KR20060028675A

KR20060028675A - 신규한 폴리 (에틸렌 글리콜) 개질 화합물 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20060028675A
Application number: KR1020057021600A
Authority: KR
Inventors: 크리스토퍼 피. 홈즈; 쿤 인; 데이빗 튜멜티
Original assignee: 아피맥스, 인크.
Priority date: 2003-05-12
Filing date: 2004-05-12
Publication date: 2006-03-31
Also published as: EP1626983B8; WO2004101600A3; DE602004028725D1; AU2004238869B2; NZ544024A; NO20055849L; EA010016B1; MXPA05012315A; ATE478093T1; JP2012158598A; EP2336162A1; AU2004238869A1; EP1626983A2; US20050107297A1; WO2004101600A2; EP1626983B1; CN1820024A; IS8169A; JP2007530440A; EA200501799A1

Abstract

본 발명은 폴리(에틸렌 글리콜) 부분(바람직하게는 직쇄상)이 20 K Daltons(바람직하게는 20 내지 60 K Daltons) 이상의 분자량을 가지는 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분 및 펩티드 부분을 포함하는 펩티드 기재 화합물에 관한 것이다. 상기 펩티드 부분은 단량체, 이량체, 올리고머일 수 있다. 상기 펩티드 기재 화합물은 선택적으로 연결자 부분 및/또는 간격자 부분을 포함할 수 있다.

폴리 (에틸렌 글리콜), 연결자, 간격자

Description

신규한 폴리 (에틸렌 글리콜) 개질 화합물 및 그의 용도{NOVEL POLY(ETHYLENE GLYCOL) MODIFIED COMPOUNDS AND USES THEREOF}

관련 출원에 대한 참조

본 출원은 35 U.S.C.§119 (e)조 규정에 의거한, 2003년 5월 12일자 미국 가특허출원 제60/470,246호의 우선권 주장 출원이다. 우선권의 기초가 된 상기 출원발명의 내용은 본 출원발명에 그 전체가 참고로 통합되어 있다.

발명이 속하는 분야

본 발명은 폴리 (에틸렌 글리콜) 또는 "PEG."로 펩티드 기재 화합물을 개질하는 것에 관한 것이다. 특히 본 발명은 PEG로, 바람직하게는 20 내지 60 KDaltons 사이의 직쇄상 PEG 부분 (부분)으로 개질된 펩티드 단량체, 이량체 및 올리고머에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 PEG 개질 화합물을 이용한 신규한 치료 방법에 관한 것이다.

최근 단백질에 관한 연구의 발달로, 다양한 활성을 갖는 많은 수의 펩티드가 발견되었다. 유전 재조합 기술 및 펩티드의 유기 합성 방법의 발전으로, 이렇게 생리학적으로 활성인 펩티드 및 그들과 구조적으로 유사한 화합물을 다량으로 얻는 것이 가능해졌다. 특별한 활성을 갖는 많은 수의 상기 펩티드는 약학에서 특히 유 용하다.

상기 펩티드의 예에는 에리스로포이에틴 (EPO) 수용체 (EPO-R: erythropoietin recept)와 결합한 펩티드를 포함한다. EPO는 165개의 아미노산을 가지고, 아미노산 24,38,83 및 126번 좌위에 4개의 글리코실화 부위 (glycosylation sites) 및 분자량이 약 34,000인 당단백질 호르몬이다. 이는 유사 분열 및 적혈구 전구 세포의 분화를 촉진시켜 적혈구를 생성케 한다. EPO는 적혈구 생성 과정에서 필수적이고, 호르몬은 잠재적으로 낮은 또는 불완전한 적혈구 생산에 의하여 발생하는 혈액 장애의 치료 및 진단에 모두 유용하게 적용할 수 있다. EPO-R과 반응하는 많은 수의 펩티드가 밝혀져 있다 (예컨대, Wrighton 등의 미국 특허 제 5,773, 569호; Wrighton 등의 미국 특허 제 5,830,851호 ; 및 Smith- Swintosky 등의 유럽 특허 제01/91780호 참조).

그러나 펩티드는, 특히 순환계로 투여된 경우 일반적으로 매우 빨리 제거된다. 그러므로, 상기 펩티드의 내구성을 개선시키는 것이 바람직하다. 또한, 펩티드가 펩티드 단백질 엔지니어링에 의해 설계된 여러종의 동물로부터 얻어지고/얻어지거나 대상자의 것과는 다른 구조를 갖는 경우, 항체의 생산으로 인하여 심각한 증상을 나타낼 위험이 있다. 그러므로, 또한 상기 펩티드의 항원성을 증가시키는 것이 바람직하다. 상기 펩티드를 약학에 이용하기 위해서는, 개선된 항원성 및 내구성이 모두 필요하다.

폴리 (에틸렌 글리콜)과 같은 고분자 화합물로 펩티드를 화학적으로 개질하는 것은 다양한 펩티드의 항원성 및 내구성을 개선시키는데 효과적임이 밝혀져 있 다. 따라서 폴리 (에틸렌 글리콜) 및 폴리 (에틸렌 글리콜) 유도체를 펩티드 개질 고분자 시약으로서 널리 사용하고 있다.

최광의의 형태로, 폴리 (에틸렌 글리콜)은 다음의 구조를 갖는다:

HO- (CH₂CH₂0)_nCH₂CH₂-OH

전술한 중합체, 즉, 알파-, 오메가-디하이드록실 폴리 (에틸렌 글리콜)은 간단히 HO-PEG-OH로 표시되며 여기서, -PEG-라는 기호는 다음 구조 단위를 나타내는 것으로 이해된다:

CH₂CH₂0- (CH₂CH₂0) n-CH₂CH₂-

작용에 관한 특정 이론이나 메카니즘에 구애됨이 없이, 이 길다란 쇄상 PEG 분자 또는 부분은 수성 매질 중에서 고도로, 그리고 급속한 모션으로 수화되는 것으로 믿어진다. 이러한 급속한 모션은 PEG로 하여금 큰 부피를 갖는 다른 분자들을 쓸어내어 다른 분자들의 접근과 간섭을 방지해준다. 그 결과, 다른 화학적 개체 (예컨대 펩티드)에 부착될 경우, PEG 중합체 사슬은 이러한 화학적 개체를 면역 반응 및 다른 소거 메카니즘으로부터 보호해줄 수 있다. 그 결과, 페길화 (PEGylation)는 약동학을 최적화시켜줌으로써, 개선된 약물 효능과 안전성을 확보해주며, 생체이용성을 증진시키고 면역원성과 투여 빈도수를 감소시켜준다.

예컨대, PEG의 몇몇 활성 유도체를 단백질 및 효소에 부착시켜 이로운 결과를 얻은 바 있다. PEG는 유기 용매에 가용성이다. 효소에 부착된 PEG는 유기 용매에서 가용성이며 활성적인 PEG-효소 접합체 (conjugates)를 결과시킬 수 있다. 단 백질에 PEG를 부착시키면, 개질 되지 않은 단백질과 비교할 때, 면역원성을 감소시킬 수 있고 PEG-단백질의 신장으로부터의 소거 속도를 낮출 수 있는데, 이로 인해 이 접합체의 혈액 순환 기간을 극적으로 증가시킬 수도 있다.

예컨대, 인터류킨 (Knauf, M. J. 등, J. Biol. Chem. 1988,263, 15,064 ; Tsutsumi, Y. 등, J. Controlled Release 1995,33, 447), 인터페론 (Kita, Y. 등, Drug Des. Delivery 1990,6, 157), 카탈라제 (Abuchowski, A. 등, J. Biol. Chem. 1977,252, 3,582), 수퍼옥사이드 디스뮤타제 (Beauchamp, C.O. 등, Anal. Biochem. 1983,131, 25), 및 아데노신 데아미나제 (Chen, R. 등, Biochim.Biophy. Acta 1981,660, 293)와 같은 치료용 단백질에 PEG를 공유적으로 부착시켜 이들의 생체내 반감기를 연장시키고/연장시키거나 이들의 면역원성과 항원성을 감소시키는 것이 보고된 바 있다.

또한, 표면에 부착된 PEG는 표면에 대한 단백질 및 세포 흡착을 감소시켜 표면의 전기적 특성을 변경시킨다. 마찬가지로, 리포좀에 부착된 PEG는 이들 입자의 혈액 순환 기간을 크게 증가시킴으로써 약물 전달에 있어서의 이들의 이용성을 증진시킬 수 있다 (J. M. Harris, 편집. ,"Biomedical and Biotechnical Applications of Polyethylene Glycol Chemistry, "Plenum, New York, 1992).

Johnson 등의 미국 특허 5,767, 078호에는 EPO-R에 결합할 수 있는 펩티드 단량체의 이량화를 개시하고 있다. 상기 이량화는 단량체의 공유 결합에 기초한다. PEG는 이량체를 형성하기 위한 바람직한 연결자 (linker)이다. 그 가운데 PEG는 특히 3400 또는 5000의 분자량을 가지는 것을 사용한다.

Smith-Swintosky 등의 WO 01/91780호에는 성장 인자 유형 수용체의 하나의 개시 및 결합을 형성하는 펩티드의 이량체 및 다량체를 개시하고 있다. 개시된 연결자는 폴리에틸렌 글리콜이다. 그러나, 참조 문헌은 PEG의 적절한 크기나 종류(예컨대, 직쇄상)를 선택하기 위한 지침은 제공하지 않는다.

Wei 등의 미국 특허 제6,077, 939호에는 히드라존 또는 환원된 히드라존 결합, 또는 옥심 또는 환원된 옥심 결합을 통하여 N-말단의 α-탄소 원자에 공유적으로 결합하는 필수적으로 폴리펩티드 및 수용성 중합체를 함유하는 조성물을 개시하고 있다. 수용성 중합체의 분자량의 범위는 200 내지 200K Daltons이다. PEG는 수용성 중합체의 실시예에서 개시되어 있다. PEG의 분자량은 단지 700 내지 20K Daltons이고, 5K Daltons의 PEG 부분이 더 바람직하다고 보고되어 있다.

Balu 등의 WO 제01/38342호는 두 개의 펩티드 사슬로 연결되는 C₁ _-12 결합 부분에 의하여 형성되는 이량체를 개시하고 있다. 그것은 이량체의 N-말단이 페길화일 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 사용되는 PEG의 분자량을 특정하거나 그것이 직쇄상인지 분지상인지는 공개하지 않았다.

Saifer 등(Adv. Exp. Med. Biol. (1994), 366: 377-87)은 고분자량(35K-120K Daltons) PEG의 1-9 스트랜드(strand)가 SOD에 커플링된 소 및 재조합 인간의 Cu, Zn 수퍼옥사이드 디스무타제 (SOD)의 페길화 부가물을 개시하고 있다. Somack 등 (Free Rad. Res.Comms. (1991), 12-13: 553-562)은 고분자량(41K-72K Daltons) PEG의 1 내지 4 스트랜드를 함유하는 SOD 부가물을 개시하고 있다. 상기 두 개의 참고 문헌 중 어느 것도 PEG로 펩티드를 개질하는 것을 보고하지 않았다. 게다가 상기 화합물에서 사용되는 PEG 부분은 직쇄상 PEG에 반대되는 분지상이다.

EG 개질된 펩티드 기재 화합물의 영역이 발전하였음에도 불구하고, 개선된 항원성 및 내구성을 가진 신규한 PEG 개질된 화합물은 여전히 필요하다.

본 섹션 및 명세서 전반에서 인용된 참고 문헌의 인용 및 논의 사항들은 본 발명의 설명을 명료하게 하기 위한 것일 뿐, 이들 문헌을 본 발명의 선행 기술로서 인정하고자 하는 것은 아니다.

발명의 요약

본 발명은 펩티드 부분 및 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 펩티드 기재 화합물에 관한 것으로서, 이중 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분은 직쇄상이고 20 KDaltons 이상의 분자량을 갖는다.

바람직하게는 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분의 분자량이 약 20 내지 60 KDaltons인 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분의 분자량이 약 20 내지 40 KDaltons인 것이 좋다. 가장 바람직하게는 PEG의 분자량이 20 KDaltons인 경우이다.

바람직하게는 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분은 중합분산도 (polydispersity) 값 (M_w/M_n)이 1.20 미만, 더욱 바람직하게는 1.1 미만, 가장 바람직하게는 1.05 미만인 것이 좋다.

바람직하게는 펩티드 부분은 이량체이고 연결자 부분에 의해 연결된 두개의 모노머형 중합체를 함유한다. 또한 상기 이량체 및 다른 다량체는 헤테로이량체 또는 헤테로다량체일 수 있다.

