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TW201932490A - 針對ｐｄ－１之單域抗體及其變異體 - Google Patents

針對ｐｄ－１之單域抗體及其變異體 Download PDF

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TW201932490A
TW201932490A TW108101554A TW108101554A TW201932490A TW 201932490 A TW201932490 A TW 201932490A TW 108101554 A TW108101554 A TW 108101554A TW 108101554 A TW108101554 A TW 108101554A TW 201932490 A TW201932490 A TW 201932490A
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武術
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大陸商南京傳奇生物科技有限公司
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Abstract

本申請案提供包含特異性識別PD-1之單域抗體(sdAb)部分之構築體。亦提供製備及使用此等構築體之方法。

Description

針對PD-1之單域抗體及其變異體
本發明係關於包含特異性識別PD-1之單域抗體(sdAb)部分之構築體以及其製備及使用方法。
主要表現於活化T細胞及B細胞上的免疫抑制性受體，程式性細胞死亡受體1(PD-1；亦稱為程式性死亡受體1、程式性細胞死亡蛋白1、CD279)為與CD28及細胞毒性T淋巴球相關蛋白-4(CTLA-4、CD152)相關之免疫球蛋白超家族成員。PD-1(及相似的家族成員)為I型跨膜醣蛋白，其含有結合配體之細胞外Ig可變型(V型)域及結合傳訊分子之胞質尾。PD-1之胞質尾含有兩種基於酪胺酸之傳訊模體：ITIM(免疫受體基於酪胺酸之抑制模體)及ITSM(免疫受體基於酪胺酸之轉換模體)。
當藉由程式性細胞死亡配體1(亦稱為程式性死亡配體1(PD-L1、CD274、B7-H1))及/或程式性細胞死亡配體2(亦稱為程式性死亡配體2(PD-L2、CD273、B7-DC))結合時，PD-1減弱T細胞反應。此等配體中任一者與PD-1之結合傳導抑制T細胞增殖、細胞介素產生、及細胞溶解功能之訊息。阻斷PD-L1與PD-1之結合增強腫瘤特異性CD8+ T細胞免疫性，有助於免疫系統對腫瘤細胞的清除。
PD-1/PD-L1相互作用之抗體介導之阻斷已進入治療難治性實體腫瘤之臨床試驗中，難治性實體腫瘤包括黑色素瘤、腎細胞癌、結腸直腸癌、非小 細胞肺癌、及血液惡性腫瘤。然而，仍然需要用於治療、穩定、預防各種癌症、及/或延遲其發展的最佳療法，尤其是鑒於PD-1/PD-L1阻斷後的抗性或復發。
本文所引用之所有公開案、專利、專利申請案、及經公開專利申請案之揭示內容均據此以全文引用之方式併入本文。
本發明係關於抗PD-1構築體以及其製備及使用方法，該抗PD-1構築體包含特異性識別PD-1之sdAb部分(下文稱為「抗PD-1 sdAb」)，諸如：抗PD-1 sdAb；抗PD-1 HCAb，例如包含融合至人類免疫球蛋白G(IgG)之結晶片段(Fc)片段的抗PD-1 sdAb之抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白；及多特異性(諸如雙特異性)抗原結合蛋白，其包含融合至例如其他sdAb、全長四鏈抗體、或其抗原結合片段(例如，Fab或scFv)之抗PD-1 sdAb。
本申請案之一個態樣提供一種經單離抗PD-1構築體，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分，其中該sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體包含特異性識別PD-1之sdAb部分，其中該sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，特異性識別PD-1 之sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中，其中CDR3包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，特異性識別PD-1之sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。
在根據上文所述之任一經單離抗PD-1構築體之一些實施例中，特異性識別PD-1之sdAb部分包含以下中任一者：(1)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(2)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：110之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：182之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(3)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：111之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺 基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：183之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(4)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：112之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：184之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(5)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：113之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：185之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(6)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：114之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：186之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(7)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：115之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：187之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(8)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：116之胺基 酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：188之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(9)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：117之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：189之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(10)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：118之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：190之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(11)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：191之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(12)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：192之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體； (13)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：193之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(14)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：122之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：194之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(15)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：123之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：195之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(16)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：124之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：196之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(17)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：125之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺 基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：197之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(18)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：126之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(19)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：127之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：199之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(20)包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(21)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：201之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(22)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：130之胺基 酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(23)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：131之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：203之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(24)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：132之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：204之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(25)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：133之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(26)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：134之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：206之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體； (27)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(28)包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：208之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(29)包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(30)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：138之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：210之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(31)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺 基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：211之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(32)包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：212之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(33)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：141之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：213之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(34)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：142之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：214之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(35)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：143之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：215之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；或(35)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：144之胺基 酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：216之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。
在根據上文所述之任一經單離抗PD-1構築體之一些實施例中，特異性識別PD-1之sdAb部分包含以下中任一者：(1)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(2)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：110之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：182之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(3)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：111之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：183之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(4)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：112之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：184之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(5)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之CDR13包含SEQ ID NO：113之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：185之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(6)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：114之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：186之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體； (7)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：115之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：187之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(8)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：116之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：188之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(9)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：117之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：189之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(10)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：118之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：190之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(11)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：191之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(12)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：192之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(13)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：193之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(14)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：122之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：194之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體； (15)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：123之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：195之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(16)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：124之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：196之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(17)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：125之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：197之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(18)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：126之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(19)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：127之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：199之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(20)包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(21)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：201之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(22)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：130之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體； (23)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：131之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：203之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(24)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：132之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：204之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(25)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：133之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(26)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：134之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：206之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(27)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(28)包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：208之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(29)包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(30)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：138之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：210之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體； (31)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：211之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(32)包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：212之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(33)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：141之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：213之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(34)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：142之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：214之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；(35)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：143之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：215之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；或(36)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：144之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：216之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。
在根據上文所述之任一經單離抗PD-1構築體之一些實施例中，特異性識別PD-1之sdAb部分包含VHH域，該VH域包含以下中任一者之胺基酸序列：a-1)在位置37處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：F、Y、L、I、及V(諸如F、Y、或V，或諸如F)；a-2)在位置44處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：A、G、E、D、G、Q、R、S、及L(諸如E、Q、或G，或諸如E)；a-3)在位置 45處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：L、R、及C(諸如L或R)；a-4)在位置103處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：W、R、G、及S(諸如W、G、或R，或諸如W)；且a-5)在位置108處之胺基酸殘基為Q；或b-1)在位置37處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：F、Y、L、I、及V(諸如F、V、或Y，或諸如F)；b-2)在位置44處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：E、Q、及G；b-3)在位置45處之胺基酸殘基為R；b-4)在位置103處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：W、R、及S(諸如W)；且b-5)在位置108處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：Q及L(諸如Q)；其中，胺基酸位置係根據Kabat編號，且其中當位置108為Q時，位置108可視情況經人源化為L。
在根據上文所述之任一經單離抗PD-1構築體之一些實施例中，特異性識別PD-1之sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：289-324中任一者具有至少約80%(諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%中任一者)序列一致性的變異體。在一些實施例中，特異性識別PD-1之sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列，或其在VHH域中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR中，諸如SEQ ID NO：289-324中任一者之CDR1、及/或CDR2、及/或CDR3。在一些實施例中，胺基酸取代在FR中，諸如SEQ ID NO：289-324中任一者之FR1、及/或FR2、及/或FR3、及/或FR4。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR及FR兩者中。在一些實施例中，特異性識別PD-1之sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列。
在根據上文所述之任一經單離抗PD-1構築體之一些實施例中，特異性識別PD-1之sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-5M至約10-12M、約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。
在根據上文所述之任一經單離抗PD-1構築體之一些實施例中，特異性識別PD-1之sdAb部分為駱駝(camelid)、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化sdAb部分。
在根據上文所述之任一經單離抗PD-1構築體之一些實施例中，經單離抗PD-1構築體為僅重鏈抗體(HCAb)，其包含經由視情況選用之連接子融合至Fc片段的特異性識別PD-1之sdAb部分。在一些實施例中，HCAb為單體HCAb。在一些實施例中，HCAb為二聚HCAb。在一些實施例中，Fc片段為人類IgG1(hIgG1)Fc、無效應子(惰性)hIgG1 Fc、hIgG4 Fc、或hIgG4 Fc(S228P)。在一些實施例中，Fc片段包含SEQ ID NO：363-365中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，Fc片段為hIgG4 Fc(S228P)。在一些實施例中，視情況選用之連接子包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，HCAb包含SEQ ID NO：325-360中任一者之胺基酸序列。
