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TW202204406A - 抗個體遺傳型抗體及使用其之方法 - Google Patents

抗個體遺傳型抗體及使用其之方法 Download PDF

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TW202204406A
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艾克塔 帕特爾
軍霞 王
阿吉特 卡麥斯
內森 Ｋ 加姆洛
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Abstract

本揭露內容大體而言關於結合至抗CD123抗體、嵌合抗原受體(CAR)或抗體結合片段的抗體及其結合片段。特定言之，所揭露的抗個體遺傳型抗體與片段係結合至抗CD123抗體、CAR或其片段，並包含新穎的互補決定區(CDR)。最後，本揭露內容關於使用所揭露的抗體及其片段來擴增及/或活化表現CD123-CAR的免疫細胞之方法，偵測或定量CD123-CAR之方法，以及分離出表現CD123-CAR的免疫細胞之方法。

Description

抗個體遺傳型抗體及使用其之方法
本揭露內容大體而言關於結合至抗CD123抗體、嵌合抗原受體(CAR)或抗體結合片段的抗體及其結合片段。特定言之，所揭露的抗個體遺傳型抗體與片段係結合至抗CD123抗體、CAR或其片段，並包含新穎的互補決定區(CDR)。最後，本揭露內容關於使用所揭露的抗體及其片段來擴增及/或活化表現CD123-CAR的免疫細胞之方法，偵測或定量CD123-CAR之方法，以及分離出表現CD123-CAR的免疫細胞之方法。
以下論述僅供協助讀者理解本揭露內容，不得用以描述或構成本案之先前技術。
CD123(即介白素3受體α鏈；IL-3Rα)屬於I型細胞介素受體家族，並為一異二聚體，其帶有與共同β(βc或CD131)次單元配對的獨特α鏈。CD123係表現於各種惡性腫瘤，包括急性與慢性骨髓性白血病、毛細胞白血病、B細胞關聯急性淋巴母細胞白血病，及母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤。此外，CD123並非典型地表現於正常造血幹細胞，因此使CD123成為一理想的免疫治療標靶。
如表現抗體與嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞(例如T細胞或自然殺手細胞)的免疫治療，係具有使用標靶特異性機制來治療各種類型的癌症之巨大潛力。然而，分離及定量此等表現抗體或CAR的細胞會是費力且困難的，而表現CAR之細胞的擴增及活化可能具有挑戰性。
本揭露內容提供結合至抗CD123抗體、CAR或其片段的抗個體遺傳型抗體及片段，其可用於各種不同的製造、品質管制及治療之應用。
本文所述為結合至抗CD123抗體或其片段之新穎的抗個體遺傳型抗體以及使用其之方法。
在一態樣中，本揭露內容係關於一種抗體或抗原結合片段，其包含一重鏈變異(VH )區及一輕鏈變異(VL )區，該VH 及VL 區包含：含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)之一重鏈互補決定區1(CDRH1)，含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)之一CDRH2，及含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)之一CDRH3；以及含EDIYX1 X2 (SEQ ID NO: 10)之一輕鏈互補決定區1(CDRL1)、含X3 AX4 (SEQ ID NO: 11)之一CDRL2、及含QQX5 X6 X7 YPX8 T (SEQ ID NO: 12)之一CDRL3，其中X1 為一極性胺基酸；X2 係選自於由以下所構成之群組：絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺酸(N)、麩醯胺酸(Q)、半胱胺酸(C)、甘胺酸(G)及脯胺酸(P)；X3 係選自於由以下所構成之群組：天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺酸(N)及麩醯胺酸(Q)；X4 係一極性胺基酸；X5 及X6 係選自於由以下所構成之群組：精胺酸(R)、組胺酸(H)、離胺酸(K)、丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)；X7 係選自於由以下所構成之群組：天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺酸(N)及麩醯胺酸(Q)；以及X8 係選自於由以下所構成之群組：丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)。
在一些實施態樣中，X1 為絲胺酸(S)或天冬醯胺酸(N)。在一些實施態樣中，X2 為天冬醯胺酸(N)或甘胺酸(G)。在一些實施態樣中，X3 為天冬胺酸(D)或天冬醯胺酸(N)。在一些實施態樣中，X4 為絲胺酸(S)或天冬醯胺酸(N)。在一些實施態樣中，X5 及X6 為組胺酸(H)或酪胺酸(Y)。在一些實施態樣中，X7 為天冬胺酸(D)或天冬醯胺酸(N)。在一些實施態樣中，X8 為白胺酸(L)或酪胺酸(Y)。在一些實施態樣中，X1 為絲胺酸(S)或天冬醯胺酸(N)；X2 為天冬醯胺酸(N)或甘胺酸(G)；X3 為天冬胺酸(D)或天冬醯胺酸(N)；其中X4 為絲胺酸(S)或天冬醯胺酸(N)；X5 及X6 為組胺酸(H)或酪胺酸(Y)；X7 為天冬胺酸(D)或天冬醯胺酸(N)；以及X8 為白胺酸(L)或酪胺酸(Y)。
在一些實施態樣中，該抗體或抗原結合片段可能包含：含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的一CDRH1、含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的一CDRH2及含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的一CDRH3，以及含EDIYSN (SEQ ID NO: 4)的一CDRL1、含DAS (SEQ ID NO: 5)的一CDRL2及含QQHHDYPLT (SEQ ID NO: 6)的一CDRL3；或者含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的一CDRH1、含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)之一CDRH2及含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的一CDRH3，以及含EDIYNG (SEQ ID NO: 7)的一CDRL1、含NAN (SEQ ID NO: 8)的一CDRL2及含QQYYNYPYT (SEQ ID NO: 9)的 一CDRL3。 在一些實施態樣中，該抗體或抗原結合片段可能包含：含EVQLQQSGAELVRPGASVRLSCTTSGFNIKDSFIHWVKQRTEQGLEWIGRI DPEDDETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASPIYGSREAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 13)的VH 區及含DIQMTQSPASLSASLGETVTIECLASEDIYSNLAWYQQKPGKSPQLLIYDASSLQDGVPSRFSGSESGTQYSLEINSLQSEDAATYFCQQHHDYPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 14)的VL 區；或者含EVQLQQSGAELVRPGASVRLSCTTSGFNIKDSFIHWVK QRTEQGLEWIGRIDPEDDETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASPIYGSREAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 13)的VH 區及含DIQMTQSPASLSASLGETVTIECRASEDIYNGLAWYQQKPGKSPQLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVASYFCQQYYNYPYTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 15)的VL 區。
在一些實施態樣中，該抗體或抗原結合片段係特異性結合至在一抗CD123抗體或一抗CD123抗原結合片段上的一個體遺傳型。在一些實施態樣中，該抗CD123抗體或抗CD123抗原結合片段包含DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKDLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQ SGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNKYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 20)的VL 域及/或QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWM NWVKQRPDQGLEWIGRIDPYDSETHYNQKFKDKAILTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGNWDDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 21)的VH 域。在一些實施態樣中，該抗CD123抗原結合片段係一scFv。在一些實施態樣中，該抗CD123抗原結合片段係併入一嵌合抗原受體(CAR)。
在抗個體遺傳型抗體或片段與一CAR結合之該等實施態樣中，該CAR可能包含一IgG鉸鏈或一經修飾的IgG鉸鏈、一跨膜域、一共刺激訊號傳導域及一T細胞受體ζ鏈訊號傳導域。在一些實施態樣中，該共刺激訊號傳導域係選自於由以下所構成之群組：一CD27共刺激訊號傳導域、一CD28共刺激訊號傳導域、一4-1BB共刺激訊號傳導域及一OX40共刺激訊號傳導域。在一些實施態樣中，該跨膜域包含CD28、CD4、CD8、4-1BB、CD 27、ICOS、OX40、HVEM或CD30之一跨膜部分。在一些實施態樣中，該CD123-CAR包含：含SEQ ID NO: 20的一VL 域及含SEQ ID NO: 21的一VH 域、一CD28跨膜域、含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25的一共刺激域，以及含SEQ ID NO: 48的一CD3ζ域。在一些實施態樣中，該CD123-CAR包含SEQ ID NO: 49。在一些實施態樣中，該CD123-CAR包含：含SEQ ID NO: 22的一VL 域及含SEQ ID NO: 23的一VH 域、一CD28跨膜域、含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25的一共刺激域，以及含SEQ ID NO: 48的一CD3ζ域。在一些實施態樣中，該CD123-CAR包含SEQ ID NO: 50。
