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CN111936169A - 喜树碱肽缀合物 - Google Patents

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CN111936169A
CN111936169A CN201980024331.XA CN201980024331A CN111936169A CN 111936169 A CN111936169 A CN 111936169A CN 201980024331 A CN201980024331 A CN 201980024331A CN 111936169 A CN111936169 A CN 111936169A
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alkyl
gly
camptothecin
radical
alkylene
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CN201980024331.XA
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English (en)
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S·杰弗里
R·利斯基
M·瑞安
J·考克兰
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Seagen Inc
Original Assignee
Seattle Genetics Inc
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Publication date
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Abstract

本文提供了喜树碱缀合物、喜树碱‑连接子化合物、喜树碱化合物、其中间体及其制备方法。本文还提供了用本文所述的缀合物治疗癌症和自身免疫疾病的方法。

Description

喜树碱肽缀合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年4月6日提交的美国临时专利申请号62/653,961的优先权益，该临时专利申请以引用方式整体并入本文。
对序列表的引用
本申请在名为4500-00111_Sequence_Listing_ST25的文件中包含电子序列表，该文件于2019年7月18日创建并含13KB，其以引用方式并入本文。
背景技术
围绕使用单克隆抗体(mAb)向肿瘤细胞靶向递送细胞毒素剂，人们有着极大兴趣。虽然已评估了许多不同的药物类别经由抗体的递送，但只有少数几个药物类别被证明作为抗体药物缀合物是足够活性的，同时具有合适的毒性特性，以保证临床开发。受到关注的一个类别是喜树碱。
抗体药物缀合物(ADC)的设计是通过通常经由连接子将细胞毒素剂与抗体附连，其涉及对多种因素的考虑，包括药物上用于与连接子附连的缀合柄的存在和用于以条件稳定的方式附连药物到抗体的连接子技术。某些据信缺乏适宜的缀合柄的药物类别已被认为不适合用作ADC。尽管可能可以改性这样的药物以使其包含缀合柄，但这样的改性可能会不利地干扰药物的活性特性(profile)。
包含酯和碳酸酯的连接子通常也已用于含醇药物的缀合并产生稳定性和药物释放特性易变的ADC。非最佳特性可能导致ADC效能的降低、缀合物免疫学特异性的不足以及由于药物从缀合物的非特异性释放所致的毒性的增加。
因此，存在对可用于靶向疗法的新连接子技术和缀合物的需要。本发明解决了这些及其他需要。
发明内容
本发明特别提供了喜树碱缀合物、喜树碱-连接子化合物和喜树碱化合物、制备和使用它们的方法及可用于其制备中的中间体。本发明的喜树碱缀合物在循环中是稳定的，但能够一旦在肿瘤细胞附近或内部自缀合物释放出游离药物就造成细胞死亡。
在一个主要的实施方式中，提供了一种具有下式的喜树碱缀合物：
L-(Q-D)p
或其药学上可接受的形式，其中
L为配体单元；
Q为具有选自以下的式的连接子单元：
-Z-A-S*-RL-；-Z-A-LP(S*)-RL-；-Z-A-S*-RL-Y-；和-Z-A-LP(S*)-RL-Y-；
其中Z为延伸子(Stretcher)单元，A为键或接头(Connector)单元；LP为并行(Parallel)接头单元；S*为键或分配剂(Partitioning Agent)；RL为包含2至8个氨基酸的肽；并且Y为间隔子(Spacer)单元；
D为选自以下的药物单元：
Figure BDA0002712615540000031
其中
RB为选自H、C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、苯基和苯基C1-C4烷基的成员；
RC为选自C1-C6烷基和C3-C6环烷基的成员；
RF和RF’各自为独立地选自H、C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C2-C6杂烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-、C1-C8氨基烷基C(O)-、C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环烷基、C3-C10杂环烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基的成员；或者RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元环，所述取代基选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2；
并且其中RB、RC、RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代；并且
p为约1至约16；
其中Q通过CPT1、CPT2、CPT3、CPT4或CPT5上存在的羟基或胺基团中的任一个附连。
在另一个主要的实施方式中，提供了具有下式的喜树碱缀合物：
L-(Q-D)p
或其药学上可接受的盐，其中
L为配体单元；
Q为具有选自以下的式的连接子单元：
-Z-A-S*-RL-；-Z-A-LP(S*)-RL-；-Z-A-S*-RL-Y-；和-Z-A-LP(S*)-RL-Y-；
其中Z为延伸子单元，A为键或接头单元；LP为并行接头单元；S*为键或分配剂；RL为包含2至8个氨基酸的肽；切Y为间隔子单元；
D为选自以下的药物单元：
Figure BDA0002712615540000041
其中
RB为选自-H、-(C1-C4)烷基-OH、C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、苯基和苯基C1-C4烷基的成员；
RF和RF’各自为独立地选自H、C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C2-C6杂烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-、C1-C8氨基烷基C(O)-、C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环烷基、C3-C10杂环烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基的成员；或者RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元环，所述取代基选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2；
并且其中RB、RC、RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代；并且
p为约1至约16；
其中Q通过CPT2或CPT5上存在的羟基或胺基团中的任一个附连。
在又一个主要的实施方式中，提供了具有下式的喜树碱缀合物：
L-(Q-D)p
或其药学上可接受的盐，其中
L为配体单元；
Q为具有选自以下的式的连接子单元：
-Z-A-S*-RL-；-Z-A-LP(S*)-RL-；-Z-A-S*-RL-Y-；和-Z-A-LP(S*)-RL-Y-；
其中Z为延伸子单元，A为键或接头单元；LP为并行接头单元；S*为键或分配剂；RL为包含2至8个氨基酸的肽；Y为间隔子单元；
D为具有以下结构式的药物单元：
Figure BDA0002712615540000051
其中
RF和RF’各自为独立地选自H、C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C2-C6杂烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-、C1-C8氨基烷基C(O)-、C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环烷基、C3-C10杂环烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基的成员；或者RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元环，所述取代基选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2；
并且其中RB、RC、RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代；并且
p为约1至约16；
其中Q通过CPT5上存在的羟基或胺基团中的任何一个附连。
如上所述的其他主要实施方式为可用作制备喜树碱缀合物的中间体的喜树碱-连接子化合物，其中所述喜树碱-连接子化合物由喜树碱(D)和连接子单元(Q)组成，其中所述连接子单元由能够与提供配体单元的靶向配体形成共价键的延伸子单元前体(Z')和为2至8个氨基酸的肽的可释放连接子(RL)组成。
在另一个方面，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用本文所述的喜树碱缀合物。
在另一个方面，本文提供了使用本文所述的喜树碱-连接子化合物或喜树碱治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文提供了包含本文所述的喜树碱缀合物的试剂盒。
附图说明
图1A和1B示出了霍奇金淋巴瘤的L540cy皮下小鼠异种移植模型的平均肿瘤体积图，比较了基于肽的喜树碱ADC的活性。
图2示出了基于肽的喜树碱ADC对786-O肾细胞癌皮下小鼠异种移植模型的平均肿瘤体积的影响。
图3A-3C示出了Karpas 299/Karpas299-BVR间变性大细胞淋巴瘤旁观者皮下异种移植肿瘤模型的结果。
图4A-4D示出了在DelBVR模型中CD30导向喜树碱ADC的活性。
图5A和5B示出了在DelBVR模型中CD30导向喜树碱ADC的活性以及与本妥昔单抗的比较。
图6示出了在Karpas 299模型中使用单次和重复给药时CD30导向喜树碱ADC的活性。
图7A和7B示出了在L428模型中使用单次和重复给药时CD30导向喜树碱ADC的活性。
图8示出了在DEL-15模型中使用各种剂量时CD30导向喜树碱ADC的活性。
图9示出了在L82模型中CD30导向喜树碱ADC的活性。
图10示出了在小鼠血浆中进行的ADC稳定性研究的结果。
图11示出了IgG mAb和IgG-喜树碱ADC在Sprague-Dawley大鼠中的药代动力学特性。
图12示出了Kupffer细胞ADC摄取测定法的结果。
图13示出了用未缀合的cAC10单克隆抗体和CD30导向喜树碱ADC进行疏水相互作用色谱的结果。
图14A和14B分别示出了在ALCL细胞系Karpass 299和HL细胞系L540cy中自CD30导向喜树碱ADC的体外药物释放的结果。
具体实施方式
定义
除非另有说明，否则本文所用的以下术语和表述旨在具有以下含义。当在本文中使用商品名时，除非上下文另有指出，否则该商品名包括商品名产品的产品配方、通用名药物和活性药物成分。
如本文所用，术语“抗体”在最广义上使用并具体涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和表现出所需生物活性的抗体片段。抗体的天然形式为四聚体并由两个相同的免疫球蛋白链对组成，每个对具有一条轻链和一条重链。在每个对中，轻链和重链可变区(VL和VH)一起主要负责与抗原的结合。轻链和重链可变结构域由被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)打断的框架区组成。恒定区可被免疫系统识别并与之相互作用。(参见例如Janeway等,2001,Immunol.Biology,第5版,Garland Publishing,New York)。抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的。抗体可源自任何合适的物种。在一些实施方式中，抗体是人源或鼠源的。抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质性的抗体群体(即，除可少量存在的可能的自然发生的突变外构成该群的各个抗体均相同)获得的抗体。单克隆抗体具有高度特异性，针对的是单个抗原位点。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上均质性的抗体群体获得这一特征，而不应理解为需要通过任何特定的方法产生抗体。
如与抗体类别相适应，“完整抗体”是包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2、CH3和CH4的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，包含其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、双链抗体、三链抗体、四链抗体、线性抗体、单链抗体分子、scFv、scFv-Fc、由一个或多个抗体片段形成的多特异性抗体片段、由Fab表达文库产生的一个或多个片段、或上述任何一个的表位结合片段，所述表位结合片段与靶抗原(例如，癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)免疫特异性结合。
“抗原”是抗体特异性结合的实体。
术语“特异性结合”和“特异性地结合”是指抗体或抗体衍生物将以高度选择性的方式与其靶抗原的相应表位结合而不与多种其他抗原结合。通常，抗体或抗体衍生物以至少约1x10-7 M、优选地10-8M至10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的亲和力结合，并以比其与预定的抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力大至少两倍的亲和力与预定的抗原结合。
术语“抑制”或“…的抑制”指的是减少可测量的量或完全防止。
术语“治疗有效量”是指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的缀合物的量。就癌症而言，治疗有效量的缀合物可减少癌细胞的数量；减小肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减慢并优选停止)癌细胞向周围器官中的浸润；抑制(即在一定程度上减慢并优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解伴随癌症的一种或多种症状。在药物可抑制生长和/或杀伤现有癌细胞的程度上，其可以是细胞抑制的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，可例如通过评估疾病进展时间(TTP)和/或确定缓解率(RR)来衡量功效。
术语“基本”或“基本上”是指混合物或样品群体的大多数，即>50％，优选超过群体的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
术语“细胞毒性活性”是指药物或喜树碱缀合物或喜树碱缀合物的细胞内代谢物的细胞杀伤作用。细胞毒性活性可以IC50值表示，该值为一半细胞存活的单位体积浓度(摩尔或质量)。
术语“细胞抑制活性”是指药物或喜树碱缀合物或喜树碱缀合物的细胞内代谢物的抗增殖作用。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指具有细胞毒性活性并导致细胞破坏的物质。该术语旨在包括化学治疗剂和毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其合成类似物和衍生物。
如本文所用，术语“细胞抑制剂”是指抑制细胞功能的物质，包括抑制细胞生长或增殖的物质。细胞抑制剂包括抑制剂如蛋白质抑制剂，例如酶抑制剂。细胞抑制剂具有细胞抑制活性。
术语“癌症”和“癌”是指或描述哺乳动物中通常以细胞生长失控为特征的生理状况或病症。“肿瘤”包含一个或多个癌细胞。
如本文所用，“自身免疫疾病”是指源自或针对个体自身组织或蛋白质的疾病或病症。
如本文所用，“患者”是指施用本发明的喜树碱缀合物的受试者。患者包括但不限于人、大鼠、小鼠、豚鼠、非人灵长类动物、猪、山羊、牛、马、狗、猫、鸟和禽类。通常，患者为大鼠、小鼠、狗、人或非人灵长类动物，更通常为人。
除非上下文另有指出，否则术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指治疗性治疗和预防性治疗，其中目的在于抑制或减慢(减轻)不希望的生理变化或病症，如癌症的发展或扩散。就本发明的目的而言，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病状态的稳定化(即，不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。与未接受治疗的预期生存期相比，“治疗”还可能意味着生存期延长。需要治疗的那些包括已经患上该疾病或病症的那些以及容易患上该疾病或病症的那些。
在癌症的范畴内，术语“治疗”包括以下中的任何或全部：杀伤肿瘤细胞；抑制肿瘤细胞、癌细胞或肿瘤的生长；抑制肿瘤细胞或癌细胞的复制；减轻总体肿瘤负荷或减少癌细胞的数量；和改善伴随疾病的一种或多种症状。
在自身免疫疾病的范畴内，术语“治疗”包括以下中的任何或全部：抑制与自身免疫疾病状态相关的细胞的复制，包括但不限于产生自身免疫抗体的细胞；减轻自身免疫抗体负荷和改善自身免疫疾病的一种或多种症状。
如本文所用，术语“药学上可接受的形式”是指所公开的化合物的形式，包括但不限于其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物、多晶型物、异构体、前药和同位素标记衍生物。在一个实施方式中，“药学上可接受的形式”包括但不限于其药学上可接受的盐、酯、前药和同位素标记衍生物。在一些实施方式中，“药学上可接受的形式”包括但不限于其药学上可接受的异构体和立体异构体、前药和同位素标记衍生物。
在某些实施方式中，药学上可接受的形式为药学上可接受的盐。如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指化合物(例如，药物、药物-连接子或喜树碱缀合物)的药学上可接受的有机或无机盐。在一些方面，化合物可含至少一个氨基基团，并因此可与氨基基团形成酸加成盐。示例性的盐包括但不限于硫酸盐、三氟乙酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸酯、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐(即，1,1’-亚甲基双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可能涉及另一分子如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他抗衡离子的引入。抗衡离子可以是任何将稳定母体化合物上的电荷的有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐可在其结构中具有不止一个带电荷的原子。其中多个带电荷的原子是药学上可接受的盐的一部分的情况可具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电荷的原子和/或一个或多个抗衡离子。
连接子单元为在喜树碱缀合物中将喜树碱与配体单元相连的双官能部分。本发明的连接子单元具有若干组分(例如，在一些实施方式中将具有碱性单元的延伸子单元；可存在或不存在的接头单元；也可存在或不存在的并行接头单元；可释放的肽连接单元；以及也可存在或不存在的间隔子单元)。
如本文所用，“PEG单元”为由重复的乙烯-氧基亚单元(PEG或PEG亚单元)组成的有机部分并可以是多分散的、单分散的或离散的(即，具有离散数目的乙烯-氧基亚单元)。多分散PEG为大小和分子量的非均匀混合物，而单分散PEG通常是从非均匀混合物纯化的并因此具有单一的链长和分子量。优选的PEG单元包含离散的PEG，其是以逐步的方式而非经由聚合过程合成的化合物。离散的PEG提供具有限定和指定链长的单一分子。
本文提供的PEG单元包含一个或多个聚乙二醇链，每个聚乙二醇链由一个或多个彼此共价附连的乙烯氧基亚单元组成。聚乙二醇链可例如以线形、支化或星形构型连接在一起。通常，在引入到喜树碱缀合物中之前，将至少一个聚乙二醇链在一端处用经亲电基团取代的烷基部分衍生化以与亚甲基氨基甲酸酯单元(即，代表R的一个实例)的氨基甲酸酯氮共价附连。通常，每个聚乙二醇链中未参与与连接子单元的其余部分的共价附连的末端乙烯氧基亚单元由PEG封端单元修饰，所述封端单元通常为任选被取代的烷基如–CH3、CH2CH3或CH2CH2CO2H。优选的PEG单元具有有着2至24个–CH2CH2O-亚单元的单一聚乙二醇链，这些亚单元串联地共价附连并在一端处由PEG封端单元终止。
除非另有指出，否则术语“烷基”本身或作为另一术语的一部分是指具有指定碳原子数的被取代或未被取代的直链或支链、饱和或不饱和烃(例如，“-C1-C8烷基”或“-C1-C10”烷基分别是指具有1至8或1至10个碳原子的烷基基团)。当未指定碳原子数时，烷基基团具有1至8个碳原子。代表性的直链“-C1-C8烷基”基团包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基和-正辛基；而支链–C3-C8烷基包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基和-2-甲基丁基；不饱和的-C2-C8烷基包括但不限于-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、-1-己基、2-己基、-3-己基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基和-3-甲基-1-丁炔基。有时烷基基团是未被取代的。烷基基团可被一个或多个基团所取代。在其他方面，烷基基团将是饱和的。
除非另有指出，否则“亚烷基”本身或作为另一术语的一部分是指具有述及的碳原子数、通常1-10个碳原子并具有两个一价原子团中心、通过从母体烷烃的同一或两个不同的碳原子去除两个氢原子而得到的被取代或未被取代的饱和、支链或直链或环状烃原子团。典型的亚烷基原子团包括但不限于：亚甲基(CH2)、1,2-亚乙基(CH2CH2)、1,3-亚丙基(CH2CH2CH2)、1,4-亚丁基(CH2CH2CH2CH2)等。在优选的方面，亚烷基为支链或直链烃(即，其不是环状烃)。
除非另有指出，否则“芳基”本身或作为另一术语的一部分是指具有述及的碳原子数、通常6-20个碳原子的通过从母体芳族环系的单个碳原子去除一个氢原子而得到的被取代或未被取代的一价碳环状芳族烃原子团。一些芳基基团在示例性的结构中以“Ar”表示。典型的芳基基团包括但不限于衍生自苯、被取代的苯、萘、蒽、联苯等的原子团。示例性的芳基基团为苯基基团。
除非另有指出，否则“亚芳基”本身或作为另一术语的一部分是指具有两个共价键(即，其是二价的)并如下面的结构中所示可在邻位、间位或对位取向的如上所定义的芳基基团，以苯基作为示例性基团：
Figure BDA0002712615540000131
除非另有指出，否则“C3-C8杂环”本身或作为另一术语的一部分是指具有3至8个碳原子(也称为环成员)和一至四个独立选自N、O、P或S的杂原子环成员并通过从母体环系的环原子去除一个氢原子而得到的一价的被取代或未被取代的芳族或非芳族单环状或双环状环系。杂环中的一个或多个N、C或S原子可被氧化。包含杂原子的环可以是芳族的或非芳族的。其中所有环原子都涉及在芳香化合物结构中的杂环被称为杂芳基，否则被称为杂碳环。除非另有指出，否则杂环在将产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处与其侧接基团附连。因此，杂芳基可通过其芳族环系的芳族碳键合，称为C-连接的杂芳基，或通过其芳族环系中的非双键N原子(即，非＝N-)键合，其被称为N-连接的杂芳基。因此，含氮杂环可以是C-连接的或N-连接的并包括吡咯部分，如吡咯-1-基(N-连接的)和吡咯-3-基(C-连接的)，以及咪唑部分，如咪唑-1-基和咪唑-3-基(两者都是N-连接的)及咪唑-2-基、咪唑-4-基和咪唑-5-基部分(它们都是C-连接的)。
除非另有指出，否则“C3-C8杂芳基”为芳族C3-C8杂环，其中下标表示该杂环的环状环系的碳总数或该杂芳基的芳族环系的芳族碳总数并且不暗示环系的大小或环稠合的存在与否。C3-C8杂环的代表性实例包括但不限于吡咯烷基、氮杂环丁烷基、哌啶基、吗啉基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、吡咯基、噻吩基(噻吩)、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、嘧啶基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基和异噁唑基。当明确给出时，杂环或杂芳基的环系的大小由环中原子的总数指示。例如，指定为5-或6-元杂芳基指示杂芳基的杂芳族环系中芳族原子的总数(即，5或6个)，但并不暗示该环系中芳族杂原子或芳族碳的数目。稠合的杂芳基被明确述及或由上下文如此暗示，并通常由稠合在一起构成稠合的杂芳族环系的每个芳族环中芳族原子的数目指示。例如，5,6-元杂芳基为与芳族6-元环稠合的芳族5-元环，其中一个或两个环具有一个或多个芳族杂原子或者其中在两个环之间共享杂原子。
通过与稠合环系的非芳族部分附连而与芳基或杂芳基稠合使得杂环保持非芳族并且是较大结构的一部分的杂环是任选被取代的杂环的一个实例，其中所述杂环被与芳基或杂芳基的环稠合所取代。同样，与通过与稠合环系的芳族部分附连而为较大结构的一部分的杂环或碳环稠合的芳基或杂芳基是任选被取代的芳基或杂环的一个实例，其中所述芳基或杂环被与杂环或碳环的环稠合所取代。
除非另有指出，否则“C3-C8杂环基(杂环基)”本身或作为另一术语的一部分是指其中杂环的氢原子之一被键替代的上文所定义C3-C8杂环状(heterocyclic)(即，其是二价的)。除非另有指出，否则“C3-C8亚杂芳基”本身或作为另一术语的一部分是指其中杂芳基基团的氢原子之一被键替代的上文所定义C3-C8杂芳基基团(即，其是二价的)。
除非另有指出，否则“C3-C8碳环”本身或作为另一术语的一部分为通过从母体环系的环原子去除一个氢原子而得到的3-、4-、5-、6-、7-或8-元一价、被取代或未被取代、饱和或不饱和的非芳族单环状或双环状碳环状环。代表性的-C3-C8碳环包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊二烯基、环己基、环己烯基、1,3-环己二烯基、1,4-环己二烯基、环庚基、1,3-环庚二烯基、1,3,5-环庚三烯基、环辛基和环辛二烯基。
除非另有指出，否则“C3-C8碳环基”本身或作为另一术语的一部分是指其中碳环基团的氢原子中的另一个被键替代的上文所定义C3-C8碳环基团(即，其是二价的)。
除非另有指出，否则术语“杂烷基”本身或与另一术语组合，除非另有述及，否则是指完全饱和或含1至3个不饱和度、由述及的碳原子数和一至十个、优选一至三个选自O、N、Si和S的杂原子组成的稳定的直链或支链烃或其组合，并且其中氮和硫原子可任选被氧化并且氮杂原子可任选被季铵化。杂原子O、N和S可位于杂烷基基团的任何内部位置处或位于烷基基团与分子的其余部分附连的位置处。杂原子Si可位于杂烷基基团的任何位置处，包括烷基基团与分子的其余部分附连的位置。实例包括–CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-O-CH3和–CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，如例如-CH2-NH-OCH3和–CH2-O-Si(CH3)3。通常，C1至C4杂烷基或亚杂烷基具有1至4个碳原子和1或2个杂原子，C1至C3杂烷基或亚杂烷基具有1至3个碳原子和1或2个杂原子。在一些方面，杂烷基和亚杂烷基是饱和的。
除非另有指出，否则术语“亚杂烷基”本身或与另一术语组合指的是衍生自杂烷基(如上文所讨论)的二价基团，例如–CH2-CH2-S-CH2-CH2-和–CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烷基基团，杂原子也可占据链末端中的任一个或两个。还此外，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团，不暗示连接基团的取向。
除非另有指出，否则“氨基烷基”本身或与另一术语组合指的是其中如本文所定义的烷基部分被氨基、烷基氨基、二烷基氨基或环烷基氨基基团所取代的杂烷基。示例性的非限制性氨基烷基有–CH2NH2、-CH2CH2NH2、-CH2CH2NHCH3和-CH2CH2N(CH3)2并还包括支化种类如呈(R)-或(S)-构型的–CH(CH3)NH2和-C(CH3)CH2NH2。或者，氨基烷基为如本文所定义的烷基部分、基团或取代基，其中除自由基碳外的sp3碳已被氨基或烷基氨基部分所替代，其中其sp3氮替代了烷基的sp3碳，条件是保留至少一个sp3碳。当将氨基烷基部分称为较大结构或另一个部分的取代基时，氨基烷基通过氨基烷基的烷基部分的碳自由基共价附连到该结构或部分。
除非另有指出，否则“烷基氨基”和“环烷基氨基”本身或与另一术语组合指的是如本文所述的烷基或环烷基原子团，其中所述烷基或环烷基原子团的自由基碳已被氮自由基所替代，条件是保留至少一个sp3碳。在其中烷基氨基在其氮处被另一个烷基部分取代的那些情况下，所得的被取代原子团有时被称为二烷基氨基部分、基团或取代基，其中取代氮的烷基部分是独立选择的。示例性且非限制性的氨基、烷基氨基和二烷基氨基取代基包括具有–N(R’)2结构的那些，其中这些实例中的R’独立选自氢或C1-6烷基，通常氢或甲基，而在包含在杂环烷基中的环烷基胺中，两个R’和它们所附连至的氮一起限定杂环状环。当两个R’均为氢或烷基时，有时将该部分分别描述为伯氨基基团和叔胺基团。当一个R’为氢而另一个为烷基时，则该部分有时被描述为仲氨基基团。伯和仲烷基氨基部分作为亲核试剂对含羰基的亲电中心更具反应性，而叔胺则更碱性。
“被取代的烷基”和“被取代的芳基”分别是指其中一个或多个氢原子(通常一个)各自独立地被取代基所替代的烷基和芳基。典型的取代基包括但不限于X、R’、OH、OR’、SR’、N(R’)2、N(R’)3、＝NR’、CX3、CN、NO2、-NR’C(＝O)R’、-C(＝O)R’、-C(＝O)N(R’)2、-S(＝O)2R’、-S(＝O)2NR’、-S(＝O)R’、-OP(＝O)(OR’)2、-P(＝O)(OR’)2、-PO3 ＝、PO3H2、-C(＝O)R’、-C(＝S)R’、-CO2R’、-CO2 -、-C(＝S)OR’、-C(＝O)SR’、-C(＝S)SR’、-C(＝O)N(R’)2、-C(＝S)N(R’)2和-C(＝NR)N(R’)2，其中每个X独立地选自卤素：-F、-Cl、-Br和-I；并且其中每个R’独立地选自-H、-C1-C20烷基、-C6-C20芳基、-C3-C14杂环、保护基团和前药部分。
更通常地，取代基选自X、R’、OH、OR’、SR’、N(R’)2、N(R’)3、＝NR’、-NR’C(＝O)R’、-C(＝O)R’、-C(＝O)N(R’)2、-S(＝O)2R’、-S(＝O)2NR’、-S(＝O)R’、-C(＝O)R’、-C(＝S)R’、-C(＝O)N(R’)2、-C(＝S)N(R’)2和-C(＝NR)N(R’)2，其中每个X独立地选自–F和-Cl，或者选自X、R’、OH、OR’、N(R’)2、N(R’)3、-NR’C(＝O)R’、-C(＝O)N(R’)2、-S(＝O)2R’、-S(＝O)2NR’、-S(＝O)R’、-C(＝O)R’、-C(＝O)N(R’)2、-C(＝NR)N(R’)2、保护基团和其中每个X为–F的前药部分；并且其中每个R’独立地选自氢、-C1-C20烷基、-C6-C20芳基、-C3-C14杂环、保护基团和前药部分。在一些方面，烷基取代基选自N(R’)2、N(R’)3和-C(＝NR)N(R’)2，其中R’选自氢和-C1-C20烷基。在其他方面，烷基被一系列乙烯氧基部分取代而限定PEG单元。如上所述的亚烷基、碳环、碳环基、亚芳基、杂烷基、亚杂烷基、杂环、杂环基、杂芳基和亚杂芳基也可被类似地取代。
如本文所用，“保护基团”指的是防止或降低与其连接的原子或官能团参与不希望的反应的能力的部分。Greene(1999),“PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS,3RD ED.”,WileyInterscience中给出了原子或官能团的典型保护基团。在一些情况下使用针对杂原子如氧、硫和氮的保护基团来最大限度地减少或避免不希望的其与亲电化合物的反应。在其他情况下，使用保护基团来减少或消除无保护杂原子的亲核性和/或碱性。被保护的氧的非限制性实例由-ORPR给出，其中RPR为羟基的保护基团，其中羟基通常以酯(例如，乙酸酯、丙酸酯或苯甲酸酯)的形式被保护。羟基的其他保护基团将避免干扰有机金属试剂或其他高度碱性试剂的亲核性，其中羟基通常以醚的形式被保护，包括烷基或杂环烷基醚(例如，甲基或四氢吡喃基醚)、烷氧基甲基醚(例如，甲氧基甲基或乙氧基甲基醚)、任选被取代的芳基醚和甲硅烷基醚(例如，三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS/TBDMS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)和[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]-甲基甲硅烷基(SEM))。氮保护基团包括针对伯胺或仲胺的那些，如在-NHRPR或-N(RPR)2-中，其中RPR中的至少一个为氮原子保护基团或两个RPR一起构成保护基团。
当某保护基团能够在分子中其他地方实现期望的化学转化所需的反应条件下以及在期望时纯化新形成的分子的过程中防止或避免不希望的副反应或保护基团的过早损失，并且可在不会不利地影响该新形成的分子的结构或立体化学完整性的条件下去除时，则该保护基团将是合适的。作为实例而非限制，合适的保护基团可包括前文针对保护官能团所描述的那些。合适的保护基团有时是在肽偶联反应中使用的保护基团。
“芳族醇”本身或作为较大结构的一部分是指被羟基官能团-OH取代的芳族环系。因此，芳族醇是指具有键合到其芳族环系的芳族碳的羟基官能团的任何如本文所述的芳基、杂芳基、亚芳基和亚杂芳基部分。当芳族醇的芳族环系是该部分的取代基时，该芳族醇可以是较大部分的一部分，或者可通过环稠合嵌入到较大部分中，并且可任选被如本文所述的部分所取代，包括一个或多个其他羟基取代基。酚醇是具有酚基团作为芳族环的芳香醇。
“脂族醇”本身或作为较大结构的一部分是指具有键合到羟基官能团-OH的非芳族碳的部分。带羟基的碳可未被取代(即，甲醇)，或者可具有一个、两个或三个任选被取代的支化或未支化烷基取代基而在线形或环状结构内限定伯醇、或者脂族仲或叔醇。当是较大结构的一部分时，醇可以是通过经带羟基的碳、经如本文所述的烷基或其他部分的碳键合到该带羟基的碳或经该烷基或其他部分的取代基取代该结构的取代基。脂族醇涵盖其中羟基官能团键合到其环状环系的非芳族碳上的非芳族环状结构(即，碳环和杂碳环，任选被取代)。
如本文所用，“芳基烷基”或“杂芳基烷基”是指其中芳基部分键合到烷基部分的取代基、部分或基团，即芳基-烷基-，其中烷基和芳基基团为如上所述，例如，C6H5-CH2-或C6H5-CH(CH3)CH2-。芳基烷基或杂芳基烷基通过其烷基部分的sp3碳与较大的结构或部分缔合。
