTFGQGTKLEIK
5 64A10 VH胺基酸序列 QVQLKESGPVLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVYWVRQPPGKGPEWLGVIWTSGNTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCVKHDGGNYVGVMNYWGQGTSVTVSS
6 64A10 VL胺基酸序列 DIQMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSQESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPPTFGGGTKLEIK
7 64A10HZ VH胺基酸序列 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVYWVRQPPGKGPEWLGVIWTSGNTNYNPSLKSRLTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCVKHDGGNYVGVMNYWGQGTLVTVSS
8 64A10HZ VL胺基酸序列 EIVMTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDYLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSISGVPSRFSGSGSGSDFTLTINSLEAEDAATYYCQNGHSFPPTFGQGTKLEIK
9 64A10HZ05 VH胺基酸序列 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVYWVRQPPGKGLEWLGVIWTSGNTNYNPSLKSRLTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCVKHDGGNYVGVMNYWGQGTLVTVSS
10 64A10HZ05 VL胺基酸序列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISDYLHWYQQKPGKAPKLLIKYASQSISGVPSRFSGSGSGSDFTLTISSLQPEDFATYYCQNGHSFPPTFGGGTKVEIK
11 101A6/101A6HZ/101A6HZm Chothia CDR H1 GFTFTDY
12 101A6/101A6HZ/101A6HZm Chothia CDR H2 RNKANGYT
13 101A6/101A6HZ/101A6HZm Chothia/kabat/AbM CDR H3 DTLAAY
14 101A6/101A6HZ/101A6HZm Chothia/Kabat/AbM CDR L1 KASQDVGSAVI
15 101A6/101A6HZ/101A6HZm Chothia/Kabat/AbM CDR L2 WASTRHT
16 101A6/101A6HZ/101A6HZm Chothia/Kabat/IMGT/AbM CDR L3 QQYSSYPLT
17 101A6/101A6HZ/101A6HZm Kabat CDR H1 DYYLS
18 101A6HZ/101A6HZm Kabat CDR H2 LIRNKANGYTTEYAASVKG
19 101A6 Kabat CDR H2 LIRNKANGYTTEYSASVKG
20 101A6/101A6HZ/101A6HZm IMGT CDR H1 GFTFTDYY
21 101A6/101A6HZ/101A6HZm IMGT CDR H2 IRNKANGYTT
22 101A6/101A6HZ/101A6HZm IMGT CDR H3 ARDTLAAY
23 101A6/101A6HZ/101A6HZm IMGT CDR L1 QDVGSA
24 101A6/101A6HZ/101A6HZm IMGT CDR L2 WAS
25 101A6/101A6HZ/101A6HZm AbM CDR H1 GFTFTDYYLS
26 101A6/101A6HZ/101A6HZm AbM CDR H2 LIRNKANGYTTE
27 64A10/64A10HZ/64A10HZ05 Chothia CDR H1 GFSLTSY
28 64A10/64A10HZ/64A10HZ05 Chothia CDR H2 WTSGN
29 64A10/64A10HZ/64A10HZ05 Chothia/Kabat/AbM CDR H3 HDGGNYVGVMNY
30 64A10/64A10HZ/64A10HZ05 Chothia/Kabat/AbM CDR L1 RASQSISDYLH
31 64A10/64A10HZ/64A10HZ05 Chothia/Kabat/AbM CDR L2 YASQSIS
32 64A10/64A10HZ/64A10HZ05 Chothia/Kabat/IMGT/AbM CDR L3 QNGHSFPPT
33 64A10/64A10HZ/64A10HZ05 Kabat CDR H1 SYGVY
34 64A10HZ/64A10HZ05 Kabat CDR H2 VIWTSGNTNYNPSLKS
35 64A10 Kabat CDR H2 VIWTSGNTNYNSALMS
36 64A10/64A10HZ/64A10HZ05 IMGT CDR H1 GFSLTSYG
37 64A10/64A10HZ/64A10HZ05 IMGT CDR H2 IWTSGNT
38 64A10/64A10HZ/64A10HZ05 IMGT CDR H3 VKHDGGNYVGVMNY
39 64A10/64A10HZ/64A10HZ05 IMGT CDR L1 QSISDY
40 64A10/64A10HZ/64A10HZ05 IMGT CDR L2 YAS
41 64A10/64A10HZ/64A10HZ05 AbM CDR H1 GFSLTSYGVY
42 64A10/64A10HZ/64A10HZ05 AbM CDR H2 VIWTSGNTN
43 人類重鏈恆定區IgG1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
44 人類輕鏈恆定區CL RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
45 突變體人類重鏈恆定區IgG1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
46 101A6HZm HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYLSWVRQAPGKGLEWLALIRNKANGYTTEYAASVKGRFTISRDSSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDTLAAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
47 101A6HZ/101A6HZm LC DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQDVGSAVIWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSSYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
48 連接體 GGFG
49 連接體 GFLG
51 連接體 GGGGG
52 101A6HZm HC 重鏈胺基酸序列(N末端之焦麩胺酸鹽或焦麩胺酸；無C末端離胺酸) XVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYLSWVRQAPGKGLEWLALIRNKANGYTTEYAASVKGRFTISRDSSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDTLAAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
53 101A6HZm HC 重鏈胺基酸序列(無C末端離胺酸) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYLSWVRQAPGKGLEWLALIRNKANGYTTEYAASVKGRFTISRDSSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDTLAAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
54 101A6HZm HC 重鏈胺基酸序列(N末端之焦麩胺酸鹽或焦麩胺酸) XVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYLSWVRQAPGKGLEWLALIRNKANGYTTEYAASVKGRFTISRDSSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDTLAAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK X係焦麩胺酸鹽或焦麩胺酸
55 連接體 GGGGS
56 連接體 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
本文之縮寫具有以下含義：
縮寫 含義 縮寫 含義
HATU N,N,N',N'-四甲基-O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽 NBS N-溴琥珀醯亞胺
DIPEA 二異丙基乙胺 THF 四氫呋喃
HPLC 高效液相層析 DMSO 二甲基亞碸
TFA 三氟乙酸鹽 DMF N,N-二甲基甲醯胺
Pd/C 碳載鈀 PyroE 焦麩胺酸鹽
以下實例中所述之化合物之結構係藉由核磁共振( 1H NMR)或質譜(MS)來測定。
經由Bruker 400 MHz核磁共振儀器實施核磁共振( 1H NMR)之測定；氘化試劑係六氘代二甲基亞碸(DMSO-d6)；且內部標準係四甲基矽烷(TMS)。
實例中所用之核磁共振(NMR)光譜中之縮寫顯示於下文中。
s：單峰，d：雙重峰，t：三重峰，q：四重峰，m：多重峰，br：寬峰，J：偶合常數，Hz：赫茲，及DMSO-d6：氘化二甲基亞碸。δ值以ppm表示。
使用Agilent (ESI)質譜儀實施質譜(MS)之測定，且型號係Agilent 6120B。 實例1 N-((S)-10-苄基-1-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1-H-吡咯-1-基)己醯胺(A-01)
將化合物A-01-1 (0.40 g, 640.59 μmol，其合成參考專利CN 111936169A)及甲磺酸伊沙替康(exatecan mesylate，0.37 g, 704.65 μmol)溶解於DMF (8 mL)中；且添加HATU (0.32 g, 832.77 μmol)及DIPEA (0.25 g, 1.92 mmol)以在25℃下反應4 h。在減壓下去除DIPEA，用水實施冷凍乾燥來去除大部分DMF以獲得粗產物，且藉由製備型高效液相層析(條件如下)純化粗產物，以獲得273 mg標題化合物。 層析管柱：Waters XBridge製備型C18 OBD 45 mm×450 mm×8.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%三氟乙酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0.00 30 70 70
5.00 30 70 70
60.00 70 30 70
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1034.4 [M+H] +。 實例2 合成N-((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺及N-((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺(1-8-A及1-8-B) 步驟1：合成1-氯-3-溴-2-甲基-5-硝基苯(1-8-2)
將化合物1-8-1 (5.00 g, 29.14 mmol)在低於25℃之溫度下溶解於正庚烷(25 mL)中；添加濃硫酸(25 mL)並加熱至50℃；在50℃下分批添加NBS (6.22 g, 34.97 mmol)，且將溫度保持在50℃下並反應2 h；且藉由薄層層析(乙酸乙酯:石油醚=1:10)監測反應。將反應溶液冷卻至室溫，然後逐滴添加至冰水中，且用甲苯萃取；合併有機相，分別用亞硫酸鈉溶液、水及飽和鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，並在減壓下濃縮；且藉由製備型高效液相層析(條件如下所示)純化粗產物，並將所得溶液冷凍乾燥，以獲得4.88 g標題化合物。 層析管柱：C18 ODS 45 mm×450 mm×8.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0 60 40 60
10 60 40 60
40 100 0 60
步驟2：合成3-氯-5-溴-4-甲基苯胺(1-8-3)
將化合物1-8-2 (4.88 g, 19.48 mmol)在25℃下溶解於乙酸乙酯(100 mL)中，且添加碳載鉑(2.00 g, 19.48 mmol, 5%含量)。在氫替代後，將反應在60℃下在氫保護下實施4 h，且藉由高效液相層析-質譜監測反應。將反應溶液過濾且濃縮，以獲得3.68 g標題化合物之粗產物，其未經進一步純化即直接用於下一反應中。 步驟3：合成N-(3-氯-5-溴-4-甲基苯基)乙醯胺(1-8-4)
將化合物1-8-3 (3.63 g, 14.82 mmol)在20℃下溶解於乙酸乙酯(70 mL)中；添加三乙胺(4.50 g, 44.45 mmol)及乙酸酐(2.27 g, 22.23 mmol)，將反應在20℃下保持20 h，且藉由高效液相層析-質譜監測。將水添加至反應液體中；用乙酸乙酯實施萃取；合併有機相，經無水硫酸鈉乾燥，並在減壓下濃縮以獲得粗產物，將其於乙酸乙酯:石油醚=1:5之混合物中製成漿液，以獲得2.86 g標題化合物。 步驟4：合成4-(5-乙醯胺基-3-氯-2-甲基苯基)丁-3-烯酸(1-8-5)
將化合物1-8-4 (1.80 g, 6.86 mmol)在20℃下溶解於THF (20 mL)及水(5 mL)中；添加乙烯基乙酸(708.31 mg, 8.23 mmol)、DIPEA (1.95 g, 15.08 mmol)及參(鄰甲基苯基)磷(62.60 mg, 0.20 mmol)；並用氮沖洗反應系統且然後加熱至70℃並保持5 h；且藉由HPLC-MS監測反應。將1 N氫氧化鈉溶液添加至反應溶液中以調節pH=8；添加乙酸乙酯進行萃取；用1 N鹽酸調節水相直至達到pH=3，且然後用乙酸乙酯萃取；且合併有機相，經無水硫酸鈉乾燥，並在減壓下濃縮，以獲得0.82 g標題化合物，其直接用於下一反應中。 步驟5：合成4-(5-乙醯胺基-3-氯-2-甲基苯基)丁酸(1-8-6)
將化合物1-8-5 (2.60 g, 9.71 mmol)在20℃下溶解於THF (50 mL)中；添加Pd/C (0.52 g，含量10%)；使用填充有氫氣之氣球將系統置於正氫壓力下，並在40℃下反應2 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。將反應溶液過濾，且濃縮濾液以獲得2.43 g標題化合物，其未經進一步純化即直接用於下一反應中。 步驟6：合成N-(3-氯-4-甲基-8-側氧基-5,6,7,8-四氫萘-1-基)乙醯胺(1-8-7)
將化合物1-8-6 (2.43 g, 9.01 mmol)溶解於三氟乙酸(10 mL)中，且冷卻至5℃；逐滴添加三氟乙酸酐(3.78 g, 18.02 mmol, 2.50 mL)；將溫度維持在5℃下並反應4 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。將反應溶液添加至水中，且溶解於10 N氫氧化鈉中以調節pH=9；添加乙酸乙酯進行萃取；合併有機相，經無水硫酸鈉乾燥，在減壓下濃縮，且藉由矽膠管柱(乙酸乙酯:石油醚=0-20%)純化，以獲得1.53 g標題化合物。 步驟7：合成(Z)-N-(3-氯-7-(羥基亞胺基)-4-甲基-8-側氧基-5,6,7,8-四氫萘-1-基)乙醯胺(1-8-8)
將第三丁醇鉀(1.50 g, 13.37 mmol)在5℃下溶解於THF (16 mL)及第三丁醇(4 mL)中；逐滴添加THF溶液(16 mL)中之化合物1-8-7 (1.53 g, 6.08 mmol)；10 min後，逐滴添加亞硝酸戊酯(1.14 g, 9.73 mmol)；並將反應在5℃下保持1 h且藉由高效液相層析-質譜監測。用1 N鹽酸將反應溶液調節至pH=5，且用乙酸乙酯萃取；合併有機相，經無水硫酸鈉乾燥，並在減壓下濃縮；且用甲基第三丁基醚將粗產物製成漿液，以獲得1.20 g標題化合物。 步驟8：合成N-(7-胺基-3-氯-4-甲基-8-側氧基-5,6,7,8-四氫萘-1-基)乙醯胺(1-8-9)
將化合物1-8-8 (0.50 g, 1.78 mmol)在20℃下溶解於甲醇(8 mL)及2 N鹽酸(8 mL)中；添加Pd/C (0.15 g，含量10%)；使用填充有氫氣之氣球將系統置於正氫壓力下，在5℃下反應2 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。將反應溶液過濾且濃縮，以獲得0.52 g標題化合物，其未經進一步純化即直接用於下一反應中。 步驟9：合成N,N’-(3-氯-4-甲基-8-側氧基-5,6,7,8-四氫萘-1,7-二基)二乙醯胺(1-8-10)
將化合物1-8-9 (0.52 g, 1.70 mmol)在20℃下溶解於吡啶(5 mL)中；添加乙酸酐(2 mL)；並將反應在20℃下維持2 h，且藉由高效液相層析-質譜監測。將反應溶液添加至水中；添加乙酸乙酯進行萃取；用水洗滌有機相，合併，經無水硫酸鈉乾燥，在減壓下濃縮，且藉由矽膠管柱(乙酸乙酯:石油醚=0-30%)純化，以獲得0.22 g標題化合物。 步驟10：合成N-(8-胺基-6-氯-5-甲基-1-側氧基-1,2,3,4-四氫萘-2-基)乙醯胺(1-8-11)
將化合物1-8-10 (450.97 mg, 1.46 mmol)在20℃下溶解於甲醇(16 mL)中；添加2 N鹽酸(16 mL)，且加熱至60℃並保持2 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。將飽和碳酸氫鈉溶液添加至冷卻的反應溶液中以調節pH=8；添加乙酸乙酯進行萃取；合併有機相，經無水硫酸鈉乾燥，並在減壓下濃縮，以獲得230.00 mg標題化合物，其未經進一步純化即直接用於下一步驟中。 步驟11：合成N-((9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)乙醯胺(1-8-12)
將化合物1-8-11 (230.00 mg, 0.78 mmol)溶解於甲苯(10 mL)中；添加(S)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1H-哌喃并[3,4-f]吲嗪-3,6,10(4H)-三酮(230.00 mg, 0.87 mmol)及對甲苯磺酸(26.73 mg, 0.16 mmol)，且加熱至140℃並反應5 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。濃縮反應溶液，且藉由矽膠管柱(甲醇:二氯甲烷=0-10%)純化粗產物，以獲得150.00 mg標題化合物。 步驟12：合成(9S)-1-胺基-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氫-10H,13H-苯并哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮(1-2)
將化合物1-8-12 (40.00 mg, 0.081 mmol)添加至濃鹽酸(1 mL)中，且加熱至100℃並保持5 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。將反應溶液過濾，藉由製備型高效液相層析(條件如下所示)純化濾液，並將所得溶液冷凍乾燥，以獲得標題化合物1-2鹽酸鹽。在以下純化條件下分離化合物1-2鹽酸鹽以獲得兩種異構物，根據滯留時間命名為1-2-A (5.00 mg三氟乙酸鹽，滯留9.85 min)及1-2-B (7.00 mg三氟乙酸鹽，滯留10.62 min)。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%三氟乙酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0 5 95 28
2 5 95 28
18 50 50 28
結構表徵數據如下： 1-2-A： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.42 (s, 3H), 8.27 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.59 (s, 1H), 5.78-5.63 (m, 1H), 5.50-5.36 (m, 3H), 5.10-5.06 (m, 1H), 3.20-3.04 (m, 2H), 2.56 (s, 3H), 2.26-2.13 (m, 2H), 1.93-1.79 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.2 Hz, 3H)。
ESI-MS (m/z): 452.1 [M+H] +。
1-2-B： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.42 (s, 3H), 8.27 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.58 (s, 1H), 5.78-5.63 (m, 1H), 5.50-5.36 (m, 3H), 5.10-5.06 (m, 1H), 3.20-3.04 (m, 2H), 2.55 (s, 3H), 2.26-2.13 (m, 2H), 1.93-1.79 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.2 Hz, 3H)。
ESI-MS (m/z): 452.0 [M+H] +。 步驟13：合成2-((第三丁基二苯基矽基)氧基)-N-((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)乙醯胺及2-((第三丁基二苯基矽基)氧基)-N-((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)乙醯胺(1-8-13-A及1-8-13-B)
將化合物1-2之鹽酸鹽(40.00 mg, 81.91 μmol)在25℃下溶解於N,N-二甲基甲醯胺(1 mL)中；添加2-((第三丁基二苯基矽基)氧基)乙酸(30.91 mg, 98.29 μmol)、HATU (62.25 mg, 163.81 μmol)及N,N-二異丙基乙胺(42.34 mg, 327.63 μmol)；並將反應在25℃下保持0.5 h，且藉由高效液相層析-質譜監測。完成反應後，將水添加至反應溶液中；添加二氯甲烷/甲醇(v/v=10/1)進行萃取；合併有機相，經無水硫酸鈉乾燥並在減壓下濃縮；且藉由製備型薄層層析(二氯甲烷:甲醇=20:1)純化粗產物並分離，以獲得兩種異構物；且根據Rf值，將兩種異構物命名為1-8-13-A (15.00 mg，Rf值係0.3)及1-8- 13-B (12.00 mg，Rf值係0.35)。 步驟14：合成N-((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺及N-((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺(1-8-A及1-8-B)