在根據上文所述之任一經單離抗PD-1構築體之一些實施例中，經單離抗PD-1構築體進一步包含特異性識別第二表位之第二抗體部分。在一些實施例中，第二抗體部分為全長抗體、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、單鏈Fv(scFv)、scFv-scFv、微型抗體、雙功能抗體、或sdAb。在一些實施例中，抗PD-1構築體具有單特異性。在一些實施例中，抗PD-1構築體具有多特異性(諸如雙特異性)。在一些實施例中，第二表位不來自PD-1。在一些實施例中，第二表位來自與抗PD-1 sdAb部分特異性識別者不同的PD-1。在一些實施例中，第二表位與抗PD-1 sdAb部分特異性識別者相同。在一些實施例中，特異性識別PD-1之sdAb部分及第二抗體部分視情況藉由肽連接子連接，諸如包含SEQ ID NO：367-376 中任一者之胺基酸序列之肽連接子。在一些實施例中，第二抗體部分為sdAb，諸如特異性識別PD-1或CTLA-4之sdAb。在一些實施例中，第二抗體部分為Fab。在一些實施例中，第二抗體部分為scFv。在一些實施例中，第二抗體部分為由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體。在一些實施例中，重鏈之Fc片段為IgG1 Fc、無效應子IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc、或IgG4 Fc(S228P)，諸如SEQ ID NO：363-365中任一者。在一些實施例中，特異性識別PD-1之sdAb部分之N末端融合至全長抗體之重鏈之至少一者之C末端。在一些實施例中，特異性識別PD-1之sdAb部分之C末端融合至全長抗體之重鏈之至少一者之N末端。在一些實施例中，特異性識別PD-1之sdAb部分之N末端融合至全長抗體之輕鏈之至少一者之C末端。在一些實施例中，特異性識別PD-1之sdAb部分之C末端融合至全長抗體之輕鏈之至少一者之N末端。在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體包含四個一致的如上文所述之特異性識別PD-1之sdAb部分，各抗PD-1 sdAb部分之C末端經由視情況選用之肽連接子融合至全長抗體之各鏈之N末端。在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體包含四個一致的如上文所述之特異性識別PD-1之sdAb部分，兩個抗PD-1 sdAb部分經由視情況選用之肽連接子彼此融合，其他兩個抗PD-1 sdAb部分經由視情況選用之肽連接子彼此融合，且各抗PD-1 sdAb部分融合多肽之C末端經由視情況選用之肽連接子融合至全長抗體之各重鏈之N末端。在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)VL-CL；(2)抗PD-1 sdAb-VH-CH1-CH2-CH3；(3)抗PD-1 sdAb-VH-CH1-CH2-CH3；及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第一複本的抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗 PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第二複本的抗原結合位點，且各抗PD-1 sdAb特異性結合PD-1之複本。在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3-抗PD-1 sdAb；(3)VH-CH1-CH2-CH3-抗PD-1 sdAb；及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第一複本的抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第二複本的抗原結合位點，且各抗PD-1 sdAb特異性結合PD-1之複本。在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)抗PD-1 sdAb-VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；及(4)抗PD-1 sdAb-VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第一複本的抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第二複本的抗原結合位點，且各抗PD-1 sdAb特異性結合PD-1之複本。在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)VL-CL-抗PD-1 sdAb；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；及(4)VL-CL-抗PD-1 sdAb，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第一複本的抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1 (諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第二複本的抗原結合位點，且各抗PD-1 sdAb特異性結合PD-1之複本。在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)抗PD-1 sdAb-VL-CL；(2)抗PD-1 sdAb-VH-CH1-CH2-CH3；(3)抗PD-1 sdAb-VH-CH1-CH2-CH3；及(4)抗PD-1 sdAb-VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第一複本的抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第二複本的抗原結合位點，且各抗PD-1 sdAb特異性結合PD-1之複本。在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)VL-CL；(2)抗PD-1 sdAb-抗PD-1 sdAb-VH-CH1-CH2-CH3；(3)抗PD-1 sdAb-抗PD-1 sdAb-VH-CH1-CH2-CH3；及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第一複本的抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第二複本的抗原結合位點，且各抗PD-1 sdAb特異性結合PD-1之複本。在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-抗PD-1 sdAb-CH2-CH3；(3)VH-CH1-抗PD-1 sdAb-CH2-CH3；及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第一複本的抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之 VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第二複本的抗原結合位點，且各抗PD-1 sdAb特異性結合PD-1之複本。在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體由四條多肽鏈組成，其各自結構自N末端至C末端係如下：VL-VH-抗PD-1 sdAb-CH2-CH3，其中各多肽鏈之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之複本的抗原結合位點，且各抗PD-1 sdAb特異性結合PD-1之複本。在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)VL-CL-抗PD-1 sdAb-CL；(2)VH-CH1-抗PD-1 sdAb-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-抗PD-1 sdAb-CH1-CH2-CH3；及(4)VL-CL-抗PD-1 sdAb-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第一複本的抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之第二複本的抗原結合位點，且各抗PD-1 sdAb特異性結合PD-1之複本。在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)抗PD-1 sdAb-CL；(2)VL-VH-抗PD-1 sdAb-CH1-CH2-CH3；(3)VL-VH-抗PD-1 sdAb-CH1-CH2-CH3；及(4)抗PD-1 sdAb-CL，其中多肽鏈(2)及(3)之VH及VL各自形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位))之複本的scFv，且各抗PD-1 sdAb特異性結合PD-1之複本。在一些實施例中，全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)特異性識別TIGIT。在一些實施例中，抗TIGIT全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部 分)包含：VH，其包含有包含SEQ ID NO：377之胺基酸序列之重鏈之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3；及VL，其包含有包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之輕鏈之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，抗TIGIT全長抗體包含有包含SEQ ID NO：377之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，特異性識別TIGIT之全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)衍生自替拉古單抗(tiragolumab)。在一些實施例中，全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)特異性識別LAG-3。在一些實施例中，抗LAG-3全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)包含：VH，其包含有包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列之重鏈之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3；及VL，其包含有包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之輕鏈之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，抗LAG-3全長抗體包含有包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，特異性識別LAG-3之全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)衍生自瑞拉里單抗(relatlimab)。在一些實施例中，全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)特異性識別TIM-3。在一些實施例中，抗TIM-3全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)包含：VH，其包含有包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列之重鏈之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3；及VL，其包含有包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之輕鏈之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，抗TIM-3全長抗體包含有包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，特異性識別TIM-3之全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)衍生自MBG453。在一些實施例中，全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)特異性識別CTLA-4。在一些實施例中，抗CTLA-4全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)包含：VH，其包含有包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列之重鏈之HC-CDR1、 HC-CDR2、及HC-CDR3；及VL，其包含有包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之輕鏈之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，抗CTLA-4全長抗體包含有包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，特異性識別TIM-4之全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)衍生自伊匹單抗(Ipilimumab)(例如，Yervoy®)。在一些實施例中，全長抗體(或包含H及VL之抗原結合部分)特異性識別PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位)。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)包含：VH，其包含有包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列之重鏈之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3；及VL，其包含有包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之輕鏈之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體包含有包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，特異性識別PD-1之全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)衍生自派姆單抗(Pembrolizumab)(例如，Keyruda®)或納武單抗(nivolumab)(例如，Opdivo®)。
在根據上文所述之任一經單離抗PD-1構築體之一些實施例中，經單離抗PD-1構築體進一步包含生物活性蛋白或其片段。
進一步提供一種經單離抗PD-1構築體，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分，其中該sdAb部分包含SEQ ID NO：289-324中任一者之CDR1、CDR2、及CDR3。
進一步提供一種經單離抗PD-1構築體(例如，抗PD-1 sdAb、抗PD-1 HCAb(例如，抗PD-1 sdAb-Fc融合物)、PD-1×TIGIT BABP、PD-1×LAG-3 BABP、PD-1×TIM-3 BABP、PD-1×CTLA-4 BABP、或PD-1×PD-1 BABP)，其以與上文所述之經單離抗PD-1構築體競爭之方式特異性結合PD-1。
進一步提供一種醫藥組成物，其包含上文所述之任一經單離抗PD-1構築體及視情況醫藥學上可接受之載劑。
本申請案之另一態樣提供一種治療患有PD-1相關疾病(諸如癌症或免疫相關疾病)之個體之方法，其包含向該個體投與有效量上文所述之任一醫藥組成物。在一些實施例中，PD-1相關疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為實體腫瘤，諸如結腸癌。在一些實施例中，PD-1相關疾病為免疫相關疾病。在一些實施例中，免疫相關疾病與T細胞功能不良病症相關。在一些實施例中，T細胞功能不良病症之特徵在於T細胞無反應(anergy)或分泌細胞介素、增殖、或執行細胞溶解活性之能力降低。在一些實施例中，T細胞功能不良病症之特徵在於T細胞耗竭(exhaustion)。在一些實施例中，免疫相關疾病選自由以下組成之群：未解決之急性感染、慢性感染、及腫瘤免疫性。在一些實施例中，PD-1相關疾病為病原性感染。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投與額外療法(例如，癌症療法)，諸如手術、放射、化療、免疫療法、激素療法、或其組合。在一些實施例中，額外療法為免疫療法。在一些實施例中，免疫療法包含向該個體投與有效量第二醫藥組成物，該醫藥組成物包含免疫調節劑，諸如免疫檢查點抑制劑(例如，特異性識別TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1、或PD-L1之抗體)。在一些實施例中，醫藥組成物係全身投與，諸如靜脈內(i.v.)或腹膜內(i.p.)投與。在一些實施例中，醫藥組成物係局部投與，諸如腫瘤內投與。在一些實施例中，個體為人類。
進一步提供一種經單離核酸，其編碼上文所述之任一經單離抗PD-1構築體。在一些實施例中，經單離核酸包含SEQ ID NO：253-288中任一者之核酸序列。
進一步提供一種載體，其包含上文所述之任一經單離核酸。
進一步提供一種經單離宿主細胞，其包含上文所述之任一經單離核酸或載體。
進一步提供一種套組，其包含上文所述之任一經單離抗PD-1構築體、經單離核酸、載體、或經單離宿主細胞。
本申請案之另一態樣提供一種產生上文所述之任一經單離抗PD-1構築體之方法，其包含在有效表現經編碼抗PD-1構築體之條件下培養包含上文所述之任一經單離核酸或載體之宿主細胞，或培養上文所述之任一經單離宿主細胞；及自該宿主細胞獲得經表現抗PD-1構築體。在一些實施例中，該方法進一步包含產生包含上文所述之任一經單離核酸或載體之宿主細胞。
圖1A-1B描繪在PD-1免疫之後第一駱駝之反應評估。圖1A描繪免疫前血清及第6次免疫之後第一駱駝之免疫血清之免疫反應評估。圖1B描繪第6次免疫之後重鏈抗體(IgG2及IgG3)之免疫反應評估(末梢采血)。將自免疫前血清分級之重鏈抗體用作陰性對照。
圖2A-2B描繪在PD-1免疫之後第二駱駝之反應評估。圖2A描繪免疫前血清及第6次免疫之後第二駱駝之免疫血清之免疫反應評估。圖2B描繪第6次免疫之後重鏈抗體(IgG2及IgG3)之免疫反應評估(末梢采血)。將自免疫前血清分級之重鏈抗體用作陰性對照。
圖3A-3F描繪藉由表面電漿共振量測之所選六頭駱駝sdAb之親和力。k on 、k off 、及KD值概述於圖3G中。
圖4A-4B描繪所生成sdAb與人類PD-1表現細胞之結合親和力。圖4A描繪藉由流動式細胞測量術之AS06962 sdAb、AS07424 sdAb、及A31543 sdAb與人類PD-1表現細胞之結合。EC50資料概述於圖4B中。
圖5A-5B描繪藉由流動式細胞測量術量測之所生成sdAb之配體競爭活性評估。圖5A描繪使用PD-L1 Fc配體及PD-1表現細胞株的，藉由流動式細胞測量術量測之AS06962 sdAb及A31543 sdAb之配體競爭活性評估。將Keytruda®用作陽性抗PD-1對照抗體。IC50概述於圖5B中。
圖6B-6L描繪藉由表面電漿共振量測之所生成駱駝HCAb之親和力。將Keytruda®用作陽性抗PD-1對照抗體(圖6K)。k on 、k off 、及KD參數概述於圖6A中。
圖7A-7X描繪藉由流動式細胞測量術之所生成駱駝HCAb與人類PD-1表現細胞之結合能力。圖7A-7V描繪所生成駱駝HCAb與人類PD-1表現細胞之基於FACS之結合。將Keytruda®用作陽性抗PD-1對照抗體(圖7W)。EC50概述於圖7X中。
圖8A-8X描繪藉由流動式細胞測量術量測之所生成駱駝HCAb之配體競爭活性評估。圖8A-8V描繪使用PD-L1 Fc配體及PD-1表現細胞株之所生成駱駝HCAb之基於FACS之配體競爭檢定。將Keytruda®用作陽性抗PD-1對照抗體(圖8W)。IC50概述於圖8X中。
圖9A-9H描繪藉由NFAT誘導螢光素酶報導子活性量測之所生成駱駝HCAb之生物活性評估。圖9A-9F描繪在PD-1效應細胞及PD-L1細胞孵育期間，在所生成駱駝HCAb存在下，自IL-2啟動子之通過NFAT反應元件的RLU誘導。將Keytruda®用作陽性抗PD-1對照抗體(圖9G)。EC50概述於圖9H中。
圖10A-10C描繪藉由混合淋巴球反應(MLR)檢定之駱駝HCAb AS15140_HCAb、AS15156_HCAb、及AS15193_HCAb之功能活性評估。將Keytruda®用作陽性抗PD-1對照抗體(圖10D)。EC50概述於圖10E中。
圖11描繪親體AS15193 sdAb、其對應的四種人源化變型、及人類接受者之序列比對。
圖12A-12E描繪藉由表面電漿共振之四種人源化HCAb(圖12B-12E)及親體HCAb(AS15193_HCAb，圖12A)之親和力。k on 、k off 、及KD值概述於圖12F中。
圖13A-13E描繪四種人源化HCAb(圖13B-13E)及親體HCAb(AS15193_HCAb，圖13A)與人類PD-1表現細胞之結合親和力。EC50概述於圖13F中。
圖14A-14F描繪藉由流動式細胞測量術量測之四種人源化HCAb之配體競爭活性評估。圖14B-14E描繪使用PD-L1-Fc配體及PD-1表現細胞株之人源化HCAb之基於FACS之配體競爭檢定。將親體HCAb AS15193_HCAb用作陽性抗PD-1對照抗體(圖14A)。IC50概述於圖14F中。
圖15A-15F描繪藉由NFAT誘導螢光素酶報導子活性所量測之四種人源化HCAb及其親體HCAb之生物活性評估。圖15B-15E描繪在PD-1效應細胞及PD-L1細胞孵育期間，在人源化HCAb存在下，自IL-2啟動子之通過NFAT反應元件的RLU誘導。將親體HCAb AS15193_HCAb用作陽性抗PD-1對照抗體(圖15A)。EC50概述於圖15F中。
圖16描繪示範性BABP之示意性結構，示範性BABP包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體及兩個相同抗PD-1 sdAb，其中各抗PD-1 sdAb之C末端經由視情況選用之肽連接子融合至一條重鏈之N末端。兩個抗PD-1 sdAb特異性結合第一表位(PD-1)。全長抗體具有兩個特異性結合第二表位之抗原結合位點。例如，BABP可由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)VL-CL；(2)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第二複本之抗原結合位點，且各VHH特異性結合第一表位之 複本(PD-1)。在替代形式中，各抗PD-1 sdAb可省略，或經兩個相同或不同的彼此融合的抗PD-1 sdAb置換。單特異性全長抗體可經雙特異性全長抗體置換以進一步擴大結合特異性。
圖17描繪示範性BABP之示意性結構，示範性BABP包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體及兩個相同抗PD-1 sdAb，其中各抗PD-1 sdAb之N末端經由視情況選用之肽連接子融合至一條重鏈之C末端。兩個抗PD-1 sdAb特異性結合第一表位(PD-1)。全長抗體具有兩個特異性結合第二表位之抗原結合位點。例如，BABP可由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3-VHH；(3)VH-CH1-CH2-CH3-VHH；及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第二複本之抗原結合位點，且各VHH特異性結合第一表位之複本(PD-1)。在替代形式中，各抗PD-1 sdAb可省略，或經兩個相同或不同的彼此融合的抗PD-1 sdAb置換。單特異性全長抗體可經雙特異性全長抗體置換以進一步擴大結合特異性。
圖18描繪示範性BABP之示意性結構，示範性BABP包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體及兩個相同抗PD-1 sdAb，其中各抗PD-1 sdAb之C末端經由視情況選用之肽連接子融合至一條輕鏈之N末端。兩個抗PD-1 sdAb特異性結合第一表位(PD-1)。全長抗體具有兩個特異性結合第二表位之抗原結合位點。例如，BABP可由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)VHH-VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；及(4)VHH-VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第二複本之抗原結合位點，且各VHH特異性結合第一表位之複本(PD-1)。在替 代形式中，各抗PD-1 sdAb可省略，或經兩個相同或不同的彼此融合的抗PD-1 sdAb置換。單特異性全長抗體可經雙特異性全長抗體置換以進一步擴大結合特異性。
圖19描繪示範性BABP之示意性結構，示範性BABP包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體及兩個相同抗PD-1 sdAb，其中各抗PD-1 sdAb之N末端經由視情況選用之肽連接子融合至一條輕鏈之C末端。兩個抗PD-1 sdAb特異性結合第一表位。全長抗體具有兩個特異性結合第二表位之抗原結合位點。例如，BABP可由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)VL-CL-VHH；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；及(4)VL-CL-VHH，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第二複本之抗原結合位點，且各VHH特異性結合第一表位之複本(PD-1)。在替代形式中，各抗PD-1 sdAb可省略，或經兩個相同或不同的彼此融合的抗PD-1 sdAb置換。單特異性全長抗體可經雙特異性全長抗體置換以進一步擴大結合特異性。
圖20描繪示範性BABP之示意性結構，示範性BABP包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體及四個相同抗PD-1 sdAb，其中各抗PD-1 sdAb之C末端經由視情況選用之肽連接子融合至單特異性全長抗體之重鏈或輕鏈之N末端。各抗PD-1 sdAb特異性結合第一表位(PD-1)。全長抗體具有兩個各自特異性結合第二表位之抗原結合位點。例如，BABP可由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)VHH-VL-CL；(2)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；及(4)VHH-VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第二複本之抗原結合位點，且各VHH特異性結合第一表位之複本(PD-1)。在替代形式中，各抗PD-1 sdAb 可省略，或經兩個相同或不同的彼此融合的抗PD-1 sdAb置換。單特異性全長抗體可經雙特異性全長抗體置換以進一步擴大結合特異性。
圖21描繪示範性BABP之示意性結構，該示範性BABP包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體及四個相同抗PD-1 sdAb，其中兩個相同抗PD-1 sdAb融合至各重鏈之N末端，兩個抗PD-1 sdAb經由視情況選用之肽連接子彼此融合，且兩個抗PD-1 sdAb經由視情況選用之肽連接子融合至各重鏈之N末端。各抗PD-1 sdAb特異性結合第一表位(PD-1)。全長抗體具有兩個各自特異性結合第二表位之抗原結合位點。例如，BABP可由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)VL-CL；(2)VHH-VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VHH-VH-CH1-CH2-CH3；及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第二複本之抗原結合位點，且各VHH特異性結合第一表位之複本(PD-1)。在替代形式中，各抗PD-1 sdAb可省略，或經兩個相同或不同的彼此融合的抗PD-1 sdAb置換。單特異性全長抗體可經雙特異性全長抗體置換以進一步擴大結合特異性。
圖22描繪示範性BABP之示意性結構，該示範性BABP包含兩個相同的抗原結合(Fab)片段、兩個相同的抗PD-1 sdAb、及Fc區，其中各抗PD-1 sdAb之N末端經由視情況選用之肽連接子融合至Fab片段之CH1區之C末端，且各抗PD-1 sdAb之C末端融合至Fc區之CH2區之N末端。各抗PD-1 sdAb特異性結合第一表位(PD-1)。各Fab片段特異性結合第二表位。例如，BABP可由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-VHH-CH2-CH3；(3)VH-CH1-VHH-CH2-CH3；及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第二複本之抗原結合位點，且各 VHH特異性結合第一表位之複本(PD-1)。在替代形式中，各抗PD-1 sdAb可省略，或經兩個相同或不同的彼此融合的抗PD-1 sdAb置換。在替代形式中，為了擴大特異性，兩個Fab片段可特異性結合不同表位，及/或VHH片段可特異性結合不同表位。
圖23描繪示範性BABP之示意性結構，該示範性BABP包含兩個相同的單鏈可變片段(scFv)、兩個相同的抗PD-1 sdAb、及Fc區，其中各抗PD-1 sdAb之N末端經由視情況選用之肽連接子融合至scFv之C末端，且各抗PD-1 sdAb之C末端融合至Fc區之N末端。各抗PD-1 sdAb特異性結合第一表位(PD-1)。各scFv特異性結合第二表位。例如，BABP可由兩條多肽鏈組成，其各自結構自N末端至C末端係如下：VL-VH-VHH-CH2-CH3，其中各多肽鏈之VH及VL形成特異性結合第二表位之複本之scFv域，且各VHH特異性結合第一表位之複本(PD-1)。在替代形式中，scFv域可自N末端至C末端包含：VH-VL。在替代形式中，各抗PD-1 sdAb可省略，或經兩個相同或不同的彼此融合的抗PD-1 sdAb置換。另外，為了擴大特異性，兩個scFvs可特異性結合不同表位，及/或VHH片段可特異性結合不同表位。
圖24描繪示範性BABP之示意性結構，該示範性BABP包含兩個相同的Fab片段、各自包含兩個VHH片段之兩個相同的Fab樣片段、及Fc區。在各Fab樣片段中，VH及VL區各自由抗PD-1 sdAb置換。各Fab樣片段特異性結合第一表位(PD-1)。各Fab片段特異性結合第二表位。例如，BABP可由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)VL-CL-VHH-CL；(2)VH-CH1-VHH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-VHH-CH1-CH2-CH3；及(4)VL-CL-VHH-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二表位之第二複本之抗原結合位點，且各VHH特異性結合第一表位之複本(PD-1)。在替代 形式中，為了擴大特異性，兩個Fab片段可特異性結合不同表位，及/或Fab樣片段可特異性結合不同表位(例如，與PD-1不同之表位)。
圖25描繪示範性BABP之示意性結構，該示範性BABP包含兩個相同的scFv、各自包含兩個VHH片段之兩個相同的Fab樣片段、及Fc區。在各Fab樣片段中，VH及VL區各自由抗PD-1 sdAb置換。各Fab樣片段特異性結合第一表位(PD-1)。各scFv特異性結合第二表位。例如，BABP可由四條多肽鏈組成，其中結構自N末端至C末端係如下：(1)VHH-CL；(2)VL-VH-VHH-CH1-CH2-CH3；(3)VL-VH-VHH-CH1-CH2-CH3；及(4)VHH-CL，其中多肽鏈(2)及(3)之VH及VL各自形成特異性結合第二表位之複本之scFv，且各VHH特異性結合第一表位之複本(PD-1)。在替代形式中，scFv之C末端可融合至包含VHH-CL之Fab樣片段中之鏈之N末端；及/或scFv域可自N末端至C末端包含：VH-VL。另外，為了擴大特異性，兩個scFvs可特異性結合不同表位，及/或VHH片段可特異性結合不同表位(例如，與PD-1不同之表位)。
圖26A-26B描繪示範性抗PD-1 HCAb之示意性結構。圖26A描繪示範性單特異性二價抗PD-1 HCAb之示意性結構。圖26B描繪示範性雙特異性二價抗PD-1 HCAb之示意性結構。
圖27描繪兩種人源化HCAb AS15193VH8M1_HCAb及AS15193VH18M1_HCAb之體內功效研究。
圖28描繪所選sdAb之純化概要。
圖29描繪所選HCAb之純化概要。
相關申請案之交互參照
本申請案主張2018年1月15日提交之國際專利申請案第PCT/CN2018/072589號之優先權權益，其內容以全文引用之方式併入本文。
呈ASCII文本檔案形式之序列表之提交
呈ASCII文本檔案形式之以下提交之內容以全文引用之方式併入本文：序列表之電腦可讀形式(CRF)(檔案名稱：761422000840SEQLIST.txt，記錄日期：2018年1月14日，大小：271KB)。
本發明提供新穎的特異性識別PD-1之sdAb(下文亦稱為「抗PD-1 sdAb」)及其抗體變異體(例如，包含抗PD-1 sdAb之較大蛋白或多肽，諸如抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，抗PD-1 HCAb)，融合至全長抗體、Fab、或scFv之抗PD-1 sdAb，或包含抗PD-1 sdAb之多特異性抗原結合蛋白(MABP，諸如雙特異性抗原結合蛋白(BABP))、用於治療PD-1相關疾病(諸如癌症)之用途、及其製備方法。
sdAb因具有單個單體抗體可變域(諸如重鏈可變域(VHH))而與習知4鏈抗體不同，其可不藉助於輕鏈而表現出與抗原之高親和力。已知駱駝VHH為最小的功能性抗原結合片段，分子量為大約15kDa。
據此，本申請案之一個態樣提供一種經單離抗PD-1構築體，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分。經單離抗PD-1構築體可為例如抗PD-1 sdAb(例如自然、人源化、或人類抗PD-1 sdAb)、包含多種融合在一起的本文所述之抗PD-1 sdAb之多肽、包含融合至Fc片段(例如，人類IgG1 Fc、無效應子(惰性)hIgG1 Fc、hIgG4 Fc、或hIgG4 Fc(S228P))之本文所述之抗PD-1 sdAb之抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，抗PD-1 HCAb)、或包含融合至全長抗體(諸如，特異性識別TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、或PD-1(例如，與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別者不同的第二PD-1表位)之抗體)或其包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)抗原結合片段之MABP。抗PD-1構築體可具有單特異性或多特異性(諸如雙特異性)，為單價或多價(諸如二價)。
亦提供包含本文所述之抗PD-1構築體之組成物(諸如醫藥組成物)、套組、及製品，其製備方法，及使用本文所述之抗PD-1構築體治療PD-1相關疾病(諸如癌症)之方法。
I.定義
術語「表位」意謂能夠特異性結合抗體之蛋白決定位。表位通常由分子之化學活性表面分組組成，諸如胺基酸或糖側鏈，且通常具有特定三維結構特徵以及特呂電荷特徵。構象及非構象表位之區別在於，在變性溶劑存在下，喪失與前者之結合而未喪失與後者之結合。
