TW202426656A

TW202426656A - 生產醣蛋白組成物之方法

Info

Publication number: TW202426656A
Application number: TW112141961A
Authority: TW
Inventors: 瑪莉娜露薏絲波伊德; 克里斯蒂安克寧爵
Original assignee: 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Priority date: 2022-11-02
Filing date: 2023-11-01
Publication date: 2024-07-01
Also published as: AR130921A1; WO2024094457A1

Abstract

本發明涉及一種重組生產包含至少一種醣蛋白的醣蛋白組成物之方法，其包含以下步驟：在生物反應器中的培養基中培養表現該醣蛋白的重組宿主細胞，該生物反應器具有位於該生物反應器中且經組態以與該培養基實體接觸的 pH 測量裝置，其中 (a) 該培養係在無菌條件下進行，(b) 用該 pH 測量裝置所測量的 pH 值與該培養基之 pH 值相差 0.05 個單位或更少，以及 (c) 與其中藉由該 pH 測量裝置所測量的該 pH 值與該培養基中的該 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳相差多於 0.03 個單位之方法相比，該醣蛋白組成物中的至少一種醣基化變異體之相對含量具有降低的批次間變異性；以及由此生產該醣蛋白組成物。本發明進一步涉及藉由該方法生產的醣蛋白組成物，以及涉及用於基於二氧化碳的 pH 校準之方法用於改善批次間變異性之用途。

Description

生產醣蛋白組成物之方法

本發明涉及重組生產具有降低的批次間變異性的醣蛋白組成物之方法。本文揭露之方法包括 pH 測量步驟，其中所測量之 pH 值與培養基之 pH 值相差 0.05 個單位或更少，導致與其中藉由 pH 測量裝置測量的 pH 值與培養基中之 pH 值相差 0.05 個單位或更少的方法相比，醣蛋白組成物中的一種或多種醣基化變異體的降低的批次間變異性。

重組醣蛋白通常在真核表現系統中生產，因為真核細胞擁有必要的醣基化機制，亦即將糖部分接附至蛋白質上所需之酶。蛋白質上聚醣模式的變異對蛋白質功能有巨大影響。例如，蛋白質上之 N-連接聚醣的結構對多種特徵有影響，該等特徵包括細胞或生物體中蛋白質的蛋白酶敏感性、細胞內運輸、分泌、組織靶向、生物半衰期及抗原性。此等特徵中之一者或多者的改變極大地影響醣蛋白在其天然環境下之功效，並且因此亦可能影響醣蛋白作為治療劑之功效。醣蛋白的醣基化狀態受到嚴格調控，且即使醣基化的微小差異亦可具有顯著效應。

在醣蛋白中，糖接附至天冬醯胺酸側鏈中之醯胺氮原子 (N-鍵結) 或接附至絲胺酸或蘇胺酸側鏈中之氧原子 (O-鍵結)。醣基化始於內質網中 N-鍵結之形成，即所謂「核心醣基化」。此後，多肽經轉運至高基氏體，於高基氏體處，O-鍵結之糖被添加並且 N-鍵結之糖鏈係以多種不同方式修飾，例如，藉由去除甘露糖殘基、添加 N-乙醯基葡萄糖胺、半乳糖及/或岩藻醣及/或唾液酸殘基。

紅血球生成刺激醣蛋白包含多個 N-醣基化位點。紅血球生成素 (EPO) 為一種具有三個 N-醣基化位點及一個 O-醣基化位點之醣蛋白。紅血球生成素已使用重組 DNA 技術生物合成製造 (Egrie, J C, Strickland, T W, Lane, J 等人 (1986) Immunobiol.72: 213-224)，且為將經選殖之人類 EPO 基因插入中華倉鼠卵巢組織細胞 (CHO 細胞) 並且在其中表現的產物。人類紅血球生成素 (hEPO) 的主要完全加工形式之一級結構在圖 1 中示出。有兩個雙硫鍵：Cys7-Cys161 之間及 Cys29-Cys33 之間。不含糖部分的紅血球生成素之多肽鏈之分子量為 18,236 Da。在完整的紅血球生成素醣蛋白中，大約 40% 的分子量由使蛋白質醣基化的碳水化合物基團佔據 (Sasaki, H, Bothner, B, Dell, A 及 Fukuda, M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059)。

紅血球生成素之典型 N-聚醣包括具有一個或兩個 N-乙醯乳糖胺重複序列的雙觸角、三觸角及四觸角結構 (參見例如 Postnikov 等人 2016 Russ.Chem. Rev. 85-99)。已知當與經較少唾液酸化之紅血球生成素醣蛋白相比時，紅血球生成素之 N-聚醣上較高數量的末端唾液酸部分係與紅血球生成素的較高比活性相關聯 (參見例如 Imai 等人，Eur. J. Biochem. 194 (1990), 第 457-462 頁)。紅血球生成素的去唾液酸化縮短紅血球生成素在循環中的半衰期 (Ridley 等人 J Natl Med Assoc.1994 年 2 月;86(2): 129-35)。據報導，紅血球生成素之較高數量的聚-N-乙醯乳糖胺重複序列或較高數量的 N-聚醣分支兩者分別與較高的紅血球生成素特異性生物活性相關聯 (參見例如 WO 99/28346)。紅血球生成素的醣基化變異體不僅是紅血球生成素之生物活性、活體內生物活性及藥物動力學的關鍵影響因素，它們亦改變醣蛋白於血液中的溶解度及壽命。

在 ICH 指南中，關鍵品質屬性 (CQA) 係定義為物理、化學、生物或微生物特性或特徵，其應在適當的限度、範圍或分佈內，以確保所期望之產品品質 (人用藥品註冊技術要求國際協調會議，藥品開發，Q8 (R2))。由於所描述的對生物活性的潛在影響，重組生產的紅血球生成素之 N-醣基化被認為是關鍵品質屬性 (CQA)，且在生產期間經仔細監測以確保一致的產品品質。醣基化變異體之相對含量很大程度取決於幾個因素，包括細胞培養條件。由於醣基化變異體對生物利用度的關鍵影響，因此，持續生產醫藥紅血球生成素產品之窄範圍醣基化變異體的能力亦轉化為紅血球生成素比活性方面較低的批次間變異性。

Yoon 等人(Biotechnol Bioeng, 89(3):345– 356, 2005) 揭露了 CHO 細胞之無血清懸浮培養物中培養溫度及 pH 的優化可導致最大紅血球生成素濃度及體積生產率的增加。

WO 2017/072340 A1 揭露一種監測生物反應器中的細胞培養物之狀態與參考生物反應器中的細胞培養物之參考狀態的偏差之系統，其中該生物反應器包含與該參考生物反應器相同的培養基。

WO 2017/072346 A1 揭露一種確定 pH 測量裝置是否受到 pH 測量問題影響以及重新校準 pH 計之系統及方法，使用在兩個或更多個不同罐中測量的 CO ₂濃度來鑑定可操作地連接到不同罐的 pH 測量裝置之 pH 測量偏差。

因此，持續關注以可靠的高品質生產紅血球生成素之方法。

本發明基於以下發現：在發酵期間嚴格控制生產生物反應器中的培養基之 pH 導致醣蛋白產物的變異性、並且特定而言紅血球生成素之 N-醣基化譜的變異性顯著改善，特定而言關於紅血球生成素之唾液酸化同功型及四觸角 + 1 個重複結構的存在。

發明人已發現，藉由將生物反應器 pH 探針訊號調整為準確反映培養基中之 pH 的 pH 參考值，不受可能由採樣及離線測量引入的任何偏移之影響，並且視情況亦藉由隨後用此 pH 探針控制培養基中之 pH，可以在重組哺乳動物宿主細胞中生產醣蛋白組成物期間顯著降低關於 N-醣基化及唾液酸化的變異性。

已經發現，使用一種在將生物反應器滅菌並且用培養基填充後校準在線 pH 測量裝置的方法，該方法包含以下步驟： a) 判定在該生物反應器頂部空間及/或排氣中的二氧化碳濃度， b) 使用培養基特定相關性來計算該生物反應器中的培養基之 pH 值，以及 c) 將 pH 測量裝置調整為該 pH 值，與已使用其中藉由 pH 測量裝置在該生物反應器中所測量的 pH 值與該培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳相差多於 0.03 個單位之方法生產的醣蛋白組成物中的相同醣基化變異體之相對含量的標準差相比，導致在此類生物反應器中生產的醣蛋白組成物中的一種或多種醣基化變異體之相對含量的標準差的減少，特定而言依賴於 pH 的離線測量以 (重新‑) 校準在線 pH 測量裝置之此類方法。由此針對來自至少兩個發酵批次的醣蛋白組成物來計算該一種或多種醣基化變異體之相對含量的標準差。

因此，本發明之一個態樣為一種重組生產包含至少一種醣蛋白的醣蛋白組成物之方法，其中該方法包含以下步驟：在生物反應器中的培養基中培養表現該醣蛋白的重組宿主細胞，該生物反應器具有位於該生物反應器中且經組態以與該培養基實體接觸的 pH 測量裝置，其特徵在於， (a) 該培養係在無菌條件下進行， (b) 用該 pH 測量裝置所測量的 pH 值與該培養基之 pH 值相差少於 0.05 個單位，並且 (c) 與其中藉由該 pH 測量裝置所測量的 pH 值與該培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳相差多於 0.03 個單位之方法相比，在該醣蛋白組成物中的至少一種醣基化變異體之相對含量具有降低的批次間變異性，以及由此生產醣蛋白組成物。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，其中藉由 pH 測量裝置所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳相差多於 0.03 個單位之方法為包含以下步驟之方法：從生物反應器中移除培養基樣品、特定而言是在無菌條件下，用位於該生物反應器外部的 pH 測量裝置測量該樣品之 pH 值 (「離線 pH 測量」)，以及將該生物反應器中的該 pH 測量裝置調整為所測量的 pH 值。

另一態樣為一種在表現醣蛋白的重組宿主細胞中重組生產包含至少一種醣蛋白的醣蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟： (a) 提供生物反應器，該生物反應器包含位於該生物反應器中且經組態以與培養基實體接觸的 pH 測量裝置， (b) 將該生物反應器關閉並滅菌， (c) 將培養基填充至該生物反應器中， (d) 校準該 pH 測量裝置， (e) 用該重組宿主細胞接種該生物反應器，以及 (f) 在適合生產該醣蛋白的條件下培養該重組宿主細胞，以及 (g) 由此生產該醣蛋白，其特徵在於，步驟 (d) 之校準包含以下步驟： (i) 將包含二氧化碳氣體的氣體混合物引入該生物反應器中， (ii) 判定在該生物反應器之頂部空間及/或排氣中的二氧化碳濃度， (iii) 基於培養基特定相關性計算該培養基之 pH，以及 (iv) 將該 pH 測量裝置調整為在步驟 (iii) 中計算的 pH。

在該態樣之某些實施例中，在校準步驟 (d) 之後用 pH 測量裝置測量的 pH 與培養基之 pH 值相差 0.05 個單位或更少、較佳 0.03 個單位或更少。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，該醣蛋白組成物包含醣蛋白的至少一種醣基化變異體，並且與針對已使用其中藉由 pH 測量裝置所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳相差多於 0.03 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對來自至少兩個發酵批次的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。

在某些實施例中，當將根據本發明生產的醣蛋白組成物的醣基化變異體的標準差與另一種醣蛋白組成物的標準差比較時，用生物反應器中的 pH 測量裝置所測量的 pH 值與培養基中的 pH 之間的差異係在發酵批次之生產中改變的唯一參數。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，針對來自至少三個、較佳至少五個、更佳至少十個發酵批次的醣蛋白組成物計算標準差。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，重組宿主細胞為哺乳動物細胞、特定而言 CHO 細胞。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，培養基包含碳酸鹽緩衝液。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，藉由針對培養基收集至少一個培養基特定資料集來判定培養基特定相關性，其中使用以下步驟收集該資料集： (a) 將培養基填充到生物反應器中，其中該生物反應器具有位於該生物反應器中且經組態以與培養基實體接觸的至少一個 pH 測量裝置， (b) 將包含二氧化碳的氣體混合物引入該生物反應器中， (c) 用該 pH 測量裝置測量培養基中的 pH，其中該 pH 測量裝置已經校準 (在非無菌條件下) 以測量培養基中的 pH， (d) 變更以下任一者： (i) 該培養基中的 pH 值並且針對至少兩個不同 pH 值測量在生物反應器之頂部空間及/或排氣中的二氧化碳濃度，或 (ii) 在氣體混合物中的二氧化碳濃度並且針對在該氣體混合物中的至少兩種不同二氧化碳濃度測量 pH 值，以及 (e) 藉由數學擬合至少兩對頂部空間/排氣二氧化碳濃度及培養基的對應 pH 值獲得培養基特定相關性。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，在接種之前，在至少一個預培養步驟中，已在預培養基中培養重組宿主細胞，其中用於預培養的生物反應器具有位於該生物反應器中其經組態以與預培養基實體接觸的至少一個 pH 測量裝置，並且其中在用於預培養的生物反應器中的該 pH 測量裝置係根據以下步驟校準： (i) 將包含二氧化碳氣體的氣體混合物引入該生物反應器中 (ii) 判定在頂部空間及/或廢氣中的二氧化碳濃度， (iii) 基於預培養基特定相關性計算該培養基之 pH 值，以及 (iv) 將該 pH 測量裝置調整為在步驟 (iii) 中計算的 pH 值。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，醣蛋白組成物為紅血球生成性組成物。在全部態樣及實施例之某些實施例中，醣蛋白為紅血球生成刺激醣蛋白。在全部態樣及實施例之某些實施例中，醣蛋白為紅血球生成素。

本發明之一個態樣為降低重組醣蛋白組成物的批次之間的至少一種醣基化變異體之相對含量的變異性之方法，該方法包含： (a) 提供生物反應器，該生物反應器包含位於該生物反應器中且經組態以與培養基實體接觸的 pH 測量裝置， (b) 將該生物反應器關閉並滅菌， (c) 將培養基填充至該生物反應器中， (d) 校準該 pH 測量裝置， (e) 用表現該醣蛋白的重組宿主細胞接種該生物反應器， (f) 在適合生產該醣蛋白的條件下培養該重組宿主細胞，以及 (g) 由此生產該醣蛋白，其中步驟 (d) 之校準包含以下步驟： (i) 將包含二氧化碳氣體的氣體混合物引入該生物反應器中， (ii) 判定在頂部空間及/或廢氣中的二氧化碳濃度， (iii) 基於培養基特定相關性計算該培養基之 pH 值，以及 (iv) 將該 pH 測量裝置調整為在步驟 iii) 中計算的 pH 值，並且其中步驟 (a) 至 (g) 產生具有限定相對含量之該醣基化變異體的該重組醣蛋白組成物之第一批次， (h) 重複該等步驟 (a) 至 (g) 產生該醣蛋白組成物之至少一個後續批次，其中該第一批次及該至少一個後續批次之該至少一種醣基化變異體之相對含量具有降低的批次間變異性。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，針對該第一批次及至少一個後續批次計算的醣蛋白之相對含量的標準差為 pH 值之中位數的 1% 或更少、特定而言 0.8% 或更少、最特定而言 0.5% 或更少。

本發明之一個態樣為一種校準位於生物反應器中且經組態以與該生物反應器中的培養基實體接觸的 pH 測量裝置之基於二氧化碳的方法之用途，其用於與使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳多於 0.03 個單位的 pH 方法生產的醣蛋白組成物相比，降低在至少兩個批次之間所計算的醣蛋白組成物中的一種或多種醣基化變異體之相對含量的標準差。

本發明之又一態樣為一種紅血球生成性組成物，其包含至少一种紅血球生成刺激醣蛋白，其中 (a) 約 3.3 面積-% 至約 3.8 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有雙觸角結構；(b) 約 8.6 面積-% 至約 9.5 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有三觸角結構；(c) 約 5.6 面積-% 至約 5.9 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有三觸角 + 1 個重複結構；(d) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角結構；(e) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 1 個重複結構；(f) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 2 個重複結構，(g) 約 13.2 面積-% 至約 16.0 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 2；(h) 約 24.1 面積-% 至約 26.5 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 3；(i) 約 23.5 面積-% 至約 24.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 4；(j) 約 17.1 面積-% 至約 18.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 5；(k) 約 9.4 面積-% 至約 11.8 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 6；(l) 約 3.7 面積-% 至約 5.5 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 7；及/或 (m) 約 0.9 面積-% 至約 1.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 8。在全部態樣及實施例之實施例中，紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣的面積百分比係在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡糖以及 (酶促) 去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析判定。在某些實施例中，陰離子交換層析為帶有脈衝電流檢測的高效陰離子交換層析 (HPAEC-PAD)。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物中的紅血球生成刺激醣蛋白的唾液酸化同功型之面積百分比係藉由毛細管區帶電泳判定。

本發明提供一種生產醣蛋白、特定而言紅血球生成刺激醣蛋白、例如紅血球生成素之方法，關於醣基化、特定而言關於帶有四觸角、四觸角 + 1 個重複、四觸角 + 2 個重複及四觸角 + 3 個重複結構之 N-聚醣，以及關於唾液酸化同功型、特定而言同功型 2 及 3，該方法具有降低的批次間變異性，其可以確保恆定的產品品質及/或改善 (紅血球生成刺激) 醣蛋白的生物功能、諸如特定生物活性。 胺基酸序列說明

SEQ ID NO: 1

人類紅血球生成素 165aa APPRLICDSR VLERYLLEAK EAENITTGCA EHCSLNENIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVNSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS PPDAASAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGD

1. 定義

為了可以更容易地理解本發明，首先定義某些術語。在進一步描述本發明之前，應理解，本發明不限於所描述的特定實施例，因此當然可以變更。亦應理解，本文所用的術語僅出於描述具體實施例的目的，而不旨在限制本發明的範圍，因為本發明之範圍僅由所附申請專利範圍限制。

除非本文另外定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應具有本領域中通常歸於其等之含義。然而，術語之含義及範圍應係明晰的，如果存在任何潛在的歧義，則本文所提供的定義優先於字典或外部定義。儘管類似或等效於現在所述之彼等的任意方法及材料亦可用於本發明之實踐或測試，但較佳的方法及材料於本文中描述。本文提及的全部出版物皆藉由引用併入本文以揭露及描述與所引用之出版物相關的方法及/或材料。

在提供數值範圍的情況下，應了解，除非上下文另有明確規定，否則在該範圍的上限與下限之間的每個中間值至下限單位之十分之一或該指定範圍中之中間值係涵蓋於本發明內。此等較小範圍 (其可以獨立地包括在更小的範圍內) 亦涵蓋於本發明內，受到指定範圍內任何明確排除的限值之限定。在所述範圍包括一個或兩個限值時，排除那些涵蓋的一者或兩者的範圍亦包括在本發明中。

亦必須注意，除非上下文另有明確規定，否則如本文中及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一」、「一種」及「該」包括複數個提及物。進一步應注意，申請專利範圍可以起草為排除任何視情況選用之要素。因此，本陳述旨在充當結合申請專利範圍要素之敘述而使用諸如「唯一」、「僅」等排他性術語或使用「否定」限制的前置基礎。