將1-8-13-A (15.00 mg)及1-8-13-B (12.00 mg)分別在兩個反應燒瓶中在25℃下溶解於四氫呋喃(1 mL)中；逐滴添加四丁基氟化銨(四氫呋喃中之1M)/冰乙酸混合物(v/v=13/1) (50 uL)；並將反應在25℃下保持0.5 h，且藉由高效液相層析-質譜監測。完成反應後，分別藉由製備型高效液相層析純化反應溶液，且分別將所得溶液冷凍乾燥，以獲得各別標題化合物1-8-A (即1-10) (6.94 mg)及1-8-B (即1-9) (4.00 mg)。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸) 時間[min]  移動相A [%]      移動相B [%]      流量[mL/min]
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0 20 80 28
3 20 80 28
18 90 10 28
1-8-A (即1-10)之結構表徵數據如下： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.43 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 5.65-5.36 (m, 4H), 5.21 (q, J = 19.0 Hz, 2H), 3.95 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 3.26-3.11 (m, 2H), 2.53 (s, 3H), 2.30-2.08 (m, 2H), 1.94-1.79 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H)。
ESI-MS (m/z): 510.1 [M+H] +。
1-8-B (即1-9)之結構表徵數據如下： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.45 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.64-5.35 (m, 4H), 5.19 (q, J = 19.0 Hz, 2H), 3.97 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 3.27-3.10 (m, 2H), 2.51 (s, 3H), 2.27-2.10 (m, 2H), 1.93-1.80 (m, 2H), 0.88 (t, J = 7.3 Hz, 3H)。
ESI-MS (m/z): 510.1 [M+H] +。 實例3 N-((10S)-10-苄基-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’;6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-己-5-炔醯胺及N-((10S)-10-苄基-1-(((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’;6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5 ,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-己-5-炔醯胺(A-07-A(A -05)及A-07-B(A-06)) 步驟1：合成(S)-10-苄基-23-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-6,9,12,15,18-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十三烷-22-炔甲酸(A-07-3)
將化合物A-07-2 (30.00 mg, 0.07 mmol)在25℃下溶解於DMF (0.2 mL)中；添加 2,5-二側氧基吡咯啶-1-基-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己炔-5-酸酯(A-07-1, 28.00 mg, 0.08 mmol)，並在30℃下反應1 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。藉由製備型高效液相層析(條件如下所示)直接純化反應溶液，並將所得溶液冷凍乾燥，以獲得20.00 mg標題化合物。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 691.0 [M+H 2O] +。 步驟2：合成N-((10S)-10-苄基-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’;6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-己-5-醯胺及N-((10S)-10-苄基-1-(((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’;6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-己-5-醯胺(A-07-A及A-07-B)
將1-2之鹽酸鹽(30.00 mg, 61.43 μmol)在25℃下溶解於N,N-二甲基甲醯胺(1 mL)中；依序添加A-07-3 (49.66 mg, 73.72 μmol)、HATU (35.01 mg, 92.14 μmol)及N,N-二異丙基乙胺(23.82 mg, 184.29 μmol)；並將反應在25℃下保持0.5 h且藉由高效液相層析-質譜監測。完成反應後，藉由製備型高效液相層析(條件如下所示)純化反應溶液，並將所得溶液冷凍乾燥，以獲得標題化合物A-07。在以下純化條件下分離A-07，以獲得兩種異構物，根據滯留時間命名為A-07-A (即A-05) (11.04 mg，滯留時間係7.5 min)及A-07-B (即A-06) (19.42 mg，滯留時間係8.0 min)。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0 30 70 28
3 30 70 28
18 90 10 28
結構表徵數據如下： A-07-A (即A-05)： ESI-MS (m/z): 1107.3 [M+H] +。
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.10 (s, 2H), 8.66 - 8.63 (m, 1H), 8.51 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.34 - 8.31 (m, 1H), 8.21 - 8.19 (m, 1H), 8.17 - 8.09 (m, 2H), 8.08 - 8.04 (m, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.26 - 7.15 (m, 5H), 6.55 (s, 1H), 5.56 - 5.55 (m, 1H), 5.48 - 5.35 (m, 2H), 5.25 - 5.10 (m, 2H), 4.64 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 4.45 - 4.44 (m, 1H), 4.06 - 3.98 (m, 2H), 3.77 -3.52 (m, 6H), 3.41 (s, 3H), 3.25 - 3.12 (m, 2H), 3.03 - 3.00 (m, 1H), 2.83 - 2.72 (m, 1H), 2.58 - 2.56 (m, 2H), 2.48 (s, 3H), 2.33 - 2.30 (m, 2H), 2.21 - 2.13 (m, 2H), 1.91 - 1.76 (m, 4H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。
A-07-B (即A-06)： ESI-MS (m/z): 1107.3 [M+H] +。 實例4 (S)-7-乙基-7-羥基-14-(2-(異丙基胺基)乙基)-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮(2-2) 步驟1：合成3-(異丙基胺基)-1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧雜環己烯-5-基)丙-1-酮(2-2-2)
將化合物2-2-1 (1.90 g, 8.08 mmol)在0℃下緩慢添加至硝酸(8 mL)中，且將溫度緩慢升溫至25℃並反應1 h。藉由反相管柱層析(乙腈/0.5%甲酸水溶液)直接純化反應溶液，以獲得1.50 g標題化合物之甲酸鹽。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 281.1 [M+H] +。 步驟2：合成1-(6-胺基苯并[d][1,3]二氧雜環己烯-5-基)-3-(異丙基胺基)丙-1-酮(2-2-3)
將化合物2-2-2之甲酸鹽(1.25 g, 4.46 mmol)添加至四氫呋喃(20 mL)中；添加10%碳載鈀(125.00 mg)；實施三次氫替代；且然後將反應在25℃下實施16 h。經由矽藻土過濾反應溶液，且將濾液在減壓下濃縮至乾燥，以獲得895.00 mg標題化合物之粗產物，其未經純化即直接用於下一反應中。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 251.1 [M+H] +。 步驟3：合成((S)-7-乙基-7-羥基-14-(2-(異丙基胺基)乙基)-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮(2-2)
將化合物2-2-3 (23.00 mg, 0.09 mmol)及(4S)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1H-哌喃并[3,4-f]吲嗪-3,6,10(4H)-三酮(21.00 mg, 0.09 mmol)溶解於甲苯(4 mL)中；且添加對甲苯磺酸(1.40 mg, 0.009 mmol)，並將反應在140℃下實施12 h。在減壓下去除溶劑，以獲得標題化合物之粗產物；藉由HPLC (移動相A：乙腈，移動相B：0.05%甲酸水溶液)純化粗產物，且將3滴3 M鹽酸添加至製備溶液中，然後冷凍乾燥，以獲得8.70 mg標題化合物之鹽酸鹽。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z)：478.2 [M+H] +。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.38 (brs, 2H), 7.85 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.30 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 5.43 (s, 2H), 5.30 (s, 2H), 3.57 - 3.45 (m, 2H), 3.40 - 3.25 (m, 1H), 3.22 - 3.06 (m, 2H), 1.95 - 1.77 (m, 2H), 1.27 (d, J = 6.4 Hz, 6H), 0.87 (t, J = 7.6 Hz, 3H)。 實例5 合成碳酸((S)-4-乙基-11-(2-(N-異丙基甲基磺醯胺基)乙基)-3,14-二側氧基-3,4,12,14-四氫-1H-哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-4-基)酯4-((S)-2-(4-胺基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二側氧基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧雜-3,9-二氮雜三十五基醯胺基)苄基酯(B-01) 步驟1：合成碳酸(4-((S)-2-(4-(((4-甲基氧基苯基)二苯基甲基)胺基)丁基)-35-(4-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二側氧基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧基-3,9-二氮雜三十五基醯胺基)苄基)酯(S)-4-乙基-11-(2-(N-異丙基甲磺醯胺基)乙基)-3,14-二側氧基-3,4,12,14-四氫-1H-哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-4-基酯(B-01-2)
將化合物B-01-1 (413.40 mg, 0.251 mmol，其合成參考專利CN111295389B)在室溫下溶解於二甲基亞碸及水(2.0 mL:0.5 mL)中；添加溴化亞銅(72.95 mg, 0.503 mmol)及6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)-己-5-炔醯胺(95.10 mg, 0.302 mmol)，且在攪拌1 h後過濾；並藉由製備型高效液相層析(條件如下所示)純化濾液，以獲得30.00 mg標題化合物。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0.00 40 60 28
8.00 40 60 28
50.00 90 10 28
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 815.9 [(M-273)/2+H] +。 步驟2：合成碳酸((S)-4-乙基-11-(2-(N-異丙基甲基磺醯胺基)乙基)-3,14-二側氧基-3,4,12,14-四氫-1H-哌喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-4-基)酯4-((S)-2-(4-胺基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二側氧基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧雜-3,9-二氮雜三十五基醯胺基)苄基酯(B-01)
將化合物B-01-3 (30.00 mg, 0.02 mmol)溶解於二氯甲烷(1.0 mL)中；且將三氟乙酸(0.2 mL)添加至反應溶液中，並在室溫下反應30 min。在減壓下濃縮反應溶液且藉由製備型高效液相層析(條件如下)純化，以獲得20.00 mg標題化合物之三氟乙酸鹽。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%三氟乙酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0.00 15 85 28
8.00 15 85 28
50.00 60 40 28
結構表徵數據如下：ESI-MS (m/z): 508.2 [M+H] +。 實例6 (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((2-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷并[4,5-g]哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)(異丙基)胺甲醯基)氧基)甲基)-2-(2-(2-(2-(6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)乙氧基)乙氧基)乙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-哌喃-2-甲酸(B-03) 步驟1：合成(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(羥基甲基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-哌喃-3,4,5-三乙酸酯(B-03-3)
將化合物(2R,3R,4S,5S,6S)-2-溴-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-哌喃-3,4,5-三乙酸三酯(B-03-1, 12.32 g, 31.02 mmol)及4-羥基-3-硝基苄醇(化合物B-03-2, 5.00 g, 29.56 mmol)溶解於乙腈(200 mL)中；在攪拌的同時添加氧化銀(27.40 g, 118.25 mmol)；且在氮替代後，將反應在室溫下在黑暗中實施12 h。藉由高效液相層析-質譜監測反應；經由矽藻土過濾反應溶液，並在減壓下濃縮濾液且然後藉由矽膠管柱層析(石油醚:乙酸乙酯= 1:3)純化，以獲得12.80 g標題化合物。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 503 [M+18] +。 步驟2：合成(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-胺基-4-(羥基甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-哌喃-3,4,5-三乙酸酯(B-03-4)
將化合物B-03-3 (2.20 g, 4.53 mmol)溶解於乙酸乙酯及四氫呋喃(各自50 mL)中；添加PtO 2(0.20 g)；且然後將反應系統用氫氣球替代三次；並將反應在氫氣氛下實施2 h。藉由高效液相層析-質譜監測反應；直接過濾反應液體；且用乙酸乙酯沖洗濾餅，並將濾液在減壓下蒸發至乾燥，以獲得2.02 g標題化合物之粗產物，其直接用於下一反應中。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 456.1 [M+1] +。 步驟3：合成(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(1-(9H-茀-9-基)-3-側氧基-2,7,10-三氧基-4-氮雜十二基-12-胺基)-4-(羥基甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-哌喃-3,4,5-三乙酸酯(B-03-5)：將化合物B-03-4 (456.00 mg, 1.00 mmol)及[2-[2-(Fmoc-胺基)乙氧基]乙氧基]乙酸(385.91 mg, 1.00 mmol)溶解於二氯甲烷(10 mL)中；在攪拌的同時添加2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氫喹啉(495.22 mg, 2.00 mmol)；且將反應物攪拌2 h。藉由高效液相層析質譜監測反應；並在減壓下濃縮反應溶液且然後藉由矽膠管柱層析(甲醇:二氯甲烷=1:20)純化，以獲得507.00 mg標題化合物。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 823.3 [M+1] +。 步驟4：合成(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(1-(9H-茀-9-基)-3,11-二側氧基-2,7,10-三氧雜-4,12-二氮雜十二基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-哌喃-3,4,5-三乙酸酯(B-03-6)
將化合物B-03-5 (507.00 mg, 616.18 μmol)及二異丙基乙胺(238.91 mg, 1.85 mmol)溶解於二氯甲烷(20 mL)中；然後將氯甲酸對硝基苯基酯(372.60 mg, 1.85 mmol)溶解於二氯甲烷(1 mL)中，且逐滴緩慢添加至反應溶液中；並在完成添加後，將反應在室溫下實施15 h。藉由高效液相層析-質譜監測反應；並在減壓下濃縮反應溶液且然後藉由矽膠管柱層析(甲醇:二氯甲烷=1:20)純化，以獲得496.00 mg標題化合物。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 988.5 [M+1] +。 步驟5：合成4-((((2-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧基-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷并[4,5-g]哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)(異丙基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-哌喃-3,4,5-三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(1-(9H-茀-9-基)-3-側氧基-2,7,10-三氧基-4-氮雜十二烷醯醯胺基-12-胺基)酯(B-03-7)
將化合物B-03-6 (165.51 mg, 0.17 mmol)、化合物2-2 (40.00 mg, 0.084 mmol)及1-羥基苯并三唑(33.96 mg, 0.25 mmol)溶解於DMF (4 mL)中；逐滴添加二異丙基乙胺(32.48 mg, 0.25 mmol)，並在攪拌下反應12；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。添加水及乙酸乙酯並攪拌，且然後靜置以使相分離；且用飽和鹽水洗滌有機相，乾燥，並在減壓下濃縮，以獲得100.00 mg標題化合物之粗產物，其直接用於下一反應中。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1326.2 [M+1] +。 步驟6：合成(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙醯胺基)-4-((((2-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧基-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷并[4,5-g]哌喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)(異丙基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-哌喃-2-甲酸(B-03-8).
將化合物B-03-7 (100.00 mg, 0.08 mmol)溶解於MeOH (5 mL)中；逐滴添加1滴二氯甲烷；逐滴添加氫氧化鋰單水合物(15.82 mg, 0.377 mmol)之水溶液(1 mL)，且將反應物攪拌2 h。藉由高效液相層析-質譜監測反應；逐滴添加3 N鹽酸水溶液以將反應溶液調節至pH=4；在減壓下濃縮產物且然後藉由製備型高效液相層析(條件如下所示)純化；並將所得溶液冷凍乾燥，以獲得27.00 mg標題化合物。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0.00 20 80 28
2.00 20 80 28
18.00 80 20 28
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 964.2 [M+1] +。 步驟7：合成(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷并[4,5-g]哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)(異丙基)胺甲醯基)氧基)甲基)-2-(2-(2-(2-(6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)乙氧基)乙氧基)乙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-哌喃-2-甲酸(B-03).