如本文所用，“吸电子基团(EWG)”指的是这样的官能团或电负性原子，其以感应方式和/或通过共振从其所键合的原子吸走电子密度，感应和共振中的任何一个都可以更占主导(即，官能团或原子可以感应方式吸电子，但总体上可以是通过共振给电子的)，并往往稳定阴离子或富电子部分。吸电子效应通常以感应方式(虽然以衰减形式)传递到与键合原子附连的其他原子，键合原子已因吸电子基团(EWG)而缺电子，从而影响更远的反应中心的亲电性。示例性的吸电子基团包括但不限于-C(＝O)、-CN、-NO2、-CX3、-X、-C(＝O)OR’、-C(＝O)N(R’)2、-C(＝O)R’、-C(＝O)X、-S(＝O)2R’、-S(＝O)2OR’、-S(＝O)2NHR’、-S(＝O)2N(R’)2、-P(＝O)(OR’)2、-P(＝O)(CH3)NHR’、-NO、-N(R’)3 +，其中X为-F、-Br、-Cl或-I，并且在一些方面，R’在每次出现时独立地选自氢和C1-6烷基，以及某些如本文所述的O-连接部分如酰氧基。
示例性的EWG也可包括芳基基团(例如，苯基)，具体取决于取代和某些杂芳基基团(例如，吡啶)。因此，术语“吸电子基团”还包括被吸电子基团进一步取代的芳基或杂芳基。通常，芳基或杂芳基上的吸电子基团为-C(＝O)、-CN、-NO2、-CX3和–X，其中X独立地选自卤素，通常-F或-Cl。取决于其取代基，烷基部分也可以是吸电子基团。
“离去基团能力”涉及与喜树碱缀合物中的喜树碱相对应的含醇、含硫醇、含胺或含酰胺的化合物在缀合物内自消解(self-immolative)事件的激活后作为游离药物从缀合物释放的能力。该释放可能是可变的，而没有其喜树碱附连到的亚甲基氨基甲酸酯单元的益处(即，当喜树碱直接附连到自消解部分并且不具有插入的亚甲基氨基甲酸酯单元时)。良好的离去基团通常是弱碱，并且从这样的缀合物排出的官能团酸性越强，则缀合物碱越弱。因此，在未使用亚甲基氨基甲酸酯单元(即，其中喜树碱直接附连到自消解部分)的情况下，含醇、含硫醇、含胺或含酰胺的游离药物从喜树碱的离去基团能力将与从缀合物排出的药物官能团的pKa有关。因此，该官能团的较低pKa将增加其离去基团能力。尽管其他因素可能有助于游离药物从缀合物的释放而不具有亚甲基氨基甲酸酯的益处，但通常，具有有着较低pKa值的官能团的药物通常将比经由具有较高pKa值的官能团附连的药物是更好的离去基团。另一个考虑是，由于喜树碱经由自发水解的过早损失，故pKa值太低的官能团可能导致不可接受的活性特性。对于采用亚甲基氨基甲酸酯单元的缀合物，在自消解后会产生具有允许游离药物的高效释放的pKa值的通用官能团(即，氨基甲酸)，而不会遭受不可接受的喜树碱损失。
如本文所用，“琥珀酰亚胺部分”是指由琥珀酰亚胺环系组成的有机部分，其存在于一种类型的延伸子单元(Z)中，所述延伸子单元通常还包含键合到该环系的酰亚胺氮的含亚烷基的部分。琥珀酰亚胺部分通常由配体单元的巯基基团向延伸子单元前体(Z')的马来酰亚胺环系的Michael加成产生。因此，琥珀酰亚胺部分由硫取代的琥珀酰亚胺环系组成，并且当存在于喜树碱缀合物中时，其酰亚胺氮被喜树碱缀合物的连接子单元的其余部分所取代并任选被存在于Z'的马来酰亚胺环系上的一个或多个取代基所取代。
如本文所用，“酸-酰胺部分”是指具有酰胺取代基的琥珀酸，其由琥珀酰亚胺部分的硫取代琥珀酰亚胺环系通过水解使其羰基-氮键中之一断裂产生。产生琥珀酸-酰胺部分的水解提供的连接子单元不太可能遭受通过抗体-硫取代基的消除而与之键合的配体单元的过早损失。硫-取代的琥珀酰亚胺部分的琥珀酰亚胺环系的水解预期将提供酸-酰胺部分的区域化学异构体，这是由于琥珀酰亚胺环系的两个羰基碳的反应性差异可至少部分归因于延伸子单元前体的马来酰亚胺环系中存在的任何取代基和由靶向配体引入的硫取代基。
如本文所用，术语“前药”是指生物活性较低或无活性的化合物，其经由化学或生物过程(即，化学反应或酶促生物转化)在体内转化为生物活性更高的化合物。通常，通过用前药部分对化合物进行化学修饰使得生物活性化合物的生物活性降低(即，转化为前药)。在一些方面，前药为II型前药，其在细胞外(例如，在消化液中)或在人体的循环系统中(例如，在血液中)被生物活化。示例性的前药有酯和β-D-吡喃葡萄糖苷。
在许多情况下，本文描述的缀合物、连接子和组分的组装体将是指反应性基团。“反应性基团”或RG是含反应性位点(RS)的基团，该位点能够与连接子单元的组分(即，A、W、Y)或喜树碱D形成键。RS为反应性基团(RG)内的反应性位点。反应性基团包括形成二硫键或硫醚键的巯基基团，形成腙键的醛、酮或肼基团，形成肽键的羧基或氨基基团，形成酯键的羧基或羟基基团，形成磺酰胺键的磺酸，形成氨基甲酸酯键的醇，和形成磺酰胺键或氨基甲酸酯键的胺。下表是反应性基团、反应性位点和在反应性位点的反应后可形成的示例性官能团的示意。该表不是限制性的。本领域技术人员应理解，表中提及的R'和R”部分实际上是任何有机部分(例如，烷基基团、芳基基团、杂芳基基团或被取代的烷基、芳基或杂芳基基团)，其与在将RG转化为示例性官能团之一中提供的键形成相容。还应理解，如适用于本发明的实施方式，视情况而定，R'可代表自稳定连接子或任选的辅助连接子的一种或多种组分，并视情况而定，R”可代表任选的辅助连接子、喜树碱、稳定单元或检测单元的一种或多种组分。
Figure BDA0002712615540000211
Figure BDA0002712615540000221
同位素标记化合物也在本公开的范围内。如本文所用，“同位素标记化合物”或“同位素衍生物”是指其中一个或多个原子被具有的原子质量或质量数不同于自然界通常发现的原子质量或质量数的原子所替代的目前公开的化合物，包括各自如本文所述的药物盐和前药。可引入到目前公开的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，如分别为2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F和36Cl。
通过同位素标记目前公开的化合物，所述化合物可用于药物和/或底物组织分布测定法中。氚化(3H)和碳-14(14C)标记化合物由于其易于制备和可检测性而特别优选。此外，用较重的同位素如氘(2H)取代可提供某些治疗优势，这是由于更高的代谢稳定性所致，例如，体内半衰期延长或剂量要求降低，并因此在一些情况下可能是优选的。同位素标记的目前公开的化合物，包括其药物盐、酯和前药，可通过本领域已知的任何手段来制备。用13C替代通常丰富的12C也可得到益处。(参见WO 2007/005643、WO 2007/005644、WO 2007/016361和WO 2007/016431。)
例如，出于通过初级动力学同位素效应来操纵化合物的氧化代谢的目的，可向本文公开的化合物中引入氘(2H)。初级动力学同位素效应是由同位素核的交换引起的化学反应速率的变化，这又是由此同位素交换后形成共价键所需的基态能量的变化引起的。较重的同位素的交换通常会导致化学键的基态能量的降低，从而导致限制速率的键断裂中速率的降低。如果沿着多产物反应的坐标在鞍点区域内或附近发生键断裂，则产物分布比可被大大改变。为了说明：如果氘在不可交换的位置与碳原子键合，则kM/kD＝2-7的速率差是典型的。如果该速率差被成功应用于容易氧化的本文所公开化合物，则该化合物在体内的特性可被极大改变并导致改善的药代动力学性质。
在发现和开发治疗剂时，本领域技术人员能够优化药代动力学参数，同时保留所需的体外性质。有理由假定许多药代动力学特性差的化合物容易发生氧化代谢。当前可用的体外肝微粒体测定提供了关于这种类型的氧化代谢过程的有价值的信息，这进而允许合理设计通过抵抗这样的氧化代谢而具有改善的稳定性的本文所公开化合物的氘化化合物。由此获得本文所公开化合物的药代动力学特性的显著改善，并可根据体内半衰期(t/2)、最大治疗效果浓度(Cmax)、剂量反应曲线下的面积(AUC)和F的增加以及根据下降的清除率、剂量和材料成本来定量表示。
以下旨在说明上述内容：以一系列类似物制备具有多个潜在的氧化代谢攻击位点例如苄基氢原子和与氮原子键合的氢原子的化合物，其中氢原子的各种组合被氘原子所替代，使得这些氢原子中的一些、大多数或全部已被氘原子所替代。半衰期确定使得能够有利和准确地确定抵抗氧化代谢的抵抗性改善已改善的程度。这样确认了由于这种类型的氘-氢交换，母体化合物的半衰期可延长至多100％。
本文公开的化合物中的氘-氢交换也可用来实现起始化合物的代谢物谱的有利修饰以减少或消除不希望的有毒代谢物。例如，如果有毒的代谢物通过氧化性碳-氢(C-H)键断裂而产生，则可合理地认为，氘化的类似物将在很大程度上减少或消除不希望的代谢物的产生，即便特定的氧化不是速率决定步骤。关于氘-氢交换的现有技术的更多信息可见于例如Hanzlik等,J.Org.Chem.55,3992-3997,1990；Reider等,J.Org.Chem.52,3326-3334,1987；Foster,Adv.Drug Res.14,1-40,1985；Gillette等,Biochemistry 33(10)2927-2937,1994；和Jarman等，Carcinogenesis 16(4),683-688,1993中。
本发明所设想的取代基和变量的组合仅是导致形成稳定化合物的那些。如本文所用，术语“稳定的”是指具有足以允许制造的稳定性并且将所述化合物的完整性维持足够长的时间段以可用于本文详述的目的(例如，治疗或预防性施用于受试者)的化合物。
在其制备之后优选将本发明的化合物分离和纯化以获得含等于或大于95重量％的量的(“基本上纯的”)组合物，然后如本文所述使用或配制。在某些实施方式中，本发明的化合物的纯度高于99％。
实施方式
下面描述了本发明的许多实施方式，其并不意在以任何方式限制本发明，并且后面跟着构成缀合物的组分的更详细的讨论。本领域技术人员应理解，所确定的每种缀合物及其任何选定实施方式意在包括每种组分和连接子的全部范围。
喜树碱缀合物
在一个方面，本文提供了具有下式的喜树碱缀合物：
L-(Q-D)p
或其药学上可接受的形式，其中
L为配体单元；
Q为具有选自以下的式的连接子单元：
-Z-A-S*-RL-；-Z-A-LP(S*)-RL-；-Z-A-S*-RL-Y-和-Z-A-LP(S*)-RL-Y-；
其中Z为延伸子单元，A为键或接头单元；LP为并行接头单元；S*为键或分配剂；RL为包含2至8个氨基酸的肽；Y为间隔子单元；
D为选自以下的药物单元：
Figure BDA0002712615540000251
其中
RB为选自H、C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、苯基和苯基C1-C4烷基的成员；
RC为选自C1-C6烷基和C3-C6环烷基的成员；
RF和RF’各自为独立选自H、C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C2-C6杂烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-、C1-C8氨基烷基C(O)-、C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环烷基、C3-C10杂环烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基的成员；或者RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元环，所述取代基选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2；
并且其中RB、RC、RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代；并且
p为约1至约16；
其中Q通过CPT1、CPT2、CPT3、CPT4或CPT5上存在的羟基或胺基团中的任一个附连。
在另一个方面，本文提供了具有下式的喜树碱缀合物：
L-(Q-D)p
或其药学上可接受的形式，其中
L为配体单元；
Q为具有选自以下的式的连接子单元：
-Z-A-S*-RL-；-Z-A-LP(S*)-RL-；-Z-A-S*-RL-Y-；和-Z-A-LP(S*)-RL-Y-；
其中Z为延伸子单元，A为键或接头单元；LP为并行接头单元；S*为键或分配剂；RL为包含2至8个氨基酸的肽；Y为间隔子单元；
D为选自以下的药物单元：
Figure BDA0002712615540000261
其中
RB为选自-H、-(C1-C4)烷基-OH、C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、苯基和苯基C1-C4烷基的成员；
RF和RF’各自为独立选自H、C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C2-C6杂烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-、C1-C8氨基烷基C(O)-、C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环烷基、C3-C10杂环烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基的成员；或者RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元环，所述取代基选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2；
并且其中RB、RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代；并且
p为约1至约16；
其中Q通过CPT2或CPT5上存在的羟基或胺基团中的任一个附连。
在又一个方面，本文提供了具有下式的喜树碱缀合物：
L-(Q-D)p
或其药学上可接受的形式，其中
L为配体单元；
Q为具有选自以下的式的连接子单元：
-Z-A-S*-RL-；-Z-A-LP(S*)-RL-；-Z-A-S*-RL-Y-；和-Z-A-LP(S*)-RL-Y-；
其中Z为延伸子单元，A为键或接头单元；LP为并行接头单元；S*为键或分配剂；RL为包含2至8个氨基酸的肽；Y为间隔子单元；
D为具有以下结构式的药物单元：
Figure BDA0002712615540000271
其中
RF和RF’各自为独立选自H、C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C2-C6杂烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-、C1-C8氨基烷基C(O)-、C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环基烷基、C3-C10杂环基烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基的成员；或者RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元环，所述取代基选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2；
并且其中RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代；并且
p为约1至约16；
其中Q通过CPT5上存在的羟基或胺基团中的任一个附连。
在一组实施方式中，D具有式CPT5。
在一组实施方式中，D具有式CPT2。
在一组实施方式中，D具有式CPT3。
在一组实施方式中，D具有式CPT4。
在一组实施方式中，D具有式CPT1。
在一些实施方式中，药学上可接受的形式为药学上可接受的盐。
在一组实施方式中，Q具有选自以下的式：
-Z-A-S*-RL-和-Z-A-S*-RL-Y-。
在另一组实施方式中，Q具有选自以下的式：-Z-A-LP(S*)-RL-和-Z-A-LP(S*)-RL-Y-。
在一组实施方式中，喜树碱缀合物包含具有式CPT1的药物单元并由选自以下的式表示：
Figure BDA0002712615540000291
其中基团L、Z、A、S*、LP、RL和Y具有上文以及本文具体叙述的任何实施方式中所提供的含义。
在另一组实施方式中，喜树碱缀合物包含具有式CPT2的药物单元并由选自以下的式表示：
Figure BDA0002712615540000301
其中基团L、Z、A、S*、LP、RL和Y具有上文以及本文具体叙述的任何实施方式中所提供的含义。
在一组实施方式中，RB为选自H、C1-C8烷基和C1-C8卤代烷基的成员。
在一组实施方式中，RB为选自C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、苯基和苯基C1-C4烷基的成员，并且其中RB的环烷基和苯基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代。
在另一组实施方式中，RB为H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、1-乙基丙基或己基。在其他实施方式中，RB为氯甲基或溴甲基。在其他实施方式中，RB为苯基或卤素取代的苯基。在其他实施方式中，RB为苯基或氟苯基。
在另一组实施方式中，喜树碱缀合物包含具有式CPT3的药物单元并由选自以下的式表示：
Figure BDA0002712615540000311
其中基团L、Z、A、S*、LP、RL和Y具有上文以及本文具体叙述的任何实施方式中所提供的含义。
在一组实施方式中，RC为C1-C6烷基。在一些实施方式中，RC为甲基。
在一组实施方式中，RC为C3-C6环烷基。
在另一组实施方式中，喜树碱缀合物包含具有式CPT4的药物单元并由选自以下的式表示：
Figure BDA0002712615540000321
其中基团L、Z、A、S*、LP、RL和Y具有上文以及本文具体叙述的任何实施方式中所提供的含义。
在另一组实施方式中，喜树碱缀合物包含具有式CPT5的药物单元并由选自以下的式表示：
Figure BDA0002712615540000331
Figure BDA0002712615540000341
其中基团L、Z、A、S*、LP、RL和Y具有上文以及本文具体叙述的任何实施方式中所提供的含义。
在一组实施方式中，RF和RF’均为H。
在一组实施方式中，RF和RF’中的至少一个为独立地选自C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C2-C6杂烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-和C1-C8氨基烷基C(O)-的成员。
在一组实施方式中，RF和RF’各自为独立选自C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C2-C6杂烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-和C1-C8氨基烷基C(O)-的成员。
在一组实施方式中，RF和RF’中的至少一个为独立地选自C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环烷基、C3-C10杂环烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基的成员，并且其中RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代。
在一组实施方式中，RF和RF’各自为独立选自H、C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环烷基、C3-C10杂环烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基的成员，并且其中RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代。
在一些实施方式中，RF为H而RF’为C1-C8烷基。
在一组实施方式中，RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元环，所述取代基选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2。
在一些实施方式中，喜树碱缀合物具有式(IC)：
Figure BDA0002712615540000351
或其药学上可接受的盐；
其中
y为1、2、3或4，或者为1或4；并且
z为2至12的整数，或者为2、4、8或12；
并且p为1-16。
在这些实施方式的一些方面，p为2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些方面，p为2、4或8。
在一些实施方式中，喜树碱缀合物具有式：
Figure BDA0002712615540000361
或其药学上可接受的盐；
其中p为2、4或8，优选地p为8。
在一些实施方式中，喜树碱缀合物具有式：
Figure BDA0002712615540000362
或其药学上可接受的盐；
其中p为2、4或8，优选地p为8。
在这些实施方式的一些方面，p为8。
喜树碱-连接子化合物
在一些方面，当制备喜树碱缀合物时，在与靶向配体缀合之前，需要合成完整的药物-连接子组合，或将药物与连接子的一部分组合。在这样的实施方式中，如本文所述的喜树碱-连接子化合物为中间体化合物。在这些实施方式中，喜树碱-连接子化合物中的延伸子单元尚未与配体单元共价附连并因此具有用于与靶向配体缀合的官能团(即，为延伸子单元前体Z')。在一个方面，喜树碱-连接子化合物包含喜树碱(在本文中以式CPT1、CPT2、CPT3、CPT4和CPT5示出)和包含可释放肽连接子(RL)的连接子单元(Q)，配体单元通过该连接子与喜树碱相连。因此，除了RL(其为肽连接子)外，连接子单元还包含延伸子单元前体(Z')，该前体包含用于与配体单元缀合的官能团并且能够将RL与配体单元(直接或间接地)相连。当期望添加分配剂(S*)作为侧链附接物时，在一些实施方式中可存在并行接头单元(LP)。在一些实施方式中，当期望在延伸子单元和RL之间增加更多距离时，存在接头单元(A)。
在一个方面，喜树碱-连接子化合物由具有式CPT1、CPT2、CPT3、CPT4或CPT5的喜树碱和连接子单元(Q)组成，其中Q包含直接附连到延伸子单元前体(Z')或通过与喜树碱-连接子化合物的连接子单元的中间组分(即，A、S*和/或LP(S*))附连而间接附连到Z'的可释放肽连接子，其中Z'由能够与靶向配体形成共价键的官能团组成。
在喜树碱缀合物和/或喜树碱-连接子化合物的上下文中，组装体最好按照其组分基团进行描述。尽管本文还描述了一些程序，但本领域技术人员将很好地理解组装的顺序及制备缀合物和化合物的通用条件。
组分基团
配体单元：
在本发明的一些实施方式中，存在配体单元。配体单元(L-)是与靶部分特异性结合的靶向剂。在一组实施方式中，配体单元特异性地并选择性地与细胞组分(细胞结合剂)或感兴趣的其他靶分子结合。配体单元的作用是将喜树碱(CPT1、CPT2、CPT3、CPT4或CPT5)或含喜树碱的药物组分靶向并呈递给因其靶组分或分子的存在而与该配体单元相互作用并允许游离药物随后在靶细胞内(即，细胞内)或附近(即，细胞外)释放的特定靶细胞群体。配体单元L包括但不限于蛋白质、多肽和肽。合适的配体单元包括例如抗体，例如全长抗体及其抗原结合片段、干扰素、淋巴因子、激素、生长因子和集落刺激因子、维生素、营养转运分子(如但不限于转铁蛋白)或任何其他细胞结合分子或物质。在一些实施方式中，配体单元(L)为抗体或非抗体蛋白靶向剂。
在一组实施方式中，配体单元与包含可释放肽连接子的Q(连接子单元)键合。如上所述，本文描述的缀合物中还可存在其他连接组分以用于在喜树碱药物化合物与配体单元之间提供额外的空间(例如，延伸子单元和任选地接头单元A)或提供组合物属性以增加溶解度(例如，分配剂S*)。在这些实施方式中的一些中，配体单元经由配体单元的杂原子与连接子单元的Z键合。可能存在于配体单元上用于该键合的杂原子包括硫(在一个实施方式中，来自靶向配体的巯基基团)、氧(在一个实施方式中，来自靶向配体的羧基或羟基基团)和氮，其任选被取代(在一个实施方式中，来自靶向配体的伯或仲胺官能团，或在另一个实施方式中，来自任选被取代的酰胺氮)。这些杂原子可以配体的天然状态(例如，在天然存在的抗体中)存在于靶向配体上，或者可经由化学修饰或生物工程引入到靶向配体中。
在一个实施方式中，配体单元具有巯基官能团，使得配体单元经由巯基官能团的硫原子与连接子单元键合。
在另一个实施方式中，配体单元具有一个或多个赖氨酸残基，其能够与喜树碱-连接子化合物中间体的延伸子单元前体的活化酯(这样的酯包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯基和对硝基苯基酯)反应并因此提供由配体单元的氮原子和连接子单元的延伸子单元的C＝O基团组成的酰胺键。
在又一个方面，配体单元具有一个或多个能够经化学修饰以引入一个或多个巯基基团的赖氨酸残基。在这些实施方式中，配体单元经由巯基官能团的硫原子共价附连到连接子单元。可用来以这种方式修饰赖氨酸的试剂包括但不限于N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸盐(SATA)和2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(Traut试剂)。
在另一个实施方式中，配体单元具有一个或多个能够经修饰以提供一个或多个巯基官能团的碳水化合物基团。喜树碱缀合物中经化学修饰的配体单元经由巯基官能团的硫原子与连接子单元组分(例如，延伸子单元)键合。
在又一个实施方式中，配体单元具有一个或多个可被氧化以提供醛(-CHO)官能团的碳水化合物基团(参见例如Laguzza等,1989,J.Med.Chem.32(3):548-55)。在这些实施方式中，相应的醛与延伸子单元前体上的反应性位点相互作用而在延伸子单元与配体单元之间形成键。延伸子单元前体上能够与靶向配体单元上的反应性含羰基官能团相互作用的反应性位点包括但不限于肼和羟胺。用于修饰蛋白质以附连连接子单元(Q)或相关物质的其他方案见述于Coligan等,Current Protocols in Protein Science,vol.2,John Wiley&Sons(2002)中(以引用方式并入本文)。
在一些方面，配体单元能够通过与延伸子单元前体(Z')上的反应性官能团相互作用而在延伸子单元(Z)与对应于靶向配体的配体单元之间形成共价键。具有与靶向配体相互作用的能力的Z'的官能团将取决于配体单元的性质。在一些实施方式中，反应性基团为马来酰亚胺，其在附连以形成配体单元之前存在于延伸子单元上(即，延伸子单元前体的马来酰亚胺部分)。配体单元与延伸子单元的共价附连通过配体单元的巯基官能团与Z'的马来酰亚胺官能团相互作用形成硫取代的琥珀酰亚胺而实现。巯基官能团可以配体单元的天然状态(例如，在天然存在的残基中)存在于配体单元上，或者可经由化学修饰或通过生物工程引入到配体单元中。
在又一个实施方式中，配体单元为抗体，并且巯基基团通过抗体的链间二硫化物的还原生成。相应地，在一些实施方式中，连接子单元与来自经还原的链间二硫化物的半胱氨酸残基缀合。
在又一个实施方式中，配体单元为抗体，并且巯基官能团以化学方式引入到抗体中，例如，通过半胱氨酸残基的引入。相应地，在一些实施方式中，连接子单元(具有或不具有附连的喜树碱)通过配体单元的引入的半胱氨酸残基与配体单元缀合。
对于生物缀合物，已观察到药物缀合的位点可影响许多参数，包括缀合的容易性、药物-连接子稳定性、对所得生物缀合物的生物物理性质的影响以及体外细胞毒性。关于药物-连接子稳定性，在一些情况下，药物-连接子部分与配体单元的缀合位点可影响缀合的药物-连接子部分进行消除反应的能力而引起游离药物的过早释放。在靶向配体上缀合的位点包括例如经还原的链间二硫化物以及工程化位点处的选定半胱氨酸残基。在一些实施方式中，形成如本文所述的喜树碱缀合物的缀合方法使用与使用来自经还原的二硫键的硫醇残基的缀合方法相比较不易于发生消除反应的在工程化位点处的硫醇残基(例如，根据Kabat中所述的EU索引的位置239)。在其他实施方式中，形成如本文所述的喜树碱缀合物的缀合方法使用在更易于发生消除反应的位点处的硫醇残基(例如，由链间二硫化物还原产生)。
在一些实施方式中，喜树碱缀合物包含非免疫反应性蛋白质、多肽或肽作为其配体单元。相应地，在一些实施方式中，配体单元为非免疫反应性蛋白质、多肽或肽。实例包括但不限于转铁蛋白、表皮生长因子(“EGF”)、蛙皮素、胃泌素、胃泌素释放肽、血小板衍生生长因子、IL-2、IL-6、转化生长因子(“TGF”)如TGF-α和TGF-β、牛痘病毒生长因子(“VGF”)、胰岛素和胰岛素样生长因子I和II、生长激素抑制素、凝集素和来自低密度脂蛋白的脱辅基蛋白。
特别优选的配体单元来自抗体。实际上，在本文描述的任何实施方式中，配体单元都可来自抗体。可用的多克隆抗体为衍生自免疫动物的血清的抗体分子的异质群体。可用的单克隆抗体为针对特定抗原决定簇(例如，癌细胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白质、肽、碳水化合物、化学物质、核酸或其片段)的抗体的同质群体。可通过使用本领域已知的任何技术来制备针对感兴趣抗原的单克隆抗体(mAb)，这些技术通过培养中的连续细胞系提供抗体分子的产生。
可用的单克隆抗体包括但不限于人单克隆抗体、人源化单克隆抗体或嵌合人-小鼠(或其他物种)单克隆抗体。抗体包括全长抗体及其抗原结合片段。人单克隆抗体可通过本领域已知的多种技术中的任何一种来制备(例如，Teng等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80:7308-7312；Kozbor等,1983,Immunology Today 4:72-79；和Olsson等,1982,Meth.Enzymol.92:3-16)。
抗体可以是将与靶细胞(例如，癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)免疫特异性结合的抗体的功能活性片段、衍生物或类似物，或者是与肿瘤细胞或基质结合的其他抗体。在这点上，“功能活性”指的是所述片段、衍生物或类似物能够与靶细胞免疫特异性结合。为了确定哪些CDR序列将与抗原结合，可通过本领域已知的任何结合测定方法(例如，BIA核心测定法)将含有CDR序列的合成肽用在与抗原的结合测定中(参见例如Kabat等,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,National Institute ofHealth,Bethesda,Md；Kabat E等,1980,J.Immunology 125(3):961-969)。
其他可用的抗体包括抗体的片段，如但不限于F(ab’)2片段、Fab片段、Fvs、单链抗体、双抗体、三链抗体、四链抗体、scFv、scFv-FV或与抗体具有相同的特异性的任何其他分子。
另外，可使用标准重组DNA技术制备的包含人和非人部分的重组抗体如嵌合和人源化单克隆抗体都是可用的抗体。嵌合抗体是其中不同的部分衍生自不同动物物种的分子，如例如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些。(参见例如美国专利号4,816,567和美国专利号4,816,397，其以引用方式全文并入本文。)人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。(参见例如美国专利号5,585,089，其以引用方式全文并入本文。)这样的嵌合和人源化单克隆抗体可通过本领域已知的重组DNA技术产生，例如使用国际公开号WO 87/02671；欧洲专利公开号0 184 187；欧洲专利公开号0 171 496；欧洲专利公开号0 173 494；国际公开号WO 86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利公开号012023；Berter等,1988,Science 240:1041-1043；Liu等,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439-3443；Liu等,1987,J.Immunol.139:3521-3526；Sun等,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等,1987,Cancer.Res.47:999-1005；Wood等,1985,Nature 314:446-449；和Shaw等,1988,J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559；Morrison,1985,Science229:1202-1207；Oi等,1986,BioTechniques 4:214；美国专利号5,225,539；Jones等,1986,Nature 321:552-525；Verhoeyan等,1988,Science 239:1534；和Beidler等,1988,J.Immunol.141:4053-4060中所述的方法；它们中的每一个均以引用方式全文并入本文。
在一些情况下(例如，当可能发生对非人抗体或嵌合抗体的免疫原性时)，完全人抗体将更理想并可使用不能够表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因但可表达人重链和轻链基因的转基因小鼠产生。
抗体包括经修饰的类似物和衍生物，即通过任何类型分子的共价附连修饰的类似物和衍生物，只要这样的共价附连允许抗体保持其抗原结合免疫特异性即可。例如但不限于，抗体的衍生物和类似物包括已经进一步修饰的那些，例如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、与细胞抗体单元或其他蛋白质的连接等修饰。众多化学修饰中的任何一种均可通过已知的技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、在衣霉素存在下的代谢合成等。另外，类似物或衍生物可含一种或多种非天然氨基酸。
抗体可在与Fc受体相互作用的氨基酸残基中具有修饰(例如，取代、删除或添加)。特别地，抗体可在确定为涉及在抗Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用中的氨基酸残基中具有修饰(参见例如国际公开号WO 97/34631，其以引用方式全文并入本文)。
对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体可商购获得或通过本领域技术人员已知的任何方法如重组表达技术生产。编码对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体的核苷酸序列可例如自GenBank数据库或类似数据库、文献出版物或通过常规克隆和测序获得。
在一个具体的实施方式中，可使用用于治疗癌症的已知抗体。
在另一个具体的实施方式中，根据本发明的组合物和方法使用用于治疗自身免疫疾病的抗体。
在某些实施方式中，可用的抗体可与活化淋巴细胞上表达的受体或受体复合物结合。受体或受体复合物可包含免疫球蛋白基因超家族成员、TNF受体超家族成员、整联蛋白、细胞因子受体、趋化因子受体、主要组织相容性蛋白、凝集素或补体调节蛋白。
在一些方面，引入到喜树碱缀合物中的抗体将与CD19、CD30、CD33、CD70或LIV-1特异性结合。
在一些方面，引入到喜树碱缀合物中的抗体将与CD30特异性结合。在另一些方面，引入到喜树碱缀合物中的抗体为cAC10抗-CD30抗体，其在国际专利公开号WO 02/43661中有述。在一些实施方式中，抗CD30抗体包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗CD30抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗CD30抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在一些方面，引入到喜树碱缀合物中的抗体将与CD70特异性结合。在另一些方面，引入到喜树碱缀合物中的抗体为h1F6抗CD70抗体，其在国际专利公开号WO 2006/113909中有述。在一些方面，引入到喜树碱缀合物中的抗体将与CD48特异性结合。在另一些方面，引入到喜树碱缀合物中的抗体为hMEM102抗CD48抗体，其在国际专利公开号WO 2016/149535中有述。在一些方面，引入到喜树碱缀合物中的抗体将与NTB-A特异性结合。在另一些方面，引入到喜树碱缀合物中的抗体为h20F3抗NTB-A抗体，其在国际专利公开号WO 2017/004330中有述。