在另一態樣中，本揭露內容提供編碼一抗體或抗原結合片段之核苷酸序列，其包含： GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAGGTTGTCCTGCACAACTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTCCTTTATTCACTGGGTGAAGCAGAGGACTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATGAAACTAAATATGCCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGCCCCATCTACGGTAGTAGAGAGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 16)以及GACATCCAGATGACACAGTCTCCAGCTTCCCTGTCTGCATCTCTGGGAGAAACTGTCACCATCGAATGTCTAGCAAGTGAAGACATTTACAGTAATTTAGCGTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATGATGCAAGTAGCTTGCAAGATGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCAGTGAATCTGGCACACAGTATTCTCTCGAGATCAACAGCCTGCAATCTGAAGATGCCGCGACTTATTTCTGTCAACAGCATCATGATTATCCTCTCACGTTCGGTTCTGGGACCAAGCTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 17)；或者 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAGGTTGTCCTGCACAACTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTCCTTTATTCACTGGGTGAAGCAGAGGACTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATGAAACTAAATATGCCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGCCCCATCTACGGTAGTAGAGAGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 18)以及GACATCCAGATGACACAGTCTCCAGCTTCCCTGTCTGCATCTCTGGGAGAAACTGTCACCATCGAATGTCGAGCAAGTGAGGACATTTACAATGGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATAATGCAAATAGCTTGCATACTGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACACAGTATTCTCTCAAGATAAACAGCCTGCAGTCTGAAGATGTCGCAAGTTATTTCTGTCAACAGTATTACAATTATCCGTACACGTTTGGAGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA (SEQ ID NO: 19)。在一些實施態樣中，前述核苷酸序列可被含納在一表現載體內。
在另一態樣中，本揭露內容提供用於擴增或活化表現一抗CD123嵌合抗原受體(CD123-CAR)之免疫細胞的方法，包括於活體外將表現一CD123-CAR之免疫細胞群體與一抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段接觸，其特異性結合至該CD123-CAR之一個體遺傳型，其中該CD123-CAR包含結合至CD123之一scFv、一鉸鏈域、一跨膜域、一共刺激域，及T細胞受體ζ鏈訊號傳導域。
在另一態樣中，本揭露內容提供偵測一樣本中一CD123-CAR之存在的方法，包含：將含疑似表現一CD123-CAR之免疫細胞之一樣本與特異性結合至該CD123-CAR之個體遺傳型的一抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段接觸，並將表現該CD123-CAR之細胞數目定量，其中該CD123-CAR包含結合至CD123之一scFv、一鉸鏈域、一跨膜域、至少一共刺激域及T細胞受體ζ鏈訊號傳導域。在一些實施態樣中，該樣本係一細胞培養基。在一些實施態樣中，該樣本係一血液樣本，來自於已使用該表現CD123-CAR之免疫細胞來治療的一受試者。在一些實施態樣中，偵測CD123-CAR之存在的本方法可進一步包含：若判定該表現CD123-CAR之免疫細胞的量係低於一預設臨界值，則建議投予更多表現CD123-CAR之免疫細胞。在一些實施態樣中，偵測CD123-CAR之存在的本方法可進一步包含：若判定該表現CD123-CAR之免疫細胞的量係低於一預設臨界值，則投予更多表現CD123-CAR之免疫細胞。在一些實施態樣中，偵測CD123-CAR之存在的本方法可進一步包含：若判定該表現CD123-CAR之免疫細胞的量係高於一預設臨界值，則建議避免投予更多表現CD123-CAR之免疫細胞。在一些實施態樣中，偵測CD123-CAR之存在的本方法可進一步包含：若判定該表現CD123-CAR之免疫細胞的量係高於一預設臨界值，則避免投予更多表現CD123-CAR之免疫細胞。在一些實施態樣中，偵測CD123-CAR之存在的本方法可進一步包含：自該受試者之血液移除免疫細胞，其係藉由將該血液與一固態撐體接觸來進行，該固態撐體包含抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段，其包含例如含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的一CDRH1、含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的一CDRH2及含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的一CDRH3，以及含EDIYSN (SEQ ID NO: 4)的一CDRL1、含DAS (SEQ ID NO: 5)的一CDRL2及含QQHHDYPLT (SEQ ID NO: 6)的一CDRL3；或者含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的一CDRH1、含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的一CDRH2及含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的一CDRH3，以及含EDIYNG (SEQ ID NO: 7)的一CDRL1、含NAN (SEQ ID NO: 8)的一CDRL2及含QQYYNYPYT (SEQ ID NO: 9)的一CDRL3；藉此自該受試者之血液螯合表現該CD123-CAR之免疫細胞，隨後將已移除該等表現CD123-CAR之免疫細胞的血液送回至該受試者。在一些實施態樣中，受試者具有急性骨髓性白血病(AML)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(BPDCN)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)，或毛細胞白血病。
在另一態樣，本揭露內容提供從一樣本分離出表現CD123-CAR之免疫細胞的方法，該方法包含：將包含疑似表現CD123-CAR之免疫細胞的一樣本與包含一抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段的一固態撐體接觸，藉此從該樣本中分離出表現CD123-CAR之免疫細胞，其中該CD123-CAR係包含結合至CD123之一scFv、一鉸鏈域、一跨膜域、一共刺激域，及T細胞受體ζ鏈訊號傳導域。在一些實施態樣中，該樣本係一細胞培養基。在一些實施態樣中，該樣本係一血液樣本，來自於已使用該表現CD123-CAR之免疫細胞來治療的一受試者。在一些實施態樣中，該固態撐體可包含一管柱或珠粒，該抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段係連接至該管柱或珠粒。
在前述方法之一些實施態樣中，該抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段包含：含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的一CDRH1、含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的一CDRH2及含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的一CDRH3，以及含EDIYSN (SEQ ID NO: 4)的一CDRL1、含DAS (SEQ ID NO: 5)的一CDRL2及含QQHHDYPLT (SEQ ID NO: 6)的一CDRL3；或者含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的一CDRH1、含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的一CDRH2及含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的一CDRH3，以及含EDIYNG (SEQ ID NO: 7)的一CDRL1、含NAN (SEQ ID NO: 8)的一CDRL2及含QQYYNYPYT (SEQ ID NO: 9)的一CDRL3。
在前述方法之一些實施態樣中，該抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段包含：含EVQLQQSGAELVRPGASVRLSCTTSG FNIKDSFIHWVKQRTEQGLEWIGRIDPEDDETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASPIYGSREAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 13)的一VH 區及含DIQMTQSPASLSASLGETVTIECLASEDIYSNLAWYQQKPGKSPQLLIYDASSLQDGVPSRFSGSESGTQYSLEINSLQSEDAATYFCQQHHDYPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 14)的一VL ；或者含 EVQLQQSGAELVRPGASVRLSCTTSGFNIKDSFIHWVKQR TEQGLEWIGRIDPEDDETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASPIYGSREAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 13)的一VH 區及含DIQMTQSPASLSASLGETVTIECRASEDIYNGLAWYQQKPGKSPQLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVASYFCQQYYNYPYTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 15)的一VL 。
在前述方法的一些實施態樣中，該CD123-CAR的鉸鏈係一IgG鉸鏈或一經修飾的IgG鉸鏈。在前述方法的一些實施態樣中，該CD123-CAR的共刺激訊號傳導域係選自於由以下所構成之群組：一CD27共刺激訊號傳導域、一CD28共刺激訊號傳導域、一4-1BB共刺激訊號傳導域，及一OX40共刺激訊號傳導域。在前述方法的一些實施態樣中，該跨膜域包含CD28、CD4、CD8、4-1BB、CD27、ICOS、OX40、HVEM或CD30之一跨膜部分。在前述方法的一些實施態樣中，該CD123-CAR的scFv包含SEQ ID NO: 20與21或者SEQ ID NO :22與23。在前述方法的一些實施態樣中，該CD123-CAR包含SEQ ID NO: 49或SEQ ID NO: 50。在前述方法的一些實施態樣中，其中表現該CD123-CAR之該免疫細胞可能為一T細胞或一自然殺手(NK)細胞。
前述一般性說明及下列詳細說明為示例性及解釋性，其旨在提供如所請求之揭露內容的進一步解釋。習於此藝者由以下圖式簡單說明及本揭露內容之詳細說明將會輕易顯知其他標的、優勢及新穎特徵。
本揭露內容提供抗個體遺傳型抗體，其結合至抗CD123抗體或其片段或CD123-CAR的變異域。因此，現揭露之抗個體遺傳型抗體可用來偵測抗CD123抗體或片段及CD123-CAR T細胞、區別表現不同CAR之T細胞，及擴增及/或活化CD123-CAR T細胞。所揭露之抗個體遺傳型抗體的偵測及分析能力將對CAR T細胞製程還有CD123-CAR T細胞之臨床應用兩者提供益處。 I.定義
應理解的是方法並不受限於所描述之該等特定實施態樣，故而可能有所變化。亦應理解的是本文所用之術語係僅供描述特定實施態樣之目的，並不意欲作為限制。本技術之範疇將僅受限於隨附之申請專利範圍。
於本文使用時，某些術語可具有以下所界定的意義。於說明書及申請專利範圍中使用時，單數形式的「一(a/an)」及「該」包括單數與複數指示物，除非上下文顯然另有所指。舉例而言，術語「一細胞」包括單一細胞與多個細胞，包括其混合物。
於本文使用時，術語「包含」欲意謂組成物與方法包括所述之要素，但並不排除其他要素。當「基本上由…所構成」用來界定組成物及方法時，應意謂排除對該組成物或方法具任何實質意義的其他要素。「由...所構成」應意謂排除所請求之組成物及實質方法步驟中較微量元素多的其他成分。由此等過渡性術語各者所界定之實施態樣皆在本揭露內容之範疇內。因此，意欲的是方法及組成物可包括額外步驟及組分(包含)；或替代地，包括不具意義之步驟及組成物(基本上由…所構成)；或替代地，意指僅僅所述方法步驟或組成物(由...所構成)。
