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TW202144401A - 一種辨識afp的t細胞受體 - Google Patents

一種辨識afp的t細胞受體 Download PDF

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TW202144401A
TW202144401A TW110107108A TW110107108A TW202144401A TW 202144401 A TW202144401 A TW 202144401A TW 110107108 A TW110107108 A TW 110107108A TW 110107108 A TW110107108 A TW 110107108A TW 202144401 A TW202144401 A TW 202144401A
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懿 李
楊東雪
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大陸商香雪生命科學技術（廣東）有限公司
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Abstract

本發明提供了一種能夠特異性結合衍生自AFP抗原的短鏈胜肽KWVESIFLIF的T細胞受體(TCR)，所述抗原短鏈胜肽KWVESIFLIF可與HLA A2402形成複合物並一起被呈現到細胞表面。本發明還提供了編碼所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的載體。另外，本發明還提供了轉導本發明TCR的細胞。

Description

一種辨識AFP的T細胞受體
本發明涉及能夠辨識源自AFP抗原短鏈胜肽的TCR及其編碼序列，本發明還涉及轉導上述TCR來獲得的AFP特異性的T細胞，及他們在預防和治療AFP相關疾病中的用途。
AFP (αFetoprotein)也稱α胎蛋白，是胚胎發育過程中表現的一種蛋白，是胚胎血清的主要成分。在發育過程中，AFP在卵黃囊及肝臟中有比較高的表現位準，隨後被抑制。在肝細胞癌中，AFP的表現被活化(Butterfieldet al .J Immunol ., 2001, Apr 15;166(8):5300-8)。AFP在細胞內生成後被降解成小分子多肽，並與MHC (主要組織相容性複合體)分子結合形成複合物，被呈現到細胞表面。KWVESIFLIF (SEQ ID NO:9)是衍生自AFP抗原的短鏈胜肽，是AFP相關疾病治療的一種標的。
T細胞過繼免疫治療是將對標的細胞抗原具有特異性的反應性T細胞轉入病人體內，使其針對標的細胞發揮作用。T細胞受體(TCR)是T細胞表面的一種膜蛋白，其能夠辨識相應的標的細胞表面的抗原短鏈胜肽。在免疫系統中，透過抗原短鏈胜肽特異性的TCR與短鏈胜肽-主要組織相容性複合體(pMHC複合物)的結合引發T細胞與抗原呈現細胞(APC)直接的物理接觸，然後T細胞及APC兩者的其它細胞膜表面分子就發生相互作用，引起一系列後續的細胞信號傳遞和其它生理反應，從而使得不同抗原特異性的T細胞對其標的細胞發揮免疫反應。因此，本領域技術人員致力於分離出對AFP抗原短鏈胜肽具有特異性的TCR，以及將該TCR轉導T細胞來獲得對AFP抗原短鏈胜肽具有特異性的T細胞，從而使他們在細胞免疫治療中發揮作用。
發明概要
本發明的目的在於提供一種辨識AFP抗原短鏈胜肽的T細胞受體。
本發明的第一方面，提供了一種T細胞受體(TCR)，所述TCR能夠與KWVESIFLIF-HLA A2402複合物結合。
在另一優選例中，所述TCR包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域，所述TCRα鏈可變域的CDR3的胺基酸序列為AVRRRNYGQNFV (SEQ ID NO：12)；和/或所述TCRβ鏈可變域的CDR3的胺基酸序列為ASSLIAQNHNEQF (SEQ ID NO：15)。
在另一優選例中，所述TCRα鏈可變域的3個互補決定區(CDR)為： α CDR1-DSAIYN     (SEQ ID NO：10) α CDR2-IQSSQRE    (SEQ ID NO：11) α CDR3-AVRRRNYGQNFV   (SEQ ID NO：12)；和/或 所述TCRβ鏈可變域的3個互補決定區為： β CDR1-SGHDT         (SEQ ID NO：13) β CDR2-YYEEEE          (SEQ ID NO：14) β CDR3-ASSLIAQNHNEQF     (SEQ ID NO：15)。
在另一優選例中，所述TCR包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域，所述TCRα鏈可變域為與SEQ ID NO：1具有至少90%序列相同性的胺基酸序列；和/或所述TCRβ鏈可變域為與SEQ ID NO：5具有至少90%序列相同性的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述TCR包含α鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO：1。
在另一優選例中，所述TCR包含β鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO：5。
在另一優選例中，所述TCR為αβ異質二聚體，其包含TCRα鏈恆定區TRAC*01和TCRβ鏈恆定區TRBC1*01或TRBC2*01。
在另一優選例中，所述TCR的α鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：3和/或所述TCR的β鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：7。
在另一優選例中，所述TCR是可溶的。
在另一優選例中，所述TCR為單鏈。
在另一優選例中，所述TCR是由α鏈可變域與β鏈可變域透過肽連接序列連接而成。
在另一優選例中，所述TCR在α鏈可變區胺基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位，和/或α鏈J基因短鏈胜肽胺基酸倒數第3位、倒數第5位或倒數第7位中具有一個或多個突變；和/或所述TCR在β鏈可變區胺基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位，和/或β鏈J基因短鏈胜肽胺基酸倒數第2位、倒數第4位或倒數第6位中具有一個或多個突變，其中胺基酸位置編號按IMGT (國際免疫遺傳學資訊系統)中列出的位置編號。
在另一優選例中，所述TCR的α鏈可變域胺基酸序列包含SEQ ID NO：32和/或所述TCR的β鏈可變域胺基酸序列包含SEQ ID NO：34。
在另一優選例中，所述TCR的胺基酸序列為SEQ ID NO：30。
在另一優選例中，所述TCR包括(a)除跨膜結構域以外的全部或部分TCRα鏈；以及(b)除跨膜結構域以外的全部或部分TCRβ鏈； 並且(a)和(b)各自包含功能性可變結構域，或包含功能性可變結構域和所述TCR鏈恆定結構域的至少一部分。
在另一優選例中，半胱胺酸殘基在所述TCR的α和β鏈恆定域之間形成人工二硫鍵。
在另一優選例中，在所述TCR中形成人工二硫鍵的半胱胺酸殘基取代了選自下列的一組或多組位址： TRAC*01外顯子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57； TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77； TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser17； TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp59； TRAC*01外顯子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu15； TRAC*01外顯子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser54； TRAC*01外顯子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ala19；和 TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。
在另一優選例中，所述TCR的α鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：26和/或所述TCR的β鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：28。