將化合物B-03-8 (27.00 mg, 0.03 mmol)及6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己炔-5-酸2,5-二氧基吡咯啶-1-基酯(A-07-1) (11.26 mg, 0.03 mmol)溶解於DMF (1 mL)中；在攪拌的同時逐滴添加二異丙基乙胺(3.62 mg, 0.03 mmol)，並在室溫下反應4 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。藉由製備型高效液相層析(條件如下所示)純化反應溶液，並將所得溶液冷凍乾燥，以獲得11.70 mg標題化合物。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0.00 20 80 28
2.00 20 80 28
18.00 80 20 28
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1214.4 [M+1] +。 實例7 合成N-((1S,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺及N-((1R,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺(1-11-A及1-11-B) 步驟1：合成3-溴-4-氯-5-氟苯胺(1-5-02)
將化合物1-5-01 (2.00 g, 10.53 mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(30 mL)中；然後緩慢添加N-氯琥珀醯亞胺(1.69 g, 12.63 mmol)；完成添加後，將反應在室溫下實施16 h；且藉由高效液相層析-質譜偵測反應。在減壓下濃縮反應溶液以獲得粗產物，且藉由急速層析使用矽膠管柱(乙酸乙酯:石油醚=0-25%)純化粗產物，以獲得0.95 g標題化合物。
結構表徵數據如下： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 6.77 (dd, J = 2.5, 1.4 Hz, 1H), 6.51 (dd, J = 11.7, 2.5 Hz, 1H), 5.84 (s, 2H)。 步驟2：合成N-(3-溴-4-氯-5-氟苯基)乙醯胺(1-5-03)
將化合物1-5-02 (0.95 g, 4.23 mmol)溶解於乙酸乙酯(20 mL)中，且在氮保護下添加乙酸酐(648.13 mg, 6.35 mmol)；完成添加後，將溫度升溫至50℃並反應15 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。用甲醇(5 mL)淬滅反應溶液，且直接在減壓下蒸發至乾燥以獲得粗產物，藉由急速層析使用矽膠管柱(乙酸乙酯:石油醚=0-40%)純化該粗產物，以獲得1.01 g標題化合物。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 265.9 [M+H] +。 步驟3：合成(E)-4-(5-乙醯胺基-2-氯-3-氟苯基)-3-丁烯酸(1-5-04)
將化合物1-5-03及3-丁烯酸(387.65 mg, 4.50 mmol)溶解於1,4-二噁烷(24 mL)及水(8 mL)之混合物中，且然後添加N,N-二異丙基乙胺(1.45 g, 11.26 mmol)、參(鄰甲基苯基)磷(114.21 mg, 375.24 μmol)及乙酸鈀(42.12 mg, 187.62 μmol)；完成添加後，用氮氣替代反應系統中之氣氛，且在氮氣氛下將溫度升溫至100℃並反應16 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。將反應溶液冷卻至室溫後，添加1 N氫氧化鈉水溶液(60 mL)及乙酸乙酯(50 mL)且振蕩以使相分離。分離出下層水相後，用4 mol/L鹽酸水溶液將pH調節至約3；然後添加乙酸乙酯進行萃取；合併有機相，用飽和鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，且過濾；並將濾液在減壓下蒸發至乾燥，以獲得1.00 g標題化合物之粗產物。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 272.0 [M+H] +。 步驟4：合成4-(5-乙醯胺基-2-氯-3-氟苯基)丁酸(1-5-05)
將化合物1-5-04之粗產物(1.00 g, 3.68 mmol)溶解於四氫呋喃(15 mL)中；然後添加10%碳載鈀(0.10 g)；完成添加後，將反應系統用氫氣球替代三次，並將反應在氫氣氛下實施4 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。將反應溶液過濾，且將濾液在減壓下濃縮至乾燥，以獲得1.00 g標題化合物之粗產物。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 274.0 [M+H] +。 步驟5：合成N-(4-氯-3-氟-8-側氧基-5,6,7,8-四氫萘-1-基)乙醯胺(1-5-06)
將化合物1-5-05之粗產物(1.00 g, 3.65 mmol)溶解於三氟乙酸(5 mL)中；冷卻至5℃後，緩慢添加三氟乙酸酐(3.84 g, 18.27 mmol, 2.54 mL)；完成添加後，將溫度保持在5℃下並反應2 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。將反應溶液緩慢傾倒至水中，且然後用乙酸乙酯萃取；合併有機相，用飽和鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，且然後過濾；並將濾液在減壓下蒸發至乾燥以獲得粗產物，藉由急速層析使用矽膠管柱純化該粗產物，以獲得0.43 g標題化合物。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 256.1 [M+H] +。 步驟6：合成N-(4-氯-3-氟-7-(羥基亞胺基)-8-側氧基-5,6,7,8-四氫萘-1-基)乙醯胺(1- 5-07)
將四氫呋喃(16 mL)及第三丁醇(4 mL)添加至反應溶液瓶中；且在冰浴中冷卻至5℃後，添加第三丁醇鉀(415.18 mg, 3.70 mmol)；將化合物1-5-06 (0.43 mg, 1.68 mmol)溶解於四氫呋喃(1 mL)中，並逐滴添加至反應溶液中；10 min後，另外添加亞硝酸異戊酯(315.24 mg, 2.69 mmol)；完成添加後，將溫度保持在5℃下並反應1 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。用飽和氯化銨水溶液淬滅反應溶液，且用乙酸乙酯萃取；合併有機相，用飽和鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，然後過濾；並在減壓下濃縮濾液，以獲得455.00 mg標題化合物之粗產物。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 285.0 [M+H] +。 步驟7：合成N-(7-胺基-4-氯-3-氟-8-側氧基-5,6,7,8-四氫萘-1-基)乙醯胺(1-5-08)
將化合物1-5-07之粗產物(0.40 g, 1.41 mmol)溶解於甲醇(10 mL)中；然後添加3 mol/L鹽酸水溶液(1 mL)及10%碳載鈀(40.00 mg)；完成添加後，用氫氣替代反應系統中之氣氛；將反應在室溫下在氫氣氛下實施1 h，且藉由高效液相層析-質譜監測。將反應溶液過濾，並在減壓下濃縮濾液，以獲得0.43 mg標題化合物之粗鹽酸鹽。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 271.0 [M+H] +。 步驟8：合成(8-乙醯胺基-5-氯-6-氟-1-側氧基-1,2,3,4-四氫萘-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(1-5-09)
將化合物1-5-08之粗鹽酸鹽(0.43 g, 1.19 mmol)溶解於1,4-二噁烷(15 mL)中；然後添加碳酸氫鈉(400.35 mg, 4.77 mmol)、水(5 mL)及碳酸9-茀基甲基-N-琥珀醯亞胺基酯(481.81 mg, 1.43 mmol)；完成添加後，在攪拌的同時將反應在室溫下實施2 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。將反應溶液傾倒至水中，且然後用乙酸乙酯萃取；合併有機相，用飽和鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，且過濾；並在減壓下濃縮濾液以獲得粗產物。藉由C18反相管柱(乙腈:水中之0.05%甲酸=20%-100%)純化粗產物，以獲得301.00 mg標題化合物。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 493.2 [M+H] +。 步驟9：合成(8-胺基-5-氯-6-氟-1-側氧基-1,2,3,4-四氫萘-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(1-5-10)
將化合物1-5-09 (300.00 mg, 608.61 μmol)溶解於二噁烷(5 mL)中；添加12 mol/L濃鹽酸(1 mL)；完成添加後，將溫度升溫至60℃並反應2 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。將反應溶液傾倒至水中，且然後用乙酸乙酯萃取；合併有機相，用飽和鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，且過濾；並在減壓下濃縮濾液以獲得粗產物。藉由急速層析使用矽膠管柱(乙酸乙酯:石油醚=0-50%)純化粗產物，以獲得198.00 mg標題化合物。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 451.1 [M+H] +。 步驟10：合成((9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(1-5-11)
將(S)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1H-哌喃并[3,4-f]吲嗪-3,6,10(4H)-三酮(138.72 mg, 526.96 μmol)及化合物1-5-10 (198.00 mg, 439.13 μmol)添加於甲苯(10 mL)中；然後添加對甲苯磺酸(75.53 mg, 439.13 μmol)；完成添加後，將溫度升溫至140℃並反應4 h；將反應溶液在140℃下在減壓下直接蒸發至乾燥以獲得粗產物，藉由急速層析使用矽膠管柱(甲醇:二氯甲烷=0-5%)純化該粗產物，以獲得256.00 mg標題化合物。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 678.1 [M+H] +。 步驟11：合成(1S,9S)-1-胺基-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-1,2,3,9,12,15-六氫-10H,13H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮及(1R,9S)-1-胺基-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-1,2,3,9,12,15-六氫-10H,13H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮(1-5-A及1-5-B)
將化合物1-5-11 (201.18 mg, 296.67 μmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(4 mL)中；然後添加二乙胺(108.49 mg, 1.48 mmol)；完成添加後，將反應在室溫下實施0.5 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。在減壓下自反應溶液蒸餾掉乙二胺後，用1 mol/L鹽酸水溶液將pH調節至2-3；且藉由製備型高效液相層析直接純化反應溶液，以獲得標題化合物1-5-A (44.00 mg)及1-5-B (43.00 mg)。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0 10 90 28
3 10 90 28
18 70 30 28
1-5-A (首先出現6 min LCMS峰，滯留時間：1.276 min)
結構表徵數據如下： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.00 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 7.33 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.62 (d, J = 19.3 Hz, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.38 (d, J = 19.3 Hz, 1H), 4.43-4.38 (m, 1H), 3.28-3.10 (m, 2H), 2.22-2.12 (m, 1H), 2.12-2.02 (m, 1H), 1.93-1.80 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H)。
ESI-MS (m/z): 456.1 [M+H] +。
1-5-B (稍後出現6 min LCMS峰，滯留時間：1.300 min)之結構表徵數據如下： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ7.98 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H), 5.61 (d, J = 19.4 Hz, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.32 (d, J = 19.4 Hz, 1H), 4.44-4.36 (m, 1H), 3.33-3.25 (m, 1H), 3.22-3.11 (m, 1H), 2.23 - 2.13 (m, 1H), 2.11-2.03 (m, 1H), 1.96 -1.82 (m, 2H), 0.89 (t, J = 7.3 Hz, 3H)。
ESI-MS (m/z): 456.1 [M+H] +。
6 min LCMS條件： 層析管柱：Waters SunFire C18 OBD 4.6 mm×50 mm×5.0 μm 移動相A：0.05%乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0 90 10 2
4.2 10 90 2
5.7 10 90 2
5.71 90 10 2
6.70 90 10 2
步驟12：合成N-((10S)-10-苄基-1-(((1S,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺及N-((10S)-10-苄基-1-(((1R,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺(1-5-12-A及1-5-12-B)
將呈單一構形之化合物1-5-A (36.00 mg, 79.70 μmol)及化合物A-07-3 (64.43 mg, 95.64 μmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(2 mL)中；然後添加4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(46.98 mg, 159.40 μmol)及三乙胺(24.19 mg, 239.10 μmol)；完成添加後，將反應在室溫下實施1 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。藉由高效液相層析直接純化反應溶液，以獲得呈單一構形之標題化合物1-5-12-A (51.00 mg, A-14)。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0 30 70 28
3 30 70 28
18 90 10 28
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1111.0 [M+H] +。
將呈單一構形之化合物1-5-B (36.00 mg, 79.70 μmol)及化合物A-07-3 (64.43 mg, 95.64 μmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(2 mL)中；然後添加4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(46.98 mg, 159.40 μmol)及三乙胺(24.19 mg, 239.10 μmol)；完成添加後，將反應在室溫下實施1 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。藉由高效液相層析直接純化反應溶液，以獲得呈單一構形之標題化合物1-5-12-B (52.00 mg, A-15)。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0 30 70 28
3 30 70 28
18 90 10 28
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1111.0 [M+H] +。 步驟13：合成N-((1S,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺及N-((1R,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺(1-11-A及1-11-B)
將化合物1-5-12-A (40.00 mg, 35.99 μmol)稱重且溶解於二氯甲烷(2 mL)及甲醇(1 mL)之混合溶劑中；然後添加4 mol/L之乙酸乙酯鹽酸鹽溶液(1 mL)；完成添加後，將反應在室溫下實施0.5 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。將反應溶液在減壓下直接濃縮至乾燥以獲得粗產物，藉由高效液相層析純化該粗產物，以獲得呈單一構形之標題化合物1-11-A (4.75 mg)。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0 15 85 28
3 15 85 28
18 90 10 28
結構表徵數據如下： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.50 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 7.33 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 5.67-5.60 (m, 1H), 5.49 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.21 (s, 2H), 3.96 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 3.32-3.22 (m, 2H), 2.28-2.15 (m, 2H), 1.93-1.80 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H)。
ESI-MS (m/z): 514.0 [M+H] +。
將化合物1-5-12-B (40.00 mg, 35.99 μmol)稱重且溶解於二氯甲烷(2 mL)及甲醇(1 mL)之混合溶劑中；然後添加4 mol/L之乙酸乙酯鹽酸鹽(1 mL)；完成添加後，將反應在室溫下實施0.5 h；且藉由高效液相層析-質譜監測反應。將反應溶液在減壓下直接濃縮至乾燥以獲得粗產物，藉由高效液相層析純化該粗產物，以獲得單一構形之標題化合物1-11-B (8.24 mg)。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0 15 85 28
3 15 85 28
18 90 10 28
結構表徵數據如下： 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.52 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 7.34 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 5.68-5.58 (m, 1H), 5.53 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.43 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 5.20 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 3.97 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 3.31-3.21 (m, 2H), 2.26-2.15 (m, 2H), 1.92-1.82 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H)。
ESI-MS (m/z): 514.0 [M+H] +。 實例8 N-((10S,19S)-胺基-10-苄基-1-((1S,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4]:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-胺基)-1,6,9,12,15,18,25-七側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17,24-六氮雜-30-(2-甲基磺醯基嘧啶-5-基)-29-三十-19-基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八-38-醯胺(A-17-A) 步驟1：合成(2S)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八-38-醯胺基)-6-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸(A-17-03)
將化合物A-17-02之鹽酸鹽(389.68 mg, 962.45 μmol)溶解於二氯甲烷(8 mL)中，且添加DIPEA (518.28 mg, 4.01 mmol, 713.88 μL)及化合物A-17-01 (550.00 mg, 802.04 μmol)，並在25℃下反應1.5 h。用稀鹽酸將反應溶液之pH調節至中性，且在減壓下去除溶劑。藉由製備型高效液相層析純化濃縮物，以獲得標題化合物A-17-03 (450.00 mg)。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0 10 90 28
2 10 90 28
18 80 20 28
ESI-MS (m/z): 939.3 [M+H] +。 步驟2：合成2-({2-[(2S)-2-(2-{2-[(2S)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八-38-醯胺基)-6-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己醯胺基]乙醯胺基}乙醯胺基)-3-苯基丙基]乙醯胺基}甲氧基)乙酸(A-17-04)
將化合物A-17-03 (50.00 mg, 118.09 μmol)溶解於DMF (2.5 mL)中；且添加HATU (49.39 mg, 129.89 μmol)、化合物A-07-2 (133.07 mg, 141.70 μmol)及DIPEA (45.78 mg, 354.26 μmol, 63.06 μL)，並在25℃下反應1 h。在減壓下去除溶劑；且藉由製備型高效液相層析純化濃縮物，以獲得標題化合物A-17-04 (40.00 mg)。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0 10 90 28
2 10 90 28
18 80 20 28
ESI-MS (m/z): 1344.4 [M+H] +。 步驟3：合成((40S)-40-((10S)-10-苄基-1-((9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基胺甲醯基)-38-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,35-十二氧雜-39-氮雜-44-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(A-17-05)
將化合物1-17-04 (29.86 mg, 59.50 μmol)溶解於DMF (3 mL)中；且添加HATU (27.15 mg, 71.40 μmol)及化合物1-7 (80.00 mg, 59.50 μmol)及DIPEA (38.45 mg, 297.51 μmol, 52.96 μL)，並在25℃下反應1 h。在減壓下去除溶劑；且藉由製備型高效液相層析純化濃縮物，以獲得標題化合物A-17-05 (50.00 mg)。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0 10 90 28
2 10 90 28
18 80 20 28
ESI-MS (m/z): 1781.6 [M+H] +。 步驟4：合成N-((10S,19S)-23-胺基-10-苄基-1-((9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4]:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉并苯基-1-胺基)-1,6,9,12,15,18,25-七氧基-3-側氧基-5,8,11,14,17,24-六氮雜三十-19-基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八-38-醯胺(A-17-06)
將化合物A-17-05 (20.00 mg, 11.22 μmol)溶解於DMF (2.5 mL)及二乙胺(0.5 mL)中，並在25℃下反應2 h。在減壓下去除溶劑；且藉由製備型高效液相層析純化濃縮物，以獲得標題化合物A-17-06之甲酸鹽(10.00 mg)。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0 15 85 28
2 15 85 28
18 80 20 28
ESI-MS (m/z): 1559.7 [M+H]+。 步驟5：合成N-((10S,19S)-胺基-10-苄基-1-((1S,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羥基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4]:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-胺基)-1,6,9,12,15,18,25-七側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17,24-六氮雜-30-(2-甲基磺醯基嘧啶-5-基)-29-三十-19-基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八-38-醯胺(A-17-A)
將化合物A-17-06之甲酸鹽(7.00 mg, 4.49 μmol)及化合物A-07-1 (3.28 mg, 8.97 μmol)溶解於DMF (1 mL)中，向其中添加DIPEA (1.74 mg, 13.46 μmol, 2.40 μL)，並在25℃下反應2 h。在減壓下去除溶劑；且藉由製備型高效液相層析純化濃縮物，以獲得標題化合物A-17-A (5.60 mg)。 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0 20 80 28
2 20 80 28
18 80 20 28
ESI-MS (m/z): 1809.8 [M+H] +。 實例9 (1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁烷-2-基)胺基)-2-甲基-1-側氧基丙基-2-基)胺基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊烷醯胺基)苄基酯(C-01)
根據國際專利公開案第WO 2015/168019 A2號中之合成程序，使用碳酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基胺基)-3-甲基丁基胺基)-5-脲基戊烷醯胺基)苄基酯(4-硝基苯基)酯(C-01-1)及(S)-2-(2-胺基-2-甲基丙醯胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N,3-二甲基丁醯胺(Aur0101)來獲得標題化合物C-01。
ESI-MS (m/z): 1341.7 [M+1]+。 實例10：N-((7S,10S,13S)-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-7,10-二甲基-1,6,9,12-四氧化物-3-氧基-5,8,11-三疊氮化物十四烷-13-基)-6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基(A-26). 步驟1：
將化合物A-26-1 (657 mg, 1.22 mmol)及化合物1-4 (500 mg, 1.11 mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(10 mL)中，添加HATU (630.67 mg, 1.66 mmol)及N,N-二異丙基乙胺(428 mg, 3.32 mmol)，且將反應在室溫下在攪拌下實施1小時。完成反應後，藉由製備型高效液相層析直接純化反應溶液，且然後凍乾，以獲得700 mg A-26-2化合物。
製備方法如下： Waters SunFire製備型C18 OBD (5 μm*19 mm*150 mm) 層析管柱：Waters SunFire製備型C18 OBD (5 μm*19 mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] A [%] 移動相A B [%] 移動相B 流量 [mL/min]
0.00 30 70 28
2.00 30 70 28
18.00 90 10 28
步驟2：
將化合物A-26-2 (500 mg, 0.513 mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(2 mL)中，添加二乙胺(75.05 mg, 1.03 mmol)，將反應在室溫下實施1小時。完成反應後，藉由製備型高效液相層析直接純化反應溶液，且然後凍乾，以獲得307 mg A-26-3化合物。
製備方法如下： 層析管柱：Waters SunFire製備型C18 OBD (5 μm*19 mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0.00 20 80 24
2.00 20 80 24
18.00 80 20 24
步驟3：
將化合物A-26-3 (170 mg, 0.226 mmol)及化合物A-07-1 (90.83 mg, 0.249 mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(10 mL)中，添加N,N-二異丙基乙胺(29.21 mg, 0.226 mmol)。將反應在室溫下在攪拌下實施16小時。藉由製備型高效液相層析直接純化反應溶液，且然後凍乾，以獲得50.56 mg A-26化合物。
結構表徵數據如下：MS m/z (ESI): 1002.4 [M+H] +。
分離及純化方法如下： 層析管柱：Waters SunFire製備型C18 OBD (5 μm*19 mm*150 mm) 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
[min] 時間 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0.00 30 70 28
2.00 30 70 28
18.00 90 10 28
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.11 (s, 2H), 8.68 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 8.49 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.16 (s, 1H), 8.10 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 5.65-5.55 (m, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.21(s, 2H), 4.67-4.55 (m, 2H), 4.29-4.15 (m, 3H), 3.98 (s, 2H), 3.41 (s, 3H), 3.25-3.15 (m, 2H), 2.57-2.56 (m, 2H), 2.35-2.27 (m, 2H), 2.22-2.12 (m, 2H), 1.91-1.75 (m, 4H), 1.23-1.09 (m, 9H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。 實例11 碳酸((1S,9R)-5-氯-9-乙基-1-(2-羥基乙醯胺基)-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[d]哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)酯4-((S)-2-(4-胺基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二側氧基-6,12,15,18,24,27,30,33-壬基氧基-3,9-二氮雜五氮雜三醯胺)苄基酯(B-04) 步驟1：製備乙酸2-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[d]哌喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-側氧基乙酯(B-04-1).