일례에서, 펩티드 부분은 에리스로포이에틴-수용체에 결합하는 펩티드 중에서 선택된다. 이러한 EPO-R 결합 펩티드의 예로는 공개된 국제특허출원PCT/US00/32224 (공개번호 WO01/38342 A2), PCT/US96/09810 (공개번호WO 96/40749) 및 PCT/US01/16654 (공개번호 WO01/91780 Al); 및 미국특허 5,767,078호, 5,773,569호, 5,830,851호, 5,986,047호를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 펩티드 부분으로 사용될 수 있는 EPO-R 결합 펩티드의 부가적인 예는 2003년 5월 12일자 미국 가특허출원 60/470,245호에 개시되어 있다. 본 발명의 펩티드 부분으로 사용될 수 있는 EPO-R 결합 펩티드의 부가적인 예는 2003년 5월 12일자 미국 가특허출원 60/469,993호에 개시되어 있다. 본 발명의 펩티드 부분으로 사용될 수 있는 EPO-R 결합 펩티드의 또 다른 부가적인 예는 2003년 5월 12일자 미국 가특허출원 60/470,244호에 개시되어 있다.

또 다른 구체예로서, 펩티드 부분은 트롬보포이에틴-수용체 ("TPO-R")에 결합된 펩티드 중에서 선택된다. TPO-R 결합 펩티드의 예로서 미국특허 6,552,008호, 6,506,362호, 6,498,155호, 6,465,430호, 6,333,031호, 6,251,864호, 6,121,238호, 6,083,913호, 5,932,546호, 5,869,451호, 5,683,983호, 5,677,280호, 5,668,110호, 및 5,654,276호; 및 공개된 미국특허출원 2003/0083361호, 2003/0009018호, 2002/0177166호 및 2002/0160013호에 개시된 것들을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

바람직하게는, 상기 펩티드 기재 화합물은 펩티드 부분과 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분 사이에 간격자 부분을 더 포함한다. 더욱 바람직하게는, 간격자 부분은 다음의 구조를 갖는다:

- MH- (CH₂)_α- [O- (CH₂)_β]_γ-O_δ- (CH₂)_ε-Y-

식 중, α, β, γ, δ, 및 ε는 각각 독립적으로 선택되는 정수이다. 상기 간격자 부분은 2003년 5월 12일자 미국 가특허출원 60/469,996호에 "폴리 (에틸렌 글리콜) 개질된 펩티드 기재 화합물을 위한 신규한 간격자 부분 (Novel SpacerMoiety For Poly (ethylene Glycol) Modified Peptide-base Compounds)"이라는 명칭으로 더 자세히 개시되어 있다.

바람직한 구체예에서

α는 1 ≤α≤ 6의 정수;

β는 1 ≤β≤ 6의 정수;

ε는 1 ≤ε≤ 6의 정수;

δ는 0 또는 1;

γ는 0 ≤γ≤ 10의 정수이고;

Y는 NH 또는 CO이다.

특정의 바람직한 구체예에서, γ>1이면, β = 2이다.

한가지 바람직한 구체예에서,

α=β=ε=2;

γ=δ= 1이고;

Y는 NH이다.

또 다른 구체예에서,

γ=δ= 0;

2 ≤α+ε≤5이고;

Y는 CO이다.

또 다른 구체예에서,

γ=δ= 0;

α+ε=5이고;

Y는 CO이다.

본 발명은 또한 1 이상의 전술한 펩티드 기재 화합물을 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이기도 하다.

정의

펩티드 내에 존재하는 아미노산 잔기는 다음과 같은 약어로 표시된다: 페닐알라닌은 Phe 또는 F; 류신은 Leu 또는 L; 이소류신은 Ile 또는 I ; 메티오닌은 Met 또는 M; 발린은 Val 또는 V; 세린은 Ser 또는 S; 프롤린은 Pro 또는 P; 트레오닌은 Thr 또는 T; 알라닌은 Ala 또는 A; 티로신은 Tyr 또는 Y; 히스티은 His 또는 H; 글루타민은 Gln 또는 Q; 아스파라긴은 Asn 또는 N ; 리신은 Lys 또는 K ;아스파르트산은 Asp 또는 D; 글루탐산은 Glu 또는 E; 시스테인은 Cys 또는 C; 트립토판은 Trp 또는 W; 아르기닌은 Arg 또는 R; 그리고 글리신은 Gly 또는 G이다. 펩티드 내에 존재하는 통상적인 것이 아닌 아미노산은 다음과 같은 약어로 표시된다:1- 나프틸알라닌은 1-nal ; 2-나프틸알라닌은 2-nal; N-메틸글리신 (사르코신 (sarcosine)으로도 알려져 있는)은 MeG; 아세틸화 글리신 (N-아세틸글리신)은 AcG; 호모세린 메틸에테르은 Hsm이다.

"폴리펩티드" 또는 "단백질"라는 용어는 아미드 결합을 통하여 서로 연결된 알파 아미노산인 단량체의 중합체를 지칭한다. 폴리펩티드는 길이에 있어서 적어도 2개의 아미노산 단량체를 가진다. 일반적으로, 본 발명의 명세서 및 당업계에서 사용하는 경우, "펩티드"라는 용어는 길이에 있어서 단지 몇 개의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명에 따른 펩티드는 바람직하게는 길이에 있어서 약 50개 이하의 아미노산 잔기를 가지며, 더욱 바람직하게는 길이에 있어서 약 5 내지 40 아미노산 잔기를 가지며, 더더욱 바람직하게는 길이에 있어서 약 17 내지 약 40 아미노산 잔기를 갖는다. 펩티드와는 달리, 폴리펩티드는 어떤 개수의 아미노산 잔기라도 포함할 수 있다. 따라서, 폴리펩티드는 펩티드는 물론, 길이에 있어서 수백개의 아미노산 잔기를 가질 수 있는 단백질과 같은, 긴 아미노산 서열 역시 포함하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 펩티드는 단백질 서열과 같이, 더 긴 폴리펩티드 서열로부터의 "유도체"이거나 그 일부분일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한"이라는 구절은 "일반적으로 안정한 것으로 여겨지는, 예를 들면, 생리학적으로 허용 가능하고, 인간에게 투여되었을 때, 알레르기 또는 위장 부조 (gastric upset), 현기증 등과 같은 이와 유사한 나쁜 반응을 유발하지 않는 분자체 (molecular entities) 및 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, 본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 연방 또는 주 정부의 규제 당국에 의하여 승인된 것 또는 미국 약전 또는 동물, 더욱 특별하게는 인간에게 사용함에 있어서 일반적으로 인정된 다른 약전에 실려 있는 것을 의미한다. "담체"라는 용어는 화합물이 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 운송 수단을 지칭한다. 이러한 제약 담체는 물, 및 낙화생유, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등과 같은, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것을 포함하는 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 바람직하게는 물 또는 식염수 용액 및 덱스트로스 수용액 및 글리세롤 용액이 특히 주사용 용액을 위한 담체로서 사용된다. 적합한 제약 담체는 E. W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 "작용제"라는 용어는 이의 상보적인 생물학적 활성 수용체와 결합하여 상기 수용체를 활성화함으로써 상기 수용체에서의 생물학적 응답을 야기하거나 또는 이미 존재하는 수용체의 생물학적 활성을 향상시키는 생물학적 활성 리간드를 지칭한다.

PEG 부분

본 발명의 PEG 부분은 직쇄상이고 분자량 20 KDaltons 이상, 바람직하게는 약 20 내지 60 KDaltons의 분자량을 가진다. 더욱 바람직하게는 약 20 내지 40 KDaltons 분자량을 가지며, 가장 바람직하게는 PEG는 20 KDaltons의 분자량을 가진다.

PEG 부분은 본 발명의 화합물에 또는, 펩티드 부분, 연결자 부분 또는 간격자 부분에 직접 공유적으로 부착한다. 하나의 구체예에서 PEG 부분은 펩티드 단량체 또는 이량체의 1 이상의 말단 (N-말단 또는 C- 말단)에 부착된다: 펩티드 이량체의 각 N-말단은 부착된 PEG 부분 (총 두 개의 PEG 부분을 위한)을 가질 수 있다. 하나의 구체예에서, PEG는 두 개의 펩티드 단량체를 이량화하는 연결자로서 기능할 수 있다: 예컨대, 한개의 PEG 부분은 동시에 펩티드 이량체의 양쪽 N-말단에 부착될 수 있다. 다른 한가지 구체례에 있어서, PEG를 펩티드 단량체 또는 이량체의 간격자 부분에 부착한다. 바람직한 구체례에 있어서, PEG를 펩티드 이량체의 연결자 부분에 부착한다. 매우 바람직한 구체례에 있어서, PEG를, 간격자 부분이 펩티드 이량체의 단량체를 연결하는 펩티드 이량체의 연결자 L_K 부분에 부착되어 있는 것인, 상기 간격자 부분에 부착한다. 특히 바람직한 구체례에 있어서, PEG를, 간격자 부분이 리신 연결자의 카보닐 탄소 또는 리신 아미드 연결자의 아미드 질소를 통하여 펩티드 이량체에 부착되어 있는 것인, 상기 간격자 부분에 부착한다.

본 발명의 펩티드 기재 화합물은 다수의 PEG 부분 (예컨대, 2, 3, 4 이상)을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, PEG 부분은 두 개의 직쇄상 단량체 PEG 사슬을 갖는다. 바람직하게는 이 두 개의 직쇄상 PEG 사슬은 리신 잔기 또는 리신 아미드 (카르복실기가 아미드 부분 -CONH₂로 전환된 리신 잔기)를 통해 서로 연결되는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, 이들 두 개의 PEG 사슬은 리신의 알파 및 엡실론 아미노기에 연결되는 반면, 카르복실기는 간격자 부분에 결합하기 위해 히드록시숙신이미딜 에스테르로서 활성화되는 것이 좋다. 예컨대, 아리신 아미드가 두개의 단량체 PEG 사슬에 연결되면 이 이량체는 다음 화학식 I에 도시된 바와 같은 구조를 가질 수 있으며, 화학식 II에 도시된 바와 같이 요약될 수 있다:

화학식 I 화학식 II

화학식 I에서, N²는 리신의 ε-아미노기의 질소 원자를 나타내고 N¹은 리신의 α 아미노기의 질소 원자를 나타낸다. 바람직한 구체예에서, 두개의 펩티드 단량체들의 C 말단 리신은 L-리신이다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 리신 잔기는 D-리신일 수 있다.

화합물이 1 이상의 PEG 부분을 포함하는, 복합 PEG 부분은 동일하거나 다른 화학적 부분 (예컨대, 다른 분자량의 PEG)일 수 잇다. 어떤 경우, 페길화의 정도(펩티드에 부착된 PEG 부분의 수 및/또는 PEG가 부착된 펩티드의 총 수)는 각각의 반응 혼합물 중에서의 총 농도에 의한 것뿐만 아니라 페길화 반응 중에서 펩티드 분자에 대한 PEG 분자의 비율에 의하여 영향을 받을 수 있다. 일반적으로 펩티드에 대한 PEG의 최적비(비반응 펩티드 및/또는 PEG이 남지 않도록 하는 반응 효율)는 원하는 페길화의 정도(예컨대, 모노, 디-, 트리-, 등), 선택한 중합체의 분자량, 그 중합체가 분지상인지 또는 직쇄상인지, 및 특별한 부착 방법을 위한 반응 조건과 같은 요소에 의하여 결정될 것이다.

당업계의 숙련된 자가 적용할 수 있는 PEG 부착 방법이 다수 있다. [예컨대 Goodson 등의 (1990)Bio/Technology 8: 343 (PEGylation ofinterleukin-2 at its glycosylation site after site-directed mutagenesis); EP 0 401 384 호(coupling PEG to G-CSF); Malik, etal., (1992) Exp. Hemato. 20: 1028-1035 (PEGylation of GM-CSF using tresyl chloride); PCT 공개 번호 WO 제 90/12874 (PEGylation of erythropoietin containing a recombinantly introduced cysteine residue using a cysteine-specific mPEG derivative); 미국 특허 출원 5,757, 078호 (PEGylation of EPO peptides); 미국 특허 출원 5,612, 460호(Active 카보네이트s of Polyalkylene Oxides for Modification of Polypeptides), 미국 특허 출원 5,672, 662호 (Poly (ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof forbiotechnical applications); 미국 특허 출원 6,077, 939호 (PEGylation of an N-tenninal a-carbon of a peptide); Veronese et al. , (1985) Appl. Biochem.Bioechnol 11: 141-142 (PEGylation of an N-terminal a-carbon of a peptide with PEG-니트로phenyl카보네이트 ("PEG-NPC") or PEG-trichlorophenyl카보네이트); and Veronese (2001) Biomaterials 22: 405-417 (Review article on peptide and protein PEGylation) 참조].