喜树碱：
本文描述的各个方面和实施方式中采用的喜树碱由下式表示：
Figure BDA0002712615540000441
如本文所述。
在一个具体的实施方式中，喜树碱具有下式：
Figure BDA0002712615540000442
其中RF和RF’各自独立地为H、甘氨酰基、羟基乙酰基、乙基或2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基，或者其中RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成5-、6-或7-元杂环烷基环。在一些方面，RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成6-元环。在一些方面，所述6-元环为吗啉基或哌嗪基基团。在一些方面，RF’为H而RF为甘氨酰基、羟基乙酰基、乙基或2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基。在一些方面，RF’为H而RF包含脂族基团。RF’为H而RF包含芳基基团。在一些方面，RF’为H而RF包含酰胺基团。在一些方面，RF’为H而RF包含环氧乙烷基团。
在一个具体的实施方式中，喜树碱具有下式：
Figure BDA0002712615540000451
或其药学上可接受的盐，
其中RB为-H、-(C1-C4)烷基-OH、-(C1-C4)烷基-O-(C1-C4)烷基-NH2、-C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、苯基或苯基C1-C4烷基。在一些方面，RB包含C1-C8烷基。在一些方面，RB包含环丙基、戊基、己基、叔丁基或环戊基基团。
还有其他的喜树碱可用于本文描述的缀合物和化合物的上下文中。有效地，喜树碱将具有类似于如式CPT1、CPT2、CPT3、CPT4和CPT5所提供的那些结构的五环或六环稠合骨架，但可具有额外的基团，包括但不限于羟基、硫醇、胺或酰胺官能团，其氧、硫或任选被取代的氮杂原子能够引入到连接子中，并能够以游离药物的形式从缀合物释放。在一些方面，该官能团提供了药物上可用于附连到连接子单元(Q)的唯一位点。所得药物-连接子部分是可从喜树碱缀合物释放活性游离药物的部分，该喜树碱缀合物在其配体单元靶向的位点处具有该部分以发挥细胞毒性、抑制细胞或免疫抑制作用。
“游离药物”是指药物，因为它一旦从药物-连接子部分释放出来就存在。在一些实施方式中，游离药物包含可释放肽连接子(RL)或间隔子单元(Y)基团的片段。在一些实施方式中，包含可释放肽连接子基团的片段的游离药物是生物活性的。包含可释放肽连接子或间隔子单元(Y)的片段的游离药物经由可释放连接子的裂解从其余的药物-连接子部分释放，或经由间隔子单元(Y)基团中的键的裂解而释放，并在释放后是活性的。在一些实施方式中，游离药物与缀合药物的不同在于，药物的用于附连到自消解组装体单元的官能团不再与喜树碱缀合物的组分(除先前共享的杂原子之外)缔合。例如，含醇药物的游离羟基官能团可以D-O*H表示，而在缀合形式中，由O*表示的氧杂原子被引入到自消解单元的亚甲基氨基甲酸酯单元中。在自消解部分的激活和游离药物的释放后，与O*的共价键将被氢原子所替代，使得由O*表示的氧杂原子以-O-H的形式存在于游离药物上。
在一些实施方式中，喜树碱是生物活性的。在一些实施方式中，这样的喜树碱可用在抑制拓扑异构酶、杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞、癌细胞或肿瘤的生长、抑制肿瘤细胞或癌细胞的复制、减轻总体肿瘤负荷或减少癌细胞的数量、或改善伴随癌症或自身免疫疾病的一种或多种症状的方法中。这样的方法包括例如将癌细胞与喜树碱化合物接触。
连接子单元(Q)
如上所述，在一些实施方式中，连接基团Q具有选自以下的式：
-Z-A-S*-RL-
-Z-A-LP(S*)-RL-
-Z-A-S*-RL-Y-；和
-Z-A-LP(S*)-RL-Y-，
其中Z为延伸子单元，A为接头单元；LP为并行接头单元；S*为分配剂；RL为可释放肽连接子；Y为间隔子单元。
在一组实施方式中，Q具有选自以下的式：
-Z-A-S*-RL-；和-Z-A-S*-RL-Y-
其中Z为延伸子单元，A为键或接头单元；S*为分配剂；Y为间隔子单元。
延伸子单元(Z)或(Z’)：
延伸子单元(Z)为喜树碱缀合物或喜树碱-连接子化合物或其他中间体的组分，其作用是将配体单元与缀合物的其余部分相连。在这点上，延伸子单元在附连到配体单元之前(即，延伸子单元前体Z')具有可与靶向配体的官能团形成键的官能团。
在一些方面，延伸子单元前体(Z')具有能够与配体单元(例如，抗体)上存在的反应性亲核基团相互作用的亲电基团以在配体单元与连接子单元的延伸子单元之间提供共价键。抗体上具有该能力的亲核基团包括但不限于巯基、羟基和氨基官能团。抗体的亲核基团的杂原子与延伸子单元前体上的亲电基团是反应性的并在配体单元与连接子单元或药物-连接子部分的延伸子单元之间提供共价键。对于该目的可用的亲电基团包括但不限于马来酰亚胺、卤代乙酰胺基团和NHS酯。亲电基团为抗体附连以形成喜树碱缀合物或配体单元-连接子中间体提供了方便的位点。
在另一个实施方式中，延伸子单元前体具有反应性位点，该位点具有与配体单元(例如，抗体)上存在的亲电基团反应性的亲核基团。抗体上对于该目的可用的亲电基团包括但不限于醛和酮羰基基团。延伸子单元前体的亲核基团的杂原子可与抗体上的亲电基团反应并与抗体形成共价键。延伸子单元前体上对于该目的可用的亲核基团包括但不限于酰肼、羟胺、氨基、肼、缩氨基硫脲、羧酸肼和芳基酰肼。抗体上的亲电基团为抗体附连以形成喜树碱缀合物或配体单元-连接子中间体提供了方便的位点。
在一些实施方式中，配体单元的硫原子与延伸子单元由靶向配体的硫醇官能团与相应的延伸子单元前体的马来酰亚胺部分的反应形成的琥珀酰亚胺环系键合。在其他实施方式中，配体单元的硫醇官能团与α卤代乙酰胺部分反应以通过其卤素取代基的亲核取代而提供硫键合的延伸子单元。
这些实施方式的代表性延伸子单元包括在式Za和Zb的方括号内的那些(其中示出配体单元L供参考)：
Figure BDA0002712615540000481
Figure BDA0002712615540000482
其中波浪线表示与并行接头单元(LP)或接头单元(A)(如果LP不存在的话)或分配剂(S*)(如果LP不存在的话)的附连，并且R17为-C1-C10亚烷基-、C1-C10亚杂烷基-、-C3-C8碳环基-、-O-(C1-C8亚烷基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基C(＝O)-、C1-C10亚杂烷基-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-C(＝O)-、-O-(C1-C8亚烷基)-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-NH-、C1-C10亚杂烷基-NH-、-C3-C8碳环基-NH-、-O-(C1-C8亚烷基)-NH-、-亚芳基-NH-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-NH-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-NH-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C3-C8杂环基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-NH-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-S-、C1-C10亚杂烷基-S-、-C3-C8碳化基-S-、-O-(C1-C8亚烷基)-S-、-亚芳基-S-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-S-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-S-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-S-、-C3-C8杂环基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-S-或-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-S-。
在一些方面，式Za的R17基团任选地被碱性单元(BU)如氨基烷基部分例如–(CH2)xNH2、–(CH2)xNHRa和–(CH2)xNRa 2所取代，其中x为1-4的整数并且每个Ra独立地选自C1-6烷基和C1-6卤代烷基，或者两个Ra基团与它们所附连的氮组合形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基团。
一种示意性的延伸子单元是式Za或Zb的延伸子单元，其中R17为-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚杂烷基-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-C(＝O)-、-O-(C1-C8亚烷基)-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-C(＝O)-或-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-。
另一种示意性的延伸子单元是式Za的延伸子单元，其中R17为–C1-C5亚烷基-C(＝O)-，其中所述亚烷基任选被碱性单元(BU)如任选被取代的氨基烷基例如–(CH2)xNH2、–(CH2)xNHRa和–(CH2)xN(Ra)2取代，其中x为1-4的整数并且每个Ra独立地选自C1-6烷基和C1-6卤代烷基，或者两个Ra基团与它们所附连的氮组合形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基团。在合成过程中，碱性单元的碱性氨基官能团可由保护基团保护起来。
与配体单元键合的延伸子单元的示例性实施方式有如下：
Figure BDA0002712615540000491
Figure BDA0002712615540000501
其中与羰基相邻的波浪线表示与上式中LP、A或S*的附连，具体取决于A和/或LP的存在与否。
在一些优选的实施方式中，延伸子单元(Z)由琥珀酰亚胺部分组成，当与L键合时，其由式Za’的结构表示：
Figure BDA0002712615540000502
其中与羰基相邻的波浪线表示与上式中LP、A或S*的附连，具体取决于A和/或LP的存在与否；R17为–C1-C5亚烷基-，其中所述亚烷基被碱性单元(BU)取代，其中BU为–(CH2)xNH2、–(CH2)xNHRa或–(CH2)xN(Ra)2，其中x为1-4的整数并且每个Ra独立地选自C1-6烷基和C1-6卤代烷基，或者两个Ra与它们所附连的氮一起限定氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基团。
应理解，经配体单元取代的琥珀酰亚胺可以一种或多种水解形式存在。这些形式在下面针对与L键合的Za’的水解举例说明，其中表示来自该水解的区域异构体的结构为式Zb'和Zc'。相应地，在其他优选的实施方式中，延伸子单元(Z)由酸-酰胺部分组成，当与L键合时，其由以下表示：
Figure BDA0002712615540000511
与和R17键合的羰基相邻的波浪线为如针对Za’所定义，具体取决于A和/或LP的存在与否；并且R17为–C1-C5亚烷基-，其中所述亚烷基被碱性单元(BU)取代，其中BU为–(CH2)xNH2、–(CH2)xNHRa或–(CH2)xN(Ra)2，其中x为1-4的整数并且每个Ra独立地选自C1-6烷基和C1-6卤代烷基，或者两个Ra与它们所附连的氮一起限定氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基团。
在一些实施方式中，延伸子单元(Z)由酸-酰胺部分组成，当与L键合时，其由式Zd'或Ze'的结构表示：
Figure BDA0002712615540000521
其中与羰基相邻的波浪线为如针对Za’所定义。
在优选的实施方式中，延伸子单元(Z)由琥珀酰亚胺部分组成，当与L键合时，其由以下结构表示：
Figure BDA0002712615540000522
该结构由马来酰亚胺基-氨基-丙酰基(mDPR)类似物(3-氨基-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸衍生物)生成或由酸-酰胺部分组成，当与L键合时，其由以下结构表示：
Figure BDA0002712615540000523
与配体单元(L)和接头单元(A)键合的示意性延伸子单元具有以下结构，其由来自Za、Za'、Zb'或Zc'的结构组成，其中–R17-或–R17(BU)-为–CH2-、-CH2CH2-或–CH(CH2NH2)-：
Figure BDA0002712615540000531
其中与羰基相邻的波浪线为如针对Za’所定义。
在一组实施方式中，Z-A-包含马来酰亚胺基-链烷酸组分或mDPR组分。参见例如WO2013/173337。在一组实施方式中，Z-A-为马来酰亚胺基丙酰基组分。
与配体单元(L)和接头单元(A)键合的其他延伸子单元具有上述结构，其中上述Z-A结构中的A被具有以下结构的并行接头单元所替代：
Figure BDA0002712615540000541
其中n在8至24的范围内；RPEG为PEG单元封端基团，优选–CH3或–CH2CH2CO2H，星号(*)表示在结构上与式Za、Za'、Zb'或Zc'对应的延伸子单元的共价附连，波浪线表示与可释放连接子(RL)的共价附连。
与配体单元缀合之前的示例性延伸子单元(即，延伸子单元前体)由马来酰亚胺部分组成并由包括式Z’a的结构表示：
Figure BDA0002712615540000542
其中与羰基相邻的波浪线为如针对Za'所定义；R17为–(CH2)1-5-，任选被碱性单元如任选被取代的氨基烷基例如–(CH2)xNH2、–(CH2)xNHRa和–(CH2)xN(Ra)2所取代，其中x为1-4的整数并且每个Ra独立地选自C1-6烷基和C1-6卤代烷基，或者两个Ra基团与它们所附连的氮组合形成氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基团。
在式Z’a的一些优选的实施方式中，延伸子单元前体(Z')由以下结构之一表示：
Figure BDA0002712615540000551
其中与羰基相邻的波浪线为如针对Za’所定义。
在其他优选的实施方式中，延伸子单元前体(Z')由马来酰亚胺部分组成并由式Za’的结构表示：
Figure BDA0002712615540000552
其中与和R17键合的羰基相邻的波浪线为如针对Za’所定义；R17为–C1-C5亚烷基-，其中所述亚烷基被碱性单元(BU)所取代，其中BU为–(CH2)xNH2、–(CH2)xNHRa或–(CH2)xN(Ra)2，其中x为1-4的整数并且每个Ra独立地选自C1-6烷基和C1-6卤代烷基，或者两个Ra与它们所附连的氮一起限定氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基团。
在更优选的实施方式中，延伸子单元前体(Z')由马来酰亚胺部分组成并由以下结构表示：
Figure BDA0002712615540000553
其中与羰基相邻的波浪线为如针对Za'所定义。
在具有BU部分的延伸子单元中，应理解，在合成过程中该部分的氨基官能团可由氨基保护基团例如酸不稳定保护基团(例如，BOC)进行保护。
与由来自Za或Za’的结构组成的接头单元(其中–R17-或–R17(BU)-为–CH2-、-CH2CH2-或–CH(CH2NH2)-)共价附连的示意性延伸子单元前体具有以下结构：
Figure BDA0002712615540000561
其中与羰基相邻的波浪线为如针对Za’所定义。
与接头单元(A)键合的其他延伸子单元前体具有上述结构，其中上述Z’-A结构中的A被具有以下结构的并行接头单元和分配剂(-LP(S*)-)所替代：
Figure BDA0002712615540000562
其中n在8至24的范围内；RPEG为PEG单元封端基团，优选–CH3或–CH2CH2CO2H，星号(*)表示在结构上与式Za或Za’对应的延伸子单元单体的共价附连，波浪线表示与RL的共价附连。在如这里示出的那些的情况下，所示的PEG基团是各种分配剂的示例，包括不同长度的PEG基团和可直接附连或经修饰以附连到并行接头单元的其他分配剂。
在另一个实施方式中，延伸子单元经由配体单元的硫原子与延伸子单元的硫原子之间的二硫键与配体单元附连。该实施方式的代表性延伸子单元在式Zb的方括号内描绘：
Figure BDA0002712615540000571
其中波浪线表示与并行接头单元(LP)或接头单元(A)(如果LP不存在的话)或分配剂(S*)(如果A和LP不存在的话)的附连，R17为-C1-C10亚烷基-、C1-C10亚杂烷基-、-C3-C8碳环基-、-O-(C1-C8亚烷基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基C(＝O)-、C1-C10亚杂烷基-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-C(＝O)-、-O-(C1-C8亚烷基)-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-NH-、C1-C10亚杂烷基-NH-、-C3-C8碳环基-NH-、-O-(C1-C8亚烷基)-NH-、-亚芳基-NH-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-NH-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-NH-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C3-C8杂环基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-NH-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-S-、C1-C10亚杂烷基-S-、-C3-C8碳环基-S-、-O-(C1-C8亚烷基)-S-、-亚芳基-S-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-S-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-S-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-S-、-C3-C8杂环基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-S-或-(C3-C8之间)-C1-C10亚烷基-S-。
在又一个实施方式中，延伸子单元前体的反应性基团含可与配体单元的伯或仲氨基基团形成键的反应性位点。这些反应性位点的实例包括但不限于活化酯如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。该实施方式的代表性延伸子单元在式Zci、Zcii和Zciii的方括号内描绘：
Figure BDA0002712615540000581
其中波浪线表示与并行接头单元(LP)或接头单元(A)(如果LP不存在的话)或分配剂(S*)(如果A和LP不存在的话)的附连，并且R17为-C1-C10亚烷基-、C1-C10亚杂烷基-、-C3-C8碳环基-、-O-(C1-C8亚烷基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、C1-C10亚杂烷基-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-C(＝O)-、-O-(C1-C8亚烷基)-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-NH-、C1-C10亚杂烷基-NH-、-C3-C8碳环基-NH-、-O-(C1-C8亚烷基)-NH-、-亚芳基-NH-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-NH-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-NH-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C3-C8杂环基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-NH-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-S-、C1-C10亚杂烷基-S-、-C3-C8碳环基-S-、-O-(C1-C8亚烷基)-S-、-亚芳基-S-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-S-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-S-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-S-、-C3-C8杂环基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-S-或-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-S-。
在又一个方面，延伸子单元前体的反应性基团含反应性亲核试剂，其能够与存在于或引入到配体单元上的亲电试剂反应。例如，靶向配体上的碳水化合物部分可使用试剂如高碘酸钠温和地氧化并且被氧化的碳水化合物产生的亲电官能团(-CHO)可与含反应性亲核试剂的延伸子单元前体缩合，反应性亲核试剂有如酰肼、肟、伯胺或仲胺、肼、缩氨基硫脲、羧酸肼或芳基酰肼如Kaneko,T.等(1991)Bioconjugate Chem.2:13341中描述的那些。该实施方式的代表性延伸子单元在式Zdi、Zdii和Zdiii的方括号内描绘：
Figure BDA0002712615540000591
其中波浪线表示与并行接头单元(LP)或接头单元(A)或者分配剂(S*)(如果A和LP不存在的话)的附连，并且R17为-C1-C10亚烷基-、C1-C10亚杂烷基-、-C3-C8碳环基-、-O-(C1-C8亚烷基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、C1-C10亚杂烷基-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-C(＝O)-、-O-(C1-C8亚烷基)-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-NH-、C1-C10亚杂烷基-NH-、-C3-C8碳环基-NH-、-O-(C1-C8亚烷基)-NH-、-亚芳基-NH-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-NH-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-NH-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C3-C8杂环基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-NH-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-S-、C1-C10亚杂烷基-S-、-C3-C8碳环基-S-、-O-(C1-C8亚烷基)-S-、-亚芳基-S-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-S-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-S-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-S-、-C3-C8杂环基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-S-或-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-S-。
在本发明的一些方面，延伸子单元的质量不超过约1000道尔顿，不超过约500道尔顿，不超过约200道尔顿，为约30、50或100道尔顿至约1000道尔顿，为约30、50或100道尔顿至约500道尔顿，或为约30、50或100道尔顿至约200道尔顿。
接头单元(A)
接头单元(A)用来结合延伸子单元(Z)与分配剂(S*)或并行接头单元/分配剂组合(-LP(S*)-)。在一些实施方式中，接头单元(A)为直接连接组分的键。在一些实施方式中，喜树碱缀合物或喜树碱-连接子化合物中包含接头单元(A)以在延伸子单元(Z)或其前体(Z')与可释放肽连接子(RL)之间增加额外的距离。在一些方面，额外的距离将有助于RL内的激活。相应地，当存在时，接头单元(A)将扩展连接子单元的框架。在这点上，接头单元(A)在一个末端处与延伸子单元(或其前体)共价键合并在其另一个末端处与任选的并行接头单元(LP)或分配剂(S*)共价键合。
本领域技术人员应理解，接头单元可以是用来提供分配剂/可释放肽连接子部分(-S*-RL-)或并行接头单元/分配剂/可释放肽连接子部分(-LP(S*)-RL-)与连接子单元(Q)的其余部分的附连的任何基团。接头单元可例如由一种或多种(例如，1-10种，优选地1、2、3或4种)天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛、二氨基残基组成。在一些方面，接头单元为单个天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛或二氨基残基。一种能够充当接头单元的示例性氨基酸为β-丙氨酸。
在一些方面，接头单元具有下面所示的式：
Figure BDA0002712615540000611
其中波浪线表示喜树碱缀合物或喜树碱连接子化合物内与接头单元的附连；其中R111独立地选自氢、对-羟基苄基、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、
Figure BDA0002712615540000612
并且每个R100独立地选自氢或-C1-C3烷基，优选氢或CH3；下标c为从1至10、优选1至3独立地选择的整数。
具有羰基基团以便与分配剂(S*)或与–LP(S*)-附连的一种代表性接头单元为如下：
Figure BDA0002712615540000621
其中在每一种情况下R13独立地选自-C1-C6亚烷基-、-C3-C8碳环基-、-亚芳基-、-C1-C10亚杂烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-和-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-，下标c为1至4的范围内的整数。在一些实施方式中，R13为-C1-C6亚烷基，c为1。
具有羰基基团以便与分配剂(S*)或与–LP(S*)-附连的另一种代表性接头单元为如下：
Figure BDA0002712615540000622
其中R13为-C1-C6亚烷基-、-C3-C8碳环基-、-亚芳基-、-C1-C10亚杂烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-或-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-。在一些实施方式中，R13为-C1-C6亚烷基。
具有与分配剂(S*)或与–LP(S*)-附连的NH部分的一种代表性接头单元为如下：
Figure BDA0002712615540000623
其中在每一种情况下R13独立地选自-C1-C6亚烷基-、-C3-C8碳环基-、-亚芳基-、-C1-C10亚杂烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-和-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-，下标c为1至14。在一些实施方式中，R13为-C1-C6亚烷基，下标c为1。
具有与分配剂(S*)或与–LP(S*)-附连的NH部分的另一种代表性接头单元为如下：
Figure BDA0002712615540000631
其中R13为-C1-C6亚烷基-、-C3-C8碳环基-、-亚芳基-、-C1-C10亚杂烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-、–C(＝O)C1-C6亚烷基-或-C1-C6亚烷基-C(＝O)-C1-C6亚烷基。
接头单元的选定实施方式包括具有以下结构的那些
Figure BDA0002712615540000632
其中与氮相邻的波浪线表示与延伸子单元(Z)(或其前体Z')的共价附连，与羰基相邻的波浪线表示与分配剂(S*)或与–LP(S*)-的共价附连；m为1至6、优选2至6、更优选2至4的范围内的整数。
可释放肽连接子(RL)：
在一些实施方式中，可释放肽连接子(RL)将包含两个或更多个连续或非连续的氨基酸的序列(例如，使得RL具有2至不超过12个氨基酸)。可释放肽连接子可包含例如二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元或者由其组成。在一些方面，在存在酶(例如，肿瘤相关蛋白酶)的情况下，氨基酸之间的酰胺键被裂解，这最终导致游离药物的释放。
每个氨基酸都可以是天然或非天然的和/或为D-或L-异构体，条件是RL包含可裂解的键，当裂解时，该键将引发喜树碱的释放。在一些实施方式中，可释放肽连接子仅包含天然氨基酸。在一些方面，可释放肽连接子在连续序列中具有2至不超过12个氨基酸。
在一些实施方式中，每个氨基酸独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、硒代半胱氨酸、鸟氨酸、青霉胺、β-丙氨酸、氨基链烷酸、氨基炔酸、氨基链烷双酸、氨基苯甲酸、氨基-杂环基-链烷酸、杂环基-羧酸、瓜氨酸、抑胃酶氨酸和二氨基链烷酸及其衍生物。在一些实施方式中，每个氨基酸独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和硒代半胱氨酸。在一些实施方式中，每个氨基酸独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。在一些实施方式中，每个氨基酸选自蛋白原或非蛋白原氨基酸。
在另一个实施方式中，每个氨基酸独立地选自以下L-(天然)氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸和缬氨酸。
在另一个实施方式中，每个氨基酸独立地选自以下这些天然氨基酸的D-异构体：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸和缬氨酸。
在某些实施方式中，可释放肽连接子仅由天然氨基酸组成。在其他实施方式中，可释放肽连接子仅由非天然氨基酸组成。在一些实施方式中，可释放肽连接子由与非天然氨基酸附连的天然氨基酸组成。在一些实施方式中，可释放肽连接子由与天然氨基酸的D-异构体附连的天然氨基酸组成。
在另一个实施方式中，每个氨基酸独立地选自β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸。
示例性的可释放肽连接子包括具有Val-Lys-Gly-、-Val-Cit-、-Phe-Lys-或–Val-Ala-的二肽或三肽。
可设计和优化可用的可释放肽连接子对由特定的酶例如肿瘤相关蛋白酶进行酶促裂解的选择性。在一些实施方式中，由组织蛋白酶B、C或D或纤溶酶蛋白酶催化键的裂解。
在一些实施方式中，可释放肽连接子(RL)由-(–AA-)2-12-或(–AA-AA-)1-6表示，其中AA在每次出现时独立地选自天然或非天然氨基酸。在一个方面，AA在每次出现时独立地选自天然氨基酸。在另一个方面，RL为具有下式的三肽：AA1-AA2-AA3，其中AA1、AA2和AA3各自独立地为氨基酸并且其中AA1与–NH-附连而AA3与S*附连。在又一个方面，AA3为gly或β-ala。
在一些实施方式中，可释放肽连接子具有下面在方括号中所示的式，下标w为2至12的范围内的整数，或w为2、3或4，或w为3：
Figure BDA0002712615540000651
其中R19在每种情况下独立地选自氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、对羟基苄基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基、
Figure BDA0002712615540000661
在一些方面，每个R19独立地为氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、-(CH2)3NH2或-(CH2)4NH2。在一些方面，每个R19独立地为氢、异丙基或-(CH2)4NH2。
示意性的可释放肽连接子由式(Pa)、(Pb)和(Pc)表示
Figure BDA0002712615540000662
其中R20和R21为如下：
Figure BDA0002712615540000663
Figure BDA0002712615540000671
Figure BDA0002712615540000672
其中R20、R21和R22为如下：
Figure BDA0002712615540000673
Figure BDA0002712615540000674
其中R20、R21、R22和R23为如下：
Figure BDA0002712615540000675
在一些实施方式中，RL包含选自以下的肽：gly-gly、gly-gly-gly、gly-gly-gly-gly、val-gly-gly、val-cit-gly、val-gln-gly、val-glu-gly、phe-lys-gly、leu-lys-gly、gly-val-lys-gly、val-lys-gly-gly、val-lys-gly、val-lys-ala、val-lys-leu、leu-leu-gly、gly-gly-phe-gly、gly-gly-phe-gly-gly、val-gly和val-lys-β-ala。
在其他实施方式中，RL包含选自以下的肽：gly-gly-gly、gly-gly-gly-gly、val-gly-gly、val-cit-gly、val-gln-gly、val-glu-gly、phe-lys-gly、leu-lys-gly、gly-val-lys-gly、val-lys-gly-gly、val-lys-gly、val-lys-ala、val-lys-leu、leu-leu-gly、gly-gly-phe-gly和val-lys-β-ala。
还在其他的实施方式中，RL包含选自以下的肽：gly-gly-gly、val-gly-gly、val-cit-gly、val-gln-gly、val-glu-gly、phe-lys-gly、leu-lys-gly、val-lys-gly、val-lys-ala、val-lys-leu、leu-leu-gly和val-lys-β-ala。
仍在其他的实施方式中，RL包含选自以下的肽：gly-gly-gly-gly、gly-val-lys-gly、val-lys-gly-gly和gly-gly-phe-gly。
在其他实施方式中，RL为选自以下的肽：val-gln-gly、val-glu-gly、phe-lys-gly、leu-lys-gly、val-lys-gly、val-lys-ala、val-lys-leu、leu-leu-gly和val-lys-β-ala。
还在其他的实施方式中，RL为val-lys-gly。
还在其他的实施方式中，RL为val-lys-β-ala。
分配剂(S*)：
本文所述的喜树碱缀合物还可包含分配剂(S*)。分配剂部分可用于例如掩盖特定喜树碱或其他连接单元组分的疏水性。
代表性的分配剂包括聚乙二醇(PEG)单元、环糊精单元、聚酰胺、亲水性肽、多糖和树状聚合物。