術語「約」表示其後數值之 +/- 20% 的範圍。在某些實施例中，術語「約」表示其後數值之 +/- 10% 的範圍。在某些實施例中，術語「約」表示其後數值之 +/- 5% 的範圍。

術語「包含」亦包括術語「由…組成」。

應當理解，為清楚起見在單獨的實施方案的上下文中描述的本發明的某些特徵也可以在單個實施方案中組合提供。相反，為簡潔起見，在單個實施例之上下文中描述的本發明的各種特徵亦可單獨地或以任何合適的子組合來提供。與本發明有關的實施例之全部組合皆為本發明所特別涵蓋，並且在本文中揭露，恰似每個組合皆單獨且明確地揭露一樣。另外，各種實施例及其要素之全部子組合亦皆為本發明所特別涵蓋，並且在本文中揭露，恰似每個此類子組合皆單獨且明確地在本文中揭露一樣。

如本文所用，術語「準確度」係指報告值或估計值與真實值的接近程度。不準確的測量、觀察或估計與真實值不同。準確的測量、觀察或估計與真實值沒有差異。

術語「通氣」、「曝氣」或「充氣」在本文中同義使用，且係指將氣態材料分散到可流動流體諸如培養基中，例如以提供擴散表面以將分子或化合物從氣體引入可流動表面內。該術語並不限於空氣本身的分散，而是指將任何氣體引入培養基，例如氧氣、二氧化碳、氮氣等及其混合物。在全部態樣及實施例之某些實施例中，細胞培養物係用例如包括製程空氣及二氧化碳的限定氣體混合物通氣。為了細胞的正常生長，必須維持特定濃度的溶解氧。又，控制二氧化碳之引入用於將 pH 維持在所期望之水平。在某些實施例中，在校準 pH 測量裝置期間及/或在培養期間引入生物反應器的氣體混合物包含 93% 製程空氣及 7% CO ₂。曝氣可以藉由頂部空間曝氣進行，但對於大型生物反應器，藉由頂部空間曝氣實現的氣體交換可能太慢。將氣體引入生物反應器流體中的最有效方式為浸沒充氣或通氣攪動 (其中這兩個術語在本文中同義使用)，其涉及在流體中形成小氣泡。較佳係藉由通氣攪動對培養基進行曝氣，以允許分子及/或化合物在氣泡排出到培養基中之後透過流體-氣泡界面擴散到培養基中。在一個實施例中，藉由用具有限定二氧化碳濃度的氣體通氣攪動培養基來實現曝氣。在某些實施例中，用包含 93% 製程空氣及 7% CO ₂的氣體混合物通氣攪動培養基。在一些實施例中，多孔固體材料 (如鈦) 或具有與生物反應器相關聯之小預鑽孔的金屬通氣攪動環提供通氣攪動。

如本文所用，術語「面積百分比」或「面積-%」係指，如藉由檢測器所測量，特定物質 (例如，醣蛋白的某種醣基化變異體) 之峰下積分面積 (下文稱為「AUP」) 相對於整個層析圖 (例如藉由帶有脈衝電流檢測的高效陰離子交換層析或藉由毛細管區帶電泳生成的層析圖) 的總積分峰面積的百分比。AUP 可以藉由使用合適的積分函數來判定。層析圖中的各峰對應於加載到層析管柱上的混合物中的不同組分，並且可檢測組分中之各者的 AUP 與全部樣品組分的總 AUP 之比率產生該面積百分比。面積百分比可以用數學方式表示為：面積 _i-%=100×(AUP _i)/(Σ 全部 AUP)

如本文所使用，術語「生物反應器」係指用於哺乳動物細胞培養物生長的任何生物相容性罐或容器，諸如大型發酵室。通常，生物反應器將為至少 0.25 L，並且可為 1、10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000 L 或更大，或介於兩者之間的任何體積。在本文全部態樣及實施例之一個實施例中，生物反應器為大規模生物反應器，換言之，生物反應器將為至少 10 L、較佳至少 50 L、更佳至少 500 L、特佳至少 5000 L，且/或用於商業目的之重組醣蛋白生產。通常，可以在培養期間監測、調整及控制生物反應器的內部條件，包括但不限於 pH、溶解氧、攪拌、溫度及/或 pH。當培養基已填充到生物反應器中時，生物反應器內部的體積通常未完全填充，而是分為工作體積及頂部空間體積，其中該工作體積為培養基所佔據的總體積之分數，而培養基上方的剩餘體積在本文中稱為「頂部空間」或「頂部空間體積」。通常，工作體積約為生物反應器總體積之 70% 至 80%。生物反應器包括至少一個入口及一個出口，其分別允許引入及去除氣流。此等可包括空氣入口過濾器，其為生物反應器內的滅菌條件提供無菌氣體混合物。透過出口離開生物反應器的氣流在本文中亦稱為「排氣」。出口可包含允許判定排氣中的二氧化碳濃度的感測器。此類感測器可為例如基於紅外的廢氣分析儀、質譜儀、RAMAN 感測器或光學裝置。生物反應器通常進一步與其他容器 (例如培養基罐或收穫罐) 流體連通，以允許將液體培養基引入生物反應器或從生物反應器去除。對於本領域技術人員來說顯而易見的是，可以提供一個或多個額外的接入端口以更好地接入生物反應器的內部，包括在滅菌/無菌條件下進入，例如用於取出可用於離線測量的樣品。生物反應器可進一步具有額外的設備，例如葉輪、擋板、分佈器及/或通氣攪動器，其特別允許哺乳動物細胞的培養及繁殖。生物反應器可以由任何適合於在本發明的培養條件下盛放懸浮在培養基中的哺乳動物細胞培養物的材料組成，其包括玻璃、塑料或金屬或其組合。生物反應器可為多次或單次使用、可重複使用、一次性或可回收的。

如本文所使用，術語「緩衝劑」係指一種物質，該物質藉由其在溶液中的存在而增加必須添加以引起 pH 值單位變化的酸或鹼的量。緩衝溶液藉由酸-鹼結合物組分之作用來抵抗 pH 的變化。與生物試劑一起使用的緩衝溶液通常能夠維持恆定的氫離子濃度，使得該溶液之 pH 在所期望範圍內，該範圍通常接近生理 pH。傳統的緩衝劑組分包括但不限於有機以及無機鹽、酸及鹼。習知的緩衝劑物質為例如由磷酸及/或其鹽組成的磷酸鹽緩衝溶液、由乙酸及其鹽組成的乙酸鹽緩衝溶液、碳酸鹽及/或碳酸氫鹽緩衝溶液、由檸檬酸及/或其鹽組成的檸檬酸鹽緩衝溶液、嗎啉緩衝溶液、2-(N-嗎啉基)乙磺酸緩衝溶液、組胺酸緩衝溶液、甘胺酸緩衝溶液、參(羥基甲基)胺基甲烷 (TRIS) 緩衝溶液。

術語「二氧化碳濃度」及「二氧化碳 (氣體) 之分數」在本文中可互換使用，並且係指氣體混合物中存在的二氧化碳氣體之相對量。本文中二氧化碳濃度以 [%] 表示。

術語「細胞培養」及「細胞培育」係指在適用於細胞群體之存活及/或生長的條件下，將細胞群體懸浮在培養基中。該等術語亦將應用於培養基及懸浮在其中的細胞群體之組合。該等術語包括全部規模 (例如，從 Ambr® 系統到大規模工業生物反應器，亦即從毫升規模到＞ 10.000 L 規模)、全部不同的製程模式 (例如批式、饋料批式、灌流、連續培養)、全部製程控制模式 (例如非受控、全自動及受控系統，帶有對 pH、溫度、氧含量等的控制) 以及在各種類型之細胞培養系統 (例如一次性系統、不銹鋼系統、玻璃器皿系統) 中的細胞培養製程，亦稱為「發酵」或「發酵製程」。一般來說，以下參數係通常每天判定且覆蓋活細胞濃度、產物濃度以及數種代謝物諸如葡萄糖或乳酸、pH、滲透壓、重量滲透壓及銨。在本發明的一較佳實施例中，細胞培養物為哺乳動物細胞培養物且係批式或饋料批式培養。通常，細胞培養在無菌、受控溫度及大氣條件下以附著式培養或懸浮培養進行。培養物可在搖瓶、小規模生物反應器和/或大規模生物反應器中生長。在本文全部態樣及實施例之某些實施例中，本發明之方法可以用於大規模哺乳動物細胞培養，亦即在具有至少 10 L、較佳至少 50 L、更佳至少 500 L、特佳至少 5000 L 的生物反應器中，及/或用於商業目的之重組醣蛋白生產。在一個實施例中，本發明之細胞培養方法及組成物適用於大規模 CHO 細胞培養及醣蛋白生產。在本文全部態樣及實施例之一個實施例中，重組醣蛋白生產係用於商業目的及/或使用大規模生物反應器進行。

本文所述的醣蛋白一旦已藉由重組表現生產，其即可藉由本領域已知的任何純化方法、例如藉由層析 (例如，離子交換、親和性及粒徑篩析管柱層析)、離心、差異溶解度或者藉由任何其他用於純化蛋白質的標準技術純化。例如，可藉由經適當選擇親和性管柱諸如蛋白 A 管柱且將其與層析管柱組合、過濾、超濾、鹽析及透析程序來分離及純化抗體 (參見，例如，Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow, David Lane 編, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。此外，如本文所述，醣蛋白可以與異源多肽序列融合以促進純化。具有所期望糖鏈的多肽可以藉由本領域已知的方法用凝集素管柱分離。

如本文所使用，術語「培養基」或「培養介質」意指用於提供營養物質 (例如，維生素、胺基酸、必需營養物、鹽等) 及特性 (例如，相似性、緩衝性) 以維持活細胞、特定而言哺乳動物細胞且支持其生長的液體溶液。較佳地，哺乳動物細胞可在中性 pH 下、例如約 pH 6.5 至約 pH 7.5、較佳約 pH 6.6 至約 pH 7.3、更佳在約 7 的 pH 下培養。因此，應向培養基中添加緩衝劑。商業上可獲得的培養基為本領域技術人員已知的。在全部態樣及實施例之一個實施例中，培養基係使用碳酸鹽緩衝系統來緩衝。在預培養步驟期間使用的培養基在本文中稱為「預培養基」。它可以與用於主階段栽培的培養基具有相同或不同的組成。

如本文所使用，術語「醣蛋白」係指含有一個或多個經共價連接之寡醣鏈的蛋白質或多肽。寡醣鏈可由單一糖殘基、糖殘基之單一無分支的鏈構成，或者可以由糖殘基之分支一次或多次的鏈組成。在某些實施例中，寡醣鏈為 N-連接的。在某些實施例中，寡醣鏈為 O-連接的。如本文所使用，術語「醣蛋白組成物」係指包含至少一種醣蛋白的組成物。

醣蛋白包括例如多種血液劑中之任一者 (包括，例如，紅血球生成素、凝血因子等)、干擾素、集落刺激因子、抗體、酶及激素。特定醣蛋白之身份並非旨在限製本揭露，且本文所述的治療性製劑可包括任何所關注醣蛋白，例如具有 Fc 區的醣蛋白。

本文所揭示的醣蛋白可包括結合至所關注標靶 (例如，結合至抗原) 的標靶結合域。例如，醣蛋白 (諸如抗體) 可結合至跨膜多肽 (例如，受體) 或配體 (例如，生長因子)。用於本文所述之醣蛋白 (例如，抗體) 的示例性分子標靶 (例如，抗原) 包括：CD 蛋白，諸如 CD2、CD3、CD4、CD8、CD11、CD19、CD20、CD22、CD25、CD33、CD34、CD40、CD52；ErbB 受體家族之成員，諸如 EGF 受體 (EGFR、HER1、ErbB1)、HER2 (ErbB2)、HER3 (ErbB3) 或 HER4 (ErbB4) 受體；巨噬細胞受體，諸如 CRIg；腫瘤壞死因子，諸如 TNFa 或 TRAIL/Apo-2；細胞黏附分子，諸如 LFA-1、MacI、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM 及 αvβ3 整聯蛋白，包括其 a 或 p 次單元 (例如，抗 CD11a、抗 CD18 或抗 CD11b 抗體)；生長因子及受體，諸如 EGF、FGFR (例如，FGFR3) 及 VEGF；IgE；細胞激素，諸如 IL1；細胞激素受體，諸如 IL2受體；血型抗原；flk2/flt3 受體；肥胖 (OB) 受體；mpl 受體；CTLA-4；蛋白 C；neutropilin；肝配蛋白 (ephrin) 及受體；軸突導向因子 (netrin) 及受體；slit 及受體；趨化因子及趨化因子受體，諸如 CCL5、CCR4、CCR5；澱粉樣 β 蛋白；補體因子，諸如補體因子 D；脂蛋白，諸如經氧化之 LDL (oxLDL)；淋巴毒素，諸如淋巴毒素 α (LTa)。其他分子標靶包括 Tweak、B7RP-1、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9 型 (PCSK9)、硬化素、c-kit、Tie-2、c-fms 及抗 M1。

示例性醣蛋白產品可包括阿巴西普 (abatacept) (ORENCIA®，Bristol-Myers Squibb)、阿昔單抗 (abciximab) (REOPRO®，羅氏)、阿達木單抗 (adalimumab) (HUMIRA®，Bristol-Myers Squibb)、阿柏西普 (aflibercept) (EYLEA®，Regeneron Pharmaceuticals)、阿法西普 (alefacept) (AMEVIVE®，Astellas Pharma)、阿侖單抗 (alemtuzumab) (CAMPATH®，Genzyme/Bayer)、阿替利珠單抗 (atezolizumab) (TECENTRIQ®，建南德克公司)、巴利昔單抗 (basiliximab) (SIMULECT®，Novartis)、貝拉西普 (belatacept) (NULOJIX®，Bristol-Myers Squibb)、貝利木單抗 (belimumab) (BENLYSTA®，Glaxo SmithKline)、貝伐珠單抗 (bevacizumab) (AVASTIN®，羅氏)、卡納金單抗 (canakinumab) (ILARIS®，Novartis)、本妥昔單抗維多汀 (brentuximab vedotin) (ADCETRIS®，Seattle Genetics)、賽妥珠單抗 (certolizumab) (CIMZIA®，UCB, Brussels, Belgium)、西妥昔單抗 (cetuximab) (ERBITUX®，Merck-Serono)、達珠單抗 (daclizumab) (ZENAPAX®，Hoffmann-La Roche)、地尼白介素毒素連接物 (denileukin diftitox) (ONTAK®, Eisai)、狄諾塞麥 (denosumab) (PROLIA®，Amgen；XGEVA®，Amgen)、依庫珠單抗 (eculizumab) (SOLIRIS®，Alexion Pharmaceuticals)、依法珠單抗 (efalizumab) (RAPTIVA®，建南德克公司)、依那西普 (etanercept) (ENBREL®，Amgen-Pfizer)、法瑞西單抗 (faricimab) (VABYSMO®，羅氏)、吉妥珠單抗 (gemtuzumab) (MYLOTARG®，Pfizer)、戈利木單抗 (golimumab) (SIMPONI®，Janssen)、替伊莫單抗 (ibritumomab) (ZEVALIN®，Spectrum Pharmaceuticals)、英夫利昔單抗 (infliximab) (REMICADE®,Centocor)、伊匹單抗 (ipilimumab) (YERVOY™，Bristol-Myers Squibb)、莫羅單抗 (muromonab) (ORTHOCLONE OKT3®，Janssen-Cilag)、那他珠單抗 (natalizumab) (TYSABRI®，Biogen Idee, Elan)、奧瑞珠單抗 (ocrelizumab) (OCREVUS®，建南德克公司)、奧法木單抗 (ofatumumab) (ARZERRA®，Glaxo SmithKline)、奧瑪珠單抗 (omalizumab) (XOLAIR®，Novartis)、帕利珠單抗 (palivizumab) (SYNAGIS®，MedImmune)、帕尼單抗 (panitumumab) (VECTIBIX®，Amgen)、蘭尼單抗 (ranibizumab) (LUCENTIS®，建南德克公司)、利洛西普 (rilonacept) (ARCALYST®，Regeneron Pharmaceuticals)、利妥昔單抗 (rituximab) (MABTHERA®，羅氏)、托珠單抗 (tocilizumab) (ACTEMRA®，建南德克公司；RoActemra，Hoffman-La Roche)、托西莫單抗 (tositumomab) (BEXXAR®，Glaxo SmithKline) 及曲妥珠單抗 (trastuzumab) (HERCEPTIN®，羅氏)。

如本文所使用，術語「紅血球生成性組成物」係指一種組成物，其包含至少一種含有醣基化位點的紅血球生成刺激醣蛋白，並且其中至少一些分子攜帶糖鏈，視情況包含至少一個末端唾液酸殘基 (亦即，此類分子經「唾液酸化」)。類似地，如本文所使用，術語「醣蛋白組成物」係指一種組成物，其包含至少一種醣蛋白分子，其中至少一些分子係視情況經唾液酸化。

如本文所使用，「紅血球生成刺激醣蛋白」意指一種蛋白質，其直接或間接引起紅血球生成素受體的活化，例如藉由結合至且引起受體之二聚化。紅血球生成刺激醣蛋白包括：紅血球生成素及其變異體、類似物或衍生物，其結合至且活化紅血球生成素受體；抗體，其結合至且活化紅血球生成素受體；或肽，其結合至且活化紅血球生成素受體。如本文所指的紅血球生成素的變異體、類似物或衍生物包含至少三個 N-醣基化位點。在一個實施例中，N-醣基化位點為 Asn24、Asn38 及 Asn83。紅血球生成刺激醣蛋白包括但不限於，促紅血球生成素 (epoetin) α、促紅血球生成素 β、促紅血球生成素 δ、促紅血球生成素 ω、促紅血球生成素 ι、促紅血球生成素 ζ、及其類似物、聚乙二醇化之紅血球生成素、胺甲醯化之紅血球生成素、模擬肽 (包括 EMPl/hematide) 及模擬抗體。示例性紅血球生成刺激醣蛋白包括紅血球生成素、達貝泊汀 (darbepoetin)、紅血球生成素促效劑變異體、以及結合且活化紅血球生成素受體的肽或抗體 (並且包括美國專利申請公開號 2003/0215444 20 及 2006/0040858 中報道的化合物，其各自之揭示係藉由引用以其整體併入本文)，以及如下列專利或專利申請中所揭示的紅細胞生成素分子或其變異體或類似物，下列專利或專利申請各自皆藉由引用以其整體併入本文：美國專利號 4,703,008、5,441,868、5,547,933、5,618,698、5,621,080、5,756,349、5,767,078、5,773,569、25 5,955,422、5,830,851、5,856,298、5,986,047、6,030,086、6,310,078、6,391,633、6,583,272、6,586,398、6,900,292、6,750,369、7,030,226、7,084,245、7,217,689；PCT 公開號 WO 91/05867、WO 95/05465、WO 99/66054、WO 00/24893、WO 01/81405、WO 00/61637、WO 01/36489、WO 02/014356、WO 02/19963、WO 02/20034、WO 02/49673、WO 02/085940、WO 03/029291、WO 2003/055526、WO 2003/0844 77、WO 2003/094858、WO 2004/002417、WO 2004/002424、WO 2004/009627、WO 2004/024761、WO 2004/033651、WO 2004/035603、WO 2004/043382、WO 2004/101600、WO 2004/101606、WO 2004/101611、WO 2004/1063 73、WO 2004/018667、WO 2005/001025、WO 2005/001136、WO 2005/021579、WO 2005/025606、WO 2005/032460、WO 2005/051327、WO 2005/063808、WO 2005/063809、WO 2005/070451 、WO 2005/081687、WO 2005/084711、WO 2005/103076、WO 2005/100403、WO2005/092369、WO 2006/50959、WO 2006/02646、WO 2006/29094；及美國公開號 US2002/0155998、US2003/0077753、US2003/0082749、US 2003/0143202、US2004/0009902、US2004/0071694、US2004/0091961、US2004/0143857、US2004/0157293、US2004/0175379、US2004/0175824、US2004/0229318、US2004/0248815、US2004/0266690、US2005/0019914、US2005/0026834、US2005/0096461、US2005/0107297、US2005/0107591、US2005/0124045、US2005/0124564、US2005/0137329、US2005/0142642、US2005/0143292、US2005/0153879、US2005/0158822、US2005/0158832、US2005/0170457、US2005/0181359、US2005/0181482、US2005/0192211、US2005/0202538、US2005/0227289、US2005/0244409、US2006/0088906、US2006/0111279。