예를 들면, PEG를 반응성 기를 통하여 아미노산 잔기에 공유 결합시킬 수 있다. 반응성 기는 활성화 PEG 분자를 결합시키는 것들이다 (예를 들면, 유리 아미노 또는 카복실기). 예를 들면, N-말단 아미노산 잔기 및 리신 (K) 잔기는 유리 아미노기를 가지며, C-말단 아미노산 잔기는 유리 카복실기를 갖는다. (예를 들면, 시스테인 잔기에서 발견되는 것과 같은)설프하이드릴 기를 PEG를 부착하기 위한 반응성 기로 사용할 수도 있다. 그 외에, 활성화 기 (예를 들면, 하이드라지드, 알데히드, 및 방향족-아미노기)를 특이적으로 폴리펩티드의 C-말단에 도입하기 위한 효소-보조 방법은 [Schwarz 외 (1990) 방법s Enzymol. 184: 160; Rose 외 (1991) Bioconjugate Chem. 2: 154; Gaertner 외 (1994) J. Biol. Chem. 269: 7224]에 설명되어 있다.

예를 들면, PEG 분자를 상이한 반응성 부분을 갖는 메톡실화 PEG ("PEG")를 사용하여 펩티드 아미노기에 부착시킬 수 있다. 상기 반응 부분의 비제한적인 예에는 숙신이미딜 숙시네이트 (SS),숙신이미딜 카보네이트 (SC),mPEG-이미데이트, 파라-니트로페닐카보네이트 (NPC),숙신이미딜 프로피오네이트 (SPA) 및 시아누릭 클로라이드를 포함한다. 상기 반응 부분과 함께하는 mPEG의 비제한적인 예에는 mPEG-숙신이미딜 숙시네이트(mPEG-SS), mPEG- 숙신이미딜카보네이트 (mPEG-SC), mPEG-이미데이트, mPEG-파라- 니트로페닐카보네이트 (mPEG-NPC), mPEG-숙신이미딜프로피오네이트 (mPEG-SPA) 및 mPEG-시아누릭 클로라이드를 포함한다.

PEG의 부착이 비특이적이고, 특이적 PEG 부착을 갖는 펩티드가 필요한 경우, 목적하는 페길화 화합물을 페길화 화합물의 혼합물로부터 정제할 수 있다. 예를 들면, N-말단 페길화 펩티드가 필요한 경우, N-말단 페길화 형을 무작위적으로 페길화된 펩티드의 집단으로부터 정제 (즉, 다른 모노페길화 부분으로부터 이 부분을 분리)할 수 있다.

바람직한 구체례에 있어서, PEG를 부위 특이적으로 펩티드에 부착시킨다. 성장 호르몬-방출 인자의 잠재적인 유사체의 N-말단, 측쇄 및 C-말단에서의 부위 특이적 페길화는 고상 합성법을 통하여 수행되어 왔다 [Felix 외 (1995) Int. J. Peptide Protein Res. 46: 253]. 다른 부위-특이적 방법은 N-말단 트레오닌이 과요오드산나트륨 에 의하여 산화되어 생성되는 N-말단에 있는 반응성 알데히드기를 통하여 부위-특이적 방법으로 리포솜 표면 그라프트 PEG 사슬의 극단(extremities)에 부착하는 것을 포함한다 [Zalipsky 외 (1995) Bioconj. Chem. 6: 705]. 그러나, 이 방법은 N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기을 갖는 폴리펩티드에 한정된다.

한 가지 방법에 있어서, 선택적 N-말단 페길화를, 특정 단백질에서 유도체화하는 데에 이용할 수 있는 상이한 형태의 1차 아미노기 (리신 대 N-말단)의 구별되는 반응성을 이용하는 환원성 알킬화에 의하여 달성할 수 있다. 적절한 반응 조건 하에서, PEG를 갖는 카보닐 기를 선택적으로 펩티드의 N-말단에 부착한다. 예를 들면, 펩티드의 리신 잔기의 ε-아미노기와 N-말단 잔기의 α-아미노기 사이의 pKa 차이를 이용하는 pH에서 반응을 수행함으로써 단백질을 선택적으로 N-말단 페길화할 수 있다. 이와 같은 선택적 부착에 의하여, 다른 반응성 기 (예를 들면, 리신 측쇄 아미노기)의 중요한 변경이 없이, 단백질의 N-말단에서 페길화가 지배적으로 일어난다. 환원성 알킬화를 이용하는 경우, PEG는 단백질에 커플링하기 위한 1개의 반응성 알데히드를 가져야 한다 (예를 들면, PEG 프로프리온알데히드가 사용될 수 있다).

부위-특이적 돌연 변이가 부위-특이적 중합체 부착 펩티드 제조에 이용될 수 있는 추가의 접근법이다. 이 방법을 위해서는, 펩티드의 아미노산 서열이 적절한 반응성 기가 펩티드 내의 목적하는 위치에 도입되도록 고안된다. 예를 들면, WO 90/12874는 시스테인 잔기의 삽입 또는 시스테인 잔기를 다른 잔기로 치환하는 것에 의하여 변경된 단백질의 부위-지향성 페길화를 기술하고 있다. 이 공보는 또한 시스테인-특이적 mPEG 유도체를 재조합적으로 도입된 EPO 상의 시스테인 잔기와 반응시킴으로써 mPEG-에리스로포이에틴 ("mPEG-EPO")을 제조하는 방법을 설명하고 있다.

PEG를 간격자 또는 연결자 부분에 부착하는 경우에, 유사한 부착 방법이 이용될 수 있다. 이 경우에, 상기 연결자 또는 간격자는 반응성 기를 가지며, 적절한 상보적인 반응성 기를 갖는 활성화 PEG 분자가 공유적 부착이 일어나도록 하는 데에 이용된다. 바람직한 구체례에 있어서, 상기 연결자 또는 간격자 반응성 기는 적당하게 활성화된 PEG 분자와 반응함으로써 아미드 또는 카바메이트와 같은 안정한 공유 결합을 형성하는 말단 아미노기 (즉, 연결자 또는 간격자의 말단에 위치하는)를 갖는다.

본 발명의 펩티드, 펩티드 이량체 및 기타의 펩티드 기재 분자를, 수용성 중합체를 분자 (예를 들면, 펩티드 + 간격자)의 수용체-결합 부분에 연결시키는 다양한 화학 중의 어떤 것을 이용하여 수용성 중합체 (예를 들면, PEG)에 부착시킬 수 있다. 통상의 구체례는 수용성 중합체를 수용체-결합 부분에 공유적으로 부착함에 있어서 1개의 부착 접합부(junction)을 이용하지만, 대안적인 구체례에 있어서는 다수개의 부착 접합부가 사용될 수 있고, 이 경우, 서로 상이한 종의 수용성 중합체를, 상기 간격자에 및/또는 펩티드 사슬의 한쪽 또는 양쪽 모두에 대한 공유적 부착을 포함할 수 있는 구별되는 부착 접합부에 있는 수용체-결합 부분에 부착시키는 것인 추가적인 변형을 포함할 수 있다. 몇 가지 구체례에 있어서, 이량체 또는 그 이상의 다량체는 구별되는 종의 펩티드 사슬 (즉, 이종 이량체 또는 다른 이종 다량체)을 포함할 것이다. 이에 제한되지 않은 예로서, 이량체는 PEG 부착 접합부를 갖는 제1 펩티드 사슬을 포함할 수 있고, 제2 펩티드 사슬은 PEG 부착 접합부를 갖지 않거나 또는 제1 펩티드 사슬과는 상이한 결합 화학을 이용할 수 있으며, 몇 가지 변형에 있어서 상기 간격자는 PEG 부착 접합부를 갖거나 갖지 않을 수 있고, 페길화(PEGylated)되는 경우 상기 간격자는 제1 및/또는 제2 펩티드 사슬의 것과는 상이한 결합 화학을 이용할 수 있다. 대안적인 구체례는 수용체-결합 부분의 간격자 부분에 부착되어 있는 PEG 및 분자의 펩티드 부분의 아미노산 중 1개의 측쇄에 접합되어 있는 상이한 수용성 중합체 (예를 들면, 탄수화물)를 이용한다.

매우 다양한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 종이 수용체-결합 부분 (펩티드 + 간격자)의 페길화에 사용될 수 있다. 실질적으로 어떠한 적합한 반응성 PEG 시약이라도 사용될 수 있다. 바람직한 구체례에 있어서, 반응성 PEG 시약은 수용체-결합 부분에 접합되는 경우에 카바메이트 또는 아미드 결합의 생성을 가져올 것이다. 적합한 반응성 PEG 종은 NOF Corporation (Yebisu Garden Place Tower, 20-3 Ebisu 4-chome, Shibuya-ku, Tokyo 150-6019)의 Drug 전달 Systems 카탈로그 (2003) 및 Nektar 치료s (490 Discovery Drive, Huntsville, Alabama 35806)의 Molecular Engineering 카탈로그 (2003)에서 시판되고 있는 것들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이에 제한되지 않는 예로서, 다음과 같은 PEG 시약이 다양한 구체례에 있어서 바람직하다: mPEG2-NHS, mPEG2-ALD, multi-Arm PEG, mPEG(MAL)2, mPEG2(MAL), mPEG-NH2, mPEG-SPA, mPEG-SBA, mPEG-티오에스테르, mPEG-Double, 에스테르, mPEG-BTC, mPEG-ButyrALD, mPEG-ACET, 이종 작용성 PEG (NH2-PEG-COOH, Boc-PEG-NHS, Fmoc-PEG-NHS, NHS-PEG-VS, NHS-PEG-MAL), PEG acrylates (ACRL-PEG-NHS), PEG-인지질 (예를 들면, mPEG- DSPE), 본 발명 분야의 당업자가 선택한 화학에 의하여 활성화된 글리세린 기재 PEG의 GL 시리즈를 포함하는 SUNBRITE 시리즈의 다중 팔(multiarmed) PEG, (카복실-PEG, p-NP-PEG, 트레실-PEG, 알데히드 PEG, acetal-PEG, 아미노-PEG, 티올-PEG, 말레이미도-PEG, 하이드록실-PEG-아민, 아미노-PEG-COOH, 하이드록실-PEG-알데히드, 카복실산 무수물형-PEG, 작용기화 PEG-인지질, 및 특별한 응용 및 이용을 위하여 본 발명 분야의 숙련자에 의하여 선택되는 기타 유사하거나 및/또는 적합한 반응성 PEG를 포함하지만 이에 한정되지는 않는) SUNBRITE 활성화 PEG 중의 어떤 것.

펩티드 부분

인간을 포함하는 다양한 동물, 미생물 또는 식물로부터 유도되는 펩티드 및 유전 공학과 합성에 의하여 생산되는 펩티드는 펩티드 부분으로서 적용할 수 있다. 실시예는 TPO-R에 결합된 펩티드 및 EPO-R에 결합된 펩티드를 포함한다.

바람직하게는, 펩티드 부분은 1 이상의 펩티드를 포함하며, 각각의 펩티드의 길이는 50 아미노산 미만, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 25 아미노산, 그리고 가장 바람직하게는 약 12-18 아미노산이다.

하나의 바람직한 구체예에서, 이러한 EPO-R 결합 펩티드부터 선택된 펩티드 부분의 예로는 (예컨대 Wrighton 등의 미국 특허 출원 5,773, 569호;5, 830, 851호; 및 5, 986, 047 ; Wrighton 등의 PCT 공개 번호 WO 제 96/40749 호 ; 미국 특허 출원 5,767, 078호 및 Johnson and Zivin 등의 PCT 공개 번호 96/40772호; Balu 등의 PCT 공개 번호 WO 제01/38342호; Smith-Swintosky 등의 WO 제01/91780호 ; 2003년 5월 12일자 미국 가특허출원 60/479,245호; 2003년 5월 12일자 미국 가특허출원 60/469,993호 및 2003년 5월 12일자 미국 가특허출원 60/470,244 호에 개시되어 있다.

또 다른 바람직한 구체예로서, 펩티드 부분은 트롬보포이에틴-수용체 ("TPO-R")에 결합된 펩티드 중에서 선택된다. TPO-R 결합 펩티드의 비제한적인 예로서 미국특허 6,552,008호, 6,506,362호, 6,498,155호, 6,465,430호, 6,333,031호, 6,251,864호, 6,121,238호, 6,083,913호, 5,932,546호, 5,869,451호, 5,683,983호, 5,677,280호, 5,668,110호, 및 5,654,276호; 및 공개된 미국특허출원 2003/0083361호, 2003/0009018호, 2002/0177166호 및 2002/0160013호에 개시된 것들을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

하나의 구체예에서, 펩티드 부분은 길이에서 10 내지 40 이상 아미노산 잔기 및 서열 X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈인 단량체 펩티드이다. 각각의 아미노산은 표준 단문자 약어로 표시되며: X₄는 R, H, L, 또는 W; X₅는 M, F, 또는 I; X₆은 독립적으로 20개의 일반적으로 코딩된 L-아미노산 중 어느 하나를 선택한다; X₇은 D, E,I, L, 또는 V; 및 X₈은 C, 이는 에리스로포이에틴수용체 (EPO-R)를 활성화하고 결합하거나 한편으로는 EPO 작용제로서 작용한다.