於本文使用時，「約」意謂加減10%以及本數。舉例而言，「約10」應理解為「10」及「9-11」。
於本文使用時，「可選的」或「可選地」意謂接續描述的事件或情況可能會或可能不會發生，以及該描述包括所述事件或情況會發生及不會發生的實例。
於本文使用時，術語「個體」、「患者」或「受試者」可為一個別生物體、一脊椎動物、一哺乳動物(例如牛、犬、貓或馬)或一人類。在一較佳實施態樣中，該個體、患者或受試者係一人類。
於本文使用時，術語「經分離的抗體」欲意指一抗體，其實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體(例如一經分離之抗個體遺傳型抗體，係實質上不含不會結合至在抗CD123抗體或CD123-CAR上之個體遺傳型的抗體)。不過，特異性結合至抗CD123抗體或CD123-CAR之個體遺傳型的一經分離的抗體，可能會對其他蛋白具有交叉反應性。然而，該抗體較佳係始終結合至抗CD123抗體或CD123-CAR之一個體遺傳型。此外，一經分離之抗體實質上典型地不含其他細胞材料及/或化學品。
於本文使用時，術語「人源化抗體」意指一抗體，其包含衍生自人類以外的哺乳動物之抗體的CDR，並包含人類抗體之框架(FR)區與恆定區。一人源化抗體作為根據本揭露內容之治療劑中之有效組分係有用的，因為人源化抗體在人體內的抗原性較低。
於本文使用時，術語「重組人類抗體」包括所有藉由重組方式製備、表現、創造或分離的人類抗體，其包括但不限於：(a)從一對人類免疫球蛋白基因具轉殖性或轉染色體性之動物(例如小鼠)或自其製備之一融合瘤所分離出的抗體；(b)從一經轉形來表現抗體之宿主細胞(例如從一轉染瘤)所分離出的抗體；(c)從一重組型組合人類抗體庫所分離出的抗體；以及(d)藉由涉及剪接人類免疫球蛋白基因序列至其他DNA序列之任何其他方式來製備、表現、創造或分離出的抗體。此等重組人類抗體具有衍生自人類生殖系及/或非生殖系免疫球蛋白序列的變異與恆定區。然而，在某些實施態樣中，此等重組人類抗體可經受活體外突變(或活體內體細胞突變，當使用針對人類Ig序列之動物基因轉殖時)，故而該重組抗體之VH與VL區的胺基酸序列可能為活體內人類抗體生殖系譜系中並不天然存在的序列，儘管其衍生自人類生殖系VH與VL序列。
於本文使用時，術語「醣基化模式」係界定為碳水化合物單元之模式，該單元共價式附接至一蛋白質，更具體而言是附接至一免疫球蛋白蛋白質。
於本文使用時，片語「治療有效量」與「治療位準」分別意謂提供特定藥理作用的藥物劑量或在一受試者內的血漿濃度，在需要此等治療之受試者中施予藥物以達到藥理作用，該治療即減輕、改善或消除癌症、惡性疾病或癌細胞增殖的症狀或作用。已強調一藥物的一治療有效量或治療位準將並不始終對治療所述之病況/疾病有效，即使此等劑量被習於此藝者視為一治療有效量。該治療有效量可能基於投藥途徑與劑量形式、受試者之年齡與體重及/或受試者病況而變化，該病況包括癌症、惡性疾病或癌細胞增殖的類型與階段，及其他因素。
術語「治療(treatment)」或「治療(treating)」於本文中針對癌症、惡性疾病或癌細胞增殖使用時，意指減輕、改善或消除癌症、惡性疾病或癌細胞增殖之一或更多症狀或作用。 II.抗個體遺傳型抗體
本文所提供的是結合至一CD123結合蛋白或胜肽之變異域的抗個體遺傳型抗體。所揭露的抗個體遺傳型抗體及其功能性片段將具有各種功能性性質，其用來偵測與評估CD123結合蛋白或胜肽，諸如一抗CD123抗體或CD123-CAR。
所揭露之抗個體遺傳型抗體可為多株的、單株的、嵌合的、人類的、部分或完全人源化的及/或重組的。
多株抗體可藉由本技藝已知之方法來獲得，諸如以包含所有抗CD123抗體或CD123-CAR的變異域之部分的一抗原來免疫一所擇之動物、從該動物收集血清，及從該血清分離及/或純化抗體。單株抗體(mAb)可藉由本技藝已知之方法來獲得，例如藉由融合產生抗體之細胞與永生細胞來獲得一融合瘤，及/或藉由使用組合抗體庫技術來從mRNA產生mAb，該mRNA係抽取自經免疫之動物的骨髓與脾臟細胞。重組抗體可藉由本技藝已知之方法來獲得，例如使用噬菌體或酵母展現技術及/或表達或共表達抗體多肽。用來製備抗體之其他技術在本技藝中係已知的，且可被用來獲得用於本文所述之方法中的抗體。所揭露的抗體可衍生自一合適的動物，包括但不限於大鼠、小鼠、豬、山羊、牛、馬或人類。
典型地，一抗體係由四個多肽所構成：一重(H)鏈多肽之兩個相同拷貝以及一輕(L)鏈多肽之兩個拷貝。典型地，每一重鏈含有一個N端變異(VH)區及三個C端恆定(CH1、CH2及CH3)區，以及每一輕鏈含有一個N端變異(VL)區及一個C端恆定(CL)區。每一對輕鏈與重鏈的變異區形成一抗體的抗原結合位。
術語「結合片段」或「功能性片段」於本文使用時意指一抗個體遺傳型抗體的一或更多片段，其保留與一抗CD123抗體或CD123-CAR的變異域結合的能力。結合片段的實施例包括(i)Fab片段(由VL、VH、CL及CH1域所構成的單價片段)；(ii)F(ab')2片段(二價片段，其包含被鉸鏈區之一雙硫鍵連接的兩個Fab片段)；(iii)Fd片段(包含該VH及CH1域)；(iv)Fv片段(包含一抗體之單一臂的VH與VL域)，(v)dAb片段(包含VH域)；以及(vi)經分離的互補決定區(CDR)，例如VH CDR3。其他實施例包括單鏈Fv(scFv)構造。參見例如Bird等人, Science, 242:423-26(1988)；Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-83(1988)。
在一些實施態樣中，抗個體遺傳型抗體或其片段可包含下表1與2中所揭露的示例性CDR序列。 表1
抗體 HCDR1 HCDR2 HCDR3
1 GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1) IDPEDDET (SEQ ID NO: 2) ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)
2 GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1) IDPEDDET (SEQ ID NO: 2) ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)
表2
抗體 LCDR1 LCDR2 LCDR3
1 EDIYSN (SEQ ID NO: 4) DAS (SEQ ID NO: 5) QQHHDYPLT (SEQ ID NO: 6)
2 EDIYNG (SEQ ID NO: 7) NAN (SEQ ID NO: 8) QQYYNYPYT (SEQ ID NO: 9)
應理解的是，在表1與2中所揭露之CDR序列的取代或其他變化是可容許的，只要其仍讓該抗個體遺傳型抗體與例如抗CD123抗體或其片段之變異域結合。因此，在CDR序列中的一些胺基酸是可變異的而可被改變。
舉例而言，在一些實施態樣中，所揭露之抗個體遺傳型抗體的CDRL1可包含EDIYX1 X2 (SEQ ID NO: 10)；其中X1 係一極性胺基酸；及其中X2 係選自於由絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺酸(N)、麩醯胺酸(Q)、半胱胺酸(C)、甘胺酸(G)及脯胺酸(P)所構成的群組。在一些實施態樣中，X1 為絲胺酸(S)或天冬醯胺酸(N)。在一些實施態樣中，X2 為天冬醯胺酸(N)或甘胺酸(G)。
在一些實施態樣中，所揭露之抗個體遺傳型抗體之CDRL2可包含X3 AX4 (SEQ ID NO: 11)；其中X3 係選自於由以下所構成的群組：天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺酸(N)及麩醯胺酸(Q)；及其中X4 係一極性胺基酸。在一些實施態樣中，X3 為天冬胺酸(D)或天冬醯胺酸(N)。在一些實施態樣中，X4 為絲胺酸(S)或天冬醯胺酸(N)。
在一些實施態樣中，所揭露之抗個體遺傳型抗體的CDRL3可包含QQX5 X6 X7 YPX8 T (SEQ ID NO: 12)，其中X5 及X6 係獨立地選自於由以下所構成的群組：精胺酸(R)、組胺酸(H)、離胺酸(K)、丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)；X7 係選自於由以下所構成的群組：天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺酸(N)及麩醯胺酸(Q)；及X8 選自於由以下所構成的群組：丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)。在一些實施態樣中，X5 係組胺酸(H)或酪胺酸(Y)。在一些實施態樣中，X6 係組胺酸(H)或酪胺酸(Y)。在一些實施態樣中，X7 為天冬胺酸(D)或天冬醯胺酸(N)。在一些實施態樣中，X8 為白胺酸(L)或酪胺酸(Y)。
在一些實施態樣中，所揭露之抗個體遺傳型抗體中X1 係絲胺酸(S)或天冬醯胺酸(N)；X2 為天冬醯胺酸(N)或甘胺酸(G)；X3 為天冬胺酸(D)或天冬醯胺酸(N)；其中X4 為絲胺酸(S)或天冬醯胺酸(N)；X5 及X6 為組胺酸(H)或酪胺酸(Y)；X7 為天冬胺酸(D)或天冬醯胺酸(N)；及X8 為白胺酸(L)或酪胺酸(Y)。
所揭露之抗個體遺傳型抗體的一些實施態樣可包含：含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的一CDRH1、含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的一CDRH2及含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的一CDRH3，以及含EDIYSN (SEQ ID NO: 4)的一CDRL1、含DAS (SEQ ID NO: 5)的一CDRL2及含QQHHDYPLT (SEQ ID NO: 6)的一CDRL3；或者含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的一CDRH1、含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的一CDRH2及含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的一CDRH3，以及含EDIYNG (SEQ ID NO: 7)的一CDRL1、含NAN (SEQ ID NO: 8)的一CDRL2及含QQYYNYPYT (SEQ ID NO: 9)的一CDRL3。
所揭露之抗個體遺傳型抗體或結合片段亦可包含一變異的重鏈域(VH )與一變異的輕鏈域(VL )。舉例而言，該抗個體遺傳型抗體或其片段之該VH 區可包含： EVQLQQSGAELVRPGASVRLSCTTSGFNIKDSFIHWVKQRTEQGLEWIGRIDPEDDETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASPIYGSREAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 13)；及該抗個體遺傳型抗體或其片段之該VL區可包含：DIQMTQSPASLSASLGETVTIECLASEDIYSNLAWYQQKPGKSPQLLIYDASSLQDGVPSRFSGSESGTQYSLEINSLQSEDAATYFCQQHHDYPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 14)；或 DIQMTQSPASLSASLGETVTIECRASEDIYNGLAWYQQKPGKSPQLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVASYFCQQYYNYPYTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 15)。此外，在一些實施態樣中，所揭露之抗體與片段可包含對其框架區作各種修改(即取代、添加或刪除)。確實，所揭露之CDR與變異區可易適用於各種Fc形式，包括例如人類、小鼠或大鼠的IgG諸如IgGa2。在一些實施態樣中，抗個體遺傳型抗體可為生物素化的或非生物素化的。
所揭露之抗體或抗原結合片段可藉由下表3中的一或更多核酸序列來編碼。可將編碼本案所揭露抗體與片段的核酸序列併入例如表現載體中，以允許所揭露之抗體或片段的重組表現。 表3
SEQ ID NO 說明 序列
16 VH 編碼序列1 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAGGTTGTCCTGCACAACTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTCCTTTATTCACTGGGTGAAGCAGAGGACTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATGAAACTAAATATGCCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGCCCCATCTACGGTAGTAGAGAGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