「紅血球生成素」、「紅血球生成素多肽」或「EPO」係指一種醣蛋白，其屬於「紅血球生成刺激醣蛋白」之群組且直接或間接引起紅血球生成素受體的活化，例如藉由結合至且引起該受體的二聚化。其係指具有 SEQ ID NO: 1 中所示之胺基酸序列的醣蛋白。在一個實施例中，該術語包括與 SEQ ID NO: 1 之序列基本同源的胺基酸序列，其生物學特性涉及刺激紅血球生產以及刺激骨髓中定向紅血球祖細胞的分裂及分化。如本文所使用，此等術語包括此類如例如藉由定點誘變而故意修飾或透過突變而意外修飾之蛋白質。如本文所使用，「紅血球生成素」包括紅血球生成素及其變異體、類似物或衍生物，其結合至且活化紅血球生成素受體。如本文所指的紅血球生成素的變異體、類似物或衍生物包含至少三個 N-醣基化位點，在一個實施例中，N-醣基化位點為 Asn24、Asn38 及 Asn83。紅血球生成素包括但不限於促紅血球生成素 α、促紅血球生成素 β、促紅血球生成素 δ、促紅血球生成素 ω、促紅血球生成素 ι、促紅血球生成素 ζ、及其類似物、聚乙二醇化之紅血球生成素、及胺甲醯化之紅血球生成素。在一個實施例中，術語紅血球生成素或 EPO 類似物包括具有 1 至 6 個用於醣基化之額外位點的類似物、在醣蛋白之羧基末端處具有至少一個額外胺基酸的類似物 (其中該額外胺基酸包括至少一個醣基化位點) 及具有包括至少一個用於醣基化之位點的重排的胺基酸序列之類似物。如本文所使用，醣基化位點的「重排」意指天然存在的 EPO 中的一個或多個醣基化位點之缺失以及一個或多個非天然存在的醣基化位點之添加。此等術語包括天然的及重組生產的人類紅血球生成素兩者。

如本文所使用，術語「批次」、「培養批次」或「發酵批次」係指藉由在一個生物反應器中進行一次重組生產醣蛋白組成物之方法獲得的醣蛋白組成物。特定而言，其係指藉由進行一次包括以下步驟之方法獲得的醣蛋白組成物： (a) 提供生物反應器，該生物反應器包含位於該生物反應器中且經組態以與培養基實體接觸的 pH 測量裝置， (b) 將該生物反應器關閉並滅菌， (c) 將培養基填充至該生物反應器中， (d) 校準該 pH 測量裝置， (e) 用表現該醣蛋白的重組宿主細胞接種該生物反應器， (f) 在適合生產該醣蛋白的條件下培養該重組宿主細胞，以及 (g) 由此生產該醣蛋白。

隨後可將所獲醣蛋白組成物分成更小的體積用於進一步加工，該等更小的體積通常稱為「屬於/來自同一批次」，並且除非經歷不同的後續加工步驟，否則其在物理及化學參數、諸如例如醣基化概況方面將具有可比的品質。

如本文所用，術語「醣基化」和「經醣基化」係指存在與生物分子（例如，蛋白或脂質）相聯的碳水化合物（例如，寡糖或多糖，也稱為「聚醣」）。在特定實施例中，醣基化係指接附至蛋白質 (例如，紅血球生成刺激醣蛋白，特定而言紅血球生成素) 或所關注蛋白質的一部分的聚醣 (例如，N-聚醣) 之存在。如本文所使用，術語「聚醣」係指多醣、寡醣或單醣。聚醣可為糖殘基的單體或聚合物，且可為直鏈或分支的。N-連接的醣基化係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基的側鏈相聯。O-連接的醣基化係指 N-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖中的一種糖與羥基胺基酸（最常見的是絲胺酸或蘇胺酸）相聯，儘管 5-羥基脯胺酸或 5-羥基離胺酸亦可以參與 O-連接的醣基化。有關醣基化的綜述，參見，例如，Varki 等人，Essentials of Glycobiology, 第 3 版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2015-2017。如本文所可互換使用，術語「無醣基化」及「未經醣基化」係指未經醣基化 (例如，未經 N-醣基化）) 蛋白質或所關注蛋白質的一部分。聚醣可包括天然糖殘基 (例如，葡萄糖、N-乙醯基葡萄糖胺、N-乙醯基神經胺酸、半乳糖、甘露糖、岩藻醣、己糖、阿拉伯糖、核糖、木糖等) 及/或經修飾之糖 (例如，2'-氟核糖、2'-去氧核糖、磷酸甘露糖、6' 磺基 N-乙醯葡萄胺糖等)。聚醣在本文中亦用於指醣結合物的碳水化合物部分，諸如醣蛋白、醣脂、醣肽、醣蛋白質體、肽聚醣、脂多醣或蛋白聚醣。聚醣通常僅由單醣之間的 O-糖苷鍵結組成。例如，纖維素為由 B-l,4-連接之 D-葡萄糖組成的聚醣 (或更具體而言葡聚醣)，且幾丁質為由 ß-1,4-連接之 N-乙醯基-D-葡萄糖胺組成的聚醣。聚醣可為單醣殘基的均聚物或異聚物，並且可為直鏈或分支的。可發現聚醣接附至蛋白質，如在醣蛋白及蛋白聚醣中。它們通常見於細胞之外表面上。O-聚醣及 N-聚醣在真核生物中非常常見，但亦可見於原核生物中，儘管不太常見。如本文所使用，「半乳醣基化聚醣」係指包括至少一個半乳糖糖殘基的聚醣。在一些實施例中，半乳醣基化聚醣為 G1、G2、G1F、G2F、A1 及/或 A2 聚醣。在一些實施例中，半乳醣基化聚醣包括一個或多個聚 N-乙醯基乳糖胺重複。在一些實施例中，半乳醣基化聚醣為含有半乳糖-α-1-3-半乳糖的聚醣。在一些實施例中，半乳醣基化聚醣為三觸角聚醣或四觸角聚醣。非半乳醣基化聚醣包括 G0F 或 G0。

如本文所使用，術語「N-聚醣」係指 N-連接之寡醣，例如藉由天冬醯胺酸 N-乙醯葡糖胺鍵結接附至多肽之天冬醯胺酸殘基的寡醣。發現 N-聚醣接附在序列子中的天冬醯胺酸之 R 基團氮 (N)。該序列子為 Asn-X-Ser 或 Asn-X-Thr 序列，其中 X 為除脯胺酸之外的任何胺基酸。N-聚醣具有 Man3GlcNAc2 的共同五醣核心 (「Man」係指甘露糖；「Glc」係指葡萄糖；且「NAc」係指 N-乙醯基；「GlcNAc」係指 N-乙醯基葡萄糖胺)。五醣核心可經岩藻醣基化。關於 N-聚醣使用的術語「三甘露糖核心」亦指結構 Man3GlcNAc2 (「Man3」)。N-聚醣在包含添加到 Man3 核心結構的周圍糖 (例如，岩藻醣 [本文縮寫為「Fuc」] 及唾液酸) 的支鏈 (觸角) 之數量方面有所不同。N-聚醣係根據其分支的構件 (例如，高甘露糖、複合物或雜合物) 進行分類。本文所使用的縮寫，包括糖的縮寫，係本領域中常用的。其他常見縮寫包括「PNGase」，其係指肽 N-糖苷酶 F (EC 3.2.2.18)。受質 UDP-GlcNAc 為 UDP-N-乙醯葡萄胺糖的縮寫。中間體 ManNAc 為 N-乙醯基甘露糖胺的縮寫。中間體 ManNAc-6-P 為 N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸酯的縮寫。中間體 Sia-9-P 為唾液酸-9-磷酸酯的縮寫。中間體胞苷單磷酸酯-唾液酸縮寫為「CMP-Sia」。唾液酸係縮寫為「Sia」、「Neu5Ac」、「NeuAc」或「NANA」。

紅血球生成刺激醣蛋白、例如紅血球生成素上的 N-聚醣包括一個或多個 N-乙醯基乳糖胺單元，該單元結合至 N-連接之寡醣的五醣核心結構。如本文所使用，寡醣「分支」之數量係指結合至五醣核心結構的個別寡醣鏈之數量。例如，如圖 2A 所表明，兩個個別寡醣鏈經結合至五醣核心結構，因此，N-聚醣包含兩個分支且為雙觸角的。例如，如圖 2B 所表明，三個個別寡醣鏈經結合至五醣核心結構，因此，N-聚醣包含三個分支且為三觸角的。例如，如圖 2C 所表明，四個個別寡醣鏈經結合至五醣核心結構，因此，N-聚醣包含四個分支且為四觸角的。紅血球生成刺激醣蛋白、例如紅血球生成素上的 N-聚醣包括聚 N-乙醯基乳糖胺單元，該單元結合至 N-連接之寡醣的五醣核心結構。如本文所使用，術語「重複」或「聚 N-乙醯基乳糖胺重複」係指一個寡醣分支內的 N-乙醯基乳糖胺單元之數量減去一 (針對第一個 N-乙醯基乳糖胺單元)。例如，如圖 2D 所表明，兩個 N-乙醯基乳糖胺單元存在於一個寡醣分支內，這意味著該寡醣包含一個聚 N-乙醯基乳糖胺重複。本文中對應的 N-聚醣結構亦稱為「四觸角 + 1 個重複」。例如，如圖 2E 所表明，四個 N-乙醯基乳糖胺單元存在於一個寡醣分支內，這意味著該寡醣包含三個聚 N-乙醯基乳糖胺重複。本文中對應的 N-聚醣結構亦稱為「四觸角 + 3 個重複」。

如本文所使用，術語「醣基化佔有率」係指蛋白質在特定醣基化位點 (例如，共有醣基化位點之 Asn 殘基) 經醣基化的可能性或在特定醣基化位點經醣基化的蛋白質群中蛋白質之相對含量。例如，紅血球生成素多肽可以在 SEQ ID NO: 1 之胺基酸殘基 Asn24、Asn38 及/或 Asn83 上醣基化。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用，係指已向其中引入外源性核酸的細胞，包括此等細胞的子代細胞。本領域技術人員知曉用於製備 (紅血球生成刺激) 醣蛋白組成物之方法，其中該方法包含在適用於表現該 (紅血球生成刺激) 醣蛋白的條件下培養如上文所提供的包含編碼該 (紅血球生成刺激) 醣蛋白的核酸之宿主細胞，以及視情況從該宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 回收該 (紅血球生成刺激) 醣蛋白；以及製備包含編碼 (紅血球生成刺激) 醣蛋白的核酸的宿主細胞之方法。為了重組生產 (紅血球生成刺激) 醣蛋白組成物，將例如如上所述之編碼 (紅血球生成刺激) 醣蛋白的核酸分離並插入到一種或多種載體中，以用於在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此等核酸可通過習用方法 (例如，使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針) 輕易地分離並序列化，或通過重組方法或化學合成進行生產。宿主細胞包括「轉化子」和「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文中包括具有與原始轉化細胞中篩選或選擇的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突變子代細胞。可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞株。可用的哺乳動物宿主細胞株的實例為：由 SV40 (COS-7) 轉形的猴腎 CV1 系；人類胚胎腎系 (如 Graham, F.L. 等人, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 中所描述之 293 或 293T 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (如 Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 中所描述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如 Mather, J.P. 等人, Annals N.Y.Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFR-CHO 細胞 (Urlaub, G. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；及骨髓瘤細胞系，例如 Y0、NS0 及 Sp2/0。在本發明之一個實施例中，宿主細胞為 CHO 細胞。在本發明之一個實施例中，宿主細胞為 CHO-K1 細胞。有關某些適用於抗體生產的哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如：Yazaki, P. 及 Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, 第 248 卷, Lo, B.K.C. (主編)，Humana Press, Totowa, NJ (2004), 第 255-268 頁。

術語「在線 (pH) 測量」係指用通常安裝在生物反應器中的製程感測器直接在生物反應器中進行的測量。如本文所使用，術語「在線 (pH) 探針」或「在線 (pH) 測量裝置」係指安裝在生物反應器中的此類製程感測器。所生成的測量結果可即時發送至系統以用於所測量的參數、例如 pH 值之自動控制。通常在線測量細胞培養製程參數，諸如 pH、溶解氧、溶解 CO₂、溫度及電導率。

術語「唾液酸化」及「經唾液酸化」係指在蛋白質或所關注蛋白質的一部分上存在唾液酸，特定而言作為接附至蛋白質的聚醣鏈 (例如，N-聚醣) 之組分。唾液酸 (本文亦稱為「唾液酸部分」) 通常係指神經胺酸之 N- 或 O- 取代的衍生物。N-乙醯基神經胺酸 (5-乙醯胺基-3,5-二去氧-D-甘油-D-半乳糖醛酸；亦稱為 NANA 或 Neu5Ac) 為哺乳動物中最常見的唾液酸。其他示例性唾液酸包括但不限於 2-酮基-3-去氧-D-甘油-D-半乳糖醛酸 (亦稱為 Kdn)、N-羥乙基神經胺酸 (亦稱為 Neu5Gc 或 NGNA)、神經胺酸 (亦稱為 Neu) 及 2-去氧-2,3-二氫-Neu5Ac (亦稱為 Neu2en5Ac)。游離唾液酸 (Sia) 活化後可用於核苷酸供體 CMP-Sia 上的聚醣合成。在真核生物的高基氏系統中，Sia 從 CMP-Sias 轉移至新合成的醣結合物 (例如，醣蛋白) 上由一組鍵結特異性唾液酸轉移酶 (ST) 催化。唾液酸通常為聚醣 (例如，N-聚醣) 分支的末端殘基。在一些實施例中，唾液酸可以佔有聚醣內的內部位置，最通常是當一個唾液酸殘基與另一殘基相聯時。關於唾液酸化及唾液酸的綜述，參見，例如，Varki 等人, Essentials of Glycobiology, 第 3 版, Cold Spring Flarbor Laboratory Press, 2015-2017 之第 15 章。

如本文所使用，術語「唾液酸含量」係指經醣基化之蛋白質或所關注蛋白質的一部分的唾液酸化之水平或量。關於含有醣蛋白之組成物 (例如，醫藥組成物或批次) 的術語「唾液酸平均含量」係指每莫耳組成物中醣蛋白的組成物中唾液酸之總莫耳數量。因此，例如，此類組成物可含有醣蛋白的異質庫，其中該組成物中個別醣蛋白具有不同的唾液酸化水平 (例如，在每莫耳紅血球生成刺激醣蛋白 0 至 14 莫耳唾液酸的範圍內)。

表 1 - 常見紅血球生成素同功型之實例

紅血球生成素同功型	唾液酸殘基之數量
同功型 2	14
同功型 3	13
同功型 4	12
同功型 5	11
同功型 6	10
同功型 7	9
同功型 8	8

關於唾液酸化，紅血球生成素主要以十種同功型存在。術語「同功型」係指一組紅血球生成素分子，該等分子具有同一胺基酸序列及相同數量的結合唾液酸殘基。同功型具有相同的等電點，並且在醣基殘基結合至胺基酸序列的程度、複雜性及觸角方面可能有所不同。例如，術語「紅血球生成素之同功型 2」涵蓋一組具有 14 個唾液酸殘基的紅血球生成素分子。同功型 3 具有 13 個唾液酸，以此類推。此外，存在具有不在末端處的額外唾液酸的少數形式的紅血球生成素。因此，同功型 1 具有 15 個、且同功型 1' 有 16 個結合至醣基殘基的唾液酸。

如本文所使用，術語「不含唾液酸」係指基本上不含包含末端唾液酸部分的 N-聚醣的醣蛋白群。在一個實施例中，如本文所使用，術語「不含唾液酸」係指醣蛋白群，其包含相對頻率為 5% 或更少的包括唾液酸部分之 N-連接之聚醣。在一個實施例中，不含唾液酸之醣蛋白包含相對頻率為約 0% 的包括唾液酸部分之 N-連接之聚醣。

如本文所使用，術語「醣基化變異體」或「醣化變異體」係指醣蛋白，特定而言紅血球生成刺激醣蛋白，例如紅血球生成素，其特徵在於，其上接附有限定碳水化合物部分。醣蛋白的「醣基化變異體」或「醣化變異體」可為一種醣蛋白，其包含特定的 N-連接之寡醣，特定而言具有 Man3GlcNAc2 之五醣核心並且具有結合至該五醣核心結構的不同數量之分支 (觸角) 的 N-聚醣。在全部態樣及實施例之某些實施例中，「醣基化變異體」可為三觸角的或四觸角的。在另一態樣中，「醣基化變異體」可包括不同數量的結合至 N-連接之寡醣的五醣核心結構的聚 N-乙醯基乳糖胺單元 (「重複」/「聚 N-乙醯基乳糖胺重複」)。特定而言，醣蛋白的「醣基化變異體」可具有「三觸角 + 1 個重複」、「四觸角 + 1 個重複」、「四觸角 + 2 個重複」及/或「四觸角 + 3 個重複」N-聚醣結構。本文中之術語「醣基化變異體」或「醣化變異體」亦包含醣蛋白的「唾液酸化變異體」。如本文所使用，醣蛋白的「唾液酸化變異體」或「唾液酸化之變異體」係指具有特定唾液酸化水平或量的醣蛋白 (例如，在紅血球生成刺激醣蛋白的情況下，這可係每莫耳紅血球生成刺激醣蛋白 0-14 莫耳唾液酸之範圍)。因此，醣蛋白的「醣基化變異體」或「醣化變異體」亦可為包含特定量的唾液酸部分的醣蛋白。在一特定實施例中，紅血球生成醣蛋白的醣基化變異體可為紅血球生成素的主要十種同功型 (同功型 1 至 10) 之一，特定而言表 1 中所示的七種同功型之一。醣蛋白組成物通常可包含醣蛋白的不同醣基化變異體之混合物，該醣蛋白組成物中存在的不同醣基化變異體具有限定相對量。在紅血球生成性組成物的情況下，這可為紅血球生成刺激醣蛋白的不同醣基化變異體之混合物，該組成物中存在的不同醣基化變異體具有限定相對量。