將(1S,9S)-1-胺基-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氫-10H,13H-苯并[d]哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮(2 g, 3.65 mmol)溶解於DMF (50 mL)中；逐滴添加DIPEA (1.18 g, 9.12 mmol, 1.59 mL)；在冰浴中邊攪拌邊逐滴添加乙醯氧基乙醯氯(548.12 mg, 4.01 mmol, 431.59 μL)；且使攪拌反應持續1小時。將反應溶液添加至0.1M稀鹽酸水溶液中以使固體沈澱，將其過濾。將濾餅溶解於二氯甲烷及甲醇中，經無水硫酸鈉乾燥，過濾，且濃縮以獲得粗產物，藉由矽膠管柱(甲醇/二氯甲烷=0%~5%)純化並再次濃縮，以獲得標題化合物(1.7g, 3.077 mmol)。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 552.2 [M+1] +。 步驟2：製備乙酸2-(((1S,9S)-9-(((4-((S)-35-疊氮基-2-(4-(4-甲氧基苯基)二苯基甲基)胺基)丁基)-4,8-二側氧基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬基氧基-3,9-二氮雜五氮雜三醯胺)苄基)氧基)羰基)氧基-5-氯-9-乙基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-側氧基乙酯(B-04-2)
將乙酸2-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[d]哌喃并[3',4':6,7]茚并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-側氧基乙酯(500 mg, 0.905 mmol)及DMAP (885.33 mg, 7.25 mmol)溶解於無水二氯甲烷(5 mL)中，在氮保護下冷卻至0℃，且逐滴添加三光氣(268.81 mg, 0.905 mmol)二氯甲烷溶液(5 mL)，保持攪拌並反應0.5小時。逐滴緩慢添加(S)-2-(32-疊氮基-5-側氧基-3,9,12,15,18,21,24,27,30-壬基氧基-6-氮雜三硝基胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-(((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)胺基)己醯胺(1.44 g, 1.36 mmol)二氯甲烷溶液，自然返回至室溫並反應4小時。用水淬滅反應溶液，用二氯甲烷萃取3次(100 ml × 3)，合併有機相，用飽和鹽水洗滌，乾燥，且濃縮，並藉由矽膠管柱(MeOH/DCM = 0% ~ 5%)純化，以獲得標題化合物(498 mg, 0.304 mmol)。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1352.8 [M+1] +。 步驟3：製備碳酸((1S,9S)-5-氯-9-乙基-1-(2-羥基乙醯胺基)-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)酯4-((S)-35-疊氮基-2-(4-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)胺基)丁基)-4,8-二側氧基-6,12,15,18,24,27,30,33-壬基氧基-3,9-二氮雜五氮雜三醯胺)苄基)酯(B-04-3)
將乙酸2-(((1S,9S)-9-(((4-((S)-35-疊氮基-2-(4-(4-甲氧基苯基)二苯基甲基)胺基)丁基)-4,8-二側氧基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬基氧基-3,9-二氮雜五氮雜三醯胺)苄基)氧基)羰基)氧基-5-氯-9-乙基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-側氧基乙酯(200 mg, 0.122 mmol)溶解於THF (3 mL)及MeOH (3 mL)中，邊攪拌邊逐滴添加碳酸鈉(25.88 mg, 0.224 mmol)水溶液(1 mL)，且使攪拌反應持續1小時。藉由逐滴添加稀鹽酸溶液來中和反應溶液，在減壓下濃縮，然後直接進行下一步驟。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1596.7 [M+1] +。 步驟4：製備碳酸((1S,9S)-5-氯-9-乙基-1-(2-羥基乙醯胺基)-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)酯4-((S)-2-(4-胺基丁基)-35-疊氮基-4,8-二側氧基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬基氧基-3,9-二氮雜五氮雜三醯胺)苄基)酯(B-04-4)
將碳酸((1S,9S)-5-氯-9-乙基-1-(2-羥基乙醯胺基)-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)酯4-((S)-35-疊氮基-2-(4-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)胺基)丁基)-4,8-二側氧基-6,12,15,18,24,27,30,33-壬基氧基-3,9-二氮雜五氮雜三醯胺)苄基)酯(190 mg, 119.04 μmol)溶解於二氯甲烷(5 mL)中，添加三氟乙酸鹽(0.5 mL)，然後使反應持續1小時。將飽和碳酸氫鈉水溶液逐滴添加至反應溶液中進行中和，然後分離液體，且濃縮有機相以獲得粗產物。在藉由反相層析管柱(乙腈/1%甲酸水溶液=0%~50%)純化及冷凍乾燥後，獲得標題化合物(95 mg, 69.35 μmol)。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1323.6 [M+1] +。 步驟5：製備碳酸((1S,9R)-5-氯-9-乙基-1-(2-羥基乙醯胺基)-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[d]哌喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)酯4-((S)-2-(4-胺基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二側氧基-6,12,15,18,24,27,30,33-壬基氧基-3,9-二氮雜五氮雜三醯胺)苄基酯(B-04)
將碳酸((1S,9S)-5-氯-9-乙基-1-(2-羥基乙醯胺基)-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)酯4-((S)-2-(4-胺基丁基)-35-疊氮基-4,8-二側氧基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬基氧基-3,9-二氮雜五氮雜三醯胺)苄基)酯(90 mg, 0.066 mmol)及6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)己-5-炔醯胺(24.07 mg, 0.079 mmol)溶解於DMSO (2 mL)及水(0.2 mL)中，添加溴化亞銅(9.42 mg, 0.066 mmol)，然後保持攪拌2小時。直接過濾反應溶液且濃縮粗產物，藉由製備型高效液相層析純化該粗產物並凍乾，以獲得標題化合物(42.2 mg, 24.69 μmol)。
結構表徵數據如下： ESI-MS (m/z): 1628.7 [M+1] +。
製備型高效液相層析之方法如下： 層析管柱：SunFire製備型C18 OBD 19 mm×150 mm×5.0 μm 移動相A：乙腈；移動相B：水(0.05%甲酸)
時間[min] 移動相A [%] 移動相B [%] 流量[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
實例12 製備抗體
採用人類PTK7蛋白來免疫野生型小鼠；藉由ELISA及細胞流式細胞術監測血清效價；根據效價結果，選擇最佳小鼠，自其取出脾細胞進行融合、篩選及亞選殖；偵測不同單純系與人類\猴蛋白、細胞結合之活性、內吞作用及其他活性；選擇純系進行人類化；及最後獲得64A10人類化抗體可變區(重鏈可變區SEQ ID NO:7；輕鏈可變區SEQ ID NO:8)及101A6人類化抗體可變區(重鏈可變區SEQ ID NO:3；輕鏈可變區SEQ ID NO:4)；將上述重鏈可變區序列分別融合至人類IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO :43)，且將上述輕鏈可變區序列分別融合至人類κ輕鏈恆定區(SEQ ID NO:44)，以形成兩種完整的人類化抗體(參見表1)；委託Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd.對抗體實施密碼子最佳化及基因合成，並將抗體構築至pTT5質體中；且將重鏈及輕鏈質體同時轉染至CHO-S細胞中，並使用蛋白質A純化上清液中所表現之抗體，以獲得相應抗體64A10HZ及101A6HZ。同時，為降低由抗體Fc受體介導之非靶毒性，將人類化101A6重鏈可變區融合至突變人類IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO: 45)，且將所表現之抗體命名為101A6HZm。hIgG1係融合至人類IgG1重鏈恆定區之抗雞溶菌酶抗體，且hIgG1m係融合至突變人類IgG1重鏈恆定區之抗雞溶菌酶抗體。
PTK7對照抗體係自專利CN201580030255中之Hu24獲得。在密碼子最佳化後，將抗體重鏈及輕鏈核苷酸序列分別合成且選殖至pTT5載體中，並根據上述方法表現及純化。 實例13 抗體結合及偵測 抗體與C-01之結合
取64A10HZ、101A6HZ、Hu24或hIgG1m抗體且用20 mM PB+0.1 M EDTA (pH 7.60)稀釋；然後用1 M Na 2HPO 4溶液將pH調節至7.60；且添加10 mM TCEP (參(2-羧基乙基)膦，pH 7.60)溶液，均勻混合並在室溫下靜置1.5 h。將C-01 (10 mM, 5當量抗體)於DMSO中之溶液添加至上述混合物中，且然後將所得混合物均勻混合並在室溫下靜置2 h；然後採用NAP-5凝膠管柱(Cytiva)將緩衝溶液替代成20 mM組胺酸緩衝溶液(pH 6.0)，以獲得抗體-藥物結合物。藉由質譜測定之DAR值顯示於表2中。 101A6HZ與A-05之結合
取1.938 mol 101A6HZ抗體(25.8 mg/mL)且用96.9 uL 20 mM PB+0.1 M EDTA (pH 7.60)稀釋；然後用1 M Na 2HPO 4溶液將pH調節至7.60；且添加10 mM TCEP (參(2-羧基乙基)膦，83.1 uL，pH 7.60)溶液，均勻混合並在室溫下靜置1.5 h。將A-05 (10 mM, 5當量抗體)於DMSO中之溶液添加至上述混合物中，且然後將所得混合物均勻混合並在室溫下靜置2 h；然後採用NAP-5凝膠管柱(Cytiva)將緩衝溶液替代成20 mM組胺酸緩衝溶液(pH 6.0)，以獲得抗體-藥物結合物(即ADC 101A6HZ-A-05-4)。藉由質譜測定之DAR值係3.73。 抗體與A-05、B-01、A-26及B-04之結合
取101A6HZ、101A6HZm、64A10HZ、Hu24、hIgG1或hIgG1m抗體且用20 mM PB+0.1 M EDTA (pH 7.60)稀釋；然後用1 M Na 2HPO 4溶液將pH調節至7.60；且添加10 mM TCEP (參(2-羧基乙基)膦，pH 7.60)溶液，均勻混合並在室溫下靜置1.5 h。將A-05及B-01、A-26或B-04 (10 mM, 10當量抗體)於DMSO中之溶液添加至上述混合物中，且然後將所得混合物均勻混合並在室溫下靜置2 h；且然後採用NAP-5凝膠管柱(Cytiva)用20 mM組胺酸緩衝溶液(pH 6.0)替代緩衝溶液，以獲得抗體-藥物結合物。
結合反應後，A-05、B-01、A-26或B-04之甲基磺醯基被置換，且參考抗體中之半胱胺酸硫氫基直接鍵結至嘧啶環，如ADC A-05、ADC B-01、ADC A-26或ADC B-04中所顯示。
藉由質譜測定之DAR值顯示於表2中。
如下測定結合樣品之藥物/抗體比率(DAR)： 對結合之ADC樣品實施LC-MS分子量分析。
層析測定條件： 液相層析管柱：Thermo MAbPac RP 3.0*100 mm； 移動相A：0.1% FA/H 2O；移動相B：0.1% FA/ACN； 流量：0.25 ml/min；樣品室溫度：8 ℃；管柱溫度：60 ℃；注射體積：2 μl；
時間(min) 2 20 22 25 26 30
移動相A (體積%) 75 60 5 5 75 75
移動相B (體積%) 25 40 95 95 25 25
質譜測定條件： 質譜型號：AB Sciex Triple TOF 5600+； GS1 35；GS2 35；CUR 30；TEM 350；ISVF 5500；DP 200；CE 10；累積時間0.5 s； m/z 600-4000；欲求和之時間倉(Time bins to sum)40。 表2 ADC品質測試結果
藥物-連接體 編號 ADC編號 純度 SEC% DAR
A-05 64A10HZ-A-05 95.9 8.00
A-05 101A6HZ-A-05 98.8 8.03
B-01 64A10HZ-B-01 92.7 8.01
B-01 101A6HZ-B-01 99.4 7.97
C-01 64A10HZ-C-01 90.0 3.4
C-01 101A6HZ-C-01 89.1 3.96
C-01 Hu24-C-01 92.5 4.08
A-05 101A6HZ-A-05-4 99.2 3.73
A-05 101A6HZm-A-05 97.6 8.05
A-05 hIgG1-A-05 98.5 8.02
A-05 hIgG1m-A-05 97.9 7.18
C-01 hIgG1m-C-01 98.1 2.73
A-26 101A6HZm-A-26 96.7 8.15
B-04 101A6HZm-B-04 93.8 8.47
實例12 抗體-藥物結合物之活性之偵測 1. NCI-H358模型中不同結合物藥物之活體內效能偵測 1.NCI-H358模型中不同抗體-藥物結合物之活體內效能偵測
在活體外以單層培養人類非小細胞肺癌NCI-H358細胞(NANJING COBIOER BIOSCIENCES CO., LTD)，培養條件係：在RPMI1640培養基中添加10%胎牛血清，且在含有5% CO 2之培育器中在37℃下實施培育。將5×10 6個NCI-H358細胞皮下接種於每一小鼠之右腋下，且懸浮於0.05 ml PBS+0.05 ml Matrigel中。當平均腫瘤體積生長至150-200 mm 3時，排除腫瘤體積不規則及腫瘤體積過小或過大之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分成8組，每組6隻小鼠。以單一劑量(3 mg/kg) IV給予藥物；給藥後，使用游標卡尺每週兩次量測腫瘤，且根據下式計算腫瘤體積：V = 0.5a×b 2，其中a及b分別表示腫瘤之長徑及短徑；經由腫瘤生長抑制率TGI (%)評估抗腫瘤藥物效能，且計算式係：TGI (%) (腫瘤體積) = [1-(T Vt- T V0)/(C Vt- C V0)]×100%；當腫瘤緩解時，TGI(%) (腫瘤體積) = 100%-(T Vt-T V0)/ T V0×100%。T V0係組給藥時測試藥物組之平均腫瘤體積；T Vt係在給藥後第t天時測試藥物組之平均腫瘤體積；C V0係組給藥時媒劑組(生理鹽水)之平均腫瘤體積；且C Vt係在給藥後第t天時媒劑組之平均腫瘤體積。若與初始體積相比腫瘤收縮，亦即V t＜V 0，則將其定義為腫瘤部分反應(PR)；且若腫瘤完全消失，則將其定義為腫瘤完全反應(CR)。每天觀察並記錄動物死亡，且具體結果顯示於表3及圖1A-1B中。 表3 在NCI-H358皮下荷瘤小鼠模型(N=6)中，不同抗體-藥物結合物對人類非小細胞肺癌細胞之效能之分析
藥物 V P0(mm 3， 平均值±SEM) V P21(mm 3， 平均值±SEM) TGI (%) P 值
生理鹽水 191.91±11.32 647.23±67.63 / /
hIgG1-A-05 190.46±9.11 421.66±34.42 49.22* 0.01398
64A10HZ-A-05 191.59±9.35 268.77±26.92 83.05*** 0.00040
101A6HZ-A-05 190.85±9.52 281.42±24.19 80.11*** 0.00047
64A10HZ-B-01 190.68±7.73 331.38±36.46 69.10** 0.00211
64A10HZ-C-01 188.74±9.49 443.05±33.63 44.15* 0.02219
101A6HZ-C-01 192.06±9.41 465.40±40.01 39.97* 0.04320
Hu24-C-01 189.77±6.92 449.71±50.28 42.91* 0.04107
注意：T測試 * P＜0.05、 ** P＜0.01、 *** P＜0.001意指與生理鹽水組相比之顯著差異。
結果顯示：實施單一靜脈內給藥，不同結合藥物在NCI-H358小鼠皮下異種移植物腫瘤動物模型中對人類非小細胞肺癌細胞具有顯著藥物效應，TGI (%)：A-05結合物優於C-01結合物，且每組中之動物耐受較佳。 2.A431模型中不同抗體藥物結合物之活體內效能偵測
在如下條件中培養人類上皮鱗狀細胞癌A431細胞(NANJING COBIOER BIOSCIENCES CO., LTD)：將10%胎牛血清添加至DMEM培養基中，且在含有具有5% CO 2之空氣之培育器中在37℃下實施培育。將5×10 6個A431細胞皮下接種於每一小鼠之右腋下，且懸浮於0.1 ml PBS中。當平均腫瘤體積生長至約100-150 mm 3時，排除腫瘤體積過小或過大之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分成3組，每組5隻小鼠；每週一次IV給予藥物，總共兩次。在給藥後每週兩次量測腫瘤體積及體重，且具體結果顯示於表4及圖2A-2B中。 表4 在A431皮下荷瘤小鼠模型(N=5)中，抗體-藥物結合物對人類上皮鱗狀細胞癌細胞之效能之分析
藥物 藥物投與劑量(mg/kg) V P0(mm 3， 平均值±SEM) V P22(mm 3， 平均值±SEM) TGI (%) P 值
生理鹽水 / 128.36±9.62 1675.96±199.83 / /
hIgG1-A-05 10 126.58±9.30 1749.78±145.64 -4.89 0.77291
101A6HZ-A-05 10 127.77±9.58 624.86±96.98 67.88** 0.00148
注意：T測試 ** P＜0.01意指與生理鹽水組相比之顯著差異。
結果顯示：101A6HZ-A-05在10 mg/kg之條件下具有顯著效能。 3. 抗人類PTK7抗體及其結合物與不同屬及種之PTK7過表現細胞之結合之偵測
藉由流式細胞儀(Beckman，型號：Cytoflex)偵測抗體及其結合物結合至CHO-PTK7細胞之能力。對懸浮培養之CHO-PTK7細胞(人類：hPTK7，猴：cPKT7，小鼠：mPTK7，大鼠：rPTK7)計數；以2×10 5個細胞/孔之密度收集細胞，用1×PBS洗滌兩次，且重懸於1% BSA溶液中；然後將細胞轉移至96孔深板，50 μl/孔；用1% BSA分別稀釋抗體及其藥物結合物，自10 μg/ml開始，且以三重梯度之方式實施稀釋；然後將50 μl經稀釋抗體或抗體-藥物結合物添加至含有細胞之深板中，並在4℃下培育40 min；用PBS將細胞洗滌兩次，然後將50 μl經稀釋之二級抗體添加至每孔中，且均勻混合，並將細胞在4℃下培育30 min；且用PBS將細胞洗滌兩次，然後將細胞重懸於400 μl PBS中，並藉由流式細胞術監測。數據處理：將中值螢光信號值輸入GraphPad Prism 6軟體中以計算EC 50，且結果顯示於表5中。結果顯示，本發明之抗體101A6HZ及101A6HZm結合物可結合至過表現之人類及猴PTK7細胞，但不結合至小鼠及大鼠PTK7細胞。 表5 抗人類PTK7_ADC細胞之親和力測定結果
藥物 EC 50(ng/ml)
hPTK7 cPTK7 mPTK7 rPTK7
101A6HZm-A-05 418.70 551.20 未結合 未結合
101A6HZ-C-01 147.50 114.70 未結合 未結合
4. 抗人類PTK7抗體及其結合物之細胞親和力之偵測
藉由流式細胞儀(Beckman，型號：Cytoflex)偵測抗人類PTK7抗體及結合之ADC對OVCAR3 (ATCC)、NCI-H358、HCC1806 (ATCC)、A431、NCI-H520 (Nanjing Cobioer Biosciences Co., LTD.)、DU4475細胞之親和力。藉由胰蛋白酶消化貼壁細胞OVCAR、NCI-H358、HCC1806、A431、NCI-H520，利用吸移混合懸浮細胞DU4475，計數並收集適量細胞，且流式細胞術之偵測步驟與上文相同。結果顯示於表6及圖3A-3F中。結果顯示，在本發明之抗體101A6HZ及101A6HZm結合至ADC中後，其仍可以高親和力結合腫瘤細胞。 表6-1 抗人類PTK7 ADC對細胞之親和力測定結果
藥物 EC 50(ng/ml)
OVCAR3 NCI-H358 HCC1806 A431
101A6HZm-A-05 127.20 123.60 152.0 154.10
101A6HZ-C-01 102.60 108.10 67.07 97.40
表6-2 抗人類PTK7 ADC細胞親和力偵測之結果
藥物 EC 50(ng/ml)
NCI-H520 DU4475
101A6HZm-A-05 157.0 173.0
101A6HZm-A-26 114.3 89.13
101A6HZm-B-04 97.29 74.81
5. 抗人類PTK7抗體及其結合物之細胞內吞作用之偵測 5.1 內吞作用偵測方法I
用胰蛋白酶消化HCC1806及OVCAR3細胞，重懸且然後計數；以約2×10 5個細胞/孔之密度收集細胞；用1% BSA以50 μl體積/孔懸浮細胞，散佈在深板上；添加抗體及相應ADC並在4℃下培育60 min；用1% BSA將細胞洗滌兩次，然後添加第二抗體(抗人類IgG Alexa Fluor 488)，並在4℃下培育30 min；參考文獻偵測不同溫度下之內吞作用(PLoS ONE 10(4): e0124708)；且在培育後，添加150 μl 1% BSA重懸並在機器上測試。數據分析：採用在37℃下淬滅後之螢光信號值在不同濃度點製作擬合曲線，且計算EC 50。結果顯示於表7中。候選抗體結合物具有良好的內吞活性。 表7 ADC之細胞內吞作用之偵測
藥物 EC 50(ng/ml)
OVCAR3 NCI-H358 HCC1806 A431
101A6HZm-A-05 168.70 178.40 185.0 96.62
101A6HZ-C-01 65.29 96.20 106.3 68.02
5.2 內吞作用偵測方法II
藉由胰蛋白酶消化貼壁細胞NCI-H358、HCC1806、OVCAR3、NCI-H520，利用吸移混合懸浮細胞DU4475，然後對細胞計數且置於96孔板中，每孔含有100 μl培養基中之10,000個細胞。然後在培育器中在37℃中培養細胞。第二天，用完全培養基稀釋抗體或ADC樣品，自4.8 μg/ml開始，稀釋3倍，以8個濃度進行梯度稀釋。使用經完全培養基稀釋至12 μg/ml之pHrodo紅來標記抗體或ADC樣品。將30 μl經稀釋之抗體/ADC樣品及30 μl經稀釋之pHrodo紅樣品在96孔板中混合，在室溫下在黑暗中培育30分鐘。然後自細胞去除50 μl培養基/孔，將50 μl經標記之抗體或ADC添加至細胞中，將細胞在培育器中在37℃ 5% CO2下培育24小時。第二天，去除培養物上清液，用PBS將細胞洗滌一次，且藉由添加40 μl 0.25%胰蛋白酶/孔消化，然後用100 μl完全培養基中和，藉由上下吸移充分混合。使用流式細胞術來偵測由561 nm處之激發波長激發之螢光信號。