또 다른 구체예에서, 펩티드 부분은 핵심 아미노산 서열 LYACHMGPITXlVCQPLR로 이루어진 길이 17 내지 약 40 아미노산의 단량체 펩티드이다. 각각의 아미노산은 표준 단문자 약어로 표시되며; Xi는 트립토판 (W), 1-나프틸알라닌 (1-nal), 또는 2- 나프틸알라닌 (2-nal)이다.

또 다른 구체예에서, 펩티드 부분은 Ac-Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Nal(1)- Leu-Ala-Ala-Arg-Sar 또는 Ac-Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala- Arg-Sar와 같은 서열을 가지는 1 이상의 TPO-R 결합 펩티드를 포함한다.

본 발명의 몇 가지 구체례에 따르면, 유전적으로 암호화되는 20개의 L-아미노산 또는 입체 이성체성 D-아미노산 중 어떤 것으로부터 독립적으로 선택되는 2개 이상 및 바람직하게는 2 내지 6개의 아미노산 잔기가 전술한 핵심 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단에 커플링될 것이다. 예를 들면, 종종 서열 GG가 펩티드 합성을 용이하게 하기 위하여 핵심 서열의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 부착될 것이다. 또한 본 발명은 EPO-R 결합의 특성을 보유하는 상기 펩티드와 유도체 및 펩티드의 모방체의 접합체를 제공한다.

20개의 통상의 아미노산, a,a-디치환(disubstituted) 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 및 기타의 통상의 것이 아닌 아미노산과 같은 비천연 아미노산의 입체 이성질체 (예를 들면, D-아미노산) 역시 본 발명의 화합물의 적합한 성분이 될 수 있다. 통상의 것이 아닌 아미노산의 예는 β-알라닌, 3-피리딜알라닌, 4-하이드록시프롤린, O-포스포세린, N-메틸글리신, N-아세틸세린, N-포밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, 노르-류신 및 기타 이와 유사한 아미노산 및 이미노산을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 구체례에 있어서, 본 발명의 펩티드 단량체는 상기 핵심 서열의 2개의 시스테인 잔기 사이에 분자 내 디설파이드 결합을 함유한다. 이러한 단량체는 다음과 같이 도식화될 수 있다.

예컨대:

또는

이량체 및 올리고머 펩티드

바람직한 구체예에서, 본 발명의 단량체 펩티드 부분은 이량체 또는 올리고머를 형성하기 위하여 이량화 또는 올리고머화한다.

한 가지 구체례에 있어서, 본 발명의 펩티드 단량체를 비오틴/스트렙타비딘(streptavidin) 시스템을 이용하여 올리고머화할 수 있다. 펩티드 단량체의 비오틴화 유도체는 표준 기술로 합성될 수 있다. 예를 들면, 펩티드 단량체는 C-말단 비오틴화될 수 있다. 그 다음, 이들 비오틴화 단량체를 스트렙타비딘과 함께 배양 [예를 들면, 실온에서 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 HEPES-완충 RPMI 배지 (Invitrogen) 내에서 4:1 몰비로 1 시간 동안]함으로써 올리고머화한다. 이 구체례의 한 가지 변형에 있어서, 비오틴화 펩티드 단량체를 상업적으로 구입 가능한 다양한 항 비오틴 항체 중의 어느 한 가지 [예를 들면, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. (Washington, DC)의 염소 항 비오틴 IgG]와 함께 배양함으로써 올리고머화할 수 있다.

연결자(Linkers)

바람직한 구체례에 있어서, 본 발명의 펩티드 단량체는 1개 이상의 연결자 부분(연결자 부분)에 공유 결합시킴으로써 이량화된다. 상기 연결자(L_K) 부분은, 필수적인 것은 아니지만, 바람직하게는 임의로 1개 또는 2개의 -NH- 결합으로 종결되고, 임의로 1개 이상의 이용 가능한 탄소 원자가 저급 알킬 치환기로 치환되는 C₁ _-12 연결 부분이다. 바람직하게는 상기 연결자 L_K는 R이 (예를 들면, 고체 지지체의 표면에 존재하는 것과 같은) 다른 분자 부분에 결합할 수 있는 카복실기 또는 아미노기와 같은 작용기로 치환된 저급 (C_l-6) 직쇄상 탄화수소인 -NH-R-NH-를 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 연결자는 리신 잔기 또는 리신 아미드 (카복실기가 아미드 부분 -CONH₂로 전환된 리신 잔기)이다. 바람직한 구체례에 있어서, 상기 연결자는 각 단량체의 C-말단 아미노산에 동시에 부착됨으로써 2개의 펩티드 단량체의 C-말단을 연결시킨다.

예를 들면, C-말단 연결자 L_K가 리신 아미드인 경우, 상기 이량체는 다음 화학식 1에 제시된 것과 같은 구조로 설명될 수 있고, 화학식 2에 제시된 것과 같이 간략화될 수 있다.

화학식 I 화학식 II

화학식 I에서, N²는 리신의 ε-아미노기의 질소 원자를 나타내는 것이고, N¹은 리신의 α-아미노기의 질소 원자를 나타내는 것이다. 상기 이량체 구조는 리신의 α 및 ε 아미노기 양쪽 모두에 결합되어 있는 펩티드를 표시하기 위하여 [펩티드]₂ Lys-아미드로, 또는 리신의 아미노기의 α 및 ε 아미노기 양쪽 모두에 결합되어 있는 N-말단 아세틸화 펩티드를 표시하기 위하여 [Ac-펩티드]₂ Lys-아미드로, 분자 내 디설파이드 루프를 갖는 각각의 펩티드가 리신의 α 및 ε 아미노기 양쪽 모두에 결합되어 있는 N-말단 아세틸화 펩티드를 표시하기 위하여 [Ac-펩티드, 디설파이드]₂ Lys-아미드로, 분자 내 디설파이드 루프 및 리신의 C-말단과 PEG 부분 사이에 공유 결합을 형성하는 간격자 분자를 갖는 각각의 펩티드가 리신의 α 및 ε 아미노기 양쪽 모두에 결합되어 있는 N-말단 아세틸화 펩티드를 표시하기 위하여 [Ac-펩티드, 디설파이드]₂ Lys-간격자-PEG로, 리신의 아민이 이미노디아세트산의 2개의 카복실기 각각에 결합되어 있다.

필수적인 것은 아니지만, 일반적으로 세포간 이황화 결합을 형성하는 기술에 의하여 이량화된 펩티드 이량체는 또한 펩티드 단량체의 시스테인 잔기 사이에 1개 이상의 분자 내 디설파이드 결합을 가질 것이다. 예컨대 두 개의 이량체는 하나 이상의 세포한 이황화 결합에 의하여 교차 연결된다. 바람직하게는, 2개의 단량체는 1개 이상의 분자 내 디설파이드 결합을 갖는다. 가장 바람직하게는, 펩티드 이량체의 단량체는 양쪽 모두 분자 내 디설파이드 결합을 가짐으로써, 각 단량체는 고리기를 갖는다.

펩티드 변경

본 발명의 펩티드 화합물의 아미노 및/또는 카복시 말단을 변경시킴으로써 본 발명의 다른 화합물을 제조할 수 있다. 아미노 말단 변경은 메틸화 (예를 들면, --NHCH₃또는 --N(CH₃)₂), (예를 들면, 아세트산으로 또는 α-클로로아세트산, α-브로모아세트산 또는 α-요오도아세트산과 같은 이들의 할로겐화 유도체로의) 아세틸화, 벤질옥시카보닐 (Cbz) 기의 첨가, 또는 R이 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬 아릴 등 및 이와 유사한 기들로부터 선택되는 것인 RCOO--로 정의되는 카복실레이트 작용기 또는 R--SO2--로 정의되는 설포닐 작용기로 아미노 말단을 차단하는 것을 포함한다. 프로테아제에 대한 감수성을 감소시키기 위하여 또는 펩티드 화합물의 배열(conformation)을 제한하기 위하여 N-말단에 데스아미노산(desamino acid)을 도입할 수 있다 (이 경우, N-말단 아미노기가 존재하지 않는다). 바람직한 구체례에 있어서, N-말단을 아세틸화한다. 특히 바람직한 구체례에 있어서, N-말단 글리신을 아세틸화하여 N-아세틸글리신 (AcG)을 얻는다.

카복시 말단 변경은 유리산을 카복사미드기로 대체하거나 또는 카복시 말단에 고리형 락탐을 생성시켜 구조적 제한을 가하는 것을 포함한다. 본 발명의 펩티드를 고리화하거나 또는 펩티드의 말단에 데스아미노 또는 데스카복시(descarboxy) 잔기를 도입하여 말단 아미노 또는 카복실기가 존재하지 않도록 함으로써, 프로테아제에 대한 감수성을 감소시키거나 또는 펩티드의 배열을 제한한다. 본 발명의 화합물의 C-말단 작용기는 아미드, 아미드 저급 알킬, 아미드 디(저급 알킬), 저급 알콕시, 하이드록시 및 카복시, 및 이들의 저급 에스테르 유도체, 및 약제학적으로 허용 가능한 이들의 염을 포함한다.

유전적으로 암호화되는 20개의 천연 아미노산 (또는 입체 이성체성 D 아미노산)의 측쇄를 다른 측쇄, 예를 들면, 알킬, 저급 알킬, 고리형 4-, 5-, 6- 내지 7-원 알킬, 아미드, 아미드 저급 알킬, 아미드 디(저급 알킬), 저급 알콕시, 하이드록시, 카복시 및 이들의 저급 에스테르 유도체로, 및 with 4-, 5-, 6- 내지 7-원 헤테로 고리와 같은 기로 교체할 수 있다. 특히, 프롤린 잔기의 고리 크기가 5원 내지 4, 6, 또는 7원까지 변하는 프롤린 유사체가 사용될 수 있다. 고리기는 포화 또는 불포화될 수 있고, 불포화되는 경우 방향족 또는 비방향족일 수 있다. 헤테로고리기는 바람직하게는 1개 이상의 질소, 산소, 및/또는 황 헤테로 원자를 갖는다. 이러한 기의 예는 퓨라자닐, 퓨릴, 이미다졸리디닐, 이미다졸릴, 이미다졸리닐, 이소티아졸릴, 이소옥사졸릴, 모폴리닐 (예를 들면 모폴리노), 옥사졸릴, 피페라지닐 (예를 들면, 1-피페라지닐), 피페리딜 (예를 들면,1-피페리딜, 피페리디노), 피라닐, 피라지닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리딜, 피리미디닐, 피롤리디닐 (예를 들면, 1-피롤리디닐), 피롤리닐, 피롤릴, 티아디아졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 티오모폴리닐 (예를 들면, 티오모폴리노) 및 트리아졸릴을 포함한다. 이들 헤테로고리기는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 이들 기가 치환되는 경우, 치환기는 알킬, 알콕시, 할로겐, 산소, 또는 치환되거나 또는 치환되지 않은 페닐일 수 있다.

펩티드는 인산화 및 [예를 들면, Hruby,외 (1990) Biochem J. 268: 249-262에 기술되어 있는 것과 같은] 기타의 방법으로 용이하게 변경될 수 있다.

본 발명의 펩티드 화합물은 유사한 생물학적 활성을 갖는 비펩티드 화합물을 위한 구조적 모형으로 작용할 수도 있다. 본 발명 분야의 숙련자는 선도(lead) 펩티드 화합물과 동일하거나 또는 유사한 목적하는 생물학적 활성을 갖지만, 용해도, 안정성, 및 가수 분해 및 단백질 분해 반응에 있어서는 선도 물질에 비하여 더 좋은 활성을 갖는 화합물을 설계하는 데에 다양한 기술이 이용될 수 있다는 것을 인식한다 [Morgan and Gainor (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252 참조]. 이들 기술은 펩티드 골격을 포스포네이트, 아미데이트, 카바메이트, 설폰아미드, 2차 아민 및 N-메틸아미노산으로 이루어진 골격으로 교체하는 것을 포함한다.

단량체, 이량체 또는 올리고머 펩티드 부분은 직접 PEG 부분에 부착되거나 1 이상의 간격자 부분을 통하여 부칙될 수 있다.

간격자 부분 (Spacer Moiety)

구체예에서 단량체, 이량체 또는 올리고머 펩티드 부분은 간격자 부분에 대하여 PEG 부분에 부착되고, 간격자 부분은 부분 선택적으로 -NH-결합 또는 -C(O)0- 기로 종결될 수 있다. 예컨대, 간격자는 다른 분자 부분에 결합이 가능하게 하는 카복실기 또는 아미노기, 또는 1 이상의 글리신 (G) 잔기, 또는 6-아미노 헥사노산과 같은 아미노 헥사노산 (Ahx); 또는 리신 (K) 잔기 또는 리신 아미드(K-NH₂, 카복실기가 아미드부분-CONH₂으로 전환되는 리신 잔기)와 같은 작용기로 선택적으로 치환된 저급(1-12) 직쇄상 탄화수소일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 간격자 부분은 다음의 구조를 갖는다:

- NH- (CH₂)_α-[O- (CH₂)_β]_γ-O_δ- (CH₂)_ε-Y--

식 중, α, β, γ, δ, 및 ε는 각각 독립적으로 선택되는 정수이다.