如本文所用，「治療(treatment)」或「治療(treating)」為用於獲得有利或所要結果(包括臨床結果)之方法。出於本發明之目的，有利或所要臨床結果包括但不限於以下之一或多種：減輕由疾病引起之一或多種症狀；削弱疾病之程度；穩定疾病(例如，預防或延遲疾病之惡化)；預防或延遲疾病之蔓延(例如，轉移)；預防或延遲疾病之復發；延遲或減緩疾病之進展；改善疾病狀態；提供疾病之緩解(部分或全部)；減少治療疾病所需之一或多種其他藥物之劑量；延遲疾病之進展；提高生活品質；及/或延長存活。「治療」亦涵蓋減少癌症之病理學後果。本發明之方法考慮此等治療態樣中任一或多者。
術語「預防(prevent)」及其類似詞語諸如「預防(prevented)」、「預防(preventing)」等指示用於預防、抑制疾病或病狀(例如癌症)、或減少其復發可能性之方法。其亦關於延遲疾病或病狀復發、或延遲疾病或病狀之症狀復發。如本文所用，「預防(prevention)」及類似詞語亦包括在疾病或病狀復發之前減少疾病或病狀之強度、效果、症狀、及/或負荷。
如本文所用，「延遲」癌症之發展意謂推遲、阻礙、減緩、減慢、穩定、及/或延後疾病之發展。此延遲可為不同時間長度，其取決於病史及/或正治療的個體。「延遲」癌症之發展的方法為與不使用該方法相比較，在給定時 段內減少疾病發展之機率及/或在給定時段內減少疾病之程度的方法。此類比較通常係基於臨床研究，使用統計學顯著數量的個體。癌症發展可使用標準方法偵測，包括但不限於電腦斷層掃描(CAT掃描)、磁振造影(MRI)、腹部超音波、凝結測試、動脈攝影、或生檢。發展亦可指代最初不可偵測的癌症進展且包括發生、復發、及發作。
本文所用之術語「有效量」係指足以治療指定病症、病狀、或疾病諸如改善、緩和、減輕、及/或延遲其症狀中一或多種的藥劑或藥劑組合之量。關於癌症，有效量包含足以引起腫瘤縮小及/或降低腫瘤生長速率(諸如抑制腫瘤生長)或預防或延遲其他不需要的細胞增殖之量。在一些實施例中，有效量為足以延遲發展之量。在一些實施例中，有效量為足以預防或延遲復發之量。有效量可以一或多次投與之形式投與。有效量藥物或組成物可：(i)減少癌細胞數量；(ii)減小腫瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、減慢、減緩並較佳阻止癌細胞浸潤至外周器官中；(iv)抑制(即，在一定程度上減緩並較佳阻止)腫瘤轉移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)預防或延遲腫瘤發生及/或復發；及/或(vii)在一定程度上緩解與癌症相關之一或多種症狀。
如本文所用，「個體」或「受試者」係指哺乳動物，包括但不限於人類、牛、馬、貓、犬、齧齒動物、或靈長類動物。在一些實施例中，個體為人類。
術語「抗體」、「抗原結合部分」、或「抗體部分」以其最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、全長抗體、及其抗原結合片段，只要其表現出所要抗原結合活性即可。
基本的4鏈抗體單元為由兩條一致輕(L)鏈及兩條一致重(H)鏈組成之異四聚醣蛋白。IgM抗體由5個基本的四聚體單元連同稱為J鏈之額外肽組 成，而IgA抗體包含2-5個基本的4鏈單元，該等單元可聚合以與J鏈組合之形式形成多價裝配物。在IgG之情況下，4鏈單元一般為約150,000道耳頓。各L鏈藉由一個共價二硫鍵連接H鏈，而兩條H鏈藉由一或多個二硫鍵(其取決於H鏈同型)彼此連接。各H鏈及L鏈亦具有規則隔開的鏈內二硫橋。各H鏈在N末端具有可變域(VH)，接著對於α及γ鏈之各者而言為三個恆定域(CH)，且對於μ及ε同型而言為四個CH域。各L鏈在N末端具有可變域(VL)，接著在其另一端為恆定域。VL與VH對齊，且CL與重鏈之第一恆定域(CH1)對齊。據信具體胺基酸殘基形成輕鏈可變域與重鏈可變域之間的界面。將VH及VL配對在一起形成單一抗原結合位點。不同類別抗體之結構及性質參見例如Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Sties,Abba I.Terr及Tristram G.Parsolw(編)，Appleton & Lange,Norwalk,Conn.,1994，第71頁及第6章。來自任何脊椎動物物種之L鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種截然不同類型(稱為κ及λ)之一。取決於其重鏈恆定域(CH)之胺基酸序列，免疫球蛋白可歸於不同類別或同型。有五類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，其分別具有稱為α、δ、ε、γ、及μ之重鏈。基於CH序列及功能之相對較小的差異，γ及α類經進一步分成亞類，例如，人類表現以下亞類：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2。
術語「僅重鏈抗體」或「HCAb」係指包含重鏈但缺少一般存在於在4-鏈抗體中之輕鏈的功能性抗體。已知駱駝科動物(例如駱駝、美洲駝、或羊駝)產生HCAb。
術語「單域抗體」或「sdAb」係指具有三個互補決定區(CDR)之單一抗原結合多肽。單獨sdAb能夠在不與對應的含CDR之多肽配對之情況下結合抗原。在一些情況下，單域抗體由駱駝科HCAb工程改造，且其重鏈可變域在本文中稱為「VHH」(重鏈抗體之重鏈之可變域)。駱駝sdAb為已知最小的抗 原結合抗體片段之一(參見例如Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-8(1993)；Greenberg等人，Nature 374：168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人，Nanomedicine(Lond),8：1013-26(2013))。基本的VH自N末端至C末端具有以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分別指代框架區1至4，且其中CDR1至CDR3係指互補決定區1至3。
「經單離」抗體(或構築體)為已鑒別、自其產生環境(例如，天然或重組)之組分單離及/或回收者。較佳地，經單離多肽不與來自其產生環境的所有其他組分締合。其產生環境之污染物組分(諸如得自重組轉染細胞之組分)為通常干擾抗體之研究、診斷、或治療用途的物質，且可包括酶、激素、及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，多肽經純化至：(1)如藉由例如勞里法(Lowry method)所確定之大於95重量%抗體，並且在一些實施例中大於99重量%；(2)足以藉由使用轉杯式測序儀(spinning cup sequenator)獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度；或(3)藉由使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色，在非還原或還原條件下進行之SDS-PAGE至均質。經單離抗體(或構築體)包括原位處於重組細胞內之抗體，因為將不存在抗體之天然環境中之至少一種組分。然而通常，經單離多肽、抗體、或構築體藉由至少一個純化步驟製備。
抗體之「可變區」或「可變域」係指抗體之重鏈或輕鏈之胺基末端域。重鏈及輕鏈之可變域可分別稱為「VH」及「VL」。此等域通常為抗體之最易變部分(相對於相同類別的其他抗體)且含有抗原結合位點。來自駱駝物種之僅重鏈抗體具有單一重鏈可變區，其被稱為「VHH」。因此VHH為一種特殊類型的VH。
術語「可變」係指可變域之某些區段之序列於抗體之間廣泛不同。V域介導抗原結合且界定具體抗體對其具體抗原之特異性。然而，可變性未在可 變域之整個跨度內均勻地分佈。而是，其集中於重鏈及輕鏈可變域中稱為互補決定區(CDR)或超變區(HVR)的三個區段中。可變域之更高保守部分稱為框架區(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變域各自包含四個FR區，其主要採用β-折疊組態，由三個CDR連接，該等CDR形成連接β-折疊結構之環且在一些情況下形成β-折疊結構之一部分。各鏈中之CDR藉由FR區緊密地保持在一起，且與來自另一鏈之CDR一起有助於抗體之抗原結合位點之形成(參見Kabat等人，Sequences of Immunological Interest，第五版，National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恆定域不直接參與抗體與抗原之結合，但表現出各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上均質的抗體群體獲得之抗體，即，構成該群體之個別抗體除了可以微量之形式存在的可能天然存在之突變及/或轉譯後修飾(例如，異構化、醯胺化)之外為相同的。單株抗體具有高特異性，其針對單一抗原位點。與通常包括針對不同決定位(表位)之不同抗體的多株抗體製劑形成對比，各單株抗體針對抗原上之單一決定位。除了特異性，單株抗體之優勢在於，其藉由融合瘤培養來合成，不受其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體之特性為獲自實質上均質的抗體群體，且不應理解為需要藉由任何具體方法來產生抗體。例如，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製成，包括例如融合瘤方法(例如，Kohler及Milstein.,Nature,256：495-97(1975)；Hongo等人，Hybridoma,14(3)：253-260(1995)；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))；重組DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號)；噬菌體顯示技術(參見例如Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)； Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methoas 284(1-2)：119-132(2004))；及用於在具有編碼人類免疫球蛋白序列之部分或全部人類免疫球蛋白基因座或基因的動物中產生人類或人類樣抗體的技術(參見例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.7：33(1993)；美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、及第5,661,016號；Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison,Nature 368：812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14：826(1996)；及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。
術語「全長抗體」、「完整抗體」、或「全抗體」可互換地用於指代以實質上完整形式的抗體，與抗體片段不同。特定言之，全長4鏈抗體包括具有重鏈及輕鏈(包括Fc區)的抗體。全長僅重鏈抗體包括重鏈可變域(諸如VHH)及Fc區。恆定域可為天然序列恆定域(例如，人類天然序列恆定域)或其胺基酸序列變異體。在一些情況下，完整抗體可具有一或多種效應功能。
「抗體片段」或「抗原結合片段」包含完整抗體之一部分，較佳地完整抗體之抗原結合區及/或可變區。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2、及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體(參見美國專利第5,641,870號，實例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995))；單鏈抗體(scFv)分子；單域抗體(諸如VHH)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。抗體之木瓜酶消化產生兩個相同的抗原結合片段(稱為「Fab」片段)及殘餘「Fc」片段(名稱反映易於結晶之能力)。Fab片段由整條L鏈連同H鏈之可變域(VH)及一條重鏈之第一恆定 結構域(CH1)組成。各Fab片段關於抗原結合為單價的，即，其具有單一抗原結合位點。抗體之木瓜酶處理產生單一大型F(ab')2片段，該片段大體上對應於兩個具有不同抗原結合活性的經二硫化物連接Fab片段且仍能夠交聯抗原。Fab'片段因在CH1域之羧基末端處具有少量額外殘基(包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸)而與Fab片段不同。Fab'-SH為本文中恆定域之半胱胺酸殘基攜帶自由硫醇基的Fab'的名稱。F(ab')2抗體片段最初呈其之間具有鉸鏈半胱胺酸的Fab'片段對產生。抗體片段之其他化學偶聯亦為已知的。
術語「恆定域」係指免疫球蛋白分子之以下部分，其相對於該免疫球蛋白之含有抗原結合位點的其他部分(可變域)具有較保守胺基酸序列。恆定域含有重鏈之CH1、CH2、及CH3域(統稱為CH)及輕鏈之CHL(或CL)域。
任何哺乳動物物種之抗體(免疫球蛋白)之「輕鏈」均可基於其恆定域之胺基酸序列而歸為兩種明顯不同類型(稱為卡帕(「κ」)及拉姆達(「λ」))之一。
「Fv」為含有完全抗原識別及結合位點的最小抗體片段。此片段由以緊密、非共價締合之形式的一個重鏈可變區結構域及一個輕鏈可變區結構域的二聚體組成。這兩個域之折疊產生六個高變環(自H鏈及L鏈各自產生3個環)，該等高變環有助於胺基酸殘基之抗原結合且賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變域(或僅包含三個特異於抗原之CDR的半個Fv)具有識別並結合抗原的能力，但是與整個結合位點相比，親和力較低。
「單鏈Fv」(亦縮寫為「sFv」或「scFv」)為包含連接至單一多肽鏈中之VH及VL抗體域的抗體片段。較佳地，scFv多肽進一步包含VH與VL域之間的多肽連接子，該多肽連接子能夠使scFv形成用於抗原結合的所要結構。關於scFv之評述，參見Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。
術語「雙功能抗體」係指以下小型抗體片段，其藉由在VH與VL域之間以短連接子(約5-10個殘基)構築sFv片段(參見前一段落)來製備，使得達成V域之鏈內而非鏈間配對，從而得到二價片段，即具有兩個抗原結合位點之片段。雙特異性抗體為兩個「交叉」sFv片段之異二聚體，其中兩種抗體之VH及VL域存在於不同多肽鏈上。雙功能抗體更詳細地描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。
特定言之，本文中之單株抗體包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與源於具體物種或屬於具體抗體類別或亞類之抗體中對應的序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與源於另一物種或屬於另一抗體類別或亞類之抗體中對應的序列一致或同源，以及該等抗體之片段，只要其表現出所要生物活性即可(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))。「人源化抗體」用作「嵌合抗體」之亞組。
非人類(例如，美洲駝或駱駝)抗體之「人源化」形式為含有源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。在一些實施例中，人源化抗體為以下人類免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自受者CDR(下文經定義)的殘基經具有所需特異性、親和力、及/或能力的來自諸如小鼠、大鼠、兔、駱駝、美洲駝、羊駝、或非人類靈長類動物的非人類物種(供體抗體)CDR之殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之框架區(「FR」)殘基經對應的非人類殘基置換。此外，人源化抗體可包含存在於受者抗體或供體抗體中之殘基。可進行此等修飾以進一步完善抗體性能，諸如結合親和力。通常，人源化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中全部或實質上全部高變環對應於非人類免疫球蛋白序列之高變環，且全部或實質上全部FR區為人類免疫球蛋白序列之FR區，但是FR區可包括一或多處個別FR殘基取代，其改良抗體性能，諸如結合親和力、異構化、免疫原性等。FR中此等胺基酸取代之數目通常在H鏈中不多於6，且 在L鏈中不多於3。人源化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白之恆定區。進一步細節參見例如Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。亦參見例如Vaswani及Hamilton,Ann.Allergy,Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle及Gross,Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)；及美國專利第6,982,321號及第7,087,409號。
「人類抗體」為具有對應於人類所產生之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列及/或已使用如本文所揭示之製備人類抗體之任一技術製成的抗體。此人類抗體定義特定地排除包含非人類抗原結合殘基之人源化抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術產生，包括噬菌體顯示文庫。Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581(1991)。Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，J.Immunol.,147(1)：86-95(1991)中所述之方法亦可用於製備人類單株抗體。亦參見van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5：368-74(2001)。人類抗體可藉由向基因轉殖動物投與抗原來製備，該基因轉殖動物已經修飾以回應於抗原攻擊而產生此類抗體，但其內源基因座已失能，例如經免疫基因轉殖鼠(xenomice)(XENOMOUSETM技術參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號)。經由人類B細胞融合瘤技術生成之人類抗體亦參見例如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)。
本文所用之術語「高變區」、「HVR」、或「HV」係指抗體可變域之在序列方面高度可變及/或形成結構確定環的各區。通常，單域抗體包含三個HVR(或CDR)：HVR1(或CDR1)、HVR2(或CDR2)、及HVR3(或CDR3)。在三個HVR中，HVR3(或CDR3)顯示最大多樣性，且據信其在賦予抗體之良好特 異性方面發揮獨特作用。參見例如Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-448(1993)；Sheriff等人，Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。
術語「互補決定區」或「CDR」用於指代如藉由Kabat系統所定義之高變區。參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。
多個HVR描述在使用中且涵蓋在本文中。Kabat互補決定區(CDR)係基於序列可變性且最常用(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。Chothia替代地提及結構環之位置(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbMHVR表示KabatHVR與Chothia結構環之間的折衷，且係藉由Oxford Molecular的AbM抗體建模軟體來使用。「接觸」HVR係基於可用複合物晶體結構之分析。來自此等HVR中之各者的殘基在以下表1中指出。
HVR可包含如下「延長HVR」：在VL中，24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)、及89-97或89-96(L3)，以及在VH中，26-35(H1)、50-65或49-65(H2)、及93-102、94-102、或95-102(H3)。這些定義中之各者之可變域殘基係根據Kabat等人(出處同上)進行編號。
單域抗體(諸如VHH)之胺基酸殘基係根據Kabat等人給出之VH域之一般編號進行編號(「Sequence of proteins of immunological interest」,US Public Health Services,NIH Bethesda,Md.，公開號91)，如Riechmann及Muyldermans,J.Immunol.Methods,2000年6月，23；240(1-2)：185-195之文章中對來自駱駝科動物之VHH域所應用。根據此編號，VHH之FR1包含在位置1-30處之胺基酸殘基，VHH之CDR1包含在位置31-35處之胺基酸殘基，VHH之FR2包含在位置36-49處之胺基酸，VHH之CDR2包含在位置50-65處之胺基酸殘基，VHH之FR3包含在位置66-94處之胺基酸殘基，VHH之CDR3包含在位置95-102處之胺基酸殘基，且VHH之FR4包含在位置103-113處之胺基酸殘基。在此態樣中應該注意，如針對VH域及VHH域之技術所熟知，各CDR中胺基酸殘基之總數可有所不同，且可不對應於Kabat編號所指示之胺基酸殘基之總數(也就是說，在實際序列中根據Kabat編號之一或多個位置可不經佔據，或實際序列可含有比Kabat編號所允許之數目多的胺基酸殘基)。
表述「如Kabat中的可變域殘基編號」或「如Kabat中的胺基酸位置編號」及其變型係指用於Kabat等人(出處同上)中的抗體編譯之重鏈可變域或輕鏈可變域之編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有較少或額外胺基酸，該等胺基酸對應於可變域之FR或HVR之縮短或對其進行的插入。例如，重鏈可變域可包括H2之殘基52之後的單一胺基酸插入(根據Kabat之殘基52a)及重鏈FR殘基82之後的插入殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b、及82c等)。可藉由將抗體序列中具有同源性之區與「標準」Kabat編號序列比對來判定給定抗體中殘基之Kabat編號。
除非本文另外指示，否則免疫球蛋白重鏈中殘基之編號係如Kabat等人(出處同上)之EU索引之編號。「如Kabat中之EU索引」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。
「框架」或「FR」殘基為除了如本文所定義之HVR殘基以外的那些可變域殘基。
「人類共通框架」或「受體人類框架」為表示人類免疫球蛋白VL或VH框架序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基的框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列選自可變域序列之亞群。通常，序列之亞群為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中之亞群。實例包括對於VL，亞群可為如Kabat等人(出處同上)中之亞群κI、κII、κIII、或κIV。此外，對於VH，亞群可為如Kabat等人中之亞群I、亞群II、或亞群III。可替代地，人類共通框架可來源於上述者，其中具體殘基，諸如當人類框架殘基係基於其與供體框架之同源性藉由將供體框架序列與各種人類框架序列之集合進行比對來選擇時。「來源於」人類免疫球蛋白框架或人類共通框架之接受者人類框架可包含其相同的胺基酸序列，或其可含有預先存在的胺基酸序列變化。在一些實施例中，預先存在的胺基酸變化之數目為10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少、或2個或更少。
「親和力成熟」抗體係在其一或多個CDR中具有一或多個改變而導致抗體對抗原之親和力相較於不具有彼等改變之親本抗體改良的抗體。在一些實施例中，親和力成熟抗體對靶抗原具有奈莫耳或甚至皮莫耳親和力。親和力成熟抗體係藉由此項技術中已知的程序產生。例如，Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)描述藉由VH域及VL域改組之親和力成熟。CDR及/或框架殘基之隨機誘變描述於例如：Barbas等人，Proc Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier等人，Gene 169：147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins等人，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
如本文所用，術語「特異性結合」、「特異性識別」、或「特異於」係指可量測且可再現的相互作用，諸如靶標與抗原結合蛋白(諸如sdAb)之間的結合，該結合在存在包括生物分子的分子的異質群體的情況下確定靶標的存在。例如，特異性結合靶標(其可為表位)之抗原結合蛋白(諸如sdAb)為係與其結合其他靶標相比，以較大親和力、親合力、較容易、及/或以較長持續時間結合該靶標的抗原結合蛋白(諸如sdAb)。在一些實施例中，抗原結合蛋白(諸如sdAb)與不相關靶標之結合程度係抗原結合蛋白(諸如sdAb)與靶標之結合的小於約10%，例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在一些實施例中，特異性結合靶標之抗原結合蛋白(諸如sdAb)具有10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、或10-12M之解離常數(Kd)。在一些實施例中，抗原結合蛋白特異性結合在來自不同物種的蛋白中保守的蛋白上的表位。在一些實施例中，特異性結合可包括但不需要專一性結合。抗體或抗原結合域之結合特異性可藉由此項技術中已知之方法以實驗方式確定。此類方法包含但不限於西方墨點法、ELISA測試、RIA測試、ECL測試、IRMA測試、EIA測試、BIAcore測試、及肽掃描。
術語「特異性」係指抗原結合蛋白(諸如sdAb)對抗原之具體表位的選擇性識別。例如，天然抗體具有單特異性。如本文所用之術語「多特異性」表示抗原結合蛋白具有多表位特異性(即，能夠特異性結合一種生物分子上之兩種、三種、或更多種不同表位或能夠特異性結合兩種、三種、或更多種不同生物分子上之表位)。如本文所用之「雙特異性」表示抗原結合蛋白具有兩種不同的抗原結合特異性。除非另外指示，否則所列出之雙特異性抗體所結合之抗原之順序係任意的。也就是說，例如，術語「抗TIGIT/PD-1」、「抗PD-1/TIGIT」、「TIGIT×PD-1」、「PD-1×TIGIT」、「PD-1/TIGIT」、「TIGIT/PD-1」、「PD-1-TIGIT」、及「TIGIT-PD-1」可互換地用於指代特異性結合TIGIT及PD-1之雙特異性抗體。 如本文所用之術語「單特異性」表示具有一或多個結合位點之抗原結合蛋白(諸如sdAb)，各結合位點結合相同抗原之相同表位。
如本文所用之術語「價」表示抗原結合蛋白中指定數目的結合位點之存在。例如天然抗體或全長抗體具有兩個結合位點且係二價的。因此，術語「三價」、「四價」、「五價」、及「六價」分別表示抗原結合蛋白中兩個結合位點、三個結合位點、四個結合位點、五個結合位點、及六個結合位點之存在。
「抗體效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異體Fc區)的彼等生物活性，且隨抗體同型而有所不同。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。「減少或最小化的」抗體效應功能意謂其自野生型或未經修飾之抗體減少至少50%(可替代地60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%)。一般熟習此項技術者可易於確定及量測抗體效應功能之確定。在較佳實施例中，補體結合、補體依賴性細胞毒性、及抗體依賴性細胞毒性之抗體效應子功能受到影響。在一些實施例中，效應子功能通過恆定區中消除醣化的突變(例如「無效應子突變」)而經消除。在一個態樣中，無效應子突變為CH2區中之N297A或DANA突變(D265A+N297A)。Shields等人，J.Biol.Chem.276(9)：6591-6604(2001)。可替代地，導致減少或消除效應功能的額外突變包括：K322A及L234A/L235A(LALA)。可替代地，效應功能可通過生產技術來減少或消除，諸如在不醣化的宿主細胞(例如，大腸桿菌(E.coli.))中之表現或以導致醣化模式改變成在促進效應功能時無效或不太有效的方式(例如Shinkawa等人，J.Biol.Chem.278(5)：3466-3473(2003))。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或ADCC係指一種細胞毒性形式，其中結合至某些細胞毒性細胞(例如，自然殺傷(NK)細胞、嗜中性球、及巨噬細胞)上存在之Fc受體(FcR)上的分泌Ig使得此等細胞毒性效應細胞能夠與攜帶抗原之靶細胞特異性結合並隨後以細胞毒素殺傷靶細胞。抗體「武裝」細胞毒性細胞且為藉由此機制殺傷靶細胞所需的。用於介導ADCC的初級細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII、及FcγRIII。造血細胞上之Fc表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)之第464頁之表2中。為了評估所關注之分子之ADCC活性，可執行體外ADCC檢定，諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中所述。用於此類檢定之有用效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。可替代地或此外，可例如在動物模型(諸如Clynes等人，PNAS USA 95：652-656(1998)中所揭示之動物模型)中體內評估所關注之分子之ADCC活性。
本文中之術語「Fc區」或「片段可結晶區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C末端區，包括天然序列Fc區及變異體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可有所不同，但人類IgG重鏈Fc區通常定義成從在位置Cys226處的胺基酸殘基或從Pro230伸長至其羧基末端。Fc區之C末端離胺酸(根據EU編號系統之殘基447)可例如在抗體之產生或純化期間，或藉由重組工程改造編碼抗體之重鏈的核酸來移除。據此，完整抗體之組成物可包含所有K447均移除之抗體群體、無K447殘基移除之抗體群體、及具有帶有或不帶有K447殘基之抗體之混合物之抗體群體。用於本文所述之抗體中的合適的天然序列Fc區包括人類IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3、及IgG4。
「Fc受體」或「FcR」描述結合抗體Fc區之受體。較佳FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII、及FcγRIII亞類之受體(包括此等受質之等位基因變異體及替代剪接形式)的 FcR，FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，其具有主要在其細胞質結構域中不同的類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制模體(ITIM)。(參見M.Daëron,Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR評述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中。其他FcR(包括將來欲鑒別之FcR)在本文中藉由術語「FcR」來涵蓋。
術語「Fc受體」或「FcR」亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒。Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994)。量測與FcRn結合之方法為已知的(參見例如Ghetie及Ward,Immunol.Today 18：(12)：592-8(1997)；Ghetie等人，Nature Biotechnology 15(7)：637-40(1997)；Hinton等人，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人))。可以例如在表現人類FcRn之基因轉殖小鼠或轉染人類細胞株中或者在投與具有變異體Fc區之多肽的靈長類動物中檢定體內與FcRn之結合及人類FcRn高親和力結合多肽之血清半衰期。WO 2004/42072(Presta)描述改良或減弱與FcR之結合的抗體變異體。亦參見例如Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指靶細胞在補體存在下之溶解。經典補體路徑之活化係藉由補體系統之第一組分(C1q)與結合其同源抗原的(適當亞類的)抗體之結合來起始。為了評估補體活化，可執行CDC檢定，例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。Fc區胺基酸序列改變及C1q結合能力增加或減小的抗體變異體描述於美國專利第 6,194,551B1號及WO99/51642中。該等專利公開案之內容明確以引用之方式併入本文。亦參見Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