如本文所使用，術語「饋料批式」涉及其中用含有營養物的饋料培養基連續或定期對細胞進行饋料的細胞培養物。饋料可以在細胞培養開始後不久在第 0 天或更通常在開始培養後一天、兩天或三天開始。饋料可以遵循預設的時間表，諸如每天、每兩天、每三天等。替代性地，可以監測培養物的細胞生長、營養物或毒性副產物，並且可以據此調整饋料。批式或饋料批式培養通常在某一點停止，並且收穫培養基中的細胞及/或所關注蛋白質且視情況純化。

術語「培養基特定相關性」係指生物反應器內給定培養基中的 pH 值與在生物反應器的頂部空間及/或排氣中確定的對應 CO ₂濃度之間的關係的數學描述。培養基特定相關性對於相應培養基係通用的及適用的，與位置及所使用的容器無關。可藉由將該培養基置於容器中並且判定在不同 pH 值下的排氣 CO ₂濃度來判定特定培養基的培養基特定相關性，並且使用該資料集來開發合適的模型。由於相關性與規模無關，故實際上任何容器、諸如簡單的罐或生物反應器皆可用於收集此類資料集。較佳地，進行數次測量以提供更穩健的資料集。本領域技術人員熟悉從此類資料集推斷相關性之方法。根據實施例，培養基特定相關性為方程式 FCO2 _M1(pH)=REL -M1(pH)，該方程式係藉由對生物反應器中使用的培養基樣品之 pH 值與相應測量的該樣品上方頂部空間中 CO ₂氣體之分數 (其可以直接在頂部空間中、或更常見地在生物反應器的排氣中測量) 的多個經驗判定之對進行數學擬合而獲得。技術人員熟悉對經驗判斷之資料集進行數學擬合、例如線性、二次或對數擬合之方法。在一個實施例中，資料集係經二次擬合。樣品可為例如生物反應器中的全部無細胞培養基或該培養基的無細胞等分試樣。

作為一個實例，模型之品質，亦即模型描述經建模之資料點的能力，可以藉由回歸係數 R‑平方 (R ²) 來描述。R ²為 1 意指模型完美地描述了全部資料點。在為本方法準備的全部模型中，發現 R 平方大於 0.98。全部模型之均方根誤差皆為 0.02。考慮到校正之潛在誤差、環境因素等，本方法之準確度被認為在培養基之 pH 的 0.03 個 pH 單位內。

如本文所使用，術語「偏差」係指在從離線樣品判定 pH 值時，由多種因素諸如採樣程序、設備、樣品保持時間、樣品溫度變化、樣品的二氧化碳脫氣、設備間差異、一般樣品特性 (諸如細胞密度、溶解二氧化碳及培養基緩衝) 及/或跨位點/尺度壓力效應所引起的與培養基中的真實 pH 值相比的誤差之總和。

術語「pH 測量裝置」或「pH 探針」係指用於測量培養基中當前 pH 值的裝置及/或物質。在一個實施例中，pH 測量裝置為例如電位測定儀器。根據較佳實施例，pH 測量裝置為 pH 計。pH 計可為例如連續 pH 計，亦即，能夠連續且重複地測量生物反應器中培養基之 pH 而無需抽取樣品且無需針對各個別測量將該 pH 計插入培養基中的 pH 計。例如，pH 測量裝置可為精密電壓表，與培養基接觸並且連接至參考電極，並且以這樣的方式進行縮放：不顯示所測量的電位，而顯示現成 pH 值。優先地，pH 測量裝置係浸沒在培養基中，並且用於在生物反應器中培養細胞的整個時間時間重複地或連續地測量培養基中當前 pH 值。例如，pH 測量裝置可以每分鐘、或每 30 分鐘、或每小時測量當前 pH 值。在現今用作 pH 測量裝置的典型 pH 計中，參考電極係內置於 pH 電極中，這使得裝置變得緊湊。

如本文所使用，術語「校準」或「校正」係指下述程序：將測量裝置、諸如 pH 測量裝置的測量值、諸如 pH 值與參考測量值或與已知準確度的校準標準及標稱 (例如 pH) 值進行比較，並且將測量裝置調整為該參考值。pH 測量裝置通常使用具有限定 pH 值的所謂校準緩衝液進行校準。通常，可以使用一種、兩種或三種具有不同 pH 值的緩衝液 (分別為一點、兩點及三點校準)。該程序需要將 pH 測量裝置與校準緩衝液接觸。由於該校準方法會破壞滅菌生物反應器的無菌性，故校準安裝在生物反應器中的在線 pH 測量裝置之常見替代性方法將會是：從生物反應器中取出樣品並使用已知準確度的另一 pH 測量裝置來離線測量樣品之 pH，並且隨後將該在線 pH 測量裝置單點校準為離線所測量 (「離線測量」) 的該 pH 值。

術語「基於二氧化碳的 pH 參考方法」、「基於二氧化碳的校準」或「基於二氧化碳的校正」係指本文所揭示之方法，該方法藉由使用氣相中的二氧化碳濃度與直接影響碳酸鹽緩衝系統中的 pH 值的溶解二氧化碳、碳酸氫鹽及隨之而來的質子濃度之間的培養基特定相關性計算培養基中的 pH 值，來避免對於採樣及離線測量 pH 的需要。該基於二氧化碳的 pH 參考方法與規模及生物反應器配置無關，並且能夠準確地判定生物反應器中的培養基中的 pH 而無需採樣。

術語「培養基之/中的 pH 值」涉及已藉由與培養基直接接觸的在線 pH 測量裝置所判定的 pH 值並且因此沒有藉由例如採樣程序、設備、樣品保持時間、樣品溫度及二氧化碳脫氣的變化、裝置間差異、樣品特性 (細胞密度、溶解二氧化碳濃度、培養基緩衝等) 及/或跨位點/規模壓力效應所引入的偏移，並且已根據公認的標準進行校準，例如具有經認證之 pH 校準標準 4.01、7.00、9.21 pH。在全部態樣之一實施例中，為了以最大準確度判定培養基之/中的 pH 值，可將已校準為具有 0.01 pH 之最大可接受誤差的兩個獨立 pH 測量裝置防止為同時與培養基直接接觸。用上述兩個獨立 pH 測量裝置在培養基中測量的值之最大可接受差異可以設定為 0.02 個 pH 單位，並且可以使用兩個測量值之平均值。

如本文所所用，術語醣基化變異體之「相對含量」係指醣蛋白組成物中特定醣基化變異體之量。通常，醣蛋白組成物可為異質的並且可含有兩種或更多種醣基化變異體，並且因此，沒有單一醣基化變異體構成組成物之 100%。相對含量可用本領域已知的多種形式中之任一者表示；例如，相對含量可表示為組成物中醣蛋白之總量之相對含量，或可表示為相對於特定類型醣基化之量，例如相對於 N-聚醣變異體之總量或相對於唾液酸化同功型之總量。本文描述判定醣基化變異體之相對含量之方法及測定。

如本文所使用，術語「滅菌」係指消除 (去除) 或殺死 (滅活) 全部生命形式及其他生物劑的任何製程。滅菌可用下列中之一者或多者實現：熱、化學品、輻射、高壓及過濾。當系統或系統元件無法移動時 (例如大型不鏽鋼生物反應器)，則使用稱為就地滅菌 (SIP) 的原位滅菌製程。SIP 製程可藉由在滅菌設備之間提供無菌連接來減少或消除滅菌後處理。用於 SIP 的常見滅菌方式為蒸氣 (濕熱)、過熱水、乾熱、氣體、液體及蒸氣滅菌，其中蒸氣為最常見的方法。SIP 方法一般與封閉系統、諸如 GMP 環境中的大規模生物技術製造一起使用，以在產品製造期間維持無菌條件。如本文所使用，術語「在無菌條件下」係指避免及/或防止生物反應器 (包括計入至其的全部容器及裝置)、培養基及/或細胞培養物在已進行生物反應器滅菌後被任何不期望的活生物體污染之條件，該等不期望的活生物體諸如但不限於任何病菌、病原體、包括其孢子在內的微生物 (諸如細菌) 及/或病毒 (但當然不包括表現所關注醣蛋白的重組宿主細胞)。「在無菌條件下」重組生產醣蛋白之方法係本領域技術人員所習知的，並且包括使用如上所述的封閉系統以及合適的措施以確保任何材料 (無論它們是固體、液體或氣體) 或在製造期間、特定而言在培養製程期間與培養基及/或生物反應器內部接觸的任何裝置 (諸如用於曝氣的氣體混合物、進料流、採樣裝置) 不含任何污染性活生物體 (宿主細胞除外)。

如本文所使用，術語「批次間變異性」係指藉由運行重組生產方法一次所獲得的分離醣蛋白組成物與藉由後續運行相同重組生產方法所獲得的另一分離醣蛋白組成物之間的特性之差異。該批次間變異性可關於醣蛋白組成物的任何化學或物理特性諸如醣蛋白濃度、pH 值、滲透壓、醣基化變異體含量或蛋白質修飾 (例如脫醯胺、酸性變異體) 進行定量。在本發明之一個態樣中，批次間變異性係關於至少醣基化變異體、例如 N-聚醣變異體或唾液酸化同功型之相對含量進行判定。

如本文所使用，術語「產量」係指從重組宿主細胞培養物收穫的醣蛋白之量。產量可藉由宿主細胞的「mg 蛋白質/g 生物量」(以乾細胞重量或濕細胞重量測量) 表示。發酵批次之絕對產量可藉由「g 蛋白」表示，並且可藉由使用合適的方法、諸如 RP-HPLC 判定重組醣蛋白組成物之濃度並且藉由將所得濃度乘以所獲醣蛋白組成物之體積來計算。術語「效價」當在本文中使用時類似地指所生產的所關注蛋白質或模型蛋白質之量，以「g 蛋白/L 培養基」呈現。 2. 本發明之方法

在重組 (醣) 蛋白的商業生產中，pH 探針通常置於生物反應器內部以在線測量 pH。在細胞培養製程開始時，將生物反應器關閉並且滅菌，然後用培養基填充之。然而，生物反應器的滅菌對位於該生物反應器中的在線 pH 探針有影響，因為用於 SIP 的溫度通常高於 pH 探針工作範圍並且處於探針內的電解質可能液化的範圍內，導致潛在的不對稱變化。為了能夠依賴於藉由在線 pH 探針所顯示的測量結果，因此需要在滅菌後重新校準。然而，在 GMP (良好生產規範) 製造中，在滅菌及填充後，不再可能在不破壞無菌性且不違反 GMP 原則的情況下直接平衡或重新調整在線 pH 探針。因此，通常使用基於樣品的離線測量來監測及控制細胞培養物之 pH 值。為此，在生物反應器滅菌後從培養基中取得樣品以離線測量 pH (例如使用玻璃電極或血液氣體分析儀)，然後基於離線 pH 值重新調整 (校準) 在線 pH 探針。在培養期間，經常持續進行離線採樣，以便檢測在線 pH 探針中的任何漂移。為此，將離線測量的 pH 值持續地與在線測量的 pH 值進行比較，如果它們顯示的差異超出某一可接受限值，則將在線 pH 探針重新校準為在離線樣品中測量的值。

然而，該程序可能導致問題。各種因素 (諸如測量不準確，緩衝溶液處理錯誤 (例如，不使用新鮮的鹼性緩衝溶液，因為從環境空氣中吸收的 CO ₂導致 pH 值減少)，＞ pH 12 或＜ pH 2 的極端 pH 值，樣品保持時間導致 pH 值、樣品溫度或二氧化碳脫氣發生變化，使用不同離線方法或者不同採樣程序或設備) 可能影響離線所測量的 pH 值，其因此偏離生物反應器內的實際「真實」pH 值。全部此等影響加起來最多可產生 +/- 0.15 個 pH 單位的偏移。因此，與生物反應器內部的實際 pH 相比，根據基於樣品的離線測量結果來重新校準在線 pH 電極引入了顯著偏移，亦即，測量的 pH 值無法準確反映培養基中的 pH。不僅在滅菌後重新調整 pH 電極時而且在用宿主細胞接種培養基之前皆可能引入誤差，導致不同 pH 下的製程不一致性。如果在細胞培養製程期間使用離線測量結果來繼續監測及重新調整在線 pH 探針，則生物反應器內部的細胞之新陳代謝也藉由改變培養基之組成來增加 pH 偏移。

這也可能影響細胞培養製程的控制。通常，針對生產治療性蛋白質的細胞培養製程限定固定的 pH 設定點，並且為了將細胞培養物中的 pH 保持恆定，最常見的是，經由在細胞培養物中的溶解二氧化碳之分壓 (pCO ₂) 或藉由將鹼添加至培養基中來控制培養基。如果測量的 pH 值無法反映培養基中的 pH 值，則可能會錯誤地將 pH 設定為高於或低於所期望設定點的 pH 值，從而導致不期望的結果。

發明人發現，藉由使用將封閉生物反應器中的在線 pH 測量裝置校準為一 pH 值之方法，該方法使得該在線 pH 測量裝置可靠地反映培養基中的 pH 值並且因此避免對於離線 pH 判定之需求，導致當使用哺乳動物宿主細胞培養物在生物反應器中重組生產醣蛋白時，某些醣基化變異體的變異性以及總體產量的變異性大大降低。令人驚訝地發現，在不改變其他參數的情況下，藉由將離線、基於樣品的 pH 測量/校準方法替換為高度準確的基於二氧化碳之方法來判定培養基中的 pH 值並且將在線 pH 探針調整為該 pH 值，僅藉此來解決使用離線、基於樣品的 pH 測量/校準方法給 (大規模) 培養製程帶來的變異性，就可以實現關於重組生產的醣蛋白組成物的醣基化變異體的變異性之顯著改善。

例如，這可以藉由使用非侵入性方法來判定無菌生物反應器中的 pH 及 pCO ₂來實現，該非侵入性方法無需採樣及離線測量。該方法利用在氣相中的二氧化碳與直接影響碳酸鹽緩衝系統中的 pH 的溶解二氧化碳、碳酸氫鹽以及隨之而來的質子濃度之間的化學相關性。該基於二氧化碳的 pH 參考方法與規模及生物反應器配置無關，並且能夠準確地判定生物反應器中的真實 pH 而無需採樣。

在治療性醣蛋白的商業化製造中，降低的變異性不僅導致關於醣基化變異體的高度一致產品品質，而且改善總體製程產量及效率，因為它降低了不滿足所需產物規格的風險，因此避免對於丟棄不符合規格的部分或全部生產批次之需求。

因此，本發明之一個態樣為一種重組生產包含至少一種醣蛋白的醣蛋白組成物之方法，其中該方法包含以下步驟：在生物反應器中的培養基中培養表現該醣蛋白的重組宿主細胞，該生物反應器具有位於該生物反應器中且經組態以與該培養基實體接觸的 pH 測量裝置，其特徵在於， (a) 該培養係在無菌條件下進行， (b) 用該 pH 測量裝置所測量的 pH 值與該培養基之 pH 值相差 0.05 個單位或更少，並且 (c) 與其中藉由該 pH 測量裝置所測量的 pH 值與該培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳相差多於 0.03 個單位之方法相比，在該醣蛋白組成物中的至少一種醣基化變異體之相對含量具有降低的批次間變異性，以及由此生產醣蛋白組成物。

本發明之另一態樣為一種在表現醣蛋白的重組宿主細胞中重組生產包含至少一種醣蛋白的醣蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟： (a) 提供生物反應器，該生物反應器包含位於該生物反應器中且經組態以與培養基實體接觸的 pH 測量裝置， (b) 將該生物反應器關閉並滅菌， (c) 將培養基填充至該生物反應器中， (d) 校準該 pH 測量裝置， (e) 用該重組宿主細胞接種該生物反應器， (f) 在適合生產該醣蛋白組成物的條件下培養該重組宿主細胞，以及 (g) 由此生產醣蛋白組成物其特徵在於，步驟 (d) 之校準包含以下步驟： (i) 將包含二氧化碳氣體的氣體混合物引入該生物反應器中， (ii) 判定在頂部空間及/或排氣中的二氧化碳濃度， (iii) 基於培養基特定相關性計算該培養基之 pH 值，以及 (iv) 將該 pH 測量裝置調整為在步驟 (iii) 中計算的 pH 值。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，在校準步驟之後用 pH 測量裝置測量的 pH 值與培養基之 pH 值相差 0.05 個 pH 單位或更少。在全部態樣及實施例之一較佳實施例中，在校準步驟之後用 pH 測量裝置測量的 pH 與培養基之 pH 值相差 0.03 個 pH 單位或更少。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，判定在生物反應器的排氣中的二氧化碳濃度。

變異性的改善可藉由下述評定：針對醣蛋白組成物的至少兩個發酵批次 (亦即來自根據本發明的方法進行的至少兩次不同培養) 判定的至少一種醣基化變異體的標準差，並將其與針對根據另一方法製造的醣蛋白組成物的至少兩個批次判定的相同醣基化變異體的標準差進行比較，該另一方法亦即其中用 pH 測量裝置所測量的 pH 值與該培養方法之 pH 值相差多於 0.05 個 pH 單位、較佳相差多於 0.03 個 pH 單位之方法。在一個實施例中，藉由將使用除了用於校準 pH 測量裝置之方法外基本相同的製造方法製造的批次之間的標準變化進行比較來比較批次間變異性。在全部態樣及實施例之某些實施例中，針對來自至少三個發酵批次的醣蛋白組成物的至少一種醣基化變異體計算標準差。在另一實施例中，針對來自至少五個發酵批次的醣蛋白組成物的至少一種醣基化變異體計算標準差。在又一實施例中，針對來自至少 10 個發酵批次的醣蛋白組成物的至少一種醣基化變異體計算標準差。

在全部態樣及實施例之一個實施例中，與針對已使用其中藉由 pH 測量裝置所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳相差多於 0.03 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的產量的標準差相比，在培養後醣蛋白組成物的產量具有降低的批次間變異性。在全部態樣及實施例之一個實施例中，與針對已使用其中藉由 pH 測量裝置所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳相差多於 0.03 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的絕對產量的標準差相比，在培養後醣蛋白組成物的絕對產量具有降低的批次間變異性。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，與針對已使用其中藉由 pH 測量裝置所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳相差多於 0.03 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的 (絕對) 產量的標準差相比，針對來自至少兩個發酵批次的醣蛋白組成物計算的 (絕對) 產量的標準差降係減少的。在全部態樣及實施例之某些實施例中，針對來自至少三個發酵批次的醣蛋白組成物計算標準差。在另一實施例中，針對來自至少五個發酵批次的醣蛋白組成物計算標準差。在又一實施例中，針對來自至少十個發酵批次的醣蛋白組成物計算標準差。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，重組宿主細胞為哺乳動物細胞。在全部態樣及實施例之一較佳實施例中，重組宿主細胞為 CHO 細胞。