在另一優選例中，所述TCR的α鏈可變區與β鏈恆定區之間含有人工鏈間二硫鍵。
在另一優選例中，其特徵在於，在所述TCR中形成人工鏈間二硫鍵的半胱胺酸殘基取代了選自下列的一組或多組位址： TRAV的第46位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位胺基酸； TRAV的第47位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61位胺基酸； TRAV的第46位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位胺基酸；或 TRAV的第47位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位胺基酸。
在另一優選例中，所述TCR包含α鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結構域以外的全部或部分β鏈恆定域，但其不包含α鏈恆定域，所述TCR的α鏈可變域與β鏈形成異質二聚體。
在另一優選例中，所述TCR的α鏈和/或β鏈的C-或N-末端結合有偶聯物。
在另一優選例中，與所述T細胞受體結合的偶聯物為可檢測標記物、治療劑、PK修飾部分或任何這些物質的組合。優選地，所述治療劑為抗-CD3抗體。
本發明的第二方面，提供了一種多價TCR複合物，其包含至少兩個TCR分子，並且其中的至少一個TCR分子為本發明第一方面所述的TCR。
本發明的第三方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼本發明第一方面所述的TCR分子的核酸序列或其互補序列。
在另一優選例中，所述核酸分子包含編碼TCRα鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：33。
在另一優選例中，所述的核酸分子包含編碼TCRβ鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：35。
在另一優選例中，所述核酸分子包含編碼TCRα鏈的核苷酸序列SEQ ID NO：4和/或包含編碼TCRβ鏈的核苷酸序列SEQ ID NO：8。
本發明的第四方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發明第三方面所述的核酸分子；優選地，所述的載體為病毒載體；更優選地，所述的載體為慢病毒載體。
本發明的第五方面，提供了一種分離的宿主細胞，所述的宿主細胞中含有本發明第四方面所述的載體或基因組中整合有外源的本發明第三方面所述的核酸分子。
本發明的第六方面，提供了一種細胞，所述細胞轉導本發明第三方面所述的核酸分子或本發明第四方面所述的載體；優選地，所述細胞為T細胞或幹細胞。
本發明的第七方面，提供了一種藥物組成物，所述組成物含有藥學上可接受的載劑以及本發明第一方面所述的TCR、本發明第二方面所述的TCR複合物、本發明第三方面所述的核酸分子、本發明第四方面所述的載體、或本發明第六方面所述的細胞。
本發明的第八方面，提供了本發明第一方面所述的T細胞受體、或本發明第二方面所述的TCR複合物、本發明第三方面所述的核酸分子、本發明第四方面所述的載體、或本發明第六方面所述的細胞的用途，用於製備治療腫瘤或自體免疫疾病的藥物，優選地，所述腫瘤為肝細胞癌。
本發明的第九方面，提供了本發明第一方面所述的T細胞受體、或本發明第二方面所述的TCR複合物、本發明第三方面所述的核酸分子、本發明第四方面所述的載體、或本發明第六方面所述的細胞用作治療腫瘤或自體免疫疾病的藥物；優選地，所述腫瘤為肝細胞癌。
本發明的第十方面，提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對象施用適量的本發明第一方面所述的T細胞受體、或本發明第二方面所述的TCR複合物、本發明第三方面所述的核酸分子、本發明第四方面所述的載體、或本發明第六方面所述的細胞、或本發明第七方面所述的藥物組成物；
優選地，所述的疾病為腫瘤，優選地所述腫瘤為肝細胞癌。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
具體實施方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，找到了與AFP抗原短鏈胜肽KWVESIFLIF(SEQ ID NO：9)能夠特異性結合的TCR，所述抗原短鏈胜肽KWVESIFLIF可與HLA A2402形成複合物並一起被呈現到細胞表面。本發明還提供了編碼所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的載體。另外，本發明還提供了轉導本發明TCR的細胞。術語
MHC分子是免疫球蛋白超家族的蛋白質，可以是Ⅰ類或Ⅱ類MHC分子。因此，其對於抗原的呈現具有特異性，不同的個體有不同的MHC，能呈現一種蛋白抗原中不同的短鏈胜肽到各自的APC細胞表面。人類的MHC通常稱為HLA基因或HLA複合體。
T細胞受體(TCR)，是呈現在主要組織相容性複合體(MHC)上的特異性抗原胜肽的唯一受體。在免疫系統中，透過抗原特異性的TCR與pMHC複合物的結合引發T細胞與抗原呈現細胞(APC)直接的物理接觸，然後T細胞及APC兩者的其它細胞膜表面分子就發生相互作用，這就引起了一系列後續的細胞信號傳遞和其它生理反應，從而使得不同抗原特異性的T細胞對其標的細胞發揮免疫反應。
TCR是由α鏈/β鏈或者γ鏈/δ鏈以異質二聚體形式存在的細胞膜表面的糖蛋白。在95%的T細胞中TCR異質二聚體由α和β鏈組成，而5%的T細胞具有由γ和δ鏈組成的TCR。天然αβ異質二聚TCR具有α鏈和β鏈，α鏈和β鏈構成αβ異源二聚TCR的次單元。廣義上講，α和β各鏈包含可變區、連接區和恆定區，β鏈通常還在可變區和連接區之間含有短的多變區，但該多變區常視作連接區的一部分。各可變區包含嵌合在框架結構(framework regions)中的3個CDR (互補決定區)，CDR1、CDR2和CDR3。CDR區決定了TCR與pMHC複合物的結合，其中CDR3由可變區和連接區重組而成，被稱為超變區。TCR的α和β鏈一般看作各有兩個“結構域”即可變域和恆定域，可變域由連接的可變區和連接區構成。TCR恆定域的序列可以在國際免疫遺傳學資訊系統(IMGT)的公開資料庫中找到，如TCR分子α鏈的恆定域序列為“TRAC*01”，TCR分子β鏈的恆定域序列為“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。此外，TCR的α和β鏈還包含跨膜區和胞質區，胞質區很短。
在本發明中，術語“本發明多肽”、“本發明的TCR”、“本發明的T細胞受體”可互換使用。天然鏈間二硫鍵與人工鏈間二硫鍵
在天然TCR的近膜區Cα與Cβ鏈間存在一組二硫鍵，本發明中稱為“天然鏈間二硫鍵”。在本發明中，將人工引入的，位置與天然鏈間二硫鍵的位置不同的鏈間共價二硫鍵稱為“人工鏈間二硫鍵”。
為方便描述二硫鍵的位置，本發明中TRAC*01與TRBC1*01或TRBC2*01胺基酸序列的位置編號按從N端到C端依次的順序進行位置編號，如TRBC1*01或TRBC2*01中，按從N端到C端依次的順序第60個胺基酸為P (脯胺酸)，則本發明中可將其描述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Pro60，也可將其表述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位胺基酸，又如TRBC1*01或TRBC2*01中，按從N端到C端依次的順序第61個胺基酸為Q (麩醯胺酸)，則本發明中可將其描述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Gln61，也可將其表述為TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位胺基酸，其它以此類推。本發明中，可變區TRAV與TRBV的胺基酸序列的位置編號，按照IMGT中列出的位置編號。如TRAV中的某個胺基酸，IMGT中列出的位置編號為46，則本發明中將其描述為TRAV第46位胺基酸，其它以此類推。本發明中，其它胺基酸的序列位置編號有特殊說明的，則按特殊說明。發明詳述 TCR 分子
在抗原加工過程中，抗原在細胞內被降解，然後透過MHC分子攜帶至細胞表面。T細胞受體能夠辨識抗原呈現細胞表面的胜肽-MHC複合物。因此，本發明的第一方面提供了一種能夠結合KWVESIFLIF-HLA A2402複合物的TCR分子。優選地，所述TCR分子是分離的或純化的。該TCR的α和β鏈各具有3個互補決定區(CDR)。