「結合親和力」通常係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總強度。除非另外指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對成員之間的1：1相互作用的固有結合親和力。結合親和力可藉由Kd、K off 、K on 、或Ka指示。如本文所用，術語「K off 」意欲指代抗體(或抗原結合域)從抗體/抗原複合物中解離之解離速率常數，如從動力學選擇設置所確定，以s-1為單位表示。如本文所用，術語「K on 」意欲指代抗體(或抗原結合域)與抗原締合以形成抗體/抗原複合物之締合速率常數，以M-1s-1為單位表示。如本文所用，術語平衡解離常數「KD」或「Kd」係指具體抗體-抗原相互作用之解離常數，且描述在平衡時佔據存在於抗體分子溶液中之所有抗體結合域之一半所需之抗原濃度，且等於K off /K on ，以M為單位表示。Kd之量測預先假定所有結合劑都在溶液中。在抗體繫留於細胞壁之情況下，例如在酵母表現系統中，對應的平衡速率常數表示為EC50，此給出Kd之良好近似值。親和力常數Ka為解離常數Kd之倒數，以M-1為單位表示。解離常數(KD或Kd)用作顯示抗體與抗原之親和力之指標。例如，藉由使用標記有多種標記物試劑之抗體的Scatchard方法，以及藉由使用BiacoreX(Amersham Biosciences製造)(其為直接出售的量測套組)或類似套組根據套組附帶之用戶手冊及實驗操作方法，有可能進行簡單的分析。可以使用此等方法導出之KD值以M(莫耳)為單位表示。特異性結合靶標之抗體或其抗原結合片段可具有例如10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、或10-12M之解離常數(Kd)。
半數最大抑制濃度(IC50)係物質(諸如抗體)抑制特定生物或生物化學功能之有效性之量度。其指示抑制給定生物過程(例如，PD-1與PD-L1/PD-L2，或過程之組分，即酶、細胞、細胞受體、或微生物之間的結合)達一半需要多少 具體藥物或其他物質(抑制劑，諸如抗體)。該等值通常表示為莫耳濃度。對於促效劑藥物或其他物質(諸如抗體)之IC50與「EC50」相當。EC50亦表示在體內獲得最大作用之50%所需的血漿濃度。如本文所用，「IC50」用於指示在活體外中和50%抗原生物活性(諸如PD-1生物活性)所需的抗體(例如抗PD-L1 sdAb)之有效濃度。IC50或EC50可藉由生物檢定進行量測，諸如藉由FACS之配體結合抑制分析(競爭結合檢定)、基於細胞之細胞介素釋放檢定、或放大發光鄰近均相檢定(AlphaLISA)。
關於肽、多肽、或抗體序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」及「同源性」定義為，在比對序列並引入缺口(若需要)以達成最大序列一致性百分比之後，候選序列中與特定肽或多肽序列中胺基酸殘基相同的胺基酸殘基之百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的所進行的比對可以此項技術中的各種方式達成，例如使用公眾可獲得之計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、或MEGALIGNTM(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定量測比對的適當參數，包括在所比較之序列之全長範圍內達成最大比對所需之任何演算法。
編碼本文所述之構築體、抗體、或其抗原結合片段之「經單離」核酸分子為經鑒別且與至少一種在其產生環境中普遍與之締合的污染物核酸分子分離的核酸分子。較佳地，經單離核酸分子不與所有與產生環境相關的組分締合。編碼本文所述之多肽及抗體的經單離核酸分子係以其在自然界中存在的形式或情況以外的形式。因此經單離核酸分子區別於天然存在於細胞中編碼本文所述之多肽及抗體的核酸。經單離核酸包括普遍含有核酸分子的細胞中所含有之核酸分子，但核酸分子存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同的染色體位置處。
術語「控制序列」係指在具體宿主有機體中表現經可操作地連接之編碼序列所必需的DNA序列。適用於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況操縱子序列、及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化訊號、及增強子。
當核酸與另一核酸序列處於某一功能關係時，其「經可操作地連接」。例如，若用於前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽之分泌的前蛋白，則其可操作性連接至用於多肽之DNA；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則其可操作性連接至該序列；或若核糖體結合位點經定位以便促進轉譯，則其可操作性連接至編碼序列。通常，「可操作地連接」意謂連接之DNA序列為鄰近的，且就分泌前導序列而言，為鄰近的且處於閱讀相中。然而，增強子不必為鄰近的。連接藉由在便利限制位點處之接合實現。若此類位點不存在，則根據習知實踐使用合成寡核苷酸轉接子(adaptor)或連接子。
如本文所用，術語「載體」係指能增殖與之連接之另一核酸的核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入其所引入的宿主細胞之基因體中的載體。某些載體能夠導引與其可操作地連接之核酸表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。
如本文所用之術語「轉染」、或「轉型」、或「轉導」係指將外源性核酸轉移或引入至宿主細胞中的過程。「轉染」、或「轉型」、或「轉導」細胞為已經轉染、轉型、或轉導有外源性核酸的細胞。細胞包括原代受試者細胞及其後代。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及「宿主細胞培養物」可互換使用且指代已引入外源性核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括原代轉型細胞及源於其之後代而不考慮繼代數目。後代可能在核酸含量方面未與親體細胞完全一致，且可含有突變。本 文中包括如在初始轉型細胞中所篩選或選擇具有相同功能或生物活性之突變型後代。
「輔助環境」係指個體已具有癌症病史且通常(但不必要)對療法有反應的臨床環境，療法包括但不限於手術(例如，手術切除)、放療、及化療。然而，此等個體因其癌症病史而被視為處於發展疾病之風險。「輔助環境」中之治療或投與係指隨後的治療方式。風險程度(例如，當輔助環境中之個體被視為「高風險」或「低風險」時)取決於若干因素，最常見為首次治療時的疾病程度。
「新輔助環境」係指在初步/確定性療法之前進行方法的臨床環境。
術語「醫藥組成物」之「醫藥調配物」係指以下製劑，其以允許活性成分之生物活性有效之形式，且不含有對投與調配物之受試者有不可接受毒性之額外組分。此類調配物係無菌的。「無菌」調配物係滅菌的或不含所有活的微生物及其孢子。
應理解，本文所述之本發明之實施例包括「由實施例組成」及/或「主要由實施例組成」。
本文中對「約」一值或參數的提及包括(且描述)關於該值或參數本身的變化。例如，提及「約X」之描述包括「X」之描述。
如本文所用，提及「非」一值或參數通常意謂且描述「除」一值或參數之外。例如，該方法不用於治療X型癌症，意謂該方法用於治療除X之外類型的癌症。
除非上下文另外明確規定，否則如本文及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一」、「或」、及「該」包括複數個參考物。
II.抗PD-1構築體
(I)抗PD-1單域抗體部分
本文所述之經單離抗PD-1構築體包含特異性識別PD-1(或「抗PD-1 sdAb」)之單域抗體(sdAb)部分。在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體為抗PD-1 sdAb。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列，且胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。因此，在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體，其中胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
本文所說明之CDR之序列提供於表3中。CDR可以各種成對組合之形式組合以生成許多抗PD-1部分。
例如，在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2 個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：110之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：182之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：110之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：182之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2 中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：110之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：182之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：111之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：183之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：111之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：183之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：111之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：183之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3 個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：112之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：184之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：112之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：184之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：112之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：184之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：113之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：185之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：113之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：185之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2 中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：113之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：185之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：114之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：186之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：114之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：186之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：114之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：186之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3 個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：115之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：187之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：115之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：187之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：115之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：187之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：116之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：188之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：116之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：188之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2 中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：116之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：188之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：117之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：189之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：117之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：189之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：117之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：189之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3 個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：118之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：190之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：118之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：190之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：118之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：190之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：191之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：191之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2 中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：191之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：192之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：192之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：192之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3 個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：193之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：193之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：193之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：122之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：194之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：122之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：194之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2 中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：122之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：194之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：123之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：195之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：123之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：195之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：123之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：195之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3 個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：124之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：196之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：124之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：196之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：124之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：196之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：125之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：197之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：125之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：197之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2 中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：125之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：197之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：126之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：126之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：126之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3 個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：127之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：199之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：127之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：199之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：127之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：199之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2 中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：201之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：201之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：201之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3 個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：130之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：130之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：130之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：131之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：203之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：131之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：203之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2 中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：131之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：203之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：132之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：204之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：132之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：204之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：132之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：204之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3 個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：133之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：133之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：133之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：134之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：206之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：134之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：206之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2 中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：134之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：206之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3 個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：208之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：208之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：208之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2 中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：138之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：210之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：138之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：210之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：138之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：210之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3 個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：211之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：211之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：211之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：212之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：212之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2 中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：212之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：141之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：213之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：141之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：213之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：141之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：213之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3 個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：142之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：214之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：142之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：214之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：142之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：214之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：143之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：215之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：143之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：215之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2 中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：143之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：215之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：144之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：216之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：144之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：216之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含：包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：144之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：216之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