在某些實施例中，重組生產醣蛋白組成物之方法係用於商業目的及/或使用大規模生物反應器進行。在一個特定實施例中，大規模生物反應器具有至少 10 L、較佳至少 50 L、更佳至少 500 L、特佳至少 5000 L。在全部態樣及實施例之某些實施例中，生物反應器係用於商業目的之重組蛋白質生產。在一個實施例中，本發明之大規模細胞培養方法係適用於 CHO 細胞培養。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，醣基化變異體係選自由以下所組成之群組：N-聚醣變異體、O-聚醣變異體、唾液酸化變異體、甘露醣基化變異體、半乳醣基化變異體及岩藻醣基化變異體。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，用於重組生產醣蛋白組成物之方法包含將培養基中的 pH 維持在所期望設定點之步驟，特定而言在宿主細胞的培養期間。在全部態樣及實施例之某些實施例中，藉由 (a) 如果 pH 高於所期望設定點則增加二氧化碳流入，或 (b) 如果 pH 值低於所期望設定點則向培養基添加鹼性組分、較佳 1 mol/L NaOH 來調整培養基中的所期望 pH 設定點。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，藉由通氣攪動將二氧化碳引入生物反應器中。

本發明之又一態樣為降低重組醣蛋白組成物的批次之間的至少一種醣基化變異體之相對含量的變異性之方法，該方法包含： (a) 提供生物反應器，該生物反應器包含位於該生物反應器中且經組態以與培養基實體接觸的 pH 測量裝置， (b) 將該生物反應器關閉並滅菌， (c) 將培養基填充至該生物反應器中， (d) 校準該 pH 測量裝置， (e) 用表現該醣蛋白的重組宿主細胞接種該生物反應器，以及 (f) 在適合生產該醣蛋白的條件下培養該重組宿主細胞，以及 (g) 由此生產該醣蛋白，其中步驟 (d) 之校準包含以下步驟： (i) 將包含二氧化碳氣體的氣體混合物引入該生物反應器中 (ii) 判定在該生物反應器頂部空間及/或排氣中的二氧化碳濃度， (iii) 基於培養基特定相關性計算該培養基之 pH 值，以及 (iv) 將該 pH 測量裝置調整為在步驟 (iii) 中所計算的 pH 值，並且其中步驟 (a) 至 (g) 產生具有限定相對含量之該醣基化變異體的該重組醣蛋白之第一批次； (h) 重複該等步驟 (a) 至 (g) 產生該醣蛋白之至少一個後續批次，其中該第一批次及該至少一個後續批次之該至少一種醣基化變異體之相對含量具有降低的批次間變異性。

為了確定參數之批次間變異性，必須評定來自不同發酵批次的至少兩種醣蛋白組成物。因此，在全部態樣及實施例之某些實施例中，藉由將來自至少兩個發酵批次的醣蛋白組成物的變異性與來自已使用不同的用於校準 pH 測量裝置 (較佳根據基於樣品的離線 pH 測量結果) 之方法獲得的至少兩個發酵批次的變異性進行比較，評定由於基於二氧化碳的校準方法的批次間變異性之降低。在全部態樣及實施例之某些實施例中，藉由將來自至少三個發酵批次的醣蛋白組成物的變異性進行比較來評定批次間變異性之降低。在另一實施例中，藉由將來自至少五個發酵批次的醣蛋白組成物的變異性進行比較來評定批次間變異性之降低。在另一實施例中，藉由將來自至少十個發酵批次的醣蛋白組成物的變異性進行比較來評定批次間變異性之降低。

在全部態樣及實施例之一較佳實施例中，針對該第一批次及至少一個後續批次計算的醣蛋白之相對含量的標準差為 pH 值之中位數的 1% 或更少、特定而言 0.8% 或更少、最特定而言 0.5% 或更少。

本發明之另一態樣為一種校準位於生物反應器中且經組態以與該生物反應器中的培養基實體接觸的 pH 測量裝置之基於二氧化碳的方法之用途，其用於與已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳多於 0.03 個單位的 pH 方法生產的醣蛋白組成物相比，降低在至少兩個發酵批次之間所計算的醣蛋白組成物中的醣基化變異體之相對含量的標準差。在全部態樣及實施例之一較佳實施例中，基於二氧化碳的方法包含以下步驟：(i) 將包含二氧化碳氣體的氣體混合物引入包含培養基的生物反應器中，(ii) 判定在該生物反應器頂部空間及/或排氣中的二氧化碳濃度，(iii) 基於培養基特定相關性計算該培養基之 pH，及 (iv) 將 pH 測量裝置調整為在步驟 (iii) 中計算的 pH 值。在一個實施例中，該用途為用於與已生產的醣蛋白組成物相比降低標準差，包含根據基於樣品的離線 pH 測量結果來校準 pH 測量裝置。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，培養基係經碳酸鹽緩衝。在該態樣之某些實施例中，藉由通氣攪動將二氧化碳氣體引入生物反應器中。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，醣蛋白組成物為紅血球生成性組成物。在該態樣之一較佳實施例中，醣蛋白為紅血球生成刺激醣蛋白。在全部態樣及實施例之某些實施例中，醣蛋白組成物為紅血球生成素。

本發明之一個態樣為藉由本文所揭示之方法所生產的紅血球生成性組成物。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物的特徵在於 (a) 約 3.3 面積-% 至約 3.8 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有雙觸角結構； (b) 約 8.6 面積-% 至約 9.5 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有三觸角結構； (c) 約 5.6 面積-% 至約 5.9 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有三觸角 + 1 個重複結構； (d) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角結構； (e) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 1 個重複結構； (f) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 2 個重複結構； (g) 約 13.2 面積-% 至約 16.0 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 2； (h) 約 24.1 面積-% 至約 26.5 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 3； (i) 約 23.5 面積-% 至約 24.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣屬於同功型 4； (j) 約 17.1 面積-% 至約 18.6 面積-% 紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 5； (k) 約 9.4 面積-% 至約 11.8 面積-% 紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 6； (l) 約 3.7 面積-% 至約 5.5 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 7；及/或 (m) 約 0.9 面積-% 至約 1.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 8。在全部態樣及實施例之實施例中，紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣的面積百分比係在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡糖以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析判定。在某些實施例中，陰離子交換層析為帶有脈衝電流檢測的高效陰離子交換層析 (HPAEC-PAD)。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物中的同功型之面積百分比係藉由毛細管區帶電泳判定。

在線 pH 測量裝置有時可能出現不希望的 pH 漂移，這可能對細胞培養中的製程性能、產品品質及產品產量產生不利影響。因此，在全部態樣及實施例之某些實施例中，生物反應器包含定位在生物反應器中且經組態以與培養基實體接觸的至少兩個 pH 測量裝置。在全部態樣及實施例之一較佳實施例中，當藉由該至少兩個 pH 測量裝置所判定的 pH 值彼此相差多於 0.05 個單位時，發出警報。該警報表明藉由該等探針的測量結果可能不再可靠，並且允許採取適當的對策以避免任何不期望之後果，諸如無意中將培養基 pH 調整為錯誤的 pH 設定點。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，藉由針對培養基收集至少一個培養基特定資料集來判定培養基特定相關性，其中使用以下步驟收集該資料集： (a) 將培養基填充到罐、較佳生物反應器中，其中該罐具有位於該罐中且經組態以與培養基實體接觸的至少一個 pH 測量裝置， (b) 將包含二氧化碳的氣體混合物引入該罐中， (c) 用該 pH 測量裝置測量培養基中的 pH，其中該 pH 測量裝置已經校準 (在非無菌條件下) 以測量培養基中的 pH， (d) 變更以下任一者： (i) 該培養基中的 pH 並且針對至少兩個不同 pH 值測量在頂部空間及/或排氣中的二氧化碳濃度，或 (ii) 在氣體混合物中的二氧化碳濃度並且針對在該氣體混合物中的至少兩種不同二氧化碳濃度測量 pH 值，以及 (e) 藉由數學擬合至少兩對頂部空間/排氣二氧化碳濃度及培養基中的對應 pH 值獲得培養基特定相關性。

應該注意的是，資料集的收集只能在不再處於無菌條件下的製程中進行，因為用於測量培養基之 pH 值的 pH 探針係藉由從用於校準的罐 (生物反應器) 取出 pH 探針、較佳藉由使 pH 測量裝置與校準緩衝液接觸並且將其放回罐 (生物反應器) 中進行校準。

在生物反應器中的氣相中的二氧化碳與培養基中的溶解二氧化碳之間形成平衡可能需要一些時間。因此，在全部態樣及實施例之某些實施例中，在生物反應器中的氣相中的二氧化碳與培養基中的溶解二氧化碳之間已形成平衡之後判定在頂部空間及/或排氣中的二氧化碳。

基於二氧化碳的 pH 校準方法不僅可以用於主階段發酵，亦可用於種株培養期間，亦即用於彼等經進行以生成足夠高數量的宿主細胞以接種主階段發酵的生物反應器的培養步驟中。因此，在全部態樣及實施例之某些實施例中，在接種步驟之前，已在至少一個預培養步驟中在用於預培養的生物反應器中在預培養基中培養重組宿主細胞，其中用於預培養的生物反應器具有位於該生物反應器中其經組態以與預培養基實體接觸的至少一個 pH 測量裝置，並且其中在用於預培養的生物反應器中的該 pH 測量裝置係根據下列步驟校準： (i) 將包含二氧化碳氣體的氣體混合物引入該生物反應器中 (ii) 判定在用於預培養的生物反應器頂部空間及/或排氣中的二氧化碳濃度， (iii) 基於預培養基特定相關性計算該培養基之 pH，以及 (iv) 將該 pH 測量裝置調整為在步驟 (iii) 中計算的 pH。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，用於重組生產醣蛋白之方法包含將培養基中的 pH 維持在 pH 6.95 的所期望設定點之步驟。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，醣蛋白為紅血球生成性組成物。在全部態樣及實施例之一較佳實施例中，醣蛋白為紅血球生成刺激醣蛋白、特定而言紅血球生成素。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一种醣基化變異體，該變異體係選自由以下所組成之群組：(a) 具有帶雙觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(b) 具有帶三觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(c) 具有帶三觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(d) 具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(e) 具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(f) 具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(g) 具有 14 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白酸 (同功型 2)，(h) 具有 13 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 3)，(i) 具有 12 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 4)，(j) 具有 11 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 5)，(k) 具有 10 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 6)，(l) 具有 9 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 7)，及 (m) 具有 8 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 8)。在全部態樣及實施例之某些實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一种醣基化變異體，該變異體係選自由以下所組成之群組：(a) 具有帶雙觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(b) 具有帶三觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(c) 具有帶三觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(d) 具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(e) 具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(f) 具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白。在全部態樣及實施例之某些實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一种醣基化變異體，該變異體係選自由以下所組成之群組：(a) 具有 14 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 2)，(b) 具有 13 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 3)，(c) 具有 12 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 4)，(d) 具有 11 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 5)，(e) 具有 10 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 6)，(f) 具有 9 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 7)，及 (g) 具有 8 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 8)。在全部態樣及實施例之某些實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一种醣基化變異體，該變異體係選自由以下所組成之群組：(a) 具有帶三觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(b) 具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(c) 具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，及 (d) 具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(e) 具有 14 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 2)，(f) 具有 13 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 3)，(g) 具有 11 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 5)，(h) 具有 10 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 6)，及 (i) 具有 9 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 7)。在全部態樣及實施例之某些實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一种醣基化變異體，該變異體係選自由以下所組成之群組：(a) 具有帶三觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(b) 具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(c) 具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，及 (d) 具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白。在全部態樣及實施例之某些實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一种醣基化變異體，該變異體係選自由以下所組成之群組：(a) 具有 14 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 2)，(b) 具有 13 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 3)，(c) 具有 11 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 5)，(d) 具有 10 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 6)，及 (e) 具有 9 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 7)。在全部態樣及實施例之某些實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。在一較佳實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.03 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一种醣基化變異體，該變異體係選自由以下所組成之群組：(a) 具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(b) 具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(c) 具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(d) 具有 14 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 2)，及 (e) 具有 13 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 3)。在全部態樣及實施例之某些實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一种醣基化變異體，該變異體係選自由以下所組成之群組：(a) 具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(b) 具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，及 (c) 具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一种醣基化變異體，該變異體係選自由以下所組成之群組：(a) 具有 14 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 2)，及 (b) 13 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 3)。在全部態樣及實施例之某些實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。在一較佳實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.03 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含限定量的具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白的至少一种醣基化變異體。在全部態樣及實施例之某些實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含限定量的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白的至少一种醣基化變異體。在全部態樣及實施例之某些實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含限定量的具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白的至少一种醣基化變異體。在全部態樣及實施例之某些實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一种醣基化變異體，該變異體具有 14 個唾液酸殘基 (同功型 2)。在全部態樣及實施例之某些實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一种醣基化變異體，該變異體具有 13 個唾液酸殘基 (同功型 3)。在全部態樣及實施例之某些實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。

在一較佳實施例中，與針對已使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.03 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對至少兩個發酵批次之間的紅血球生成性組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含選自由以下所組成之群組中之一者或多者：(a) 約 3.3 面積-% 至約 3.8 面積-% 的具有帶雙觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(b) 約 8.6 面積-% 至約 9.5 面積-% 的具有帶三觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(c) 約 5.6 面積-% 至約 5.9 面積-% 的具有帶三觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(d) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(e) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(f) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，(g) 約 13.2 面積-% 至約 16.0 面積-% 的同功型 2 之紅血球生成刺激醣蛋白；(h) 約 24.1 面積-% 至約 26.5 面積-% 的同功型 3 之紅血球生成刺激醣蛋白；(i) 約 23.5 面積-% 至約 24.6 面積-% 的同功型 4 之紅血球生成刺激醣蛋白；(j) 約 17.1 面積-% 至約 18.6 面積-% 的同功型 5 之紅血球生成刺激醣蛋白；(k) 約 9.4 面積-% 至約 11.8 面積-% 的同功型 6 之紅血球生成刺激醣蛋白；(l) 約 3.7 面積-% 至約 5.5 面積-% 的同功型 7 之紅血球生成刺激醣蛋白；及 (m) 約 0.9 面積-% 至約 1.6 面積-% 的同功型 8 之紅血球生成刺激醣蛋白。在全部態樣及實施例之實施例中，紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣的面積百分比係在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡糖以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析判定。在某些實施例中，陰離子交換層析為帶有脈衝電流檢測的高效陰離子交換層析 (HPAEC-PAD)。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物中的同功型之面積百分比係藉由毛細管區帶電泳判定。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含選自由以下所組成之群組中之一者或多者：(a) 約 3.3 面積-% 至約 3.8 面積-% 的具有帶雙觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(b) 約 8.6 面積-% 至約 9.5 面積-% 的具有帶三觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(c) 約 5.6 面積-% 至約 5.9 面積-% 的具有帶三觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(d) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(e) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(f) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含選自由以下所組成之群組中之一者或多者：(a) 約 13.2 面積-% 至約 16.0 面積-% 的同功型 2 之紅血球生成刺激醣蛋白；(b) 約 24.1 面積-% 至約 26.5 面積-% 的同功型 3 之紅血球生成刺激醣蛋白；(c) 約 23.5 面積-% 至約 24.6 面積-% 的同功型 4 之紅血球生成刺激醣蛋白；(j) 約 17.1 面積-% 至約 18.6 面積-% 的同功型 5 之紅血球生成刺激醣蛋白；(k) 約 9.4 面積‑% 至約 11.8 面積-% 的同功型 6 之紅血球生成刺激醣蛋白；(e) 約 3.7 面積-% 至約 5.5 面積-% 的同功型 7 之紅血球生成刺激醣蛋白；及 (f) 約 0.9 面積-% 至約 1.6 面積-% 的同功型 8 之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地如藉由毛細管區帶電泳所判定。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含選自由以下所組成之群組中之一者或多者：(a) 約 8.6 面積-% 至約 9.5 面積-% 的具有帶三觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(b) 約 5.6 面積-% 至約 5.9 面積-% 的具有帶三觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(c) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(d) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定；(e) 約 13.2 面積-% 至約 16.0 面積-% 的同功型 2 之紅血球生成刺激醣蛋白；(f) 約 24.1 面積-% 至約 26.5 面積-% 的同功型 3 之紅血球生成刺激醣蛋白；(g) 約 17.1 面積-% 至約 18.6 面積-% 的同功型 5 之紅血球生成刺激醣蛋白；(h) 約 9.4 面積-% 至約 11.8 面積-% 的同功型 6 之紅血球生成刺激醣蛋白；及 (i) 約 3.7 面積-% 至約 5.5 面積-% 的同功型 7 之紅血球生成刺激醣蛋白；較佳地如藉由毛細管區帶電泳所判定。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含選自由以下所組成之群組中之一者或多者：(a) 約 8.6 面積-% 至約 9.5 面積-% 的具有帶三觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(b) 約 5.6 面積-% 至約 5.9 面積-% 的具有帶三觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(c) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；及 (d) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含選自由以下所組成之群組中之一者或多者：(a) 約 13.2 面積-% 至約 16.0 面積-% 的同功型 2 之紅血球生成刺激醣蛋白；(b) 約 24.1 面積-% 至約 26.5 面積-% 的同功型 3 之紅血球生成刺激醣蛋白；(c) 約 17.1 面積-% 至約 18.6 面積-% 的同功型 5 之紅血球生成刺激醣蛋白；(d) 約 9.4 面積-% 至約 11.8 面積-% 的同功型 6 之紅血球生成刺激醣蛋白；及 (e) 約 3.7 面積-% 至約 5.5 面積-% 的同功型 7 之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地如藉由毛細管區帶電泳所判定。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含選自由以下所組成之群組中之一者或多者：(a) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(b) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(c) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定；以及 (d) 約 13.2 面積-% 至約 16.0 面積-% 的同功型 2 之紅血球生成刺激醣蛋白；及 (e) 約 24.1 面積-% 至約 26.5 面積-% 的同功型 3 之紅血球生成刺激醣蛋白；較佳地如藉由毛細管區帶電泳所判定。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含選自由以下所組成之群組中之一者或多者：(a) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(b) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；及 (c) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含選自由以下所組成之群組中之一者或多者：(a) 約 13.2 面積-% 至約 16.0 面積-% 的同功型 2 之紅血球生成刺激醣蛋白；(b) 約 24.1 面積-% 至約 26.5 面積-% 的同功型 3 之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地如藉由毛細管區帶電泳所判定。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含選自由以下所組成之群組中之一者或多者：(a) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；(b) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；及 (c) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 2 個重複結構，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含約 26.5 面積-% 至約 28.2 面積-% 的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含約 27.0 面積-% 至約 28.1 面積-% 的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物包含約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成性組成物具有每莫耳紅血球生成刺激醣蛋白約 10.5 至 11.0 莫耳唾液酸的平均唾液酸含量。

在全部態樣及實施例之一較佳實施例中，紅血球生成刺激醣蛋白為紅血球生成素。

本文亦揭示醣蛋白、特定而言紅血球生成刺激醣蛋白、特定而言紅血球生成素，其係藉由本文所揭示之方法獲得。本文進一步揭示醣蛋白、特定而言紅血球生成刺激醣蛋白、特定而言紅血球生成素，其可藉由本文所揭示之方法獲得。