在本發明的一個優選地實施方式中，所述TCR的α鏈包含具有以下胺基酸序列的CDR： α CDR1-DSAIYN     (SEQ ID NO：10) α CDR2-IQSSQRE    (SEQ ID NO：11) α CDR3-AVRRRNYGQNFV   (SEQ ID NO：12)；和/或 所述TCRβ鏈可變域的3個互補決定區為： β CDR1-SGHDT         (SEQ ID NO：13) β CDR2-YYEEEE          (SEQ ID NO：14) β CDR3-ASSLIAQNHNEQF     (SEQ ID NO：15)。
可以將上述本發明的CDR區胺基酸序列嵌入到任何適合的框架結構中來製備嵌合TCR。只要框架結構與本發明的TCR的CDR區兼容，本領域技術人員根據本發明公開的CDR區就能夠設計或合成出具有相應功能的TCR分子。因此，本發明TCR分子是指包含上述α和/或β鏈CDR區序列及任何適合的框架結構的TCR分子。本發明TCRα鏈可變域為與SEQ ID NO：1具有至少90%，優選地95%，更優選地98%序列相同性的胺基酸序列；和/或本發明TCRβ鏈可變域為與SEQ ID NO：5具有至少90%，優選地95%，更優選地98%序列相同性的胺基酸序列。
在本發明的一個優選例中，本發明的TCR分子是由α與β鏈構成的異質二聚體。具體地，一方面所述異質二聚TCR分子的α鏈包含可變域和恆定域，所述α鏈可變域胺基酸序列包含上述α鏈的CDR1 (SEQ ID NO：10)、CDR2 (SEQ ID NO：11)和CDR3 (SEQ ID NO：12)。優選地，所述TCR分子包含α鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO：1。更優選地，所述TCR分子的α鏈可變域胺基酸序列為SEQ ID NO：1。另一方面，所述異質二聚TCR分子的β鏈包含可變域和恆定域，所述β鏈可變域胺基酸序列包含上述β鏈的CDR1 (SEQ ID NO：13)、CDR2 (SEQ ID NO：14)和CDR3 (SEQ ID NO：15)。優選地，所述TCR分子包含β鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO：5。更優選地，所述TCR分子的β鏈可變域胺基酸序列為SEQ ID NO：5。
在本發明的一個優選例中，本發明的TCR分子是由α鏈的部分或全部和/或β鏈的部分或全部組成的單鏈TCR分子。有關單鏈TCR分子的描述可以參考文獻Chunget al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658。根據文獻中所述，本領域技術人員能夠容易地建構包含本發明CDRs區的單鏈TCR分子。具體地，所述單鏈TCR分子包含Vα、Vβ和Cβ，優選地按照從N端到C端的順序連接。
所述單鏈TCR分子的α鏈可變域胺基酸序列包含上述α鏈的CDR1 (SEQ ID NO：10)、CDR2 (SEQ ID NO：11)和CDR3 (SEQ ID NO：12)。優選地，所述單鏈TCR分子包含α鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO：1。更優選地，所述單鏈TCR分子的α鏈可變域胺基酸序列為SEQ ID NO：1。所述單鏈TCR分子的β鏈可變域胺基酸序列包含上述β鏈的CDR1 (SEQ ID NO：13)、CDR2 (SEQ ID NO：14)和CDR3 (SEQ ID NO：15)。優選地，所述單鏈TCR分子包含β鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO：5。更優選地，所述單鏈TCR分子的β鏈可變域胺基酸序列為SEQ ID NO：5。
在本發明的一個優選例中，本發明的TCR分子的恆定域是人的恆定域。本領域技術人員知曉或可以透過查閱相關書籍或IMGT (國際免疫遺傳學資訊系統)的公開資料庫來獲得人的恆定域胺基酸序列。例如，本發明TCR分子α鏈的恆定域序列可以為“TRAC*01”，TCR分子β鏈的恆定域序列可以為“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。IMGT的TRAC*01中提供的胺基酸序列的第53位為Arg，在此表示為：TRAC*01外顯子1的Arg53，其它以此類推。優選地，本發明TCR分子α鏈的胺基酸序列為SEQ ID NO：3，和/或β鏈的胺基酸序列為SEQ ID NO：7。
天然存在的TCR是一種膜蛋白，透過其跨膜區得以穩定。如同免疫球蛋白(抗體)作為抗原辨識分子一樣，TCR也可以被開發應用於診斷和治療，這時需要獲得可溶性的TCR分子。可溶性的TCR分子不包括其跨膜區。可溶性TCR有很廣泛的用途，它不僅可用於研究TCR與pMHC的相互作用，也可用作檢測感染的診斷工具或作為自體免疫疾病的標記物。類似地，可溶性TCR可以被用來將治療劑(如細胞毒素化合物或免疫刺激性化合物)輸送到呈現特異性抗原的細胞，另外，可溶性TCR還可與其它分子(如，抗-CD3抗體)結合來重新定向T細胞，從而使其標靶呈現特定抗原的細胞。本發明也獲得了對AFP抗原短鏈胜肽具有特異性的可溶性TCR。
為獲得可溶性TCR，一方面，本發明TCR可以是在其α和β鏈恆定域的殘基之間引入人工二硫鍵的TCR。半胱胺酸殘基在所述TCR的α和β鏈恆定域間形成人工鏈間二硫鍵。半胱胺酸殘基可以取代在天然TCR中合適位址的其它胺基酸殘基以形成人工鏈間二硫鍵。例如，取代TRAC*01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57的半胱胺酸殘基來形成二硫鍵。引入半胱胺酸殘基以形成二硫鍵的其它位址還可以是：TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77；TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser17；TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp59；TRAC*01外顯子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu15；TRAC*01外顯子1的 Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser54；TRAC*01外顯子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ala19；或TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。即半胱胺酸殘基取代了上述α與β鏈恆定域中任一組位址。可在本發明TCR恆定域的一個或多個C末端截短最多50個、或最多30個、或最多15個、或最多10個、或最多8個或更少的胺基酸，以使其不包括半胱胺酸殘基來達到缺失天然二硫鍵的目的，也可透過將形成天然二硫鍵的半胱胺酸殘基突變為另一胺基酸來達到上述目的。
如上所述，本發明的TCR可以包含在其α和β鏈恆定域的殘基間引入的人工二硫鍵。應注意，恆定域間含或不含上文所述的引入的人工二硫鍵，本發明的TCR均可含有TRAC恆定域序列和TRBC1或TRBC2恆定域序列。TCR的TRAC恆定域序列和TRBC1或TRBC2恆定域序列可透過存在於TCR中的天然二硫鍵連接。
為獲得可溶性TCR，另一方面，本發明TCR還包括在其疏水核心區域發生突變的TCR，這些疏水核心區域的突變優選為能夠使本發明可溶性TCR的穩定性提高的突變，如在公開號為WO2014/206304的專利文獻中所述。這樣的TCR可在其下列可變域疏水核心位置發生突變：(α和/或β鏈)可變區胺基酸第11，13，19，21，53，76，89，91，94位，和/或α鏈J基因(TRAJ)短鏈胜肽胺基酸位置倒數第3，5，7位，和/或β鏈J基因(TRBJ)短鏈胜肽胺基酸位置倒數第2，4，6位，其中胺基酸序列的位置編號按國際免疫遺傳學資訊系統(IMGT)中列出的位置編號。本領域技術人員知曉上述國際免疫遺傳學資訊系統，並可根據該資料庫得到不同TCR的胺基酸殘基在IMGT中的位置編號。
本發明中疏水核心區域發生突變的TCR可以是由一柔性胜肽鏈連接TCR的α與β鏈的可變域而構成的穩定性可溶單鏈TCR。應注意，本發明中柔性胜肽鏈可以是任何適合連接TCRα與β鏈可變域的胜肽鏈。如在本發明實施例4中建構的單鏈可溶性TCR，其α鏈可變域胺基酸序列為SEQ ID NO：32，編碼的核苷酸序列為SEQ ID NO：33；β鏈可變域胺基酸序列為SEQ ID NO：34，編碼的核苷酸序列為SEQ ID NO：35。