当Q中包含聚乙二醇(PEG)单元、环糊精单元、聚酰胺、亲水性肽、多糖或树状聚合物时，这些基团可能以“串联(in line)”组分或者以侧链或支化组分存在。对于其中存在支化形式的那些实施方式，连接子单元通常包含赖氨酸残基(或并行接头单元LP)，其提供例如PEG单元与连接单元的其余部分的简单官能缀合。
聚乙二醇(PEG)单元
多分散PEG、单分散PEG和离散的PEG均可用作本发明的化合物中的分配剂的一部分。多分散PEG为大小和分子量的非均匀混合物，而单分散PEG通常是从非均匀混合物纯化的并因此具有单一的链长和分子量。优选的PEG为离散的PEG，其是以逐步的方式而非经由聚合过程合成的化合物。离散的PEG具有有着限定和指定链长的单一分子。
本文提供的PEG包含一条或多条聚乙二醇链。聚乙二醇链由至少两个环氧乙烷(CH2CH2O)亚单元组成。聚乙二醇链可以例如线形、支化或星形构型连接于一起。通常，PEG链中的至少之一在一端处经衍生化以共价附连到连接子单元的组分(例如，LP)上的适宜位点或者可用作其内的串联(例如，双官能)连接基团以共价接合两个连接子单元组分(例如，Z-A-S*-RL-、Z-A-S*-RL-Y-)。示例性的连接子单元内的附连借助的是非条件可裂解键或经由的是条件可裂解键。示例性的附连经由酰胺键、醚键、酯键、腙键、肟键、二硫键、肽键或三唑键。在一些方面，连接子单元内的附连借助的是非条件可裂解键。在一些方面，连接子单元内的附连不经由酯键、腙键、肟键或二硫键。在一些方面，连接子单元内的附连不经由腙键。
条件可裂解键是指当在血浆中循环时对裂解基本上不敏感但在细胞内或肿瘤内环境中对裂解敏感的键。非条件可裂解键是在任何生物环境中都对裂解基本上不敏感的键。腙的化学水解、二硫化物的还原和肽键或糖苷键的酶促裂解是条件可裂解键的实例。
在一些实施方式中，PEG单元将直接与并行接头单元B附连。PEG单元的另一个末端(或端子)可以是自由而不受束缚的并且可呈甲氧基、羧酸、醇或其他合适的官能团的形式。甲氧基、羧酸、醇或其他合适的官能团充当PEG单元的末端PEG亚单元的端帽(cap)。不受束缚的意思是PEG单元不会在该不受束缚的位点处与喜树碱、与抗体或与另一连接组分附连。技术人员应理解，PEG单元除了包含重复的乙二醇亚单元外还可含有非PEG材料(例如，以促进多条PEG链彼此的偶联)。非PEG材料是指PEG单元中不是重复的–CH2CH2O-亚单元的一部分的原子。在本文提供的一些实施方式中，PEG单元包含经由非PEG元件彼此附连的两条单体PEG链。在本文提供的其他实施方式中，PEG单元包含附连到中心核或并行接头单元的两条线形PEG链(即，PEG单元本身是支化的)。
本领域技术人员可利用许多PEG附连方法[参见例如Goodson,等(1990)Bio/Technology 8:343(PEGylation of interleukin-2at its glycosylation site aftersite-directed mutagenesis)；EP 0 401 384(coupling PEG to G-CSF)；Malik,等,(1992)Exp.Hematol.20:1028-1035(PEGylation of GM-CSF using tresyl chloride)；PCT公开号WO 90/12874(PEGylation of erythropoietin containing a recombinantlyintroduced cysteine residue using a cysteine-specific mPEG derivative)；美国专利号5,757,078(PEGylation of EPO peptides)；美国专利号5,672,662(Poly(ethyleneglycol)and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acidsand functional derivatives thereof for biotechnical applications)；美国专利号6,077,939(PEGylation of an N-terminal.alpha.-carbon of a peptide)；Veronese等,(1985)Appl.Biochem.Bioechnol 11:141-142(PEGylation of an N-terminalα-carbonof a peptide with PEG-nitrophenylcarbonate("PEG-NPC")or PEG-trichlorophenylcarbonate)；和Veronese(2001)Biomaterials 22:405-417(肽和蛋白PEG化的综述文章)]。
例如，PEG可经由反应性基团与氨基酸残基共价结合。反应性基团是活化的PEG分子可结合的那些(例如，游离氨基或羧基基团)。例如，N-末端氨基酸残基和赖氨酸(K)残基具有游离的氨基基团；而C-末端氨基酸残基具有游离的羧基基团。硫醇基团(例如，如半胱氨酸残基上存在的)也可用作附连PEG的反应性基团。另外，用于特异性地在多肽的C-末端处引入活化基团(例如，酰肼、醛和芳族氨基基团)的酶辅助方法已见描述(参见Schwarz,等(1990)Methods Enzymol.184:160；Rose,等(1991)Bioconjugate Chem.2:154；和Gaertner,等(1994)J.Biol.Chem.269:7224]。
在一些实施方式中，可使用具有不同反应性部分的甲氧基化PEG("mPEG")来附连PEG分子与氨基基团。这样的反应性部分的非限制性实例包括琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺碳酸酯(SC)、mPEG-亚氨酸酯、对硝基苯基碳酸酯(NPC)、琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)和氰脲酰氯。这样的mPEG的非限制性实例包括mPEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG-SS)、mPEG2-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG2-SS)；mPEG-琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)、mPEG2-琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG2-SC)；mPEG-亚氨酸酯、mPEG-对硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)、mPEG-亚氨酸酯；mPEG2-对硝基苯基碳酸酯(mPEG2-NPC)；mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)；mPEG2-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG,--SPA)；mPEG-N-羟基-琥珀酰亚胺(mPEG-NHS)；mPEG2-N-羟基-琥珀酰亚胺(mPEG2--NHS)；mPEG-氰脲酰氯；mPEG2-氰脲酰氯；mPEG2-赖氨醇-NPC和mPEG2-Lys-NHS。
通常，构成PEG单元的PEG链中的至少之一被官能化，使得其能够与其他连接子单元组分共价附连。
官能化包括例如经由胺、硫醇、NHS酯、马来酰亚胺、炔、叠氮化物、羰基或其他官能团。在一些实施方式中，PEG单元还包含非PEG材料(即，不是由–CH2CH2O-组成的材料)，其提供与其他连接子单元组分的偶联或者促进两条或更多条PEG链的偶联。
连接子单元中PEG单元(或其他分配剂)的存在可能对所得喜树碱缀合物的药代动力学产生两个潜在影响。期望的影响是清除率的下降(和随之而来暴露的增加)，这产生于喜树碱缀合物暴露的疏水性元件或暴露于喜树碱本身的疏水性元件所引起的非特异性相互作用的减少。第二个影响是不期望的并且是体积的减小和分配速率的降低，这有时产生于喜树碱缀合物的分子量的增加。增加PEG亚单元的数量会增大缀合物的流体动力学半径，这通常导致扩散性的降低。继而，扩散性的降低通常减弱喜树碱缀合物穿透到肿瘤中的能力(Schmidt and Wittrup,Mol Cancer Ther 2009；8:2861-2871)。由于这两种相互竞争的药代动力学作用，故希望使用足够大的PEG以降低喜树碱缀合物的清除率，从而增加血浆暴露，但又不大到会大大减弱其扩散性到其干扰喜树碱缀合物到达预期的靶细胞群体的能力的程度。关于针对特定的药物-连接子选择最佳PEG大小的方法，参见实施例(例如，US2016/0310612的实施例1、18和21)，其以引用方式并入本文。
在一组实施方式中，PEG单元包含一条或多条线形PEG链，每条链具有至少2个亚单元、至少3个亚单元、至少4个亚单元、至少5个亚单元、至少6个亚单元、至少7个亚单元、至少8个亚单元、至少9个亚单元、至少10个亚单元、至少11个亚单元、至少12个亚单元、至少13个亚单元、至少14个亚单元、至少15个亚单元、至少16个亚单元、至少17个亚单元、至少18个亚单元、至少19个亚单元、至少20个亚单元、至少21个亚单元、至少22个亚单元、至少23个亚单元或至少24个亚单元。在优选的实施方式中，PEG单元包含总计至少4个亚单元、至少6个亚单元、至少8个亚单元、至少10个亚单元或至少12个亚单元。在一些这样的实施方式中，PEG单元包含不超过总计约72个亚单元、优选不超过总计约36个亚单元。
在另一组实施方式中，PEG单元包含总计4至72、4至60、4至48、4至36或4至24个亚单元，5至72、5至60、5至48、5至36或5至24个亚单元，6至72、6至60、6至48、6至36或6至24个亚单元，7至72、7至60、7至48、7至36或7至24个亚单元，8至72、8至60、8至48、8至36或8至24个亚单元，9至72、9至60、9至48、9至36或9至24个亚单元，10至72、10至60、10至48、10至36或10至24个亚单元，11至72、11至60、11至48、11至36或11至24个亚单元，12至72、12至60、12至48、12至36或12至24个亚单元，13至72、13至60、13至48、13至36或13至24个亚单元，14至72、14至60、14至48、14至36或14至24个亚单元，15至72、15至60、15至48、15至36或15至24个亚单元，16至72、16至60、16至48、16至36或16至24个亚单元，17至72、17至60、17至48、17至36或17至24个亚单元，18至72、18至60、18至48、18至36或18至24个亚单元，19至72、19至60、19至48、19至36或19至24个亚单元，20至72、20至60、20至48、20至36或20至24个亚单元，21至72、21至60、21至48、21至36或21至24个亚单元，22至72、22至60、22至48、22至36或22至24个亚单元，23至72、23至60、23至48、23至36或23至24个亚单元，或者24至72、24至60、24至48、24至36或24个亚单元。
在一些实施方式中，分配剂S*为线形PEG单元，其包含2至20、或2至12、或4至12、或4、8或12个-CH2CH2O-亚单元。在一些实施方式中，线形PEG单元在PEG单元的一端处与RL单元相连并在PEG单元的另一端处与延伸子/接头单元(Z-A-)相连。在一些实施方式中，PEG单元经由与RL单元形成酰胺键的-CH2CH2C(O)-基团与RL单元相连(例如，-(CH2CH2O)n-CH2CH2C(O)-RL)并经由与Z-A-部形成酰胺键的-NH-基团(例如，Z-A-NH-(CH2CH2O)n-)与延伸子单元/接头单元(Z-A-)相连。
与RL和延伸子/接头单元(Z-A-)相连的PEG单元的示意性实施方式为如下所示：
Figure BDA0002712615540000731
并且在特别的实施方式中，PEG单元为：
Figure BDA0002712615540000732
其中左侧的波浪线表示与Z-A-的附连位点，右侧的波浪线表示与RL的附连位点，并且每个b独立地选自2至72、4至72、6至72、8至72、10至72、12至72、2至24、4至24、6至24、或8至24、2至12、4至12、6至12和8至12。在一些实施方式中，下标b为2、4、8、12或24。在一些实施方式中，下标b为2。在一些实施方式中，下标b为4。在一些实施方式中，下标b为8。在一些实施方式中，下标b为12。
在一些实施方式中，线形PEG单元在一端处与并行接头单元相连并在另一端处包含端帽。在一些实施方式中，PEG单元经由与并行接头单元赖氨酸残基氨基基团形成酰胺键的羰基与并行接头单元相连(例如，-(OCH2CH2)n-C(O)-LP-)并包含选自C1-4烷基和C1-4烷基-CO2H的PEG单元端帽基团。在一些实施方式中，分配剂S*为包含4、8或12个-CH2CH2O-亚单元和末端甲基端帽的线形PEG单元。
可在本文提供的任何实施方式中使用的示意性线形PEG单元为如下：
Figure BDA0002712615540000741
并且在特别的实施方式中，PEG单元为：
Figure BDA0002712615540000742
其中波浪线表示与并行接头单元(LP)的附连位点，并且每个n独立地选自4至72、6至72、8至72、10至72、12至72、6至24、或8至24。在一些实施方式中，下标b为约4、约8、约12或约24。
如本文所用，术语“PEG2”、“PEG4”、“PEG8”和“PEG12”是指包含所述PEG亚单元数目(即，下标“b”的数目)的特定PEG单元实施方式。例如，“PEG2”是指包含2个PEG亚单元的PEG单元实施方式，“PEG4”是指包含4个PEG亚单元的PEG单元实施方式，“PEG8”是指包含8个PEG亚单元的PEG单元实施方式，“PEG12”是指包含12个PEG亚单元的PEG单元实施方式。喜树碱-连接子化合物
如本文所述，选择PEG亚单元的数目使得其改善所得喜树碱缀合物的清除率但不显著影响缀合物穿透到肿瘤中的能力。在实施方式中，要选择使用的PEG亚单元的数目优选具有2个亚单元至约24个亚单元、4个亚单元至约24个亚单元、更优选约4个亚单元至约12个亚单元。
在本公开的优选实施方式中，PEG单元为约300道尔顿至约5千道尔顿；约300道尔顿至约4千道尔顿；约300道尔顿至约3千道尔顿；约300道尔顿至约2千道尔顿；或约300道尔顿至约1千道尔顿。在一些这样的方面，PEG单元具有至少6个亚单元或者至少8、10或12个亚单元。在一些这样的方面，PEG单元具有至少6个亚单元或者至少8、10或12个亚单元但不超过72个亚单元、优选不超过36个亚单元。
应理解，当提及PEG亚单元时，并取决于上下文，亚单元的数目可能代表平均数目，例如当提及喜树碱缀合物或喜树碱-连接子化合物的群体和使用多分散PEG时。
并行接头单元(LP)：
在一些实施方式中，喜树碱缀合物和喜树碱连接子化合物包含并行接头单元以提供与分配剂的附连点(在连接子单元中以-LP(S*)-示出)。作为一般性的实施方式，PEG单元可附连到并行接头单元如赖氨酸，如下所示，其中波浪线和星号表示喜树碱缀合物或喜树碱连接子化合物的连接子单元内的共价键合：
Figure BDA0002712615540000751
在一些实施方式中，并行接头单元(LP)和分配剂(S*)(一起，-LP(S*)-)具有以下结构：
Figure BDA0002712615540000752
其中n在8至24的范围内；RPEG为PEG单元封端基团，优选–CH3或–CH2CH2CO2H，星号(*)表示与对应于式Za、Za'、Zb'或Zc'的接头单元A的共价附连，波浪线表示与可释放连接子(RL)的共价附连。在一些实施方式中，该结构附连到式Za或Za’中的接头单元A。在一些实施方式中，n为2、4、8或12。在如这里示出的那些的情况下，所示的PEG基团是各种分配剂的示例，包括不同长度的PEG基团和可直接附连或经修饰以附连到并行接头单元的其他分配剂。
间隔子(Y)：
在一些实施方式中，本文提供的喜树碱缀合物在可释放连接子(RL)与喜树碱之间具有间隔子(Y)。间隔子可以是将促进RL与喜树碱的附连的官能团，或者其可提供附加的结构组分以进一步促进喜树碱从缀合物的其余部分的释放(例如，自消解对氨基苄基(PAB)组分)。
其他的间隔子单元由下式表示：
Figure BDA0002712615540000761
其中在每种情况下EWG均表示吸电子基团。在一些实施方式中，EWG选自-CN、-NO2、-CX3、-X、C(＝O)OR’、-C(＝O)N(R’)2、-C(＝O)R’、-C(＝O)X、-S(＝O)2R、-S(＝O)2OR、-S(＝O)2NHR、-S(＝O)2N(R)2、-P(＝O)(OR’)2、-P(＝O)(CH3)NHR’、-NO、-N(R’)3 +，其中X为-F、-Br、-Cl或-I，R’独立地选自氢和C1-6烷基。
还在其他的实施方式中，间隔子单元由下式表示：
Figure BDA0002712615540000762
还在其他的实施方式中，间隔子单元由下式表示：
Figure BDA0002712615540000763
下标‘”p”
在本发明的一个方面，下标p表示一个单独的喜树碱缀合物的配体单元上的药物连接子部分的数目并且是优选在1至16、1至12、1至10或1至8的范围内的整数。单独的喜树碱缀合物也可称为喜树碱缀合物化合物。在任何本文的实施方式中，可以有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个缀合到一个单独的喜树碱缀合物的配体单元的药物连接子部分。在本发明的另一个方面，一组实施方式描述了除与每个配体单元键合的喜树碱连接子化合物部分的数目外基本上相同的一个单独的喜树碱缀合物的群体(即，喜树碱缀合物组合物)，使得p表示与喜树碱缀合物组合物的配体单元键合的喜树碱连接子化合物部分的平均数目。在该组实施方式中，p为在1至约16、1至约12、1至约10、或1至约8、2至约16、2至约12、2至约10、或2至约8的范围内的数。在一些方面，p为约2。在一些方面，p为约4。在一些方面，p为约8。在一些方面，p为约16。在一些方面，p为2。在一些方面，p为4。在一些方面，p为8。在一些方面，p为16。在一些方面，p值是指平均药物载量以及组合物中占主导地位的ADC的药物载量。
在一些方面，缀合将经由链间二硫化物进行并且将有1至约8个喜树碱连接子化合物(Q-D)分子与配体分子缀合。在一些方面，缀合将经由引入的半胱氨酸残基以及链间二硫化物进行并且将有1至10或1至12或1至14或1至16个喜树碱连接子化合物分子与配体分子缀合。在一些方面，缀合将经由引入的半胱氨酸残基进行并且将有2或4个喜树碱连接子化合物分子与配体分子缀合。
部分释放的游离药物
在一些实施方式中提供了化合物，其中缀合物中的RL单元已被裂解，从而留下具有一个与之键合的氨基酸残基的药物部分。在一些实施方式中，部分释放的游离药物(药物-氨基酸缀合物)为式(IV)的化合物：
Figure BDA0002712615540000771
或其立体异构体或立体异构体的混合物，或其药学上可接受的盐，其中Rx为如本文所述的氨基酸侧链。在一些实施方式中，Rx为H、甲基、异丙基、苄基或–(CH2)4-NH2。在一些实施方式中，Rx为H或甲基。在一些实施方式中，Rx为H。在一些实施方式中，Rx为甲基。
在一些实施方式中，式(IV)的化合物为生物活性化合物。在一些实施方式中，这样的化合物可用在抑制拓扑异构酶、杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞、癌细胞或肿瘤的生长、抑制肿瘤细胞或癌细胞的复制、减轻总体肿瘤负荷或减少癌细胞的数量、或改善伴随癌症或自身免疫疾病的一种或多种症状的方法中。这样的方法包括例如使癌细胞与式(IV)的化合物接触。
喜树碱缀合物混合物和组合物
本发明提供了喜树碱缀合物混合物和包含任何本文所述的喜树碱缀合物的药物组合物。混合物和药物组合物包含多个缀合物。在一些方面，混合物或组合物中的每个缀合物是相同或基本上相同的，然而，混合物或组合物中配体上药物-连接子的分布可变化，并且药物载量也可变化。例如，用来缀合药物-连接子与作为靶向配体的抗体的缀合技术可产生就混合物和/或组合物内抗体(配体单元)上喜树碱连接子化合物的分布而言不均匀的组合物或混合物。在一些方面，在这样的分子的混合物或组合物中，每个抗体分子上喜树碱连接子化合物的载量为1至14的范围内的整数。
在这些方面，当以整体提及组合物时，药物-连接子的载量为1至约14的范围内的数。在组合物或混合物内，也可能存在小百分数的未缀合抗体。混合物或组合物中每个配体单元的平均药物-连接子数目(即，平均药物载量)是一种重要的属性，因为它决定着可递送至靶细胞的最大药物量。平均药物载量可以是1、2或约2、3或约3、4或约4、5或约5、6或约6、7或约7、8或约8、9或约9、10或约10、11或约11、12或约12、13或约13、14或约14、15或约15、16或约16。
在一些方面，混合物和药物组合物包含多个(即，一群)缀合物，然而，就混合物和/或组合物内配体分子上药物-连接子的分布而言和就混合物和/或组合物内配体分子上药物-连接子的载量而言，这些缀合物是相同或基本上相同的并且是基本上均匀的。在一些这样的方面，抗体配体单元上药物-连接子的载量为2或4。在组合物或混合物内，也可能存在小百分数的未缀合抗体。在这样的实施方式中，平均药物载量为约2或约4。通常，这样的组合物和混合物因位点特异性缀合技术的使用而产生，并且缀合归因于引入的半胱氨酸残基。
来自缀合反应的制剂中每个配体单元的平均喜树碱或喜树碱-连接子化合物数目可通过常规措施如质谱法、ELISA测定法、HPLC(例如，HIC)来表征。还可确定喜树碱缀合物就p而言的定量分布。在一些情况下，均匀的喜树碱缀合物的分离、纯化和表征可通过措施如反相HPLC或电泳实现。
在一些方面，组合物为包含本文所述的喜树碱缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些方面，药物组合物呈液体形式。在一些方面，药物组合物为固体。在一些方面，药物组合物为冻干粉。
组合物，包括药物组合物，可以纯化的形式提供。如本文所用，“纯化的”指的是当分离时，分离物含分离物的重量的至少95％、在另一个方面至少98％的缀合物。
使用方法
癌症的治疗
本文所述的喜树碱缀合物可用于抑制肿瘤细胞或癌细胞的增殖，引起肿瘤或癌细胞的凋亡，或用于在患者中治疗癌症。相应地，本文提供了在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用一种或多种本文所述的喜树碱缀合物。
喜树碱缀合物可相应地用于多种环境中以治疗癌症。喜树碱缀合物可用来向肿瘤细胞或癌细胞递送药物。不受理论的束缚，在一个实施方式中，喜树碱缀合物的配体单元将与癌细胞或肿瘤细胞相关抗原结合或缔合，并且喜树碱缀合物可在肿瘤细胞或癌细胞内通过受体介导的内吞作用或其他内在化机制被吸收(内在化)。抗原可附连到肿瘤细胞或癌细胞，或者可以是与肿瘤细胞或癌细胞相关的细胞外基质蛋白。一旦进入细胞中，药物就会在细胞内经由肽裂解而释放。在一个替代的实施方式中，游离药物在肿瘤细胞或癌细胞外从喜树碱缀合物释放，并且游离药物随后穿透细胞。
在一个实施方式中，配体单元与肿瘤细胞或癌细胞结合。
在另一个实施方式中，配体单元与肿瘤细胞或癌细胞的表面上的肿瘤细胞或癌细胞抗原结合。
在另一个实施方式中，配体单元与肿瘤细胞或癌细胞抗原结合，所述肿瘤细胞或癌细胞抗原是与肿瘤细胞或癌细胞相关的细胞外基质蛋白。
配体单元对特定肿瘤细胞或癌细胞的特异性对于确定被最有效地治疗的肿瘤或癌症可能很重要。例如，靶向存在于造血系统癌症中的癌细胞抗原的喜树碱缀合物可用于治疗血液系统恶性肿瘤(例如，抗CD30、抗CD70、抗CD19、抗CD33结合配体单元(例如，抗体)可用于治疗血液系统恶性肿瘤)。靶向存在于实体瘤上的癌细胞抗原的喜树碱缀合物可用于治疗这样的实体瘤。
可用喜树碱缀合物治疗的癌症包括但不限于造血系统癌症，如例如淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)以及白血病和实体瘤。造血系统癌症的实例包括滤泡性淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。实体瘤的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、咽喉癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆斯氏瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、小细胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、皮肤癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
在优选的实施方式中，所治疗的癌症为上述淋巴瘤和白血病中的任一种。
癌症的多模式疗法
可通过施用喜树碱缀合物来治疗或抑制癌症，包括但不限于以细胞生长不受控制为特征的肿瘤、转移瘤或其他疾病或病症。
在其他实施方式中，提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的喜树碱缀合物和化学治疗剂。在一个实施方式中，所述化学治疗剂为用其治疗癌症尚未发现难治的化学治疗剂。在另一个实施方式中，所述化学治疗剂为用其治疗癌症已发现难治的化学治疗剂。喜树碱缀合物可施用于已也接受过手术作为癌症治疗的患者。
在一些实施方式中，患者还接受另外的治疗，如放射疗法。在一个具体的实施方式中，喜树碱缀合物与化学治疗剂或与放射疗法同时施用。在另一个具体的实施方式中，在施用喜树碱缀合物之前或之后施用化学治疗剂或放射疗法。
可在一系列疗程中施用化学治疗剂。可施用任何一种化学治疗剂或化学治疗剂的组合，如护理标准化学治疗剂。
另外，提供了用喜树碱缀合物治疗癌症的方法作为化学疗法或放射疗法的替代品，其中化学疗法或放射疗法已证明或可能证明对于被治疗的受试者毒性太大，例如，导致不可接受或无法忍受的副作用。被治疗的患者可任选地用另一种癌症治疗方法如手术、放射疗法或化学疗法治疗，具体取决于发现哪种治疗可接受或可忍受。
自身免疫疾病的治疗
喜树碱缀合物可用于杀伤或抑制产生自身免疫疾病的细胞的不希望的复制或用于治疗自身免疫疾病。
喜树碱缀合物可相应地用于多种环境中以在患者中治疗自身免疫疾病。喜树碱缀合物可用来向靶细胞递送药物。不受理论的束缚，在一个实施方式中，喜树碱缀合物将与促炎性或被不适当地刺激的免疫细胞的表面上的抗原缔合，然后喜树碱缀合物将通过受体介导的内吞作用被吸收在靶细胞中。一旦进入细胞中，连接子单元将被裂解，从而导致喜树碱的释放。释放的喜树碱然后可自由地在细胞溶质中迁移并诱导细胞毒性或细胞抑制活性。在一个替代的实施方式中，药物在靶细胞外从喜树碱缀合物裂解，随后喜树碱穿透细胞。
在一个实施方式中，配体单元与自身免疫抗原结合。在一个方面，抗原在自身免疫病中涉及的细胞的表面上。
在一个实施方式中，配体单元与自身免疫疾病状态相关的活化淋巴细胞结合。
在又一个实施方式中，喜树碱缀合物杀伤或抑制产生与特定自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞的增殖。
可用喜树碱缀合物治疗的自身免疫疾病的特定类型包括但不限于Th2淋巴细胞相关病症(例如，特应性皮炎、特应性哮喘、鼻结膜炎、过敏性鼻炎、Omenn综合征、全身性硬化症和移植物抗宿主病)；Th1淋巴细胞相关病症(例如，类风湿性关节炎、多发性硬化症、牛皮癣、干燥综合征、桥本甲状腺炎、Grave病、原发性胆汁性肝硬化、韦格纳氏肉芽肿和结核病)；和活化的B淋巴细胞相关病症(例如，系统性红斑狼疮、肺出血-肾炎综合征、类风湿性关节炎和I型糖尿病)。
自身免疫疾病的多药物疗法
还公开了用于治疗自身免疫疾病的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的喜树碱缀合物和已知用于治疗自身免疫疾病的另一种治疗剂。
组合物和施用方法
本发明提供了包含本文所述的喜树碱缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。喜树碱缀合物可呈允许将化合物施用给患者以治疗与配体单元结合的抗原的表达相关的病症的任何形式。例如，缀合物可呈液体或固体的形式。优选的施用途径是肠胃外。肠胃外施用包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输注技术。在一个方面，组合物肠胃外施用。在一个方面，缀合物静脉内施用。可通过任何方便的途径进行施用，例如通过输注或推注。
可配制药物组合物以使得在向患者施用组合物后化合物是可生物利用的。组合物可呈一个或多个剂量单位的形式。
在药物组合物的制备中使用的材料在使用的量上可以是无毒的。对于本领域普通技术人员显而易见的是，药物组合物中一种或多种活性成分的最佳剂量将取决于多种因素。相关因素包括但不限于动物的类型(例如，人)、化合物的特定形式、施用的方式和所采用的组合物。
组合物可例如呈液体形式。液体可用于通过注射递送。在用于通过注射施用的组合物中，还可包含表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
液体组合物，无论它们是溶液、悬浮液还是其他类似形式，也可包含以下中的一种或多种：无菌稀释剂(如注射用水)、盐水溶液(优选生理盐水)、林格氏溶液、等渗氯化钠、可充当溶剂或悬浮介质的不挥发性油如合成的甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、环糊精、丙二醇或其他溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如氨基酸、乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；洗涤剂，如非离子表面活性剂、多元醇；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。肠胃外组合物可封装在由玻璃、塑料或其他材料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是示例性的佐剂。可注射组合物优选是无菌的。
在特定病症或病的治疗中有效的缀合物的量将取决于病症或病的性质，并可通过标准临床技术来确定。另外，可任选地采用体外或体内测定法来帮助鉴定最佳剂量范围。组合物中待采用的精确剂量还取决于施用途径以及疾病或病症的严重性，并应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。
组合物包含有效量的化合物，以便获得合适的剂量。通常，该量为组合物的至少约0.01重量％的化合物。
对于静脉内施用，组合物可包含约0.01至约100mg喜树碱缀合物每kg动物体重。在一个方面，组合物可包含约1至约100mg喜树碱缀合物每kg动物体重。在另一个方面，所施用的量将在约0.1至约25mg化合物/kg体重的范围内。取决于所使用的药物，剂量可甚至更低，例如1.0μg/kg至5.0mg/kg、4.0mg/kg、3.0mg/kg、2.0mg/kg或1.0mg/kg、或1.0μg/kg至500.0μg/kg受试者体重。
通常，施用给患者的缀合物的剂量通常为约0.01mg/kg至约100mg/kg受试者体重或者1.0μg/kg至5.0mg/kg受试者体重。在一些实施方式中，施用给患者的剂量在约0.01mg/kg至约15mg/kg受试者体重之间。在一些实施方式中，施用给患者的剂量在约0.1mg/kg至约15mg/kg受试者体重之间。在一些实施方式中，施用给患者的剂量在约0.1mg/kg至约20mg/kg受试者体重之间。在一些实施方式中，施用的剂量在约0.1mg/kg至约5mg/kg或约0.1mg/kg至约10mg/kg受试者体重之间。在一些实施方式中，施用的剂量在约1mg/kg至约15mg/kg受试者体重之间。在一些实施方式中，施用的剂量在约1mg/kg至约10mg/kg受试者体重之间。在一些实施方式中，在一个治疗周期内，施用的剂量在约0.1至4mg/kg、甚至更优选0.1至3.2mg/kg、或甚至更优选0.1至2.7mg/kg受试者体重之间。
术语“载体”是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂或赋形剂。这样的药物载体可以是液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油。载体可以是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体氧化硅、尿素。另外，可使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方式中，当向患者施用时，化合物或组合物和药学上可接受的载体是无菌的。
当化合物静脉内施用时，水是示例性的载体。盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可用作液体载体，特别是对于可注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇。如果需要，本发明的组合物还可含少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。
在一个实施方式中，根据常规程序将缀合物配制成适于静脉内施用给动物、特别是人类的药物组合物。通常，用于静脉内施用的载体或媒介物为无菌的等渗水性缓冲溶液。必要时，组合物还可包含增溶剂。用于静脉内施用的组合物可任选地包含局部麻醉剂如利多卡因以减轻注射部位的疼痛。通常，将成分分开或以单位剂型混合在一起提供，例如，作为干燥的冻干粉或无水浓缩物在指示活性剂的量的密闭容器如安瓿瓶或小药囊中提供。当通过输注施用缀合物时，其可例如用装有无菌药物级水或盐水的输注瓶分配。当通过注射施用缀合物时，可提供一安瓿瓶的无菌注射用水或盐水以便可在施用之前将成分混合。
药物组合物通常被配制为无菌的、基本上等渗的并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。
制备喜树碱缀合物的方法
本文所述的喜树碱缀合物可以抗体、连接子和药物单元的串联构造制备，也可通过组装各部分、然后完成组装步骤以收敛的方式制备。
在一组实施方式中，将如本文所提供的喜树碱-连接子化合物与合适的配体单元合并以便于喜树碱-连接子化合物与配体单元的共价附连。在一些实施方式中，配体单元为具有至少2个、至少4个、至少6个或8个硫醇的抗体，作为还原链间二硫键的结果，所述硫醇可用于连接子化合物的附连。在一些实施方式中，喜树碱-连接子化合物通过抗体上引入的半胱氨酸部分与配体单元附连。
用于治疗用途的试剂盒
在一些方面，提供了用于癌症治疗和自身免疫疾病治疗的试剂盒。这样的试剂盒可包括药物组合物，其包含本文所述的喜树碱缀合物。
在一些实施方式中，试剂盒可包括用于任何本文所述的治疗方法中的说明书。所包括的说明书可提供向受试者施用药物组合物以在受试者中实现预期的活性例如治疗疾病或病如癌症的描述。在一些实施方式中，与本文描述的药物组合物的使用有关的说明书可包括关于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、大包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量的。在本公开的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页上的书面说明书。标签或包装插页指明药物组合物用于在受试者中治疗疾病或病症、延缓疾病或病症的发作和/或缓解疾病或病症。
在一些实施方式中，本文提供的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装等。还涵盖与特定装置如吸入器、鼻腔施用装置或输注装置结合使用的包装。在一些实施方式中，试剂盒可具有无菌输液港(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。
在一些实施方式中，本文提供的试剂盒包括可用于治疗如本文所述的癌症或自身免疫疾病的另外的治疗剂。
示例性实施方式
实施方式1：一种喜树碱缀合物，其具有式：
L-(Q-D)p
或其药学上可接受的盐，其中
L为配体单元；
Q为具有选自以下的式的连接子单元：
-Z-A-S*-RL-；-Z-A-LP(S*)-RL-；-Z-A-S*-RL-Y-；和-Z-A-LP(S*)-RL-Y-；
其中Z为延伸子单元，A为键或接头单元；LP为并行接头单元；S*为分配剂；RL为包含2至8个氨基酸的肽；且Y为间隔子单元；
D为选自以下的药物单元：
Figure BDA0002712615540000871
其中
RB为选自H、C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、苯基和苯基C1-C4烷基的成员；