數據處理：將中值輸出且輸入GraphPad Prism 6軟體中，計算EC 50。結果顯示於表8及圖4A-4E中。 表8 抗體及抗體-藥物結合物之內吞作用之偵測
藥物 EC 50(ng/ml)
NCI-H358 HCC1806 OVCAR3 NCI-H520 DU4475
101A6HZm 47.43 137.8 32.94 45.40 42.16
101A6HZm-A-05 58.64 138.0 32.53 45.78 47.50
101A6HZm-A-26 47.34 134.5 24.98 38.73 46.56
101A6HZm-B-04 47.36 176.8 21.20 44.90 44.91
6. 抗人類PTK7抗體-藥物結合物之活體外細胞毒性偵測
藉由胰酶消化FADU (NANJING COBIOER BIOSCIENCES CO., LTD)、HCC1806、DU4475 (NANJING COBIOER BIOSCIENCES CO., LTD)及H358-hPTK7細胞；根據每一腫瘤細胞之增殖曲線選擇最佳細胞數並平鋪，且然後在37℃下培養過夜。用培養基稀釋每一抗體及結合物，添加至細胞中，且連續培養5-6天。將CCK8添加至細胞中，且連續培養2-4 h；用微量板讀數器讀取OD450 nm處之值；計算殺傷活性；且結果顯示於表9及圖5A-5C中。結合物之殺傷活性顯著強於陰性抗體結合物之殺傷活性，此指示殺傷效應由靶調介。 表9 抗人類PTK7 ADC之活體外細胞殺傷結果
藥物 IC 50(nM)
FADU HCC1806 DU4475 H358-hPTK7
hIgGm-A-05 187.54 / 130.17 /
101A6HZm-A-05 22.51 21.59 1.96 1.03
注意：「/」意指無殺傷活性。 7. 抗人類PTK7抗體及結合物之親水性偵測
採用Agilent 1260及分析型管柱TSKgel丁基-NPR來偵測抗體及結合物之親水性；取適量測試樣品且用稀釋劑(0.75mol/L (NH 4) 2SO 4)稀釋以製造1.0 mg/ml溶液作為測試樣品溶液；且分別取出對照抗體(親水對照，泰特利單抗；疏水對照，沙妥珠單抗。二者皆係由Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd.生產)並用稀釋劑製成1 mg/ml溶液作為系統適用性溶液。注入約40 μg樣品；分析梯度溶析；在偵測後根據對照樣品計算測試樣品之疏水值，且計算式係：(測試樣品之滯留時間 - 親水對照之滯留時間) / (疏水對照之滯留時間 - 親水對照之滯留時間)，滯留時間及疏水值愈小，抗體之親水性愈佳。結果顯示於表10中。抗體101A6HZm結合物具有良好的親水性，其等效於沙妥珠單抗裸抗體，且可改良活體內ADC藥物之代謝。 表10 抗人類PTK7抗體及結合物之親水性偵測
抗體 滯留時間 疏水值
親水對照 9.097 0.00
疏水對照 15.962 1.00
101A6HZm-A-05 15.451 0.9
8. 抗人類PTK7抗體-藥物結合物與Fc受體之結合活性之偵測
採用ForteBio (Pall life sciences)來偵測抗體101A6HZm及101A6HZm-A-05與人類Fc受體蛋白CD16a、CD32a、CD32b、CD64及FcRn之動態親和力。具體方法包括：在PBST溶液中藉由使用SA感測器(Pall life sciences)分別捕獲欲偵測之生物素化蛋白質；藉由使用PBST稀釋欲偵測之抗體及結合物以達到5,000 nM之初始濃度，並實施雙重稀釋直至達到7個濃度點；在Data Analysis 11.0軟體中結合、解離並開放偵測結果；及藉由選擇1:1模式及全局擬合來分析結果，以獲得結合速率、解離速率及親和力常數；且結果顯示於表11中。 表11 抗體及結合物與Fc受體之結合活性之偵測
抗體 KD(M)
CD16a CD32a CD32b CD64 FcRn
101A6HZm 未偵測到 未偵測到 未偵測到 未偵測到 1.66E-8
101A6HZm-A-05 未偵測到 未偵測到 未偵測到 未偵測到 1.42E-8
結果顯示，突變101A6HZm及其結合物並不與Fc受體CD16a、CD32a、CD32b及CD64蛋白結合，此可能減少由Fc受體介導之非特異性殺傷並改良藥物安全性。同時，101A6HZm及其結合物保留FcRn蛋白結合活性且並不影響藥物之半衰期。 9. HCC1806模型中抗人類PTK7抗體-藥物結合物之活體內效能偵測
在活體外以單層培養人類乳癌HCC1806細胞，且培養條件包括：將10%胎牛血清添加至RPMI 1640培養基中，且在含有具有5% CO 2之空氣之培育器中在37℃下實施培育。將2×10 6個HCC1806細胞皮下接種於每一小鼠之右腋下，且懸浮於0.1 ml PBS中。當平均腫瘤體積生長至約100-150 mm 3時，排除腫瘤體積過小或過大之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分成5組，每組5隻小鼠；每兩週一次IV給予藥物，總共兩次(P0及P18)。在給藥後每週兩次量測腫瘤體積及體重，且具體結果顯示於表12及圖6A-6B中。 表12 在HCC1806皮下荷瘤小鼠模型(N=5)中，抗體-藥物結合物對人類乳癌細胞之效能之分析
藥物 給藥 劑量 (mg/kg) V P0(mm 3， 平均值±SEM) V P31(mm 3， 平均值±SEM) TGI (%) P 值
生理鹽水 / 100.87±9.32 2086.11±202.17 / /
hIgG1m-A-05 3 100.47±8.76 1470.03±187.50 31.01 0.0559
hIgG1m-A-05 10 102.18±9.99 979.31±147.87 55.82** 0.0040
101A6HZm-A-05 3 100.52±9.40 801.28±213.70 64.70** 0.0024
101A6HZm-A-05 10 102.08±9.06 489.36±83.95 80.49*** 0.0001
注意：T測試 * P＜0.05、 ** P＜0.01、 *** P＜0.001意指與生理鹽水組相比之顯著差異。
結果顯示，101A6HZm-A-05組在3 mg/kg及10 mg/kg之條件下具有顯著的藥物效能，且抗腫瘤效應顯著優於hIgG1m-A-05組之相同劑量之抗腫瘤效應。 10. OVCAR3模型中抗人類PTK7抗體-藥物結合物之活體內效能偵測
在活體外以單層培養人類卵巢癌OVCAR3細胞，且培養條件包括：將20%胎牛血清添加至RPMI1640培養基中，且在含有具有5% CO 2之空氣之培育器中在37℃下實施培育。將5×10 6個OVCAR3細胞皮下接種於每一小鼠之右腋下，且懸浮於0.05 ml PBS + 0.05 ml matrigel中。當平均腫瘤體積生長至約100-150 mm 3時，排除腫瘤體積過小或過大之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分成5組，每組5隻小鼠；且以單一劑量IV給予藥物。在給藥後每週兩次量測腫瘤體積及體重，且具體結果顯示於表13及圖7A-B中。 表13 在OVCAR3皮下荷瘤小鼠模型(N=5)中，抗體-藥物結合物對人類卵巢癌細胞之效能之分析
藥物 給藥 劑量(mg/kg) V P0(mm 3， 平均值±SEM) V P36(mm 3， 平均值±SEM) TGI (%) P值 腫瘤 緩解
生理鹽水 / 131.40±9.19 2081.67±316.61 / / 無
hIgG1m-A-05 3 130.66±11.60 1550.40±281.78 27.20 0.2454 無
hIgG1m-A-05 10 132.09±9.09 256.56±21.21 93.62*** 0.0004 無
101A6HZm-A-05 3 129.39±11.41 39.57±10.89 169.41*** 0.0002 1/5CR，4/5PR
101A6HZm-A-05 10 129.93±8.95 45.53±3.11 164.96*** 0.0002 5/5PR
注意：T測試 ** P＜0.01、 *** P＜0.001意指與生理鹽水組相比之顯著差異。
結果顯示，101A6HZm-A-05組在3 mg/kg及10 mg/kg之條件下具有顯著的藥物效能，且抗腫瘤效應顯著優於hIgG1m-A-05組之相同劑量之抗腫瘤效應。根據腫瘤消退，在3 mg/kg 101A6HZm-A-05之條件下，5隻給藥小鼠中之1隻具有完全反應(CR)，且4隻具有部分反應(PR)；且在10 mg/kg條件下之101A6HZm-A-05之條件下，所有5隻給藥小鼠達成部分反應(PR)。 實例13 抗體結合及偵測 抗體與C-01之結合
取64A10HZ、101A6HZ、Hu24或hIgG1m抗體且用20 mM PB+0.1 M EDTA (pH 7.60)稀釋；然後用1 M Na 2HPO 4溶液將pH調節至7.60；且添加10 mM TCEP (參(2-羧基乙基)膦，pH 7.60)溶液，均勻混合並在室溫下靜置1.5 h。將C-01 (10 mM, 5當量抗體)於DMSO中之溶液添加至上述混合物中，且然後將所得混合物均勻混合並在室溫下靜置2 h；然後採用NAP-5凝膠管柱(Cytiva)將緩衝溶液替代成20 mM組胺酸緩衝溶液(pH 6.0)，以獲得抗體-藥物結合物。藉由質譜測定之DAR值顯示於表2中。 101A6HZ與A-05之結合
取1.938 mol 101A6HZ抗體(25.8 mg/mL)且用96.9 uL 20 mM PB+0.1 M EDTA (pH 7.60)稀釋；然後用1 M Na 2HPO 4溶液將pH調節至7.60；且添加10 mM TCEP (參(2-羧基乙基)膦，83.1 uL，pH 7.60)溶液，均勻混合並在室溫下靜置1.5 h。將A-05 (10 mM, 5當量抗體)於DMSO中之溶液添加至上述混合物中，且然後將所得混合物均勻混合並在室溫下靜置2 h；然後採用NAP-5凝膠管柱(Cytiva)用20 mM組胺酸緩衝溶液(pH 6.0)替代緩衝溶液，以獲得抗體-藥物結合物(即ADC 101A6HZ-A-05-4)。藉由質譜測定之DAR值係3.73。 A-05、B-01、A-26、B-04之結合
取101A6HZ、101A6HZm、64A10HZ、Hu24、hIgG1或hIgG1m抗體且用20 mM PB+0.1 M EDTA (pH 7.60)稀釋；然後用1 M Na 2HPO 4溶液將pH調節至7.60；且添加10 mM TCEP (參(2-羧基乙基)膦，pH 7.60)溶液，均勻混合並在室溫下靜置1.5 h。將A-05、B-01、A-26或B-04 (10 mM, 10當量抗體)於DMSO中之溶液添加至上述混合物中，且然後將所得混合物均勻混合並在室溫下靜置2 h；且然後採用NAP-5凝膠管柱(Cytiva)用20 mM組胺酸緩衝溶液(pH 6.0)替代緩衝溶液，以獲得抗體-藥物結合物。
結合反應後，A-05之甲基磺醯基被置換，且參考抗體中之半胱胺酸硫氫基直接鍵結至嘧啶環，如ADC A-05中所顯示。
藉由質譜測定之DAR值顯示於表2中。
如下測定結合樣品之藥物/抗體比率(DAR)： 對結合之ADC樣品實施LC-MS分子量分析。 層析測定條件 液相層析管柱：Thermo MAbPac RP 3.0*100 mm 移動相A：0.1% FA/H 2O；移動相B：0.1% FA/CAN 流量：0.25 ml/min；樣品室溫度：8 ℃；管柱溫度：60 ℃；注射體積：2 μl；
時間(min) 2 20 22 25 26 30
移動相A (體積%) 75 60 5 5 75 75
移動相B (體積%) 25 40 95 95 25 25
質譜測定條件： 質譜型號：AB Sciex Triple TOF 5600+； GS1 35；GS2 35；CUR 30；TEM 350；ISVF 5500；DP 200；CE 10；累積時間0.5 s； m/z 600-4000；欲求和之時間倉40。 表2 ADC品質測試結果
藥物-連接體 編號 ADC編號 純度 SEC% DAR
A-05 64A10HZ-A-05 95.9 8.00
A-05 101A6HZ-A-05 98.8 8.03
B-01 64A10HZ-B-01 92.7 8.01
B-01 101A6HZ-B-01 99.4 7.97
C-01 64A10HZ-C-01 90.0 3.4
C-01 101A6HZ-C-01 89.1 3.96
C-01 Hu24-C-01 92.5 4.08
A-05 101A6HZ-A-05-4 99.2 3.73
A-05 101A6HZm-A-05 97.6 8.05
A-05 hIgG1-A-05 98.5 8.02
A-05 hIgG1m-A-05 97.9 7.18
C-01 hIgG1m-C-01 98.1 2.73
A-26 101A6HZm-A-26 96.7 8.15
B-04 101A6HZm-B-04 93.8 8.47
實例14 抗體-藥物結合物之活性之偵測 1.NCI-H358模型中不同抗體-藥物結合物之活體內效能偵測
在活體外以單層培養人類非小細胞肺癌NCI-H358細胞(NANJING COBIOER BIOSCIENCES CO., LTD)，培養條件係：在RPMI1640培養基中添加10%胎牛血清，且在含有5% CO2 之培育器中在37℃下實施培育。將5×106個NCI-H358細胞皮下接種於每一小鼠之右腋下，且懸浮於0.05 ml PBS+0.05 ml Matrigel中。當平均腫瘤體積生長至150-200 mm3時，排除腫瘤體積不規則及腫瘤體積過小或過大之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分成8組，每組6隻小鼠。以單一劑量(3 mg/kg) IV給予藥物；給藥後，使用游標卡尺每週兩次量測腫瘤，且根據下式計算腫瘤體積：V = 0.5a×b2，其中a及b分別表示腫瘤之長徑及短徑；經由腫瘤生長抑制率TGI (%)評估抗腫瘤藥物效能，且計算式係：TGI (%) (腫瘤體積) = [1-(TVt- TV0)/(CVt- CV0)]×100%；當腫瘤緩解時，TGI(%) (腫瘤體積) = 100%-(TVt-TV0)/ TV0×100%。TV0係組給藥時測試藥物組之平均腫瘤體積；TVt 係在給藥後第t天時測試藥物組之平均腫瘤體積；CV0係組給藥時媒劑組(生理鹽水)之平均腫瘤體積；且CVt係在給藥後第t天時媒劑組之平均腫瘤體積。若與初始體積相比腫瘤收縮，亦即Vt＜V0，則將其定義為腫瘤部分反應(PR)；且若腫瘤完全消失，則將其定義為腫瘤完全反應(CR)。每天觀察並記錄動物死亡，且具體結果顯示於表3及圖1A-1B中。 表3 在NCI-H358皮下荷瘤鼠類模型(N=6)中，不同抗體-藥物結合物對人類非小細胞肺癌細胞之效能之分析
藥物 V P0(mm 3， 平均值±SEM) V P21(mm 3， 平均值±SEM) TGI (%) P值
生理鹽水 191.91±11.32 647.23±67.63 / /
hIgG1-A-05 190.46±9.11 421.66±34.42 49.22* 0.01398
64A10HZ-A-05 191.59±9.35 268.77±26.92 83.05*** 0.00040
101A6HZ-A-05 190.85±9.52 281.42±24.19 80.11*** 0.00047
64A10HZ-B-01 190.68±7.73 331.38±36.46 69.10** 0.00211
64A10HZ-C-01 188.74±9.49 443.05±33.63 44.15* 0.02219
101A6HZ-C-01 192.06±9.41 465.40±40.01 39.97* 0.04320
Hu24-C-01 189.77±6.92 449.71±50.28 42.91* 0.04107
注意：T測試*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001意指與生理鹽水組相比之顯著差異。
結果顯示：實施單一靜脈內給藥，不同結合藥物在NCI-H358小鼠皮下異種移植物腫瘤動物模型中對人類非小細胞肺癌細胞具有顯著藥物效應，TGI (%)：A-05結合物優於C-01結合物，且每組中之動物耐受較佳。 2. A431模型中不同抗體藥物結合物之活體內效能偵測
在如下條件中培養人類上皮鱗狀細胞癌A431細胞(NANJING COBIOER BIOSCIENCES CO., LTD)：將10%胎牛血清添加至DMEM培養基中，且在含有具有5% CO2 之空氣之培育器中在37℃下實施培育。將5×106個A431細胞皮下接種於每一小鼠之右腋下，且懸浮於0.1 ml PBS中。當平均腫瘤體積生長至約100-150 mm3時，排除腫瘤體積過小或過大之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分成3組，每組5隻小鼠；每週一次IV給予藥物，總共兩次。在給藥後每週兩次量測腫瘤體積及體重，且具體結果顯示於表4及圖2A-2B中。 表4 在A431皮下荷瘤鼠類模型(N=5)中，抗體-藥物結合物對人類上皮鱗狀細胞癌細胞之效能之分析
藥物 藥物投與劑量(mg/kg) V P0(mm 3， 平均值±SEM) V P22(mm 3， 平均值±SEM) TGI (%) P值
生理鹽水 / 128.36±9.62 1675.96±199.83 / /
hIgG1-A-05 10 126.58±9.30 1749.78±145.64 -4.89 0.77291
101A6HZ-A-05 10 127.77±9.58 624.86±96.98 67.88** 0.00148
注意：T測試**P＜0.01意指與生理鹽水組相比之顯著差異。
結果顯示：101A6HZ-A-05在10 mg/kg之條件下具有顯著效能。 3. 抗人類PTK7抗體及其結合物與不同屬及種之PTK7過表現細胞之結合之偵測
藉由流式細胞儀(Beckman，型號：Cytoflex)監測抗體及其結合物結合至CHO-PTK7細胞之能力。對懸浮培養之CHO-PTK7細胞(人類：hPTK7，猴：cPKT7，小鼠：mPTK7，大鼠：rPTK7)計數；以2×105個細胞/孔之密度收集細胞，用1×PBS洗滌兩次，且重懸於1% BSA溶液中；然後將細胞轉移至96孔深板，50 μl/孔；用1% BSA分別稀釋抗體及其藥物結合物，自10 μg/ml開始，且以三重梯度之方式實施稀釋；然後將50 μl經稀釋抗體或抗體-藥物結合物添加至含有細胞之深板中，並在4℃下培育40 min；用PBS將細胞洗滌兩次，然後將50 μl經稀釋之二級抗體添加至每孔中，且均勻混合，並將細胞在4℃下培育30 min；且用PBS將細胞洗滌兩次，然後將細胞重懸於400 μl PBS中，並藉由流式細胞術偵測。數據處理：將中值螢光信號值輸入GraphPad Prism 6軟體中以計算EC50，且結果顯示於表5中。結果顯示，本發明之抗體101A6HZ及101A6HZm結合物可結合至過表現之人類及猴PTK7細胞，但不結合至小鼠及大鼠PTK7細胞。 表5 抗人類PTK7_ADC細胞之親和力測定結果
藥物 EC 50(ng/ml)
hPTK7 cPTK7 mPTK7 rPTK7
101A6HZm-A-05 418.70 551.20 未結合 未結合
101A6HZ-C-01 147.50 114.70 未結合 未結合
4. 抗人類PTK7抗體及其結合物之細胞親和力之偵測
藉由流式細胞儀(Beckman，型號：Cytoflex)偵測抗人類PTK7抗體及結合之ADC對OVCAR3 (ATCC)、NCI-H358、HCC1806 (ATCC)、A431、NCI-H520 (Nanjing Cobioer Biosciences Co., LTD.)、DU4475細胞之親和力。藉由胰蛋白酶消化貼壁細胞OVCAR3、NCI-H358、HCC1806、A431、NCI-H520，利用吸移混合懸浮細胞DU4475，計數並收集適量細胞，且流式細胞術之偵測步驟與上文相同。結果顯示於表6-1、表6-2及圖3A-3F中。結果顯示，在本發明之抗體101A6HZ及101A6HZm結合至ADC中後，其仍可以高親和力結合腫瘤細胞。 表6-1 抗人類PTK7 ADC對細胞之親和力測定結果
藥物 EC 50(ng/ml)
OVCAR3 NCI-H358 HCC1806 A431
101A6HZm-A-05 127.20 123.60 152.0 154.10
101A6HZ-C-01 102.60 108.10 67.07 97.40
表6-2 抗人類PTK7 ADC細胞親和力偵測之結果
藥物 EC 50(ng/ml)
NCI-H520 DU4475
101A6HZm-A-05 157.0 173.0
101A6HZm-A-26 114.3 89.13
101A6HZm-B-04 97.29 74.81
5. 抗人類PTK7抗體及其結合物之細胞內吞作用之偵測 5.1 內吞作用偵測方法I
用胰蛋白酶消化HCC1806及OVCAR3細胞，重懸且然後計數；以約2×105個細胞/孔之密度收集細胞；用1% BSA以50 μl體積/孔懸浮細胞，散佈在深板上；添加抗體及相應ADC並在4℃下培育60 min；用1% BSA將細胞洗滌兩次，然後添加第二抗體(抗人類IgG Alexa Fluor 488)，並在4℃下培育30 min；參考文獻偵測不同溫度下之內吞作用(PLoS ONE 10(4): e0124708)；且在培育後，添加150 μl 1% BSA重懸並在機器上測試。數據分析：採用在37℃下淬滅後之螢光信號值在不同濃度點製作擬合曲線，且計算EC50。結果顯示於表7中。候選抗體結合物具有良好的內吞活性。 表7 ADC之細胞內吞作用之偵測
藥物 EC 50(ng/ml)
OVCAR3 NCI-H358 HCC1806 A431
101A6HZm-A-05 168.70 178.40 185.0 96.62
101A6HZ-C-01 65.29 96.20 106.3 68.02
5.2 內吞作用偵測方法II
藉由胰蛋白酶消化貼壁細胞NCI-H358、HCC1806、OVCAR3、NCI-H520，利用吸移混合懸浮細胞DU4475，然後對細胞計數且置於96孔板中，每孔含有100ml培養基中之10,000個細胞。然後在培育器中在37℃中培養細胞。第二天，用完全培養基稀釋抗體或ADC樣品，自4.8 μg/ml開始，稀釋3倍，以8個濃度進行梯度稀釋。使用經完全培養基稀釋至12 mg/ml之pHrodo紅來標記抗體或ADC樣品。將30ml經稀釋之抗體/ADC樣品及30 ml經稀釋之pHrodo紅樣品在96孔板中混合，在室溫下在黑暗中培育30分鐘。然後自細胞去除50 ml培養基/孔，將50ml經標記之抗體或ADC添加至細胞中，將細胞在培育器中在37℃ 5% CO2下培育24小時。第二天，去除培養物上清液，用PBS將細胞洗滌一次，且藉由添加40 μl 0.25%胰蛋白酶/孔消化，然後用100 ml完全培養基中和，藉由上下吸移充分混合。使用流式細胞術來偵測由561 nm處之激發波長激發之螢光信號。數據處理：將中值輸出且輸入GraphPad Prism 6軟體中，計算EC50。結果顯示於表8及圖4A-4E中。 表8 抗體及抗體-藥物結合物之內吞作用之偵測
藥物 EC 50(ng/ml)
NCI-H358 HCC1806 OVCAR3 NCI-H520 DU4475
101A6HZm 47.43 137.8 32.94 45.40 42.16
101A6HZm-A-05 58.64 138.0 32.53 45.78 47.50
101A6HZm-A-26 47.34 134.5 24.98 38.73 46.56
101A6HZm-B-04 47.36 176.8 21.20 44.90 44.91
6. 抗人類PTK7抗體-藥物結合物之活體外細胞毒性偵測
藉由胰酶消化FADU (NANJING COBIOER BIOSCIENCES CO., LTD)、HCC1806、DU4475 (NANJING COBIOER BIOSCIENCES CO., LTD)及H358-hPTK7細胞；根據每一腫瘤細胞之增殖曲線選擇最佳細胞數並平鋪，且然後在37℃下培養過夜。用培養基稀釋每一抗體及結合物，添加至細胞中，且連續培養5-6天。將CCK8添加至細胞中，且連續培養2-4 h；用微量板讀數器讀取OD450 nm處之值；計算殺傷活性；且結果顯示於表9及圖5A-5C中。結合物之殺傷活性顯著強於陰性抗體結合物之殺傷活性，此指示殺傷效應由靶調介。 表9 抗人類PTK7 ADC之活體外細胞殺傷結果