另外，對於穩定性而言，專利文獻201680003540.2還公開了在TCR的α鏈可變區與β鏈恆定區之間引入人工鏈間二硫鍵能夠使TCR的穩定性顯著提高。因此，本發明的TCR的α鏈可變區與β鏈恆定區之間還可以含有人工鏈間二硫鍵。具體地，在所述TCR的α鏈可變區與β鏈恆定區之間形成人工鏈間二硫鍵的半胱胺酸殘基取代了：TRAV的第46位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位胺基酸；TRAV的第47位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61位胺基酸；TRAV的第46位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位胺基酸；或TRAV的第47位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位胺基酸。優選地，這樣的TCR可以包含(i)除其跨膜結構域以外的全部或部分TCRα鏈，和(ii)除其跨膜結構域以外的全部或部分TCRβ鏈，其中(i)和(ii)均包含TCR鏈的可變域和至少一部分恆定域，α鏈與β鏈形成異質二聚體。更優選地，這樣的TCR可以包含α鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結構域以外的全部或部分β鏈恆定域，但其不包含α鏈恆定域，所述TCR的α鏈可變域與β鏈形成異質二聚體。
本發明的TCR也可以多價複合體的形式提供。本發明的多價TCR複合體包含兩個、三個、四個或更多個本發明TCR相結合而形成的多聚物，如可以用p53的四聚結構域來產生四聚體，或多個本發明TCR與另一分子結合而形成的複合物。本發明的TCR複合物可用於體外或體內追蹤或標靶呈現特定抗原的細胞，也可用於產生具有此類應用的其它多價TCR複合物的中間物。
本發明的TCR可以單獨使用，也可與偶聯物以共價或其它方式結合，優選以共價方式結合。所述偶聯物包括可檢測標記物(為診斷目的，其中所述TCR用於檢測呈現KWVESIFLIF-HLA A2402複合物的細胞的存在)、治療劑、PK (蛋白激酶)修飾部分或任何以上這些物質的組合結合或偶聯。
用於診斷目的的可檢測標記物包括但不限於：螢光或發光標記物、放射性標記物、MRI (核磁共振成像)或CT (電腦X射線斷層掃描技術)造影劑、或能夠產生可檢測產物的酶。
可與本發明TCR結合或偶聯的治療劑包括但不限於：1. 放射性核種(Koppe等，2005，癌轉移評論(Cancer metastasis reviews) 24，539)；2. 生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature) 339，394；Epel等，2002，癌症免疫學和免疫治療(Cancer Immunology and Immunotherapy) 51，565)；3. 細胞激素如IL-2等(Gillies等，1992，美國國家科學院院刊(PNAS) 89，1428；Card等，2004，癌症免疫學和免疫治療(Cancer Immunology and Immunotherapy) 53，345；Halin等，2003，癌症研究(Cancer Research) 63，3202)；4. 抗體Fc片段(Mosquera等，2005，免疫學雜誌(The Journal Of Immunology) 174，4381)；5. 抗體scFv片段(Zhu等，1995，癌症國際期刊(International Journal of Cancer)62, 319)；6. 金奈米顆粒/奈米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancer letters )239，36；Huang等，2006，美國化學學會雜誌(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；7. 病毒顆粒(Peng等，2004，基因治療(Gene therapy) 11，1234)；8. 脂質體(Mamot等，2005，癌症研究(Cancer research)65，11631)；9. 奈米磁粒；10. 前驅藥活化酶[例如，DT-心肌黃酶(DTD)或聯苯基水解酶-樣蛋白質(BPHL)]；11. 化療劑(例如，順鉑)或任何形式的奈米顆粒等。
另外，本發明的TCR還可以是包含衍生自超過一種物種序列的雜合TCR。例如，有研究顯示鼠科TCR在人T細胞中比人TCR能夠更有效地表現。因此，本發明TCR可包含人可變域和鼠的恆定域。這一方法的缺陷是可能引發免疫反應。因此，在其用於過繼性T細胞治療時應當有調節方案來進行免疫抑制，以允許表現鼠科的T細胞的植入。
應理解，本文中胺基酸名稱採用國際通用的單英文字母或三英文字母表示，胺基酸名稱的單英文字母與三英文字母的對應關係如下：Ala (A)、Arg (R)、Asn (N)、Asp (D)、Cys (C)、Gln (Q)、Glu (E)、Gly (G)、His (H)、Ile (I)、Leu (L)、Lys (K)、Met (M)、Phe (F)、Pro (P)、Ser (S)、Thr (T)、Trp (W)、Tyr (Y)、Val (V)。核酸分子
本發明的第二方面提供了編碼本發明第一方面TCR分子或其部分的核酸分子，所述部分可以是一個或多個CDR，α和/或β鏈的可變域，以及α鏈和/或β鏈。
編碼本發明第一方面TCR分子α鏈CDR區的核苷酸序列如下： α CDR1-gatagcgctatttacaac (SEQ ID NO：16) α CDR2-attcagtcaagtcagagagag (SEQ ID NO：17) α CDR3-gctgtgaggcggagaaactatggtcagaattttgtc (SEQ ID NO：18)
編碼本發明第一方面TCR分子β鏈CDR區的核苷酸序列如下： β CDR1- tctgggcataggagt (SEQ ID NO：19) β CDR2- tattatgaggaggaagag (SEQ ID NO：20) β CDR3- gccagcagcttgatagcacagaaccacaatgagcagttc (SEQ ID NO：21)
因此，編碼本發明TCRα鏈的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，和/或編碼本發明TCRβ鏈的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21。
本發明核酸分子的核苷酸序列可以是單鏈或雙鏈的，該核酸分子可以是RNA或DNA，並且可以包含或不包含內含子。優選地，本發明核酸分子的核苷酸序列不包含內含子但能夠編碼本發明多肽，例如編碼本發明TCRα鏈可變域的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO：2和/或編碼本發明TCRβ鏈可變域的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO：6。或者，編碼本發明TCRα鏈可變域的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO：33和/或編碼本發明TCRβ鏈可變域的本發明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO：35。更優選地，本發明核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：8。或者，本發明核酸分子的核苷酸序列為SEQ ID NO：31。
應理解，由於遺傳密碼的簡併，不同的核苷酸序列可以編碼相同的多肽。因此，編碼本發明TCR的核酸序列可以與本發明附圖中所示的核酸序列相同或是簡併的變異體。以本發明中的其中一個例子來說明，“簡併的變異體”是指編碼具有SEQ ID NO：1的蛋白序列，但與SEQ ID NO：2的序列有差別的核酸序列。
核苷酸序列可以是經密碼子最適化的。不同的細胞在具體密碼子的利用上是不同的，可以根據細胞的類型，改變序列中的密碼子來增加表現量。哺乳動物細胞以及多種其它生物的密碼子選擇表是本領域技術人員公知的。
本發明的核酸分子全長序列或其片段通常可以用但不限於PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。目前，已經可以完全透過化學合成來得到編碼本發明TCR (或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。載體
本發明還涉及包含本發明的核酸分子的載體，包括表現載體，即能夠在體內或體外表現的建構體。常用的載體包括細菌質體、噬菌體和動植物病毒。
病毒遞送系統包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體。
優選地，載體可以將本發明的核苷酸轉移至細胞中，例如T細胞中，使得該細胞表現AFP抗原特異性的TCR。理想的情況下，該載體應當能夠在T細胞中持續高位準地表現。細胞