RC为选自C1-C6烷基和C3-C6环烷基的成员；
RF和RF’各自为独立选自H、C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-、C1-C8氨基烷基C(O)-、C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环基烷基、C3-C10杂环基烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基的成员；或者RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元环，所述取代基选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2；
并且其中RB、RC、RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代；
下标p为1至16的整数；并且
其中Q通过CPT1、CPT2、CPT3、CPT4或CPT5上存在的羟基和胺基团中的任一个附连。
实施方式2：实施方式1的喜树碱缀合物，其中D具有式CPT5。实施方式3：实施方式1的喜树碱缀合物，其中D具有式CPT2。实施方式4：实施方式1的喜树碱缀合物，其中D具有式CPT3。实施方式5：实施方式1的喜树碱缀合物，其中D具有式CPT4。实施方式6：实施方式1的喜树碱缀合物，其中D具有式CPT1。实施方式7：实施方式1的喜树碱缀合物，其中L为抗体。实施方式8：实施方式1或3的喜树碱缀合物，其中RB为选自H、C1-C8烷基和C1-C8卤代烷基的成员。实施方式9：实施方式1或3的喜树碱缀合物，其中RB为选自C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、苯基和苯基C1-C4烷基的成员，并且其中RB的环烷基和苯基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代。实施方式10：实施方式1或4的喜树碱缀合物，其中RC为C1-C6烷基。实施方式11：实施方式1或4的喜树碱缀合物，其中RC为C3-C6环烷基。实施方式12：实施方式1或2的喜树碱缀合物，其中RF和RF’均为H。实施方式13：实施方式1或2的喜树碱缀合物，其中RF和RF’中的至少一个为独立选自C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-和C1-C8氨基烷基C(O)-的成员。实施方式14：实施方式1或2的喜树碱缀合物，其中RF和RF’各自为独立地选自C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-和C1-C8氨基烷基C(O)-的成员。实施方式15：实施方式1或2的喜树碱缀合物，其中RF和RF’中的至少一个为独立地选自C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环基烷基、C3-C10杂环基烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基的成员，并且其中RF和RF’的环烷基、杂环基烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代。实施方式16：实施方式1或2的喜树碱缀合物，其中RF和RF’各自为独立地选自C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环基烷基、C3-C10杂环基烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基的成员，并且其中RF和RF’的环烷基、杂环基烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代。实施方式17：实施方式1或2的喜树碱缀合物，其中RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元环，所述取代基选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2。实施方式18：实施方式1的喜树碱缀合物，其中Q为具有选自以下的式的连接子单元：
-Z-A-S*-RL-；和-Z-A-S*-RL-Y-；
其中Z为延伸子单元，A为键或接头单元；S*为分配剂；Y为间隔子单元。实施方式19：实施方式18的喜树碱缀合物，其中Z-A-包含马来酰亚胺基-链烷酸组分或mPDR组分。实施方式20：实施方式18的喜树碱缀合物，其中RL为二肽。实施方式21：实施方式1的喜树碱缀合物，其中RL为三肽。实施方式22：实施方式18的喜树碱缀合物，其中RL为四肽。实施方式23：实施方式18的喜树碱缀合物，其中RL为五肽。实施方式24：实施方式18至23中任一项的喜树碱缀合物，其中RL包含选自以下的氨基酸：β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸。实施方式25：实施方式1的喜树碱缀合物，其中Y存在并包含：
Figure BDA0002712615540000901
其中EWG为吸电子基团。实施方式26：实施方式1的喜树碱缀合物，其中Y存在并包含：
Figure BDA0002712615540000902
实施方式27：实施方式1的喜树碱缀合物，其中Y存在并包含：
Figure BDA0002712615540000903
其中EWG为吸电子基团。实施方式28：实施方式25或27的喜树碱缀合物，其中EWG为选自-CN、-NO2、-CX3、-X、C(＝O)OR’、-C(＝O)N(R’)2、-C(＝O)R’、-C(＝O)X、-S(＝O)2R’、-S(＝O)2OR’、-S(＝O)2NHR’、-S(＝O)2N(R’)2、-P(＝O)(OR’)2、-P(＝O)(CH3)NHR’、-NO、-N(R’)3 +的成员，其中X为-F、-Br、-Cl或-I，R’独立地选自氢和C1-6烷基。实施方式29：实施方式1至27中任一项的喜树碱缀合物，其中RL为选自以下的肽：gly-gly、gly-gly-gly、gly-gly-gly-gly、val-gly-gly、val-cit-gly、val-gln-gly、val-glu-gly、phe-lys-gly、leu-lys-gly、gly-val-lys-gly、val-lys-gly-gly、val-lys-gly、val-lys-ala、val-lys-leu、leu-leu-gly、gly-gly-phe-gly、gly-gly-phe-gly-gly、val-gly和val-lys-β-ala。实施方式30：实施方式1至27中任一项的喜树碱缀合物，其中RL为选自以下的肽：gly-gly、gly-gly-gly、gly-gly-gly-gly、val-gly-gly、val-cit-gly、val-gln-gly、val-glu-gly、phe-lys-gly、leu-lys-gly、gly-val-lys-gly、val-lys-gly-gly、val-lys-gly、val-lys-ala、val-lys-leu、leu-leu-gly、gly-gly-phe-gly、gly-gly-phe-gly-gly、val-gly和val-lys-β-ala；Y为PEG单元；Z-X为马来酰亚胺基-链烷酸组分或mDPR组分。实施方式31：实施方式1至27中任一项的喜树碱缀合物，其中S*为PEG单元；Z-A-为马来酰亚胺基丙酰基组分或mDPR组分。实施方式32：实施方式31的喜树碱缀合物，其中Z-A-为马来酰亚胺基丙酰基组分。实施方式33：实施方式31的喜树碱缀合物，其中Q具有下式：
Figure BDA0002712615540000911
其中n为2至20的整数；RL为二肽、三肽、四肽或五肽；标有单个*的波浪线表示与D或与间隔子单元(Y)的附连位点；标有***的波浪线表示与L的硫原子的附连点。实施方式34：实施方式33的喜树碱缀合物，其中n为4至10的整数。实施方式35：实施方式1至34中任一项的喜树碱缀合物，其中L为抗体，其将与选自CD19、CD30、CD33、CD70和LIV-1的抗原特异性结合。实施方式36：实施方式1的喜树碱缀合物，其中所述缀合物具有式：
Figure BDA0002712615540000912
其中Ab为对选自CD19、CD30、CD33、CD70和LIV-1的抗原具有特异性的抗体，RL为选自以下的肽：gly-gly-gly-gly、val-lys-β-ala、val-gln-gly、val-lys-ala、phe-lys-gly、val-lys-gly-gly、gly-gly、val-lys-gly、val-gly-gly、leu-leu-gly、leu-lys-gly、val-glu-gly、gly-gly-gly、val-asp-gly、val-lys、val-gly和gly-val-lys-gly；p为1至16的整数。实施方式37：实施方式36的喜树碱缀合物，其中RL选自val-lys-β-ala、val-gln-gly、val-lys-ala、phe-lys-gly、val-lys-gly、val-gly-gly、leu-leu-gly、leu-lys-gly、val-glu-gly、gly-gly-gly和val-asp-gly。实施方式38：实施方式36的喜树碱缀合物，其中RL选自val-lys-β-ala、val-gln-gly、val-lys-ala、phe-lys-gly、val-lys-gly、val-gly-gly、leu-lys-gly、val-glu-gly和val-asp-gly。实施方式39：实施方式36的喜树碱缀合物，其中RL为val-lys-gly。
实施方式40：一种喜树碱-连接子化合物，其具有选自以下的式：
Z’-A—S*-RL-D；
Z’-A-LP(S*)-RL-D；
Z’-A-S*-RL-Y-D；和
Z’-A-LP(S*)-RL-Y-D；
其中Z’为延伸子单元；A为键或接头单元；LP为并行接头单元；S*为分配剂；RL为包含2至8个氨基酸的肽；Y为间隔子单元；且D为选自以下的药物单元：
Figure BDA0002712615540000921
其中
RB为选自H、C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、苯基和苯基C1-C4烷基的成员；
RC为选自C1-C6烷基和C3-C6环烷基的成员；
RF和RF’各自为独立地选自H、C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-、C1-C8氨基烷基C(O)-、C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环基烷基、C3-C10杂环基烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基的成员；或者RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元环，所述取代基选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2；
并且其中RB、RC、RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代；
下标p为1至16的整数；并且
其中Q通过CPT1、CPT2、CPT3、CPT4或CPT5上存在的羟基和胺基团中的任一个附连。
实施方式41：实施方式40的喜树碱-连接子化合物，其具有式(i)或(iii)。实施方式42：实施方式40的喜树碱-连接子化合物，其具有式(ii)或(iv)。实施方式43：实施方式40的喜树碱-连接子化合物，其具有式(i)。实施方式44：实施方式40的喜树碱-连接子化合物，其具有式(iii)。实施方式45：实施方式40至44中任一项的喜树碱-连接子化合物，其中D为CPT5。实施方式46：实施方式40至44中任一项的喜树碱-连接子化合物，其中RB为选自H、C1-C8烷基和C1-C8卤代烷基的成员。实施方式47：实施方式40至44中任一项的喜树碱-连接子化合物，其中RB为选自C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、苯基和苯基C1-C4烷基的成员，并且其中RB的环烷基和苯基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基所取代。实施方式48：实施方式40至44中任一项的喜树碱-连接子化合物，其中RC为C1-C6烷基。实施方式49：实施方式40至44中任一项的喜树碱-连接子化合物，其中RC为C3-C6环烷基。实施方式50：实施方式40至44中任一项的喜树碱-连接子化合物，其中RF和RF’均为H。实施方式51：实施方式40至44中任一项的喜树碱-连接子化合物，其中RF和RF’中的至少一个为独立地选自C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-和C1-C8氨基烷基C(O)-的成员。实施方式52：实施方式40至44中任一项的喜树碱-连接子化合物，其中RF和RF’各自为独立地选自H、C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-和C1-C8氨基烷基C(O)-的成员。实施方式53：实施方式40至44中任一项的喜树碱-连接子化合物，其中RF和RF’中的至少一个为独立地选自C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环基烷基、C3-C10杂环基烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基的成员，并且其中RF和RF’的环烷基、杂环基烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基所取代。实施方式54：实施方式40至44中任一项的喜树碱-连接子化合物，其中RF和RF’各自为独立地选自H、C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环基烷基、C3-C10杂环基烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基的成员，并且其中RF和RF’的环烷基、杂环基烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代。实施方式55：实施方式40至44中任一项的喜树碱-连接子化合物，其中RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元环，所述取代基选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2。实施方式56：实施方式40至55中任一项的喜树碱-连接子化合物，其中Z’-A–为马来酰亚胺基丙酰基、mDPR、马来酰亚胺基己酰基或马来酰亚胺基丙酰基-β-丙氨酰基。实施方式57：实施方式56的喜树碱-连接子化合物，其中Z’-A-为马来酰亚胺基丙酰基。实施方式58：实施方式56的喜树碱-连接子化合物，其中Z’-A–为mDPR。实施方式59：实施方式40的喜树碱-连接子化合物，其中S*为PEG基团。实施方式60：实施方式40的喜树碱-连接子化合物，其中RL包含选自以下的肽：gly-gly、gly-gly-gly、gly-gly-gly-gly、val-gly-gly、val-cit-gly、val-gln-gly、val-glu-gly、phe-lys-gly、leu-lys-gly、gly-val-lys-gly、val-lys-gly-gly、val-lys-gly、val-lys-ala、val-lys-leu、leu-leu-gly、gly-gly-phe-gly、gly-gly-phe-gly-gly、val-gly和val-lys-β-ala。实施方式62：实施方式40的喜树碱-连接子化合物，其中RL包含选自以下的肽：gly-gly、gly-gly-gly、gly-gly-gly-gly、val-gly-gly、val-cit-gly、val-gln-gly、val-glu-gly、phe-lys-gly、leu-lys-gly、gly-val-lys-gly、val-lys-gly-gly、val-lys-gly、val-lys-ala、val-lys-leu、leu-leu-gly、gly-gly-phe-gly、gly-gly-phe-gly-gly、val-gly和val-lys-β-ala；Z’-A–为马来酰亚胺基丙酰基、mDPR或马来酰亚胺基丙酰基-β-丙氨酰基；S*为PEG基团。实施方式62：实施方式40的喜树碱-连接子化合物，其选自：
Figure BDA0002712615540000951
其中RL为选自以下的肽：gly-gly-gly-gly、val-lys-β-ala、val-gln-gly、val-lys-ala、phe-lys-gly、val-lys-gly-gly、gly-gly、val-lys-gly、val-gly-gly、leu-leu-gly、leu-lys-gly、val-glu-gly、gly-gly-gly、val-asp-gly、val-lys、val-gly和gly-val-lys-gly。实施方式63：实施方式62的喜树碱-连接子化合物，其中RL选自val-lys-β-ala、val-gln-gly、val-lys-ala、phe-lys-gly、val-lys-gly、val-gly-gly、leu-leu-gly、leu-lys-gly、val-glu-gly、gly-gly-gly和val-asp-gly。实施方式64：实施方式62的喜树碱-连接子化合物，其中RL选自val-lys-β-ala、val-gln-gly、val-lys-ala、phe-lys-gly、val-lys-gly、val-gly-gly、leu-lys-gly、val-glu-gly和val-asp-gly。实施方式65：实施方式62的喜树碱-连接子化合物，其中RL为val-lys-gly。
实施方式66：一种喜树碱化合物，其具有式：
Figure BDA0002712615540000961
其中RF和RF’各自独立地为选自H、甘氨酰基、羟基乙酰基、乙基和2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基的成员，或其中RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成吗啉基。实施方式67：实施方式66的喜树碱化合物，其中RF为H而RF’为甘氨酰基、羟基乙酰基、乙基、2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基。实施方式68：实施方式66的喜树碱化合物，其中RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成吗啉基。
实施方式69：一种喜树碱化合物，其具有式：
Figure BDA0002712615540000962
其中RB为选自环丙基、戊基、己基、叔丁基和环戊基的成员。
实施方式70：一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用实施方式1至39中任一项的喜树碱缀合物。实施方式71：实施方式70的方法，其中所述癌症选自淋巴瘤、白血病和实体瘤。实施方式72：实施方式70的方法，其中所述癌症为淋巴瘤或白血病。实施方式73：实施方式70至73中任一项的方法，其还包含另外的治疗剂。实施方式74：实施方式73的方法，其中所述另外的治疗剂为一种或多种化学治疗剂或放射疗法。
实施方式75：一种在有此需要的受试者中治疗自身免疫疾病的方法，所述方法包括向受试者施用实施方式1至39中任一项的喜树碱缀合物。实施方式76：实施方式75的方法，其中所述自身免疫疾病选自Th2淋巴细胞相关病症、Th1淋巴细胞相关病症和活化的B淋巴细胞相关病症。
实施方式77：一种制备实施方式1至39中任一项的喜树碱缀合物的方法，所述方法包括使抗体与实施方式40至65中任一项的喜树碱-连接子化合物反应。
实施方式78：一种试剂盒，所述试剂盒包含实施方式1至39中任一项的喜树碱缀合物。实施方式79：实施方式77的试剂盒，所述试剂盒还包含另外的治疗剂。
实施例
实验程序
针对合成的缩写
Figure BDA0002712615540000971
Figure BDA0002712615540000981
材料和方法
除非另有说明，否则以下材料和方法适用于本节中描述的合成程序。所有市售无水溶剂均无需进一步纯化即可使用。起始材料、试剂和溶剂购自商业供应商(Sigma、Aldrich和Fischer)。采用Biotage Isolera One快速纯化系统(Charlotte,NC)通过快速柱色谱法纯化产物。在与配备有Waters Acuity UPLC BEH C18(2.1x 50mm,1.7μm)反相柱的Waters Acquity UPLC系统接口的Waters单四级杆质谱仪上进行UPLC-MS。洗脱液由具有0.1％甲酸的溶剂乙腈和0.1％的甲酸水溶液组成。通用方法是在1.7min内用3-60％的乙腈进行梯度洗脱，然后从60％至95％线性梯度洗脱至2.0min，随后用95％的乙腈等度洗脱至2.5min，然后从2.8至3.0min将色谱柱平衡至3％，流率为0.5mL/min。2＝0.4mL/min)，配备有Acquity UPLC BEH C18(2.1x 50mm,1.7μm)反相柱。制备HPLC在配置有Wasters 2998PDA检测器的Waters 2454二元梯度模块溶剂递送系统上进行。用Phenomenex Max-RP 4μmSynergi
Figure BDA0002712615540000983
250mm反相柱的适宜直径柱纯化产物，用0.05％的三氟乙酸/水和0.05％的三氟乙酸/乙腈洗脱。
喜树碱化合物制备
以下实施例中提供的喜树碱化合物可用于制备如本文所述的喜树碱-连接子化合物以及喜树碱缀合物。
实施例1
SN-38的TBS保护：
Figure BDA0002712615540000982
Figure BDA0002712615540000991
将购自MedChemExpress的7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN-38)(160.0mg,0.4077mmmol)悬浮在无水DCM(2mL)中。加入DIPEA(0.22mL,1.3mmol)，然后加入TBSCl(154mg,1.02mmol)。将反应搅拌30分钟直至SN-38变得可溶并通过UPLC-MS观察到完全转化。用MeOH淬灭反应，通过硅胶塞过滤，并真空浓缩。将所得无色油与Hex一起研磨。产物从溶液中沉淀出来。通过过滤收集沉淀物并用Hex冲洗，得到灰白色固体状的TBS-SN-38(1)(200mg,0.395mmol,97％)。Rt＝1.86min，疏水方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C28H35N2O5Si计算值507.23，实测值506.96。
实施例2
Figure BDA0002712615540000992
按Burke,P.J.,Jeffrey,S.C.等,Bioconjugate Chem.2009,20,1242–1250中描述的程序合成化合物2-a。将化合物2-a(50mg,0.108mmol)溶解在DCM(1mL)中。向反应中加入DMAP(13mg,0.11mmol)，然后加入Boc2O(24mg,0.11mmol)。将反应搅拌5分钟，这时观察到向所需产物的完全转化。将受保护的产物通过柱色谱法用10G Biotage Ultra、0-5％的MeOH/DCM纯化。真空浓缩含所需产物的级分，得到呈黄色固体的化合物2-b(49mg,0.087mmol,80％)。Rt＝2.24min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C30H34N3O8计算值564.23，实测值564.10。
将化合物2-b(49mg,0.087mmol)溶解在无水DCM(2mL)中。加入DMAP(37mg,0.304mmol)并将反应冷却至0℃。向反应中逐滴加入以10mg/mL溶解在DCM中的三光气(12mg,0.039mmol)，15分钟加完。将2uL等分试样在98uL MeOH稀释剂中淬灭并注入到UPLC-MS上。通过UPLC-MS观察到向MeOH加合物的完全转化。该反应混合物(化合物2)可直接用在与合适的连接子的偶联步骤中。Rt＝2.09min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C32H36N3O10计算值622.24，实测值622.02。
实施例3
Figure BDA0002712615540001001
将化合物3-a(150mg,0.334mmol)溶解在无水DCM(2mL)中。加入DMAP(143mg,1.17mmol)。逐滴加入溶解在无水DCM中的三光气(45mg,0.15mmol)(50mg/mL)，5分钟加完。反应于室温下搅拌30分钟。将反应混合物的2uL等分试样在98uL MeOH稀释剂中淬灭。观察到向MeOH碳酸酯的几乎完全转化，表明形成了氯甲酸酯。产物3可未经进一步纯化即用在与合适的连接子的偶联步骤中。Rt＝1.55min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C27H27N2O8计算值507.18，实测值507.06。
实施例4
7-甲基氨基衍生物-亚甲二氧基喜树碱(本文称为7-MAD-MDCPT或化合物4)的制备
Figure BDA0002712615540001011
将6-氨基-3,4-(亚甲二氧基)苯乙酮(5.00g,27.9mmol)溶解在DCM(100mL)中。将反应冷却至0℃并加入DIPEA(7.29mL,41.9mmol)，然后缓慢加入乙酰氯(2.49mL,34.9mL)。使反应加温至室温并搅拌30分钟。通过UPLC-MS观察到完全转化。用MeOH(5mL)淬灭反应，并真空浓缩反应，得到白色固体状的化合物4-a，其未经进一步纯化即用于下一步骤中。Rt＝1.37min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C11H12NO4计算值222.08，实测值222.11。
将来自前一步骤的化合物4-a(27.9mmol)溶解在AcOH(100mL)中。缓慢加入33重量/重量％的HBr/AcOH(9.78mL,55.8mmoL)。逐滴加入溴(1.44mL,27.9mmol)，15分钟加完。将反应搅拌30分钟，此时观察到向所需产物的转化。将反应倒到冰水上，通过过滤收集沉淀物，并用水洗涤。将滤液干燥，得到黄色粉末，其为所需产物化合物4-b与起始材料和二溴化产物杂质的混合物，其未经进一步纯化即用于下一步骤中(7.2g,24mmol,86％)。Rt＝1.58min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C11H11BrNO4计算值299.99，实测值299.90。
将化合物4-b(7.2g,24mmol)溶解在EtOH(100mL)中。加入浓HBr(5mL)并将反应加热至回流保持60分钟。观察到向脱保护产物的几乎完全转化。将反应真空浓缩，用DCM(200mL)和H2O(200mL)稀释。用DCM(3x 200mL)萃取水相，将收集的有机相用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。粗产物通过柱色谱法用0-10％的MeOH/DCM纯化。浓缩含所需产物及少量杂质的级分，得到黄色粉末状的化合物4-c(4.05g,15.7mmol,65％)。Rt＝1.57min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C9H9BrNO3计算值257.98，实测值257.71。
Figure BDA0002712615540001021
在烧瓶中加入化合物4-c(1.00g,3.87mmol)、p-TSA(667mg,3.87mmol)和4-乙基-4-羟基-7,8-二氢-1H-吡喃并[3,4-f]吲嗪-3,6,10(4H)-三酮(1.02g,3.87mmol,获自AvraLaboratories Pvt.Ltd.)。加入DCM(5mL)以使固体均匀，然后在氮气下蒸发。然后将纯净的固体在高真空(1毫巴)下加热至120℃保持60分钟。将反应冷却至室温，将粗产物用H2O沉淀，过滤并用H2O洗涤。沉淀物通过柱色谱法用0-10％的MeOH/DCM纯化。真空浓缩含所需产物的级分，得到棕色固体状的化合物4-d(989mg,2.04mmol,53％)。Rt＝1.57min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C9H9BrNO3计算值257.98，实测值257.71。Rt＝1.62min通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C22H17BrN2O6计算值485.03，实测值484.95。
将化合物4-d(188mg,0.387mmol)溶解在EtOH(5mL)中。加入六亚甲基四胺(163mg,1.16mmol)并将反应于回流下搅拌90分钟。冷却反应并加入浓HCl水溶液(0.1mL)。浓缩反应并通过制备-HPLC纯化。将含所需产物的级分冻干，得到白色固体状的化合物4(109mg,0.259mmol,67％)。
以下化合物可从7-MAD-MDCPT(化合物4)或从化合物4-d使用常规方法制备：
表I
Figure BDA0002712615540001022
Figure BDA0002712615540001031
Figure BDA0002712615540001041
实施例5
Figure BDA0002712615540001042
将底物(来自实施例4的4-d,10.0mg,20.6μmol)溶解在无水DMF(0.25mL)中。加入甲胺(2M在THF中,0.031mL,62μmol)。将反应搅拌30分钟，然后用AcOH(20μL)淬灭。反应通过制备型HPLC纯化。将含所需产物(5)的级分冻干，得到黄色固体(3.27mg,7.51μmol,36％)。Rt＝1.57min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C9H9BrNO3计算值257.98，实测值257.71。Rt＝0.93min通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C23H22N3O6计算值436.15，实测值435.78。
实施例5a–5aa按针对化合物5概述的通用程序进行。
表II
Figure BDA0002712615540001043
Figure BDA0002712615540001051
Figure BDA0002712615540001061
Figure BDA0002712615540001071
Figure BDA0002712615540001081
Figure BDA0002712615540001091
Figure BDA0002712615540001101
Figure BDA0002712615540001111
实施例6
Figure BDA0002712615540001112
将6-硝基-1,3-苯并二噁茂-5-甲腈(2.00g,10.4mmol)溶解在EtOH(50mL)中。将反应置于氮气氛下。向反应中加入Pd/C(2.22g,10重量/重量％,2.08mmol)。将反应置于氢气氛下。将反应搅拌2小时。通过硅藻土(Celite)床过滤反应，并用MeOH冲洗。真空浓缩洗脱物并通过快速色谱法用0-10％的DCM/MeOH纯化。浓缩含所需产物的级分，得到红色固体(1.46g,9.00mmol,87％)。Rt＝1.14min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C8H7N2O2计算值163.05，实测值162.37。
Figure BDA0002712615540001113
将6-氨基-1,3-苯并二噁茂-5-甲腈(50mg,0.31mmol)置于氮气氛下并溶解在无水THF(1mL)中。加入CuBr(1.5mg,0.010mmol)，然后加入1M在THF中的4-氟苯基溴化镁(1.23mL)。将反应加热至60℃保持30分钟，然后冷却至室温。向溶液中缓慢加入15％的H2SO4溶液，并搅拌30分钟。将反应倒入饱和NaHCO3(50mL)中，并用EtOAc(3x 50mL)萃取。将有机物用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。粗产物通过柱色谱法用10G Biotage Ultra、0-10％的EtOAc/Hex纯化。真空浓缩含所需产物的级分，得到红色固体(46.2mg,0.178mmol,58％)。Rt＝1.81min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C14H11FNO3计算值260.07，实测值259.46。
Figure BDA0002712615540001121
在闪烁小瓶中加入底物(46.2mg,0.178mmol)、p-TSA(30.7mg,0.178mmol)和4-乙基-4-羟基-7,8-二氢-1H-吡喃并[3,4-f]吲嗪-3,6,10(4H)-三酮(46.9mg,0.178mmol)。加入DCM(1mL)以使固体均匀。在氮气下浓缩溶剂。将纯净的固体在高真空(1毫巴)下加热至120℃保持60分钟。在DCM(50mL)中重构反应，用H2O洗涤，有机相用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物通过柱色谱法用10G Biotage Ultra、0-10％的MeOH/DCM纯化。真空浓缩含所需产物(6)的级分，得到红色固体(32.9mg,0.0676mmol,38％)。Rt＝1.81min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C27H20FN2O6计算值487.13，实测值487.19。
实施例6a-6o使用与上文针对化合物6所述相似的程序合成。
表III
Figure BDA0002712615540001122
Figure BDA0002712615540001131
Figure BDA0002712615540001141
Figure BDA0002712615540001151
Figure BDA0002712615540001161
实施例7
Figure BDA0002712615540001162
将7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN-38)(76.0mg,0.19mmol)溶解在二氯甲烷中，然后加入三乙胺(128μL,0.92mmol)和DMAP(2.60mg,0.02mmol)。在冰浴中将混合物冷却至0℃，然后逐滴加入乙酰氯(15.9μL,0.22mmol)。将反应混合物于室温下搅拌16小时。用二氯甲烷稀释反应，用饱和NH4Cl、水和盐水洗涤。然后将有机相经MgSO4干燥，过滤，浓缩并经由Biotage快速柱色谱法在硅胶上纯化(CH2Cl2/MeOH 0-15％)，产生乙酰化的SN-38(7)。MS(m/z)计算值435.15(M+H)+，实测值435.07。
实施例8
根据公开的程序和通用方法制备实施例8中的化合物。
表IV
Figure BDA0002712615540001163
Figure BDA0002712615540001171
喜树碱连接子制备
实施例1-1
MC-Gly-Gly-Phe-Gly-氨基甲氧基乙酰基-7-MAD-MDCPT的制备
Figure BDA0002712615540001181
MC-GGFG-半胺缩醛-乙醇酸合成
Figure BDA0002712615540001182
基于公开的程序(WO 2015/155998PCT/JP2015/002020)，将Fmoc-Gly-Gly-OH(4.70g,13.3mmol)部分溶解于THF(120mL)、甲苯(40mL)和吡啶(2mL)中。向溶液中加入四乙酸铅(7.35g,16.6mmol)。溶液变为橙色。将反应加热至回流。1小时后溶液变无色，具有白色沉淀物。将反应总共搅拌3小时，然后通过硅藻土床过滤，用EtOAc冲洗，并真空浓缩。粗残余物通过柱色谱法用100G KP-Sil、10-100％的EtOAc/Hex纯化。真空浓缩含所需产物的级分，得到无色固体(3.39g,9.19mmol,69％)。Rt＝1.85min，通用方法UPLC。由于半胺缩醛的片段化，故只能够观察到亚胺鎓，MS(m/z)[M+H]+C18H17N2O3计算值309.12，实测值309.13。