17 VL 編碼序列1 GACATCCAGATGACACAGTCTCCAGCTTCCCTGTCTGCATCTCTGGGAGAAACTGTCACCATCGAATGTCTAGCAAGTGAAGACATTTACAGTAATTTAGCGTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATGATGCAAGTAGCTTGCAAGATGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCAGTGAATCTGGCACACAGTATTCTCTCGAGATCAACAGCCTGCAATCTGAAGATGCCGCGACTTATTTCTGTCAACAGCATCATGATTATCCTCTCACGTTCGGTTCTGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
18 VH 編碼序列2 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAGGTTGTCCTGCACAACTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTCCTTTATTCACTGGGTGAAGCAGAGGACTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATGAAACTAAATATGCCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGCCCCATCTACGGTAGTAGAGAGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
19 VL 編碼序列2 GACATCCAGATGACACAGTCTCCAGCTTCCCTGTCTGCATCTCTGGGAGAAACTGTCACCATCGAATGTCGAGCAAGTGAGGACATTTACAATGGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATAATGCAAATAGCTTGCATACTGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACACAGTATTCTCTCAAGATAAACAGCCTGCAGTCTGAAGATGTCGCAAGTTATTTCTGTCAACAGTATTACAATTATCCGTACACGTTTGGAGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA
所揭露之抗體或抗原結合片段係特異性結合至在一抗CD123抗體或抗CD123抗原結合片段上之個體遺傳型。舉例而言，所揭露之抗體或抗原結合片段可特異性結合至一抗CD123抗體或抗CD123抗原結合片段(例如scFv)，其包含DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKDLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNKYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 20)的VL 域及/或QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPDQGLEWIGRIDPYDSETHYNQKFKDKAILTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGNWDDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 21)的VH 域。 替代地，所揭露之抗體或抗原結合片段可特異性結合至一抗CD123抗體或抗CD123抗原結合片段(例如scFv)，其包含DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGNTFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPPTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 22)的VL 域及/或QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYIFTNYGMNWVKQAPGKSFKWMGWINTYTGESTYSADFKGRFAFSLETSASTAYLHINDLKNEDTATYFCARSGGYDPMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 23)的VH 域。該抗CD123抗原結合片段可為一經分離的片段，或者其可被併入一較大構造，諸如一嵌合抗原受體(CAR)。
一般而言，可藉由所揭露之抗個體遺傳型抗體與片段來束縛之一CD123-CAR可包含(a)一鉸鏈及/或連接子，諸如一IgG鉸鏈或一經修飾之IgG鉸鏈、(b)一跨膜域、(c)一或更多共刺激訊號傳導域，及(d)一T細胞受體ζ鏈訊號傳導域(例如CD3ζ域)。
習於此藝者將理解的是，該共刺激訊號傳導域可選自於由例如以下所構成之群組：一CD27共刺激訊號傳導域、一CD28共刺激訊號傳導域(或一經修飾之CD28域)、一4-1BB共刺激訊號傳導域及一OX40共刺激訊號傳導域，或其組合。一些CAR可包含一個共刺激域，而其他者可含有兩個或三個。示例性共刺激域係提供於下表中。 表4-示例性共刺激域
SEQ ID NO: 說明 序列
24 CD28 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHQYPYAPPRDFAAYRS
25 CD28gg RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
26 4-1BB KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
27 OX40 ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
習於此藝者將理解的是，跨膜域可選自例如CD28、CD4、CD8、4-1BB、CD27、ICOS、OX40、HVEM或CD30之一跨膜部分。示例性跨膜域係提供於下表中。 表5-示例性跨膜域
SEQ ID NO: 說明 序列
28 CD3z LCYLLDGILFIYGVILTALFL
29 CD28 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
30 CD28(M) MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
31 CD4 MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF
32 CD8(i) IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
33 CD8(ii) IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY
34 CD8(iii) IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
35 4-1BB IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRF
習於此藝者將理解的是，該鉸鏈或連接子可選自例如一IgG4鉸鏈或其衍生物、一IgG2鉸鏈或其衍生物、一CD28鉸鏈，或一CD8鉸鏈，或者另一合適的多肽連接子，諸如一G或S重複序列。示例性鉸鏈/連接子域係提供於下表中。 表6-示例性連接子及鉸鏈
SEQ ID NO: 說明 序列
36 A3 AAA
37 連接子 GGGSSGGGSG
38 IgG4鉸鏈(S228P) ESKYGPPCPPCP
39 IgG4鉸鏈 ESKYGPPCPSCP
40 IgG4鉸鏈+連接子 ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSG
41 CD28鉸鏈 IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
42 CD8鉸鏈(48 AA) AKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
43 CD8鉸鏈(45 AA) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
44 IgG4(HL-CH3) ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
45 IgG4(L235 E、N297 Q) ESKYGPPCPSCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
46 IgG4(S228P、L235E、N297Q) ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
47 IgG4(CH3) GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
在一些實施態樣中，該CD123-CAR可包含一CD3ζ訊號傳導域(RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR; SEQ ID NO: 48)。
如請求項21之抗體或抗原結合片段，其中該CD123 CAR包含一胺基酸序列： QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPDQGLEWIGRIDPYDSETHYNQKFKDKAILTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGNWDDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKDLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNKYPYTFGGGTKLEIKESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 49)；或 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYIFTNYGMNWVKQAPGKSFKWMGWINTYTGESTYSADFKGRFAFSLETSASTAYLHINDLKNEDTATYFCARSGGYDPMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGNTFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPPTFGAGTKLELKESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 50)。
一CD123-CAR可能可選地包含額外的組分，諸如一前導序列或一代用標籤。一示例性前導序列係MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID NO: 51)。代用標籤包括但並不限於截斷蛋白，諸如CD19、上皮生長因子受體(EGFR)、CD34及NGFR，其可用來鑑別已被一表現CAR(例如CD123-CAR)之核酸轉型的細胞。示例性代用標籤序列包括截斷的EGFR(「EGFRt」)： MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMGMCSFRA SIGNAL PEPTIDE (SEQ ID NO: 52)，及截斷的CD19 (「CD19t」)： MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCVPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKR (SEQ ID NO: 53)。代用標籤係普遍地經由一T2A連接子連接至CAR，該連接子係：LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR (SEQ ID NO: 54)。
代用標籤係普遍用於品質管制之目的，但其呈現若干缺陷。舉例而言，代用標籤能鑑別出表現CAR及該代用標籤之細胞，但其無法區分CAR之間的差異。因此，在有多種表現CAR之細胞生成並必須區分的設備功能上可能出現問題。所揭露之抗個體遺傳型抗體及片段係CAR特異性而非細胞特異性，並能讓一技術人員用以區別多種CAR，即便該等CAR係於攜帶相同代用標籤之細胞中表現，。