本文所揭露之重組醣蛋白、特定而言紅血球生成刺激醣蛋白、特定而言紅血球生成素，可摻入 (例如配製) 到醫藥組成物中。據此，在另一態樣中，本發明涉及生產包含醣蛋白的醫藥組成物之方法，該方法關於一種或多種醣基化變異體具有降低的批次間變異性，其中該方法包含實施如本文所述之生產醣蛋白組成物及/或降低重組醣蛋白批次之間的醣基化變異體之變異性之方法。一個態樣亦為用本文所揭示之醣蛋白製備的醫藥組成物。

在一些實施例中，生產醫藥組成物之方法進一步包含將該重組醣蛋白 (亦即，從本文所述之方法獲得) 與醫藥上可接受之載劑組合在一起。此類醫藥組成物可用作替代物及/或相對於對應的參考醣蛋白改善的組成物用於預防及/或治療一種或多種疾病。包含醣蛋白的醫藥組成物可藉由本領域技術人員已知的彼等方法來配製。醫藥組成物可以可注射配製物的形式腸胃外投予，該配製物包含在水或另一醫藥上可接受之液體中的無菌溶液或懸浮液。例如，醫藥組成物可藉由將醣蛋白與醫藥上可接受之媒介物或培養基合適地組合來配製，該媒介物或培養基諸如無菌水、生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、穩定劑、調味賦形劑、稀釋劑、媒介物、防腐劑、接著劑。醫藥製劑中所包括的活性成分之量使得提供指定範圍內的合適劑量。

注射用無菌組成物可以根據習用醫藥實踐使用注射用蒸餾水作為媒介物來配製。例如，生理食鹽水或含有葡萄糖及其他補充物諸如 D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇及氯化鈉的等張溶液可用作注射用水溶液，視情況與合適的增溶劑 (例如醇諸如乙醇及多元醇諸如丙二醇或聚乙二醇) 以及非離子界面活性劑諸如聚山梨醇酯 80™ 等組合。

其他可包括的類目為緩衝劑諸如磷酸鹽緩衝劑或乙酸鈉緩衝劑、舒緩劑諸如鹽酸普魯卡因、穩定劑諸如苯甲醇或苯酚、以及抗氧化劑。經配製之注射劑可包裝在合適的安瓿中。投予途徑可為胃腸外，例如藉由注射投予、經鼻投予、經肺投予或經皮投予。投予可係全身性或局部的，藉由靜脈內注射、肌肉內注射、腹膜內注射、皮下注射進行。可基於患者的年齡及狀況選擇合適的投予方式。含有經修飾之醣蛋白的醫藥組成物之單一劑量可選自 0.001 至 1000 mg/kg 體重之範圍。另一方面，劑量可在 0.001 至 100000 mg/體重之範圍內選擇，但本揭露不限於此類範圍。投予之劑量及方法依據患者之體重、年齡、狀況等而變化，並且本領域技術人員可以按照需要合適地選擇。

根據以下圖式、描述及申請專利範圍，其他技術特徵對於本領域技術人員而言是顯而易見的。 3. 分析測定

對醣蛋白的醣基化變異體進行分析及定量之方法為本領域技術人員所習知的。

醣基化變異體可直接從培養基或細胞培養物上清液判定，亦即一旦已移除宿主細胞後即從培養基判定。在藉由本領域技術人員已知的方法 (諸如親和層析 (在抗體的情況下，蛋白 A 層析)、離子交換層析、疏水相互作用層析、超濾、滲濾、沉澱、離心及/或深度過濾) 判定醣基化變異體之前，醣蛋白組成物可以經歷一個或多個純化步驟。本領域技術人員知道適合且可用於製備用於分析測定的醣蛋白樣品之方法。在全部態樣及實施例之某些實施例中，醣基化變異體的定量係基於所檢測的對應於醣基化變異體的峰之相對面積百分比。峰之相對面積百分比對應於如藉由檢測器所測量的層析圖中的峰下之積分面積，相對於完整層析圖、例如藉由帶有脈衝電流檢測的高效陰離子交換層析或藉由毛細管區帶電泳生成的層析圖之總積分峰面積。在全部態樣及實施例之某些實施例中，在對醣基化變異體進行定性及/或定量分析之前，對藉由培養重組宿主細胞獲得的醣蛋白組成物進行進一步分離及/或純化步驟。在一個實施例中，醣蛋白為紅血球生成素且已使用下游純化製程進行純化，該下游純化製程包含選自由以下所組成之群組之一個或多個步驟：捕獲層析 (例如藍色瓊脂糖層析)、疏水相互作用層析 (例如丁基 toyopearl 層析)、吸附層析 (例如羥基磷灰石超凝膠層析)、製備型反相高效液相層析 (RP-HPLC) 及陰離子交換層析 (例如 DEAE Sepharose 層析)。該製程可進一步包含病毒去除步驟 (例如奈米過濾)。

在全部態樣及實施例之某些實施例中，以某種 N-聚醣結構為特徵之醣蛋白的醣基化變異體之定量係基於所檢測的對應於該醣基化變異體的峰之相對面積百分比，如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及視情況進行的酶促去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。在某些實施例中，陰離子交換層析為帶有脈衝電流檢測的高效陰離子交換層析 (HPAEC-PAD)。在全部態樣及實施例之某些實施例中，醣蛋白的唾液酸化同功型之定量係基於所檢測的對應於醣基化變異體的峰之相對面積百分比，如藉由毛細管區帶電泳所判定。

可藉由此領域中已知的各種測定法對本文所揭示之紅血球生成刺激醣蛋白的物理/化學性質及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。在全部態樣及實施例之某些實施例中，以某種 N-聚醣結構為特徵的紅血球生成刺激醣蛋白、諸如紅血球生成素的醣基化變異體之定量係基於所檢測的對應於該醣基化變異體的峰之相對面積百分比，如在 (較佳地使用酶 N-糖苷酶 F) 從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及 (較佳地藉由使用酶神經胺糖酸苷酶) 去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。在某些實施例中，陰離子交換層析為帶有脈衝電流檢測的高效陰離子交換層析 (HPAEC-PAD)。在某些實施例中，使用本文所述的紅血球生成素 N-聚醣譜之分析測定來進行定量。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成刺激醣蛋白的唾液酸化同功型之定量係基於所檢測的對應於醣基化變異體的峰之相對面積百分比，如藉由毛細管區帶電泳所判定。在全部態樣及實施例之某些實施例中，使用本文所述之用於判定紅血球生成刺激醣蛋白同功型含量之分析測定來進行紅血球生成刺激醣蛋白的唾液酸化同種型之定量。

例如，歐洲藥典描述了用於紅血球生成素之 N-聚醣分析以及用於紅血球生成素同功型之毛細管區帶電泳 (CZE) 的測定 (Ph. Eur. 11.0, 2673 (01/2023))。用於紅血球生成素同功型之 CZE 之方法亦例如在 Brinks 等人 (Pharm Res (2011) 28:386–393; DOI 10.1007/s11095-010-0288-2) 中或在 Zhang 等人 (J Pharm Biomed Anal 50(3):538-43; DOI:10.1016/j.jpba.2009.05.007) 中描述。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成素 N-聚醣之相對含量係根據歐洲藥典 (Ph. Eur. 11.0, 2673 [01/2023]) 中所述之方法判定。在全部態樣及實施例之某些實施例中，紅血球生成素同功型之相對含量係根據歐洲藥典 (Ph. Eur. 11.0, 2673 [01/2023]) 中所述之方法判定。下面，將描述用於分析紅血球生成刺激醣蛋白之示例性方法。 用於判定紅血球生成刺激醣蛋白同功型含量之測定

同功型分佈可藉由毛細管區帶電泳來判定。在該方法中，分離係在帶有均勻緩衝系統的未塗覆玻璃毛細管中以恆定場強進行，其 pH 值高於 EPO 同功型之 pI 值。由於全部 EPO 同功型皆帶負電荷且藉由內滲流運送至陰極，故首先檢測到鹼性同功型。將樣品在水中滲濾。用電解質溶液沖洗毛細管，然後將稀釋的樣品添加至毛細管中。藉由施加 25,000 V 的高電壓進行分離。使用含有過量正離子的移動緩衝液，該等正離子產生電滲流。可使用石英毛細管及二極體陣列檢測器經由光度檢測來檢測毛細管中的蛋白質。可藉由將對應於同功型 1 至同功型 9 的峰積分以獲得峰下面積 [相對面積-%] 來定量地判定同功型。 用於判定紅血球生成刺激醣蛋白 N- 聚醣譜之測定

N-聚醣的相對分佈可使用酶促測試程序與帶有脈衝電流檢測的高效陰離子交換層析系統 (HPAEC-PAD) 來判定，基本上如 WO 99/28346 中所述。在該程序中，紅血球生成素之 N-糖苷連接的寡醣最初藉由 N-糖苷酶 F 裂解。此外，在神經胺酸酶之輔助下，將末端唾液酸從寡醣中去除。在經由超濾去除蛋白質部分後，借助 HPAEC-PAD 及合適的資料記錄系統對所獲 N-低聚醣進行分離及分析。在一系列測試期間，以與樣品完全相同的方式處理紅血球生成素參考標準品。製劑中各醣基化變異體之面積百分比可從所生產的聚醣 (例如雙觸角、三觸角、三觸角 + 1 個重複、四觸角、四觸角 + 1 個重複、四觸角 + 2 個重複) 之層析圖中的相應峰計算。 唾液酸殘基之含量的判定

基本上如 WO 99/28346 中所述，在用神經胺酸酶對唾液酸進行酶促切割後，可藉由 HPAEC-PAD 以層析方法判定唾液酸含量。為此，將紅血球生成素樣品稀釋在磷酸鈉緩衝液 (pH 7.2) 中。各製劑之一半用於藉由 RP-HPLC 判定樣品中的確切紅血球生成素量。將神經胺酸酶添加至各製劑之另一半，並在 37℃ 孵育過夜。隨後，將消化混合物分為兩半，用水稀釋並且將其 50 μl 施加至 HPAEC-PAD。所施加之樣品中的唾液酸之量可藉助校準線來判定，該校準線可從在同一測試運作中分析的唾液酸標準品之值獲得。唾液酸含量 (唾液酸莫耳數/紅血球生成素莫耳數) 可從唾液酸判定之結果以及藉由 RP-HPLC 判定所述使用的紅血球生成素之量的結果來計算。 4. 發明之實施例

本發明至少涵蓋以下獨立態樣及從屬實施例： 1.一種重組生產包含至少一種醣蛋白的醣蛋白組成物之方法，其中該方法包含以下步驟：在生物反應器中的培養基中培養表現該醣蛋白的重組宿主細胞，該生物反應器具有位於該生物反應器中且經組態以與該培養基實體接觸的 pH 測量裝置，其特徵在於， (a) 該培養係在無菌條件下進行， (b) 用該 pH 測量裝置所測量的 pH 值與該培養基之 pH 值相差 0.05 個單位或更少，並且 (c) 與其中藉由該 pH 測量裝置所測量的 pH 值與該培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳相差多於 0.03 個單位之方法相比，在該醣蛋白組成物中的至少一種醣基化變異體之相對含量具有降低的批次間變異性，以及由此生產醣蛋白組成物。 2.一種在表現醣蛋白的重組宿主細胞中重組生產包含至少一種醣蛋白的醣蛋白組成物之方法，其包含以下步驟： (a) 提供生物反應器，該生物反應器包含位於該生物反應器中且經組態以與培養基實體接觸的 pH 測量裝置， (b) 將該生物反應器關閉並滅菌， (c) 將培養基填充至該生物反應器中， (d) 校準該 pH 測量裝置， (e) 用該重組宿主細胞接種該生物反應器， (f) 在適合生產該醣蛋白組成物的條件下培養該重組宿主細胞，以及 (g) 由此生產醣蛋白組成物，其特徵在於，步驟 (d) 之校準包含以下步驟： (i) 將包含二氧化碳氣體的氣體混合物引入該生物反應器中， (ii) 判定在頂部空間及/或排氣中的二氧化碳濃度， (iii) 基於培養基特定相關性計算該培養基之 pH 值，以及 (iv) 將該 pH 測量裝置調整為在步驟 (iii) 中計算的 pH 值。 3.如實施例 2 之方法，其特徵在於，在校正步驟之後，用 pH 測量裝置測量的 pH 與培養基之 pH 值相差 0.05 個單位或更少、較佳相差 0.03 個單位或更少。 4.如實施例 1 至 3 中任一項之方法，其特徵在於，該醣蛋白組成物包含醣蛋白的至少一種醣基化變異體，並且與針對已使用其中藉由 pH 測量裝置所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳相差多於 0.03 個單位之方法生產的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對來自至少兩個發酵批次的醣蛋白組成物計算的醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。 5.如實施例 4 之方法，其中針對來自至少五個、較佳至少十個發酵批次的醣蛋白組成物計算標準差。 6.如實施例 1 至 5 中任一項之方法，其中重組宿主細胞為哺乳動物細胞。 7.如請求項 1 至 6 中任一項之方法，其中重組宿主細胞為 CHO 細胞。 8.如實施例 4 至 7 中任一項之方法，其中醣基化變異體係選自由以下所組成之群組：N-聚醣變異體、O-聚醣變異體、唾液酸化變異體、甘露醣基化變異體、半乳醣基化變異體及岩藻醣基化變異體。 9.如實施例 1 至 8 中任一項之方法，其中培養基包含碳酸鹽緩衝劑。 10.如實施例 1 至 9 中任一項之方法，包含將培養基中的 pH 維持在 pH 6.95 的所期望設定點之步驟。 11.如實施例 1 至 10 中任一項之方法，其中培養基中的所期望 pH 設定點係藉由以下方式調整： (a) 如果 pH 值高於所期望設定點則增加二氧化碳流入，或 (b) 如果 pH 值低於所期望設定值則向培養基中添加鹼性組分、較佳 1 mol/L NaOH。 12.如實施例 1 至 11 中任一項之方法，其中藉由通氣攪動將二氧化碳引入生物反應器中。 13.如實施例 1 至 12 中任一項之方法，其中生物反應器包含位於該生物反應器中且經組態以與培養基實體接觸的至少兩個 pH 測量裝置。 14.如實施例 1 至 13 中任一項之方法，其中當藉由該至少兩個 pH 測量裝置所判定的 pH 值彼此相差多於 0.05 個單位時，發出警報。 15.如實施例 1 至 14 中任一項之方法，其中藉由針對培養基收集至少一個培養基特定資料集來判定培養基特定相關性，其中使用以下步驟收集該資料集： (a) 將培養基填充到罐、較佳生物反應器中，其中該罐具有位於該罐中且經組態以與培養基實體接觸的至少一個 pH 測量裝置， (b) 將包含二氧化碳的氣體混合物引入該罐中， (c) 用該 pH 測量裝置測量培養基中的 pH，其中該 pH 測量裝置已經在非無菌條件下校準以測量培養基中的 pH， (d) 變更以下任一者： (i) 該培養基中的 pH 並且針對至少兩個不同 pH 值測量在該罐之頂部空間及/或排氣中的二氧化碳濃度，或 (ii) 在氣體混合物中的二氧化碳濃度並且針對在該氣體混合物中的至少兩種不同二氧化碳濃度測量 pH 值，以及 (e) 藉由數學擬合至少兩對頂部空間及/或排氣二氧化碳濃度及培養基中的對應 pH 獲得培養基特定相關性。 16.如實施例 1 至 15 中任一項之方法，其中在罐、較佳地在生物反應器中的氣相中的二氧化碳濃度與培養基中的溶解二氧化碳之間已形成平衡之後判定在頂部空間及/或排氣中的二氧化碳。 17.如實施例 1 至 16 中任一項之方法，其特徵在於，在接種之前，已在至少一個預培養步驟中在用於預培養的生物反應器中在預培養基中培養重組宿主細胞，其中用於預培養的生物反應器具有位於該生物反應器中其經組態以與預培養基實體接觸的至少一個 pH 測量裝置，並且其中在用於預培養的生物反應器中的該 pH 測量裝置係根據實施例 2 之步驟 (i) 至 (iii) 校準。 18.如實施例 1 至 17 中任一項之方法，其中醣蛋白組成物為紅血球生成性組成物。 19.如實施例 1 至 18 中任一項之方法，其中醣蛋白為紅血球生成刺激醣蛋白、較佳為紅血球生成素。 20.如實施例 18 或 19 之方法，其特徵進一步在於，紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一種醣基化變異體，該變異體選自由以下所組成之群組： (a) 具有帶雙觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (b) 具有帶三觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (c) 具有帶三觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (d) 具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (e) 具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (f) 具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (g) 具有 14 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 2)； (h) 具有 13 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 3) (i) 具有 12 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 4)； (j) 具有 11 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 5)； (k) 具有 10 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 6)； (l) 具有 9 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 7)；及 (m) 具有 8 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 8)。 21.如實施例 18 至 20 中任一項之方法，其特徵在於，紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一種醣基化變異體，該變異體選自由以下所組成之群組： (a) 具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (b) 具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (c) 具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (d) 具有 14 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 2)；及 (e) 具有 13 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 3)。 22.如實施例 18 至 21 中任一項之方法，其特徵在於，紅血球生成性組成物包含選自由以下所組成之群組中之一者或多者： (a) 約 3.3 面積-% 至約 3.8 面積-% 的具有帶雙觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (b) 約 8.6 面積-% 至約 9.5 面積-% 的具有帶三觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (c) 約 5.6 面積-% 至約 5.9 面積-% 的具有帶三觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (d) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (e) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (f) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (g) 約 13.2 面積-% 至約 16.0 面積-% 的同功型 2 之紅血球生成刺激醣蛋白； (h) 約 24.1 面積-% 至約 26.5 面積-% 的同功型 3 之紅血球生成刺激醣蛋白； (i) 約 23.5 面積-% 至約 24.6 面積-% 的同功型 4 之紅血球生成刺激醣蛋白； (j) 約 17.1 面積-% 至約 18.6 面積-% 的同功型 5 之紅血球生成刺激醣蛋白； (k) 約 9.4 面積-% 至約 11.8 面積-% 的同功型 6 之紅血球生成刺激醣蛋白； (l) 約 3.7 面積-% 至約 5.5 面積-% 的同功型 7 之紅血球生成刺激醣蛋白；及/或 (m) 約 0.9 面積-% 至約 1.6 面積-% 的同功型 8 之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地，其中 (a) 至 (f) 係在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析判定，並且 (g) 至 (m) 係藉由毛細管區帶電泳判定。 23.如實施例 18 至 22 中任一項之方法，其特徵在於，紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一種醣基化變異體，該變異體選自由以下所組成之群組： (a) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (b) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (c) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (d) 約 13.2 面積-% 至約 16.0 面積-% 的同功型 2 之紅血球生成刺激醣蛋白；及 (e) 約 24.1 面積-% 至約 26.5 面積-% 的同功型 3 之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地，其中 (a) 至 (c) 係在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析判定，並且 (d) 至 (e) 係藉由毛細管區帶電泳判定。 24.如實施例 18 至 23 中任一項之方法，其特徵在於，紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一種醣基化變異體，該變異體選自由以下所組成之群組： (a) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (b) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白；及 (c) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。 25.如實施例 18 至 24 中任一項之方法，其特徵在於，紅血球生成性組成物包含約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。 26.如實施例 18 至 25 中任一項之方法，其中紅血球生成性組成物具有每莫耳紅血球生成刺激醣蛋白約 10.5 至 11.0 莫耳唾液酸的平均唾液酸含量。 27.如實施例 18 至 26 中任一項之方法，其中紅血球生成刺激醣蛋白為紅血球生成素。 28.一種降低重組醣蛋白組成物的批次之間的至少一種醣基化變異體之相對含量的變異性之方法，該方法包含： (a) 提供生物反應器，該生物反應器包含位於該生物反應器中且經組態以與培養基實體接觸的 pH 測量裝置， (b) 將該生物反應器關閉並滅菌， (c) 將培養基填充至該生物反應器中， (d) 校準該 pH 測量裝置， (e) 用表現該醣蛋白的重組宿主細胞接種該生物反應器，以及 (f) 在適合生產該醣蛋白組成物的條件下培養該重組宿主細胞，以及 (g) 由此生產醣蛋白組成物，其中步驟 (d) 之校準包含以下步驟： (i) 將包含二氧化碳氣體的氣體混合物引入該生物反應器中， (ii) 判定在該生物反應器頂部空間及/或排氣中的二氧化碳濃度， (iii) 基於培養基特定相關性計算該培養基之 pH 值，以及 (iv) 將該 pH 測量裝置調整為在步驟 iii) 中計算的 pH 值，並且其中步驟 (a) 至 (g) 產生具有限定相對含量之該醣基化變異體的該重組醣蛋白之第一批次； (h) 重複該等步驟 (a) 至 (g) 產生該醣蛋白之至少一個後續批次，其中該第一批次及該至少一個後續批次之該至少一種醣基化變異體之相對含量具有降低的批次間變異性。 29.如實施例 28 之方法，其中針對該第一批次及至少一個後續批次計算的醣蛋白之相對含量的標準差為 pH 值之中位數的 1% 或更少、特定而言 0.8% 或更少、最特定而言 0.5% 或更少。 30.一種校準位於生物反應器中且經組態以與該生物反應器中的培養基實體接觸的 pH 測量裝置之基於二氧化碳的方法之用途，其用於與使用其中所測量的 pH 值與培養基中的 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳多於 0.03 個單位的 pH 方法生產的醣蛋白組成物相比，降低在至少兩個發酵批次之間所計算的醣蛋白組成物中的醣基化變異體之相對含量的標準差。 31.如實施例 30 之用途，其中基於二氧化碳的校準 pH 測量裝置之方法包含以下步驟： (i) 將包含二氧化碳氣體的氣體混合物引入包含培養基的生物反應器中， (ii) 判定在該生物反應器頂部空間及/或排氣中的二氧化碳濃度， (iii) 基於培養基特定相關性計算該培養基之 pH 值，以及 (iv) 將該 pH 測量裝置調整為在步驟 (iii) 中所計算的 pH 值。 32.如實施例 30 或 31 之用途，其中藉由通氣攪動將二氧化碳引入生物反應器中。 33.如實施例 30 至 32 中任一項之用途，其中培養基包含碳酸鹽緩衝劑。 34.如實施例 30 至 33 中任一項之用途，其中醣蛋白組成物為紅血球生成性組成物。 35.如實施例 34 之用途，其中醣蛋白為紅血球生成刺激醣蛋白。 36.如實施例 34 或 35 之用途，其中紅血球生成性組成物包含限定量的紅血球生成刺激醣蛋白的至少一種醣基化變異體，該變異體選自由以下所組成之群組： (a) 具有帶雙觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (b) 具有帶三觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (c) 具有帶三觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (d) 具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (e) 具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (f) 具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (g) 具有 14 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 2)； (h) 具有 13 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 3)； (i) 具有 12 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 4)； (j) 具有 11 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 5)； (k) 具有 10 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 6)； (l) 具有 9 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 7)；及 (m) 具有 8 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 8)。 37.如實施例 34 至 36 中任一項之用途，其中在紅血球生成性組成物中 (a) 約 3.3 面積-% 至約 3.8 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有雙觸角結構； (b) 約 8.6 面積-% 至約 9.5 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有三觸角結構； (c) 約 5.6 面積-% 至約 5.9 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有三觸角 + 1 個重複結構； (d) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角結構； (e) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 1 個重複結構； (f) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 2 個重複結構， (g) 約 13.2 面積-% 至約 16.0 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 2； (h) 約 24.1 面積-% 至約 26.5 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 3； (i) 約 23.5 面積-% 至約 24.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣屬於同功型 4； (j) 約 17.1 面積-% 至約 18.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣屬於同功型 5； (k) 約 9.4 面積-% 至約 11.8 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣屬於同功型 6； (l) 約 3.7 面積-% 至約 5.5 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 7；及/或 (m) 約 0.9 面積-% 至約 1.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 8，較佳地，其中 (a) 至 (f) 係在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析判定，並且 (g) 至 (m) 係藉由毛細管區帶電泳判定。 38.如實施例 34 至 37 中任一項之用途，其中在紅血球生成性組成物中 (a) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角結構； (b) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 1 個重複結構； (c) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 2 個重複結構； (d) 約 13.2 面積-% 至約 16.0 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 2；及/或 (e) 約 24.1 面積-% 至約 26.5 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 3，較佳地，其中 (a) 至 (c) 係在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析判定，並且 (d) 至 (e) 係藉由毛細管區帶電泳判定。 39.如實施例 34 至 38 中任一項之用途，其中在紅血球生成性組成物中 (a) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角結構； (b) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 1 個重複結構；及/或 (c) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 2 個重複結構，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。 40.如實施例 34 至 39 中任一項之用途，其中在紅血球生成性組成物中，約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 1 個重複結構，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。 41.如實施例 34 至 40 中任一項之用途，其中紅血球生成性組成物具有每莫耳紅血球生成刺激多肽約 10.5 至 11.0 莫耳唾液酸的平均唾液酸含量。 42.如實施例 34 至 41 中任一項之用途，其中紅血球生成刺激醣蛋白為紅血球生成素。 43.一種紅血球生成性組成物，其包含至少一種紅血球生成刺激醣蛋白，其中 (a) 約 3.3 面積-% 至約 3.8 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有雙觸角結構； (b) 約 8.6 面積-% 至約 9.5 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有三觸角結構； (c) 約 5.6 面積-% 至約 5.9 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有三觸角 + 1 個重複結構； (d) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角結構； (e) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 1 個重複結構； (f) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 2 個重複結構； (g) 約 13.2 面積-% 至約 16.0 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 2； (h) 約 24.1 面積-% 至約 26.5 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 3； (i) 約 23.5 面積-% 至約 24.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣屬於同功型 4； (j) 約 17.1 面積-% 至約 18.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣屬於同功型 5； (k) 約 9.4 面積-% 至約 11.8 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣屬於同功型 6； (l) 約 3.7 面積-% 至約 5.5 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 7；及/或 (m) 約 0.9 面積-% 至約 1.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 8，較佳地，其中 (a) 至 (f) 係在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析判定，並且 (g) 至 (m) 係藉由毛細管區帶電泳判定。 44.如實施例 43 之紅血球生成性組成物，其中： (a) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角結構； (b) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 1 個重複結構； (c) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 2 個重複結構； (d) 約 13.2 面積-% 至約 16.0 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 2；及/或 (e) 約 24.1 面積-% 至約 26.5 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白屬於同功型 3，較佳地，其中 (a) 至 (c) 係在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析判定，並且 (d) 至 (e) 係藉由毛細管區帶電泳判定。 45.如實施例 43 或 44 之紅血球生成性組成物，其中： (a) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角結構； (b) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 1 個重複結構；及/或 (c) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 2 個重複結構，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。 46.如實施例 43 至 45 中任一項之紅血球生成性組成物，其中約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的紅血球生成刺激醣蛋白之 N-聚醣具有四觸角 + 1 個重複結構，較佳地如在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後藉由陰離子交換層析所判定。 47.如實施例 43 至 46 中任一項之紅血球生成性組成物，其中該紅血球生成性組成物具有每莫耳紅血球生成刺激醣蛋白約 10.5 至 11.0 莫耳唾液酸的平均唾液酸含量。 48.如實施例 43 至 47 中任一項之紅血球生成性組成物，其中該紅血球生成性組成物已藉由如實施例 1 至 20 中任一項之方法生產。 49.一種醣蛋白、特定而言紅血球生成刺激醣蛋白、特定而言紅血球生成素，其係藉由如實施例 1 至 29 中任一項之方法獲得。 50.醫藥組成物，其含有以實施例 1 至 29 中任一項之方法生產的醣蛋白或如實施例 43 至 48 中任一項之紅血球生成素以及醫藥稀釋劑、佐劑及/或載劑。實例