PPTS取代：
Figure BDA0002712615540001183
将底物(3.39g,9.19mmol)溶解在无水DCM(50mL)中。加入乙醇酸苄酯(13.05mL,91.94mmol)，然后加入PPTS(231mg,0.919mmol)，并将反应回流过夜。通过UPLC-MS观察到几乎完全的转化。用EtOAC(200mL)稀释反应混合物，用水(3x 200mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。粗残余物通过柱色谱法用10-100％的EtOAc/Hex纯化。浓缩含所需产物的级分，得到白色粉末(4.30g,9.06mmol,99％)。Rt＝2.18min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+Na]+C27H26N2NaO6计算值497.17，实测值497.06。
Fmoc脱保护：
Figure BDA0002712615540001191
将底物(1.00g,2.11mmol)溶解在20％的哌啶/DMF中并搅拌20分钟。真空浓缩反应并未经进一步纯化即用在下一步骤中。
Fmoc-Phe-Osu偶联：
Figure BDA0002712615540001192
将来自前一步骤的粗产物(2.11mmol)溶解在DMF(2mL)中。加入DIPEA(0.73mL,4.2mmol)，然后加入Fmoc-Phe-OSu(1.71g,3.16mmol)。将反应于室温下搅拌30分钟，然后真空浓缩，并通过柱色谱法用100G KP-Sil、10-100％的EtOAc/Hex纯化。浓缩含所需产物的级分，得到白色固体(910mg,1.46mmol,70％)。Rt＝2.28min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+Na]+C36H35N3NaO7计算值644.24，实测值644.04。
Fmoc脱保护：
Figure BDA0002712615540001193
将底物(910mg,1.46mmol)溶解在20％的哌啶/DMF中并搅拌20分钟。真空浓缩反应，且未经进一步纯化即用在下一步骤中。
Fmoc二肽偶联：
Figure BDA0002712615540001201
将来自前一步骤的粗产物(1.46mmol)溶解在无水DMF(2mL)中。向反应中加入DIPEA(1.00mL,5.76mmol)和Fmoc-Gly-Gly-OH(1.07g,3.02mmol)，然后加入HATU(1.09g,2.88mmol)。将反应搅拌30分钟。用AcOH淬灭反应并通过制备型HPLC 50mm 10-95％MeCN/H2O 0.05％TFA纯化。真空浓缩含所需产物的级分，得到白色固体(650mg,0.88mmol,61％)。Rt＝2.13min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+Na]+C40H41N5NaO9计算值758.28，实测值758.13。
Pd催化的苄酯脱保护：
Figure BDA0002712615540001202
将底物(650mg,0.88mmol)悬浮在2:1的EtOH:EtOAc(12mL)中并置于氮气氛下。向溶液中加入Pd/C(10重量/重量％,132mg,0.124mmol)。用氢气对反应鼓泡1小时(1atm)。通过硅藻土过滤反应，用MeOH冲洗，并真空浓缩。未经进一步纯化即用在下一步骤中。
Fmoc脱保护：
Figure BDA0002712615540001203
将来自前一步骤的粗固体(0.88mmol)溶解在DMF(8mL)中。加入哌啶(2mL)。搅拌10分钟。真空浓缩反应，得到白色固体。未经进一步纯化即用在下一步骤中。
MC-OSu偶联：
Figure BDA0002712615540001211
将来自前一步骤的粗产物(0.88mmol)溶解在DMF(10mL)中。加入DIPEA(1mL)，然后加入MC-OSu(407mg,1.32mmol)。将反应搅拌10分钟。通过UPLC-MS观察到完全转化。加入AcOH(1mL)以淬灭反应。通过制备型HPLC 50mm 10-95％MeCN/H2O 0.05％TFA纯化。将含所需产物的级分冻干，得到白色固体(453mg,0.735mmol,83％)。Rt＝1.21min通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C28H37N6O10计算值617.26，实测值617.07。
MC-GGFG-乙醇酸连接子与7-MAD-MDCPT偶联：
Figure BDA0002712615540001212
将MC-GGFG-乙醇酸(46mg,0.075mmol)溶解在DMF(0.5mL)中。加入DIPEA(26μL,0.149mmol)，然后加入COMU(32mg,0.075mmol)。反应于室温下搅拌30分钟。直接向7-MAD-MDCPT药物固体(来自实施例4)中加入活化的酸溶液。5分钟后通过UPLC-MS观察到完全转化。用AcOH淬灭反应，通过制备-HPLC 10-95％MeCN/H2O 0.05％TFA纯化。将含所需产物的级分冻干，得到呈白色固体的所需产物(8.00mg,7.84μmol,21％)。Rt＝1.93min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C50H54N9O15计算值1020.37，实测值1020.09。
实施例2-1
MC-Val-Cit-PABA-7-MAD-MDCPT的制备
Figure BDA0002712615540001221
将7-MAD-MDCPT TFA盐(20.0mg,0.0374mmol)和MC-Val-Cit-PABA-PNP(82.7mg,0.112mmol)溶解在无水DMF(0.5mL)中。加入DIPEA(26μL,0.149mmol)。10分钟后通过UPLC-MS观察到完全转化。用AcOH淬灭反应，并通过制备型HPLC 21mm 10-95％MeCN/H2O 0.05％TFA纯化。将含所需产物的级分冻干，得到白色粉末(2.4mg,2.4μmol,6％)。Rt＝1.59min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C51H58N9O14计算值1020.41，实测值1020.09。
实施例3-1
MP-PEG4-Val-Lys-7-MAD-MDCPT的制备
Figure BDA0002712615540001222
MP-PEG4-VK(Boc)-OH的固相肽合成
向反应容器中加入2-氯三苯甲基树脂(1.6mmol/g,2克)，并用DMF洗涤2次。将树脂在20mL DMF中溶胀10分钟，然后沥干。向树脂中加入溶解在10mL DMF中的Fmoc-Lys(Boc)-OH(937mg,2mmol)和DIPEA(0.7mL,4mmol)并在室温下振摇30分钟。向树脂中加入MeOH(5mL)并振摇5分钟，然后沥干并用DMF洗涤5次。猜想取代为1mmol/g。将树脂用DCM洗涤3次，用MeOH洗涤3次，然后高真空下干燥过夜。向反应容器中加入制得的Fmoc-Lys(Boc)-2-氯三苯甲基树脂(1克)。将树脂用DMF洗涤3次并在10mL DMF中溶胀10分钟，然后沥干。使用通用脱保护程序脱除Fmoc保护。使用通用偶联程序将Fmoc-Val-OH与树脂偶联，然后进行通用脱保护程序。使用通用偶联程序偶联MP-PEG4-OH。然后将树脂用DCM洗涤3次，随后用MeOH洗涤3次，并置于高真空下过夜。通过在1mL乙酸、2mL六氟异丙醇和7mL DCM的溶液中搅拌树脂1小时使肽从树脂裂解。然后过滤树脂并用DCM洗涤3次，然后真空浓缩溶液。将白色粉末溶解在2:1的DMA:H2O(3mL)中并通过制备HPLC使用30x 250mm Phenomenex Max-RP 4μm Synergi
Figure BDA0002712615540001231
反相柱使用如下所述5-60-95％的MeCN(0.05％TFA)/0.05％TFA水溶液的梯度洗脱进行纯化。将含所需产物的级分冻干，得到白色粉末(343mg,0.461mmol,46％)。Rt＝1.50min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C34H57N5O13计算值744.16，实测值744.40。
5-60-95％梯度洗脱
时间(分钟) 流速(mL/min) ％MeCN
初始 8 5
3 8 5
5 15 5
48 15 60
50 15 95
55 15 95
56 15 5
60 15 5
MP-PEG4-VK(Boc)-OH与7-MAD-MDCPT的偶联和Boc脱保护
Figure BDA0002712615540001241
将MP-PEG4-VK(Boc)-OH(30mg,0.040mmol)溶解在无水DMF(0.5mL)和DIPEA(50μL,0.28mmol)中。向溶液中加入HATU(15.3mg,0.0403mmol)。将反应于室温下搅拌30分钟。直接向7-MAD-MDCPT固体(17mg,0.04mmol)中加入活化的酸溶液。通过UPLC-MS监测反应的完成情况。120分钟后观察到完全转化。用AcOH(50μL,0.87mmol)酸化反应，并通过制备型HPLC使用21x 250mm Phenomenex Max-RP 4μm Synergi
Figure BDA0002712615540001242
反相柱使用先前描述的5-60-95％的MeCN(0.05％TFA)/0.05％TFA的梯度洗脱进行纯化。将含所需产物的级分冻干，得到黄色粉末(5mg,0.0044mmol,11％)。Rt＝1.70min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C57H75N7O18计算值1146.52，实测值1147.19。
将MP-PEG4-VK(Boc)-7-MAD-MDCPT溶解在20％的TFA/DCM中。通过UPLC-MS监测反应的完成情况。10分钟后完全转化。真空浓缩反应，在10％的AcOH/(2:1DMA:H2O)中重构，并通过制备HPLC使用21x 250mm Phenomenex Max-RP 4μm Synergi
Figure BDA0002712615540001243
反相柱使用先前描述的5-60-95％的MeCN(0.05％TFA)/0.05％TFA的梯度洗脱进行纯化。收集在385nm处具有吸光度的级分。将含所需产物的级分冻干，得到黄色粉末状的化合物3-1(2.5mg,0.0023mmol,55％)。Rt＝1.12min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C52H67N7O16计算值1046.47，实测值1047.26。
实施例4-1
MP-PEG4-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT的制备
Figure BDA0002712615540001251
MP-PEG4-VK(Boc)G-OH的固相肽合成
自BAChem购买以1.1mmol/g预加载于2-氯三苯甲基树脂上的无保护甘氨酸。向反应容器中加入树脂(1克)。用DMF洗涤树脂4次并完全沥干。通过在DMF中振摇30分钟使树脂溶胀，并沥干。使用通用偶联程序将Fmoc-Lys(Boc)-OH与树脂偶联。使用通用脱保护程序脱除Fmoc保护。使用通用偶联程序将Fmoc-Val-OH与树脂偶联，然后进行通用脱保护程序。使用通用偶联程序偶联MP-PEG4-OH。然后将树脂用DCM洗涤3次，随后用MeOH洗涤3次，并置于高真空下过夜。通过在1mL乙酸、2mL六氟异丙醇和7mL DCM的溶液中搅拌树脂1小时使肽从树脂裂解。然后过滤树脂并用DCM洗涤3次，然后真空浓缩溶液。将白色粉末溶解在2:1的DMA:H2O(3mL)中并通过制备HPLC使用30x 250mm Phenomenex Max-RP 4μm Synergi
Figure BDA0002712615540001252
反相柱使用先前描述的5-60-95％的MeCN(0.05％TFA)/0.05％TFA水溶液的梯度洗脱进行纯化。将含所需产物的级分冻干，得到白色粉末(354mg,0.442mmol,40％)。Rt＝1.39min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C36H59N6O14计算值801.42，实测值801.02。
5-60-95％梯度洗脱
Figure BDA0002712615540001253
Figure BDA0002712615540001261
通用Fmoc脱保护程序
向树脂中加入20％的哌啶/DMF溶液(10mL)，振摇1分钟，并沥干。向树脂中加入另外10mL 20％的哌啶/DMF，振摇30分钟，并沥干。用DMF洗涤树脂4次并完全沥干。
通用偶联程序
在DMF(10mL)中制备Fmoc氨基酸(3mmol)、HATU(3mmol)、二PEA(6mmol)的溶液。向树脂中加入该溶液，并振摇60分钟。沥干反应容器并用DMF洗涤4次。
MP-PEG4-VK(Boc)G-OSu的合成
将MP-PEG4-VKG-OH(90.0mg,0.112mmol)溶解在无水DMF(0.3mL)中并加入DIPEA(0.05mL,0.302mmol)。向反应容器中加入TSTU(67.6mg,0.224mmol)，并通过UPLC-MS监测向N-羟基琥珀酰亚胺(OSu)活化酯的转化。5分钟后观察到完全转化。用AcOH(0.05mL,0.874mmol)酸化反应。通过Biotage快速色谱法使用10G Ultra硅胶柱纯化反应，用0-10％的MeOH/DCM梯度洗脱。真空浓缩含所需产物的级分，得到白色固体，其为所需的产物MP-PEG4-VK(Boc)G-OSu(91.2mg,0.102mmol,90％)。Rt＝1.48通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C40H62N7O16计算值898.44，实测值898.33。
偶联MP-PEG4-VK(Boc)G-OSu与7-MAD-MDCPT
直接向含MP-PEG4-VK(Boc)G-OSu(50mg,0.056mmol)的反应容器中加入7-MAD-MDCPT(24mg,0.057mmol)溶解在无水DMF(0.48mL)中的溶液。向反应容器中加入DIPEA(0.05mL,.303mmol)。一经加入碱，澄清的黄色溶液即变得不透明。通过UPLC-MS监测反应的完成情况。5分钟后观察到向所需偶联产物的完全转化。用AcOH(0.05mL,0.87mmol)酸化反应并通过硅胶柱过滤纯化，用0-10％的MeOH/DCM梯度洗脱。真空浓缩洗脱物，得到黄色固体，其为所需的产物MP-PEG4-VKG-7-MAD-MDCPT(32mg,0.027mmol,48％)。Rt＝1.59min通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C58H77N9O19计算值1204.54，实测值1204.25。
MP-PEG4-VK(Boc)G-7-MAD-MDCPT的Boc脱保护
将MP-PEG4-VK(Boc)-G-7-MAD-MDCPT溶解在20％的TFA/DCM中。通过UPLC-MS监测反应的完成情况。10分钟后观察到完全转化。真空浓缩反应，在10％的AcOH/(2:1DMA:H2O)中重构，并通过制备HPLC使用21x 250mm Phenomenex Max-RP 4μm Synergi
Figure BDA0002712615540001272
反相柱使用先前描述的5-60-95％的MeCN(0.05％TFA)/0.05％TFA的梯度洗脱进行纯化。收集在385nm处具有吸光度的级分。将含所需产物的级分冻干，得到黄色粉末状的化合物Ex_4-1(33mg,.030mmol,80％)。Rt＝1.12min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C53H69N9O17计算值1104.49，实测值1104.70。
实施例4-2
MP-PEG2-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT的制备
Figure BDA0002712615540001271
使用实施例4-1中描述的通用程序通过用PEG2代替PEG4合成化合物Ex_4-2。
实施例4-3
MP-PEG8-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT的合成
Figure BDA0002712615540001281
使用实施例4-1中描述的通用程序通过用PEG8代替PEG4合成化合物Ex_4-3。
实施例4-4
MP-PEG12-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT的合成
Figure BDA0002712615540001282
使用实施例4-1中描述的通用程序通过用PEG12代替PEG4合成化合物Ex_4-4。
下表汇总了针对化合物Ex_4-2、Ex_4-3和Ex_4-4的表征数据。
表V
Figure BDA0002712615540001283
实施例4-5
MP-Lys[(C(O)(CH2CH2O)12-CH3)]-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT的制备
Figure BDA0002712615540001291
MP-Lys[(C(O)(CH2CH2O)12-CH3)]-Val-Lys(Boc)-Gly-OH的固相肽合成：
自Iris Biotech购买以0.87mmol/g预加载于2-氯三苯甲基树脂上的无保护甘氨酸。向反应容器中加入树脂(0.287gram,0.25mmol)。用DMF洗涤树脂3次并完全沥干。通过在DMF中振摇30分钟使树脂溶胀，并沥干。使用通用偶联程序将Fmoc-Lys(Boc)-OH与树脂偶联。使用通用脱保护程序脱除Fmoc保护。使用通用偶联程序将Fmoc-Val-OH与树脂偶联，然后进行通用脱保护程序。使用通用偶联程序偶联Fmoc-Lys(PEG12)-OSu(WO 2015057699)而不添加HATU。使用通用脱保护程序脱除Fmoc保护。使用通用偶联程序偶联3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯而不添加HATU。然后用DCM洗涤树脂3次，随后用Et2O洗涤3次，并置于高真空下过夜。通过在1mL乙酸、2mL三氟乙醇和7mL DCM的溶液中搅拌树脂1小时使肽从树脂裂解。然后过滤树脂并用DCM洗涤3次，然后真空浓缩溶液。将粗材料溶解在DMSO(2mL)中并通过制备HPLC使用21x 250mm Phenomenex Max-RP 4μm Synergi
Figure BDA0002712615540001292
反相柱使用5-60-95％的MeCN(0.1％甲酸)/0.1％甲酸水溶液的梯度洗脱进行纯化。浓缩含所需产物的级分，得到粘稠的油。将该油溶解在MeCN(2mL)中并用Et2O沉淀。通过过滤收集产物，得到无色非晶固体(170.7mg,0.136mmol,55％)。Rt＝1.32min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C57H102N7O23计算值1252.70，实测值1252.79。
通用Fmoc脱保护程序
向树脂中加入20％的哌啶/DMF溶液(5mL)，振摇1分钟，并沥干。向树脂中加入另外5mL 20％的哌啶/DMF，振摇30分钟，并沥干。用DMF洗涤树脂4次并完全沥干。
通用偶联程序
在DMF(5mL)中制备Fmoc氨基酸(0.75mmol)、HATU(0.75mmol)、二PEA(1.5mmol)的溶液。向树脂中加入该溶液，并振摇60分钟。沥干反应容器并用DMF洗涤4次。
Figure BDA0002712615540001301
将MP-Lys[(C(O)(CH2CH2O)12-CH3)]-Val-Lys(Boc)-Gly-OH(59.4mg,0.0475mmol)溶解在无水DMF(0.1mL)中。加入DIPEA(12.4μL,0.0712mmol)，然后加入TSTU(14.3mg,0.0475mmol)。将反应搅拌10分钟以使酸完全活化为NHS酯。向反应中加入7-MAD-MDCPT(10.0mg,0.02373mmol,100mg/mL在DMF中)。5分钟后观察到完全转化。用AcOH(25μL)淬灭反应并通过制备-HPLC 5-60-95％MeCN/H2O 0.1％TFA纯化。真空浓缩含所需产物的级分，得到黄色固体(12.3mg,0.00740mmol,31％)。Rt＝1.56min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C79H118N10O28计算值1655.82，实测值1655.89。
Figure BDA0002712615540001311
将化合物溶解在20％的TFA/DCM中。通过UPLC-MS监测反应的完成情况。10分钟后观察到完全转化。真空浓缩反应，在40％的MeCN/H2O 0.05％TFA中重构并冻干，得到黄色粉末状的化合物Ex_4-5，猜测其为TFA盐(12.99mg,0.00778mmol,105.16％)。Rt＝1.27min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C74H111N10O26计算值1555.77，实测值1555.86。
实施例5-1
MP-PEG4-Gly-Gly-7-MAD-MDCPT的制备
Figure BDA0002712615540001312
使用以下通用程序通过固相肽合成来合成肽MP-PEG4-Gly-Gly-OH。
溶胀的通用程序：
自BAChem购买以1.1mmol/g预加载于2-氯三苯甲基树脂上的无保护甘氨酸树脂(200mg)。向反应容器中加入树脂。用DMF(4x 2mL)洗涤树脂并完全沥干。通过在DMF(2mL)中振摇30分钟使树脂溶胀，并沥干。
通用Fmoc脱保护程序：
向树脂中加入20％的哌啶/DMF溶液(2mL)，振摇1分钟，并沥干。向树脂中加入另外2mL 20％的哌啶/DMF，振摇30分钟，并沥干。用DMF(4x 2mL)洗涤树脂并完全沥干。
通用偶联程序：
在DMF(2mL)中制备Fmoc氨基酸(0.6mmol)、HATU(0.6mmol)、二PEA(0.6mmol)的溶液。向树脂中加入该溶液，并振摇60分钟。沥干反应容器，用DMF(4x 2mL)洗涤并完全沥干。
通用裂解程序：
通过在1:2:7的AcOH:六氟异丙醇:DCM的溶液(5mL)中搅拌树脂1小时使肽从树脂裂解。然后过滤树脂并用DCM(3x 10mL)冲洗，然后真空浓缩溶液并通过制备HPLC使用21x250mm Phenomenex Max-RP 4μm Synergi
Figure BDA0002712615540001321
反相柱使用5-60-95％的MeCN(0.05％TFA)/0.05％TFA水溶液的梯度洗脱进行纯化。将含所需产物的级分冻干，得到白色粉末。
使用固相肽合成的通用程序合成肽MP-PEG4-Gly-Gly-OH，得到白色粉末(45mg,0.085mmol,42％)。Rt＝0.83min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C22H35N4O11计算值531.23，实测值530.82。
TSTU偶联程序：
将肽(45mg,0.085mmol)溶解在0.2mL DMF中。加入TSTU(28mg,0.093mmol,1.1当量)。加入DIPEA(1.2当量)并将反应搅拌30分钟。用AcOH淬灭反应。通过FCC用0-10％MeOH/DCM纯化。真空浓缩含所需产物的级分，得到白色粉末(10mg,0.016mmol,19％)。Rt＝0.96min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C26H38N5O13计算值628.25，实测值627.94。
直接向NHS酯肽中加入20mg/mL的7-MAD-MDCPT(1.1当量)/DMF。加入DIPEA(18μL,0.10mmol,1.2当量)并搅拌30分钟。用AcOH淬灭反应并通过制备-HPLC纯化。将含所需产物的级分冻干，得到白色粉末。Rt＝1.25min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C44H52N7O16计算值934.35，实测值934.52。
通用脱保护程序：
将具有酸不稳定保护基团的肽基药物连接子溶解在20％的TFA/DCM(2mL)中并搅拌30分钟。真空浓缩反应。
使用针对实施例5-1报道的通用程序合成化合物5-1a至5-1s。每个实施例中的药物部分具有式CPT5，其经由N-键在如针对实施例5-1所示的氨基甲基氮处连接。
表VI
Figure BDA0002712615540001331
表征数据：
Figure BDA0002712615540001341
Figure BDA0002712615540001351
实施例6-1
MC-Gly-Gly-Phe-Gly-7-NHCH2OCH2-MDCPT的制备
Figure BDA0002712615540001352
MC-Gly-Gly-Phe-OH的固相肽合成
Figure BDA0002712615540001353
自BAChem购买以1.1mmol/g预加载于2-氯三苯甲基树脂上的无保护苯丙氨酸。向反应容器中加入树脂(1克)。用DMF洗涤树脂4次并完全沥干。通过在DMF中振摇30分钟使树脂溶胀，并沥干。使用通用偶联程序将Fmoc-Gly-OH与树脂偶联。使用通用脱保护程序脱除Fmoc保护。使用通用偶联程序将Fmoc-Gly-OH与树脂偶联，然后进行通用脱保护程序。使用通用偶联程序偶联MC-OH。然后将树脂用DCM洗涤3次，随后用MeOH洗涤3次，并置于高真空下过夜。通过在1mL乙酸、2mL六氟异丙醇和7mL DCM的溶液中搅拌树脂1小时使肽从树脂裂解。然后过滤树脂，用DCM冲洗3次，并真空浓缩溶液。将白色固体通过制备型HPLC使用30x250mm Phenomenex Max-RP 4μm Synergi
Figure BDA0002712615540001354
反相柱使用5-60-95％的MeCN(0.05％TFA)/0.05％TFA的梯度洗脱进行纯化。将含所需产物的级分冻干，得到白色粉末(207mg,0.438mmol,44％)。Rt＝1.28min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C23H29N4O7计算值473.20，实测值473.00。
FmocGly-7-NHCH2OCH2-MDCPT的制备
Figure BDA0002712615540001361
将底物(52mg,0.014mmol)溶解在DCM(1mL)中。加入TMSCl(0.25mL)。将反应混合物搅拌20分钟，然后真空浓缩。将粗产物直接用在下一步骤中。
Figure BDA0002712615540001362
将来自前一步骤的经活化连接子溶解在无水DCM(1mL)中并直接加到7-BAD-MDCPT(20.0mg,0.0474mmol)固体中。密封反应容器并于60℃下搅拌24小时。用MeOH淬灭反应并真空浓缩。将粗产物通过柱色谱法用10G Biotage Ultra、0-10％的MeOH/DCM纯化。真空浓缩含所需产物和游离药物杂质的级分，得到黄色固体(25mg,50％纯度,0.017mmol,36％)。Rt＝1.77min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C40H35N4O10计算值731.24，实测值731.07。
Figure BDA0002712615540001363
将底物(0.017mmol)溶解在20％的哌啶/DMF(1mL)中。将反应搅拌5分钟，然后真空浓缩。通过制备型HPLC 21mm 10-95％MeCN/H2O 0.05％TFA纯化反应。将含所需产物的级分冻干，得到黄色固体(5.2mg,0.010mmol,60％)。Rt＝1.02min通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C25H24N4O8计算值509.17，实测值509.00。
Figure BDA0002712615540001364
Figure BDA0002712615540001371
将MC-GGFG-OH(14.5mg,0.0307mmol)溶解在DMF(0.5mL)中。加入DIPEA(9μL,0.05mmol)，然后加入TSTU(9.3mg,0.031mol)。将反应搅拌5分钟。通过UPLC-MS观察到向NHS酯产物的完全转化。将此活化NHS酯溶液直接加到药物-Gly固体中。通过UPLC-MS在5分钟后观察到完全转化。用AcOH淬灭反应并通过制备-HPLC纯化。将含所需产物的级分冻干，得到黄色粉末(3.30mg,3.43μmol,34％)。Rt＝1.53min通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C48H51N8O14计算值963.35，实测值963.14。
实施例7-1
MP-PEG4-Val-Lys-PABA-7-MAD-MDCPT的制备
Figure BDA0002712615540001372
EEDQ偶联Fmoc-Lys(Boc)-PABA
Figure BDA0002712615540001373
将Fmoc-Lys(Boc)-OH(500mg,1.07mmol)悬浮在1mL DCM中并搅拌。加入EEDQ(528mg,2.13mmol)，然后加入PABA(263mg,2.13mmol)。1分钟后反应物变得可溶，然后在10分钟后从混合物沉淀出。通过UPLC-MS观察到完全转化。过滤沉淀物，并用DCM(3x 50mL)洗涤。获得白色固体状的所需产物(612mg,1.07mmol,定量)。未经进一步纯化即用在下一步骤中。Rt＝2.08min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C33H40N3O6计算值574.29，实测值574.28。
脱保护
Figure BDA0002712615540001381
将底物(612mg,1.07mmol)溶解在5mL 20％的哌啶/DMF溶液中。将反应于室温下搅拌10分钟。通过UPLC-MS观察到完全转化。真空浓缩反应，并未经进一步纯化即用在下一步骤中。Rt＝0.80min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C18H30N3O4计算值352.22，实测值351.69。
Fmoc-Val-OSu偶联
Figure BDA0002712615540001382
将来自前一步骤的粗底物(1.07mmol)溶解在DMF(2mL)中。加入Fmoc-Val-OSu(581mg,1.33mmol)，然后加入DIPEA(0.37mL,2.13mmol)，并搅拌30分钟。通过UPLC-MS观察到完全转化。用AcOH淬灭反应，真空浓缩，并通过FCC 100G KP-Sil 0-10％MeOH/DCM纯化。真空浓缩含所需产物的级分，得到白色固体(716mg,1.06mmol,99％)。Rt＝2.12min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C38H49N4O7计算值673.36，实测值673.31。
脱保护
Figure BDA0002712615540001383
将底物(716mg,1.06mmol)溶解在5mL 20％的哌啶/DMF溶液中。将反应于室温下搅拌10分钟。通过UPLC-MS观察到完全转化。真空浓缩反应，并未经进一步纯化即用在下一步骤中。Rt＝0.94min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C23H39N4O5计算值451.29，实测值450.72。
MP-PEG4-OSu偶联
Figure BDA0002712615540001391
将来自前一步骤的粗底物(1.06mmol)溶解在DMF(1mL)中。加入MP-PEG4-OSu(1.09mg,2.13mmol)，然后加入DIPEA(0.55mL,3.19mmol)，并搅拌30分钟。通过UPLC-MS观察到完全转化。将粗反应混合物用在下一步骤中。Rt＝1.40min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C41H65N6O13计算值849.46，实测值849.06。
PNP活化
Figure BDA0002712615540001392
向来自前一步骤的粗反应混合物中加入双硝基苯酚碳酸酯(969mg,3.19mmol)。将反应搅拌30分钟。通过UPLC-MS观察到完全转化。用AcOH淬灭反应，并通过制备型HPLC 50mm10-50-70-95％MeCN/H2O0.05％TFA纯化。在Genevac上使用HPLC lyo方法真空浓缩含所需产物的级分。浓缩的级分产生白色固体(621mg,0.612mmol,58％)。Rt＝1.26min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C48H68N7O17计算值1014.47，实测值1014.25。
7-MAD-MDCPT的偶联
Figure BDA0002712615540001401
直接向经活化的连接子(93mg,0.092mmol)中加入以50mg/mL溶解在DMF中的7-MAD-MDCPT(10mg,24mmol)。加入DIPEA(0.047mL,36mmol)并搅拌反应。观察到该反应在10分钟后缓慢发展出产物。为加速反应，加入催化量的DMAP(0.01mg)。通过UPLC-MS在30分钟后观察到完全转化。用AcOH淬灭反应并通过制备型HPLC 21mm10-36-54-95％MeCN/H2O0.05％TFA纯化。将含所需产物的级分冻干，得到黄色粉末(22.4mg,17.3μmol,72.5％)。Rt＝1.66min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C64H82N9O20计算值1296.57，实测值1296.54。
Boc脱保护：
Figure BDA0002712615540001402
将底物(3.5mg,2.7μmol)溶解在10％的TFA/DCM(2mL)中。让搅拌10分钟，此时通过UPLC-MS观察到几乎完全的转化。用MeOH(2mL)稀释反应并真空浓缩。在0.3mL DMSO中重构。浓缩后未观察到产物的降解。通过制备型HPLC 10mm 5-25-41-95％MeCN/H2O 0.05％TFA纯化。将含所需产物的级分冻干，得到黄色粉末(1.9mg,1.6μmol,59％)。Rt＝1.22min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C59H74N9O18计算值1196.52，实测值1196.23。
实施例8-1
在下面的生物学实施例和表中，制备了本实施例中的比较化合物并用于评估。这些比较化合物的结构如下：
Figure BDA0002712615540001411
实施例9-1
MP-PEG4-Val-Lys-7-NH(CH2CH2O)2CH2CH2NHCH2-MDCPT的制备
Figure BDA0002712615540001412
将MP-PEG4-VK(Boc)-OH肽(10.0mg,0.0181mmol)溶解在无水DMF(0.2mL)中。加入DIPEA(6.3μL,0.036mmol)，然后加入TSTU(5.99mg,0.0199mmol)。使酸活化为NHS酯，持续20分钟。向反应中加入在0.1mL DMF中的药物(化合物5y)。5分钟后通过UPLC-MS观察到完全转化。用AcOH(10μL)淬灭反应，并通过制备-HPLC 21x 250mm 5-60-95％MeCN/H2O 0.05％TFA纯化。将含所需产物的级分冻干，得到黄色粉末(11.62mg,9.09μmol,50％)。
Figure BDA0002712615540001421
将底物(11.62mg,9.09μmol)溶解在20％的TFA/DCM(2mL)中。通过UPLC-MS在10分钟后观察到向脱保护产物的完全转化。真空浓缩反应并通过制备-HPLC 10x 250mm MaxRP5-60-95％MeCN/H2O 0.05％TFA纯化。将含所需产物的级分冻干，得到黄色粉末(2.96mg,2.51μmol,28％)。