바람직한 구체예에서

α는 1 ≤α≤ 6의 정수;

β는 1 ≤β≤ 6의 정수;

ε는 1 ≤ε≤ 6의 정수;

δ는 0 또는 1;

γ는 0 ≤γ≤ 10의 정수이고;

Y는 NH 또는 CO이다.

특정의 바람직한 구체예에서, γ>1이면, β = 2이다.

한가지 바람직한 구체예에서,

α=β=ε=2;

γ=δ= 1이고;

Y는 NH이다.

다른 바람직한 구체예에서,

γ=δ= 0;

2 ≤α+ε≤5이고;

Y는 CO이다.

일 구체예에서,

γ=δ= 0;

α+ε=5이고;

Y는 CO이다.

본 발명에 따라, 수용성 부분 (바람직하게는 PEG)은 간격자의 NH 말단에 부착된다. 이 수용성 부분은 직접 간격자에 부착될 수도 있고, 또는 간접적으로, 예컨대 아미드 또는 카바메이트 결합 (들)을 통해 부착될 수도 있다. 펩티드 부분은 간격자의 Y 말단에 부착된다. 이 간격자는 펩티드의 C 말단 또는 N 말단에 부착될 수 있다. 따라서, 간격자가 펩티드의 C 말단에 부착된 구체예에서, Y는 NH이다. 간격자가 펩티드의 N 말단에 부착된 구체예에서는, Y는 CO이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 간격자는 아래에 나타낸 리신 연결자에 의하여 펩티드 이량체에 부착한다. 상기 예에서, 간격자는 바람직하게는 연결자 부분의 C-말단에 부착되며, Y는 NH이다. 또 다른 바람직한 구체예에서 본 발명의 간격자는 3작용기성 (Trifunctional) 연결자 (역시 아래에 기재)의 부분으로서 펩티트에 부착된다. 상기 구체예에서 Y는 CO이고 Y는 3작용기성 연결자의 N 원자와 아미드 결합을 형성한다.

간격자 부분은 펩티드 합성 과정 중에 펩티드에 도입될 수 있다. 예를 들면, 간격자가 다른 분자 부분과 결합할 수 있는 유리 아미노기 및 제2 작용기 (예를 들면, 카복실기 또는 아미노기)를 갖는 경우, 상기 간격자를 고체 지지체에 접합시킬 수 있다. 그 다음, 펩티드를 표준 고상 기술을 이용하여 상기 간격자의 유리 아미노기 상에서 직접 합성할 수 있다.

바람직한 구체례에 있어서, 2개의 작용기를 갖는 간격자를 먼저 제1 작용기를 통하여 고체 지지체에 커플링한다. 그 다음, 펩티드 합성을 위한 개시 부위로 작용할 수 있는 2개의 작용기와 다른 분자 부분과 결합할 수 있는 제3 작용기 (예를 들면, 카복실기 또는 아미노기)를 갖는 연결자 L_K 부분을 상기 간격자의 제2 작용기와 연결자의 제3 작용기를 통하여 상기 간격자에 접합시킨다. 그 다음, 2개의 펩티드 단량체를 고상 합성 기술의 변형에 따라 연결자 L_K 부분의 2개의 반응성 질소기 상에서 직접 합성할 수 있다. 예를 들면, 유리 아민기를 갖는 간격자와 커플링된 고체 지지체를 연결자의 유리 카복실기를 통하여 리신 연결자와 반응시킬 수 있다.

펩티드 화합물이 간격자 부분을 갖는 것인 대안적인 구체례에 있어서, 상기 간격자를 펩티드 합성 이후에 펩티드에 접합시킬 수 있다. 이러한 접합은 본 발명 분야에서 잘 정립되어 있는 방법에 의하여 달성될 수 있다. 한 가지 구체례에 있어서, 상기 연결자는 합성되는 펩티드 단량체의 표적 작용기에 부착되기에 적합한 1개 이상의 작용기를 갖는다. 예를 들면, 유리 아민기를 갖는 간격자를 펩티드의 C-말단 카복실기와 반응시킬 수 있다. 다른 한 가지 예에 있어서, 유리 카복실기를 갖는 연결자를 펩티드의 N-말단 또는 리신 잔기의 유리 아민기와 반응시킬 수 있다. 또 다른 예에 있어서, 유리 설프하이드릴기를 갖는 간격자를 디설파이드 결합을 형성시키는 산화 반응에 의하여 펩티드의 시스테인 잔기에 접합시킬 수 있다.

의약 조성물

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 PEG 개질 펩티드 화합물의 의약 조성물이 제공된다. 이러한 조성물의 투여에 의하여 완화 또는 조절되는 상태는 앞에 나타낸 것들을 포함한다. 이러한 의약 조성물은 경구, 비경구 (근육내, 복막내, 정맥내 (IV) 또는 피하 주사), 경피 (수동적으로 또는 이온 삼투 요법 또는 전기 천공법을 이용하는), 경점막(transmucosal) (코, 질, 직장, 또는 설하) 투여 경로로 또는 생물학적 침식이 가능한 삽입물을 이용하여 투여되며, 각각의 투여 경로에 적합한 투여 제형으로 제제화될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 의하여 파악되는 것은 유효량의 본 발명의 치료 펩티드(예컨대, EPO-R에 결합한 펩티드), 또는 유도체 생성물을 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 포함하는 의약 조성물이다. 이러한 조성물은 다양한 완충 내용물 (예를 들면, 트리s-HCI, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 세기로 이루어진 희석제; 세정제 및 가용화제 (예를 들면, Tween 20, Tween 80, 폴리소르베이트 80), 산화 방지제 (예를 들면, 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이트), 보존제 (예를 들면, Thimersol, 벤질 알코올) 및 장확장성(bulking) 물질 (예를 들면, 락토오스, 마니톨)과 같은 첨가제; 물질의 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 중합체형 화합물의 미립자 제제에 또는 리포솜에 합일화(incorporation)하는 것을 포함한다. 하이알루론산 역시 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 본 발명 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도 및 생체 내 청소(clearance) 속도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로서 병합되어 있는 Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed. (1990, mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712를 참조하라. 상기 조성물은 액체형으로 제조될 수 있고, 건조 분말 (예를 들면, 동결 건조된) 형으로 제조될 수도 있다.

경구 전달

본 발명에서 사용되는 것으로 예상되는 것은 본 명세서에 참고 문헌으로서 병합되어 있는 Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042)의 89장에 일반적으로 설명되어 있는 경구 고체 투여 제형이다. 고체 투여 제형은 정제, 캡슐, 환약, 알약(troches) 또는 마름모꼴 정제(lozenges), 교갑(cachets), 펠렛, 분말, 또는 과립을 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물을 제제화하는 데에 리포솜 또는 프로테노이드 캡슐화를 이용할 수도 있다 (예를 들면, 미국 특허 제4,925,673호에 보고된 것과 같은 프로테노이드 미소 구체). 리포솜 캡슐화를 이용할 수 있는데, 리포솜을 다양한 중합체 (예를 들면, 미국 특허 제5,013, 556호)로 유도체화할 수 있다. 치료제를 위하여 가능한 고체 투여 제형에 대한 설명은 본 명세서에 참고 문헌으로서 병합되어 있는 Marshall, K. In: Modern Phar7naceutics Edited by G. S. Banker and C. T. Rhodes Chapter 10,1979에 제시되어 있다. 일반적으로, 제형은 EPO-R 작용제 펩티드 (또는 이들의 화학적 변형)와, 위장 환경에서의 보호를 허용하고, 장내에서 생물학적 활성 물질을 방출하게 하는 불활성 성분들을 포함할 것이다.

또한, 본 발명에서 사용될 것으로 예상되는 것은, 불활성 희석제; 습윤제, 유화제 및 현탁제와 같은 보조제; 및 감미제, 향료, 및 방향제(perfuming agents)를 비롯한 기타 성분들을 포함할 수 있는, 약제학적으로 허용 가능한 에멀전, 용액, 현탁액 및 시럽을 포함하는 경구 투여용 액체 투여 제형이다.

펩티드를 화학적으로 변경시켜 유도체의 경구 전달을 유효하게 할 수 있다. 일반적으로, 예상되는 화학적 변경은 성분 분자 그 자체에 1개 이상의 부분을 부착하는 것인데, 상기 부분은 (a) 단백질 분해의 억제; 및 (b) 위장 또는 장으로부터 혈류 내로의 흡수를 가능하게 한다. 또한 바람직한 것은 성분 또는 성분들의 전체적인 안정성 향상 및 체내 순환 시간의 증가이다. 앞에서 논의한 바와 같이, 페길화가 제약학적 사용을 위한 바람직한 화학적 변경이다. 이용될 수 있는 기타 부분은 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리프롤린, 폴리-1,3-디옥솔란 및 폴리-1,3,6-티옥소칸(tioxocane)을 포함한다 [예를 들면, Abuchowski and Davis (1981) "Soluble Polymer-Enzyme Adducts," in Enzymes as Drugs. Hocenberg 및 Roberts 편집 (Wiley-Interscience: New York, NY) pp. 367-383; 및 Newmark 외 (1982) J. Appl. Biochem. 4: 185-189 참조].

경구 제형의 경우, 방출 위치는 위장, 소장 (샘창자, 지주넴(jejunem) 또는 회장), 또는 대장일 수 있다. 본 발명 분야의 당업자는 위장에서는 용해되지 않지만, 샘창자 또는 장 내의 어떤 부분에서 물질을 방출하는 이용 가능한 제형을 가지고 있다. 바람직하게는, 상기 방출은 펩티드 (또는 유도체)를 보호함으로써, 또는 펩티드 (또는 유도체)를 위장 환경을 넘어서, 장과 같은 곳에서 방출하게 함으로써 위장 환경에 유해한 효과를 피할 것이다.

완전한 위장 저항성을 보장하기 위하여 pH 5.0 이상까지 비투과성인 피복이 필수적이다. 장용 피복으로 사용되는 보다 일반적인 불활성 성분의 예는 셀룰로오스 아세테이트 트리멜리테이트 (CAT), 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트 (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트 (CAP), Eudragit L, Eudragit S, 및 Shellac이다. 이들 피복은 혼합된 필름으로서 사용될 수도 있다.

피복 또는 피복의 혼합물은 위장에 대하여 보호하고자 하는 것이 아닌 정제에도 사용될 수 있다. 이것은 당류 피복, 또는 정제를 씹기 쉽게 하는 피복을 포함할 수 있다. 캡슐은 건조 치료제 (즉 분말) 전달용으로서 경질 껍질 (젤라틴과 같은)로 이루어질 수 있고, 액체 제형용으로서 연질 젤라틴 껍질이 이용될 수 있다. 알약의 껍질 물질은 두꺼운 전분 또는 기타의 식용 가능한 종이(paper)일 수 있다. 환약, 마름모꼴 정제, 성형 정제 또는 정제 가루약(triturates)의 경우, 습기 집적(massing) 기술이 사용될 수 있다.

펩티드 (또는 유도체)를 입자 크기 약 1mm의 과립 또는 펠렛 형태의 미세 다중 미립자로 제형에 포함시킬 수 있다. 캡슐 투여용 물질 제형 역시 분말, 가볍게 압착된 플러그(plugs), 또는 정제로 제공될 수 있다. 이들 치료제는 압착에 의하여 제조될 수 있었다.

착색제 및/또는 향료 역시 포함될 수 있다. 예를 들면, 펩티드 (또는 유도체)를 (리포솜 또는 미소 구체 캡슐화에 의한 것과 같이) 제제화한 다음, 착색제 및 향료를 함유하는 냉장 음료와 같은 식용 제품 내에 추가로 함유시킬 수 있다.

불활성 물질로 희석하거나 또는 펩티드 (또는 유도체)의 부피를 증가시킬 수 있다. 이들 희석제는 탄수화물, 특히 마니톨, α-락토오스, 무수 락토오스, 셀룰로오스, 수크로오스, 개질 덱스트란 및 전분을 포함할 수 있다. 칼슘 트리포스페이트, 마그네슘 카보네이트 및 염화나트륨을 비롯한 특정 무기 염 역시 충전제로서 사용될 수 있다. 몇 가지 상업적으로 구입 가능한 희석제는 Fast-Flo, Emdex,STA-Rx 1500, Emcompressand Avicell이다.