本發明還涉及用本發明的載體或編碼序列經基因工程產生的宿主細胞。所述宿主細胞中含有本發明的載體或染色體中併入了本發明的核酸分子。宿主細胞選自：原核細胞和真核細胞，例如大腸桿菌、酵母細胞、CHO細胞等。
另外，本發明還包括表現本發明的TCR的分離的細胞，特別是T細胞。該T細胞可衍生自從受試者分離的T細胞，或者可以是從受試者中分離的混合細胞群，諸如周邊血液淋巴細胞(PBL)群的一部分。如，該細胞可以分離自周邊血液單核細胞(PBMC)，可以是CD4+ 輔助T細胞或CD8+ 細胞毒性T細胞。該細胞可在CD4+ 輔助T細胞/CD8+ 細胞毒性T細胞的混合群中。一般地，該細胞可以用抗體(如，抗-CD3或抗-CD28的抗體)活化，以便使它們能夠更容易接受轉染，例如用包含編碼本發明TCR分子的核苷酸序列的載體進行轉染。
備選地，本發明的細胞還可以是或衍生自幹細胞，如造血幹細胞(HSC)。將基因轉移至HSC不會導致在細胞表面表現TCR，因為幹細胞表面不表現CD3分子。然而，當幹細胞分化為遷移至胸腺的淋巴前驅物(lymphoid precursor)時，CD3分子的表現將啟動在胸腺細胞的表面表現該引入的TCR分子。
有許多方法適合於用編碼本發明TCR的DNA或RNA進行T細胞轉染(如，Robbins等，(2008) J. Immunol. 180: 6116-6131)。表現本發明TCR的T細胞可以用於過繼免疫治療。本領域技術人員能夠知曉進行過繼性治療的許多合適方法(如，Rosenberg等，(2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308)。AFP 抗原相關疾病
本發明還涉及在受試者中治療和/或預防與AFP相關疾病的方法，其包括過繼性轉移AFP特異性T細胞至該受試者的步驟。該AFP特異性T細胞可辨識KWVESIFLIF-HLA A2402複合物。
本發明的AFP特異性的T細胞可用於治療任何呈現AFP抗原短鏈胜肽KWVESIFLIF-HLA A2402複合物的AFP相關疾病，包括但不限於腫瘤，如肝細胞癌等。治療方法
可以透過分離患有與AFP抗原相關疾病的病人或志願者的T細胞，並將本發明的TCR導入上述T細胞中，隨後將這些基因工程修飾的細胞回輸到病人體內來進行治療。因此，本發明提供了一種治療AFP相關疾病的方法，包括將分離的表現本發明TCR的T細胞，優選地，該T細胞來源於病人本身，輸入到病人體內。一般地，包括(1)分離病人的T細胞，(2)用本發明核酸分子或能夠編碼本發明TCR分子的核酸分子體外轉導T細胞，(3)將基因工程修飾的T細胞輸入到病人體內。分離、轉染及回輸的細胞的數量可以由醫師決定。本發明的主要優點在於：
(1)本發明的TCR能夠與AFP抗原短鏈胜肽複合物KWVESIFLIF-HLA A2402特異性結合，同時轉導了本發明TCR的效應細胞能夠被特異性活化；
(2)轉導了本發明TCR的效應細胞對陽性腫瘤細胞具有很強的毒殺功能。
下面的具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如(Sambrook和Russell等人，分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)(2001) CSHL出版社)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售管道獲得。實施例 實施例 1 選殖 AFP 抗原短鏈胜肽特異性 T 細胞
利用合成短鏈胜肽KWVESIFLIF (SEQ ID NO：9；北京賽百盛基因技術有限公司)刺激來自於基因型為HLA-A2402的健康志願者的周邊血液淋巴細胞(PBL)。將KWVESIFLIF短鏈胜肽與帶有生物素標記的HLA-A2402復性，製備pHLA單倍體。這些單倍體與用PE標記的鏈黴親和素(BD公司)組合成PE標記的四聚體，分選該四聚體及抗-CD8-APC雙陽性細胞。擴增分選的細胞，並按上述方法進行二次分選，隨後用極限稀釋法進行單株選殖。單選殖株細胞用四聚體染色，篩選到的雙陽性選殖株如圖3所示。經過層層篩選得到的雙陽性選殖株，還需要滿足進一步的功能測試。
透過ELISPOT實驗進一步檢測該T細胞選殖株的功能及特異性。本領域技術人員熟知利用ELISPOT實驗檢測細胞功能的方法。本實施例IFN-γ ELISPOT實驗中所用的效應細胞為本發明中獲得的T細胞選殖株，標的細胞：攜載了AFP抗原短鏈胜肽的T2 (轉染了HLA-A2402的T2細胞)、SNU398-AFP (AFP過度表現)和HepG2細胞株為陽性標的細胞；攜載了其它短鏈胜肽的T2 (轉染了HLA-A2402的T2細胞)、SNU398作為陰性標的細胞。
首先準備ELISPOT培養盤，當以T2攜載短鏈胜肽作為標的細胞，按以下順序將試驗的各個組分加入ELISPOT培養盤：T2細胞20,000個/孔、效應細胞2000個/孔後，實驗組加入20 μl本發明TCR特異的短鏈胜肽，對照組加入20 μl其它短鏈胜肽，空白組加入20 μl培養基(試驗培養基)，並設置2重複孔。當以細胞株作為標的細胞，按以下順序將試驗的各個組分加入ELISPOT培養盤：標的細胞20,000個/孔、效應細胞2000個/孔，並設置2重複孔。然後恆溫培育過夜(37°C，5%CO2 )。隨後洗滌培養盤並進行二級檢測和顯色，乾燥培養盤1小時，再利用免疫斑點培養盤讀數計(ELISPOT READER system；AID公司)計數膜上形成的斑點。
實驗結果如圖14所示，得到的T細胞選殖株被攜載了AFP短鏈胜肽的T2、AFP過度表現的SNU398-AFP和高度表現AFP的HEPG2有明顯的活化反應，而對攜載了其它短鏈胜肽的T2細胞及SNU398細胞未被活化。實施例 2 獲取 AFP 抗原短鏈胜肽特異性 T 細胞選殖株的 TCR 基因與載體的建構
用Quick-RNA™ MiniPrep (ZYMO research)萃取實施例1中篩選到的抗原短鏈胜肽KWVESIFLIF特異性、HLA-A2402限制性的T細胞選殖株的總RNA。cDNA的合成採用clontech的SMART RACE cDNA擴增套組，採用的引子是設計在人類TCR基因的C端保守區。將序列選殖至T載體(TAKARA)上進行定序。應注意，該序列為互補序列，不包含內含子。經定序，該雙陽性選殖株表現的TCR的α鏈和β鏈序列結構分別如圖1和圖2所示，圖1a、圖1b、圖1c、圖1d、圖1e和圖1f分別為TCRα鏈可變域胺基酸序列、TCRα鏈可變域核苷酸序列、TCRα鏈胺基酸序列、TCRα鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCRα鏈胺基酸序列以及具有前導序列的TCRα鏈核苷酸序列；圖2a、圖2b、圖2c、圖2d、圖2e和圖2f分別為TCRβ鏈可變域胺基酸序列、TCRβ鏈可變域核苷酸序列、TCRβ鏈胺基酸序列、TCRβ鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCRβ鏈胺基酸序列以及具有前導序列的TCRβ鏈核苷酸序列。
經鑒定，α鏈包含具有以下胺基酸序列的CDR： α CDR1-DSAIYN     (SEQ ID NO：10) α CDR2-IQSSQRE    (SEQ ID NO：11) α CDR3-AVRRRNYGQNFV   (SEQ ID NO：12)
β鏈包含具有以下胺基酸序列的CDR： β CDR1-SGHDT         (SEQ ID NO：13) β CDR2-YYEEEE          (SEQ ID NO：14) β CDR3-ASSLIAQNHNEQF     (SEQ ID NO：15)。
透過重疊(overlap) PCR分別將TCRα鏈和β鏈的全長基因選殖至慢病毒表現載體pLenti (addgene)。具體為：用overlap PCR將TCRα鏈和TCRβ鏈的全長基因進行連接得到TCRα-2A-TCRβ片段。將慢病毒表現載體及TCRα-2A-TCRβ限制酶切割連接得到pLenti-TRA-2A-TRB-IRES-NGFR質體。作為對照用，同時也建構表現eGFP的慢病毒載體pLenti-eGFP。之後再用293T/17包裝假病毒。實施例 3  AFP 抗原短鏈胜肽特異性可溶 TCR 的表現、重折疊和純化
為獲得可溶的TCR分子，本發明的TCR分子的α和β鏈可以分別只包含其可變域及部分恆定域，並且α和β鏈的恆定域中分別引入了一個半胱胺酸殘基以形成人工鏈間二硫鍵，引入半胱胺酸殘基的位置分別為TRAC*01外顯子1的Thr48和TRBC2*01外顯子1的Ser57；其α鏈的胺基酸序列與核苷酸序列分別如圖4a和圖4b所示，其β鏈的胺基酸序列與核苷酸序列分別如圖5a和圖5b所示。透過«分子選殖實驗室手冊»(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三版，Sambrook和Russell)中描述的標準方法將上述TCRα和β鏈的目標基因序列經合成後分別插入到表現載體pET28a+ (Novagene)，上下游的選殖位址分別是NcoI和NotI。插入片段經過定序確認無誤。