藥物 IC 50(nM)
FADU HCC1806 DU4475 H358-hPTK7
hIgGm-A-05 187.54 / 130.17 /
101A6HZm-A-05 22.51 21.59 1.96 1.03
注意：「/」意指無殺傷活性。 7. 抗人類PTK7抗體及結合物之親水性偵測
採用Agilent 1260及分析型管柱TSKgel丁基-NPR來偵測抗體及結合物之親水性；取適量測試樣品且用稀釋劑(0.75mol/L (NH4)2SO4)稀釋以製造1.0 mg/ml溶液作為測試樣品溶液；且分別取出對照抗體(親水對照，泰特利單抗(Tagitanlimab)；疏水對照，沙妥珠單抗(Sacituzumab)。二者皆係由Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd.生產)並用稀釋劑製成1 mg/ml溶液作為系統適用性溶液。注入約40 μg樣品；分析梯度溶析；在偵測後根據對照樣品計算測試樣品之疏水值，且計算式係：(測試樣品之滯留時間 - 親水對照之滯留時間) / (疏水對照之滯留時間 - 親水對照之滯留時間)，滯留時間及疏水值愈小，抗體之親水性愈佳。結果顯示於表10中。抗體101A6HZm結合物具有良好的親水性，其等效於沙妥珠單抗裸抗體，且可改良活體內ADC藥物之代謝。 表10 抗人類PTK7抗體及結合物之親水性偵測
抗體 滯留時間 疏水值
親水對照 9.097 0.00
疏水對照 15.962 1.00
101A6HZm-A-05 15.451 0.9
8. 抗人類PTK7抗體-藥物結合物與Fc受體之結合活性之偵測
採用ForteBio (Pall life sciences)來偵測抗體101A6HZm及101A6HZm-A-05與人類Fc受體蛋白CD16a、CD32a、CD32b、CD64及FcRn之動態親和力。具體方法包括：在PBST溶液中藉由使用SA感測器(Pall life sciences)分別捕獲欲偵測之生物素化蛋白質；藉由使用PBST稀釋欲偵測之抗體及結合物以達到5,000 nM之初始濃度，並實施雙重稀釋直至達到7個濃度點；在Data Analysis 11.0軟體中結合、解離並開放偵測結果；及藉由選擇1:1模式及全局擬合來分析結果，以獲得結合速率、解離速率及親和力常數；且結果顯示於表11中。 表11 抗體及結合物與Fc受體之結合活性之偵測
抗體 KD(M)
CD16a CD32a CD32b CD64 FcRn
101A6HZm 未偵測到 未偵測到 未偵測到 未偵測到 1.66E-8
101A6HZm-A-05 未偵測到 未偵測到 未偵測到 未偵測到 1.42E-8
結果顯示，突變101A6HZm及其結合物並不與Fc受體CD16a、CD32a、CD32b及CD64蛋白結合，此可能減少由Fc受體介導之非特異性殺傷並改良藥物安全性。同時，101A6HZm及其結合物保留FcRn蛋白結合活性且並不影響藥物之半衰期。 9. HCC1806模型中抗人類PTK7抗體-藥物結合物之活體內效能偵測
在活體外以單層培養人類乳癌HCC1806細胞，且培養條件包括：將10%胎牛血清添加至RPMI 1640培養基中，且在含有具有5% CO2之空氣之培育器中在37℃下實施培育。將2×106個HCC1806細胞皮下接種於每一小鼠之右腋下，且懸浮於0.1 ml PBS中。當平均腫瘤體積生長至約100-150 mm3時，排除腫瘤體積過小或過大之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分成5組，每組5隻小鼠；每兩週一次IV給予藥物，總共兩次(P0及P18)。在給藥後每週兩次量測腫瘤體積及體重，且具體結果顯示於表12及圖6A-6B中。 表12 在HCC1806皮下荷瘤鼠類模型(N=5)中，抗體-藥物結合物對人類乳癌細胞之效能之分析
藥物 給藥 劑量 (mg/kg) V P0(mm 3， 平均值±SEM) V P31(mm 3， 平均值±SEM) TGI (%) P值
生理鹽水 / 100.87±9.32 2086.11±202.17 / /
hIgG1m-A-05 3 100.47±8.76 1470.03±187.50 31.01 0.0559
hIgG1m-A-05 10 102.18±9.99 979.31±147.87 55.82** 0.0040
101A6HZm-A-05 3 100.52±9.40 801.28±213.70 64.70** 0.0024
101A6HZm-A-05 10 102.08±9.06 489.36±83.95 80.49*** 0.0001
注意：T測試*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001意指與生理鹽水組相比之顯著差異。
結果顯示，101A6HZm-A-05組在3 mg/kg及10 mg/kg之條件下具有顯著的藥物效能，且抗腫瘤效應顯著優於hIgG1m-A-05組之相同劑量之抗腫瘤效應。 10. OVCAR3模型中抗人類PTK7抗體-藥物結合物之活體內效能偵測
在活體外以單層培養人類卵巢癌OVCAR3細胞，且培養條件包括：將20%胎牛血清添加至RPMI1640培養基中，且在含有具有5% CO2之空氣之培育器中在37℃下實施培育。將5×106個OVCAR3細胞皮下接種於每一小鼠之右腋下，且懸浮於0.05 ml PBS + 0.05 ml matrigel中。當平均腫瘤體積生長至約100-150 mm3時，排除腫瘤體積過小或過大之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分成5組，每組5隻小鼠；且以單一劑量IV給予藥物。在給藥後每週兩次量測腫瘤體積及體重，且具體結果顯示於表13及圖7A-7B中。 表13 在OVCAR3皮下荷瘤鼠類模型(N=5)中，抗體-藥物結合物對人類卵巢癌細胞之效能之分析
藥物 給藥 劑量(mg/kg) V P0(mm 3， 平均值±SEM) V P36(mm 3， 平均值±SEM) TGI (%) P值 腫瘤 緩解
生理鹽水 / 131.40±9.19 2081.67±316.61 / / 無
hIgG1m-A-05 3 130.66±11.60 1550.40±281.78 27.20 0.2454 無
hIgG1m-A-05 10 132.09±9.09 256.56±21.21 93.62*** 0.0004 無
101A6HZm-A-05 3 129.39±11.41 39.57±10.89 169.41*** 0.0002 1/5CR，4/5PR
101A6HZm-A-05 10 129.93±8.95 45.53±3.11 164.96*** 0.0002 5/5PR
注意：T測試**P＜0.01、***P＜0.001意指與生理鹽水組相比之顯著差異。
結果顯示，101A6HZm-A-05組在3 mg/kg及10 mg/kg之條件下具有顯著的藥物效能，且抗腫瘤效應顯著優於hIgG1m-A-05組之相同劑量之抗腫瘤效應。根據腫瘤消退，在3 mg/kg 101A6HZm-A-05之條件下，5隻給藥小鼠中之1隻具有完全反應(CR)，且4隻具有部分反應(PR)；且在10 mg/kg條件下之101A6HZm-A-05之條件下，所有5隻給藥小鼠達成部分反應(PR)。 11. NCI-H146模型中抗人類PTK7抗體-藥物結合物之活體內效能偵測
在活體外以單層培養人類小細胞癌NCI-H146細胞，且培養條件包括：將10%胎牛血清添加至RPMI 1640培養基中，且在含有具有5% CO2之空氣之培育器中在37℃下實施培育。將5×106個NCI-H146細胞皮下接種於每一小鼠之右腋下，且懸浮於0.05 ml PBS + 0.05 ml matrigel中。當平均腫瘤體積生長至約150-200 mm3時，排除腫瘤體積過小或過大之小鼠，且根據腫瘤體積及動物體重將剩餘小鼠隨機分成7組，以單一劑量給予藥物。在給藥後每週兩次量測腫瘤體積及體重，且具體結果顯示於表14、圖8A-B中。 表14 在NCI-H146皮下荷瘤鼠類模型(N=5)中，抗體-藥物結合物對人類小細胞癌細胞之效能之分析
藥物 給藥劑量 (mg/kg) V P0(mm 3， 平均值±SEM) V P35(mm 3， 平均值±SEM) TGI (%) P值
生理鹽水 / 153.66±5.36 1695.16±219.94 / /
hIgG1m-A-05 3 153.83±5.18 821.17±77.32 56.71 0.0056
101A6HZm-A-05 1 154.53±7.22 244.21±17.27 94.18*** 0.0002
101A6HZm-A-05 3 154.52±5.49 10.42±3.59 193.26*** 0.0001
Hu24-C-01 1 154.70±5.60 1440.67±136.78 16.58 0.3885
Hu24-C-01 3 154.85±5.10 1412.09±155.26 18.44 0.3525
101A6HZm-A-26 3 154.04±9.57 17.87±2.13 188.40*** 0.0001
注意：T測試**P＜0.01、***P＜0.001意指與生理鹽水組相比之顯著差異。
結果顯示，101A6HZm-A-05組在1 mg/kg及3 mg/kg之條件下具有顯著的藥物效能，且抗腫瘤效應顯著優於hIgG1m-A-05組及Hu24-C-01組之相同劑量之抗腫瘤效應。101A6HZm-A-05及101A6HZm-A-26在相同劑量條件下具有相似的藥物效能。在3 mg/kg之101A6HZm-A-05及3 mg/kg之101A6HZm-A-26之條件下，所有5隻給藥小鼠達成部分反應(PR)。
儘管已詳細闡述本發明之特定實施例，但熟習此項技術者應理解，根據所揭示之所有教示，可對彼等細節作出各種修改及替代，且該等變化皆在本發明之保護範圍內。本發明之全部範圍係由所附申請專利范圍及其任何等效範圍給出。
圖1A：NCI-H358模型中不同抗體-藥物結合物之效能之偵測。 圖1B：NCI-H358模型中不同抗體-藥物結合物之體重偵測。 圖2A：A431模型中不同抗體-藥物結合物之效能偵測。 圖2B：A431模型中不同抗體-藥物結合物之體重偵測。 圖3A：抗人類PTK7抗體-藥物結合物與OVCAR3細胞之結合之偵測。 圖3B：抗人類PTK7抗體-藥物結合物與NCI-H358細胞之結合之偵測。 圖3C：抗人類PTK7抗體-藥物結合物與HCC1806細胞之結合之偵測。 圖3D：抗人類PTK7抗體-藥物結合物與A431細胞之結合之偵測。圖3E：抗人類PTK7抗體-藥物結合物與NCI-H520細胞之結合之偵測。 圖3F：抗人類PTK7抗體-藥物結合物與DU4475細胞之結合之偵測。 圖4A：NCI-H358中抗體-藥物結合物之內吞作用之pHrodo偵測。 圖4B：HCC1806中抗體-藥物結合物之內吞作用之pHrodo偵測。 圖4C：OVCAR3中抗體-藥物結合物之內吞作用之pHrodo偵測。 圖4D：NCI-H520中抗體-藥物結合物之內吞作用之pHrodo偵測。 圖4E：DU4475中抗體-藥物結合物之內吞作用之pHrodo偵測。 圖5A：FADU細胞殺傷中抗人類PTK7結合藥物之偵測。 圖5B：HCC1806細胞殺傷中抗人類PTK7結合藥物之偵測。 圖5C：DU4475細胞殺傷中抗人類PTK7結合藥物之偵測。 圖6A：HCC1806模型中抗體-藥物結合物之效能之偵測。 圖6B：HCC1806模型中抗體-藥物結合物之體重偵測之偵測。 圖7A：OVCAR3模型中抗體-藥物結合物之效能之偵測。 圖7B：OVCAR3模型中抗體-藥物結合物之體重偵測。 圖8A：NCI-H146模型中抗體-藥物結合物之效能之偵測。 圖8B：NCI-H146模型中抗體-藥物結合物之體重偵測。
TW202421204A_112139032_SEQL.xml

Claims (73)

  1. 一種抗體-藥物結合物，其具有顯示為式Ab-[M-L-E-D] x之結構，其中： Ab係特異性結合至人類PTK7之抗體或其抗原結合片段； M係連接至該抗體或其抗原結合片段之連接體位點； L係M與E之間的連接體； E係連接L及D之結構片段； D係細胞毒性藥物片段；且 x選自1至10。
  2. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (1) 以下重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中CDR係根據Chothia編號系統來定義： (1a) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 11之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 12之序列之CDR-H2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 13之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 14之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 15之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 16之序列之CDR-L3或其變異體；或 (1b) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 27之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 28之序列之CDR-H2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 29之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 30之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 31之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 32之序列之CDR-L3或其變異體； 其中(1a)及(1b)中任一者之該等變異體與衍生出該等變異體之該序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，或與衍生出該等變異體之該序列相比經歷一或若干個胺基酸之替代、缺失或添加； 或 (2) 以下重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中該等CDR係根據Kabat編號系統來定義： (2a) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 17之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 18或19之序列之CDR-H2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 13之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 14之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 15之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 16之序列之CDR-L3或其變異體；或 (2b) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 33之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 34或35之序列之CDR-H2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 29之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 30之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 31之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 32之序列之CDR-L3或其變異體； 其中(2a)及(2b)中任一者之該等變異體與衍生出該等變異體之該序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，或與衍生出該等變異體之該序列相比經歷一或若干個胺基酸之替代、缺失或添加； 或 (3) 以下重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中該等CDR係根據IMGT編號系統來定義： (3a) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 20之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 21之序列之CDR-H2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 22之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 23之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 24之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 16之序列之CDR-L3或其變異體；或 (3b) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 36之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 37之序列之CDR-H2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 38之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 39之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 40之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 32之序列之CDR-L3或其變異體； 其中(3a)及(3b)中任一者之該等變異體與衍生出該等變異體之該序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，或與衍生出該等變異體之該序列相比經歷一或若干個胺基酸之替代、缺失或添加； 或 (4) 以下重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中該等CDR係根據AbM編號系統來定義： (4a) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 25之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 26之序列之CDR-H2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 13之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 14之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 15之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 16之序列之CDR-L3或其變異體；或 (4b) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有顯示為SEQ ID NO: 41之序列之CDR-H1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 42之序列之CDR-H2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 29之序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有顯示為SEQ ID NO: 30之序列之CDR-L1或其變異體、具有顯示為SEQ ID NO: 31之序列之CDR-L2或其變異體及具有顯示為SEQ ID NO: 32之序列之CDR-L3或其變異體； 其中(4a)及(4b)中任一者之該等變異體與衍生出該等變異體之該序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，或與衍生出該等變異體之該序列相比經歷一或若干個胺基酸之替代、缺失或添加。
  3. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (a) 顯示為SEQ ID NO: 1之VH或其變異體，及/或顯示為SEQ ID NO: 2之VL或其變異體； (b) 顯示為SEQ ID NO: 3之VH或其變異體，及/或顯示為SEQ ID NO: 4之VL或其變異體； (c) 顯示為SEQ ID NO: 5之VH或其變異體，及/或顯示為SEQ ID NO: 6之VL或其變異體； (d) 顯示為SEQ ID NO: 7之VH或其變異體，及/或顯示為SEQ ID NO: 8之VL或其變異體；或 (e) 顯示為SEQ ID NO: 9之VH或其變異體，及/或顯示為SEQ ID NO: 10之VL或其變異體； 其中該等變異體與衍生出該等變異體之該序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，或與衍生出該等變異體之該序列相比經歷一或若干個胺基酸之替代、缺失或添加。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或其抗原結合片段進一步包含： (a) 人類免疫球蛋白重鏈恆定區(CH)或其變異體，其中與衍生出該變異體之野生型序列相比，該變異體具有一或多個胺基酸之替代、缺失或添加；及 (b) 人類免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)或變異體，其中與衍生出該變異體之野生型序列相比，該變異體具有一或多個胺基酸之替代、缺失或添加。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (1) 包含顯示為SEQ ID NO: 1之VH序列及顯示為SEQ ID NO: 43之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含顯示為SEQ ID NO: 2之VL序列及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈； (2) 包含顯示為SEQ ID NO: 3之VH序列及顯示為SEQ ID NO: 43或45之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含顯示為SEQ ID NO: 4之VL序列及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈； (3) 包含顯示為SEQ ID NO: 5之VH序列及顯示為SEQ ID NO: 43之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含顯示為SEQ ID NO: 6之VL序列及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈； (4) 包含顯示為SEQ ID NO: 7之VH序列及顯示為SEQ ID NO: 43之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含顯示為SEQ ID NO: 8之VL序列及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈；或 (5) 包含顯示為SEQ ID NO: 9之VH序列及顯示為SEQ ID NO: 43之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含顯示為SEQ ID NO: 10之VL序列及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體-藥物結合物，其中M係 ， 環A係5-6員脂族雜環或5-20員芳族環系統，且該脂族雜環及該芳族環系統視情況地經一或多個選自由以下組成之群之成員取代：側氧基(=O)、鹵素、氰基、胺基、羧基、巰基及C 1-6烷基；且M 1選自單鍵、C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基及C 2-20伸炔基。