붕해제를 고체 투여 제형의 치료제 제형에 포함시킬 수 있다. 붕해제로 사용되는 물질은 전분에 기초한 시판 붕해제 Explotab를 비롯한 전분을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 소듐 전분 글리콜레이트, Amberlite, 소듐 카복시메틸셀룰로오스, 울트라 아밀로펙틴(ultramylopectin), 소듐 알기네이트, 젤라틴, 오렌지 껍질, 산(acid) 카복시메틸 셀룰로오스, 천연 스폰지 및 벤토나이트가 사용될 수 있다. 붕해제는 불용성 양이온 교환 수지일 수도 있다. 분말화된 고무가 붕해제로서 및 결합제로서 사용될 수 있는데, 이것은 아가, 카라야(Karaya) 또는 트라가칸스(tragacanth)와 같은 분말화된 고무를 포함할 수 있다. 알긴산(alginic acid) 및 그 나트륨염 역시 붕해제로서 유용하다.

펩티드 (또는 유도체) 약제를 서로 붙잡아서 단단한 정제를 형성시키기 위하여 결합제가 사용될 수 있는데, 여기에는 아카시아, 트라가칸스, 전분 및 젤라틴과 같은 천연물로부터 얻어지는 물질이 포함된다. 기타의 것은 메틸 셀룰로오스 (MC), 에틸 셀룰로오스 (EC) 및 카복시메틸 셀룰로오스 (CMC)을 포함한다. 폴리비닐 피롤리돈 (PVP) 및 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스 (HPMC) 양쪽 모두는 펩티드 (또는 유도체)를 과립화하는 알코올성 용액에 사용될 수 있다.

제제화 공정 중에 들러붙는 것을 방지하기 위하여 윤활제(antifrictional agent)를 펩티드 (또는 유도체)의 제제에 포함시킬 수 있다. 윤활제는 펩티드 (또는 유도체)와 다이(die) 벽 사이에 층으로서 사용될 수 있는데, 이들은 그 마그네슘 및 칼슘염을 포함하는 스테아르산, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 액체 파라핀, 식물성 오일 및 왁스를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 소듐 라우릴 설페이트, 마그네슘 라우릴 설페이트, 다양한 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 Carbowax 4000 및 6000과 같은 용해성 윤활제를 사용할 수도 있다.

제제화 과정 중에 약물의 유동성을 향상시키고, 압착 중에 재배열을 도울 수 있는 글리던트(glidants)를 첨가할 수 있다. 글리던트는 전분, 탈크, 화성 실리카(pyrogenic silica) 및 수화 실리코알루미네이트를 포함할 수 있다.

펩티드 (또는 유도체)가 수계 환경에 용해되는 것을 돕기 위하여, 습윤제로서 계면 활성제가 첨가될 수 있다. 계면 활성제는 소듐 라우릴 설페이트, 디옥틸 소듐설포석시네이트 및 디옥틸 소듐 설포네이트와 같은 음이온성 세정제를 포함할 수 있다. 양이온성 세정제를 사용할 수 있는데, 이것은 벤잘코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드를 포함할 수 있다. 계면 활성제로서 제제에 포함시킬 수 있는 잠재적인 비이온성 세정제의 목록은 라우로매크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤모노스테아레이트, 폴리소르베이트 20, 40, 60, 65 및 80, 수크로오스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로오스 및 카복시메틸 셀룰로오스이다. 이들 계면 활성제는 단백질 또는 유도체의 제제 내에 단독으로 또는 혼합물로서 상이한 비율로 존재할 수 있다.

잠재적으로 펩티드 (또는 유도체)의 흡수(uptake)를 향상시키는 첨가제는 예를 들면 지방산 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산이다.

제어 방출 경구 제형이 필요할 수 있다. 펩티드 (또는 유도체)를, 확산 또는 침출 메커니즘 중의 어느 하나에 의한 방출을 허용하는 불활성 매트릭스, 예를 들면, 고무에 혼합할 수 있다. 서서히 분해하는(degenerating) 매트릭스 역시 제제에 혼합될 수 있다. 몇 가지 장용 피복 역시 지연된 방출 효과를 갖는다. 제어 방출의 또 다른 형태는 Oros 치료 체계 (Alza Corp.)에 기초한 방법, 즉, 삼투 효과에 기인하여 물의 유입을 허용하고, 약물을 1개의 작은 구멍을 통하여 밀어내는 반투과막으로 약물을 감싸는 방법에 의한 것이다.

다른 피복을 제제용으로 사용할 수 있다. 이들은 피복 팬(pan)에 응용될 수 있는 다양한 당류를 포함한다. 펩티드 (또는 유도체)는 필름 피복 정제로 제공될 수도 있는데, 이 경우, 사용되는 물질은 2개의 기로 나누어진다. 첫 번째 것은 비장용(nonenteric) 물질로서, 이는 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 메틸하이드록시-에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필-메틸 셀룰로오스, 소듐 카복시-메틸 셀룰로오스, 프로비돈 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 두 번째 기는 보통 프탈산의 에스테르인 장용 물질로 이루어진다.

물질의 혼합이 최적의 필름 피복을 제공하기 위하여 이용될 수 있다. 필름 피복은 팬 피복기에서 또는 유동화 베드에서, 또는 압착 피복에 의하여 수행될 수 있다.

비경구 전달

본 발명에 따른 비경구 투여용 제제는 멸균 수용액 또는 비수용액, 현탁액, 또는 에멀전을 포함한다. 비수계 용매 또는 운송 수단의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유 및 옥수수유와 같은 식물성 오일, 젤라틴, 및 에틸 올리에이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르이다. 이러한 투여 제형은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수도 있다. 이들은 , 예를 들면, 박테리아 보전 여과기를 통하여 여과시킴으로써, 조성물에 살균제(sterilizing agents)를 혼합시킴으로써, 또는 조성물을 가열함으로써 멸균될 수 있다. 이들은 사용 직전에 멸균수 또는 기타의 멸균 주사 가능 매질을 사용하여 제조될 수도 있다.

직장 또는 질내 전달

직장 또는 질내 투여용 조성물은 활성 물질 이외에도 코코아 버터 또는 좌약 왁스와 같은 부형제를 함유하는 좌약이다. 코 또는 설하 투여용 조성물 역시 본 발명 분야에 잘 알려져 있는 표준 부형제와 함께 제조된다.

폐 전달

또한, 본 발명에서 예상되는 것은 EPO-R 작용제 펩티드 (또는 이들의 유도체)의 폐 전달이다. 펩티드 (또는 유도체)는 흡입 중에 포유 동물의 폐로 전달되어, 폐 상피 내층을 통과하여 혈류로 전달된다 [예를 들면, Adjei 외 (1990) Pharmaceutical Research 7: 565-569; Adjei 외 (1990) Int. J. Pharmaceutics 63: 135-144 (류프롤리드(leuprolide) 아세테이트); Braquet 외 (1989) J. Cardiovascular Pharmacology 13 (sup5): 143-146 (엔도텔린-1); Hubbard 외 (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp. 206-212 (α1-안티트립신); Smith 외 (1989) J. Clin. Invest. 84: 1145-1146(α-1-단백 분해 효소); Oswein 외 (1990) "에어로졸ization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delievery II Keystone, Colorado (재조합 인간 성장 호르몬); Debs 외 (1988) J. Immunol. 140: 3482-3488 (인터페론-γ 및 종양 괴사 인자 α); 및 Platz 외, 미국 특허 제5,284,656호 (과립 백혈구 집락 자극 인자) 참조]. 전신 효과용 약물의 폐 전달을 위한 방법 및 조성물은 Wong 외의 미국 특허 제5,451, 569호에 기술되어 있다.

치료제 제품의 폐 전달을 위하여 고안된 매우 다양한 기계 장치가 본 발명의 실시에 사용될 것으로 예상되는데, 이는 분무기, 계량화 투여 흡입기 및 분말 흡입기를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 이들은 모두 본 발명 분야의 당업자에게 친숙한 것들이다. 본 발명의 실시에 적합한 상업적으로 구입 가능한 장치의 몇 가지 구체적인 예는 Ultravent 분무기 (Mallinclcrodt Inc., St. Louis, MO); Acorn II 분무기 (Marquest Medical Products, Englewood, CO); Ventolin 계량화 투여 흡입기 (Glaxo Inc., Research 트리angle Park, NC); 및 Spinhaler 분말 흡입기 (Fisons Corp. , Bedford, MA)이다.

이러한 모든 장치는 펩티드 (또는 유도체)의 투여(dispensing)에 적합한 제형의 사용을 필요로 한다. 통상적으로, 각각의 제형은 이용되는 장치의 유형에 대하여 특유하며, 치료에 유용한 통상의 희석제, 보조제 및/또는 담체 이외에도 적절한 분사제 물질의 사용을 포함할 수 있다. 리포솜, 마이크로캡슐 또는 미소 구체, 포함물(inclusion) 복합체, 또는 다른 유형의 담체의 사용 역시 고려된다. 화학적 변경의 유형 또는 이용되는 장치의 유형에 따라, 화학적으로 변경된 펩티드를 상이한 제형으로 제조할 수도 있다.

분사기 또는 초음파 중 어느 한쪽인 분무기와 함께 사용하는 데에 적합한 제형은 통상적으로 용액 1mL 당 생물학적 활성 단백질을 약 0.1 내지 25 mg의 농도로 물에 용해시킨 펩티드 (또는 유도체)를 포함할 것이다. 상기 제형은 (예를 들면, 단백질 안정화 및 삼투압 조절을 위한) 완충제 및 간단한 당류를 포함할 수도 있다. 분무기 제형은 에어로졸 형성 시에 용액의 원자화(atomization)에 기인하는 펩티드 (또는 유도체)의 표면 유도 응집을 감소시키거나 또는 방지하기 위한 계면 활성제를 함유할 수도 있다.

계량화-투여 흡입기 장치와 함께 사용하기 위한 제형은 일반적으로 계면 활성제의 도움으로 분사제 내에 현탁된 펩티드 (또는 유도체)를 함유하는 미분화된 분말을 포함할 것이다. 상기 분사제는 클로로플루오로카본, 하이드로클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본, 또는 하이드로탄소, including 트리클로로플루오로메탄,디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, 또는 이들의 조합과 같이, 이러한 목적에 사용되는 통상의 물질 중의 어떤 것일 수 있다. 적합한 계면 활성제는 소르비탄 트리올리에이트 및 대두(soya) 레시틴을 포함한다. 올레산 역시 계면 활성제로서 사용될 수 있다.

분말 흡입기 장치로부터 투여하기 위한 제형은 펩티드 (또는 유도체)를 함유하는 미분화된 건조 분말을 포함할 것이며, 이것은 락토오스, 소르비톨, 수크로오스, 또는 마니톨과 같은 장확장성 약물(abullcing agent)을, 장치로부터의 분말 살포(dispersal)를 용이하게 하는 양으로, 예를 들면, 제형에 대하여 50 내지 90 중량%의 양으로 포함할 수도 있다. 펩티드 (또는 유도체)는 가장 유리하게는, 먼 쪽(distal) 폐까지 가장 효과적으로 전달하기 위하여, 평균 입자 크기가 10 mm (또는 마이크론) 미만, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5mm인 미립자형으로 제조되어야 한다.

코(nasal) 전달

EPO-R 작용제 펩티드 (또는 유도체)의 코 전달 역시 고려된다. 코 전달은 치료제를 코에 투여한 후에, 치료제가 폐에 침착(deposition)될 필요 없이, 펩티드가 직접 혈류까지 통과할 수 있게 한다. 코 전달용 제형은 덱스트란 또는 사이클로덱스트란을 함께 포함한다.

투여량

모든 펩티드 화합물에 대하여 추가적인 연구를 실시함으로써, 다양한 환자의 다양한 상태를 치료하는 데에 적절한 투여량 수준과 관련된 정보가 얻어질 것이며, 통상의 숙련자는 치료 상황, 연령, 수용자의 일반적인 건강을 고려하여 적합한 투여량을 확인할 수 있을 것이다. 선택되는 투여량은 목적하는 치료 효과, 투여 경로 및 필요한 치료 기간에 의존한다. 일반적으로, 하루에 0.001 내지 10 mg/kg 체중의 투여량 수준으로 포유류에게 투여한다. 일반적으로, 정맥 주사 또는 주입의 경우에 투여량은 낮을 수 있다. 투여 계획은 순환 반감기 및 사용되는 제형에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 펩티드 (또는 이들의 유도체)는 1개 이상의 추가 활성 성분 또는 의약 조성물과 함께 투여될 수 있다.

다음에 실시예를 들어 본 발명을 설명하나 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: H-TAP- Boc 분자의 합성

공정 A: Cbz -TAP의 합성

무수 디클로로메탄 (DCM) (100 ml) 중 TAP (lOg, 67.47 mmol, Aldrich Chemical Co.에서 구입) 용액을 0℃로 냉각시켰다. 반응 혼합물의 온도를 반응 내내 0℃로 유지하면서, 무수 DCM (SO ml) 중의 벤질 클로로포르메이트 (Cbz-Cl, Cbz = 카복시벤질옥시) (4.82 ml, 33.7 mmol) 용액을 적하 깔때기를 통하여 6-7 시간 동안TAP 용액에 천천히 첨가하였다. 이렇게 얻어진 혼합물을 실온 (~25℃)로 승온시켰다. 16시간 후, DCM을 진공 제거하고 잔사를 3N HCl과 에테르 사이에서 분별시켰다. 수층을 모아 50% aq.NaOH로 pH 8-9까지 중화시키고 아세트산에틸로 추출하였다. 아세트산에틸층은 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 그 진공하에서 농축시켜 조질의 모노-Cbz-TAP (5g, 약 50% 수율)을 얻었다. 이 화합물을 추가 정제하지 않고 공정 B의 반응에 사용하였다.