抗PD-1 sdAb部分可在一或多個FR序列中包含一或多個「標誌殘基(hallmark residue)」。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含VHH域，該VHH 域包含以下中任一者之胺基酸序列：a-1)在位置37處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：F、Y、L、I、及V(諸如F、Y、或V，或諸如F)；a-2)在位置44處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：A、G、E、D、G、Q、R、S、及L(諸如E、Q、或G，或諸如E)；a-3)在位置45處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：L、R、及C(諸如L或R)；a-4)在位置103處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：W、R、G、及S(諸如W、G、或R，或諸如W)；且a-5)在位置108處之胺基酸殘基為Q；或b-1)在位置37處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：F、Y、L、I、及V(諸如F、V、或Y，或諸如F)；b-2)在位置44處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：E、Q、及G；b-3)在位置45處之胺基酸殘基為R；b-4)在位置103處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：W、R、及S(諸如W)；且b-5)在位置108處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：Q及L(諸如Q)；其中胺基酸位置係根據Kabat編號。應注意，在根據Kabat編號之胺基酸位置37、44、45、103、及108處之此等「標誌殘基」應用於天然VHH序列之抗PD-1 sdAb部分，且可在人源化期間經取代。例如，在根據Kabat編號之胺基酸位置108處之Q可視情況經人源化成L。其他人源化取代將為熟習此項技術者清楚的。例如，可藉由將天然存在之VHH之FR序列與一或多個密切相關之人類VH之對應FR序列相比較，然後使用此項技術已知(亦如本文所述)之方法將一或多個此類潛在有用之人源化取代引入至該VHH中來確定潛在有用之人源化取代。可測試所得人源化VHH序列之PD-1結合親和力、穩定性、表現之容易性及水準、及/或其他所要性質。可能的殘基取代亦可來自抗體VH域，其中VH/VL界面包含一或多個高電荷胺基酸殘基。本文所述之抗PD-1 sdAb部分可經部分或完全人源化。較佳地，所得人源化抗PD-1 sdAb以如本文所述之Kd、K on 、及K off 結合PD-1。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO： 289-324中任一者具有至少約80%(諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%中任一者)序列一致性的變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列，或其在VHH域中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，包含有包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列的VHH或其變異體之抗PD-1 sdAb部分在CDR中包含胺基酸取代，諸如SEQ ID NO：289-324中任一者之CDR1、及/或CDR2、及/或CDR3。在一些實施例中，包含有包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列之VHH域或其變異體之抗PD-1 sdAb部分包含SEQ ID NO：289-324中任一者之CDR1、CDR2、及CDR3，且胺基酸取代在FR中，諸如SEQ ID NO：289-324中任一者之FR1、及/或FR2、及/或FR3、及/或FR4。在一些實施例中，包含有包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列之VHH域或其變異體之抗PD-1 sdAb部分在CDR及FR兩者中包含胺基酸取代。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分，其包含SEQ ID NO：289-324中任一者之CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分(下文稱為「競爭性抗PD-1 sdAb部分」或「競爭性抗PD-1 sdAb」)或包含抗PD-1 sdAb部分之抗PD-1構築體(下文稱為「競爭性抗PD-1構築體」)，其以與本文所述之任一抗PD-1 sdAb部分競爭的方式特異性結合PD-1。在一些實施例中，可使用ELISA檢定來確定 競爭性結合。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分(或包含抗PD-1 sdAb部分之抗PD-1構築體)，其以與包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列之抗PD-1 sdAb部分競爭的方式特異性結合PD-1。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 sdAb部分(或包含抗PD-1 sdAb部分之抗PD-1構築體)，其以與包含以下之抗PD-1 sdAb部分競爭的方式特異性結合PD-1：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，競爭性抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，競爭性抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
單域抗體
示範性sdAb包括但不限於：僅重鏈抗體之重鏈可變域(駱駝科(Camelidae)之VHH(重鏈抗體之重鏈可變域)或軟骨魚之VNAR(鯊魚新抗原受體之可變域))；天然不含輕鏈之結合分子；來源於習知4鏈抗體之單域(諸如VH或VL)；人源化僅重鏈抗體；由表現人類重鏈區段之基因轉殖小鼠或大鼠所產生之人類單域抗體；及除來源於抗體者之外的經工程改造之域及單域支架。sdAb可來源於任何物種，包括但不限於小鼠、大鼠、人類、駱駝、美洲駝、八目鰻、魚、鯊魚、山羊、兔、及牛。本文所涵蓋之sdAb亦包括來自除駱駝科及鯊魚之外的物種的天然存在之sdAb分子。
在一些實施例中，sdAb來源於已知為不含輕鏈之重鏈抗體(本文亦稱為「僅重鏈抗體」或「HCAb」)之天然存在之單域抗原結合分子。此類單域分子揭示於例如WO 94/04678及Hamers-Casterman,C.等人，(1993)Nature 363：446-448。為明確起見，來源於天然不含輕鏈之重鏈分子的可變域在本文稱 為VHH，以與四鏈免疫球蛋白之習知VH區分。此一VHH分子可來源於駱駝科物種所產生之抗體，例如駱駝、美洲駝、駱馬、單峰駱駝、駝羊、及原駝。除駱駝可之外的其他物種可產生天然不含輕鏈之重鏈分子，且此類VHH在本申請案之範疇內。
在一些實施例中，sdAb來源於軟骨魚中存在之免疫球蛋白之可變區。例如，sdAb可來源於鯊魚血清中存在之免疫球蛋白同型，稱為新抗原受體(NAR)。產生來源於NAR可變區之單域分子(「IgNAR」)之方法描述於WO 03/014161及Streltsov(2005)Protein Sci.14：2901-2909。
在一些實施例中，sdAb為重組、CDR接枝、人源化、駱駝源化、去免疫、及/或體外生成(例如，藉由噬菌體顯示選擇)sdAb。在一些實施例中，框架區之胺基酸序列可藉由框架區中特定胺基酸殘基之「駱駝源化」來改變。駱駝源化係指習知4鏈抗體之(天然存在之)VH域之胺基酸序列中之一或多個胺基酸殘基經重鏈抗體之VHH域中對應位置處存在的一或多個胺基酸殘基替換或取代。這可例如基於本文進一步描述，以本身已知的方式執行，其為熟習此項技術者明確的。此類「駱駝源化」取代較佳插入在形成及/或存在於VH-VL的胺基酸位置及/或所謂的駱駝科標誌殘基處，如本文所定義(參見例如WO 94/04678；Davies及Riechmann FEBS Letters 339：285-290,1994；Davies及Riechmann Protein Engineering 9(6)：531-537,1996；Riechmann J.Mol.Biol.259：957-969,1996；及Riechmann及MuyldermansJ.Immunol.Meth.231：25-38,1999)。
在一些實施例中，sdAb為由表現人類重鏈區段之基因轉殖小鼠或大鼠所產生之人類sdAb。參見例如US20090307787A1、美國專利第8,754,287號、US20150289489A1、US20100122358A1、及WO2004049794。在一些實施例中，sdAb經親和力成熟。
在一些實施例中，針對具體抗原或靶標之天然存在之VHH域可獲自駱駝VHH序列之(純真(naïve)或免疫)文庫。此類方法可涉及或可不涉及使用該抗原或靶標、或其至少一部分、片段、抗原決定位或表位，使用一或多種本身已知的篩選技術篩選此一文庫。此類文庫及技術例如描述於WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020、及WO 03/035694。可替代地，可使用來源於(純真或免疫)VHH文庫之改良合成或半合成文庫，諸如藉由諸如隨機誘變及/或CDR改組之技術獲自(純真或免疫)VHH文庫之VHH文庫，如例如WO 00/43507中所述。
在一些實施例中，sdAbs係自習知4鏈抗體生成。參見例如EP 0 368 684；Ward等人，(Nature 1989年10月，12；341(6242)：544-6；Holt等人，Trends Biotechnol.,2003,21(11)：484-490；WO 06/030220；及WO 06/003388。
因為sdAb之獨特性質，將VHH域用作單抗原結合蛋白或抗原結合域(即，較大蛋白或多肽之一部分)提供許多優於習知VH及VL、scFv、及習知抗體片段(諸如Fab或(Fab')2)的顯著優勢：1)以高親和力結合抗原僅需要單個域，所以不必具有第二域，也不必確保此兩個域以正確的空間構形及組態存在(例如，不必在折疊期間將重鏈及輕鏈配對，不必使用專門設計的連接子，諸如就scFv而言)；2)可自單個基因表現VHH及其他sdAb且不需要轉譯後折疊或修飾；3)可容易地將VHH域及其他sdAb工程改造成多價及/或多特異性形式(諸如本申請案中所述者)；4)VHH域及其他sdAb可溶性高且不具有聚集傾向(如Ward等人，Nature.1989年10月，12；341(6242)：544-6所述之小鼠來源「dAb」之情況下)；5)VHH域及其他sdAb對熱、pH、蛋白酶、及其他變性試劑或條件穩定性高；6)VHH域及其他sdAb可以簡單且相對便宜的方式製備(即使在大生產規模下)，諸如使用微生物發酵，不必使用哺乳動物表現系統(例如習知抗體片段之生產所需)；7)與習知4鏈抗體及其抗原結合片段相比，VHH域及其他sdAb相對較小(大約15kDa，或比習知IgG小10倍)，因此具有較高組織滲透能力，諸如對於實 體腫瘤及其他緻密組織；且8)VHH域及其他sdAb可表現出所謂的「凹槽(cavity)結合性質」(由於其CDR3環比習知VH域之CDR3環長)且可因此觸及習知4鏈抗體及其抗原結合片段不可及的靶標及表位，例如，已顯示VHH域及其他sdAb可抑制酶(參見例如WO1997049805；Transue等人，Proteins.1998 Sep 1；32(4)：515-22；Lauwereys等人，EMBO J.1998年7月，1；17(13)：3512-20)。
PD-1
術語「程式性細胞死亡蛋白1」、「PD-1」、「PD-1抗原」、「PD-1表位」、及「程式性死亡1」可互換使用，且包括人類PD-1之變異體、同功型、物種同源物、及與PD-1具有至少一個共同表位之類似物。
人類PD-1之胺基酸序列揭示於Genbank登錄號NP_005009。胺基酸1-20之區為前導肽；胺基酸21-170之區為細胞外域；胺基酸171-191之區為跨膜域；且胺基酸192-288之區為胞質域。
具體人類PD-1序列之胺基酸序列與Genbank登錄號NP_005009之人類PD-1至少90%一致，且與其他物種(例如，鼠類)之PD-1胺基酸序列相比，含有將胺基酸序列鑒定為人類的胺基酸殘基。在一些實施例中，人類PD-1之胺基酸序列可與Genbank登錄號NP_005009之人類PD-1至少約95%、96%、97%、98%、或99%一致。在一些實施例中，人類PD-1序列將顯示與Genbank登錄號NP_005009之人類PD-1不多於10個胺基酸差異。在一些實施例中，人類PD-L1可顯示與Genbank登錄號NP_005009之人類PD-1不多於5、4、3、2、或1個胺基酸差異。可如本文所述確定一致性百分比。在一些實施例中，人類PD-1序列可因例如具有保守突變或在非保守區中具有突變而與Genbank登錄號NP_005009之人類PD-1不同，且PD-1具有與Genbank登錄號NP_005009之人類PD-1實質上相同的生物學功能。例如，人類PD-1之生物學功能為在PD-1之細胞外域中具有表位，其經本揭露之抗PD-1構築體所特異性結合，或人類PD-1 之生物學功能為調節T細胞活性。在一些實施例中，本文所述之抗PD-1 sdAb部分特異性識別與Genbank登錄號NP_005009之人類PD-1具有100%胺基酸序列一致性的PD-1多肽。在一些實施例中，本文所述之抗PD-1 sdAb部分特異性識別包含SEQ ID NO：361或362之胺基酸序列之PD-1多肽。
在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分可與來自除人類之外的物種的PD-1或結構上與人類PD-1相關的其他蛋白(例如，人類PD-1同源物)交叉反應。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分完全特異於人類PD-L1，且不表現出物種或其他類型之交叉反應性。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分特異性識別人類PD-1之可溶性同功型。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分特異性識別人類PD-1之膜結合同功型(例如，SEQ ID NO：361)。
在一些實施例中，本文所述之抗PD-1 sdAb部分特異性識別PD-1之細胞外域(ECD)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分特異性識別PD-1 ECD之N末端部分。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分特異性識別PD-1 ECD之C末端部分。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分特異性識別PD-1 ECD之中間部分。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分所特異性識別之PD-1之ECD之胺基酸序列與Genbank登錄號NP_005009之人類PD-1之ECD至少約95%、96%、97%、98%、或99%一致。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分所特異性識別之PD-1之ECD之胺基酸序列與Genbank登錄號NP_005009之人類PD-1之ECD 100%一致。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分特異性識別包含SEQ ID NO：362之胺基酸序列之PD-1多肽。
抗體親和力
抗體或抗原結合域之結合特異性可藉由此項技術中已知之方法以實驗方式確定。此類方法包含但不限於西方墨點法、ELISA測試、RIA測試、ECL測試、IRMA測試、EIA測試、BIAcore測試、及肽掃描。
在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-6M、約10-6M至約10-7M、約10-7M至約10-8M、約10-8M至約10-9M、約10-9M至約10-10M、約10-10M至約10-11M、約10-11M至約10-12M、約10-5M至約10-12M、約10-6M至約10-12M、約10-7M至約10-12M、約10-8M至約10-12M、約10-9M至約10-12M、約10-10M至約10-12M、約10-5M至約10-11M、約10-7M至約10-11M、約10-8M至約10-11M、約10-9M至約10-11M、約10-5M至約10-10M、約10-7M至約10-10M、約10-8M至約10-10M、約10-5M至約10-9M、約10-7M至約10-9M、約10-5M至約10-8M、或約10-6M至約10-8M。
在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之K on 為約102M-1s-1至約104M-1s-1、約104M-1s-1至約106M-1s-1、約106M-1s-1至約107M-1s-1、約102M-1s-1至約107M-1s-1、約103M-1s-1至約107M-1s-1、約104M-1s-1至約107M-1s-1、約105M-1s-1至約107M-1s-1、約103M-1s-1至約106M-1s-1、或約104M-1s-1至約106M-1s-1。
在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之K off 為約1s-1至約10-2s-1、約10-2s-1至約10-4s-1、約10-4s-1至約10-5s-1、約10-5s-1至約10-6s-1、約1s-1至約10-6s-1、約10-2s-1至約10-6s-1、約10-3s-1至約10-6s-1、約10-4s-1至約10-6s-1、約10-2s-1至約10-5s-1、或約10-3s-1至約10-5s-1。
在一些實施例中，在放大發光鄰近均相檢定(AlphaLISA)中，抗PD-1 sdAb部分之EC50小於10nM。在一些實施例中，在藉由FACS之配體結合抑制分析(競爭結合檢定)或基於細胞之細胞介素釋放檢定中，抗PD-1 sdAb部分之EC50小於500nM。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分之EC50小於1nM(諸如約0.001nM至約0.01nM、約0.01nM至約0.1nM、約0.1nM至約1nM等)、約1nM至約10nM、約10nM至約50nM、約50nM至約100nM、約100nM 至約200nM、約200nM至約300nM、約300nM至約400nM、或約400nM至約500nM。
在一些實施例中，在AlphaLISA中，抗PD-1 sdAb部分之IC50小於10nM。在一些實施例中，在藉由FACS之配體結合抑制分析(競爭結合檢定)或基於細胞之細胞介素釋放檢定中，抗PD-1 sdAb部分之IC50小於500nM。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分之IC50小於1nM(諸如約0.001nM至約0.01nM、約0.01nM至約0.1nM、約0.1nM至約1nM等)、約1nM至約10nM、約10nM至約50nM、約50nM至約100nM、約100nM至約200nM、約200nM至約300nM、約300nM至約400nM、或約400nM至約500nM。
嵌合或人源化抗體
在一些實施例中，本文所提供之抗PD-1 sdAb部分為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984)中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，來源於駱駝物種諸如美洲駝之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或亞類已自親體抗體之類別或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在一些實施例中，嵌合抗體為人源化抗體。通常，非人抗體經人源化以降低對人類的免疫原性，同時保留親體非人類抗體的特異性及親和力。通常，人源化抗體包含一或多個可變域，其中HVR例如CDR(或其部分)來源於非人類抗體，且FR(或其部分)來源於人類抗體序列。人源化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人源化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，HVR殘基所來源之抗體)之對應殘基取代以例如恢復或改良抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其製備方法例如評述於Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一步描述於例如Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號、及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)接枝)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述「表面重塑」)；Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述FR改組之「引導選擇」方法)中。
可用於人源化之人類框架區包括但不限於：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(參見例如Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；來源於輕鏈或重鏈可變區之具體亞群之人類抗體的共有序列之框架區(參見例如Carter等人，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)框架區或人類生殖系框架區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及來源於篩選FR文庫之框架區(參見例如Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
在一些實施例中，抗PD-1 sdAb經修飾，諸如經人源化，而不降低該域對抗原之天然親和力，且同時降低其對異源物種之免疫原性。例如，可確定美洲駝抗體之抗體可變域(VHH)之胺基酸殘基，且將例如框架區中之一或多個駱駝胺基酸經其在人類共有序列中存在之人類對應物替換，該多肽不失去其典型特徵，即人源化不顯著影響所得多肽之抗原結合能力。駱駝單域抗體之人源化需要在單一多肽鏈中引入並誘變有限量的胺基酸。這與scFv、Fab'、(Fab')2、及IgG之人源化相反，其需要在兩條鏈(輕鏈及重鏈)中引入胺基酸變化且保存兩條鏈之組裝。
包含VHH域之sdAb可經人源化以具有人類樣序列。在一些實施例中，本文所用之VHH域之FR區與人類VH框架區包含至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、或更多中任一者的胺基酸序列同源性。一類示範性人源化VHH域之特徵在於，VHH在根據Kabat編號之位置45處(諸如像L45)攜帶由甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺、或麩胺酸組成之群的胺基酸且在位置103處攜帶色胺酸。因此，屬於此類之多肽顯示與人類VH框架區高胺基酸序列同源性，且該等多肽可直接向人類投與而無期望自其發生非所要的免疫反應，且無進一步人源化負擔。
另一類示範性人源化駱駝單域抗體已描述於WO 03/035694中且含有通常存在於人類來源或其他物種之習知抗體中的疏水性FR2殘基，但藉由在位置103上的帶電色胺酸殘基來補償此親水性損失，該帶電精胺酸殘基取代雙鏈抗體之VH中存在之保守色胺酸。因此，屬於此兩類之多肽顯示與人類VH框架區高胺基酸序列同源性，且該等肽可直接向人類投與而無期望自其發生非所要的免疫反應，且無進一步人源化負擔。
人類抗體
在一些實施例中，本文所提供之抗PD-1 sdAb部分為人類抗體(稱為人類域抗體或人類DAb)。可使用此項技術中已知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體一般性地描述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)；Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)；及Chen,Mol.Immunol.47(4)：912-21(2010)。能夠產生完全人類單域抗體(或DAb)之基因轉殖小鼠或大鼠係此項技術已知的。參見例如US20090307787A1、美國專利第8,754,287號、US20150289489A1、US20100122358A1、及WO2004049794。
人類抗體(例如，人類DAb)可藉由向已經修改以回應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體之基因轉殖動物投與免疫原來製備。此類動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，其置換內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此類轉殖基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座一般已失活。自基因轉殖動物獲得人類抗體之方法之評述參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。亦參見例如描述XENOMOUSETM技術的美國專利第6,075,181號及第6,150,584號；描述HUMAB®技術的美國專利第5,770,429號；描述K-M MOUSE®技術的美國專利第7,041,870號；及描述VELOCIMOUSE®技術的美國專利申請公開案第US 2007/0061900號。由此類動物生成之完整抗體的人類可變區可進一步經修飾，例如藉由與不同人類恆定區組合。
人類抗體(例如，人類DAb)亦可藉由基於融合瘤之方法製成。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株已有描述(參見例如Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-6頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991))。經由人類B細胞融合瘤技術生成之人類抗體亦描述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。額外方法包括例如美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)中所描述之彼等方法。人類融合瘤技術(三源融合瘤技術(Trioma technology))亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3)：927-937(2005)，及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)。
人類抗體(例如，人類DAb)亦可藉由單離選自人類來源噬菌體顯示文庫之Fv純系可變域序列生成。此類可變域序列然後可與所要人類恆定域組合。下文描述用於自抗體文庫選擇人類抗體之技術。
一種用於獲得針對具體抗原或靶標之VHH序列的技術涉及：合適地免疫能夠表現重鏈抗體之基因轉殖哺乳動物(即，以便產生免疫反應及/或針對該抗原或靶標之重鏈抗體)；自該基因轉殖哺乳動物獲得合適的含有該VHH序列(編碼該VHH序列之核酸序列)之生物樣本(諸如血液樣本、血清樣本、或B細胞樣本)；然後自該樣本開始，使用本身已知的任何合適的技術(諸如本文所述之任何方法或融合瘤技術)，生成針對該抗原或靶標之VHH序列。例如，出於此目的，可使用重鏈抗體表現小鼠以及另外方法及技術，其描述於WO 02/085945、WO 04/049794及WO 06/008548、及Janssens等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006年10月，10；103(41)：15130-5。例如，此類重鏈抗體表現小鼠可表現具有任何合適(單)可變域之重鏈抗體，諸如天然來源之(單)可變域(例如，人類(單)可變域、駱駝(單)可變域、或鯊魚(單)可變域)，以及例如合成或半合成(單)可變域。
文庫來源之抗體
本申請案之抗體可藉由篩選組合文庫中具有所要活性之抗體來單離。例如，此項技術中已知多種用於生成噬菌體顯示文庫及篩選此類文庫中具有所要結合特徵之抗體之方法。此類方法評述於例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,2001)，且進一步描述於例如McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)： 12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。已描述用於構築單域抗體文庫之方法，例如參見美國專利第7371849號。
在某些噬菌體顯示方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)分開選殖VH及VL基因之全庫且隨機重組於噬菌體文庫中，然後可篩選該等文庫中之抗原結合噬菌體，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455,1994中所述。VHH基因之全庫可藉由PCR以類似方式選殖，隨機重組於噬菌體文庫中，且篩選其抗原結合噬菌體。噬菌體通常呈scFv片段或呈Fab片段顯示抗體片段。來自經免疫來源之文庫提供對免疫原具有高親和力之抗體而無需構築融合瘤。可替代地，可選殖天然全庫(例如來自人類)以提供針對廣泛範圍之非自體抗原以及自體抗原之單抗體來源而無需任何免疫，如Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所描述。最終，天然文庫亦可以合成方式藉由自幹細胞選殖未經重排之V基因區段，且使用含有隨機序列以編碼高度可變CDR3區及實現活體外重排之PCR引物來製得，如由Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所描述。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號、以及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號、及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫單離之抗體或抗體片段在本文中視為人類抗體或人類抗體片段。
生物活性
本文所述之抗PD-1 sdAb部分之生物活性可藉由量測其半數最大有效濃度(EC50)或半數最大抑制濃度(IC50)來確定，半數最大有效濃度為抗體結合其靶標之有效性之量度，半數最大抑制濃度為抗體抑制特定生物或生化功能(諸如抑制PD-1與PD-L1/PD-L2之間的結合)之有效性之量度。例如，此處EC50可用 於指示在細胞表面上結合50% PD-1所需之抗PD-1 sdAb之有效濃度，IC50可用於指示體外中和50% PD-1生物活性所需之抗-PD-1 sdAb之有效濃度。EC50亦表示在體內獲得最大作用之50%所需的血漿濃度。EC50或IC50可藉由此項技術中已知的檢定進行量測，例如生物檢定，諸如藉由FACS之配體結合抑制分析(競爭結合檢定)、基於細胞之細胞介素釋放檢定、或放大發光鄰近均相檢定(AlphaLISA)。
例如，可以使用流動式細胞測量術研究配體結合之阻斷(亦參見實例1)。表現人類PD-1之CHO細胞可自貼壁式培養瓶解離，並與用於測試之不同濃度之抗PD-1 sdAb及恆定濃度之經標記之PD-L1蛋白或經標記之PD-L2蛋白(諸如經生物素標記之人類PD-L1-Fc蛋白或經生物素標記之人類PD-L2-Fc蛋白)混合。可採用抗PD-1抗體陽性對照，諸如Keytruda®。將混合物在室溫下平衡30分鐘，用FACS緩衝液(含有1% BSA之PBS)洗滌三次。然後，添加恆定濃度之特異性識別經標記之PD-L1或PD-L2蛋白之抗體(諸如PE/Cy5鏈親和素二級抗體)並在室溫下孵育15分鐘。用FACS緩衝液洗滌細胞並藉由流動式細胞測量術分析。可使用Prism(GraphPad軟體，San Diego，CA)，使用非線性迴歸分析資料以計算IC50。競爭檢定之結果可說明抗PD-1 sdAb抑制經標記之PD-L1/PD-L2與PD-1之間的相互作用的能力。
亦可藉由基於PD-1之細胞介素釋放之阻斷檢定來測試抗PD-1 sdAb部分之生物活性(亦參見實例1)。與對細胞增殖相比，PD-1傳訊通常對細胞介素產生具有較大作用，其中對IFN-γ、TNF-α、及IL-2產生的作用顯著。因此，藉由抗PD-1抗體的PD-1路徑之阻斷可使用多種監測T細胞增殖、IFN-γ釋放、或IL-2分泌的生物檢定進行研究。PD-1介導之抑制傳訊亦取決於TCR傳訊之強度，其中在低水準TCR刺激下傳遞較大抑制。此減少可藉由通過CD28之共刺激(Freeman等人，J.Exp.Med.192：1027-34(2000))或IL-2之存在(Carter等人，Eur. J.Immunol.32：634-43(2002))來克服。PD-L1及PD-L2已顯示在結合PD-1時(Freeman等人，J.Exp.Med.192：1027-34(2000))或在IL-2存在時(Carter等人，Eur.J.Immunol.32：634-43(2002))下調T細胞活化。
例如，將PD-1效應細胞(以人類PD-1蛋白及NFAT螢光素酶穩定轉染之Jurkat細胞)及CHO-K1/人類CD274(穩定表現人類PD-L1之CHO-K1)混合於孔中。在不同的濃度下將抗PD-1 sdAb添加至各孔中。沒有抗體可用作背景對照。可採用陰性對照(諸如人類IgG4)及陽性對照(諸如Keytruda®)。在37℃/5% CO2孵育箱中孵育24小時之後，自各測試孔取出培養基以供IL-2分泌量測(Cisbio)。量測各測試抗體之EC50值，該值將反映測試抗PD-1 sdAb阻斷Jurkat細胞上PD-1與PD-L1之間的相互作用(PD-1/PD-L1相互作用抑制T細胞IL-2產生)。
亦可藉由基於PD-1之螢光素酶報導子活性之阻斷檢定來測試抗PD-1 sdAb部分之生物活性(亦參見實例1)。效應細胞含有螢光素酶構築體，其在破壞PD-1/PD-L1受體-配體相互作用時經誘導。例如，可將PD-1效應細胞(用人類PD-1蛋白及NFAT螢光素酶穩定轉染之Jurkat細胞)鋪板隔夜，然後與連續稀釋的包含抗PD-1 sdAb之抗PD-1構築體一起孵育，接著在合適的E：T比率下添加PD-L1表現細胞(CHO-K1/人類CD274)。在37℃、5% CO2下誘導6小時後，可添加Bio-GloTM螢光素酶檢定試劑並可確定發光。結果可說明抗PD-1 sdAb抑制PD-L1與PD-1之間的相互作用的能力。
在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分阻斷或拮抗由PD-1受體轉導之訊號。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分可結合PD-1上之表位，以便抑制PD-1與PD-L1/PD-L2相互作用。在一些實施例中，在抗體組合位點與PD-1配體結合位點之比例大於1：1且抗體濃度大於10-8M之條件下，抗PD-1 sdAb部分可將 PD-L1與PD-L1/PD-L2之結合降低至少約5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%、或99.9%中之任一者。
(II)包含抗PD-1 sdAb部分之構築體
包含抗PD-1 sdAb部分之抗PD-1構築體可具有任何可能的形式。
在一些實施例中，包含抗PD-1 sdAb部分之抗PD-1構築體可進一步包含額外多肽序列諸如一或多個抗體部分(或抗原結合部分)或者免疫球蛋白之Fc片段。此類額外多肽序列可改變或可不改變或以其他方式影響抗PD-1 sdAb之(生物學)性質，且可為本文所述之抗PD-1 sdAb增加或不增加另外的功能。在一些實施例中，額外多肽序列賦予本發明之抗PD-1 sdAb一或多種所要性質或功能。