於此技藝具通常知識者將理解的是，可在不損害所揭露之抗個體遺傳型抗體與功能性片段之結合親和力或功能的情況下，對所揭露之序列作出某些改變。因此，在一些實施態樣中，抗個體遺傳型抗體或片段將具有與所揭露之序列(例如SEQ ID NO: 1-9及13-15)約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的序列同一性。
在一些實施態樣中，本揭露內容提供編碼抗個體遺傳型個體或其片段之經分離的核酸序列，例如SEQ ID NO: 1-9及13-15。
所揭露之抗個體遺傳型抗體及其片段可經調配至一適於投予目標受試者的醫藥組成物中；可經固定於一固態撐體上以用於各種診斷、品質保證或臨床應用；或者可經調配以用於活體外偵測轉導細胞或作為轉導細胞之活化劑使用。 III.使用所揭露之抗個體遺傳型抗體或片段的方法
所揭露之抗個體遺傳型抗體及片段可用於多種製造、品質管制、診斷及臨床應用。
在一態樣中，所揭露之抗個體遺傳型抗體及片段可用來偵測一樣本中CD123-CAR或抗CD123抗體的存在，其係藉由將該樣本與一抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段接觸以及定量經結合之抗個體遺傳型抗體的量來進行，該抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段係特異性結合至CD123-CAR或抗CD123抗體之個體遺傳型。此一方法允許定量出表現一CD123-CAR或一抗CD123抗體之細胞的數目。出於偵測及定量方法之目的，所揭露的抗個體遺傳型抗體可以使用於一ELISA形式或一流動式細胞測量術檢定中，以偵測及/或定量CD123-CAR或抗CD123抗體。在所揭露之偵測及定量方法的一些實施態樣中，所揭露之抗個體遺傳型抗體可用於免疫組織化學。
該樣本可為一細胞培養基(例如在表現CD123-CAR之細胞的製造或擴增期間進行定量的狀況)，或者該樣本可為來自一受試者的一血液樣本，該受試者已用表現CD123-CAR之免疫細胞進行了治療(例如用以測定患者的循環中細胞的持續性或者測定是否該患者已接受一足夠的劑量)。
出於臨床應用之目的，該應用中所揭露之抗個體遺傳型抗體或片段係用於來測定患者血液樣本中CD123-CAR細胞之持續性或相對劑量，該方法可進一步包含：若判定該表現CD123-CAR之免疫細胞的量係低於一預設臨界值，則建議投予更多表現CD123-CAR之免疫細胞。對比而言，此一方法可進一步包含：若判定該表現CD123-CAR之免疫細胞的量係高於一預設臨界值，則建議避免投予更多表現CD123-CAR之免疫細胞。替代地，該方法可進一步包含：自該受試者之血液移除表現CD123-CAR之免疫細胞，其係藉由將該血液與一固態撐體接觸來進行，該固態撐體包含抗個體遺傳型抗體或其片段，其包含例如含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的一CDRH1、含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的一CDRH2及含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的一CDRH3，以及含EDIYSN (SEQ ID NO: 4)的一CDRL1、含DAS (SEQ ID NO: 5)的一CDRL2及含QQHHDYPLT (SEQ ID NO: 6)的一CDRL3；或者含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的一CDRH1、含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的一CDRH2及含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的一CDRH3，以及含EDIYNG (SEQ ID NO: 7)的一CDRL1、含NAN (SEQ ID NO: 8)的一CDRL2及含QQYYNYPYT (SEQ ID NO: 9)的一CDRL3；藉此自該受試者之血液螯合表現CD123-CAR之免疫細胞，隨後將已移除該等表現CD123-CAR之免疫細胞的血液送回至該受試者。CD123係用來治療急性骨髓性白血病(AML)之標靶，因此在此等臨床應用之一些實施態樣中，患者可能患有或疑似患有AML。但CD123亦可能為其他血液癌症或病狀之有效標靶， 諸如母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(BPDCN)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)，或毛細胞白血病。
此外，所揭露之抗個體遺傳型抗體及片段可用來從一樣本中分離出表現CD123-CAR之免疫細胞，其係藉由將包含疑似表現CD123-CAR之免疫細胞的一樣本與包含抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段的一固態撐體接觸，藉此從該樣本中分離出表現CD123-CAR之免疫細胞。在一些實施態樣中，該樣本可為一細胞培養基，而在一些實施態樣中，該樣本可為來自於已使用該表現CD123之免疫細胞來治療的受試者之血液樣本。在一些實施態樣中，該固態撐體可包含一管柱或珠粒，該抗個體遺傳型抗體或片段係連接至該管柱或珠粒。
在製造表現CAR之細胞(諸如T細胞或自然殺手(NK)細胞)期間，生產步驟之一者係活化由該細胞所表現的CAR，以擴增經轉導之細胞的群體。活化與擴增過程可包含將表現CAR之細胞與用於CAR之配體接觸。所揭露的抗個體遺傳型抗體或片段係結合至CD123-CAR的變異域，因此可刺激受體，進而活化T細胞並擴增表現CD123-CAR的群體。因此，本揭露內容提供活化及/或擴增表現CD123-CAR之細胞(例如T細胞或NK細胞)群體的方法，其包含於活體外將表現CD123-CAR之細胞的群體與所揭露之抗體或其片段接觸。
在前述方法之一些實施態樣中，該抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段包含：含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的一CDRH1、含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的一CDRH2及含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的一CDRH3，以及含EDIYSN (SEQ ID NO: 4)的一CDRL1、含DAS (SEQ ID NO: 5)的一CDRL2及含QQHHDYPLT (SEQ ID NO: 6)的一CDRL3；或者含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的一CDRH1、含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的一CDRH2及含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的一CDRH3，以及含EDIYNG (SEQ ID NO: 7)的一CDRL1、含NAN (SEQ ID NO: 8)的一CDRL2及含QQYYNYPYT (SEQ ID NO: 9)的一CDRL3。
在前述方法之一些實施態樣中，該抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段包含：含EVQLQQSGAELVRPGASVRLSCTTSG FNIKDSFIHWVKQRTEQGLEWIGRIDPEDDETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASPIYGSREAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 13)的一VH 區及含DIQMTQSPASLSASLGETVTIECLASEDIYSNLAWYQQKPGKSPQLLIYDASSLQDGVPSRFSGSESGTQYSLEINSLQSEDAATYFCQQHHDYPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 14)的一VL ；或者含 EVQLQQSGAELVRPGASVRLSCTTSGFNIKDSFIHWVKQR TEQGLEWIGRIDPEDDETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASPIYGSREAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 13)的一VH 區及含DIQMTQSPASLSASLGETVTIECRASEDIYNGLAWYQQKPGKSPQLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVASYFCQQYYNYPYTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 15)的一VL 。
在前述方法的一些實施態樣中，該CD123-CAR的鉸鏈係一IgG鉸鏈或一經修飾的IgG鉸鏈。在前述方法的一些實施態樣中，該CD123-CAR的共刺激訊號傳導域係選自於由以下所構成之群組：一CD27共刺激訊號傳導域、一CD28共刺激訊號傳導域、一4-1BB共刺激訊號傳導域，及一OX40共刺激訊號傳導域。在前述方法的一些實施態樣中，該跨膜域包含CD28、CD4、CD8、4-1BB、CD27、ICOS、OX40、HVEM或CD30之一跨膜部分。在前述方法的一些實施態樣中，該CD123-CAR的scFv包含SEQ ID NO: 20與21或者SEQ ID NO :22與23。在前述方法的一些實施態樣中，該CD123-CAR包含SEQ ID NO: 49或SEQ ID NO: 50。在前述方法的一些實施態樣中，表現CD123-CAR的免疫細胞可為T細胞或自然殺手(NK)細胞。
提供以下實施例以例示本發明。然而，應理解的是本發明並不限於此等實施例中所描述之特定條件或細節。 實施例
實施例1-用來分化活體外之CD123-CAR T細胞的方法
簡介
此步驟準則旨在驗證用於表現CD123-CAR細胞產物之釋出的識別方法，其係使用一抗個體遺傳型抗體及流動式細胞測量術來進行。此檢定使用一抗個體遺傳型抗體，其特異性針對在CD123 CAR上之個體遺傳型。
目標
此驗證評估了基於流動式細胞測量術的識別檢定，其與表現CD123-CAR之細胞一起使用。
此步驟準則評估以下標準：系統適用性、特異性、偵測極限、再現性及中間精密度。
測試材料包括三批次的表現CD123-CAR之細胞、一批次的表現CS1-CAR之細胞、未經轉導的初級T細胞，以及CD-CHEX-PLUS(由正常人類周邊血液白血球及紅血球製出的穩定血液)。
材料及設備
所有設備均將在使用之前經驗證或校準。
項目/ 部件編號 供應商 型號
2-8℃冷凍器 Thermo Fisher TSX2320FA
MACSQuant分析儀10 Miltenyi MACSQuant分析儀10
離心機 Thermo Scientific 7450
試劑
試劑 供應商 產品目錄號
抗個體遺傳型殖株1-E06 Lake Pharma 批號TP26921F(1.05mg/mL)
CD3-PE BD Biosciences 347347
鏈黴親和素APC BD Biosciences 554067
抗EGFR生物素 R&D系統 FAB9577B
抗大鼠Alexa Fluor 647 Invitrogen A10540
DAPI Invitrogen D21490
CTS™ OpTmizer™ T Cell Expansion SFM Gibco A1048501
CD-CHEX PLUS Streck 213325
流動式細胞測量術染色緩衝液(1X) R&D系統 FC001
人類TruStain FcX (Fc受體阻斷液) Biolegend 422302
MACS漂白溶液 Miltenyi Biotec 130-093-663
MACSQuant校準珠粒 Miltenyi Biotec 130-093-607
MACSQuant電泳緩衝液 Miltenyi Biotec 130-092-747
MACSQuant儲存溶液 Miltenyi Biotec 130-092-748
MACSQuant洗滌溶液 Miltenyi Biotec 130-092-749
圓底聚苯乙烯管12X75mm Falcon 352052
96孔盤 Fisher 168136
程序
製備T細胞及細胞產物
自-150℃冷凍器獲得每一細胞類型之所需數目的小瓶。將小瓶在37℃水浴中解凍直至僅殘留細薄的冰，並且在解凍時不搖晃或攪拌小瓶。
使用1000µL吸量管，將解凍的細胞移入各別的15mL離心管。將10mL的CTS OpTmizer基質添加至每一15mL管。離心管係以200×G離心6分鐘並且丟棄上清液。