  7. 如請求項1至5中任一項之抗體-藥物結合物，其中M係 ，其中環A係5員脂族雜環、6員芳族雜環或經由單鍵連接一個以上之6員芳族雜環及苯環形成之多環，且該脂族雜環視情況地經一或多個選自由以下組成之群之成員取代：側氧基(=O)、鹵素及C 1-4烷基；且M 1選自單鍵、C 3-10伸烷基、C 3-10伸烯基及C 3-10伸炔基。
  8. 如請求項1至5中任一項之抗體-藥物結合物，其中M係 ，其中環A選自 、 、 及 ；且M 1選自單鍵、C 5-8伸烷基、C 5-8伸烯基及C 5-8伸炔基。
  9. 如請求項1至5中任一項之抗體-藥物結合物，其中 M選自 及 。
  10. 如請求項1至5中任一項之抗體-藥物結合物，其中M係 。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗體-藥物結合物，其中L選自包含以下中之一或多者之結構：C 1-6伸烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、Val、Cit、Phe、Lys、Lys(COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) sOCH 3)、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Ala-Ala-Ala、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO: 48)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 49)、Gly-Gly-Val-Ala (SEQ ID NO: 50)、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 51)、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ，其中R’表示氫、C 1-6烷基或含有-(CH 2CH 2O)r-之烷基；r係選自1-10之整數；且s係選自1-20之整數。
  12. 如請求項1至10中任一項之抗體-藥物結合物，其中L選自包含以下中之一或多者之結構：C 1-6伸烷基、-NH-、Val、Cit、Phe、Lys、Lys(COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) sOCH 3)、Gly、Val-Cit、Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO: 48)、 、 、 、 、 、 、 、 及 ；且s係選自1-20之整數。
  13. 如請求項1至10中任一項之抗體-藥物結合物，其中L選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ； s係選自1-20之整數。
  14. 如請求項1至10中任一項之抗體-藥物結合物，其中L選自以下結構： 、 、 、 、 及 。
  15. 如請求項1至10中任一項之抗體-藥物結合物，其中L選自以下結構： 、 、 、 及 。
  16. 如請求項1至15中任一項之抗體-藥物結合物，其中E係單鍵、-NH-CH 2-、-NH-CH 2-O-CH 2-CO-、 、 、 、 或 。
  17. 如請求項1至15中任一項之抗體-藥物結合物，其中E係單鍵、-NH-CH 2-、-NH-CH 2-O-CH 2-CO-、 、 或 。
  18. 如請求項1至10中任一項之抗體-藥物結合物，其中E係-NH-CH 2-、 或 。
  19. 如請求項1至10中任一項之抗體-藥物結合物，其中E係-NH-CH 2-或 。
  20. 如請求項1至19中任一項之抗體-藥物結合物，其中 選自以下結構： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。
  21. 如請求項1至20中任一項之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性藥物選自微管蛋白抑制劑、DNA嵌入劑、DNA拓樸異構酶抑制劑及RNA聚合酶抑制劑或其醫藥學上可接受之鹽、酯或類似物。
  22. 如請求項21之抗體-藥物結合物，其中該微管蛋白抑制劑係奧瑞他汀(auristatin)化合物或類美登素(maytansinoid)化合物。
  23. 如請求項21之抗體-藥物結合物，其中該DNA嵌入劑係吡咯并苯并二氮呯(PBD)。
  24. 如請求項21之抗體-藥物結合物，其中該DNA拓樸異構酶抑制劑係拓樸異構酶I抑制劑或拓樸異構酶II。
  25. 如請求項24之抗體-藥物結合物，其中該拓樸異構酶I抑制劑係喜樹鹼(camptothecin)、羥基喜樹鹼、9-胺基喜樹鹼、SN-38、伊立替康(irinotecan)、托泊替康(topotecan)、貝洛替康(belotecan)或盧比替康(rubitecan)。
  26. 如請求項24之抗體-藥物結合物，其中該拓樸異構酶II抑制劑係多柔比星(doxorubicin)、PNU-159682、倍癌黴素(duocarmycin)、道諾黴素(daunorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)或依托泊苷(etoposide)。
  27. 如請求項21之抗體-藥物結合物，其中該RNA聚合酶抑制劑係α-瓢菌素(α-amanitin)或其醫藥學上可接受之鹽、酯或類似物。
  28. 如請求項21之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性藥物係 。
  29. 如請求項21之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性藥物選自顯示為式I及式II之化合物： ， R 1及R 2各自獨立地選自C 1-6烷基及鹵素； R 3選自H及-CO-CH 2OH； R 4及R 5各自獨立地選自H、鹵素及羥基；或R 4及R 5連接至相關碳原子以形成5-6員含氧雜環； R 6選自氫及-C 1-4伸烷基-NR aR b； R 7選自氫、C 1-6烷基及-C 1-4伸烷基-NR aR b；且 R a及R b在每次出現時各自獨立地選自H、C 1-6烷基、-SO 2-C 1-6烷基及-CO-C 1-6烷基。
  30. 如請求項21之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性藥物選自以下化合物： 及 ； 其中在該細胞毒性藥物連接至該連接體後獲得之該細胞毒性藥物之相應片段係如通式中所顯示之D。
  31. 如請求項30之抗體-藥物結合物，其中D係藉由自該細胞毒性藥物上之-OH、-NH 2或二級胺基失去一個H而獲得之單價結構。
  32. 如請求項1至31中任一項之抗體-藥物結合物，其選自ADC A-01至ADC A-26、ADC B-01至ADC B-06及ADC C01，如下所示： ADC A-01 、 ADC A-02 、 ADC A-03 、 ADC A-04 、 ADC A-05 、 ADC A-06 、 ADC A-07 、 ADC A-08 、 ADC A-09 、 ADC A-10 、 ADC A-11 、 ADC A-12 、 ADC A-13 、 ADC A-14 、 ADC A-15 、 ADC A-16 、 ADC A-17 、 ADC A-18 、 ADC A-19 、 ADC A-20 、 ADC A-21 、 ADC A-22 、 ADC A-23 、 ADC A-24 、 ADC A-25 、 ADC A-26 ADC B-01 、 ADC B-02 、 ADC B-03 、 ADC B-04 、 ADC B-05 、 ADC B-06 及 ADC C-01 、 其中每一抗體-藥物結合物中之HA表示包含顯示為SEQ ID NO: 1、3、5、7或9之VH及顯示為SEQ ID NO: 2、4、6、8或10之VL之抗體或其抗原結合片段， 且 表示由該抗體或抗原結合片段中之硫氫基及該連接體形成之鍵聯。
  33. 如請求項1至32中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物包含下式： 、 、 、 或 其中每一抗體-藥物結合物中之該HA選自： (1) 包含具有如SEQ ID NO: 1中所述之胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 2中所述之胺基酸序列之VL的抗體或其抗原結合片段， (2) 包含具有如SEQ ID NO: 3中所述之胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 4中所述之胺基酸序列之VL的抗體或其抗原結合片段， (3) 包含具有如SEQ ID NO: 5中所述之胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 6中所述之胺基酸序列之VL的抗體或其抗原結合片段， (4) 包含具有如SEQ ID NO: 7中所述之胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 8中所述之胺基酸序列之VL的抗體或其抗原結合片段，及 (5) 包含具有如SEQ ID NO: 9中所述之胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 10中所述之胺基酸序列之VL的抗體或其抗原結合片段， 表示由該抗體或抗原結合片段中之硫氫基及該連接體形成之鍵聯，其中 HA經由該抗體或抗原結合片段中之該等硫氫基連接以形成該抗體-藥物結合物。
  34. 如請求項1至32中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物包含下式： 、 、 或 其中每一抗體-藥物結合物中之該HA選自： (1) 包含具有如SEQ ID NO: 1中所述之該胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 43或45中所述之胺基酸序列之CH、以及具有如SEQ ID NO: 2中所述之該胺基酸序列之VL及具有如SEQ ID NO: 44中所述之胺基酸序列之CL的抗體或其抗原結合片段； (2) 包含具有如SEQ ID NO: 3中所述之該胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 43或45中所述之該胺基酸序列之CH、以及具有如SEQ ID NO: 4中所述之該胺基酸序列之VL及具有如SEQ ID NO: 44中所述之該胺基酸序列之CL的抗體或其抗原結合片段； (3) 包含具有如SEQ ID NO: 5中所述之該胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 43或45中所述之該胺基酸序列之CH、以及具有如SEQ ID NO: 6中所述之該胺基酸序列之VL及具有如SEQ ID NO: 44中所述之該胺基酸序列之CL的抗體或其抗原結合片段； (4) 包含具有如SEQ ID NO: 7中所述之該胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 43或45中所述之該胺基酸序列之CH、以及具有如SEQ ID NO: 8中所述之該胺基酸序列之VL及具有如SEQ ID NO: 44中所述之該胺基酸序列之CL的抗體或其抗原結合片段；及 (5) 包含具有如SEQ ID NO: 9中所述之該胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 43或45中所述之該胺基酸序列之CH、以及具有如SEQ ID NO: 10中所述之該胺基酸序列之VL及具有如SEQ ID NO: 44中所述之該胺基酸序列之CL的抗體或其抗原結合片段； 表示由該抗體或抗原結合片段中之硫氫基及該連接體形成之鍵聯；其中 HA經由該抗體或抗原結合片段中之一或多個硫氫基連接以形成該抗體-藥物結合物； 且x係3至9。
  35. 如請求項1至34中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或其抗原結合片段包含顯示為SEQ ID NO: 3之VH及顯示為SEQ ID NO: 43或45之CH、顯示為SEQ ID NO: 4之VL及顯示為SEQ ID NO: 44之CL。
  36. 如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物係： ， 其中該抗體-藥物結合物中之HA係包含以下之抗體或其抗原結合片段：具有如SEQ ID NO: 3中所述之該胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 43或45中所述之該胺基酸序列之重鏈恆定區(CH)，以及具有如SEQ ID NO: 4中所述之該胺基酸序列之VL及具有如SEQ ID NO: 44中所述之該胺基酸序列之輕鏈恆定區(CL)； 表示由該抗體或抗原結合片段中之硫氫基及該連接體形成之鍵聯；其中 HA經由該抗體或抗原結合片段中之該等硫氫基連接以形成該抗體-藥物結合物； 且x係7至9。
  37. 如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物係： ， 其中HA係包含具有如SEQ ID NO: 46中所述之胺基酸序列之重鏈(HC)及具有如SEQ ID NO: 47中所述之胺基酸序列之輕鏈(LC)的抗體或其抗原結合片段； 表示由該抗體或抗原結合片段中之硫氫基及該連接體形成之鍵聯；其中 HA經由該抗體或抗原結合片段中之半胱胺酸之該等硫氫基連接以形成該抗體-藥物結合物； 且x係7至8。
  38. 如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物係： ， 其中HA係包含由如SEQ ID NO: 52、53或54中所述之胺基酸序列組成之重鏈(HC)及由如SEQ ID NO: 47中所述之該胺基酸序列組成之輕鏈(LC)的抗體； 表示由該抗體或抗原結合片段中之硫氫基及該連接體形成之鍵聯；其中 HA經由該抗體或抗原結合片段中之該等半胱胺酸之該等硫氫基連接以形成該抗體-藥物結合物； 且x係7至8。
  39. 如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物係： ， 其中HA係由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之抗體，每一重鏈(HC)由如SEQ ID NO: 52中所述之該胺基酸序列組成且每一輕鏈(LC)由如SEQ ID NO: 47中所述之該胺基酸序列組成；且 表示由該抗體或抗原結合片段中之硫氫基及該連接體形成之鍵聯；其中 HA經由該抗體或抗原結合片段中之該等半胱胺酸之該等硫氫基連接以形成該抗體-藥物結合物； 且x係7至8。
  40. 如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物係： ， 其中HA係包含具有如SEQ ID NO: 46中所述之該胺基酸序列之重鏈(HC)及具有如SEQ ID NO: 47中所述之該胺基酸序列之輕鏈(LC)的抗體或其抗原結合片段； 表示由該抗體或抗原結合片段中之硫氫基及該連接體形成之鍵聯；其中 HA經由該抗體或抗原結合片段中之該等半胱胺酸之該等硫氫基連接以形成該抗體-藥物結合物； 且x係8。
  41. 如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物係： 其中該抗體-藥物結合物中之HA係包含以下之抗體或其抗原結合片段：具有如SEQ ID NO: 3中所述之該胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 43或45中所述之該胺基酸序列之重鏈恆定區(CH)，以及具有如SEQ ID NO: 4中所述之該胺基酸序列之VL及具有如SEQ ID NO: 44中所述之該胺基酸序列之輕鏈恆定區(CL)； 表示由該抗體或抗原結合片段中之硫氫基及該連接體形成之鍵聯；其中 HA經由該抗體或抗原結合片段中之該等硫氫基連接以形成該抗體-藥物結合物； 且x係7至9。
  42. 如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物係： ， 其中HA係包含具有如SEQ ID NO: 46中所述之該胺基酸序列之重鏈(HC)及具有如SEQ ID NO: 47中所述之該胺基酸序列之輕鏈(LC)的抗體或其抗原結合片段； 表示由該抗體或抗原結合片段中之硫氫基及該連接體形成之鍵聯；其中 HA經由該抗體或抗原結合片段中之該等硫氫基連接以形成該抗體-藥物結合物； 且x係7至8。
  43. 如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物係： 其中HA係包含具有如SEQ ID NO: 46中所述之該胺基酸序列之重鏈(HC)及具有如SEQ ID NO: 47中所述之該胺基酸序列之輕鏈(LC)的抗體或其抗原結合片段； 表示由該抗體或抗原結合片段中之硫氫基及該連接體形成之鍵聯；其中 HA經由該抗體或抗原結合片段中之該等硫氫基連接以形成該抗體-藥物結合物； 且x係8。
  44. 如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物係： ， 其中該抗體-藥物結合物中之HA係包含以下之抗體或其抗原結合片段：具有如SEQ ID NO: 3中所述之該胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 43或45中所述之該胺基酸序列之重鏈恆定區(CH)，以及具有如SEQ ID NO: 4中所述之該胺基酸序列之VL及具有如SEQ ID NO: 44中所述之該胺基酸序列之輕鏈恆定區(CL)； 表示由該抗體或抗原結合片段中之硫氫基及該連接體形成之鍵聯；其中 HA經由該抗體或抗原結合片段中之該等硫氫基連接以形成該抗體-藥物結合物； 且x係7至9。
  45. 如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物係： ， 其中HA係包含具有如SEQ ID NO: 46中所述之該胺基酸序列之重鏈(HC)及具有如SEQ ID NO: 47中所述之該胺基酸序列之輕鏈(LC)的抗體或其抗原結合片段； 表示由該抗體或抗原結合片段中之硫氫基及該連接體形成之鍵聯；其中 HA經由該抗體或抗原結合片段中之該等硫氫基連接以形成該抗體-藥物結合物； 且x係7至8。
  46. 如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物係： ， 其中HA係包含具有如SEQ ID NO: 46中所述之該胺基酸序列之重鏈(HC)及具有如SEQ ID NO: 47中所述之該胺基酸序列之輕鏈(LC)的抗體或其抗原結合片段； 表示由該抗體或抗原結合片段中之硫氫基及該連接體形成之鍵聯；其中 HA經由該抗體或抗原結合片段中之該等硫氫基連接以形成該抗體-藥物結合物； 且x係8。
  47. 一種組合物，其包含一或多種如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物，其中該組合物之DAR (藥物-抗體結合比率)係1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、6-7、6-8、6-9、6-10、7-8、7-9、7-10、8-9、8-10或9-10。
  48. 如請求項1至47中任一項之抗體-藥物結合物，其中(i)重鏈C末端缺少離胺酸殘基；(ii)重鏈N末端係麩醯胺酸、麩胺酸、焦麩胺酸鹽或焦麩胺酸；或(iii)該重鏈C末端缺少離胺酸殘基且該重鏈N末端係麩醯胺酸、麩胺酸、焦麩胺酸鹽或焦麩胺酸。
  49. 如請求項1至46及48中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含重鏈，該重鏈包含具有選自由SEQ ID NO: 1、3、5、7及9組成之群之該胺基酸序列之VH。
  50. 如請求項1至46、48及49中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含重鏈，該重鏈包含具有選自由SEQ ID NO: 1、3、5、7及9組成之群之該胺基酸序列之VH，其中該抗體可變區之N末端麩醯胺酸或麩胺酸已環化成焦麩胺酸鹽或焦麩胺酸。
  51. 如請求項1至46及48至50中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含輕鏈，該輕鏈包含具有如SEQ ID NO: 8中所述之該胺基酸序列之VL，其中該抗體輕鏈可變區之N末端麩胺酸已環化成焦麩胺酸鹽或焦麩胺酸。
  52. 如請求項1至46及48至51中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段包含： (a) 由顯示為SEQ ID NO: 52之該序列組成之重鏈及由顯示為SEQ ID NO: 47之該序列組成之輕鏈； (b) 由顯示為SEQ ID NO: 53之該序列組成之重鏈及由顯示為SEQ ID NO: 47之該序列組成之輕鏈；或 (c) 由顯示為SEQ ID NO: 54之該序列組成之重鏈及由顯示為SEQ ID NO: 47之該序列組成之輕鏈。
  53. 如請求項1至46及48至52中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體或抗原結合片段可藉由在宿主細胞中表現編碼該抗體或其抗原結合片段之該等重鏈及該等輕鏈之核酸分子來獲得，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (1) 包含顯示為SEQ ID NO: 1之VH序列及顯示為SEQ ID NO: 43之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含顯示為SEQ ID NO: 2之VL序列及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈； (2) 包含顯示為SEQ ID NO: 3之VH序列及顯示為SEQ ID NO: 43或45之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含顯示為SEQ ID NO: 4之VL序列及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈； (3) 包含顯示為SEQ ID NO: 5之VH序列及顯示為SEQ ID NO: 43之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含顯示為SEQ ID NO: 6之VL序列及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈； (4) 包含顯示為SEQ ID NO: 7之VH序列及顯示為SEQ ID NO: 43之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含顯示為SEQ ID NO: 8之VL序列及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈； (5) 包含顯示為SEQ ID NO: 9之VH序列及顯示為SEQ ID NO: 43之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含顯示為SEQ ID NO: 10之VL序列及顯示為SEQ ID NO: 44之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈； (6) 具有如SEQ ID NO: 46中所述之該胺基酸序列之重鏈(HC)及具有如SEQ ID NO: 47中所述之該胺基酸序列之輕鏈(LC)； (7) 具有如SEQ ID NO: 1中所述之該胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 2中所述之該胺基酸序列之VL； (8) 具有如SEQ ID NO: 3中所述之該胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 4中所述之該胺基酸序列之VL； (9) 具有如SEQ ID NO: 5中所述之該胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 6中所述之該胺基酸序列之VL； (10) 具有如SEQ ID NO: 7中所述之該胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 8中所述之該胺基酸序列之VL；或 (11) 具有如SEQ ID NO: 9中所述之該胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 10中所述之該胺基酸序列之VL。