在一些實施例中，額外多肽序列可包含特異性識別第二表位之第二抗體部分或第二抗原結合部分(諸如sdAb、scFv、Fab、全長抗體等)。在一些實施例中，第二表位來自PD-1。在一些實施例中，第二表位不來自PD-1。在一些實施例中，第二抗體部分(或第二抗原結合部分)特異性識別PD-L1上與本文所述之抗PD-1 sdAb相同的表位。在一些實施例中，第二抗體部分(或第二抗原結合部分)特異性識別PD-L1上與本文所述之抗PD-1 sdAb不同的表位。在一些實施例中，抗PD-1構築體包含二或更多個經由視情況選用之連接子(諸如肽連接子，例如，下文「肽連接子」節中所揭示之任一者)連接在一起的抗PD-1-sdAb部分。該二或更多個連接在一起的抗PD-1-sdAb部分可相同或不同。在一些實施例中，視情況選用之肽連接子包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，額外多肽序列可包含特異性識別CTLA-4之第二抗體部分或第二抗原結合部分(諸如sdAb、scFv、Fab、全長抗體等)。在一些實施例中，抗PD-1構築體包含經由視情況選用之連接子(諸如肽連接子，例如，下文「肽連接子」節中所揭示之任一者)連接在一起的一或多個本文所述之抗 PD-1-sdAb部分及一或多個抗CTLA-4 sdAb。該一或多個連接在一起的抗PD-1-sdAb部分可相同或不同，該一或多個連接在一起的抗CTLA-4-sdAb可相同或不同。抗CTLA-4 sdAb可具有任何序列，諸如PCT/CN2017/105506及PCT/CN2016/101777中所揭示之任一者，該等專利以全文引用之方式併入本文。在一些實施例中，抗CTLA-4 sdAb包含A34311VH11、AS07014VH11、或AS07189TKDVH11之胺基酸序列。包含本文所述之抗PD-1 sdAb部分及抗CTLA-4 sdAb之抗PD-1構築體可具有任何形式，例如自N末端至C末端：(抗CTLA-4 sdAb1)-L1-(抗CTLA-4 sdAb2)-L2-(抗PD-1 sdAb)、(抗CTLA-4 sdAb1)-L1-(抗PD-1 sdAb)-L2-(抗CTLA-4 sdAb2)、(抗PD-1 sdAb)-L1-(抗CTLA-4 sdAb1)-L2-(抗CTLA-4 sdAb2)、(抗PD-1 sdAb1)-L1-(抗PD-1 sdAb2)-L2-(抗CTLA-4 sdAb)、(抗PD-1 sdAb1)-L1-(抗CTLA-4 sdAb)-L2-(抗PD-1 sdAb2)、(抗CTLA-4 sdAb)-L1-(抗PD-1 sdAb1)-L2-(抗PD-1 sdAb2)等。(L1及L2可為相同或不同視情況選用之連接子，諸如視情況選用之肽連接子)。在一些實施例中，視情況選用之肽連接子包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，額外多肽序列可增加抗體構築體半衰期、溶解度、或吸收，降低免疫原性或毒性，消除或減弱不期望的副作用，及/或與本文所述之抗PD-1 sdAb本身相比，賦予本發明之抗PD-1構築體其他有利性質及/或降低其不希望之性質。此類額外多肽序列之一些非限制性實例為血清蛋白，諸如人類血清白蛋白(HSA；參見例如WO 00/27435)或半抗原分子(例如，由循環抗體識別之半抗原，參見例如WO 98/22141)。已顯示，將免疫球蛋白之片段(諸如VH域)連接至血清白蛋白或其片段可增加抗體半衰期(參見例如WO 00/27435及WO 01/077137)。因此，在一些實施例中，本發明之抗PD-1構築體可包含視情況經由合適的連接子(諸如肽連接子)連接之血清白蛋白(或其合適的片段)的本文所述之抗PD-1 sdAb部分。在一些實施例中，本文所述之抗PD-1 sdAb部分可連 接至血清白蛋白之至少包含血清白蛋白III域之片段(參見PCT/EP2007/002817)。抗PD-1 sdAb-HSA融合蛋白可具有任何形式，諸如(sdAb)n-HSA(n為至少1之整數)、sdAb-HSA-sdAb等。在一些實施例中，視情況選用之肽連接子包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列。
抗PD-1僅重鏈抗體(HCAb)
在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體為包含本文所述之抗PD-1 sdAb部分之僅重鏈抗體(HCAb)。在一些實施例中，本文所述之抗PD-1 sdAb部分可視情況經由連接子序列連接至一或多個(較佳人類)CH2及/或CH3域，例如Fc片段，以增加其體內半衰期。
因此在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體為包含融合至免疫球蛋白(諸如IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM)之Fc片段的本文所述之抗PD-1 sdAb部分的抗PD-1 HCAb。在一些實施例中，抗PD-1 HCAb包含IgG之Fc片段，諸如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4中任一者。在一些實施例中，Fc片段為人類Fc，諸如人類IgG1(hIgG1)Fc、hIgG2 Fc、或hIgG4 Fc。在一些實施例中，Fc片段無效應子，具有減少、最小化、或消除之抗體效應功能諸如諸如ADCC、CDC、及/或ADCP(抗體依賴性T細胞吞噬)。例如，在一些實施例中，無效應子Fc在CH2區中包含N297A或DANA突變(D265A+N297A)。在一些實施例中，無效應子Fc包含K322A及L234A/L235A(LALA)突變。在一些實施例中，Fc片段為無效應子(惰性)IgG1 Fc，諸如無效應子hIgG1 Fc。在一些實施例中，Fc片段為人類IgG4 Fc(S228P)。在一些實施例中，Fc片段包含SEQ ID NO：363-365中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PD-1 HCAb為單體抗PD-1 HCAb。在一些實施例中，抗PD-1 HCAb為二聚抗PD-1 HCAb。在一些實施例中，抗PD-1 HCAb為多特異性且多價的(諸如雙特異性且二價)，例如，包含二或更多個本文 所述之抗PD-1 sdAb部分(如圖26B所示範)。在一些實施例中，抗PD-1 HCAb為單特異性且多價的(例如，二價；如圖26A所示範)。
在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分及Fc片段視情況由肽連接子連接。在一些實施例中，肽連接子為人類IgG1鉸鏈(SEQ ID NO：369)。在一些實施例中，肽連接子為經突變人類IgG1鉸鏈(SEQ ID NO：368)。在一些實施例中，肽連接子為人類IgG4鉸鏈(SEQ ID NO：367)。在一些實施例中，肽連接子為hIgG2鉸鏈。在一些實施例中，肽連接子包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列，諸如SEQ ID NO：371、375、或376。
因此在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1 HCAb，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分，其中該抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體，且其中該抗PD-1 sdAb經由視情況選用之連接子融合至免疫球蛋白之Fc片段。在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1 HCAb，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分，其中該sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體，且其中該抗PD-1 sdAb部分經由視情況選用之連接子融合至免疫球蛋白之Fc片段。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 HCAb，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分，其中該sdAb部分包含： 包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，且其中該抗PD-1 sdAb部分經由視情況選用之連接子融合至免疫球蛋白之Fc片段。在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1 HCAb，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分，其中該sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：289-324中任一者具有至少約80%(諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%中任一者)序列一致性的變異體，且其中該抗PD-1 sdAb部分經由視情況選用之連接子融合至免疫球蛋白之Fc片段。在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1 HCAb，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分，其中該sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列之VHH域，或其在VHH域中包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體，且其中該抗PD-1 sdAb部分經由視情況選用之連接子融合至免疫球蛋白之Fc片段。在一些實施例中，VHH域中之胺基酸取代在CDR中，諸如SEQ ID NO：289-324中任一者之CDR1、及/或CDR2、及/或CDR3。在一些實施例中，VHH域中之胺基酸取代在FR中，諸如SEQ ID NO：289-324中任一者之FR1、及/或FR2、及/或FR3、及/或FR4。在一些實施例中，胺基酸取代在SEQ ID NO：289-324中任一者之CDR及FR兩者中。在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1 HCAb，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分，其中該sdAb部分包含有包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列之VHH域，且其中該抗PD-1 sdAb部分經由視情況選用之連接子融合至免疫球蛋白之Fc片段。在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1 HCAb，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分，其中該sdAb部分包含SEQ ID NO：289-324中任一者之CDR1、CDR2、及CDR3，且其中該抗PD-1 sdAb部分經由視情況選用之連接子融合至 免疫球蛋白之Fc片段。在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1 HCAb，其包含兩個特異性識別PD-1之sdAb部分，其中各抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體，且其中各抗PD-1 sdAb之C末端經由視情況選用之連接子融合至免疫球蛋白之Fc片段之N末端。在一些實施例中，該兩個抗PD-1 sdAb部分相同(如圖26A所示範)。在一些實施例中，該兩個抗PD-1 sdAb部分不同(如圖26B所示範)。在一些實施例中，Fc片段為人類IgG1 Fc、無效應子人類IgG1 Fc、hIgG2 Fc、人類IgG4 Fc、或hIgG4 Fc(S228P)。在一些實施例中，Fc片段包含SEQ ID NO：363-365中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PD-1 HCAb為單體抗PD-1 HCAb。在一些實施例中，抗PD-1 HCAb為二聚抗PD-1 HCAb。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分及Fc片段視情況由肽連接子連接。在一些實施例中，肽連接子包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1 HCAb，其包含SEQ ID NO：325-360中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，亦提供一種經單離抗PD-1 HCAb(下文稱為「競爭性抗PD-1 HCAb」)，其以與本文所述之經單離抗PD-1 HCAb、抗PD-1 sdAb、 或抗PD-1構築體中任一者競爭之形式特異性結合PD-1。可使用ELISA檢定來確定競爭性結合。例如，在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1 HCAb，其以與包含SEQ ID NO：325-360中任一者之胺基酸序列之抗PD-1 HCAb競爭之方式特異性結合PD-1。在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1 HCAb，其以與包含有包含以下之抗PD-1 sdAb部分之抗PD-1 HCAb競爭之方式特異性結合PD-1：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1 HCAb，其以與包含以下之抗PD-1 sdAb部分(或包含抗PD-1 sdAb部分之抗PD-1構築體)競爭之方式特異性結合PD-1：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，競爭性抗PD-1 HCAb之Fc片段包含SEQ ID NO：363-365中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，競爭性抗PD-1 HCAb與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，競爭性抗PD-1 HCAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
多價及/或多特異性抗體
在一些實施例中，經單離抗PD-1構築體包含融合至一或多個其他抗體部分或抗原結合部分(諸如特異性識別另一表位之抗體部分)的本文所述之抗PD-1 sdAb部分。該一或多個其他抗體部分可具有任何抗體或抗體片段形式，諸如全長抗體、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、scFv、scFv-scFv、微型抗體、雙功能抗體、或sdAb。在一些實施例中，該一或多個抗體部分(或抗原結合部分)包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。某些抗體片段之評述參見Hudson等人，Nat. Med.9：129-134(2003)。scFv片段之綜述參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore,(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。包含救助受體結合表位殘基且具有延長之體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的討論參見美國專利第5,869,046號。多特異性抗體之綜述參見Weidle等人，Cancer Genomics Proteomics,10(1)：1-18,2013；Geering及Fussenegger,Trends Biotechnol.,33(2)：65-79,2015；Stamova等人，Antibodies,1(2)：172-198,2012。雙功能抗體為可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。抗體片段可藉由各種技術製成，包括但不限於蛋白分解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生，如本文所述。
用於製造多特異性抗體之技術包括但不限於具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983)，WO 93/08829，及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))，及「孔中結(knob-in-hole)」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下製得：工程改造針對製造抗體Fc-雜二聚分子之靜電轉向效應(WO 2009/089004A1)；使二或更多種抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號，及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鍊來生產雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用用於製造雙特異性抗體片段的「雙抗體」技術(參見例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；及如例如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991) 中所述製備三特異性抗體；以及產生包含串聯單域抗體之多肽(參見例如，美國專利申請第20110028695號；及Conrath等人，J.Biol.Chem.,2001；276(10)：7346-50)。本文亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點的經工程改造之抗體，包括「章魚抗體(Octopus antibody)」(參見例如US 2006/0025576A1)。
肽連接子
在一些實施例中，抗PD-1構築體內之抗PD-1 sdAb及其他一或多個抗體部分(諸如全長抗體、sdAb、或包含VH及VL之抗原結合部分)可視情況藉由肽連接子連接。抗PD-1構築體中使用之肽連接子之長度、可撓性、及/或其他性質可能對性質具有一些影響，該等性質包括但不限於對於一或多種特定抗原或抗表位之親和力、特異性、或親合力。例如，可以選擇較長之肽連接子以確保兩個相鄰域在空間上不相互干擾。在一些實施例中，肽連接子包含撓性殘基(例如甘胺酸及絲胺酸)，使得相鄰域相對於彼此自由移動。例如，甘胺酸-絲胺酸雙聯體可以為合適之肽連接子。
肽連接子可具有任何合適之長度。在一些實施例中，肽連接子為至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100、或更多個胺基酸長度中之任一者。在一些實施例中，肽連接子為不多於約100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、或更少個胺基酸長度中之任一者。在一些實施例中，肽連接子之長度為約1個胺基酸至約10個胺基酸、約1個胺基酸至約20個胺基酸、約1個胺基酸至約30個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約10個胺基酸至約25個胺基酸、約5個胺基酸至約30個胺基酸、約10個胺基酸至約30個胺基酸長、約30個胺基酸至約50個胺基酸、約50個胺基酸至約100個胺基酸、或約1個胺基酸至約100個胺基酸中之任一者。
肽連接子可具有天然存在之序列或非天然存在之序列。例如，來源於僅重鏈抗體之鉸鏈區之序列可用作連接子。參見例如WO1996/34103。在一些實施例中，肽連接子為人類IgG1鉸鏈(SEQ ID NO：369)。在一些實施例中，肽連接子為經突變人類IgG1鉸鏈(SEQ ID NO：368)。在一些實施例中，肽連接子為人類IgG4鉸鏈(SEQ ID NO：367)。在一些實施例中，肽連接子為hIgG2鉸鏈。在一些實施例中，肽連接子為撓性連接子。示範性撓性連接子包括甘胺酸聚合物(G)n(SEQ ID NO：372)、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n(SEQ ID NO：373)、(GSGGS)n(SEQ ID NO：374)、(GGGS)n(SEQ ID NO：375)、及(GGGGS)n(SEQ ID NO：376)，其中n為至少1之整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物、及此項技術中已知的其他撓性連接子。在一些實施例中，肽連接子包含SEQ ID NO：370(GGGGSGGGS)或371(GGGGSGGGGSGGGGS)之胺基酸序列。
在一些實施例中，包含本文所述之抗PD-1 sdAb部分及一或多個其他抗體部分(諸如全長抗體、sdAb、或包含VH及VL之抗原結合部分)之抗PD-1構築體具有單特異性。在一些實施例中，包含本文所述之抗PD-1 sdAb部分及一或多個其他抗體部分(諸如全長抗體、sdAb、或包含VH及VL之抗原結合部分)之抗PD-1構築體具有多特異性(諸如雙特異性)。多特異性分子為對至少兩種不同表位具有結合特異性的分子(例如對兩種表位具有結合特異性的雙特異性抗體)。亦考慮到具有多於兩價及/或兩種特異性的多特異性分子。例如，可製備三特異性抗體。Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)。應理解，熟習此項技術者可選擇本文所述之個別多特異性分子之適當特徵以彼此組合來形成本發明之多特異性抗PD-1構築體。
在一些實施例中，抗PD-1構築體為多價但不是單特異性，即，抗PD-1構築體包含本文所述之抗PD-1 sdAb部分及至少第二抗體部分(諸如全長抗 體、sdAb、或包含VH及VL之抗原結合部分)，該第二抗體部分特異性識別與本文所述之抗PD-1 sdAb部分相同的PD-1表位。在一些實施例中，該一或多個特異性識別與本文所述之抗PD-1 sdAb部分相同的PD-1表位的抗體部分可包含與抗PD-1 sdAb部分相同的CDR及/或相同的VHH胺基酸序列。例如，抗PD-1構築體可包含二或更多個本文所述之抗PD-1 sdAb部分，其中該二或更多個抗PD-1 sdAb部分相同且視情況藉由肽連接子連接。在一些實施例中，肽連接子包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗PD-1構築體為多價但不是多特異性(例如，雙特異性)，即，抗PD-1構築體包含本文所述之抗PD-1 sdAb部分及至少第二抗體部分(諸如全長抗體、sdAb、或包含VH及VL之抗原結合部分)，該第二抗體部分特異性識別除PD-1之外的第二抗原，或本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別之不同PD-1表位。在一些實施例中，第二抗體部分為sdAb，諸如抗PD-1 sdAb或抗CTLA-4 sdAb(諸如PCT/CN2017/105506及PCT/CN2016/101777中所揭示之任一者，該等專利以全文引用之方式併入本文)。在一些實施例中，第二抗體部分特異性識別人類血清白蛋白(HSA)。在一些實施例中，本文所述之抗PD-1 sdAb部分融合至第二抗體部分之N末端及/或C末端。在一些實施例中，抗PD-1構築體為三價且具有雙特異性。在一些實施例中，抗PD-1構築體包含兩個本文所述之抗PD-1 sdAb部分及第二抗體部分(諸如抗HSA sdAb、抗CTLA-4 sdAb)，其中第二抗體部分在該兩個抗PD-1 sdAb部分之間。在一些實施例中，抗體部分視情況藉由肽連接子連接。在一些實施例中，肽連接子包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列。
包含二或更多個抗PD-1 sdAb部分之單特異性或多特異性抗PD-1構築體可相較於本文所述之單抗PD-1 sdAb部分具有增加的親合力。
包含融合至全長抗體之抗PD-1 sdAb部分的雙特異性抗體
在一些實施例中，抗PD-1構築體包含融合至第二抗體部分的本文所述之抗PD-1 sdAb部分，其中該第二抗體部分為由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體(諸如特異性識別TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、或PD-1(例如，與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位)之全長抗體)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分及全長抗體經由視情況選用之連接子(諸如肽連接子)連接。
因此在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1構築體，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分及全長抗體(諸如特異性識別TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、或PD-1(例如，與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位)之全長抗體)，其中該抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1構築體，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分及全長抗體(諸如特異性識別TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、或PD-1(例如，與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位)之全長抗體)，其中該抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；且其中該抗PD-1 sdAb部分之N末端融合至全長抗體之至少一條重鏈之C末端(如圖17所示範)。在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1構築體，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分及全長抗體(諸如特異性識別TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、或PD-1(例如，與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位)之全長抗體)，其中該抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；且其中該抗PD-1 sdAb部分之C末端融合至全長抗體之至少一條重鏈之N末端(如圖16所示範)。在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1構築體，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分及全長抗體(諸如特異性識別TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、或PD-1(例如，與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位)之全長抗體)，其中該抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；且其中該抗PD-1 sdAb部分之N末端融合至全長抗體之至少一條輕鏈之C末端(如圖19所示範)。在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1構築體，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分及全長抗體(諸如特異性識別TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、或PD-1(例如，與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位)之全長抗 體)，其中該抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；且其中該抗PD-1 sdAb部分之C末端融合至全長抗體之至少一條輕鏈之N末端(如圖18所示範)。在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1構築體，其包含四個特異性識別PD-1之sdAb部分及全長抗體(諸如特異性識別TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、或PD-1(例如，與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位)之全長抗體)，其中各抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；且其中抗PD-1 sdAb部分之C末端融合至全長抗體之重鏈及輕鏈兩者之N末端(如圖20所示範)。在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1構築體，其包含四個特異性識別PD-1之sdAb部分及全長抗體(諸如特異性識別TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、或PD-1(例如，與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位)之全長抗體)，其中各抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取 代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；其中兩個抗PD-1 sdAb部分經由第一視情況使用之連接子融合在一起，且其他兩個抗PD-1 sdAb部分經由第二視情況選用之連接子融合在一起，且其中兩個抗PD-1 sdAb融合物之各組之C末端經由第三及第四視情況選用之連接子融合至全長抗體之各重鏈之N末端(如圖21所示範)。在一些實施例中，四個抗PD-1 sdAb部分一致。在一些實施例中，四個抗PD-1 sdAb部分不同。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含SEQ ID NO：289-324中任一者之CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，全長抗體之Fc片段為hIgG1 Fc、無效應子hIgG1 Fc、hIgG2 Fc、hIgG4 Fc、或hIgG4 Fc(S228P)。在一些實施例中，全長抗體之Fc片段包含SEQ ID NO：363-365中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，全長抗體為刺激性免疫檢查點分子之活化劑。在一些實施例中，全長抗體為免疫檢查點抑制劑，諸如TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、或PD-1之抑制劑(例如，特異性識別與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位的抗體)。在一些實施例中，全長抗體為抗TIGIT抗體。在一些實施例中，抗TIGIT抗體包含：包含SEQ ID NO：377之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3之VH；以及包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3之VL。在一些實施例中，抗TIGIT抗體包含有包含SEQ ID NO：377之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，抗TIGIT抗體為替拉古單抗。在一些實施例中， 全長抗體為抗LAG-3抗體。在一些實施例中，抗LAG-3抗體包含：包含SEQ ID NO：379之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3之VH；以及包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3之VL。在一些實施例中，抗LAG-3抗體包含有包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，抗LAG-3抗體為瑞拉里單抗。在一些實施例中，全長抗體為抗TIM-3抗體。在一些實施例中，抗TIM-3抗體包含：包含SEQ ID NO：381之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3之VH；以及包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3之VL。在一些實施例中，抗TIM-3抗體包含有包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，抗TIM-3抗體為MBG453。在一些實施例中，全長抗體為抗CTLA-4抗體。在一些實施例中，抗CTLA-4抗體包含：包含SEQ ID NO：383之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3之VH；以及包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3之VL。在一些實施例中，抗CTLA-4抗體包含有包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，抗CTLA-4抗體為伊匹單抗(例如，Yervoy®)。在一些實施例中，全長抗體為抗PD-1抗體(例如，特異性識別與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位)。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體包含：包含SEQ ID NO：385之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3之VH；以及包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3之VL。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體包含有包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體為派姆單抗(例如，Keytruda®)或納武單抗(例如，Opdivo®)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分及全長抗體 視情況由肽連接子連接。在一些實施例中，肽連接子包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。
TIGIT
具有Ig及ITIM域之T細胞免疫受體(TIGIT，亦稱為Vstm3或WUCAM)為屬於CD28家族之免疫受體。TIGIT經由若干機制發揮其抑制性免疫檢查點功能。第一，在結合其主要配體CD155(PVR)後，其ITIM域中TIGIT之隨後磷酸化轉導抑制性訊號以經由NF-κB路徑下調T細胞及NK細胞中之IFN-γ表現。第二，由於TIGIT在高於CD226的親和力下與PVR相互作用，所以其與CD226競爭並減弱由CD226轉導之刺激性訊號。第三，PVR在樹突細胞上結合TIGIT可導致IL-10表現之上調及IL-12表現之下調，因此損害樹突細胞之抗腫瘤免疫反應。最後，最近的研究指示，TIGIT可直接順式結合CD226以抑制CD226二聚化，其為T細胞活化所必需的。因此，TIGIT在感染及癌症之免疫反應中充當重要的負調控因子，且已提出阻斷TIGIT傳訊為增強T細胞及NK細胞免疫性以供癌症治療的方法。可應用於本申請案之示範性抗TIGIT抗體包括但不限於替拉古單抗。