將細胞沉澱物再懸浮於5 mL的CTS OpTmizer基質中，且置於各別T25燒瓶中並在37℃培育箱中培育至少1小時。在此培育之後，將細胞懸浮液轉移至各別15mL離心管中且以800×G離心3分鐘。丟棄上清液並且將細胞沉澱物再懸浮於流動式細胞測量術染色緩衝液中以獲得每100µL5e⁵個細胞的密度；
CD CHEX PLUS之製備
CD CHEX PLUS之小瓶自冷凍器中移出且在使用前15分鐘升溫至室溫(18-30℃)。接著將小瓶水平保持在手掌之間並來回滾動小瓶20到30秒。溫和的翻轉(至少8-10次)來混合產物，直至所有細胞徹底懸浮。若小瓶在實驗台上放置30min，則在取樣前立即溫和翻轉小瓶5次。
將每孔200µL之CD Chex Plus試劑等分至15mL管中，並將原始小瓶放回冰箱以確保最大的開瓶穩定性。添加3mL之ACK溶解液且藉由吸量管上下混合三次。接著在室溫下將小瓶培育10±1分鐘。
使細胞在室溫下以800xG離心3分鐘，移除上清液，以及接著將細胞再懸浮於200µL的染色緩衝液中。
抗體雞尾酒製備
顯示1孔之雞尾酒計算。
抗個體遺傳型一級抗體雞尾酒(所有檢定均利用包含SEQ ID NO:13之VH 及SEQ ID NO:15之VL 的抗體)。
抗( 標靶蛋白) 之抗體 共軛物 目標物種 宿主物種 每反應µL
CD3 PE 人類 小鼠 5
抗個體遺傳型 無 人類 大鼠 1.4
染色緩衝液 13.6
  總計 25
抗EGFR一級抗體雞尾酒
抗( 標靶蛋白) 之抗體 共軛物 目標物種 宿主物種 每反應µL
CD3 PE 人類 小鼠 5
抗EGFR 生物素 人類 小鼠 10
染色緩衝液 35
  總計 50
抗大鼠Alexa Fluor 647二級雞尾酒
抗( 標靶蛋白) 之抗體 共軛物 目標物種 宿主物種 每反應µL
大鼠IgG Alexa Fluor 647 人類 大鼠 1
染色緩衝液 99
  總計 100
鏈黴親和素APC二級雞尾酒
試劑 共軛物 結合目標 每反應µL
鏈黴親和素 APC 生物素 2
染色緩衝液 98
  總計 100
系統適用性
為測試系統適用性，測定CD Chex Plus樣本中淋巴球外之CD3+細胞的%，並且將其與由製造商所提供之預期範圍相比較。
具體而言，將100µL的CD CHEX PLUS添加至96孔盤之孔中。將盤以800xG離心3分鐘，以及丟棄上清液。將細胞沉澱物再懸浮於25µL之相對應的一級抗體雞尾酒中，並在室溫下黑暗中培育25±5分鐘。
隨後，將150µL的染色緩衝液添加至每一孔，且將盤再次以800×G離心3分鐘並丟棄上清液。將所得細胞沉澱物再懸浮於100µL之二級抗體雞尾酒中且在室溫下培育20±5分鐘。
隨後，將100µL的染色緩衝液添加至每一孔，且將盤再次以800×G離心3分鐘並丟棄上清液。將所得細胞沉澱物再懸浮於150 µL的染色緩衝液中，接著再次以800xG離心3分鐘(丟棄上清液)，以及再懸浮於125 µL之染色緩衝液中。不添加DAPU以供適用性測試。
接著使用MACSQuant10分析細胞。根據圖1中的圈選策略對細胞執行圈選。記述%CD3+/淋巴球，並與所用之特定批次的製造商建議範圍相比較。
特異性分析
藉由抗個體遺傳型試劑評估可明確無誤地偵測CD123 CAR產物而非CS1-CAR產物的能力。具體而言，將該抗個體遺傳型試劑施加至CAR產物與未經轉導之T細胞兩者，以評估特異性。評估CAR細胞群體與未經轉導之T細胞中經染色之細胞的百分比。替代地，所有三個細胞產物都能以一抗EGFR抗體染色以偵測存在於二者CAR產物上的EGFR標籤。
添加每一類型3x105 個細胞至96孔盤之相應孔中，並且將該盤以800×G離心3分鐘。接著丟棄上清液，並且將細胞沉澱物再懸浮於25µL的一級抗體雞尾酒中。經再懸浮之細胞在室溫下於暗處培育25±5min，且接著將150µL的染色緩衝液添加至每一孔中。將盤以800xG離心3分鐘，丟棄上清液，且將細胞沉澱物再懸浮於100µL之二級抗體雞尾酒中並在室溫下培育20±5min。添加100µL的染色緩衝液至每一孔。將盤再次以800xG離心3分鐘，將上清液丟棄，將細胞沉澱物再懸浮於150µL的染色緩衝液中，將盤以800xG離心3分鐘，丟棄上清液，將細胞置於125µL的染色緩衝液中且接著使用MACSQuant 10取得。在使用自動試劑添加功能之前即添加DAPI。
評估與報導
使用圖2中所界定的圈選策略對各孔之細胞執行圈選。使用抗個體遺傳型染色及抗EGFR染色兩者來獲得表現CD123 CAR或CS1 CAR之CAR+細胞及未經轉導之T細胞的百分比。
如圖3所示，所揭露之抗個體遺傳型抗體能夠特異性偵測CD123-CAR T細胞，但非CS1-CAR T細胞。
偵測極限(LoD)
LoD係分析物(例如CD123-CAR T細胞)可在一給定樣本中可靠地被鑑別並可與負性對照組(未經轉導之T細胞)區分的最低濃度。為了測定LoD，以1:2的方式將CD123-CAR T細胞連續稀釋至未經轉導的一級T細胞內。接著使用抗個體遺傳型雞尾酒檢定每一稀釋液。使用未經轉導之T細胞作為稀釋劑，執行CAR T細胞的1:2連續稀釋直至達1:128稀釋為止。
將每一稀釋的3x105 個細胞分別置於96孔盤的相應孔中，並如上所述執行染色。使用圖2中所界定的圈選策略對各孔之細胞執行圈選以獲得CAR+細胞之%。「空白極限(LoB)」係如以下所界定： LoB=平均值+2*在未經轉導之T細胞(E9、F9、G9孔)中CAR+細胞之%的標準偏差。
然後判定具有最低%CAR+細胞的孔，其可藉由測試是否複製孔之平均值＞LoB來檢定，而LoD係如以下所界定： LoB+2*具有最低%CAR之孔(自8.5.3.3)的偏準偏差
該抗體展現高靈敏度的反應。圖4顯示稀釋評估的結果，其在未經轉導的T細胞中的CAR+T細胞係跨越從33.5%到0.1%之範圍，且該結果顯示出很強的線性度。在經測試之檢定範圍下，該檢定呈現線性並具有0.9971之R2 值。偵測靈敏度係1%CAR+細胞。
再現性（檢定內的精密度）
由同一分析人員使用完全相同的試劑重複進行，評估檢定的精密度。為了測定再現性，該檢定係由同一分析人員重複進行三次，並計算三重複孔之%CV。使用三個生物樣本來評估再現性。
三個CD123-CAR T細胞樣本每一者的三個複製物係添加至96孔盤的相對應孔，並如上述執行染色。針對每一樣本計算%CAR的%CV。
中間精密度(檢定間的精密度)
評估當由不同分析人員重複進行時的檢定變異。一第二分析人員係依系統適用性與再現性章節所概述般重複進行該檢定。如前述般執行細胞染色及圈選。
實施例2-跨多批次之評估
製造五批帶有CD19t代用標籤之CD123-CAR T細胞、與四批帶有CD19t代用標籤之CS1-CAR T細胞，並使用所揭露之抗個體遺傳型抗體來評估，該抗個體遺傳型抗體包含SEQ ID NO: 13之一變異的重鏈域(VH )及SEQ ID NO: 15之一變異的輕鏈域(VL )。
如下表所示，該抗體能夠在與代用標籤染色等效的位準下偵測到CD123-CAR T細胞，但並未偵測到任何CS1-CAR T細胞批。
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實施例3-血液樣本中之評估
使用所揭露之抗個體遺傳型抗體評估及偵測CD123的能力，不僅從製造的角度來看是重要，從臨床的角度來看亦然。舉例而言，所揭露之抗體可用於周期性評估在臨床試驗中或在治療方案期間的CAR T細胞持續性。因此，所揭露之抗體在血液中作用的能力在臨床上及商業上係有價值的。
為評估所揭露之抗體在臨床應用上的靈敏度，將CD123-CAR T細胞摻入至全血衍生的PBMC中，以產生CAR+比例在30%至0.1%之範圍變化的樣本。如圖5所顯示，所揭露之抗體(包含SEQ ID NO: 13之VH 及SEQ ID NO: 15之VL )在測試範圍下呈現線性，並具有0.9925之R2 值，此即表明該抗體即使在血液樣本中仍維持強靈敏度，且意味著該抗體穩定耐用足以供臨床應用。 * * * * *
本說明書中所提及之所有專利案及公開案係表明本發明所屬領域具通常知識者之水準。所有專利案及公開案均以引用方式併入本文，如同每一個別公開案係特定且個別地表明以引用方式併入本文。
此外，習於此藝者係容易瞭解到，本揭露內容非常適合實現所述目標及獲得所述目的和優勢以及隱含於其中者。習於此藝者將會思及其修改及其他用途。該等修改涵蓋在本揭露內容之概念要旨內，並且由申請專利範圍之範疇所界定，其闡明本揭露內容之非限制性實施態樣。
無
圖1顯示使用流動式細胞測量術來進行用於系統適用性測試的圈選策略。
圖2顯示使用抗個體遺傳型染色法以界定CAR+細胞的圈選策略。
圖3顯示所揭露之抗個體遺傳型抗體係特異性地偵測CD123-CAR T細胞而非CS1-CAR T細胞。
圖4顯示該抗個體遺傳型抗體可用來靈敏地評估CD123-CAR或含相同變異序列之其他抗CD123結合蛋白的存在。針對CAR+細胞，偵測的靈敏度係1%。
圖5顯示在血液樣本中係維持了該抗個體遺傳型抗體之靈敏度。
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Claims (54)

  1. 一種抗體或抗原結合片段，其包含一重鏈變異(VH )區及一輕鏈變異(VL )區，該VH 及VL 區包含：一包含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的重鏈互補決定區1(CDRH1)、一包含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的CDRH2及一包含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的CDRH3，以及一包含EDIYX1 X2 (SEQ ID NO: 10)的輕鏈互補決定區1(CDRL1)、一包含X3 AX4 (SEQ ID NO: 11)的CDRL2及一包含QQX5 X6 X7 YPX8 T (SEQ ID NO: 12)的CDRL3，其中X1 為一極性胺基酸；X2 係選自於由以下所構成之群組：絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺酸(N)、麩醯胺酸(Q)、半胱胺酸(C)、甘胺酸(G)及脯胺酸(P)；X3 係選自於由以下所構成之群組：天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺酸(N)及麩醯胺酸(Q)；X4 係一極性胺基酸；X5 及X6 係選自於由以下所構成的群組：精胺酸(R)、組胺酸(H)、離胺酸(K)、丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)；X7 係選自於由以下所構成的群組：天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺酸(N)及麩醯胺酸(Q)；及X8 係選自由以下所構成之群組：丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)。
  2. 如請求項1之抗體或抗原結合片段，其中X1 為絲胺酸(S)或天冬醯胺酸(N)。
  3. 如請求項1或請求項2之抗體或抗原結合片段，其中X2 為天冬醯胺酸(N)或甘胺酸(G)。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體或抗原結合片段，其中X3 為天冬胺酸(D)或天冬醯胺酸(N)。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體或抗原結合片段，其中X4 為絲胺酸(S)或天冬醯胺酸(N)。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體或抗原結合片段，其中X5 及X6 為組胺酸(H)或酪胺酸(Y)。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗體或抗原結合片段，其中X7 為天冬胺酸(D)或天冬醯胺酸(N)。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體或抗原結合片段，其中X8 為白胺酸(L)或酪胺酸(Y)。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體或抗原結合片段，其中X1 為絲胺酸(S)或天冬醯胺酸(N)；X2 為天冬醯胺酸(N)或甘胺酸(G)；X3 為天冬胺酸(D)或天冬醯胺酸(N)；其中X4 為絲胺酸(S)或天冬醯胺酸(N)；X5 及X6 為組胺酸(H)或酪胺酸(Y)；X7 為天冬胺酸(D)或天冬醯胺酸(N)；及X8 為白胺酸(L)或酪胺酸(Y)。