將TCR α和β鏈的表現載體分別透過化學轉形法轉形進入表現細菌BL21 (DE3)，細菌用LB培養液生長，於OD600 = 0.6時用終濃度0.5 mM IPTG誘導，TCR的α和β鏈表現後形成的包涵體透過BugBuster Mix (Novagene)進行萃取，並且經BugBuster 溶液反覆多次洗滌，包涵體最後溶解於6 M鹽酸胍、10 mM二硫蘇糖醇(DTT)、10 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、20 mM Tris (pH 8.1)中。
溶解後的TCR α和β鏈以1：1的質量比快速混合於5 M尿素、0.4 M精胺酸、20 mM Tris (pH 8.1)、3.7 mM cystamine、6.6 mM β-mercapoethylamine (4°C)中，終濃度為60 mg/mL。混合後將溶液置於10倍體積的去離子水中透析(4°C)，12小時後將去離子水換成緩衝液(20 mM Tris, pH 8.0)繼續於4°C透析12小時。透析完成後的溶液經0.45 μM的濾膜過濾後，透過陰離子交換管柱(HiTrap Q HP, 5ml, GE Healthcare)純化。洗提峰含有復性成功的α和β二聚體的TCR透過SDS-PAGE膠確認。TCR隨後透過凝膠過濾層析(HiPrep 16/60，Sephacryl S-100 HR，GE Healthcare)進一步純化。純化後的TCR純度經過SDS-PAGE測定大於90%，濃度由BCA法確定。本發明得到的可溶性TCR的SDS-PAGE膠體電泳圖如圖6所示。實施例 4  AFP 抗原短鏈胜肽特異性的可溶性單鏈 TCR 的產生
根據專利文獻WO2014/206304中所述，利用定點突變的方法將實施例2中TCRα與β鏈的可變域構建成了一個以柔性短鏈胜肽(linker)連接的穩定的可溶性單鏈TCR分子。該單鏈TCR分子的胺基酸序列及核苷酸序列分別如圖7a和圖7b所示。其α鏈可變域的胺基酸序列及核苷酸序列分別如圖8a和圖8b所示；其β鏈可變域的胺基酸序列及核苷酸序列分別如圖9a和圖9b所示；其linker序列的胺基酸序列及核苷酸序列分別如圖10a和圖10b所示。
將目標基因經NcoⅠ和NotⅠ雙限制酶切割，與經過NcoⅠ和NotⅠ限制酶切割的pET28a載體連接。連接產物轉形至E.coli DH5α，塗佈含卡那黴素的LB培養盤，37℃倒置培養過夜，挑取陽性選殖株進行PCR篩選，對陽性重組體進行定序，確定序列正確後萃取重組質體轉形至E.coli BL21(DE3)，用於表現。實施例 5  AFP 抗原短鏈胜肽特異性的可溶性單鏈 TCR 的表現、復性和純化
將實施例4中製備的含有重組質體pET28a-模板鏈的BL21(DE 3)菌落全部接種於含有卡那黴素的LB培養基中，37℃培養至OD600 為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為0.5 mM，37℃繼續培養4 h。5000 rpm離心15 min收取細胞沉澱物，用Bugbuster Master Mix (Merck)裂解細胞沉澱物，6000 rpm離心15 min回收包涵體，再用Bugbuster (Merck)進行洗滌以除去細胞碎片和膜組分，6000 rpm離心15 min，收集包涵體。將包涵體溶解在緩衝液(20 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 M尿素)中，高速離心去除不溶物，上清液用BCA法定量後進行分裝，於-80℃保存備用。
向5 mg溶解的單鏈TCR包涵體蛋白中，加入2.5 mL緩衝液(6 M Gua-HCl，50 mM Tris-HCl pH 8.1，100 mM NaCl，10 mM EDTA)，再加入DTT至終濃度為10 mM，37℃處理30 min。用注射器向125 mL復性緩衝液(100 mM Tris-HCl pH 8.1、0.4 M L-精胺酸、5 M尿素、2 mM EDTA、6.5 mM β-mercapthoethylamine、1.87 mM Cystamine)中滴加上述處理後的單鏈TCR，4℃攪拌10 min，然後將復性液裝入截留量為4 kDa的纖維素膜透析袋，透析袋置於1 L預冷的水中，4℃緩慢攪拌過夜。17小時後，將透析液換成1L預冷的緩衝液(20 mM Tris-HCl pH 8.0)，4℃繼續透析8 h，然後將透析液換成相同的新鮮緩衝液繼續透析過夜。17小時後，樣品經0.45 µm濾膜過濾，真空脫氣後透過陰離子交換管柱(HiTrap Q HP, GE Healthcare)，用20 mM Tris-HCl pH 8.0配製的0-1M NaCl線性梯度洗提液純化蛋白，收集的洗提組分進行SDS-PAGE分析，包含單鏈TCR的組分濃縮後進一步用凝膠過濾管柱(Superdex 75 10/300, GE Healthcare)進行純化，目標組分也進行SDS-PAGE分析。
用於BIAcore分析的洗提組分進一步採用凝膠過濾法測試其純度。條件為：層析管柱Agilent Bio SEC-3(300 A，φ7.8×300 mm)，流動相為150 mM磷酸鹽緩衝液，流速0.5 mL/min，管柱溫度25°C，紫外檢測波長214 nm。
本發明獲得的可溶性單鏈TCR的SDS-PAGE膠體電泳圖如圖11所示。實施例 6 結合特徵 BIAcore分析
本實施例證明了可溶性的本發明TCR分子能夠與KWVESIFLIF-HLA A2402複合物特異性結合。
使用BIAcore T200實時分析系統檢測實施例3和實施例5中得到的TCR分子與KWVESIFLIF-HLA A2402複合物的結合活性。將抗鏈黴親和素的抗體(GenScript)加入偶聯緩衝液(10 mM醋酸鈉緩衝液，pH 4.77)，然後將抗體流過預先用EDC和NHS活化過的CM5晶片，使抗體固定在晶片表面，最後用乙醇胺的鹽酸溶液封阻未反應的活化表面，完成偶聯過程，偶聯水平約為15,000 RU。
使低濃度的鏈黴親和素流過已塗佈抗體的晶片表面，然後將KWVESIFLIF-HLA A2402複合物流過檢測通道，另一通道作為參考通道，再將0.05 mM的生物素以10 µL/min的流速流過晶片2 min，封阻鏈黴親和素剩餘的結合位址。
上述KWVESIFLIF-HLA A2402複合物的製備過程如下： a. 純化
收集100 ml誘導表現重鏈或輕鏈的E. coli 菌液，於4℃ 8000 g離心10 min後用10 ml PBS洗滌菌體一次，之後用5 ml BugBuster Master Mix Extraction Reagents (Merck)劇烈震盪重新懸浮菌體，並於室溫旋轉培育20 min，之後於4℃，6000 g離心15 min，棄去上清，收集包涵體。
將上述包涵體重新懸浮於5 ml BugBuster Master Mix中，室溫旋轉培育5 min；加30 ml稀釋10倍的BugBuster，混勻，4℃ 6000 g離心15 min；棄去上清，加30 ml稀釋10倍的BugBuster重新懸浮包涵體，混勻，4℃ 6000 g離心15 min，重複兩次，加30 ml 20 mM Tris-HCl pH 8.0重新懸浮包涵體，混勻，4℃ 6000 g離心15 min，最後用20 mM Tris-HCl 8M尿素溶解包涵體，SDS-PAGE檢測包涵體純度，BCA套組測濃度。 b. 復性
將合成的短鏈胜肽KWVESIFLIF (北京賽百盛基因技術有限公司)溶解於DMSO至20 mg/ml的濃度。輕鏈和重鏈的包涵體用8 M尿素、20 mM Tris pH 8.0、10 mM DTT來溶解，復性前加入3 M鹽酸胍、10 mM醋酸鈉、10 mM EDTA進一步變性。將KWVESIFLIF胜肽以25 mg/L (終濃度)加入復性緩衝液(0.4 M L-精胺酸、100 mM Tris pH 8.3、2 mM EDTA、0.5 mM氧化性麩胱苷肽、5 mM 還原型麩胱苷肽、0.2 mM PMSF，冷卻至4°C)，然後依次加入20 mg/L的輕鏈和90 mg/L的重鏈(終濃度，重鏈分三次加入，8 h/次)，復性在4℃進行至少3天至完成，SDS-PAGE檢測能否復性成功。 c. 復性後純化
用10體積的20 mM Tris pH 8.0作透析來更換復性緩衝液，至少更換緩衝液兩次來充分降低溶液的離子強度。透析後用0.45 μm醋酸纖維素濾膜過濾蛋白質溶液，然後加載到HiTrap Q HP (GE通用電氣公司)陰離子交換管柱上(5 ml床體積)。利用Akta純化儀(GE通用電氣公司)，20 mM Tris pH 8.0配製的0-400 mM NaCl線性梯度液洗提蛋白，pMHC約在250 mM NaCl處洗提，收集諸峰組分，SDS-PAGE檢測純度。 d. 生物素化