以下為本發明之方法及組成物的實例。應當理解，鑒於上文給出的一般描述，可以實施各種其他實施例。實例 1 - 紅血球生成素在 CHO 細胞中的重組生產

紅血球生成素 (EPO) 在 CHO 細胞中以批量模式生產。對於主階段發酵，使用碳酸鹽緩衝的、無血清培養基作為培養基，其由基礎培養基 DME (HG) HAM 氏 F-12 改良 (R5) (GRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, USA，訂單編號 57-736)、碳酸氫鈉、L-(+) 麩醯胺酸、D-(+) 葡萄糖、重組胰島素、亞硒酸鈉、二胺基丁烷、氫皮質酮、硫酸鐵(II)、天冬醯胺酸、天冬胺酸、絲胺酸及聚乙烯醇組成。在根據 GMP 對生物反應器滅菌後，將其充滿培養基並用含有規定二氧化碳分數的規定氣體混合物進行通氣攪動。在通氣攪動期間將 pH 控制設定為不活躍。pH 值係藉由以下進行判定：a) 經由樣品端口採樣並將樣品轉移至離線分析儀，在該分析儀中判定樣品 pH 值；或 b) 測量在生物反應器排氣中的二氧化碳濃度並且基於二氧化碳濃度與對應 pH 值之間的適用、預定關係計算 pH 值。將生物反應器 pH 探針訊號調整 (藉由一點校準) 為用程序 a) 或 b) 判定的 pH。生物反應器用接種培養物接種並且將 pH 控制迴路設定為活化。在發酵階段期間，控制 pH，並且如有必要，分別藉由添加 1 mol/L NaOH 或增加 CO ₂流入將培養物之 pH 調整為 pH 6.95 之設定點。在約 5 天後，收穫發酵罐內容物。藉由圓盤堆疊分離從發酵上清液中去除完整的 CHO 細胞及細胞碎片並丟棄。將經過濾之無細胞培養上清液之 pH 用乙酸 (2 mol/L) 調整為 pH 5.0-5.2，孵育數小時，隨後將經 pH 調整之溶液在 1℃ 至 9℃ 過濾。實例 2 - 針對 EPO 生產製程判定 pH 值與對應之排氣二氧化碳濃度的培養基特定相關性

為了針對實例 1中所述之發酵製程經驗地判定 pH 與對應之排氣二氧化碳濃度之間的培養基特定相關性，用如其中所述之培養基填充生物反應器。生物反應器 pH 值係用內建之線上 pH 探針判定，該探針最初在緩衝液中進行兩點校準 (在 25℃ 為 4.00 及 7.00，Mettler Toledo)。使用二氧化碳氣體作為酸性 pH 值校正劑，經由 pH 控制將 pH 值維持在上死帶。將 pH 控制器設定為比例控制器，以實現恆定的二氧化碳流入。沒有使用鹼性校正劑，故藉由以製程空氣持續曝氣去除二氧化碳，pH 值自然地增加，直至 pH 控制器添加二氧化碳以將 pH 值維持在上死帶。在滅菌並填充培養基後，限定保持步驟以穩定 pH、壓力及溫度。為了獲得準確的 pH 讀數，然後打開生物反應器蓋上的一個端口，使系統在此製程中處於未滅菌狀態。將連接至相應 pH 計的兩個獨立 pH 探針透過該打開的端口插入生物反應器中，以在不進行採樣的情況下測量液相中的 pH。攪拌、曝氣及溫度控制皆保持活躍。將壓力控制設定為不活躍。pH 計獨立地經三點校準 (校準緩衝液在 25℃ 為 9.21、7.00、4.00) 且具有活躍的自動溫度補償 (ATC)。pH 計讀數之平均值用於調整 (經由一點校準) 線上生物反應器 pH 探針訊號。pH 計訊號之最大可接受差異為 0.02 個單位，並且與緩衝液 pH 的最大可接受差異為 0.01 個單位。在實驗後再次進行相同的程序以檢查生物反應器 pH，以檢測生物反應器探針訊號的任何意外漂移。在生物反應器探針訊號之標準化後，再次關閉生物反應器蓋並且將壓力控制設定為活躍。在建立平衡 (穩定的 pH 與在排氣中的二氧化碳濃度) 後，記錄第一個資料點線上 pH 及對應的排氣二氧化碳濃度。相關性係在至少四次技術重複中判定，這意味著用相同的培養基填充至少四個獨立的生物反應器，並用二次回歸進行擬合以產生以下形式的最終方程 pH = a - b * [CO ₂] + c * [CO ₂] ²

在各生物反應器中判定四個 pH 設定點。在各設定點處建立平衡後，亦經由基於樣品的離線測量結果來判定 pH。

在圖 3 中示出了針對三種壓力 20 mbar (上)、50 mbar (中) 及 135 mbar (下)，生產培養基批次的培養基特定相關性。此外，描述了來自 10L 規模的一些資料，該資料已用於證明所判定之 pH 值的規模獨立性 (點來自小規模，菱形來自 10L 不銹鋼生物反應器)。

此外，在其中將經由排氣二氧化碳濃度判定之生物反應器 pH 與基於樣品的離線 pH 進行比較的大規模驗證中，在生產規模下基於樣品的離線 pH 值與藉由如圖 3 中所示之關係所描述的生物反應器中的 pH 值之間的偏移已判定為 0.05 個 pH 單位。已在全部規模下判定，pH 之平均差異為 0.05 個單位。為了考慮到所判定之偏移，已將紅血球生成素發酵之 pH 設定點從 pH 7.00 +/- 0.05 減少至 6.95 +/- 0.05。因此，基於排氣二氧化碳濃度來計算 pH 之最終方程式得出了真實 pH，這意味著 pH 值沒有任何可能藉由基於樣品的離線測量所引入的偏移。

作為一個實例，模型之品質，亦即模型描述經建模之資料點的能力，可以藉由回歸係數 R 平方 (R ²) 來描述。因此，R ²為 1 意味著該模型完美地描述了全部資料點。在全部模型中，R 平方皆大於 0.98。全部模型之均方根誤差皆為 0.02。考慮到校正之潛在誤差、環境因素等，本方法之準確度被認為是 +/- 0.03 個 pH 單位內。實例 3 - 藍色 Sepharose 層析

基本上如 WO 2010/34442 所述來純化紅血球生成素多肽。用約 500 L 藍色 Sepharose 填充層析管柱 (Amicon P440 x 500, Amicon, GB)，並且用 0.5 N NaOH 再生。隨後，管柱用三個管柱體積 (CV) 平衡緩衝液 (20 mM 乙酸鈉、5 mM CaCl ₂、0.1 M NaCl，pH 5.0 ± 0.2) 進行平衡。紅血球生成素在低離子強度及中性至酸性 pH 值下結合至該支撐物。將實例 1 之無細胞培養上清液吸收至管柱，並且管柱用約 1 CV 洗滌緩衝液 1 (20 mM 乙酸鈉、5 mM CaCl ₂、0.25 M NaCl，pH 5.0 ± 0.2) 重新洗滌，然後用約 2 CV 洗滌洗滌緩衝液 2 (20 mM TRIS-HCl、5 mM CaCl ₂，pH 6.9 ± 0.2) 重新洗滌。隨後，藉由增加離子強度及 pH 值，用約 2 CV 溶析緩衝液 (100 mM TRIS-HCl、5 mM CaCl ₂、1 M NaCl，pH 9.0 ± 0.2) 溶析紅血球生成素。收集完整蛋白質峰，用 HCl 將 pH 調整為 6.9 並且儲存直至進一步處理。實例 4 - 丁基 Toyopearl 層析 ( 疏水層析 )

用約 200 l 丁基 Toyopearl (Tosoh Haas) 填充層析管柱 (Pharmacia BPG 300/500)，並且用 4.6 M 胍-HCl 及 0.5 N NaOH 再生。隨後，管柱用至少三個 CV 平衡緩衝液 (20 mM TRIS-HCl、5 mM CaCl ₂、0.75 M NaCl、10% 2-丙醇，pH 6.9 ± 0.2) 進行平衡。將實例 3 之藍色 Sepharose 管柱的析出液調整為 10% 2-丙醇並且吸收至管柱。管柱用一個 CV 平衡緩衝液重新洗滌，然後用約兩個 CV 洗滌緩衝液 (20 mM TRIS-HCl、5 mM CaCl ₂、0.75 M NaCl、19% 2-丙醇，pH 6.9 ± 0.2) 重新洗滌。隨後，用約兩個 CV 溶析緩衝液 (20 mM TRIS-HCl、5 mM CaCl ₂、0.75 M NaCl、27% 2-丙醇，pH 6.9 ± 0.2) 溶析紅血球生成素。收集完整蛋白質峰，立即用稀釋緩衝液 (20 mM TRIS-HCl、5 mM CaCl2，pH 6.9 ± 0.2) 稀釋三倍，並且儲存直至進一步處理。實例 5 - 羥磷灰石 Ultrogel 層析

用約 200 L 羥燐灰石 Ultrogel 填裝層析管柱 (Sartorius 100 x 50 cm，Sartorius GB)，並且用再生緩衝液 1 (0.2 M 磷酸鉀、0.1 mM CaCl ₂，pH 6.9 ± 0.2) 以及隨後用 0.5 N NaOH 再生。隨後，管柱用約 3 CV 平衡緩衝液 (20 mM Tris-HCl、5 mM CaCl ₂、0.25 M NaCl、9% 異丙醇，pH 6.9 ± 0.2) 進行平衡。將來自實例 4 之析出液吸附至管柱。管柱用一個 CV 平衡緩衝液重新洗滌，然後用約兩個 CV 洗滌緩衝液 (10 mM Tris-HCl、5 mM CaCl ₂，pH 6.9 ± 0.2) 重新洗滌。接著用約 2.5 CV 溶析緩衝液 (10 mM Tris-HCl、0.5 mM CaCl ₂、10 mM 磷酸鉀，pH 6.9 ± 0.2) 溶析。收集完整蛋白質峰並儲存直至進一步處理。實例 6 - 反相 HPLC (RP-HPLC)