Figure BDA0002712615540001422
MP-PEG4-Val-Lys-Gly-7-NH(CH2CH2O)2CH2CH2NHCH2-MDCPT的制备
Figure BDA0002712615540001423
使用上文针对化合物Ex_9-1a的制备所述的通用程序合成化合物Ex_9-1b。
下表汇总了对化合物Ex_9-1a和Ex_9-1b的表征数据。
表VII
Figure BDA0002712615540001424
实施例10-1
mDPR-PEG8-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT的制备
Figure BDA0002712615540001431
Fmoc-VK(Boc)G-OH的固相肽合成：
Figure BDA0002712615540001432
自Iris Biotech购买以0.87mmol/g预加载于2-氯三苯甲基树脂上的无保护甘氨酸。向反应容器中加入树脂(2克)。用DCM溶胀树脂30分钟，用DMF洗涤3次，并完全沥干。使用通用偶联程序将Fmoc-Lys(Boc)-OH与树脂偶联。使用通用脱保护程序脱除Fmoc保护。使用通用偶联程序将Fmoc-Val-OH与树脂偶联。用DCM洗涤树脂3次，然后用Et2O洗涤3次，并真空干燥。通过在4mL乙酸、8mL三氟乙醇和28mL DCM的溶液中搅拌树脂1小时使肽从树脂裂解。然后过滤树脂并用DCM洗涤3次，然后真空浓缩溶液。用2mL MeCN溶解粗残余物，并用100mLEt2O沉淀。通过过滤收集沉淀物，得到白色粉末(738.6mg,1.180mmol,68％)。Rt＝2.06min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C33H45N4O8计算值625.32，实测值625.30。
通用Fmoc脱保护程序
向树脂中加入20％的哌啶/DMF溶液(20mL)，振摇1分钟，并沥干。向树脂中加入另外20mL 20％的哌啶/DMF，振摇30分钟，并沥干。用DMF洗涤树脂4次并完全沥干。
通用偶联程序
在DMF(20mL)中制备Fmoc氨基酸(5mmol)、HATU(5mmol)、二PEA(5mmol)的溶液。将该溶液加到树脂中并振摇60分钟。沥干反应容器并用DMF洗涤4次。
Figure BDA0002712615540001441
将Fmoc-Val-Lys(Boc)-Gly-OH肽(738.6mg,1.180mmol)溶解在无水DMF(4mL)中。加入TSTU(373.7mg,1.24mmol)，然后加入DIPEA(0.31mL,1.77mmol)。反应在室温下搅拌15分钟，此时通过UPLC-MS观察到完全转化。用AcOH(0.20mL)淬灭反应。用EtOAc(100mL)稀释反应，用H2O(3x 100mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物再悬浮于极小量的DCM(5mL)中并用己烷(100mL)沉淀。通过过滤收集沉淀物并真空干燥，得到呈白色粉末的所需产物Fmoc-Val-Lys(Boc)-Gly-OSu(759.7mg,1.05mmol,89％)。Rt＝2.12min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C37H48N5O10计算值722.34，实测值722.39。
Figure BDA0002712615540001442
将7-MAD-MDCPT(50.0mg,0.118mmoL)溶解在无水DMF(1mL)中。加入Fmoc-Val-Lys(Boc)-Gly-OSu(129mg,0.178mmol)，然后加入DIPEA(0.041mL,0.24mmol)。将反应于室温下搅拌5分钟，此时通过UPLC-MS观察到向所需产物的完全转化。真空浓缩反应并通过FCC 10GBiotage Ultra 0-6％MeOH/DCM纯化。真空浓缩含所需产物的级分，得到棕褐色固体状的所需产物Fmoc-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT(97.9mg,0.0953mmol,80％)。Rt＝2.07min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C56H63N6O13计算值1028.44，实测值1028.22。
Figure BDA0002712615540001451
将Fmoc-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT(97.9mg,0.0953mmol)溶解在20％的哌啶/DMF中。将反应于室温下搅拌10分钟。通过UPLC-MS观察到向Fmoc脱保护产物的完全转化。真空浓缩反应，得到棕褐色固体状的所需H-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT，将其溶解在无水DMF(0.5mL)中。向反应中加入Fmoc-PEG8-NHS(90.6mg,0.119mmol,Broadpharm:BP-21634,CAS:1334170-03-4)，然后加入DIPEA(0.025mL,0.143mmol)。将反应于室温下搅拌30分钟，此时通过UPLC-MS观察到完全转化。用AcOH(0.025mL)淬灭反应并通过制备型HPLC21x 250mm Max-RP 5-40-95％MeCN/H2O 0.1％TFA/甲酸溶液纯化。浓缩含所需产物的级分，得到棕褐色固体状的所需产物Fmoc-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT(53.2mg,0.0367mmol,两步收率38％)。Rt＝1.32min，疏水方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C74H99N8O22计算值1451.69，实测值1452.15。
Figure BDA0002712615540001452
将Fmoc-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT(53.2mg,0.0367mmol)溶解在20％的哌啶/DMF中。将反应于室温下搅拌10分钟，此时通过UPLC-MS观察到完全转化。真空浓缩反应，得到棕褐色固体状的H-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT。制备粗产物在无水DMF中的0.0367M溶液并在下一步骤中用作形成马来酰亚胺类似物的试剂。
Figure BDA0002712615540001461
用冰/水浴冷却以0.0367M在DMF(0.50mL,0.018mmol)中的H-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT。向反应中加入MDPR(Boc)-OH(15.6mg,0.0550mmol,CAS:1491152-23-8,制备方法见述于WO 2013173337中)和COMU(23.6mg,0.0550mmol)，然后加入2,6-二甲基吡啶(12.8μL,0.110mmol)。用时1小时使反应加温至室温并搅拌过夜(15小时)。通过UPLC-MS观察到完全转化。用AcOH(0.020mL)淬灭反应并通过制备型HPLC 10x 250mm Max-RP 5-60-95％MeCN/H2O0.1％甲酸纯化。真空浓缩含所需产物的级分，得到黄色固体状的mDPR(Boc)-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT(13.4mg,8.97μmol,49％)。Rt＝1.71min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C71H103N10O25计算值1495.71，实测值1495.04。
Figure BDA0002712615540001462
将MDPR(Boc)-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT(13.4mg,8.97μmol)溶解在20％的TFA/DCM中并搅拌10分钟。通过UPLC-MS观察到完全转化。真空浓缩反应并通过制备-HPLC 10x 250mm Max-RP5-30-95％MeCN/H2O 0.05％TFA纯化。将含所需产物的级分冻干，得到黄色固体状的mDPR-PEG8-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT(化合物Ex_10-1a)，猜测其为双TFA盐(13.4mg,8.77μmol,98％)。Rt＝1.06min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+Na]+C61H86N10NaO21计算值1317.59，实测值1317.50。
MC-PEG8-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT的制备
Figure BDA0002712615540001471
向在DMF(0.50mL,0.018mmol)中的0.0367M的H-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT(来自上文针对化合物Ex_10-1a的制备所述的程序)中加入MCOSu(17.0mg,0.0550mmol,TCI America:S0428,CAS:55750-63-5)，然后加入DIPEA(9.6μL,0.055mmol)。将反应于室温下搅拌5分钟，此时观察到完全转化。用AcOH(0.02mL)淬灭反应，并通过制备型HPLC 10x 250mm Max-RP 5-60-95％MeCN/H2O 0.1％甲酸纯化。真空浓缩含所需产物的级分，得到黄色固体状的MC-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT(17.4mg,18.3μmol,67％)。Rt＝1.63min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C69H100N9O23计算值1422.69，实测值1422.27。
Figure BDA0002712615540001472
将MC-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT(17.4mg,12.2μmol)溶解在20％的TFA/DCM中并搅拌20分钟。通过UPLC-MS观察到完全转化。真空浓缩反应并通过制备-HPLC10x 250mm Max-RP 5-40-95％MeCN/H2O 0.05％TFA纯化。将含所需产物的级分冻干，得到黄色固体状的MC-PEG8-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT(化合物Ex_10-1b)，猜测其为TFA盐(16.54mg,11.52μmol,94％)。Rt＝1.27min，通用方法UPLC。MS(m/z)[M+H]+C64H92N9O21计算值1322.64，实测值1322.15。
喜树碱缀合方法
在50％的丙二醇(PG)1X PBS混合物中制备完全或部分还原的ADC。将一半部分的PG添加到经还原的mAb中，并将一半的PG添加到1mM的DMSO喜树碱药物-连接子储备液中。以25％为一份分多份将PG/药物-连接子混合物加到经还原的mAb中。在完成药物-连接子的添加后，通过用活性炭(1mg活性炭:1mg mAb)处理来除去过量的药物-连接子。然后经由过滤除去活性炭，并使用NAP5或PD10柱将所得ADC缓冲交换至5％的海藻糖/1X PBS(pH 7.4)中。
生物学实施例
体外小分子和ADC评估
对多种癌细胞系评估了体外效能。所有细胞系均通过在IDEXX Bioresearch处的STR图谱分析进行鉴定并在复苏后培养不超过2个月。将在对数期生长中的培养细胞在含150μl补充有20％FBS的RPMI 1640的96孔板中接种24小时。以4x工作浓度制备抗体-药物缀合物在细胞培养基中的系列稀释液，并向96孔板中加入50μl的每种稀释液。在加入测试物后，将细胞与测试物一起于37℃下孵育4天。96小时后，通过
Figure BDA0002712615540001481
(Promega,Madison,WI)评估生长抑制并在酶标仪上测量发光。IC50值(一式三份测定)在此定义为相对于未经处理的对照导致细胞生长减少50％的浓度。
在下表中，ADC和CPT游离药物的IC50值分别以ng/mL和mmol/mL浓度给出，括号中的值表示相对于未经处理的细胞在最高测试浓度(对于ADC，1000ng/mL，对于CPT游离化合物，1μM，除非另有指出)下保留的细胞百分数。暴露于ADC 96小时后，通过CellTiter-Glo染色确定细胞活力。ND＝未确定。Ag1是靶向癌细胞上普遍存在且易于内在化的抗原的抗体，Ag2是靶向CD30(+)癌细胞的cAC10抗体，Ag3是靶向CD70(+)癌细胞的h1F6抗体，Ag4是靶向CD48(+)癌细胞的hMEM102抗体，Ag5是靶向表达NTB-A的癌细胞的h20F3抗体，而h00是非结合性对照抗体。
表1A-1D。喜树碱ADC(DAR＝8)的体外效能(IC50值)。A.靶向肾癌细胞(786-O)、胰腺癌细胞(BxPC3)、肝癌细胞(HepG2)、急性早幼粒细胞白血病细胞(HL-60)、霍奇金淋巴瘤细胞(L540cy)、多发性骨髓瘤细胞(MM.1R)、急性髓细胞性白血病细胞(MOLM13)、伯基特淋巴瘤细胞(Ramos)、黑素瘤细胞(SK-MEL-5)和B-淋巴细胞癌细胞(SU-DHL-4和U266)的抗-Ag1ADC，B.靶向抗原呈阳性的霍奇金淋巴瘤细胞(DEL和L540cy)和非霍奇金淋巴瘤细胞(Karpas 299)的抗-Ag2 ADC，并针对抗原呈阴性的肾癌细胞(786-O)进行了测试，C.靶向肾癌细胞(786-O、Caki-1和UM-RC-3)和伯基特淋巴瘤细胞(Raji)的抗-Ag3 ADC，和D.靶向抗原呈阳性的多发性骨髓瘤细胞(EJM、KMM-1、MM.1R)和B淋巴细胞癌细胞(NCI-H929和U-266)的抗-Ag4 ADC和抗-Ag5 ADC，并针对抗原呈阴性的淋巴母细胞系(TF-1a)进行了测试。Ex_8-1a是指Ag1-MC-GGFG-NHCH2-DXd(1)而Ex_4-1是指MP-PEG4-VKG-7-MAD-MDCPT。
表1A：抗-Ag1 ADC
Figure BDA0002712615540001491
Figure BDA0002712615540001501
表1B：抗-Ag2 ADC
Figure BDA0002712615540001502
表1C：抗-Ag3 ADC
Figure BDA0002712615540001503
表1D：抗-Ag4 ADC和抗-Ag5 ADC
Figure BDA0002712615540001504
对CD30+亲代DEL和CD30/MDR+DEL-BVR细胞系的不同活性
表2：喜树碱Ag2-Ex_4-1(DAR＝8)对CD30+亲代DEL和CD30/MDR+DEL-BVR细胞系的不同活性。在本妥昔单抗(brentuximab vedotin)的存在下培养亲代DEL淋巴瘤细胞系以诱导MDR表型的过表达，从而产生DEL本妥昔单抗抗性系(DEL-BVR)。包括本妥昔单抗(其为Ag2-vc-MMAE)(DAR＝4)作为对照。Ex_4-1是指MP-PEG4-VKG-7-MAD-MDCPT。
Figure BDA0002712615540001505
Figure BDA0002712615540001511
聚集水平
表3：肽基喜树碱药物-连接子(DAR＝4)的ADC聚集水平。通过尺寸排阻色谱法(SEC)测定ADC聚集。当肽基喜树碱药物-连接子构建体中包含亲水性肽序列和/或PEG4单元时，观察到较低的聚集水平。
表3
Figure BDA0002712615540001512
DAR小于4
表4：肽基喜树碱抗-Ag1 DAR4 ADC对各种癌细胞系的体外效能(IC50值)证实了序列依赖性效能。
表4A：肾癌细胞(786-O)、胰腺癌细胞(BxPC3)、肝癌细胞(HepG2)和急性早幼粒细胞白血病细胞(HL-60)。
表4B：多重耐药急性早幼粒细胞白血病细胞(HL-60/RV)、霍奇金淋巴瘤细胞(L540cy)、多发性骨髓瘤细胞(MM.R1)和急性髓细胞性白血病细胞(MOLM13)。
表4C：伯基特淋巴瘤细胞(Ramos)、黑素瘤细胞(SK-MEL-5)和B-淋巴细胞癌细胞(SU-DHL-4和U266)。
表4A
Figure BDA0002712615540001521
表4B
Figure BDA0002712615540001522
Figure BDA0002712615540001531
表4C
Figure BDA0002712615540001532
Figure BDA0002712615540001541
表5：针对各种癌细胞系对疏水性不同的选定肽基喜树碱抗-Ag1(DAR＝8)ADC的评估
表5A：肾癌细胞(786-O)、胰腺癌细胞(BxPC3)、肝癌细胞(HepG2)、MDR(-)和MDR(+)急性早幼粒细胞白血病细胞(分别为HL-60和HL60/RV)和霍奇金淋巴瘤细胞(L540cy)。
表5B：多发性骨髓瘤细胞(MM.R1)、急性髓细胞性白血病细胞(MOLM13)、伯基特淋巴瘤细胞(Ramos)、黑素瘤细胞(SK-MEL-5)和B-淋巴细胞癌细胞(SU-DHL-4和U266)。
表5A
Figure BDA0002712615540001542
Figure BDA0002712615540001551
表5B
Figure BDA0002712615540001552
Figure BDA0002712615540001561
表6：与非结合型对照(h00)ADC相比，靶向表达Ag1的各种癌细胞的肽基喜树碱(DAR＝8)的体外评估
表6A：肾癌细胞(786-O)、胰腺癌细胞(BxPC3)、肝癌细胞(HepG2)、MDR(-)和MDR(+)急性早幼粒细胞白血病细胞(分别为HL-60和HL60/RV)和霍奇金淋巴瘤细胞(L540cy)。
表6B：多发性骨髓瘤细胞(MM.R1)、急性髓细胞性白血病细胞(MOLM13)、伯基特淋巴瘤细胞(Ramos)、黑素瘤细胞(SK-MEL-5)和B-淋巴细胞癌细胞(SU-DHL-4和U266)。
表6A
Figure BDA0002712615540001562
Figure BDA0002712615540001571
表6B
Figure BDA0002712615540001572
Figure BDA0002712615540001581
表7：喜树碱化合物作为游离药物的细胞毒性效能。
表7A：肾癌细胞(786-O)、胰腺癌细胞(BxPC3)、肝癌细胞(HepG2)、MDR(-)和MDR(+)急性早幼粒细胞白血病细胞(分别为HL-60和HL60/RV)、霍奇金淋巴瘤细胞(L540cy)和多发性骨髓瘤细胞(MM.1R)。
表7B：急性髓细胞性白血病细胞(MOLM-13)、伯基特淋巴瘤细胞(Ramos)、黑素瘤细胞(SK-MEL-5)和B-淋巴细胞癌细胞(SU-DHL-4和U266)。
++++IC50在0.1至＜1nM之间，+++IC50在1至≤10nM之间，++IC50在＞10nM至≤100nM之间，+IC50在＞100nM至≤1000nMm之间，
Figure BDA0002712615540001582
IC50＞1000nM。
表7A
Figure BDA0002712615540001591
Figure BDA0002712615540001601
表7B
Figure BDA0002712615540001602
Figure BDA0002712615540001611
Figure BDA0002712615540001621
体内模型方法
所有实验均根据动物护理和使用委员会在实验室动物护理评估和鉴定协会完全认可的设施中进行。在786-O、L540cy和Karpas/Karpas-BVR、DelBVR、Karpas 299、L428、DEL-15和L82异种移植模型中进行了功效实验。将肿瘤细胞以细胞悬液形式皮下植入免疫受损的SCID或裸鼠中。植入肿瘤后，当平均肿瘤体积达到约100mm3时将小鼠随机分成研究组(每组5只小鼠)。ADC或对照经由腹膜内注射给药一次。与抗体附连的药物-连接子的平均数目在ADC旁边的括号中指示(在本文中也称为药物-抗体比率(DAR)数，例如DAR4、DAR8等)。使用公式(L x W2)/2确定肿瘤体积随时间的变化。当肿瘤体积达到750mm3时，对动物实施安乐死。在植入后10-12周后，将表现出持久消退的小鼠终止。
对动物植入L540cy细胞。7天后，将动物分成平均肿瘤大小为100mm3的组，然后用单剂量的喜树碱ADC cAC10-Ex_8-1a(4)或cAC10-Ex_4-1(4)处理，剂量为3或10mg/kg。在另一个实验中，用单剂量的喜树碱ADC cAC10-Ex_4-1(8)或cAC10-Ex_4-3(8)处理，剂量为1或3mg/kg。在研究过程中评估动物的肿瘤大小和生命体征。结果示于图1A和1B中。
对动物植入786-O细胞。在第10天，将动物分成平均肿瘤大小为100mm3的组，然后用单剂量的喜树碱ADC cAC10-Ex_8-1a(4)或cAC10-Ex_4-1(4)处理，剂量为10mg/kg。在研究过程中评估动物的肿瘤大小和生命体征。结果示于图2中。
对动物植入CD30+Karpas299和CD30-Karpas299-本妥昔单抗抗性(Karpas299-BVR)细胞的1:1混合物。8天后，将动物分成平均肿瘤大小为100mm3的组，然后用单剂量的喜树碱ADC cAC10-Ex_8-1a(4)或cAC10-Ex_4-1(4)处理，剂量为10mg/kg。在另一个实验中，用单剂量的喜树碱ADC cAC10-Ex_8-1a(8)、cAC10-Ex_4-1(8)或cAC10-Ex_4-3(8)处理动物，剂量为3或10mg/kg。在研究过程中评估动物的肿瘤大小和生命体征。结果示于图3A-3C中。
对动物植入DelBVR细胞。在第7天，将动物分成平均肿瘤大小为100mm3的组，然后用单剂量的喜树碱ADC cAC10-Ex_4-1(8)、cAC10-Ex_4-3(8)、cAC10-Ex_4-4(8)或cAC10-Ex_4-5(8)处理，剂量为0.3或1mg/kg。在研究过程中评估动物的肿瘤大小和生命体征。结果示于图4中。
对动物植入DelBVR细胞。在第7天，将动物分成平均肿瘤大小为100mm3的组，然后用单剂量的喜树碱ADC cAC10-Ex_4-1(4)或cAC10-Ex_4-1(8)处理，剂量为1或2mg/kg，或者用单剂量的喜树碱ADC cAC10-Ex_4-3(4)或cAC10-Ex_4-3(8)处理，剂量为0.6或1mg/kg。在研究过程中评估动物的肿瘤大小和生命体征。结果示于图5中。
对动物植入Karpas299细胞。7天后，将动物分成平均肿瘤大小为100mm3的组，然后用单剂量的非结合型对照h00-Ex_4-3(8)或用喜树碱ADC cAC10-Ex_4-3(8)以单剂量或多剂量处理，剂量为1、3或10mg/kg。在研究过程中评估动物的肿瘤大小和生命体征。结果示于图6中。
对动物植入L428细胞。7天后，将动物分成平均肿瘤大小为100mm3的组，然后用喜树碱ADC cAC10-Ex_4-3(8)以单剂量或多剂量处理，剂量为1、3或10mg/kg。在研究过程中评估动物的肿瘤大小和生命体征。结果示于图7中。
对动物植入DEL-15细胞。7天后，将动物分成平均肿瘤大小为100mm3的组，然后用单剂量的喜树碱ADC cAC10-Ex_4-3(8)处理，剂量为0.1、0.3或1mg/kg。在研究过程中评估动物的肿瘤大小和生命体征。结果示于图8中。
对动物植入L82细胞。7天后，将动物分成平均肿瘤大小为100mm3的组，然后用单剂量的喜树碱ADC cAC10-Ex_4-1(8)处理，剂量为1mg/kg。在研究过程中评估动物的肿瘤大小和生命体征。结果示于图9中。
图1-9中的数据表明，cAC10-Ex_4-1、cAC10-Ex_4-3、cAC10-Ex_4-4和cAC10-Ex_4-5ADC对所测试的模型均显示出体内抗肿瘤活性。图1-9中的数据还表明，与cAC10-Ex_8-1aADC相比，cAC10-Ex_4-1和cAC10-Ex_4-3ADC显示出改善的体内效能，包括在Karpas/KarpasBVR旁观者模型中改善的活性(如图3A-3C中所示)。
ADC血浆稳定性测定
将所有ADC储备液标准化为2.5mg/mL。使用前将柠檬酸化小鼠(Balb C)的2.5mL单次使用等分试样保存在-80℃下。如下制备ADC在小鼠血浆中的储备溶液。ADC(50μg)在200μL血浆中(每个时间点,0.25mg/mL)，最终PBS浓度为13.85。将血浆样品在37摄氏度下孵育6小时、1天、3天和7天的时间点，并一式两份采样。在每个时间点后，将样品保存在-80摄氏度下直到对其进行分析。制备IgSelect在1XPBS中的50％浆液。对于每个时间点的样品，向3uM滤板添加50μL IgSelect浆液，并施加真空以除去上清液。洗涤树脂(2X1mL 1X PBS)，并在每次洗涤后施加真空。施加样品(180uL)，并在4摄氏度下振摇滤板(1200rpm)1小时。然后施加真空以除去血浆。用1mL PBS+50mM NaCl、1mL PBS和1mL水洗涤树脂，并在每次洗涤后施加真空。然后在Waters 350μL收集板上方将样品板在500xg下离心2分钟。通过用50μL GlypH3(2x50uL)处理从树脂洗脱ADC，在4℃下以500rpm混合2分钟，在500xg下离心3分钟到350μL 96孔板中，每个孔含有10μL 1M的Tris pH7.4缓冲液。使用UV-Vis酶标仪测定ADC浓度。使用每个样品1μL PNGase将样品去糖基化并在37摄氏度下孵育1小时。通过添加12μL100mM的DTT还原每个ADC并在37摄氏度下孵育15分钟。最后，使用15min PLRP-MS方法分析样品(10或50μL注射)以评估轻链和重链组成来量化每个时间点的载药量。如图10中所示，相对于基于Ex_8-1a和Ex_8-1b的ADC，基于Ex_4-1的ADC在小鼠血浆中显示出改善的离体药物-连接子稳定性，从而有助于改善体内活性。
ADC PK分析实验方法
此程序描述了用于定量啮齿动物K2EDTA血浆中的总人IgG的方法。
该方法使用生物素缀合的鼠抗人轻链κmAb(SDIX)作为捕获试剂，并使用与Alexafluor-647缀合的相同抗体作为检测试剂，来定量人抗体和/或抗体-药物缀合物测试物作为K2EDTA啮齿动物血浆中的总抗体(TAb)。使用GyroLab xPlore平台进行测定，该平台利用含有微流控结构的圆盘，该圆盘具有纳升规模的链霉亲和素包被珠柱，配体结合测定将在其上进行。简言之，根据需要，用幼龄混养啮齿动物K2EDTA血浆稀释研究样品，然后将其与校准物、对照和血浆空白液一起用Rexxip-HX缓冲液以1:10的最低要求稀释度(MRD)稀释，然后加载到96-孔样品板中。向96-孔试剂板中加入在具有Tween-20的pH 7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS-T)中的1ug/mL生物素-抗人κ捕获试剂、在Rexxip F缓冲液中的25nM AF647-抗人kappa检测试剂和PBS-T清洗缓冲液，将两个板均密封并加到仪器中。在GyroLab Control软件中建立运行文件，并将样品模板导出到Excel以允许输入样品名称和稀释系数。然后，在开始运行之前，将该模板导入回GyroLab Control中。测定按特定顺序进行：首先将生物素化的捕获试剂施加到BioAffy1000 CD，用PBS-T冲洗圆盘，然后添加经稀释的血浆空白液、标准物、对照和样品。在随后的PBS-T冲洗后，施加AF647-缀合的检测试剂。在最终的PBS-T冲洗后，用激光诱导荧光检测(激发波长：635nm)读取圆盘的每个珠柱。使用GyrolabEvaluator软件对在1％PMT下检测到的响应进行5-参数逻辑回归(5-PL)以将荧光响应转换为样品中存在的ng/mL总抗体。
啮齿动物K2EDTA血浆中总人IgG的定量的测定范围为：对于未缀合的抗体测试物，22.9ng/mL(LLOQ)至50,000ng/mL(ULOQ)；对于ADC，22.9ng/mL(LLOQ)至100,000ng/mL(ULOQ)。质量控制水平设定为80.0ng/mL(LQC)、800ng/mL(MQC)、8,000ng/mL(HQC2)和40,000ng/mL(HQC1)。
将喜树碱(DAR8)ADC在小鼠血浆(Balb C)中于37摄氏度下孵育。在6小时、24小时、72小时和7天时对血浆采样。用IgSelect从血浆分离ADC，用PNGase去糖基化并用二硫苏糖醇还原。通过PLRP-MS评估ADC重链和轻链以量化每个时间点的载药量。
给大鼠注射1mg/kg的亲本IgG或IgG-喜树碱Ex_4-1和Ex_8a ADC。将按时间表抽血的样品经过处理，并经由生物素缀合的鼠抗人轻链κmAb和链霉亲和素包被珠从血浆捕获人IgG抗体和ADC。使用AF647-抗人κ检测试剂经由ELISA定量人IgG抗体和ADC。如图11中所示，相对于基于Ex_8-1a的ADC，基于Ex_4-1的ADC表现出低的被Kupffer细胞(肝巨噬细胞)的摄取。该测定法是测定通过肝脏的体内ADC清除的代理方法，并表明基于Ex_4-1的ADC的清除率低。
Kupffer细胞体外测定法
将在Kupffer细胞测定法中测试的ADC用荧光染料和细胞毒性马来酰亚胺药物-连接子双重标记。首先将抗体与荧光染料(AlexaFluor 647NHS酯,ThermoFisher,部件#A20006)缀合至平均DAR＝4。然后使用TCEP将染料标记的抗体还原并与马来酰亚胺药物-连接子缀合至平均DAR＝8。将经纯化的大鼠Kupffer细胞(Life Technologies Corp.部件#RTKCCS)以50,000细胞/孔的密度接种在Ⅰ型胶原包被的96孔板(ThermoFisher,部件#A1142803)上并在添加ADC之前让粘附于板24-48小时。将Kupffer细胞与浓度为0.1mg/mL的ADC在细胞培养基中孵育24小时。孵育24小时后，除去培养基，将细胞与Versene分离，转移到圆锥形底板并通过在离心机中于400xg下离心5分钟沉淀细胞来洗涤一次，然后重新悬浮于PBS+2％BSA中。使用配备有ForeCyt软件的Intellicyte iQue筛选器通过每种处理条件的平均荧光强度(MFI)来计数和测量被摄取到细胞中的ADC。如图12中所示，相对于基于Ex_8-1a的ADC(DAR8)，基于Ex_4-1的ADC(DAR8)表现出低的被Kupffer细胞(肝巨噬细胞)的摄取。该测定法是测定通过肝脏的体内ADC的清除的代理方法，并表明基于Ex_4-1的ADC的清除率低。
使用疏水相互作用色谱法(HIC)进行疏水性研究
在25℃下向Butyl HIC NPR柱(2.5μm,4.6mm x 3.5mm,Tosoh Bioscience,PN14947)上注入裸cAC10、cAC10-Ex_4-1(8)和cAC10-Ex_8-1a(8)(约75μg)并用0-100％B以0.8mL/min的流率进行12分钟线性梯度洗脱(流动相A，1.5M的硫酸铵在25mM的磷酸钾中，pH7；流动相B，25mM的磷酸钾，pH 7，25％异丙醇)。使用配备有多波长检测器和Empower3软件的Waters Alliance HPLC系统来解析和定量具有不同药物/抗体比率的抗体种类。如图13中所示，与cAC10-Ex_8-1a ADC或裸cAC10抗体相比，cAC10-Ex_4-1ADC显示出降低的疏水性。ADC疏水性是导致ADC清除和非特异性ADC摄取的原因。
药物释放研究
在ALCL细胞系Karpas 299和HL细胞系L540cy中研究自cAC10-Ex_4-3ADC(DAR 8)的体外药物释放。使用非结合型h00-Ex_4-3ADC(DAR 8)作为对照。以5E6个细胞/mL(总共5E6个细胞)将Karpas 299(CD30阳性,T-细胞淋巴瘤)和L540cy(CD30阳性,霍奇金淋巴瘤)细胞接种在新鲜的培养基(分别为RPMI+10％FBS和RPMI+20％FBS)中。接种后，以10ng/mL培养基对细胞给予cAC10-Ex_4-3ADC(DAR 8)和h00-Ex_4-3(DAR 8)。将经处理的细胞在37℃下孵育并在给药后24小时采集。采集后，沉淀细胞，用PBS洗涤并在少量PBS中冷冻。对于分析质谱(LC-MS/MS)样品制备，将细胞在含有内标的冷甲醇中萃取并在冰上孵育。孵育后，将样品离心，除去上清液(含有提取的小分子)并在氮气下干燥。将干燥后的样品在含有0.1％甲酸的95％水中重构，然后注入到与Sciex 6500+三重四极杆质谱仪相连的WatersAcquity BEH C18(1.7μm,2.1x50mm)柱上。如图14A和14B中所示，在用cAC10-Ex_4-3ADC(DAR 8)处理的细胞中存在游离药物化合物4和化合物4b，但在用h00-Ex_4-3ADC(DAR 8)处理的细胞中检测不到。
序列表
Figure BDA0002712615540001681
Figure BDA0002712615540001691
Figure IDA0002712615590000011
Figure IDA0002712615590000021
Figure IDA0002712615590000031
Figure IDA0002712615590000041
Figure IDA0002712615590000051
Figure IDA0002712615590000061
Figure IDA0002712615590000071
Figure IDA0002712615590000081
Figure IDA0002712615590000091
Figure IDA0002712615590000101
Figure IDA0002712615590000111

Claims (143)

1.一种具有下式的喜树碱缀合物：
L-(Q-D)p (I)
或其药学上可接受的盐，其中
L为配体单元；
Q为具有选自以下的式的连接子单元：
-Z-A-S*-RL-；-Z-A-LP(S*)-RL-；-Z-A-S*-RL-Y-；或-Z-A-LP(S*)-RL-Y-，
其中Z为延伸子单元，A为键或接头单元；LP为并行接头单元；S*为键或分配剂；
RL为包含2至8个氨基酸的肽；并且
Y为间隔子单元，
D为选自以下的药物单元：
Figure FDA0002712615530000011
其中
RB为选自以下的成员：-H、-(C1-C4)烷基-OH、-(C1-C4)烷基-O-(C1-C4)烷基-NH2、-C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、苯基和苯基C1-C4烷基；
RF和RF’各自为独立选自以下的成员：H、C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C2-C6杂烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-、C1-C8氨基烷基C(O)-、C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环烷基、C3-C10杂环烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基；或者RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元环，所述取代基选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2；
并且其中RB、RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代；并且
p为约1至约16；
其中Q通过CPT2或CPT5上存在的羟基或胺基团中的任一个附连。
2.权利要求1所述的喜树碱缀合物，其中D具有式CPT2。
3.权利要求1或2所述的喜树碱缀合物，其中RB为-(C1-C4)烷基-OH或-(C1-C4)烷基-O-(C1-C4)烷基-NH2。
4.权利要求3所述的喜树碱缀合物，其中RB为-CH2-OH或-CH2-O-CH2-NH2。
5.权利要求1或2所述的喜树碱缀合物，其中RB为选自以下的成员：C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、苯基和苯基C1-C4烷基。
6.权利要求1或2所述的喜树碱缀合物，其中RB为C1-C8烷基或C1-C8卤代烷基。
7.权利要求1所述的喜树碱缀合物，其中D具有式CPT5。