  10. 如請求項1至9中任一項之抗體或抗原結合片段，其包含： a)   一包含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的CDRH1、一包含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的CDRH2及一包含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的CDRH3，以及一包含EDIYSN (SEQ ID NO: 4)的CDRL1、一包含DAS (SEQ ID NO: 5)的CDRL2及一包含QQHHDYPLT (SEQ ID NO: 6)的CDRL3；或 b)   一包含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的CDRH1、一包含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的CDRH2及一包含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的CDRH3，以及一包含EDIYNG (SEQ ID NO: 7)的CDRL1、一包含NAN (SEQ ID NO: 8)的CDRL2及一包含QQYYNYPYT (SEQ ID NO: 9)的CDRL3。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗體或抗原結合片段，其中： a)   該VH 區包含EVQLQQSGAELVRPGASVRLSCTTSGFNIKDSFIHW VKQRTEQGLEWIGRIDPEDDETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASPIYGSREAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 13)及該VL 包含DIQMTQSPASLSASLGETVTIECLASEDIYSNLAWYQQKPGKSPQLLIYDASSLQDGVPSRFSGSESGTQYSLEINSLQSEDAATYFCQQHHDYPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 14)；或 b)該VH 區包含EVQLQQSGAELVRPGASVRLSCTTSGFNIKDSFIHWV KQRTEQGLEWIGRIDPEDDETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASPIYGSREAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 13)及該VL 包含DIQMTQSPASLSASLGETVTIECRASEDIYNGLAWYQQKPGKSPQLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVASYFCQQYYNYPYTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 15)。
  12. 如請求項1至11中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係特異性結合至在一抗CD123抗體或一抗CD123抗原結合片段上的一個體基因型。
  13. 如請求項12之抗體或抗原結合片段，其中該抗CD123抗體或抗CD123抗原結合片段包含VL 域為DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKDLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNKYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 20)及/或VH 域為QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPDQGLEWIGRIDPYDSETHYNQKFKDKAILTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGNWDDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 21)。
  14. 如請求項12或請求項13之抗體或抗原結合片段，其中該抗CD123抗原結合片段係一scFv。
  15. 如請求項12至14中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗CD123抗原結合片段係併入一嵌合抗原受體(CAR)內。
  16. 如請求項15之抗體或抗原結合片段，其中該CAR包含： a)   一IgG鉸鏈或一經修飾之IgG鉸鏈， b)   一跨膜域， c)   一共刺激訊號傳導域，以及 d)   T細胞受體ζ鏈訊號傳導域。
  17. 如請求項16之抗體或抗原結合片段，其中該共刺激訊號傳導域係選自於由以下所構成之群組：一CD27共刺激訊號傳導域、一CD28共刺激訊號傳導域、一4-1BB共刺激訊號傳導域及一OX40共刺激訊號傳導域。
  18. 如請求項16或請求項17之抗體或抗原結合片段，其中該跨膜域包含CD28、CD4、CD8、4-1BB、CD27、ICOS、OX40、HVEM或CD30之一跨膜域部分。
  19. 如請求項15至18中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該CD123-CAR包含：一包含SEQ ID NO: 20的VL 域及一包含SEQ ID NO: 21的VH 域、一CD28跨膜域、一包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25的共刺激域，以及一包含SEQ ID NO: 48的CD3ζ域。
  20. 如請求項19之抗體或抗原結合片段，其中該CD123-CAR包含SEQ ID NO: 49。
  21. 如請求項15至18中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該CD123-CAR包含：一包含SEQ ID NO: 22的VL 域及包含SEQ ID NO: 23的VH 域、一CD28跨膜域、一包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25的共刺激域，以及一包含SEQ ID NO: 48的CD3ζ域。
  22. 如請求項21之抗體或抗原結合片段，其中該CD123-CAR包含SEQ ID NO: 50。
  23. 一種核苷酸序列，其編碼一抗體或抗原結合片段，該核苷酸序列包含： a) GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAGGTTGTCCTGCACAACTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTCCTTTATTCACTGGGTGAAGCAGAGGACTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATGAAACTAAATATGCCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGCCCCATCTACGGTAGTAGAGAGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 16)及GACATCCAGATGACACAGTCTCCAGCTTCCCTGTCTGCATCTCTGGGAGAAACTGTCACCATCGAATGTCTAGCAAGTGAAGACATTTACAGTAATTTAGCGTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATGATGCAAGTAGCTTGCAAGATGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCAGTGAATCTGGCACACAGTATTCTCTCGAGATCAACAGCCTGCAATCTGAAGATGCCGCGACTTATTTCTGTCAACAGCATCATGATTATCCTCTCACGTTCGGTTCTGGGACCAAGCTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 17)；或 b) GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAGGTTGTCCTGCACAACTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTCCTTTATTCACTGGGTGAAGCAGAGGACTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGGATGATGAAACTAAATATGCCCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGCCCCATCTACGGTAGTAGAGAGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 18)及GACATCCAGATGACACAGTCTCCAGCTTCCCTGTCTGCATCTCTGGGAGAAACTGTCACCATCGAATGTCGAGCAAGTGAGGACATTTACAATGGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATAATGCAAATAGCTTGCATACTGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACACAGTATTCTCTCAAGATAAACAGCCTGCAGTCTGAAGATGTCGCAAGTTATTTCTGTCAACAGTATTACAATTATCCGTACACGTTTGGAGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA (SEQ ID NO: 19)。
  24. 一種表現載體，其包含如請求項23之核苷酸序列。
  25. 一種擴增或活化免疫細胞之方法，該等免疫細胞係表現一抗CD123嵌合抗原受體(CD123-CAR)，該方法包含於活體外將表現一CD123-CAR之一免疫細胞群體與一抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段接觸，該抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段係特異性結合至該CD123-CAR之一個體遺傳型，其中該CD123-CAR係包含一結合至CD123之scFv、一鉸鏈域、一跨膜域、一共刺激域，及T細胞受體ζ鏈訊號傳導域。
  26. 如請求項25之方法，其中該抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段包含： a)   一包含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的CDRH1、一包含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的CDRH2及一包含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的CDRH3，以及一包含EDIYSN (SEQ ID NO: 4)的CDRL1、一包含DAS (SEQ ID NO: 5)的CDRL2及一包含QQHHDYPLT (SEQ ID NO: 6)的CDRL3；或 b)   一包含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的CDRH1、一包含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的CDRH2及一包含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的CDRH3，以及一包含EDIYNG (SEQ ID NO: 7)的CDRL1、一包含NAN (SEQ ID NO: 8)的CDRL2及一包含QQYYNYPYT (SEQ ID NO: 9)的CDRL3。
  27. 如請求項25或請求項26之方法，其中該抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段包含： a)   一包含EVQLQQSGAELVRPGASVRLSCTTSGFNIKDSFIHWVKQRT EQGLEWIGRIDPEDDETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASPIYGSREAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 13)的VH 區及一包含DIQMTQSPASLSASLGETVTIECLASEDIYSNLAWYQQKPGKSPQLLIYDASSLQDGVPSRFSGSESGTQYSLEINSLQSEDAATYFCQQHHDYPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 14)的VL ；或 b)   一包含EVQLQQSGAELVRPGASVRLSCTTSGFNIKDSFIHWVKQRT EQGLEWIGRIDPEDDETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASPIYGSREAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 13)的VH 區及一包含DIQMTQSPASLSASLGETVTIECRASEDIYNGLAWYQQKPGKSPQLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVASYFCQQYYNYPYTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 15)的VL 。