공정 B: Cbz -TAP- Boc 의 합성

Boc₂0 (3.86 g, 17.7 mmol, Boc = tert-부톡시카보닐)을 격렬히 교반된 헥산 (25 ml) 중 Cbz-TAP (5g, 17.7 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 교반은 실내 온도에서 밤새 계속하였다. 반응 혼합물을 DCM (25 ml)로 희석하고, 10% aq. 시트르산 (2X), 물 (2X) 및 식염수로 세척하였다. 상기 유기층은 무수 Na₂SO₄로 건조시키고 진공하에서 농축시켰다. 조 생성물 (수율 5g)은 공정 C의 반응에 직접 사용하였다.

공정 C: Boc -TAP의 합성

공정 B의 조질의 Cbz-TAP-Boc를 메탄올 (25 ml) 중에 용해시키고, 16시간 동안 기구 압력 (balloon pressure) 하에서 탄소 (5% w/w) 상 5% Pd의 존재하에 수소 첨가하였다. 혼합물을 여과하고, 메탄올로 세척하여 여과액을 진공하에서 농축시켜 조질의 H-TAP-Boc 생성물 (수율 3.7g)을 얻었다.

공정 A-C를 거친 후 전체적인 수율은 약 44% (사용되는 Cbz-Cl의 양에 근거하여 산출)이다.

실시예 2: 펩티드의 C-말단에 간격자 부착

아래의 반응식은 펩티드의 C-말단에 어떻게 간격자를 부착하는지를 도시한 것이다.

H-TAP-Boc는 실시예 1에 따라 제조하였다. DCC는 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드이다.

실시예 3: 자유 측쇄산을 갖는 펩티드에 간격자 부착

아래의 반응식은 펩티드의 자유 측쇄산에 어떻게 간격자를 부착하는지를 나타낸다.

TFA는 트리플루오로아세트산이다.

실시예 4: mPEG-NPC로 펩티드를 페길화

식 중, mPEG-NPC는 다음의 구조를 갖는다:

실시예 5: mPEG-SPA에 의한 펩티드의 페길화

식 중 mPEG-SPA는 다음의 구조를 갖는다:

실시예 6: 간격자 부착 및 펩티드 합성

아래의 반응식은 상기 고체 지지체에서 어떻게 간격자를 부착하는지와 상기 고체 지지체에서 어떻게 펩티드를 합성하는지를 나타낸다.

실시예 7: 수지에 부착된, 간격자를 갖는 펩티드 이량체의 합성

공정 A: 텐타겔 ( TentaGel )-연결자의 합성:

텐타겔 브로마이드 (2.5 g, 0.48 mmol/g, 독일 Rapp Polymere로부터 입수),페놀형 연결자 (5 당량), 및 K₂CO₃ (5 당량)을 20 ml의 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 중에서 70℃에서 14시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각한 후에, 수지를 세척하고 (0.1 N HC1, 물, 아세토니트릴 (ACN), DMF,MeOH), 건조시켜 호박색의 수지를 얻었다.

공정 B: 텐타겔 -연결자-TAP ( Boc )의 합성

상기의 공정 A로부터 얻은 수지 2.5 g과 H-TAP-Boc (1.5 gms, 5 당량) 및 빙초산 (34 ㎕, 5 당량)을 1:1 MeOH/테트라하이드로퓨란 (THF) 혼합물에 첨가하여 밤새 진탕시켰다. THF 중 소듐 시아노보로하이드라이드 (5 당량) 1M 용액을 상기 혼합물에 첨가하고 추가로 7시간 더 진탕시켰다. 상기 수지는 여과 세척한 후 (DMF, THF, 0.1 NHCl, 물, MeOH) 건조하였다. 소량의 수지를 DCM 중 벤질 클로라이드 및 디이소프로필에틸아민 (DIEA)로 벤조일화시키고, 70% 트리플루오로아세트산 (TFA)-DCM으로 분리한 후 LCMS 및 HPLC로 확인하였다.

공정 C: 텐타겔 -연결자-TAP- Lys 의 합성

상기 공정 B로부터 얻은 수지를 Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (Fmoc = 9-플루오레닐메톡시카보닐, 5 당량의 아미노산 및 5 당량의 HATU (N,N,N',N'-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트로부터 제조)를 DMF에 0.5 M 농도로 용해시킨 다음, 10 당량의 DIEA를 첨가하여 제조함)의 활성화된 용액으로 처리하고, 14시간 동안 가볍게 진탕시켰다. 이어서 수지를 세척 (DMF, THF, DCM, MeOH)하고 건조시켜 보호된 수지를 얻었다. 수지를 DCM 중 20% 피리딘, 10% 무수아세트산 용액으로 20분간 처리하여 캡핑 (capping)시킨 다음 전술한 바와 같이 세척하였다. DMF 중 30% 피페리딘에서 20분 동안 수지를 가볍게 진탕시켜 Fmoc기를 제거한 다음 세척 (DMF, THF, DCM,MeOH) 및 건조하였다.

공정 D: 텐타겔 -연결자-TAP- Lys (펩티드) ₂ 의 합성

상기 공정 C로부터 얻은 수지를, HBTU/HOBt 활성화에 의한 Fmoc-아미노산 커플링 및 피페리딘을 이용한 Fmoc 제거 사이클로 반복 처리하여, 두개의 펩티드 사슬을 동시에 만들었다. 이 공정은 Applied Biosystems, Inc.로부터 입수 가능한 ABI 433 자동 펩티드 합성기로 편리하게 수행할 수 있다. 마지막 Fmoc를 제거한 후에, 말단의 아민기를 DMF 중에서 20분 동안 무수아세트산 (10 당량) 및 DIEA (20 당량)로 아실화한 다음, 상기와 같은 방법으로 세척하였다.

공정 E: 수지로부터의 분리

상기 공정 D로부터의 수지를 실온에서 3시간 동안 TFA (82.5%), 페놀 (5%), 에탄디티올 (2.5%), 물 (5%) 및 티오아니솔 (5%) 용액 중에서 현탁시켰다. TFA (95%), 물 (2.5%) 및 트리이소프로필실란 (2.5%)과 같은 다른 분리 칵테일도 사용할 수 있다. TFA 용액을 5℃로 냉각시키고, Et₂0에 부어 펩티드를 침전시켰다. 감압하에 여과 및 건조시켜 간격자를 갖는 목적하는 펩티드 이량체를 얻었다. C18 컬럼을 가진 제조용 HPLC로 정제하여 간격자를 갖는 순수한 펩티드 이량체를 얻었다.

공정 F: 산화

환원된 시스테인 잔기를 갖는 이량체 펩티드 (간격자에 부착)를 산화시켜 디설파이드 결합을 갖는 이량체 펩티드를 얻었다.

이량체 펩티드를 20% DMSO/물 (1 mg 건조 중량 펩티드/ ml)에 용해시키고, 실온에서 36시간 방치시켰다. 반응 혼합물을 C18 HPLC 컬럼 (Waters Delta-Pak C18, 입도 15 마이크론, 공경 300 옹스트롱, 40 mm x 200 mm 길이)에 로딩시킨 다음, 5 내지 95%의 ACN을 이용하여 40분간 직쇄상 ACN/물/0.01% TFA 구배에 의해 펩티드를 정제하였다.

실시예 8: mPEG-NPC를 이용한 간격자를 갖는 펩티드 이량체의 페길화

예컨대,

간격자에 부착된 이량체 펩티드를 건조 DMF 중 동량 (몰 개념)의 활성화된 PEG종 (NOF Corp., Japan이 제조하고, Nektar Therapeutics, U.S. (전신은 "Shearwater Corp.")를 통해 입수가능한 mPEG-NPC)과 혼합하여 투명한 용액을 얻었다. 5분 후에, 4 당량의 DIEA를 상기 용액에 첨가했다. 혼합물을 주변 온도에서 14시간 동안 교반하고, 이어서 C18 역상 HPLC로 정제하였다. 페길화 펩티드의 구조를 매트릭스 지원 레이저 탈착 이온화 (Matrix-assisted-laser-desorption-ionization; MALDI) 질량 분석법에 의하여 확인하였다. mPEG-NPC는 다음의 구조를 갖는다:

실시예 9: mPEG-SPA에 의한, 간격자를 갖는 펩티드 이량체의 페길화

간격자를 갖는 펩티드 이량체의 페길화 역시 mPEG-SPA를 이용하여 수행가능하다. mPEG-SPA는 다음의 구조를 갖는다.

실시예 10: 이온 교환 정제

실시예 8에서 얻은 시료를 이용하여 펩티드-간격자-PEG 접합체를 정제하는데 적합한 이온 교환 지지체를 확인하였다.

일반적인 과정은 다음과 같다:

이온 교환 수지 (2-3g)를 1cm 컬럼에 적재한 후, 나트륨 형 (용리액이 pH14에 도달할 때까지 컬럼에 0.2N NaOH를 적재함)으로, 이어서, 수소 형 (용리액이 적재 pH에 도달할 때까지 0.1N HC1 또는 0.1M HOAc로 용리함)으로 전환시켰다. 그 후, pH가 6에 도달할 때까지, 25% ACN/물로 세척하였다. 접합 전의 펩티드 또는 펩티드-PEG 접합체를 25% ACN/물 (10 mg/ml)에 용해시키고, TEA로 pH를 3 미만으로 조정한 후, 별도 실험으로 컬럼에 적재시켰다. 25% ACN/물 2-3 컬럼 부피로 세척하고, 분획 5 ml를 수집한 후, 펩티드를 25% ACN/물 중 0.1M NH₄0Ac로 용리하여 컬럼으로부터 분리시켰다. 그 후, 다시 5 ml 분획을 수집하였다. HPLC 분석으로 원하는 펩티드를 함유하고 있는 분획을 확인하였다. 증발 빛 산란 검출기 (ELSD)를 이용한 분석으로, 펩티드가 컬럼에 머물러 있을 때와 NH₄0Ac 용액으로 용리될 때 (일반적으로 분획 4 및 10 사이임), 불순물로서 비접합된 PEG가 관찰되지 않는 것을 알 수 있었다. 펩티드가 초기 세척 완충제에서 용리될 때 (일반적으로 처음 2 분획), 원하는 PEG-접합체와 과량의 PEG의 어떠한 분리도 관찰되지 않았다.

펩티드-PEG 접합체를 미반응 (또는 가수분해된) PEG로부터 분리하는 능력과 출발 이량체 펩티드를 보유하는 능력을 기준으로 이온 교환 지지체를 선택하였다. 모노 S HR5/5 강양이온 교환 프리 로딩 컬럼 (mono S HR5/5 strong cation exchange pre-loaded column; Amersham Biosciences), SE53 셀룰로오스 미립자 강양이온 교환 지지체 (SE53 Cellulose microgranular strong cation exchange support; Whatman) 및 SP 세파로스 급류 강 양이온 교환 지지체 (SP Sepharose Fast Flow strong cation exchange support; Amersham Biosciences)가 적합한 이온 교환 지지체인 것으로 확인되었다.

실시예 11: α-아미노산에 의거한 3작용기성 분자의 합성

다음 구조를 갖는 분지상 3작용기성 분자

m=1-5, n = 1-14, m 및 n은 정수;

식 중,

를 다음의 반응식에 따라 합성하였다:

m=1-5, n = 1-14, m 및 n은 정수;

이러한 3작용기성 분자는 연결자 및 간격자로 동시에 작용한다.

실시예 12: 3차 아미드에 기초한 3작용기성 분자의 합 성

다음 구조를 갖는 분지상 3작용기성 분자:

m=1-5, n =1-14, m 및 n은 정수;

식 중

를 다음의 반응식에 따라 합성하였다:

m=1-5, n =1-14, m 및 n은 정수;

상기 3작용기성 분자는 연결자 및 간격자로 동시에 작용한다.

실시예 13: 동종3작용기성 ( homotrifunctional ) 분자의 합성

다음 구조를 갖는 동종3작용기성 분자:

m=1-2, n = 1-6, m 및 n은 정수

이 중

를 다음의 반응식에 따라 합성하였다:

m=l-2, n = 1-6, m 및 n은 정수

상기 동종3작용기성 분자는 동시에 연결자(들) 및 간격자로 작용한다.

실시예 14: 3작용기성 분자를 이용한 C-말단 이량화 및 페길화

다음 구조를 갖는 3작용기성 분자

는 실시예 12에 따라 제조하였다.