  54. 一種抗體-藥物結合物，其包含結合PTK7之抗體，該抗體經由該抗體之胺基酸之一或多個半胱胺酸或離胺酸殘基或非典型胺基酸取代結合至具有顯示為式M-L-E-D之結構之藥物連接體，其中 M係 ，其中環A係5-6員脂族雜環或5-20員芳族環系統，且該等脂族雜環及芳族環系統視情況地經一或多個選自由以下組成之群之成員取代：側氧基(=O)、鹵素、氰基、胺基、羧基、巰基及C 1-6烷基； M 1選自單鍵、C 1-20伸烷基、C 2-20伸烯基及C 2-20伸炔基； L係M與E之間的連接體； E係連接L及D之結構片段；且 D係細胞毒性藥物片段。
  55. 如請求項54之抗體-藥物結合物，其中 選自 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 。
  56. 如請求項54或55之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性藥物選自以下化合物： 及 ； 其中在該細胞毒性藥物連接至該連接體後獲得之該細胞毒性藥物之相應片段係如通式中所顯示之D。
  57. 如請求項54或55之抗體-藥物結合物，其中結合PTK7之該抗體選自由以下組成之群： (1) 以下重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中CDR係根據Chothia編號系統來定義： (1a) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有如SEQ ID NO: 11中所述之胺基酸序列之CDR-H1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 12中所述之胺基酸序列之CDR-H2或其變異體及具有如SEQ ID NO: 13中所述之胺基酸序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有如SEQ ID NO: 14中所述之胺基酸序列之CDR-L1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 15中所述之胺基酸序列之CDR-L2或其變異體及具有如SEQ ID NO: 16中所述之胺基酸序列之CDR-L3或其變異體；或 (1b) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有如SEQ ID NO: 27中所述之胺基酸序列之CDR-H1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 28中所述之胺基酸序列之CDR-H2或其變異體、具有如SEQ ID NO: 29中所述之胺基酸序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有如SEQ ID NO: 30中所述之胺基酸序列之CDR-L1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 31中所述之胺基酸序列之CDR-L2或其變異體及具有如SEQ ID NO: 32中所述之胺基酸序列之CDR-L3或其變異體； 其中(1a)及(1b)中任一者之該等變異體與衍生出該等變異體之該序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，或與衍生出該等變異體之該序列相比經歷一或若干個胺基酸之替代、缺失或添加； 或 (2) 以下重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中該等CDR係根據Kabat編號系統來定義： (2a) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有如SEQ ID NO: 17中所述之胺基酸序列之CDR-H1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 18或19中所述之胺基酸序列之CDR-H2或其變異體、具有如SEQ ID NO: 13中所述之該胺基酸序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有如SEQ ID NO: 14中所述之該胺基酸序列之CDR-L1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 15中所述之該胺基酸序列之CDR-L2或其變異體及具有如SEQ ID NO: 16中所述之該胺基酸序列之CDR-L3或其變異體；或 (2b) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有如SEQ ID NO: 33中所述之胺基酸序列之CDR-H1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 34或35中所述之胺基酸序列之CDR-H2或其變異體及具有如SEQ ID NO: 29中所述之該胺基酸序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有如SEQ ID NO: 30中所述之該胺基酸序列之CDR-L1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 31中所述之該胺基酸序列之CDR-L2或其變異體及具有如SEQ ID NO: 32中所述之該胺基酸序列之CDR-L3或其變異體； 其中(2a)及(2b)中任一者之該等變異體與衍生出該等變異體之該序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，或與衍生出該等變異體之該序列相比經歷一或若干個胺基酸之替代、缺失或添加； 或 (3) 以下重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中該等CDR係根據IMGT編號系統來定義： (3a) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有如SEQ ID NO: 20中所述之胺基酸序列之CDR-H1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 21中所述之胺基酸序列之CDR-H2或其變異體及具有如SEQ ID NO: 22中所述之胺基酸序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有如SEQ ID NO: 23中所述之胺基酸序列之CDR-L1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 24中所述之胺基酸序列之CDR-L2或其變異體及具有如SEQ ID NO: 16中所述之該胺基酸序列之CDR-L3或其變異體；或 (3b) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有如SEQ ID NO: 36中所述之胺基酸序列之CDR-H1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 37中所述之胺基酸序列之CDR-H2或其變異體及具有如SEQ ID NO: 38中所述之胺基酸序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有如SEQ ID NO: 39中所述之胺基酸序列之CDR-L1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 40中所述之胺基酸序列之CDR-L2或其變異體及具有如SEQ ID NO: 32中所述之該胺基酸序列之CDR-L3或其變異體； 其中(3a)及(3b)中任一者之該等變異體與衍生出該等變異體之該序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，或與衍生出該等變異體之該序列相比經歷一或若干個胺基酸之替代、缺失或添加； 及 (4) 以下重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中該等CDR係根據AbM編號系統來定義： (4a) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有如SEQ ID NO: 25中所述之胺基酸序列之CDR-H1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 26中所述之胺基酸序列之CDR-H2或其變異體及具有如SEQ ID NO: 13中所述之該胺基酸序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有如SEQ ID NO: 14中所述之該胺基酸序列之CDR-L1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 15中所述之該胺基酸序列之CDR-L2或其變異體及具有如SEQ ID NO: 16中所述之該胺基酸序列之CDR-L3或其變異體；或 (4b) 包含以下3個CDR之重鏈可變區(VH)：具有如SEQ ID NO: 41中所述之胺基酸序列之CDR-H1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 42中所述之胺基酸序列之CDR-H2或其變異體及具有如SEQ ID NO: 29中所述之該胺基酸序列之CDR-H3或其變異體；及/或包含以下3個CDR之輕鏈可變區(VL)：具有如SEQ ID NO: 30中所述之該胺基酸序列之CDR-L1或其變異體、具有如SEQ ID NO: 31中所述之該胺基酸序列之CDR-L2或其變異體及具有如SEQ ID NO: 32中所述之該胺基酸序列之CDR-L3或其變異體； 其中(4a)及(4b)中任一者之該等變異體與衍生出該等變異體之該序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，或與衍生出該等變異體之該序列相比經歷一或若干個胺基酸之替代、缺失或添加。
  58. 如請求項57之抗體-藥物結合物，其中結合PTK7之該抗體選自由以下組成之群： (a) 具有如SEQ ID NO: 1中所述之胺基酸序列之VH或其變異體，及/或具有如SEQ ID NO: 2中所述之胺基酸序列之VL或其變異體； (b) 具有如SEQ ID NO: 3中所述之胺基酸序列之VH或其變異體，及/或具有如SEQ ID NO: 4中所述之胺基酸序列之VL或其變異體； (c) 具有如SEQ ID NO: 5中所述之胺基酸序列之VH或其變異體，及/或具有如SEQ ID NO: 6中所述之胺基酸序列之VL或其變異體； (d) 具有如SEQ ID NO: 7中所述之胺基酸序列之VH或其變異體，及/或具有如SEQ ID NO: 8中所述之胺基酸序列之VL或其變異體；及 (e) 具有如SEQ ID NO: 9中所述之胺基酸序列之VH或其變異體，及/或具有如SEQ ID NO: 10中所述之胺基酸序列之VL或其變異體； 其中該等變異體與衍生出該等變異體之該序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，或與衍生出該等變異體之該序列相比經歷一或若干個胺基酸之替代、缺失或添加。
  59. 如請求項54或55之抗體-藥物結合物，其中結合PTK7之該抗體選自由以下組成之群： (1) 包含具有如SEQ ID NO: 1中所述之該胺基酸序列之VH及顯示為SEQ ID NO: 43之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含具有如SEQ ID NO: 2中所述之該胺基酸序列之VL及具有如SEQ ID NO: 44中所述之胺基酸序列之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈； (2) 包含具有如SEQ ID NO: 3中所述之該胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 43或45中所述之該胺基酸序列之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含具有如SEQ ID NO: 4中所述之胺基酸序列之VL及具有如SEQ ID NO: 44中所述之該胺基酸序列之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈； (3) 包含具有如SEQ ID NO: 5中所述之胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 43中所述之該胺基酸序列之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含具有如SEQ ID NO: 6中所述之胺基酸序列之VL及具有如SEQ ID NO: 44中所述之該胺基酸序列之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈； (4) 包含具有如SEQ ID NO: 7中所述之胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 43中所述之該胺基酸序列之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含具有如SEQ ID NO: 8中所述之胺基酸序列之VL及具有如SEQ ID NO: 44中所述之該胺基酸序列之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈；及 (5) 包含具有如SEQ ID NO: 9中所述之胺基酸序列之VH及具有如SEQ ID NO: 43中所述之該胺基酸序列之重鏈恆定區(CH)的重鏈，及包含具有如SEQ ID NO: 10中所述之胺基酸序列之VL序列及具有如SEQ ID NO: 44中所述之該胺基酸序列之輕鏈恆定區(CL)的輕鏈。
  60. 如請求項54或55之抗體-藥物結合物，其中結合PTK7之該抗體包含：具有如SEQ ID NO: 43或45中所述之該胺基酸序列之重鏈恆定區(CH)，及具有如SEQ ID NO: 44中所述之該胺基酸序列之輕鏈恆定區(CL)。
  61. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至60中任一項之抗體-藥物結合物及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
  62. 一種治療具有PTK7高表現之個體癌症之方法，其包括向該個體投與治療有效量之如請求項1至60中任一項之抗體-藥物結合物或如請求項61之醫藥組合物。
  63. 如請求項62之方法，其中該癌症包括實體腫瘤或血液惡性病。
  64. 如請求項63之方法，其中該癌症係肺癌、乳癌、上皮癌、卵巢癌或食道癌。
  65. 一種如請求項1至60中任一項之抗體-藥物結合物或如請求項61之醫藥組合物之用途，其用於製備用來治療具有PTK7高表現之癌症的藥物。
  66. 如請求項65之用途，其中該癌症包括實體腫瘤或血液惡性病。
  67. 如請求項65之用途，其中該具有PTK7高表現之癌症係肺癌、乳癌、上皮癌、卵巢癌及食道癌。
  68. 一種如請求項1至60中任一項之抗體-藥物結合物或如請求項61之醫藥組合物之用途，其用於治療具有PTK7高表現之癌症。
  69. 如請求項68之用途，其中該癌症包括實體腫瘤或血液惡性病。
  70. 如請求項69之用途，其中該具有PTK7高表現之癌症係肺癌、乳癌、上皮癌、卵巢癌及食道癌。
  71. 如請求項1至60中任一項之抗體-藥物結合物或如請求項61之醫藥組合物，其用於治療具有PTK7高表現之癌症。
  72. 如請求項71之抗體-藥物結合物，其中該癌症包括實體腫瘤或血液惡性病。
  73. 如請求項72之抗體-藥物結合物，其中該癌症係肺癌、乳癌、上皮癌、卵巢癌或食道癌。
TW112139032A 2022-10-14 2023-10-12 抗體—藥物結合物及其製備方法及用途 TW202421204A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2022112630340 2022-10-14
CN202211263034 2022-10-14
CN2023112843214 2023-09-28
CN202311284321 2023-09-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202421204A true TW202421204A (zh) 2024-06-01

Family

ID=89121570

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW112139032A TW202421204A (zh) 2022-10-14 2023-10-12 抗體—藥物結合物及其製備方法及用途

Country Status (2)

Country Link
TW (1) TW202421204A (zh)
WO (1) WO2024078586A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024208314A1 (zh) * 2023-04-07 2024-10-10 长春金赛药业有限责任公司 喜树碱衍生物、药物组合物及其制备方法和应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS61516B1 (sr) 2014-04-30 2021-03-31 Pfizer Konjugati anti-ptk7 antitelo-lek
EP3436070A4 (en) * 2016-03-29 2019-11-27 University of Southern California CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS TARGETING CANCER
US11970506B2 (en) 2017-12-15 2024-04-30 Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd. Bioactive molecule conjugate, preparation method and use thereof
CN111936169A (zh) 2018-04-06 2020-11-13 西雅图遗传学公司 喜树碱肽缀合物
CN117120097A (zh) * 2021-03-18 2023-11-24 思进公司 内化的生物活性化合物缀合物的选择性药物释放
TW202300179A (zh) * 2021-03-18 2023-01-01 美商西根公司 內化的生物活性化合物偶聯物選擇性釋放藥物
CN117120098A (zh) * 2021-03-18 2023-11-24 思进公司 内化的生物活性化合物缀合物的选择性药物释放
WO2022198231A1 (en) * 2021-03-18 2022-09-22 Seagen Inc. Selective drug release from internalized conjugates of biologically active compounds
IL313805A (en) * 2021-12-28 2024-08-01 Beigene Switzerland Gmbh Drug antibody conjugates
IL315508A (en) * 2022-03-17 2024-11-01 Seagen Inc Camptothecin conjugates
MX2024011518A (es) * 2022-03-23 2024-09-24 Synaffix B V Conjugados de anticuerpos para el tratamiento de tumores que expresan ptk7.

Also Published As

Publication number Publication date
WO2024078586A9 (en) 2024-10-17
WO2024078586A1 (en) 2024-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111018992B (zh) Trop2阳性疾病治疗的化合物及方法
KR20230145038A (ko) 생물활성 물질 접합체, 이의 제조방법 및 이의 용도
US20240269312A1 (en) Antibody drug conjugate, and preparation method therefor and use thereof
AU2019272250B2 (en) Anti-mesothelin antibody and antibody-drug conjugate thereof
TW202423981A (zh) 抗cd123抗體以及其結合物及衍生物
JP2024520674A (ja) 薬物コンジュゲート及びその使用
WO2023208216A1 (en) Antibody-drug conjugates and preparation methods and use thereof
JP2022533215A (ja) 親水性基を含むリンカーを有する抗体薬剤コンジュゲート
CA3005294A1 (en) Anti-5t4 antibodies and antibody-drug conjugates
KR20240043823A (ko) 링커, 약물 링커 및 그의 접합체, 및 그의 사용 방법
IL314567A (en) Drug-conjugated antibody to HER3 and its use
TW202421204A (zh) 抗體—藥物結合物及其製備方法及用途
CN117693526A (zh) 抗-c-Met抗体药物缀合物
TW202408589A (zh) 抗ror1抗體及抗體結合物、包含抗ror1抗體或抗體結合物之組合物，及製造及使用抗ror1抗體及抗體結合物之方法
JP2024535637A (ja) 抗体及びその薬物コンジュゲ－ト並びに用途
TW202421632A (zh) 抗體藥物偶聯物及其製備方法和用途
WO2024212922A1 (zh) 喜树碱类化合物及其偶联物、其制备方法和用途
KR20240130160A (ko) 항-cdh6 항체 및 항체-약물 접합체
WO2024230678A1 (zh) 喜树碱类化合物及其偶联物、其制备方法和用途
WO2024227439A1 (zh) 具有靶向作用的偶联物及其制备方法和用途
WO2022112942A2 (en) Anti-cd48 antibodies, antibody drug conjugates, and uses thereof
CN118684724A (zh) 连接子及其在配体药物偶联物中的应用
JP2024536798A (ja) 抗体薬物コンジュゲート並びにその製造方法及び医薬用途