包含針對TIGIT及PD-1之雙特異性的構築體在下文中稱為「抗TIGIT/PD-1抗體」、「抗TIGIT/PD-1構築體」、「PD-1×TIGIT抗體」、或「PD-1×TIGIT BABP」。
LAG-3
LAG-3(淋巴球活化基因-3，CD223)藉由對Treg之作用以及對CD8+T細胞的直接作用起到抑制免疫反應，的作用(Huang等人，2004,Immunity. 21(4)：503-13；Grosso等人，2007,J Clin Invest.117(11)：3383-92)。可應用於本申請案之示範性抗LAG-3抗體包括但不限於瑞拉里單抗(BMS-986016)。
包含針對LAG-3及PD-1之雙特異性的構築體在下文中稱為「抗LAG-3/PD-1抗體」、「抗LAG-3/PD-1構築體」、「PD-1×LAG-3抗體」、或「PD-1×LAG-3 BABP」。
TIM-3
含有T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域-3(TIM-3)亦稱為A型肝炎病毒細胞受體2(HAVCR2)。其為免疫檢查點分子，其與淋巴球活性之抑制相關，且在一些情況下與淋巴細胞無反應相關(Pardoll D.,Nature Reviews,2012年4月，第12期：252)。TIM-3為半乳糖凝集素9(GAL9)之受體，其在各種類型的癌症(包括乳癌)中經上調。TIM-3經鑒別為由耗竭CD8+T細胞表現之另一重要抑制性受體。在小鼠癌症模型中，已顯示大多數功能不良腫瘤浸潤CD8+T細胞實際上共表現PD-1及T-M-3。可應用於本申請案之示範性抗TIM-3抗體包括但不限於MBG453。
包含針對TIM-3及PD-1之雙特異性的構築體在下文中稱為「抗TIM-3/PD-1抗體」、「抗TIM-3/PD-1構築體」、「PD-1×TIM-3抗體」、或「PD-1×TIM-3 BABP」。
CTLA-4
細胞毒性T淋巴球相關蛋白4(CTLA-4或CD152)為CD28之同源物，且已知為活化T細胞上經上調之抑制性免疫檢查點分子。CTLA-4亦結合B7-1及B7-2，但親和力大於CD28。B7與CTLA-4之間的相互作用阻抑T細胞活化，其組成腫瘤免疫逃逸之重要機制。抗-CTLA-4抗體療法已在許多癌症中顯示出前景，諸如黑色素瘤。可應用於本申請案之示範性抗CTLA-4抗體包括但不限於伊匹單抗(例如，Yervoy®)。
包含針對CTLA-4及PD-1之雙特異性的構築體在下文中稱為「抗CTLA-4/PD-1抗體」、「抗CTLA-4/PD-1構築體」、「PD-1×CTLA-4抗體」、或「PD-1×CTLA-4 BABP」。
PD-1
在一些實施例中，第二抗體部分為由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體，其特異性識別PD-1之另一表位，與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別之PD-1表位不同。在一些實施例中，將本文所述之抗PD-1 sdAb部分與特異性識別不同PD-1表位之抗PD-1全長抗體融合將增加抗體效力。可應用於本申請案之示範性抗PD-1抗體包括但不限於派姆單抗(例如，Keytruda®)及納武單抗(例如，Opdivo®)。
包含針對PD-1之雙特異性的構築體在下文中稱為「抗PD-1/PD-1抗體」、「抗PD-1/PD-1構築體」、「PD-1/PD-1抗體」、或「PD-1×PD-1 BABP」。在一些實施例中，亦提供一種抗PD-1構築體，其包含特異性識別PD-1之sdAb半部分(下文稱為「競爭性抗PD-1構築體」)，其以與以下中任一者競爭之方式特異性結合PD-1：本文所述之抗PD-1構築體(諸如抗PD-1 sdAb部分、抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，抗PD-1 HCAb)、包含本文所述之抗PD-1 sdAb部分之多特異性或單特異性抗PD-1構築體(例如，本文所述之PD-1×TIGIT BABP、PD-1×LAG-3 BABP、PD-1×TIM-3 BABP、PD-1×CTLA-4 BABP、或PD-1×PD-1 BABP)。
抗PD-1多特異性抗原結合蛋白(MABP)
在一些實施例中，提供一種經單離抗PD-1構築體，其包含融合至包含VH及VL之全長抗體或抗原結合片段的本文所述之抗PD-1 sdAb部分，其中該抗PD-1構築體具有多特異性(下文稱為「多特異性抗PD-1構築體」或「PD-1多特異性抗原結合蛋白(MABP)」)。在一些實施例中，抗PD-1 MABP具有雙特 異性(下文稱為「雙特異性抗PD-1構築體」或「抗PD-1雙特異性抗原結合蛋白(BABP)」)。抗PD-1 sdAb部分特異性結合與包含VH及VL之全長抗體或抗原結合片段所識別之靶標不同的PD-1，從而賦予廣泛的靶向能力。由於sdAb較小，所以在一些實施例中，與全長抗體或抗原結合片段組分相比，本文所述之抗PD-1 MABP(例如，抗PD-1 BABP)可具有類似的分子量及藥代動力學性質。例如，可藉由將一或多個抗PD-1 sdAb部分與具有經證實的臨床功效及安全性的單株抗體融合來設計抗PD-1 MABP，以提供增加的臨床益處及期望的藥代動力學性質，而不妨礙多特異性構築體之表現性。在一些實施例中，將一或多個本文所述之抗PD-1 sdAb部分藉由視情況選用之肽連接子融合至全長抗體或抗原結合片段。本文所述之抗PD-1 MABP(例如，抗PD-1 BABP)可用於靶向除PD-1之外的多種疾病相關表位或抗原組合，諸如與免疫檢查點分子、細胞表面抗原(諸如腫瘤抗原)、或促發炎分子組合之PD-1，從而提供可用於治療多種疾病及病狀(諸如癌症、發炎、及自體免疫疾病)之藥劑。抗PD-1 MABP(例如，抗PD-1 BABP)可具有任何形式，例如PCT/CN2017/093644中所揭示者，該專利以全文引用之方式併入本文。
示範性抗PD-1 MABP及BABP
在一些實施例中，抗PD-1 MABP(例如，BABP)包含：(a)第一抗原結合部分，其包含本文所述之特異性識別PD-1之sdAb部分；及(b)第二抗原結合部分，其包含VH及VL，其中VH及VL一起形成特異性結合TIGIT之抗原結合位點，其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合(下文稱為「PD-1×TIGIT MABP」或「PD-1×TIGIT BABP」)。在一些實施例中，抗PD-1 MABP(例如，BABP)包含：(a)第一抗原結合部分，其包含本文所述之特異性識別PD-1之sdAb部分；及(b)第二抗原結合部分，其包含VH及VL，其中VH及VL一起形成特異性結合LAG-3之抗原結合位點，其中第一抗原結合部分及第二 抗原結合部分彼此融合(下文稱為「PD-1×LAG-3 MABP」或「PD-1×LAG-3 BABP」)。在一些實施例中，抗PD-1 MABP(例如，BABP)包含：(a)第一抗原結合部分，其包含本文所述之特異性識別PD-1之sdAb部分；及(b)第二抗原結合部分，其包含VH及VL，其中VH及VL一起形成特異性結合TIM-3之抗原結合位點，其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合(下文稱為「PD-1×TIM-3 MABP」或「PD-1×TIM-3 BABP」)。在一些實施例中，抗PD-1 MABP(例如，BABP)包含：(a)第一抗原結合部分，其包含本文所述之特異性識別PD-1之sdAb部分；及(b)第二抗原結合部分，其包含VH及VL，其中VH及VL一起形成特異性結合CTLA-4之抗原結合位點，其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合(下文稱為「PD-1×CTLA-4 MABP」或「PD-1×CTLA-4 BABP」)。在一些實施例中，抗PD-1 MABP(例如，BABP)包含：(a)第一抗原結合部分，其包含本文所述之特異性識別PD-1之sdAb部分；及(b)第二抗原結合部分，其包含VH及VL，其中VH及VL一起形成特異性結合與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位，其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合(下文稱為「PD-1×PD-1 MABP」或「PD-1×PD-1 BABP」)。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 BABP，其包含：(a)第一多肽，其自N末端至C末端包含：VH-CH1-CH2-CH3-抗PD-1 sdAb部分；及(b)第二多肽，其自N末端至C末端包含：VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位))之抗原結合位點，且其中抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任 一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIGIT之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自替拉古單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：377之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合LAG-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自瑞拉里單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIM-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自MBG453。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合CTLA-4之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自伊匹單抗(例如，Yervoy®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別不同的第二PD-1表位)之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗(例如，Keytruda®)或納武單抗(例如，Opdivo®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO： 385之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，CH3及抗PD-1 sdAb部分視情況經由肽連接子彼此融合，諸如包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列之肽連接子。在一些實施例中，CH2及CH3域來源於為IgG1 Fc、無效應子IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc、或IgG4 Fc(S228P)，例如SEQ ID NO：363-365中任一者。在一些實施例中，抗PD-1 BABP包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。在一些實施例中，PD-1 BABP具有如圖17中所示之結構。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 BABP，其包含：(a)第一多肽，其自N末端至C末端包含：抗PD-1 sdAb部分-VH-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其自N末端至C末端包含：VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位))之抗原結合位點，且其中抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基 酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIGIT之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自替拉古單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：377之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合LAG-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自瑞拉里單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIM-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自MBG453。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合CTLA-4之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自伊匹單抗(例如，Yervoy®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別不同的第二PD-1表位)之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗(例如，Keytruda®)或納武單抗(例如，Opdivo®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及抗PD-1 sdAb部分視情況經由肽連接子彼此融合，諸如包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列之肽連接子。在一些實施例中，CH2及CH3域來 源於為IgG1 Fc、無效應子IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc、或IgG4 Fc(S228P)，例如SEQ ID NO：363-365中任一者。在一些實施例中，抗PD-1 BABP包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。在一些實施例中，PD-1 BABP具有如圖16中所示之結構。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 BABP，其包含：(a)第一多肽，其自N末端至C末端包含：VH-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其自N末端至C末端包含：VL-CL-抗PD-1 sdAb部分，其中VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位))之抗原結合位點，且其中抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIGIT之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自替拉古單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：377之胺基序列之HC-CDR1、 HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合LAG-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自瑞拉里單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIM-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自MBG453。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合CTLA-4之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自伊匹單抗(例如，Yervoy®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別不同的第二PD-1表位)之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗(例如，Keytruda®)或納武單抗(例如，Opdivo®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，CL及抗PD-1 sdAb部分視情況經由肽連接子彼此融合，諸如包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列之肽連接子。在一些實施例中，CH2及CH3域來源於為IgG1 Fc、無效應子IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc、或IgG4 Fc(S228P)，例如SEQ ID NO：363-365中任一者。在一些實施例中，抗PD-1 BABP包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12 M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。在一些實施例中，PD-1 BABP具有如圖19中所示之結構。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 BABP，其包含：(a)第一多肽，其自N末端至C末端包含：VH-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其自N末端至C末端包含：抗PD-1 sdAb部分-VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位))之抗原結合位點，且其中抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIGIT之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自替拉古單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：377之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合LAG-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自瑞拉里單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3， 且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIM-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自MBG453。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合CTLA-4之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自伊匹單抗(例如，Yervoy®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別不同的第二PD-1表位)之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗(例如，Keytruda®)或納武單抗(例如，Opdivo®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VL及抗PD-1 sdAb部分視情況經由肽連接子彼此融合，諸如包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列之肽連接子。在一些實施例中，CH2及CH3域來源於為IgG1 Fc、無效應子IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc、或IgG4 Fc(S228P)，例如SEQ ID NO：363-365中任一者。在一些實施例中，抗PD-1 BABP包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。在一些實施例中，PD-1 BABP具有如圖18中所示之結構。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一多肽，其自N末端至C末端包含：抗PD-1 sdAb1部分-VH-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其自N末端至C末端包含：抗PD-1 sdAb2部分-VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位))之抗原結合位點，且其中抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分各自包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分各自包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分各自分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分相同。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分不同。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIGIT之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自替拉古單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：377之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合LAG-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自瑞拉里單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基序列之HC-CDR1、 HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIM-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自MBG453。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合CTLA-4之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自伊匹單抗(例如，Yervoy®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別不同的第二PD-1表位)之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗(例如，Keytruda®)或納武單抗(例如，Opdivo®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VL及抗PD-1 sdAb2部分視情況經由肽連接子彼此融合，諸如包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列之肽連接子。在一些實施例中，VL及抗PD-1 sdAb1部分視情況經由肽連接子彼此融合，諸如包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列之肽連接子。在一些實施例中，CH2及CH3域來源於為IgG1 Fc、無效應子IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc、或IgG4 Fc(S228P)，例如SEQ ID NO：363-365中任一者。在一些實施例中，抗PD-1 MABP(例如，BABP)包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部 分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。在一些實施例中，PD-1 MABP(例如，BABP)具有如圖20中所示之結構。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一多肽，其自N末端至C末端包含：抗PD-1 sdAb1部分-抗PD-1 sdAb2部分-VH-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其自N末端至C末端包含：VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位))之抗原結合位點，且其中抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分各自包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分各自包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分各自分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分相同。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分不同。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIGIT之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自替拉古單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：377之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異 性結合LAG-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自瑞拉里單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIM-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自MBG453。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合CTLA-4之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自伊匹單抗(例如，Yervoy®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別不同的第二PD-1表位)之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗(例如，Keytruda®)或納武單抗(例如，Opdivo®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分、及/或VH及抗PD-1 sdAb2部分視情況經由肽連接子彼此融合，諸如包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列之肽連接子。在一些實施例中，CH2及CH3域來源於為IgG1 Fc、無效應子IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc、或IgG4 Fc(S228P)，例如SEQ ID NO：363-365中任一者。在一些實施例中，抗PD-1 MABP(例如，BABP)包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌 合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。在一些實施例中，PD-1 MABP(例如，BABP)具有如圖21中所示之結構。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 BABP，其包含：(a)第一多肽，其自N末端至C末端包含：VH-CH1-抗PD-1 sdAb部分-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其自N末端至C末端包含：VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位))之抗原結合位點，且其中抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIGIT之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自替拉古單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：377之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合LAG-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自瑞拉里單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。 在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIM-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自MBG453。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合CTLA-4之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自伊匹單抗(例如，Yervoy®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別不同的第二PD-1表位)之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗(例如，Keytruda®)或納武單抗(例如，Opdivo®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，CH1及抗PD-1 sdAb部分視情況經由肽連接子彼此融合，諸如包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列之肽連接子。在一些實施例中，CH2及CH3域來源於為IgG1 Fc、無效應子IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc、或IgG4 Fc(S228P)，例如SEQ ID NO：363-365中任一者。在一些實施例中，抗PD-1 BABP包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。在一些實施例中，PD-1 BABP具有如圖22中所示之結構。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 BABP，其包含有自N末端至C末端包含VL-VH-抗PD-1 sdAb部分-CH2-CH3之多肽，其中VL及VH在一起形成 特異性識別第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位))之scFv，且其中抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 BABP，其包含有自N末端至C末端包含VH-VL-抗PD-1 sdAb部分-CH2-CH3之多肽，其中VL及VH在一起形成特異性識別第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位))之scFv，且其中抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)特異性結合TIGIT。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)來源於替拉古單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：377之胺基序列之HC-CDR1、 HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)特異性結合LAG-3。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)來源於瑞拉里單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)特異性結合TIM-3。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)來源於MBG453。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)特異性結合CTLA-4。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)來源於伊匹單抗(例如，Yervoy®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)特異性結合PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別不同的第二PD-1表位)。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)來源於派姆單抗(例如，Keytruda®)或納武單抗(例如，Opdivo®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及形成scFv之VL、及/或scFv及抗PD-1 sdAb部分視情況經由肽連接子彼此融合，諸如包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列之肽連接子。在一些實施例中，CH2及CH3域來源於為IgG1 Fc、無效應子IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc、或IgG4 Fc(S228P)，例如SEQ ID NO：363-365中任一者。在一些實施例中，抗PD-1 BABP包含多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分 與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。在一些實施例中，PD-1 BABP具有如圖23中所示之結構。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一多肽，其自N末端至C末端包含：VH-CH1-抗PD-1 sdAb1部分-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其自N末端至C末端包含：VL-CL-抗PD-1 sdAb2部分-CL，其中VH及VL形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位))之抗原結合位點，且其中抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分各自包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分各自包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分各自分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分相同。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分不同。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIGIT之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自替拉古單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：377 之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合LAG-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自瑞拉里單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合TIM-3之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域均源自MBG453。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合CTLA-4之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自伊匹單抗(例如，Yervoy®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及VL形成特異性結合PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別不同的第二PD-1表位)之抗原結合位點。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗(例如，Keytruda®)或納武單抗(例如，Opdivo®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，CH1及抗PD-1 sdAb1部分、及/或CL及抗PD-1 sdAb2部分視情況經由肽連接子彼此融合，諸如包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列之肽連接子。在一些實施例中，CH2及CH3域來源於為IgG1 Fc、無效應子IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc、或IgG4 Fc(S228P)，例如SEQ ID NO：363-365中任一者。在一些實施例中，抗PD-1 MABP(例如，BABP)包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb 部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。在一些實施例中，PD-1 MABP(例如，BABP)具有如圖24中所示之結構。