3작용기성 분자를 다음의 반응식에 따라 C-말단 이량화 및 페길화에 이용하였다:

실시예 15: 3작용기성 분자를 이용한 N-말단 이량화 및 페길화

3작용기성 분자는 다음과 같이 제조하였다:

200 ml의 DCM 중 Boc-βAla-OH (10.0 g, 52.8 mmol) (Boc = tert-부톡시카보닐) 및 디에틸 이미노디아세테이트 (10.0 g, 52.8 mmol) 용액에 0℃에서 DCC (10.5g, 50.9 mmol)를 5분간 첨가하였다. 백색의 침전물이 2분 이내 형성되었다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 데우고 24시간 동안 교반하였다. 요소 (urea)를 소결체 여과기 (다공성 매체)로 여과시키고 용매를 감압하에 제거하였다. 잔사를 500 ml의 EtOAc (EtOAc= 아세트산에틸)에서 취하고, 상기와 같은 방법으로 여과한 후 분액 깔때기로 옮겼다. 상기 유기상을 세척 (포화 NaHCO₃, 식염수, 1 N HC1, 식염수), 건조 (MgSO₄), 여과 및 건조하여 무색의 오일을 얻었다. 상기 오일을 고체화하여 10분 이내에 백색의 결정체 고체를 얻었다.

조질의 디에스테르를 75 ml의 THF (THF = 테트라하이드로퓨란) 및 75 ml의 MeOH (MeOH = 메탄올)에서 취하고 50 ml의 물을 첨가하였다. 상기 용액에 물 25 mL 중의 KOH (KOH = 수산화칼륨) (8.6 g, 153 mmol) 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물은 밝은 노란색으로 변하였다. 12시간 동안 교반한 후에 (pH는 여전히 ~12), 유기 용매를 회전식 증발 건조기에서 제거하고 얻어진 슬러리를 Et₂0 (Et₂0 = 디에틸 에테르) 및 포화 NaHC0₃ 사이에서 분별시켰다. 결합된 수성상을 pH 1로 산성화하고, NaCl로 포화시킨 다음, EtOAc로 추출하였다. 상기 EtOAc층을 세척 (식염수), 건조 (MgSO₄), 및 농축하여 백색의 고체인 생성물 13.97g을 얻었다 (2개 공정에서 90.2%).

주석: DCC 반응을 ACN 중에서 수행할 경우 수율이 73%로 하락하였다. DIC를 사용하는 경우, 크로마토그래피에 의하지 않고는 목적하는 생성물로부터 요소 부산물을 제거할 수 없었다; DCC 요소는 크로마토그래피 없이도 정량적으로 제거할 수 있다. 또한 상기 반응은 또한 수용성 카보디이미드의 경우에도 적용된다.

50 ml의 ACN 중 이산 (diacid) (l.OOg, 3.29 mmol) 및 히드록시숙신이미드 (0.945 g, 8.21 mmol) 용액에 5분간 DCC (1.36g, 6.59 mmol)를 첨가하였다. 백색의 ppt가 즉시 생성되었다. 이 반응 혼합물을 22시간 동안 교반하고 여과하여 DCC 요소를 제거하였다. 용매는 감압하에 제거하고 잔사를 EtOAc (250 ml)에서 취하여 분액 깔때기로 옮겨담았다. 유기상을 세척하고 (포화 NaHC0₃, 식염수, 1 NHC1, 식염수), 건조 (MgSO₄), 및 농축하여 백색의 고체를 얻었다. 이 고체를 75 ml의 ACN 중에서 취하고, 여과 및 농축하여 생성물 1.28 g을 백색 고체로서 얻었다 (수율 78. 2% ).

주석: 수율은 THF 중에서 31%, DMF 중에서 68% (DCC 대신에 DIC로), 그리고 DCM/DMF 중에서 57%로 하락하였다. 출발 이산은 ACN 중에서 가용성이어서, 만일 어떤 물질이 DCC가 첨가되기 전에 용해되지 않았다면, 이를 여과하여 제거할 수 있다.

상기 3작용기성 분자를 다음의 반응식에 따라 N-말단 이량화 및 페길화에 사용하였다:

실시예 16: mPEG ₂ - 리시놀 -NPC의 합성

상업적으로 입수 가능한 리시놀을 과량의 mPEG2로 처리하여 mPEG₂-리시놀을 얻었다. 그 후, mPEG₂-리시놀을 과량의 NPC로 처리하여 mPEG₂-리시놀-NPC를 형성하였다.

실시예 17: 3작용기성 분자를 이용하는 페길화 (두 개의 직쇄상 PEG 사슬을 포함하는 PEG 부분)

다음의 구조를 갖는 3작용기성 분자는 실시예 15에 따라 제조하였다.

공정1 - 펩티드 단량체에 대한 3작용기성 연결자의 커플링:

연결자에 커플링 하기 위하여, 건조 DMF 중 1 당량의 3작용기성 연결자와 2당량의 펩티드를 혼합하여 투명한 용액을 얻고, 5 당량의 DIEA를 2분 후에 첨가하였다. 혼합물을 주변 온도에서 14시간 동안 교반한다. 용매를 감압하에 제거하고 조질의 생성물을 DCM 중 80% TFA에 30분 동안 용해시켜 Boc기를 제거한 다음, C18 역상 HPLC로 정제하였다. 이량체의 구조는 전기 분무 질량 분석법에 의하여 확인하였다. 상기 커플링 반응으로 연결자를 각 단량체의 리신 잔기의 ε-아미노기의 질소 원자에 부착하였다.

공정 4 - 펩티드 이량체의 페길화 :

카바메이트 결합을 경유한 페길화 :

펩티드 이량체와 PEG 종 (mPEG₂-리시놀-NPC)을 건조 DMF 중에서 1:2의 몰비율로 혼합하여 투명한 용액을 얻는다. 5분 후에 4당량의 DIEA를 상기 용액에 첨가 하였다. 혼합물을 주변 온도에서 14시간 동안 교반하고, 이어서 C18 역상 HPLC로 정제하였다. 페길화 펩티드의 구조는 MALDI 질량 분석법에 의하여 확인하였다. 정제된 펩티드는 또한 아래에 기재한 바와 같이 양이온 교환 크로마토그래피를 통하여 정제시켰다.

아미드 결합을 경유한 페길화 :

펩티드 이량체와 PEG 종 [mPEG2-Lys-NHS]을 건조 DMF 중에서 1:2 몰비율로 혼합하여 투명한 용액을 얻었다. 5분 후, DIEA 10 당량을 상기 용액에 첨가한다. mPEG₂-Lys-NHS는 Nektar Therapeutics (490 Discovery Drive, Huntsville, Alabama 35806)의 Molecular Engineering 카탈로그 (2003), 아이템 No. 2Z3XOT01와 같이, 상업적으로 입수 가능하다, 혼합물을 주변 온도에서 2시간 동안 교반하고, 이어서 C18 역상 HPLC로 정제한다. 페길화 펩티드의 구조는 MALDI에 의하여 질량을 확인하였다. 정제된 이 펩티드를 또한 아래에 기재한 바와 같이 양이온 교환 크로마토그래피를 통하여 정제시켰다.

본 발명은 본 명세서에 제시된 구체적인 실시 형태에 의해 그 범위가 제한되는 것은 아니다. 실제로, 본 명세서에 기재된 것 외에, 본 발명에 다양한 실시 형 태는 전술한 상세한 설명과 첨부 도면으로부터 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 변형은 기재된 청구 범위에 포함되는 것이다.

특허, 특허 출원 및 다양한 공개 문헌을 포함한 수많은 참조 문헌이 본 발명의 설명에서 인용되고 논의된다. 이러한 문헌의 인용 및/또는 논의는 단지 본 발명의 보다 정확하게 기술하기 위함이며, 이러한 문헌을 본 발명의 "종래 기술"로 인정하는 것은 아니다. 본 상세한 설명에서 인용되고 논의된 모든 문헌은, 각각의 인용문헌들이 개별적으로 문헌에 의해 병합된 것처럼, 여기에서 전적으로 같은 범위로 인용문헌으로 병합된다.

Claims

폴리 (에틸렌 글리콜) 부분이 직쇄상이고 20 K Daltons 이상의 분자량을 가지는 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분 및 펩티드 부분으로 이루어진 펩티드 기재 화합물.
제1항에 있어서, 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분이 20 내지 40 KDaltons의 분자량을 가지는 화합물.
제2항에 있어서, 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분이 1.20 이하의 다분산성 값 (Mw/Mn)을 가지는 화합물.
제1항에 있어서, 펩티드 부분이 한 개의 펩티드로 구성되는 펩티드 단량체인 화합물.
제1항에 있어서, 펩티드 부분이 연결자 부분에 의하여 연결된 두 개의 펩티드로 구성되는 펩티드 이량체인 화합물.
제4항 또는 제5항에 있어서, 각각의 펩티드는 50개 이하의 아미노산 단량체로 구성되는 것인 화합물.
제6항에 있어서, 각각의 펩티드는 약 10 내지 25 개의 아미노산 단량체로 구성되는 것인 화합물.
제7항에 있어서, 각각의 펩티드는 약 12 내지 18 개의 아미노산 단량체로 구성되는 것인 화합물.
제1항에 있어서, 펩티드 부분이 에리스로포이에틴-수용체에 결합 된 펩티드로 구성되는 것인 화합물.
제1항에 있어서, 펩티드 부분이 토스롬보포이에틴-수용체에 결합 된 펩티드로 구성되는 것인 화합물.
제1항에 있어서, 펩티드 부분과 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분 사이에 간격자 부분을 더 포함하는 것인 화합물.
제1항에 있어서, 간격자 부분은 다음의 구조를 갖는 화합물;

- MH- (CH₂)_α- [O- (CH₂)_β]_γ-O_δ- (CH₂)_ε-Y-

이 중 α, β, γ, δ 및 ε은 각각 독립적으로 선택되는 값을 가지는 정수 이다.
제12항에 있어서, α는 1 ≤ α ≤ 6의 정수;

β는 1 ≤ β ≤ 6의 정수;

ε은 1 ≤ ε ≤ 6의 정수;

δ는 0 또는 1;

γ는 0 ≤ γ ≤ 10의 정수;

Y는 NH 또는 CO인 화합물.
제13항에 있어서, γ> 1 이고 β= 2인 화합물.
(a) 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분이 직쇄상이고 20 K Daltons 이상의 분자량을 가지는 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분 및 펩티드 부분으로 이루어진 펩티드 기재 화합물; 및

(b) 1 이상의 약학적으로 허용 가능한 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체를 포함하는 약학 조성물.
제15항에 있어서, 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분이 20 내지 40 K Daltons의 분자량을 가지는 것인 조성물.
제15항에 있어서, 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분이 1.20 이하의 다분산성 값 (Mw/Mn)을 가지는 조성물.
제15항에 있어서, 펩티드 부분이 한 개의 펩티드로 구성되는 펩티드 단량체인 조성물.
제15항에 있어서, 펩티드 부분이 연결자 부분에 의하여 연결된 두 개의 펩티드로 구성되는 펩티드 이량체인 조성물.
제18항 또는 제19항에 있어서, 각각의 펩티드는 50개 이하의 아미노산 단량체로 구성되는 것인 조성물.
제20항에 있어서, 각각의 펩티드는 약 10 내지 25 개의 아미노산 단량체로 구성되는 것인 조성물.
제21항에 있어서, 각각의 펩티드는 약 12 내지 18 개의 아미노산 단량체로 구성되는 것인 조성물.
제15항에 있어서, 펩티드 부분이 에리스로포이에틴-수용체에 결합 된 펩티드로 구성되는 것인 조성물.
제15항에 있어서, 펩티드 부분이 토스롬보포이에틴-수용체에 결합 된 펩티드로 구성되는 것인 조성물.
제15항에 있어서, 펩티드 부분과 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분 사이에 간격자 부분을 더 포함하는 것인 조성물.
제15항에 있어서, 간격자 부분은 다음의 구조를 갖는 화합물:

- MH- (CH₂)_α- [O- (CH₂)_β]_γ-O_δ- (CH₂)_ε-Y-

이 중 α, β, γ, δ 및 ε은 각각 독립적으로 선택되는 값을 가지는 정수이다.
제26항에 있어서, α는 1 ≤ α ≤ 6의 정수;

β는 1 ≤ β ≤ 6의 정수;

ε은 1 ≤ ε ≤ 6의 정수;

δ는 0 또는 1;

γ는 0 ≤ γ ≤ 10의 정수;

Y는 NH 또는 CO인 조성물.
제27항에 있어서, γ> 1 이고 β= 2인 조성물.
제1항에 있어서, 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분이 20 내지 60 K Daltons의 분자량을 가지는 것인 화합물.
제1항에 있어서, 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분이 20 K Daltons의 분자량을 가지는 것인 화합물.
제1항에 있어서, 폴리 (에틸렌 글리콜) 부분이 1 이상의 직쇄상 폴리 (에틸렌 글리콜) 사슬로 이루어지는 것인 화합물.