  28. 如請求項25至27中任一項之方法，其中該CD123-CAR之該鉸鏈係一IgG鉸鏈或一經修飾的IgG鉸鏈。
  29. 如請求項25至28中任一項之方法，其中該CD123-CAR之共刺激訊號傳導域係選自於由以下所構成之群組：一CD27共刺激訊號傳導域、一CD28共刺激訊號傳導域、一4-1BB共刺激訊號傳導域及一OX40共刺激訊號傳導域。
  30. 如請求項25至29中任一項之方法，其中該跨膜域包含CD28、CD4、CD8、4-1BB、CD27、ICOS、OX40、HVEM或CD30之一跨膜域部分。
  31. 如請求項25至30中任一項之方法，其中該CD123-CAR之該scFv包含SEQ ID NO: 20與21或者SEQ ID NO: 22與23。
  32. 如請求項25至31中任一項之方法，其中該CD123-CAR包含SEQ ID NO: 49與SEQ ID NO: 50。
  33. 如請求項25至32中任一項之方法，其中該等免疫細胞係T細胞或自然殺手(NK)細胞。
  34. 一種偵測一樣本中一CD123-CAR之存在的方法，包含：將一包含疑似表現一CD123-CAR之免疫細胞的樣本與一抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段接觸，該抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段係特異性結合至該CD123-CAR之一個體遺傳型；以及定量出表現該CD123-CAR之細胞的數目，其中該CD123-CAR係包含一結合至CD123之scFv、一鉸鏈域、一跨膜域、至少一共刺激域，及T細胞受體ζ鏈訊號傳導域。
  35. 如請求項34之方法，其中該抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段包含： a)   一包含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的CDRH1、一包含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的CDRH2及一包含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的CDRH3，以及一包含EDIYSN (SEQ ID NO: 4)的CDRL1、一包含DAS (SEQ ID NO: 5)的CDRL2及一包含QQHHDYPLT (SEQ ID NO: 6)的CDRL3；或 b) 一包含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的CDRH1、一包含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的CDRH2及一包含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的CDRH3，以及一包含EDIYNG (SEQ ID NO: 7)的CDRL1、一包含NAN (SEQ ID NO: 8)的CDRL2及一包含QQYYNYPYT (SEQ ID NO: 9)的CDRL3。
  36. 如請求項34或請求項35之方法，其中該抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段包含： a)   一包含EVQLQQSGAELVRPGASVRLSCTTSGFNIKDSFIHWVKQRTE QGLEWIGRIDPEDDETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASPIYGSREAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 13)的VH 區及一包含DIQMTQSPASLSASLGETVTIECLASEDIYSNLAWYQQKPGKSPQLLIYDASSLQDGVPSRFSGSESGTQYSLEINSLQSEDAATYFCQQHHDYPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 14)的VL ；或 b)一包含EVQLQQSGAELVRPGASVRLSCTTSGFNIKDSFIHWVKQRT EQGLEWIGRIDPEDDETKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASPIYGSREAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 13)的VH 區及一包含DIQMTQSPASLSASLGETVTIECRASEDIYNGLAWYQQKPGKSPQLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVASYFCQQYYNYPYTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 15)的VL 。
  37. 如請求項34至36中任一項之方法，其中該等免疫細胞係T細胞或自然殺手(NK)細胞。
  38. 如請求項34至37中任一項之方法，其中該CD123-CAR包含一包含SEQ ID NO: 20的VL 域及包含SEQ ID NO: 21的VH 域、一CD28跨膜域、一包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25的共刺激域，以及一包含SEQ ID NO: 48的CD3ζ域。
  39. 如請求項34至37中任一項之方法，其中該CD123-CAR包含一包含SEQ ID NO: 22的VL 域及包含SEQ ID NO: 23的VH 域、一CD28跨膜域、一包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25的共刺激域，以及一包含SEQ ID NO: 48的CD3ζ域。
  40. 如請求項34至39中任一項之方法，其中該CD123-CAR包含SEQ ID NO: 49與SEQ ID NO: 50。
  41. 如請求項34至40中任一項之方法，其中該樣本為一細胞培養基。
  42. 如請求項34至40中任一項之方法，其中該樣本係來自於已使用該等表現CD123-CAR的免疫細胞來治療之一受試者的一血液樣本。
  43. 如請求項42之方法，其進一步包含：若判定表現該CD123-CAR之免疫細胞的量係低於一預設臨界值，則建議投予更多表現該CD123-CAR之免疫細胞。
  44. 如請求項42之方法，其進一步包含：若判定表現該CD123-CAR之免疫細胞的量係低於一預設臨界值，則投予更多表現該CD123-CAR之免疫細胞。
  45. 如請求項42之方法，其進一步包含：若判定表現該CD123-CAR之免疫細胞的量係高於一預設臨界值，則建議避免投予更多表現該CD123-CAR之免疫細胞。
  46. 如請求項45之方法，其進一步包含藉由將該血液與一固態撐體接觸而自該受試者之該血液移除免疫細胞，該固態撐體包含一抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段，其包含： a)   一包含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的CDRH1、一包含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的CDRH2及一包含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的CDRH3，以及一包含EDIYSN (SEQ ID NO: 4)的CDRL1、一包含DAS (SEQ ID NO: 5)的CDRL2及一包含QQHHDYPLT (SEQ ID NO: 6)的CDRL3；或 b)   一包含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的CDRH1、一包含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的CDRH2及一包含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的CDRH3，以及一包含EDIYNG (SEQ ID NO: 7)的CDRL1、一包含NAN (SEQ ID NO: 8)的CDRL2及一包含QQYYNYPYT (SEQ ID NO: 9)的CDRL3； 藉此自該受試者之血液螯合表現該CD123-CAR之免疫細胞，並隨後將已移除該等表現該CD123-CAR之免疫細胞的血液投予回至該受試者。
  47. 如請求項42至46中任一項之方法，其中該受試者具有急性骨髓性白血病(AML)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(BPDCN)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)，或毛細胞白血病。
  48. 一種從一樣本分離出表現一CD123-CAR之免疫細胞的方法，包含：將一包含疑似表現一CD123-CAR之免疫細胞的樣本與一固態撐體接觸，該固態撐體包含一抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段，其包含： a)   一包含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的CDRH1、一包含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的CDRH2及一包含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的CDRH3，以及一包含EDIYSN (SEQ ID NO: 4)的CDRL1、一包含DAS (SEQ ID NO: 5)的CDRL2及一包含QQHHDYPLT (SEQ ID NO: 6)的CDRL3；或 b)   一包含GFNIKDSF (SEQ ID NO: 1)的CDRH1、一包含IDPEDDET (SEQ ID NO: 2)的CDRH2及一包含ASPIYGSREAWFAY (SEQ ID NO: 3)的CDRH3，以及一包含EDIYNG (SEQ ID NO: 7)的CDRL1、一包含NAN (SEQ ID NO: 8)的CDRL2及一包含QQYYNYPYT (SEQ ID NO: 9)的CDRL3； 藉此從該樣本分離出該等表現該CD123-CAR之免疫細胞，其中該CD123-CAR包含一結合至CD123之scFv、一鉸鏈域、一跨膜域、一共刺激域，及T細胞受體ζ鏈訊號傳導域。
  49. 如請求項48之方法，其中該樣本係一細胞培養基。
  50. 如請求項48之方法，其中該樣本係來自於已使用該等表現該CD123-CAR之免疫細胞來治療之一受試者的一血液樣本。
  51. 如請求項48至50中任一項之方法，其中該固態撐體包含一管柱或珠粒，該抗個體遺傳型抗體或抗原結合片段係連接至該管柱或珠粒。
  52. 如請求項48至51中任一項之方法，其中該CD123-CAR包含一包含SEQ ID NO: 20的VL 域及包含SEQ ID NO: 21的VH 域、一CD28跨膜域、一含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25的共刺激域，以及一含SEQ ID NO: 48的CD3ζ域。
  53. 如請求項48至51中任一項之方法，其中該CD123-CAR包含一包含SEQ ID NO: 22的VL 域及包含SEQ ID NO: 23的VH 域、一CD28跨膜域、一含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25的共刺激域，以及一含SEQ ID NO: 48的CD3ζ域。
  54. 如請求項48至53中任一項之方法，其中該CD123-CAR包含SEQ ID NO: 49與SEQ ID NO: 50。
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