8.权利要求1或7所述的喜树碱缀合物，其中所述缀合物的所述-Q-D组分具有选自(CPT5iN)、(CPT5iiN)、(CPT5iiiN)、(CPT5ivN)、(CPT5vN)、(CPT5viN)、(CPT5iO)、(CPT5iiO)、(CPT5iiiO)、(CPT5ivO)、(CPT5vO)和(CPT5viO)的式：
Figure FDA0002712615530000031
Figure FDA0002712615530000041
9.权利要求8所述的喜树碱缀合物，其中RF和RF’各自独立地选自H、C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-和C1-C8氨基烷基C(O)-；并且
其中RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代。
10.权利要求8所述的喜树碱缀合物，其中RF和RF’各自独立地选自C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环烷基、C3-C10杂环烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基，
并且其中RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分各自独立地被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代。
11.权利要求7或8所述的喜树碱缀合物，其中RF’为H。
12.权利要求8所述的喜树碱缀合物，其中所述喜树碱缀合物的所述-Q-D组分具有选自以下的式：(CPT5iN)、(CPT5iiN)、(CPT5iiiN)、(CPT5ivN)、(CPT5vN)和(CPT5viN)。
13.权利要求12所述的喜树碱缀合物，其中所述缀合物的所述-Q-D组分具有选自(CPT5iN)、(CPT5iiN)和(CPT5viN)的式。
14.权利要求12或13所述的喜树碱缀合物，其中RF选自-H、C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-和C1-C8氨基烷基C(O)-；
并且其中RF的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代。
15.权利要求12或13所述的喜树碱缀合物，其中RF选自C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环烷基、C3-C10杂环烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基，
并且其中RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分各自独立地被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代。
16.权利要求1至15中任一项所述的喜树碱缀合物，其中S*为键并且Q为-Z-A-RL-或-Z-A-RL-Y-。
17.权利要求1至15中任一项所述的喜树碱缀合物，其中S*为分配剂，并且Q为
-Z-A-S*-RL-；-Z-A-LP(S*)-RL-；-Z-A-S*-RL-Y-；或-Z-A-LP(S*)-RL-Y-。
18.权利要求17所述的喜树碱缀合物，其中S*为PEG单元。
19.权利要求18所述的喜树碱缀合物，所述所述PEG单元具有下式：
Figure FDA0002712615530000061
其中左侧的波浪线表示与A的附连位点，右侧的波浪线表示与RL的附连位点，并且b为2至20的整数，或者为2、4、8或12。
20.权利要求19所述的喜树碱缀合物，其中所述PEG单元具有下式：
Figure FDA0002712615530000062
其中左侧的波浪线表示与A的附连位点，右侧的波浪线表示与RL的附连位点，并且b为2至20的整数，或者为2、4、8或12。
21.权利要求17所述的喜树碱缀合物，其中Q具有式-Z-A-LP(S*)-RL-或-Z-A-LP(S*)-RL-Y-，并且S*为包含2、4、8或12个-CH2CH2O-亚单元和为C1-4烷基或C1-4烷基-CO2H的PEG单元端帽基团的PEG单元。
22.权利要求21所述的喜树碱缀合物，其中S*为下式：
Figure FDA0002712615530000063
其中波浪线表示与所述并行接头单元(LP)的附连位点，并且b为2至20的整数，或者为2、4、8或12。
23.权利要求22所述的喜树碱缀合物，其中S*为下式：
Figure FDA0002712615530000071
其中波浪线表示与所述并行接头单元(LP)的附连位点，并且b为2至20的整数，或者为2、4、8或12。
24.权利要求21至23中任一项所述的喜树碱缀合物，其中LP为赖氨酸。
25.权利要求24所述的喜树碱缀合物，其中LP为下式：
Figure FDA0002712615530000072
其中波浪线表示与所述分配剂的附连位置并且星号表示与A和RL的附连位置。
26.权利要求1至25中任一项所述的喜树碱缀合物，其中Z具有式Za：
Figure FDA0002712615530000073
其中星号表示与所述配体单元(L)的附连位置；
波浪线表示与所述接头单元(A)的附连位置；并且
R17为-C1-C10亚烷基-、C1-C10亚杂烷基-、-C3-C8碳环基-、-O-(C1-C8亚烷基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、C1-C10亚杂烷基-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-C(＝O)-、-O-(C1-C8亚烷基)-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-NH-、C1-C10亚杂烷基-NH-、-C3-C8碳环基-NH-、-O-(C1-C8亚烷基)-NH-、-亚芳基-NH-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-NH-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-NH-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C3-C8杂环基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-NH-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-S-、C1-C10亚杂烷基-S-、-C3-C8碳环基-S-、-O-(C1-C8亚烷基)-S-、-亚芳基-S-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-S-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-S-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-S-、-C3-C8杂环基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-S-或-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-S-；
其中R17任选地被碱性单元(BU)所取代，所述碱性单元为–(CH2)xNH2、–(CH2)xNHRa或–(CH2)xNRa 2；
其中x为1-4的整数；并且
每个Ra独立地选自C1-6烷基和C1-6卤代烷基，或者两个Ra基团与它们所附连的氮组合形成4-至6-元杂环烷基环、或者氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基团。
27.权利要求26所述的喜树碱缀合物，其中R17为-(C1-C5)亚烷基-C(＝O)-，其中R17的所述亚烷基部分任选地被所述碱性单元(BU)所取代。
28.权利要求26或27所述的喜树碱缀合物，其中Z为：
Figure FDA0002712615530000091
29.权利要求28所述的喜树碱缀合物，其中Z为：
Figure FDA0002712615530000092
30.权利要求29所述的喜树碱缀合物，其中Z为：
Figure FDA0002712615530000093
31.权利要求1至30中任一项所述的喜树碱缀合物，其中A为键。
32.权利要求1至31中任一项所述的喜树碱缀合物，其中RL为二肽、三肽或四肽。
33.权利要求32所述的喜树碱缀合物，其中RL为二肽。
34.权利要求32所述的喜树碱缀合物，其中RL为三肽。
35.权利要求32所述的喜树碱缀合物，其中RL为gly-gly、gly-gly-gly、gly-gly-gly-gly、val-gly-gly、val-cit-gly、val-gln-gly、val-glu-gly、phe-lys-gly、leu-lys-gly、gly-val-lys-gly、val-lys-gly-gly、val-lys-gly、val-lys-ala、val-lys-leu、leu-leu-gly、gly-gly-phe-gly、gly-gly-phe-gly-gly、val-gly或val-lys-β-ala。
36.权利要求34所述的喜树碱缀合物，其中RL为具有式：AA1-AA2-AA3的三肽，其中AA1、AA2和AA3各自独立地为氨基酸，其中AA1与-NH-附连而AA3与S*附连。
37.权利要求36所述的喜树碱缀合物，其中AA3为gly或β-ala。
38.权利要求37所述的喜树碱缀合物，其中RL为val-lys-gly，其中val与-NH-附连而gly与S*附连。
39.权利要求1至38中任一项所述的喜树碱缀合物，其中Y为下式：
Figure FDA0002712615530000101
40.权利要求1至39中任一项所述的喜树碱缀合物，其中p为1至16，或为2至8、或为2，或为4，或为8。
41.权利要求1所述的喜树碱缀合物，其具有式(IB)：
Figure FDA0002712615530000102
或其药学上可接受的盐，其中：
S*为PEG单元；并且
RL为可释放肽连接子，其为包含2至8个氨基酸的肽。
42.权利要求41所述的喜树碱缀合物，其中所述PEG单元具有式：
Figure FDA0002712615530000103
其中左侧的波浪线表示与-C(O)-的附连位点，右侧的波浪线表示与RL的附连位点，并且b为2至20的整数，或者为2、4、8或12。
43.权利要求41至42中任一项所述的喜树碱缀合物，其中RL为具有式：AA1-AA2-AA3的三肽，其中AA1、AA2和AA3各自独立地为氨基酸，其中AA1与-NH-附连而AA3与S*附连。
44.权利要求43所述的喜树碱缀合物，其中AA3为gly或β-ala。
45.权利要求44所述的喜树碱缀合物，其中AA3为gly。
46.权利要求45所述的喜树碱缀合物，其中RL为val-lys-gly，其中val与-NH-附连而gly与S*附连。
47.权利要求1所述的喜树碱缀合物，其具有式(IC)：
Figure FDA0002712615530000111
或其药学上可接受的盐；
其中
y为1、2、3或4，或者为1或4；并且
z为2至12的整数，或者为2、4、8或12；
并且p为1-16。
48.权利要求47所述的喜树碱缀合物，其中p为4、5、6、7、8、9或10，或者p为4或8。
49.权利要求1所述的喜树碱缀合物，其具有式(IIA)：
Figure FDA0002712615530000121
或其药学上可接受的盐，其中S*为PEG单元。
50.权利要求49所述的喜树碱缀合物，其具有式(IIB)：
Figure FDA0002712615530000122
或其药学上可接受的盐。
51.权利要求49或50所述的喜树碱缀合物，其具有式(IIC)：
Figure FDA0002712615530000123
或其药学上可接受的盐。
52.权利要求49或50所述的喜树碱缀合物，其具有式(IID)：
Figure FDA0002712615530000131
或其药学上可接受的盐，
其中
RL为选自以下的肽：gly-gly-gly-gly、val-lys-β-ala、val-gln-gly、val-lys-ala、phe-lys-gly、val-lys-gly-gly、gly-gly、val-lys-gly、val-gly-gly、leu-leu-gly、leu-lys-gly、val-glu-gly、gly-gly-gly、val-asp-gly、gly-lys-val、val-lys、val-gly和gly-val-lys-gly；并且
x为2至20的整数，或者为2、4、8或12。
53.权利要求1至52中任一项所述的喜树碱缀合物，其中所述配体单元为抗体或其抗原结合片段。
54.权利要求53所述的喜树碱缀合物，其中所述抗体为单克隆抗体或其抗原结合片段。
55.权利要求53或54所述的喜树碱缀合物，其中所述抗体为cAC10抗CD30抗体或其抗原结合片段。
56.一种具有下式的喜树碱-连接子化合物：
Q’-D，
或其药学上可接受的盐，其中
Q’为具有选自以下的式的连接子单元前体：
Z’-A-S*-RL-；Z’-A-LP(S*)-RL-；Z’-A-S*-RL-Y-；Z’-A-LP(S*)-RL-Y-；
其中
Z’为延伸子单元前体；
A为键或接头单元；
S*为键或分配剂；
LP为并行接头单元；
RL为包含肽的可释放肽连接子，所述肽包含2至8个氨基酸；并且
Y为间隔子单元，
D为选自以下的药物单元：
Figure FDA0002712615530000141
其中
RB为选自以下的成员：-H、-(C1-C4)烷基-OH、-(C1-C4)烷基-O-(C1-C4)烷基-NH2、-C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、苯基和苯基C1-C4烷基；
RF和RF’各自为独立选自以下的成员：H、C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-、C1-C8氨基烷基C(O)-、C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环烷基、C3-C10杂环烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基；或者RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成具有0至3个取代基的5-、6-或7-元环，所述取代基选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2；
并且其中RB、RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代，
其中Q通过CPT2或CPT5上存在的羟基或胺基团中的任一个附连。
57.权利要求56所述的喜树碱-连接子化合物，其中D具有式CPT2。
58.权利要求56或57所述的喜树碱-连接子化合物，其中RB为-(C1-C4)烷基-OH或-(C1-C4)烷基-O-(C1-C4)烷基-NH2。
59.权利要求58所述的喜树碱-连接子化合物，其中RB为-CH2-OH或-CH2-O-CH2-NH2。
60.权利要求56或57所述的喜树碱-连接子化合物，其中RB为选自以下的成员：C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、苯基和苯基C1-C4烷基。
61.权利要求56或57所述的喜树碱-连接子化合物，其中RB为C1-C8烷基或C1-C8卤代烷基。
62.权利要求56所述的喜树碱-连接子化合物，其中D具有式CPT5。
63.权利要求56或62所述的喜树碱-连接子化合物，其中Q’-D具有选自(CPT5iN)、(CPT5iiN)、(CPT5iiiN)、(CPT5ivN)、(CPT5vN)、(CPT5viN)、(CPT5iO)、(CPT5iiO)、(CPT5iiiO)、(CPT5ivO)、(CPT5vO)和(CPT5viO)的式：
Figure FDA0002712615530000151
Figure FDA0002712615530000161
64.权利要求63所述的喜树碱-连接子化合物，其中RF和RF’各自独立地选自H、C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-和C1-C8氨基烷基C(O)-；并且
其中RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代。
65.权利要求63所述的喜树碱-连接子化合物，其中RF和RF’各自独立地选自C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环烷基、C3-C10杂环烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基，
并且其中RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分各自独立地被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代。
66.权利要求62或63所述的喜树碱-连接子化合物，其中RF’为H。
67.权利要求63所述的喜树碱-连接子化合物，其中Q’-D具有选自(CPT5iN)、(CPT5iiN)、(CPT5iiiN)、(CPT5ivN)、(CPT5vN)和(CPT5viN)的式。
68.权利要求67所述的喜树碱-连接子化合物，其中Q’-D具有选自(CPT5iN)、(CPT5iiN)和(CPT5viN)的式。
69.权利要求67或68所述的喜树碱-连接子化合物，其中RF选自-H、C1-C8烷基、C1-C8羟烷基、C1-C8氨基烷基、C1-C4烷基氨基C1-C8烷基、(C1-C4羟烷基)(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、二(C1-C4烷基)氨基C1-C8烷基、C1-C4羟烷基C1-C8氨基烷基、C1-C8烷基C(O)-、C1-C8羟烷基C(O)-和C1-C8氨基烷基C(O)-；
并且其中RF的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代。
70.权利要求67或68所述的喜树碱-连接子化合物，其中RF选自C3-C10环烷基、C3-C10环烷基C1-C4烷基、C3-C10杂环烷基、C3-C10杂环烷基C1-C4烷基、苯基、苯基C1-C4烷基、二苯基C1-C4烷基、杂芳基和杂芳基C1-C4烷基，
并且其中RF和RF’的环烷基、杂环烷基、苯基和杂芳基部分各自独立地被0至3个选自卤素、C1-C4烷基、OH、OC1-C4烷基、NH2、NHC1-C4烷基和N(C1-C4烷基)2的取代基取代。
71.权利要求56至70中任一项所述的喜树碱-连接子化合物，其中S*为键并且Q为-Z’-A-RL-或-Z’-A-RL-Y-。
72.权利要求56至70中任一项所述的喜树碱-连接子化合物，其中S*为分配剂，并且Q为
Z’-A-S*-RL-；Z’-A-LP(S*)-RL-；Z’-A-S*-RL-Y-；或Z’-A-LP(S*)-RL-Y-。
73.权利要求72所述的喜树碱-连接子化合物，其中S*为PEG单元。
74.权利要求73所述的喜树碱-连接子化合物，所述PEG单元具有下式：
Figure FDA0002712615530000181
其中左侧的波浪线表示与A的附连位点，右侧的波浪线表示与RL的附连位点，并且b为2至20的整数，或者为2、4、8或12。
75.权利要求74所述的喜树碱-连接子化合物，其中所述PEG单元具有式：
Figure FDA0002712615530000182
其中左侧的波浪线表示与A的附连位点，右侧的波浪线表示与RL的附连位点，并且b为2至20的整数，或者为2、4、8或12。
76.权利要求72所述的喜树碱-连接子化合物，其中Q’为式-Z’-A-LP(S*)-RL-或-Z’-A-LP(S*)-RL-Y-，并且S*为包含2、4、8或12个-CH2CH2O-亚单元和为C1-4烷基或C1-4烷基-CO2H的PEG单元端帽基团的PEG单元。
77.权利要求76所述的喜树碱-连接子化合物，其中S*为下式：
Figure FDA0002712615530000191
其中波浪线表示与所述并行接头单元(LP)的附连位点，并且b为2至20的整数，或者为2、4、8或12。
78.权利要求77所述的喜树碱-连接子化合物，其中S*为下式：
Figure FDA0002712615530000192
其中波浪线表示与所述并行接头单元(LP)的附连位点，并且b为2至20的整数，或者为2、4、8或12。
79.权利要求76至78中任一项所述的喜树碱-连接子化合物，其中LP为赖氨酸。
80.根据权利要求79所述的喜树碱-连接子化合物，其中LP为下式：
Figure FDA0002712615530000193
其中波浪线表示与所述分配剂的附连位置，并且星号表示与A和RL的附连位置。
81.权利要求56至80中任一项所述的喜树碱-连接子化合物，其中Z’具有式Za：
Figure FDA0002712615530000201
波浪线表示与所述接头单元(A)的附连位置；并且
R17为-C1-C10亚烷基-、C1-C10亚杂烷基-、-C3-C8碳环基-、-O-(C1-C8亚烷基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、C1-C10亚杂烷基-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-C(＝O)-、-O-(C1-C8亚烷基)-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-NH-、C1-C10亚杂烷基-NH-、-C3-C8碳环基-NH-、-O-(C1-C8亚烷基)-NH-、-亚芳基-NH-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-NH-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-NH-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C3-C8杂环基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-NH-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-S-、C1-C10亚杂烷基-S-、-C3-C8碳环基-S-、-O-(C1-C8亚烷基)-S-、-亚芳基-S-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-S-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-S-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-S-、-C3-C8杂环基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-S-或-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-S-；
其中R17任选地被碱性单元(BU)所取代，所述碱性单元为–(CH2)xNH2、–(CH2)xNHRa或–(CH2)xNRa 2；
其中x为1-4的整数；并且
每个Ra独立地选自C1-6烷基和C1-6卤代烷基，或者两个Ra基团与它们所附连的氮组合形成4-至6-元杂环烷基环、或者氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基团。
82.权利要求81所述的喜树碱-连接子化合物，其中R17为-(C1-C5)亚烷基-C(＝O)-，其中R17的亚烷基部分任选地被所述碱性单元(BU)所取代。
83.权利要求81或82所述的喜树碱-连接子化合物，其中Z’具有式：
Figure FDA0002712615530000211
其中
与羰基相邻的波浪线描绘与A的附连点；并且
BU为碱性单元，其为-(CH2)xNH2、-(CH2)xNHRa或-(CH2)xN(Ra)2；
其中x为1至4的整数；并且
每个Ra独立地为C1-6烷基或C1-6卤代烷基，或者两个Ra基团与它们所附连的氮组合形成4-或6-元杂环烷基环、或者氮杂环丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基团。
84.权利要求83所述的喜树碱-连接子化合物，其中Z’为：
Figure FDA0002712615530000212
其中与羰基相邻的波浪线描绘与A的附连点。
85.权利要求84所述的喜树碱-连接子化合物，其中Z’为：
Figure FDA0002712615530000221
86.权利要求56至85中任一项所述的喜树碱-连接子化合物，其中A为键。
87.权利要求56至86中任一项所述的喜树碱-连接子化合物，其中RL为二肽、三肽或四肽。
88.权利要求87所述的喜树碱-连接子化合物，其中RL为二肽。
89.权利要求87所述的喜树碱-连接子化合物，其中RL为三肽。
90.权利要求87中任一项所述的喜树碱-连接子化合物，其中RL为gly-gly、gly-gly-gly、gly-gly-gly-gly、val-gly-gly、val-cit-gly、val-gln-gly、val-glu-gly、phe-lys-gly、leu-lys-gly、gly-val-lys-gly、val-lys-gly-gly、val-lys-gly、val-lys-ala、val-lys-leu、leu-leu-gly、gly-gly-phe-gly、gly-gly-phe-gly-gly、val-gly或val-lys-β-ala。
91.权利要求89所述的喜树碱-连接子化合物，其中RL为具有式：AA1-AA2-AA3的三肽，其中AA1、AA2和AA3各自独立地为氨基酸，其中AA1与-NH-附连而AA3与S*附连。
92.权利要求91所述的喜树碱-连接子化合物，其中AA3为gly或β-ala。
93.权利要求92所述的喜树碱-连接子化合物，其中AA3为gly。
94.权利要求56至93中任一项所述的喜树碱-连接子化合物，其中Y为下式：
Figure FDA0002712615530000222
95.权利要求56所述的喜树碱-连接子化合物，其具有式：
Figure FDA0002712615530000231
或其药学上可接受的盐，其中：
S*为PEG单元；并且
RL为可释放肽连接子，其为包含2至8个氨基酸的肽。
96.权利要求95所述的喜树碱-连接子化合物，其中所述PEG单元具有式：
Figure FDA0002712615530000232
其中左侧的波浪线表示与-C(O)-的附连位点，右侧的波浪线表示与RL的附连位点，并且b为2至20的整数，或者为2、4、8或12。
97.权利要求95至96中任一项所述的喜树碱-连接子化合物，其中RL为三肽。
98.权利要求95至97中任一项所述的喜树碱-连接子化合物，其中RL为具有式：AA1-AA2-AA3的三肽，其中AA1、AA2和AA3各自独立地为氨基酸，其中AA1与-NH-附连而AA3与S*附连。
99.权利要求98所述的喜树碱-连接子化合物，其中AA3为gly或β-ala。
100.权利要求97所述的喜树碱-连接子化合物，其中RL为val-lys-gly，其中val与-NH-附连而gly与S*附连。
101.权利要求56所述的喜树碱-连接子化合物，其具有式(IC)：
Figure FDA0002712615530000233
或其药学上可接受的盐；
其中
y为1、2、3或4，或者为1或4；并且
z为2至12的整数，或者为2、4、8或12；
并且p为1至16。
102.权利要求101所述的喜树碱-连接子化合物，其中p为4、5、6、7、8、9或10，或者p为4或8。
103.权利要求56所述的喜树碱-连接子化合物，其具有式：
Figure FDA0002712615530000241
或其药学上可接受的盐。
104.权利要求56所述的喜树碱-连接子化合物，其具有式：
Figure FDA0002712615530000242
或其药学上可接受的盐。
105.权利要求56所述的喜树碱-连接子化合物，其具有式：
Figure FDA0002712615530000243
或其药学上可接受的盐。
106.权利要求56所述的喜树碱-连接子化合物，其具有式：
Figure FDA0002712615530000251
或其药学上可接受的盐，其中
RL为选自以下的肽：gly-gly-gly-gly、val-lys-β-ala、val-gln-gly、val-lys-ala、phe-lys-gly、val-lys-gly-gly、gly-gly、val-lys-gly、val-gly-gly、leu-leu-gly、leu-lys-gly、val-glu-gly、gly-gly-gly、val-asp-gly、val-lys、val-gly和gly-val-lys-gly；并且
x为2至20的整数，或者为2、4、8或12。
107.权利要求56所述的喜树碱-连接子化合物，其具有式：
Figure FDA0002712615530000252
其中
x为2至20的整数，或者为2、4、8或12；并且
RL为选自以下的肽：gly-gly-gly-gly、val-lys-β-ala、val-gln-gly、val-lys-ala、phe-lys-gly、val-lys-gly-gly、gly-gly、val-lys-gly、val-gly-gly、leu-leu-gly、leu-lys-gly、val-glu-gly、gly-gly-gly、val-asp-gly、val-lys、val-gly和gly-val-lys-gly。
108.权利要求107所述的喜树碱-连接子化合物，其中x为4至12的整数。
109.权利要求56所述的喜树碱-连接子化合物，其具有式：
Figure FDA0002712615530000261
其中
x为2至20的整数，或者为2、4、8或12；并且
RL为选自以下的肽：gly-gly-gly-gly、val-lys-β-ala、val-gln-gly、val-lys-ala、phe-lys-gly、val-lys-gly-gly、gly-gly、val-lys-gly、val-gly-gly、leu-leu-gly、leu-lys-gly、val-glu-gly、gly-gly-gly、val-asp-gly、val-lys、val-gly和gly-val-lys-gly。
110.权利要求108或109所述的喜树碱-连接子化合物，其中RL为val-lys-gly。
111.下式的喜树碱化合物：
Figure FDA0002712615530000262
其中RF和RF’各自独立地为H、甘氨酰基、羟基乙酰基、乙基或2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基，或其中RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成5-、6-或7-元杂环烷基环。
112.权利要求111所述的喜树碱化合物，其中RF和RF’与各自附连的氮原子组合形成6-元环。
113.权利要求112所述的喜树碱化合物，其中所述6-元环为吗啉基或哌嗪基基团。
114.权利要求111所述的喜树碱化合物，其中RF’为H而RF为甘氨酰基、羟基乙酰基、乙基或2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基。
115.权利要求111所述的喜树碱化合物，其中RF’为H而RF包含脂族基团。
116.权利要求111所述的喜树碱化合物，其中RF’为H而RF包含芳基基团。
117.权利要求111所述的喜树碱化合物，其中RF’为H而RF包含酰胺基团。
118.权利要求111所述的喜树碱化合物，其中RF’为H而RF包含环氧乙烷基团。
119.权利要求111-118中任一项所述的喜树碱化合物，其中所述化合物选自化合物4、化合物5及表I和II中的化合物。
120.下式的喜树碱化合物：
Figure FDA0002712615530000271
或其药学上可接受的盐，
其中RB为-(C1-C4)烷基-OH、-(C1-C4)烷基-O-(C1-C4)烷基-NH2、-C1-C8烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C4烷基、苯基或苯基C1-C4烷基。
121.权利要求120所述的喜树碱化合物，其中RB包含C1-C8烷基。
122.权利要求121所述的喜树碱化合物，其中RB包含环丙基、戊基、己基、叔丁基或环戊基基团。
123.权利要求120-122中任一项所述的喜树碱化合物，其中所述化合物选自化合物6和表III中的化合物。
124.权利要求53至55中任一项所述的喜树碱缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的氨基酸序列。
125.权利要求124所述的喜树碱缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
126.权利要求124所述的喜树碱缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
127.权利要求124所述的喜树碱缀合物，其中所述抗体或包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
128.权利要求124至127中任一项所述的喜树碱缀合物，其具有式(IC)：
Figure FDA0002712615530000281
或其药学上可接受的盐；
其中
y为1、2、3或4，或者为1或4；并且
z为2至12的整数，或者为2、4、8或12；
并且p为1-16。
129.权利要求128所述的喜树碱缀合物，其中p为2、3、4、5、6、7、8、9或10，或者p为2、4或8。
130.权利要求53至55中任一项所述的喜树碱缀合物，其具有式：
Figure FDA0002712615530000291
或其药学上可接受的盐；
其中
p为2、4或8。
131.权利要求130所述的喜树碱缀合物，其中p为8。
132.一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至55和124至131中任一项的喜树碱缀合物或者权利要求111至123中任一项的喜树碱化合物。
133.权利要求132所述的方法，其中所述癌症为淋巴瘤、白血病或实体瘤。
134.权利要求132或权利要求133所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的另外的治疗剂、一种或多种化学治疗剂或放射疗法。
135.一种在有此需要的受试者中治疗自身免疫疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至55和124至131中任一项的喜树碱缀合物或者权利要求111至123中任一项的喜树碱化合物。
136.权利要求135所述的方法，其中所述自身免疫疾病为Th2淋巴细胞相关病症、Th1淋巴细胞相关病症或活化的B淋巴细胞相关病症。
137.一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括将癌症细胞与权利要求111至123中任一项所述的喜树碱化合物接触。
138.权利要求137所述的方法，其中所述癌症为淋巴瘤、白血病或实体瘤。
139.一种制备权利要求1至55和124至131中任一项的喜树碱缀合物的方法，其包括使抗体或其抗原结合片段与权利要求56至110中任一项的喜树碱-连接子化合物反应。
140.一种药物组合物，其包含权利要求1至55和124至131中任一项所述的喜树碱缀合物及药学上可接受的载体。
141.一种试剂盒，其包含权利要求1至55和124至131中任一项的喜树碱缀合物，任选地包含另外的治疗剂。
142.权利要求1至55和124至131中任一项所述的喜树碱缀合物或者权利要求111至123中任一项所述的喜树碱化合物用于治疗疾病或病症的用途。
143.权利要求1至55和124至131中任一项所述的喜树碱缀合物或者权利要求111至123中任一项所述的喜树碱化合物，以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂用于制备用于治疗疾病或病症的药剂的用途。
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