用奈米過濾器過濾來自實例 5 之析出液以去除任何病毒。使用 Merck Prepbar 100 分離系統 (或同等系統) 進行製備型 HPLC。用 Vydac C4 材料 (Grace, USA) 填裝分離管柱 (30 x 50 cm)。使用前，藉由數次施加緩衝液 A (0.1% 三氟乙酸水溶液) 至 100% 溶劑的梯度將管柱再生，接著用緩衝液 A 進行平衡。用三氟乙酸將羥磷灰石管柱之析出酸化至約 pH 2.5 並且藉由過濾進行滅菌。隨後，在 22 ± 4℃ 之溫度及 2700 ml/min 之流速下將紅血球生成素吸收至管柱。在相同溫度及流速下，用緩衝液 A 至緩衝液 B (80% 乙腈、0.1% 三氟乙酸水溶液) 之線性梯度溶析該管柱。以流份形式收集析出峰。立即藉由添加七體積 HPLC 稀釋緩衝液 (10 mM Na/K 磷酸鹽，pH 7.5 ± 0.2) 來中和析出液。將分析型 HPLC 中的純度至少為 99% 之流份合併 (池體積約 60 l)。實例 7 - DEAE Sepharose FF 層析

層析管柱 (Merck Quickscale 25 x 50 cm) 用所施加樣品中的每 g 紅血球生成素 7.5 L DEAE Sepharose 快流 (Cytiva) 矽膠填充並且用 1 M NaOH 再生。隨後管柱用 100 mM NaKPO ₄pH 7.5 ± 0.2 進行平衡，然後用至少 10 CV 10 mM 磷酸鈉/鉀 (pH 7.5 ± 0.2) 進行平衡。將來自實例 6 之 HPLC 管柱的析出液吸附至管柱上，並且用至少五個 CV 平衡緩衝液洗滌該管柱，然後用約十個 CV 洗滌緩衝液 (30 mM 乙酸鈉，pH 4.5 ± 0.1) 洗滌。隨後，再次用約十個 CV 平衡緩衝液洗滌管柱，並且用約四個 CV 溶析緩衝液 (10 mM 磷酸鈉/磷酸鉀，80 mM NaCl，pH 7.5 ± 0.2) 溶析紅血球生成素。收集完整蛋白質峰，調整 DEAE 析出液之電導率及 pH，藉由過濾進行滅菌，分配並且儲存。實例 8 - 用於產物表徵之分析方法

糖分析

為了判定 N-聚醣之相對含量，使用了酶促測試程序。在該程序中，紅血球生成素之 N-糖苷連接的寡醣係藉由 N-糖苷酶 F 裂解。此外，在神經胺酸酶之輔助下，將末端唾液酸從寡醣中去除。在經由超濾去除蛋白質部分後，使用帶有脈衝電流檢測的高效陰離子交換層析系統 (HPAEC-PAD) 及合適的資料記錄系統分離及分析所獲 N-寡醣。在一系列測試期間，以與樣品完全相同的方式處理紅血球生成素參考標準品。製劑中各醣基化變異體之面積百分比係從所生產的聚醣 (例如雙觸角、三觸角、三觸角 + 1 個重複、四觸角、四觸角 + 1 個重複、四觸角 + 2 個重複) 之層析圖中的相應峰計算。

同功型分佈之判定

藉由毛細管區帶電泳判定同功型之相對含量。在該方法中，分離係在帶有均勻緩衝系統的未塗覆玻璃毛細管中以恆定場強進行，其 pH 值高於 EPO 同功型之 pI 值。由於全部 EPO 同功型皆帶負電荷且藉由內滲流運送至陰極，故首先檢測到鹼性同功型。對於該分析，將樣品在水中滲濾。用電解質溶液沖洗毛細管，然後將稀釋的樣品添加至毛細管中。藉由施加 25,000 V 的高電壓進行分離。移動緩衝液具有過量正離子，該等正離子產生電滲流。石英毛細管的使用使得使用二極體陣列檢測器對毛細管中的蛋白質進行光度檢測以及藉由將對應於同功型 1 至同功型 9 的峰積分以獲得峰下面積 [相對面積-%] 來進行定量判斷成為可能。

唾液酸殘基之含量的判定

在用神經胺酸酶對唾液酸進行酶促切割後，藉由 HPAEC-PAD 以層析方法判定唾液酸含量。為此，將紅血球生成素樣品稀釋在 5 mM 磷酸鈉緩衝液 (pH 7.2) 中。各製劑之一半用於藉由 RP-HPLC 判定 EPO 量。將神經胺酸酶添加至該等製劑之另一半，並在 37℃ 孵育過夜。隨後，將消化混合物分為兩半，用水稀釋並且將其 50 μl 施加至 HPAEC-PAD。所施加之樣品中的唾液酸之量係藉助校準線來判定，該校準線係從亦經分析之唾液酸標準品之值獲得。唾液酸含量 (唾液酸莫耳數/EPO 莫耳數) 可從唾液酸判定之結果以及藉由 RP-HPLC 判定所述使用 EPO 之量的結果來計算。

篩析層析 (SE-HPLC)

對於 SE-HPLC，層析管柱係以三至五倍管柱體積 (CV) 緩衝液進行平衡以獲得均勻基線，在分離開始之前沒有額外的峰。將樣品稀釋至 0.2 mg/mL 之濃度並注入到 SE-HPLC 中。根據標準方法對峰進行積分。此等峰係藉由下降垂線而彼此分開。

肽圖

不完全醣基化紅血球生成素種類、諸如 de-O-EPO 及 de-N-EPO 可藉由肽映射來定量地判定。為了該目的，藉由內切蛋白酶 Lys-C 將紅血球生成素分子裂解為肽，並且藉由 HPLC 分離此等肽。將所獲肽圖譜與參考標準進行比較。關於峰大小、峰外觀及滯留時間將所獲結果與標準進行比較。實例 9 - pH 判定對於產物品質之效應

為了比較用於 pH 校準及判定之不同方法的效應，使用根據本發明的 pH 判定方法，如實例 1 至 8 中所述生產了十個批次的紅血球生成素。為了將生物反應器 pH 探針訊號標準化，在滅菌後填充到生物反應器中的培養基後續用限定氣體混合物 (93% 製程空氣及 7% CO ₂) 進行平衡，直至飽和。在平衡階段後，基於根據實例 2 中所述的方法所判定的培養基特定相關性，從排氣二氧化碳濃度計算培養基中的 pH。然後將生物反應器探針訊號調整為所計算的 pH 值。

作為對照，使用已根據相同、但其中已根據本領域已知的標準方法離線進行發酵罐中的 pH 探針之校準的製造製程生產的十個批次。為此，在發酵罐滅菌後，將培養基添加至發酵罐中，取出樣品並且使用如實例 2 所述進行 3 點校正的 pH 計來離線判定樣品 pH。然後將在線 pH 探針調整為離線測量的 pH 值。其中一次對照運作必須提前終止且收穫，並且因此排除在產量分析之外。

表 2 - 紅血球生成素產物產量

參數	經由何者判定 pH
基於樣品的方法	基於 CO ₂ 的方法
中位數	標準差	範圍	中位數	標準差	範圍
產物量 [g]	136	17.8	107 - 160	142	10.3	131 - 168

從表 2 可見，在使用基於二氧化碳的校準方法調整在線 pH 探針的運作中，產物產率之變異性係降低的。與使用基於二氧化碳的方法的十次運作相比，已調整為基於樣品的離線 pH 值的九次對照運作的標準差係高得多。

使用毛細管區帶電泳 (分析方法如實例 8 所述) 判定唾液酸化同功型 2 至 8 之結果在表 3 中示出。圖 4 示出同功型 2 之結果的示例性視覺化表示。對於許多參數，測量最小值與最大值之間的範圍顯著降低，並且標準差亦據此顯著降低。表 3 - 紅血球生成素唾液酸化

參數 [ 面積 -%]	經由何者判定 pH
基於樣品的方法	基於 CO ₂ 的方法
中位數	標準差	範圍	中位數	標準差	範圍
同功型 2	14.2	2.0	12.1-18.7	14.4	0.8	13.2-16.0
同功型 3	25.1	1.7	23.0-29.0	25.1	0.7	24.1-26.5
同功型 4	23.9	0.5	23.3-24.9	24.1	0.4	23.5-24.6
同功型 5	17.9	0.9	15.7-18.9	17.8	0.5	17.1-18.6
同功型 6	10.9	1.4	7.7-12.4	11.0	0.6	9.4-11.8
同功型 7	5.0	1.2	2.7-6.7	5.0	0.5	3.7-5.5
同功型 8	1.3	0.5	0.7-2.3	1.4	0.2	0.9-1.6

在從醣蛋白酶促釋放 N-糖苷連接的寡醣以及去唾液酸化之後使用陰離子交換層析判定去唾液酸化的 N-聚醣 (分析方法如實例 8 中所述) 之結果於表 4 中示出。圖 5 示出具有帶四觸角 + 1 個重複的 N-聚醣之結果的示例性視覺表示。與唾液酸化同功型一樣，對於許多參數，測量最小值與最大值之間的範圍顯著降低，並且標準差亦據此顯著降低。表 4 - 紅血球生成素醣基化

參數	經由何者判定 pH
基於樣品的方法	基於 CO ₂ 的方法
中位數	標準差	範圍	中位數	標準差	範圍
雙觸角 ( 面積 -%)	3.3	0.2	3.0-3.5	3.5	0.2	3.3-3.8
三觸角 ( 面積 -%)	9.2	0.4	8.6-9.8	9.3	0.3	8.6-9.5
三觸角 + 1 個重複 ( 面積 -%)	5.8	0.2	5.4-6.1	5.7	0.1	5.6-5.9
四觸角 ( 面積 -%)	43.8	1.4	41.6-46.3	43.0	0.4	42.2-43.4
四觸角 + 1 個重複 ( 面積 -%)	27.3	0.8	26.0-28.4	27.6	0.2	27.4-28.1
四觸角 + 2 個重複 ( 面積 -%)	10.4	0.9	9.4-11.9	11.0	0.3	10.7-11.6
唾液酸比率 (mol/mol)	11.0	0.3	10.6-11.7	10.9	0.2	10.5-11.0

儘管為了清楚理解起見，藉由圖示及實例的方式對上述發明進行了詳細描述，但是此等描述及實例不應被解釋是限製本發明之範圍。本文引用的所有專利及科學文獻的揭露內容皆以引用的方式明確納入其所有內容。

圖 1 ：紅血球生成素的結構及其醣基化位點 (改編自 Postnikov 等人 2016 Russ.Chem. Rev. 85-99) 圖 2 ：紅血球生成素的典型醣基化模式。圖 2A ：帶有兩個分支之 N-聚醣。圖 2B ：帶有三個分支之 N-聚醣。圖 2C ：帶有四個分支之 N-聚醣。圖 2D ：帶有四個分支及一個聚 N-乙醯基乳糖胺重複之 N-聚醣。圖 2E ：帶有四個分支及三個聚 N-乙醯基乳糖胺重複之 N-聚醣。圖 3 ：在 20 mbar (上)、50 mbar (中) 及 135 mbar (下) 三種不同壓力下獨立製造的生物反應器 pH 與對應的排氣二氧化碳濃度 (「ACO」) 的相關性。該等線代表二次擬合。圖 4 ：針對同功型 2 的紅血球生成素醣基化變異體之改善的範圍及標準差。圖 5 ：針對帶有四觸角 + 1 個重複 N-聚醣結構的紅血球生成素醣基化變異體之改善的範圍及標準差。

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Claims

一種重組生產包含至少一種醣蛋白的醣蛋白組成物之方法，其中該方法包含以下步驟在生物反應器中的培養基中培養表現該醣蛋白的重組宿主細胞，該生物反應器具有位於該生物反應器中且經組態以與該培養基實體接觸的 pH 測量裝置，其特徵在於 (a) 該培養係在無菌條件下進行， (b) 用該 pH 測量裝置所測量的 pH 值與該培養基之 pH 值相差 0.05 個單位或更少，並且 (c) 與其中藉由該 pH 測量裝置所測量的該 pH 值與該培養基中的該 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳相差多於 0.03 個單位之方法相比，在該醣蛋白組成物中的至少一種醣基化變異體之相對含量具有降低的批次間變異性，以及由此生產該醣蛋白組成物。
一種在表現醣蛋白的重組宿主細胞中重組生產包含至少一種醣蛋白的醣蛋白組成物之方法，其包含以下步驟 (a) 提供生物反應器，該生物反應器包含位於該生物反應器中且經組態以與培養基實體接觸的 pH 測量裝置， (b) 將該生物反應器關閉並滅菌， (c) 將該培養基填充至該生物反應器中， (d) 校準該 pH 測量裝置， (e) 用該重組宿主細胞接種該生物反應器， (f) 在適合生產該醣蛋白組成物的條件下培養該重組宿主細胞，以及 (g) 由此生產該醣蛋白組成物，其特徵在於，步驟 (d) 之該校準包含以下步驟 (i) 將包含二氧化碳氣體的氣體混合物引入該生物反應器中， (ii) 判定在頂部空間及/或排氣中的二氧化碳濃度， (iii) 基於培養基特定相關性 (media specific correlation) 計算該培養基之 pH 值，以及 (iv) 將該 pH 測量裝置調整為在步驟 (iii) 中所計算的該 pH 值。
如請求項 2 之方法，其中在校準步驟後用該 pH 測量裝置所測量的 pH 值與該培養基之該 pH 值相差 0.05 個單位或更少、較佳相差 0.03 個單位或更少。
如請求項 1 至 3 中任一項之方法，其中該醣蛋白組成物包含該醣蛋白之至少一種醣基化變異體，並且其中與針對已使用其中藉由該 pH 測量裝置所測量的該 pH 值與該培養基中的該 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳相差多於 0.03 個單位之方法生產的醣蛋白組成物所計算的該醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對來自至少兩個發酵批次的醣蛋白組成物所計算的該醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。
如請求項 1 至 4 中任一項之方法，其中該重組宿主細胞為哺乳動物細胞，較佳為 CHO 細胞。
如請求項 4 或 5 之方法，其中該醣基化變異體係選自由以下所組成之群組：N-聚醣變異體、O-聚醣變異體、唾液酸化變異體、甘露醣基化變異體、半乳醣基化變異體以及岩藻醣基化變異體。
如請求項 1 至 6 中任一項之方法，其中該培養基包含碳酸鹽緩衝系統。
如請求項 1 至 7 中任一項之方法，其包含將在該培養基中的 pH 維持在期望設定點之步驟。
如請求項 1 至 8 中任一項之方法，其中該醣蛋白組成物為紅血球生成性組成物 (erythropoietic composition) 且該醣蛋白為紅血球生成刺激醣蛋白 (erythropoiesis-stimulating glycoprotein)。
如請求項 9 之方法，進一步地，其中該紅血球生成性組成物包含限定量之選自由以下所組成之群組的紅血球生成刺激醣蛋白之至少一種醣基化變異體 (a) 具有帶雙觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白， (b) 具有帶三觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白， (c) 具有帶三觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白， (d) 具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白， (e) 具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白， (f) 具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白， (g) 具有 14 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 (Isoform) 2)， (h) 具有 13 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 3)， (i) 具有 12 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 4)， (j) 具有 11 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 5)， (k) 具有 10 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 6)， (l) 具有 9 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 7)，及/或 (m) 具有 8 個唾液酸殘基之紅血球生成刺激醣蛋白 (同功型 8)，並且其中與針對已使用其中所測量的 pH 值與該培養基中的該 pH 值相差多於 0.05 個單位、較佳相差多於 0.03 個單位之方法生產的紅血球生成性組成物所計算的該醣基化變異體之相對含量的標準差相比，針對來自至少兩個發酵批次的紅血球生成性組成物所計算的該醣基化變異體之相對含量的標準差係減少的。
如請求項 9 或 10 中任一項之方法，其中該紅血球生成性組成物包含選自由以下所組成之群組之一者或多者： (a) 約 3.3 面積-% 至約 3.8 面積-% 的具有帶雙觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (b) 約 8.6 面積-% 至約 9.5 面積-% 的具有帶三觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (c) 約 5.6 面積-% 至約 5.9 面積-% 的具有帶三觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (d) 約 42.2 面積-% 至約 43.4 面積-% 的具有帶四觸角結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (e) 約 27.4 面積-% 至約 28.1 面積-% 的具有帶四觸角 + 1 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白； (f) 約 10.7 面積-% 至約 11.6 面積-% 的具有帶四觸角 + 2 個重複結構的 N-聚醣之紅血球生成刺激醣蛋白， (g) 約 13.2 面積-% 至約 16.0 面積-% 的同功型 2 之紅血球生成刺激醣蛋白； (h) 約 24.1 面積-% 至約 26.5 面積-% 的同功型 3 之紅血球生成刺激醣蛋白； (i) 約 23.5 面積-% 至約 24.6 面積-% 的同功型 4 之紅血球生成刺激醣蛋白； (j) 約 17.1 面積-% 至約 18.6 面積-% 的同功型 5 之紅血球生成刺激醣蛋白； (k) 約 9.4 面積-% 至約 11.8 面積-% 的同功型 6 之紅血球生成刺激醣蛋白； (l) 約 3.7 面積-% 至約 5.5 面積-% 的同功型 7 之紅血球生成刺激醣蛋白；及/或 (m) 約 0.9 面積-% 至約 1.6 面積-% 的同功型 8 之紅血球生成刺激醣蛋白。
如請求項 1 至 11 中任一項之方法，其中該醣蛋白為紅血球生成素。
一種降低在重組醣蛋白的批次之間的至少一種醣基化變異體之相對含量的變異性之方法，該方法包含： (a) 提供生物反應器，該生物反應器包含位於該生物反應器中且經組態以與培養基實體接觸的 pH 測量裝置， (b) 將該生物反應器關閉並滅菌， (c) 將該培養基填充至該生物反應器中， (d) 校準該 pH 測量裝置， (e) 用表現該醣蛋白的重組宿主細胞接種該生物反應器，以及 (f) 在適合生產該醣蛋白的條件下培養該重組宿主細胞，以及 (g) 由此生產該醣蛋白，其中步驟 (d) 之該校準包含以下步驟 (i) 將包含二氧化碳氣體的氣體混合物引入該生物反應器中， (ii) 判定在該生物反應器之頂部空間及/或排氣中的二氧化碳濃度， (iii) 基於培養基特定相關性計算該培養基之 pH 值，以及 (iv) 將該 pH 測量裝置調整為在步驟 (iii) 中所計算的該 pH 值，並且其中步驟 (a) 至 (g) 產生具有限定相對含量之該醣基化變異體的該重組醣蛋白之第一批次； (h) 重複該等步驟 (a) 至 (g) 產生該醣蛋白之至少一個後續批次，其中該第一批次及該至少一個後續批次之該至少一種醣基化變異體之相對含量具有降低的批次間變異性。
一種校準位於生物反應器中且經組態以與該生物反應器中的培養基實體接觸的 pH 測量裝置之基於二氧化碳的方法之用途，其用於降低在至少兩個發酵批次之間所計算的醣蛋白組成物中的至少一種醣基化變異體之相對含量的標準差。
如請求項 14 之用途，其中該基於二氧化碳的方法包含以下步驟 (i) 將包含二氧化碳氣體的氣體混合物引入包含該培養基的該生物反應器中， (ii) 判定在該生物反應器之頂部空間及/或排氣中的二氧化碳濃度， (iii) 基於培養基特定相關性計算該培養基之 pH 值，以及 (iv) 將該 pH 測量裝置調整為在步驟 (iii) 中所計算的該 pH 值。