用Millipore超濾管將純化的pMHC分子濃縮，同時將緩衝液置換為20 mM Tris pH 8.0，然後加入生物素化試劑0.05 M Bicine pH 8.3、10 mM ATP、10 mM MgOAc、50 μM D-Biotin、100 μg/ml BirA酶(GST-BirA)，室溫培育混合物過夜，SDS-PAGE檢測生物素化是否完全。 e. 純化生物素化後的複合物
用Millipore超濾管將生物素化標記後的pMHC分子濃縮至1 ml，採用凝膠過濾層析純化生物素化的pMHC，利用Akta純化儀(GE通用電氣公司)，用過濾過的PBS預平衡HiPrepTM 16/60 S200 HR管柱(GE通用電氣公司)，加載1 ml濃縮過的生物素化pMHC分子，然後用PBS以1 ml/min流速洗提。生物素化的pMHC分子在約55 ml時作為單峰洗提出現。合併含有蛋白質的組分，用Millipore超濾管濃縮，BCA法(Thermo)測定蛋白質濃度，加入蛋白酶抑制劑cocktail (Roche)將生物素化的pMHC分子分裝保存在-80℃。
利用BIAcore Evaluation軟體計算動力學參數，得到本發明可溶性的TCR分子以及本發明建構的可溶性單鏈TCR分子與KWVESIFLIF-HLA A2402複合物結合的動力學圖譜分別如圖12和圖13所示。圖譜顯示，本發明得到的可溶性TCR分子以及可溶性單鏈TCR分子都能夠與KWVESIFLIF-HLA A2402複合物結合。同時，還利用上述方法檢測了本發明可溶性的TCR分子與其它幾種無關抗原短鏈胜肽與HLA複合物的結合活性，結果顯示本發明TCR分子與其它無關抗原均無結合。實施例 7 轉導本發明 TCR 的效應細胞的活化實驗
本領域技術人員熟知利用ELISPOT實驗檢測細胞功能的方法。建構包含本發明TCR目標基因的慢病毒載體，轉導T細胞，進行ELISPOT試驗，以證明本發明TCR轉導的T細胞對標的細胞特異性的活化反應。利用ELISPOT試驗檢測的IFN-γ產量作為T細胞活化的讀出值。
本實驗中所用的標的細胞為攜載了AFP抗原短鏈胜肽KWVESIFLIF的T2細胞(轉染了HLA-A2402的T2細胞)，所用的效應細胞是本發明TCR的CD3+ T細胞，並以同一志願者轉染其它TCR (A6)的CD3+ T細胞作為對照組。用抗CD3/CD28塗佈珠粒(T細胞擴增物，life technologies)刺激T細胞，轉導目標基因，在含有50 IU/ml IL-2和10 ng/ml IL-7的含10%FBS的1640培養基擴增直至轉導後9-12天，然後將這些細胞置於試驗培養基中，300g常溫離心10分鐘進行洗滌。然後將細胞以2×所需終濃度重新懸浮在試驗培養基中。同樣處理陰性對照效應細胞。在相應標的細胞(T2)實驗組加入對應短鏈胜肽，使短鏈胜肽在ELISPOT孔盤中的終濃度依次為1×10-11 M到1×10-6 M，共6個梯度。
按照生產商提供的說明書，如下所述準備孔盤：以每塊盤10毫升無菌PBS按1：200稀釋抗人IFN-γ捕捉抗體，然後將100微升的稀釋捕捉抗體等分加入各孔。4℃下培育孔盤過夜。培育後，洗滌孔盤以除去多餘的捕捉抗體。加入100微升/孔含有10%FBS的RPMI 1640培養基，並在室溫下恆溫培育孔盤2小時以封阻孔盤。然後從孔盤中洗去培養基，透過在紙上輕彈和輕拍ELISPOT孔盤以除去任何殘餘的洗滌緩衝液。然後將試驗的諸組分加入ELISPOT孔盤：標的細胞2×104 個/孔、效應細胞2×103 個/孔(按抗體陽性率計算)，並設置兩個重複孔。然後恆溫培育孔盤過夜(37°C / 5% CO2 )。
第二天，棄培養基，用雙蒸水洗滌孔盤2次，再用洗滌緩衝液洗滌3次，在紙巾上輕拍以除去殘餘的洗滌緩衝液。然後用含有10%FBS的PBS按1：200稀釋檢測抗體，按100微升/孔加入各孔。室溫下恆溫培育孔盤2小時，再用洗滌緩衝液洗滌3次，在紙巾上輕拍孔盤以除去過量的洗滌緩衝液。用含有10%FBS的PBS按1：100稀釋鏈黴親和素-鹼性磷酸酶，將100微升稀釋的鏈黴親和素-鹼性磷酸酶加入各孔並在室溫下恆溫培育孔盤1小時。然後用洗滌緩衝液洗滌4次PBS洗滌2次，在紙巾上輕拍孔盤以除去過量的洗滌緩衝液和PBS。洗滌完畢後加入套組提供的BCIP/NBT溶液100微升/孔進行顯影。在顯影期間用錫箔紙覆蓋孔盤避光，靜置5-15分鐘。在此期間常規檢測顯影孔盤的斑點，確定終止反應的最佳時間。去除BCIP/NBT溶液並用雙蒸水沖洗孔盤以中止顯影反應，甩乾，然後將孔盤底部去除，在室溫下乾燥孔盤直至每個孔完全乾燥，再利用免疫斑點培養盤計數計(CTL，細胞技術有限公司(Cellular Technology Limited))計數孔盤內底膜形成的斑點。
透過ELISPOT實驗(如上所述)檢驗轉導本發明TCR的T細胞對攜載AFP抗原短鏈胜肽KWVESIFLIF的標的細胞起反應的IFN-γ釋放。利用graphpad prism6繪製各孔中觀察到的ELSPOT斑點數量。
實驗結果如圖15所示，針對攜載了AFP抗原短鏈胜肽的標的細胞，轉導本發明TCR的T細胞在抗原短鏈胜肽濃度較低時已起明顯的活化反應，而轉導其它TCR的T細胞自始未被活化。實施例 8 轉導本發明 TCR 的效應細胞的 LDH 毒殺功能實驗
本實施例透過非放射性細胞毒性實驗，測定LDH的釋放，從而驗證轉導本發明TCR的細胞的毒殺功能。該試驗是51Cr釋放細胞毒性試驗的比色替代試驗，定量測定細胞裂解後釋放的乳酸脫氫酶(LDH)。採用30分鐘偶聯的酶反應來檢測釋放在培養基中的LDH，在酶反應中LDH可使一種四唑鹽(INT)轉化為紅色的甲臢(formazan)。生成的紅色產物的量與裂解的細胞數成正比。可以用標準的96孔盤讀取儀收集490nm可見光吸光值資料。
本實施例以轉導本發明TCR的CD3+ T細胞作為效應細胞，同時以同一志願者轉導其它TCR (A6)的CD3+ T細胞作為對照組。本實施例以HepG2作為陽性腫瘤細胞株，以NCI-H226、SK-HEP-1作為陰性腫瘤細胞株。
首先準備LDH培養盤。實驗第1天，按以下順序將試驗的各個組分加入培養盤：標的細胞系3×104 個細胞/孔、效應細胞3×104 個細胞/孔(按轉染的陽性率計算)，並設置三個重複孔。同時設置效應細胞自發孔，標的細胞自發孔，標的細胞最大孔，體積校正對照孔及培養基背景對照孔。恆溫培育過夜(37°C，5% CO2 )。實驗第2天，檢測顯色，終止反應後用酵素標示讀取儀(Bioteck)在490 nm記錄吸光值。
實驗結果如圖16所示，針對陽性腫瘤細胞，轉導本發明TCR的效應細胞對陽性標的細胞具有很強的毒殺功能，而轉導其它TCR的細胞無毒殺作用；同時，轉導本發明TCR的效應細胞對陰性腫瘤細胞沒有起毒殺作用。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中： 圖1a、圖1b、圖1c、圖1d、圖1e和圖1f分別為TCRα鏈可變域胺基酸序列、TCRα鏈可變域核苷酸序列、TCRα鏈胺基酸序列、TCRα鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCRα鏈胺基酸序列以及具有前導序列的TCRα鏈核苷酸序列。 圖2a、圖2b、圖2c、圖2d、圖2e和圖2f分別為TCRβ鏈可變域胺基酸序列、TCRβ鏈可變域核苷酸序列、TCRβ鏈胺基酸序列、TCRβ鏈核苷酸序列、具有前導序列的TCRβ鏈胺基酸序列以及具有前導序列的TCRβ鏈核苷酸序列。 圖3為單選殖株細胞的CD8+ 及四聚體-PE雙陽性染色結果。 圖4a和圖4b分別為可溶性TCRα鏈的胺基酸序列和核苷酸序列。 圖5a和圖5b分別為可溶性TCRβ鏈的胺基酸序列和核苷酸序列。 圖6a和圖6b為純化後得到的可溶性TCR的膠體電泳圖。其中，圖6a和圖6b的右側膠徑分別為非還原膠和還原膠，左側膠徑都為分子量標記(marker)。 圖7a和圖7b分別為單鏈TCR的胺基酸序列和核苷酸序列。 圖8a和圖8b分別為單鏈TCRα鏈可變域的胺基酸序列和核苷酸序列。 圖9a和圖9b分別為單鏈TCRβ鏈可變域的胺基酸序列和核苷酸序列。 圖10a和圖10b分別為單鏈TCR連接序列(linker)的胺基酸序列和核苷酸序列。 圖11為純化後得到的可溶性單鏈TCR的膠體電泳圖。最左側膠徑為還原膠，中間膠徑為分子量標記(marker)，最右側膠徑為非還原膠。 圖12為本發明可溶性TCR與KWVESIFLIF-HLA A2402複合物結合的BIAcore動力學圖譜。 圖13為本發明可溶性單鏈TCR與KWVESIFLIF-HLA A2402複合物結合的BIAcore動力學圖譜。 圖14為得到的T細胞選殖株的ELISPOT活化功能驗證結果。 圖15為轉導本發明的TCR的效應細胞的ELISPOT活化功能驗證結果。 圖16為轉導本發明的TCR的效應細胞的LDH毒殺功能驗證結果。
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Claims (26)

  1. 一種T細胞受體(TCR)，其特徵在於，所述TCR能夠與KWVESIFLIF-HLA A2402複合物結合；並且，所述TCR包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域，所述TCRα鏈可變域的3個互補決定區(CDR)為： α CDR1-DSAIYN      (SEQ ID NO：10) α CDR2-IQSSQRE     (SEQ ID NO：11) α CDR3-AVRRRNYGQNFV   (SEQ ID NO：12)；和/或 所述TCRβ鏈可變域的3個互補決定區為： β CDR1-SGHDT          (SEQ ID NO：13) β CDR2-YYEEEE           (SEQ ID NO：14) β CDR3-ASSLIAQNHNEQF     (SEQ ID NO：15)。
  2. 如請求項1所述的TCR，其特徵在於，其包含TCRα鏈可變域和TCRβ鏈可變域，所述TCRα鏈可變域為與SEQ ID NO：1具有至少90%序列相同性的胺基酸序列；和/或所述TCRβ鏈可變域為與SEQ ID NO：5具有至少90%序列相同性的胺基酸序列。
  3. 如請求項1所述的TCR，其特徵在於，所述TCR包含α鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO：1；和/或所述TCR包含β鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO：5。
  4. 如請求項1所述的TCR，其特徵在於，所述TCR為αβ異質二聚體，其包含TCRα鏈恆定區TRAC*01和TCRβ鏈恆定區TRBC1*01或TRBC2*01；優選地，所述TCR的α鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：3和所述TCR的β鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：7。
  5. 如請求項1所述的TCR，其特徵在於，所述TCR是可溶的。
  6. 如請求項5所述的TCR，其特徵在於，所述TCR為單鏈；優選地，所述TCR是由α鏈可變域與β鏈可變域透過胜肽連接序列連接而成。
  7. 如請求項6所述的TCR，其特徵在於，所述TCR在α鏈可變區胺基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位，和/或α鏈J基因短鏈胜肽胺基酸倒數第3位、倒數第5位或倒數第7位中具有一個或多個突變；和/或所述TCR在β鏈可變區胺基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位，和/或β鏈J基因短鏈胜肽胺基酸倒數第2位、倒數第4位或倒數第6位中具有一個或多個突變，其中胺基酸位置編號按IMGT (國際免疫遺傳學資訊系統)中列出的位置編號；優選地，所述TCR的α鏈可變域胺基酸序列包含SEQ ID NO：32和/或所述TCR的β鏈可變域胺基酸序列包含SEQ ID NO：34；更優選地，所述TCR的胺基酸序列為SEQ ID NO：30。
  8. 如請求項1所述的TCR，其特徵在於，所述TCR包含(i) TCRα鏈可變域和除跨膜結構域以外的全部或部分TCRα鏈恆定區；和(ii) TCRβ鏈可變域和除跨膜結構域以外的全部或部分TCRβ鏈恆定區。
  9. 如請求項8所述的TCR，其特徵在於，半胱胺酸殘基在所述TCR的α和β鏈恆定域之間形成人工二硫鍵；優選地，在所述TCR中形成人工二硫鍵的半胱胺酸殘基取代了選自下列的一組或多組位址： TRAC*01外顯子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57； TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77； TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser17； TRAC*01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp59； TRAC*01外顯子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu15； TRAC*01外顯子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser54； TRAC*01外顯子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ala19；和 TRAC*01外顯子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。
  10. 如請求項9所述的TCR，其特徵在於，所述TCR的α鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：26和/或所述TCR的β鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：28。
  11. 如請求項8所述的TCR，其特徵在於，所述TCR的α鏈可變區與β鏈恆定區之間含有人工鏈間二硫鍵；優選地，在所述TCR中形成人工鏈間二硫鍵的半胱胺酸殘基取代了選自下列的一組或多組位址： TRAV的第46位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位胺基酸； TRAV的第47位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61位胺基酸； TRAV的第46位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位胺基酸；或 TRAV的第47位胺基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位胺基酸。
  12. 如請求項1所述的TCR，其特徵在於，所述TCR包含α鏈恆定區和β鏈恆定區，所述α鏈恆定區為鼠源的和/或所述β鏈恆定區為鼠源的。
  13. 如請求項1所述的TCR，其特徵在於，所述TCR的α鏈和/或β鏈的C-或N-末端結合有偶聯物；優選地，與所述T細胞受體結合的偶聯物為可檢測標記物或治療劑；更優選地，所述治療劑為抗-CD3抗體。
  14. 如請求項1所述的TCR，其特徵在於，所述TCR是分離的或純化的。
  15. 一種多價TCR複合物，其特徵在於，包含至少兩個TCR分子，並且其中的至少一個TCR分子為上述請求項中任一項所述的TCR。
  16. 一種核酸分子，其特徵在於，所述核酸分子包含編碼上述任一請求項所述的TCR分子的核酸序列或其互補序列。
  17. 如請求項16所述的核酸分子，其特徵在於，其包含編碼TCRα鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：33。
  18. 如請求項16或17所述的核酸分子，其特徵在於，其包含編碼TCRβ鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：35。
  19. 如請求項16所述的核酸分子，其特徵在於，其包含編碼TCRα鏈的核苷酸序列SEQ ID NO：4和/或包含編碼TCRβ鏈的核苷酸序列SEQ ID NO：8。
  20. 一種載體，其特徵在於，所述的載體含有請求項16-19中任一項所述的核酸分子；優選地，所述的載體為病毒載體；更優選地，所述的載體為慢病毒載體。
  21. 一種分離的宿主細胞，其特徵在於，所述的宿主細胞中含有請求項20中所述的載體或染色體中併入了外源的請求項16-19中任一項所述的核酸分子。
  22. 一種細胞，其特徵在於，所述細胞中轉導有請求項16-19中任一項所述的核酸分子或請求項20中所述載體；優選地，所述細胞為T細胞或幹細胞。
  23. 一種藥物組成物，其特徵在於，所述組成物含有藥學上可接受的載劑以及請求項1-14中任一項所述的TCR、請求項15中所述的TCR複合物、或請求項22中所述的細胞。
  24. 請求項1-14中任一項所述的T細胞受體、或請求項15中所述的TCR複合物或請求項22中所述的細胞的用途，其特徵在於，用於製備治療腫瘤或自體免疫疾病的藥物；優選地，所述腫瘤為肝癌。
  25. 請求項1-14中任一項所述的T細胞受體、或請求項15中所述的TCR複合物或請求項22中所述的細胞，用作治療腫瘤或自體免疫疾病的藥物；優選地，所述腫瘤為肝癌。
  26. 一種治療疾病的方法，其特徵在於，包括給需要治療的對象施用適量的請求項1-14中任一項所述的TCR、請求項15中所述TCR複合物、請求項22中所述的細胞或請求項23中所述的藥物組成物； 優選地，所述的疾病為腫瘤，更優選地所述腫瘤為肝癌。
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