在一些實施例中，提供一種抗PD-1 MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一多肽，其自N末端至C末端包含：VL-VH-抗PD-1 sdAb1部分-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其自N末端至C末端包含：抗PD-1 sdAb2部分-CL，其中VL及VH形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位))之scFv，且其中抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分各自包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，提供一種抗PD-1 MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一多肽，其自N末端至C末端包含：VH-VL-抗PD-1 sdAb1部分-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其自N末端至C末端包含：抗PD-1 sdAb2部分-CL，其中VL及VH形成特異性結合第二表位(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位))之scFv，且其中抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分各自包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之 變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分各自包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分各自分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分相同。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb1部分及抗PD-1 sdAb2部分不同。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)特異性結合TIGIT。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)來源於替拉古單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：377之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)特異性結合LAG-3。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)來源於瑞拉里單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)特異性結合TIM-3。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)來源於MBG453。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)特異性結合CTLA-4。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)來源於伊匹單抗(例如，Yervoy®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：384 之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)特異性結合PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分識別不同的第二PD-1表位)。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)來源於派姆單抗(例如，Keytruda®)或納武單抗(例如，Opdivo®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，VH及形成scFv之VL、及/或scFv及抗PD-1 sdAb1部分視情況經由肽連接子彼此融合，諸如包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列之肽連接子。在一些實施例中，CH2及CH3域來源於為IgG1 Fc、無效應子IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4 Fc、或IgG4 Fc(S228P)，例如SEQ ID NO：363-365中任一者。在一些實施例中，抗PD-1 MABP(例如，BABP)包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。在一些實施例中，PD-1 MABP(例如，BABP)具有如圖25中所示之結構。
在一些實施例中，亦提供一種抗PD-1 MABP(例如，BABP)，其包含特異性識別PD-1之sdAb半部分(下文稱為「競爭性抗PD-1構築體」、「競爭性抗PD-1 MABP」、或「競爭性抗PD-1 BABP」)，其以與以下中任一者競爭之方式特異性結合PD-1：本文所述之抗PD-1構築體(諸如抗PD-1 sdAb部分、抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、包含本文所述之抗PD-1 sdAb部分之多特異性(例如，雙特異性)或單特異性抗PD-1構築體(例如，本文所述之抗PD-1/TIGIT、抗PD-1/LAG-3、抗PD-1/TIM-3、抗PD-1/CTLA-4、或抗PD-1/PD-1構築體(例如，MABP或BABP))。
(III)抗PD-1構築體抗體變異體
在一些實施例中，考慮到本文所提供之抗PD-1構築體(例如，抗PD-1 sdAb部分、抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、抗PD-1 MABP/BABP)之胺基酸序列變異體。例如，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼抗體之核酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如抗體之胺基酸序列內殘基之缺失、及/或插入、及/或取代。可進行缺失、插入、及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合。
a)取代、插入、缺失、及變異體
在一些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於取代誘變之所關注位點包括HVR(或CDR)及FR。保守取代顯示於表2中之標題「較佳取代」下。更實質性變化提供於表2中標題「示範性取代」下，且如下文參考胺基酸側鏈類別進一步描述。胺基酸取代可引入至所關注抗體中，且針對如下所需活性篩選產物：例如保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性、或改良之ADCC或CDC。
胺基酸可根據常見側鏈性質進行分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；及(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將必然伴有將此等類別中之一者之成員換成另一個類別。
一種類型之取代型變異體關於取代親本抗體(例如人源化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。通常，所產生之經選擇用於進一步研究的變異體將相對於親本抗體具有某些生物特性之修飾(例如，改良)(例如，增加之親和力、減少之免疫原性)及/或將具有實質上經保持的親本抗體之某些生物特性。一種示範性取代變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體顯示之親和力成熟技術(諸如本文所述之彼等)便利地產生。簡言之，一或多個HVR殘基發生突變且該等變異體抗體在噬菌體上顯示且針對特定生物活性(例如，結合親和力)進行篩選。
可在HVR中產生改變(例如，取代)，例如以改良抗體親和力。可在HVR「熱點」(亦即由在體細胞成熟過程期間以高頻率經受突變之密碼子編碼之殘基)(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或SDR(a-CDR)中進行此等改變，且測試所得變異型VH或VL之結合親和力。藉由構築且自二級文庫重新選擇之親和力成熟已描述於例如Hoogenboom等人.Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ, (2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之誘變)中之任一者將多樣性引入至所選用於成熟之可變基因中。然後產生二級文庫。然後篩選文庫以鑒別具有所需親和力的任何抗體變異體。引入多樣性的另一方法涉及HVR定向方法，其中使若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。牽涉於抗原結合中之HVR殘基可例如使用丙胺酸掃描誘變或模型化特定地加以鑒別。通常尤其靶向CDR-H3及CDR-L3。
在一些實施例中，取代、插入、或缺失可出現於一或多個HVR內，只要該等改變不會實質上降低該抗體結合抗原之能力。例如，可在HVR中產生不會實質上降低結合親和力之保守改變(例如，如本文所提供之保守取代)。此等改變可在HVR「熱點」或CDR以外。在上文所提供之變異體VHH序列的一些實施例中，各HVR未改變，或含有僅一種、兩種或三種胺基酸取代。
用於鑒別抗體中可經靶向用於誘變之殘基或區的適用方法係稱作「丙胺酸掃描誘變」，如由Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085所述。在此方法中，靶標殘基(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys、及Glu)中之一殘基或一組經鑒別且由中性或帶負電胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)置換以確定該抗體與抗原的相互作用是否受到影響。進一步取代可在胺基酸位置處引入，證明對初始取代之功能敏感性。可替代地或另外，抗原-抗體複合物之晶體結構用來鑒別抗體與抗原之間的接觸點。該等接觸殘基及相鄰殘基可作為取代之候選物經靶向或消除。可篩選變異體以確定其是否含有所需特性。
胺基酸序列插入包括長度介於一個殘基至含有一百或更多個殘基之多肽範圍內的胺基端及/或羧基端融合體，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。該抗體分子之其他插入變異體包括該抗體的N端或C端融合至酶(例如，針對ADEPT)或增加該抗體之血清半衰期的多肽。
b)醣化變異體
在一些實施例中，改變本文所提供之抗PD-1抗體以增加或減小構築體醣化的程度。向抗體中添加醣化位點或使抗體缺失醣化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個醣化位點來便利地實現。
在抗PD-1構築體包含Fc區(例如，抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、PD-1×TIGIT MABP、PD-1×LAG-3 MABP、PD-1×TIM-3 MABP、PD-1×CTLA-4 MABP、或PD-1×PD-1 MABP)之情況下，與之連接之碳水化合物可改變。由哺乳動物細胞產生之原生抗體通常包含分支鏈雙觸角寡醣，其一般藉由N鍵鏈接於Fc區之CH2域之Asn297上。參見例如Wright等人.TIBTECH 15：26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、及唾液酸，以及鏈接於雙觸角寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc上的海藻糖。在一些實施例中，可對本發明的抗PD-1抗體中的寡醣進行修飾以產生具有某些改善特性的抗體變異體。
在一些實施例中，提供具有缺乏附接(直接或間接)於Fc區上之海藻糖之碳水化合物結構的抗PD-1構築體抗體變異體。例如，此類抗體中海藻糖的量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%、或20%至40%。海藻糖之量藉由如藉由MALDI-TOF質譜法所量測，計算相對於連接至Asn297之所有糖結構(例如，複合、雜合、及高甘露糖結構)的總和，在糖鏈內之Asn297處之海藻糖的平均量來測定，如例如WO2008/077546中所述。Asn297係指位於Fc區中之約位置297處的天冬醯胺殘基(Fc區殘基之EU編號)；然而，Asn297亦可由於抗體中之微小序列變異而位於位置297上游或下游約±3個胺基酸處，亦即在位置294與300之間。該等海藻糖基化變異體可具有經改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US2003/0157108號(Presta,L.)；第US2004/0093621號(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd)。關於「脫海藻糖基化」或「缺乏海藻糖」抗體變 異體之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去海藻糖基化抗體之細胞株之實例包括缺乏蛋白質海藻糖基化作用之Lec13 CHO細胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312A1，Adams等人，尤其在實例11中)及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因FUT8基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
抗PD-1構築體變異體進一步具有平分寡醣，例如其中連接於抗體之Fc區上的雙觸角寡醣藉由GlcNAc平分。該等抗體變異體可具有降低之海藻糖基化及/或經改良之ADCC功能。此類抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)。亦提供在連接至Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。該等抗體變異體可具有經改良之CDC功能。此類抗體變異體描述於例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc區變異體
在一些實施例中，可將一或多種修飾引入至本文所提供之抗PD-1構築體之(例如，抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、PD-1×TIGIT MABP、PD-1×LAG-3 MABP、PD-1×TIM-3 MABP、PD-1×CTLA-4 MABP、或PD-1×PD-1 MABP)Fc區中，從而生成Fc區變異體。Fc區變異體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4 Fc區)，其在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)。
在一些實施例中，本發明涵蓋一種抗PD-1構築體(例如，抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、PD-1×TIGIT MABP、PD-1×LAG-3 MABP、PD-1×TIM-3 MABP、PD-1×CTLA-4 MABP、或PD-1×PD-1 MABP)變異體，其具有一些但非所有效應功能，該等效應功能使其成為抗PD-1構築體之體內半衰期重要但某些效應功能(諸如補體及ADCC)不必要或有害的應用所需候選物。可進行體外及/或體內細胞毒性檢定以確認CDC及/或ADCC活性的降低/減少。例如，可以進行Fc受體(FcR)結合檢定以確保抗體缺乏FcγR結合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC的初級細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII、及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)第464頁中之表2中。用於評估所關注分子之ADCC活性之體外檢定之非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號中(參見例如Hellstrom,I.等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom，I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。可替代地，可採用非放射性檢定方法(參見例如流動式細胞測量術之ACTITM非放射性細胞毒性檢定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性檢定(Promega,Madison,WI))。用於此類檢定之有用效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。可替代地或另外，所關注之分子之ADCC活性可例如在動物模型中進行體內評估，諸如Clynes等人.Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中揭示之動物模型。亦可進行C1q結合檢定以確認抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可進行CDC檢定(參見例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用此項技術中已知之方法進行FcRn結合及體內清除率/半衰期確定(參見例如Petkova,S.B.等人，Int'l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低的效應功能的抗體包括具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327、及329中之一或多者之取代的那些(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297、及327中之二或更多處具有取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代成丙胺酸的所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
與FcR之結合經改良或削弱的某些抗體變異體已有描述。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在一些實施例中，抗PD-1構築體變異體包含具有一或多個改良ADCC的胺基酸取代(例如在Fc區之位置298、333、及/或334(EU殘基編號)處之取代)的Fc區。
考慮搭配包含本文所述之任一Fc變異體之抗PD-1構築體(諸如本文所述之抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、融合至全長抗體之抗PD-1 sdAb、或抗PD-1 MABP/BABP)或其組合。
d)半胱胺酸工程改造抗體變異體
在一些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程改造抗PD-1構築體，例如「巰基單抗(thioMAb)」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在具體實施例中，經取代殘基存在於抗體之可及位點處。藉由經半胱胺酸取代 彼等殘基，反應性硫醇基由此經定位於抗體之可及位點處且可用於使抗體綴合於其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)以產生免疫綴合物，如本文中進一步描述。在一些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。可如例如美國專利第7,521,541號中所述來生成半胱胺酸工程改造抗PD-1構築體。
III.醫藥組成物
本申請案進一步提供醫藥組成物，其包含如本文所述之包含特異性識別PD-1之sdAb的任一種抗PD-1構築體(諸如抗PD-1 sdAb、抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、抗PD-1/TIGIT雙特異性抗體(例如，PD-1×TIGIT BABP)、抗PD-1/LAG-3雙特異性抗體(例如，PD-1×LAG-3 BABP)、抗PD-1/TIM-3雙特異性抗體(例如，PD-1×TIM-3 BABP)、抗PD-1/CTLA-4雙特異性抗體(例如，PD-1×CTLA-4 BABP)、或抗PD-1/PD-1雙特異性抗體(例如，PD-1×PD-1 BABP))及視情況醫藥學上可接受之載劑。醫藥組成物可藉由將本文所述之具有所要程度之純度的抗PD-1構築體與視情況選用之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑、或穩定劑混合來製備(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980))，其為凍乾調配物或水溶液形式。
醫藥組成物較佳為穩定的，其中包含本文所述之抗PD-1 sdAb部分之抗PD-1構築體在儲存時基本上保持其物理及化學穩定性以及完整性。用於量測蛋白穩定性之各種分析技術係此項技術中可用的且評述於Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee編，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)以及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)。
為了使醫藥組成物用於體內投與，其必須為無菌的。可藉由過濾通過無菌過濾膜來使醫藥組成物無菌。通常將本文中之醫藥組成物放置於具有無菌進入孔的容器中，例如具有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。
投與途徑根據已知且已接受之方法，諸如藉由單次或多次推注或者以合適方式在長時間內輸注，例如藉由皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、病灶內、或關節內途徑進行注射或輸注，局部投與，吸入，或藉由持續釋放或延長釋放方式。在一些實施例中，醫藥組成物係局部投與，諸如腫瘤內投與。
本文中之醫藥組成物亦可含有多於一種如欲治療之具體適應症所需的活性化合物，較佳為具有互補活性並且不會對彼此有不利影響的化合物。可替代地或另外，組成物可包含細胞毒性劑、化學治療劑、細胞介素、免疫抑制劑、或生長抑制劑。此類分子合適地以對預期之目的有效之量以組合形式存在。
IV.治療PD-1相關疾病之方法
如本文所述之包含特異性識別PD-1之sdAb部分之抗PD-1構築體(諸如抗PD-1 sdAb、抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、抗PD-1/TIGIT雙特異性抗體(例如，PD-1×TIGIT BABP)、抗PD-1/LAG-3雙特異性抗體(例如，PD-1×LAG-3 BABP)、抗PD-1/TIM-3雙特異性抗體(例如，PD-1×TIM-3 BABP)、抗PD-1/CTLA-4雙特異性抗體(例如，PD-1×CTLA-4 BABP)、或抗PD-1/PD-1雙特異性抗體(例如，PD-1×PD-1 BABP))以及其組成物(諸如醫藥組成物)可用於多種應用，諸如診斷、分子檢定、及療法。
本發明之一個態樣提供一種治療有需要之個體中之PD-1相關疾病或病狀之方法，其包含向個體投與有效量之包含本文所述之抗PD-1構築體之醫藥組成物。在一些實施例中，PD-1相關疾病為癌症，諸如實體腫瘤(例如，結腸癌)。在一些實施例中，PD-1相關疾病係病原性感染，例如病毒感染。在一些實施例中，PD-1相關疾病為免疫相關疾病。在一些實施例中，免疫相關疾病與T細胞功能不良病症相關。在一些實施例中，T細胞功能不良病症之特徵在於T細胞無反應或分泌細胞介素、增殖、或執行細胞溶解活性之能力降低。在一些 實施例中，T細胞功能不良病症之特徵在於T細胞耗竭。在一些實施例中，T細胞為CD4+及CD8+ T細胞。在一些實施例中，免疫相關疾病選自由以下組成之群：未解決之急性感染、慢性感染、及腫瘤免疫性。在一些實施例中，本文所述之抗PD-1構築體可用於增加、增強、或刺激有需要之受試者之免疫反應或功能。在一些實施例中，PD-1相關疾病(例如，癌症、免疫相關疾病)部分耐免疫檢查點分子單阻斷(例如，部分耐抗TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1抗體單一療法治療)。
本發明部分涵蓋抗PD-1蛋白構築體(諸如抗PD-1 sdAb、抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、抗PD-1/TIGIT雙特異性抗體(例如，PD-1×TIGIT BABP)、抗PD-1/LAG-3雙特異性抗體(例如，PD-1×LAG-3 BABP)、抗PD-1/TIM-3雙特異性抗體(例如，PD-1×TIM-3 BABP)、抗PD-1/CTLA-4雙特異性抗體(例如，PD-1×CTLA-4 BABP)、或抗PD-1/PD-1雙特異性抗體(例如，PD-1×PD-1 BABP))、編碼其之核酸分子或載體、包含編碼其之核酸分子或載體之宿主細胞，其可單獨或以與另一療法組合之形式，且在一些態樣中，連同醫藥學上可接受之載劑或賦形劑進行投與。在一些實施例中，在投與抗PD-L1構築體之前，其可與此項技術熟知之合適之醫藥載劑及賦形劑組合。根據本揭露所製備之組成物可用於治療癌症或延遲癌症惡化，或增加、增強、或刺激有需要之受試者之免疫反應或功能。
在一些實施例中，提供一種治療PD-1相關疾病(例如，癌症、免疫相關疾病諸如與T細胞功能不良病症相關之疾病)之方法，其包含向個體投與有效量醫藥組成物，該醫藥組成物包含包含經單離抗PD-1構築體之及視情況醫藥學上可接受之載劑，該經單離抗PD-1構築體包含特異性識別PD-1之sdAb部分(諸如抗PD-1 sdAb、抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、抗PD-1/TIGIT雙特異性抗體(例如，PD-1×TIGIT BABP)、抗PD-1/LAG-3雙特異性抗體(例如， PD-1×LAG-3 BABP)、抗PD-1/TIM-3雙特異性抗體(例如，PD-1×TIM-3 BABP)、抗PD-1/CTLA-4雙特異性抗體(例如，PD-1×CTLA-4 BABP)、或抗PD-1/PD-1雙特異性抗體(例如，PD-1×PD-1 BABP))，其中該抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，PD-1相關疾病為癌症。在一些實施例中，癌症為實體腫瘤(諸如結腸癌)。在一些實施例中，PD-1相關疾病為免疫相關疾病。在一些實施例中，免疫相關疾病與T細胞功能不良病症相關。在一些實施例中，T細胞功能不良病症之特徵在於T細胞無反應或分泌細胞介素、增殖、或執行細胞溶解活性之能力降低。在一些實施例中，T細胞功能不良病症之特徵在於T細胞耗竭。在一些實施例中，免疫相關疾病選自由以下組成之群：未解決之急性感染、慢性感染、及腫瘤免疫性。在一些實施例中，PD-1相關疾病(例如，癌症、免疫相關疾病)部分耐免疫檢查點抑制劑單一療法(例如，部分耐抗TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1抗體單一療法治療)。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投與額外療法(例如，癌症療法)，諸如手術、放射、化療、免疫療法、激素療法、或其組合。在一些實施例中，額外療法為免疫療法，例如，藉由向個體投與有效量包含免 疫調節劑之第二醫藥組成物。在一些實施例中，免疫調節劑為免疫檢查點抑制劑，例如，抗TIGIT、抗LAG-3、抗TIM-3、抗CTLA-4、抗PD-1、或抗PD-L1抗體。在一些實施例中，醫藥組成物係全身(諸如靜脈內或腹膜內)投與。在一些實施例中，醫藥組成物局部(例如腫瘤內)投與。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，該治療癌症之方法具有一或多種以下生物活性：(1)殺死癌細胞(包括旁觀者殺死)；(2)抑制癌細胞之增殖；(3)在腫瘤中誘導免疫應答；(4)減小腫瘤大小；(5)緩解患有癌症之個體之一或多種症狀；(6)抑制腫瘤轉移；(7)延長生存期；(8)延長癌症進展時間；(9)預防、抑制癌症復發、或降低癌症復發之可能性。在一些實施例中，藉由本文所述之醫藥組成物介導之殺傷癌細胞之方法可達成至少約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或更大中任一者之腫瘤細胞死亡率。在一些實施例中，藉由本文所述之醫藥組成物介導之殺傷癌細胞之方法可達成至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或更大中任一者之旁觀腫瘤細胞(例如未受編碼抗PD-1構築體之溶瘤VV感染)死亡率。在一些實施例中，藉由本文所述之醫藥組成物介導之減小腫瘤大小之方法可減小至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%、或100%中任一者)腫瘤大小。在一些實施例中，藉由本文所述之醫藥組成物介導之抑制腫瘤轉移之方法可抑制至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%、或100%中任一者)轉移。在一些實施例中，藉由本文所述之醫藥組成物介導之延長個體(諸如人類)存活之方法可延長個體之存活至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、或24個月中任一者。在一些實施例中，藉由本文所述之醫藥組成物介導之延長癌症進展時間之方法可延長癌症進展時間至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12週中任一者。在一些實施例中，該治療免疫相關疾病之方法可增加、增強、或刺激受試者之免疫反應或功能。在一些實施例中，免疫反應或功能係藉由活 化效應細胞(例如，T細胞，例如CD8+及/或CD4+ T細胞)、擴充(增加)效應細胞群體、及/或殺傷受試者之靶細胞(例如，靶腫瘤細胞)來增加、增強、及/或刺激。
在一些實施例中，該方法適用於治療具有異常PD-1或PD-L1/PD-L2表現、活性、及/或傳訊之癌症，作為非限制性實例，該等癌症包括血液癌症及/或實體腫瘤。可使用本發明之抗體抑制其生長的一些癌症包括通常對免疫療法有反應之癌症。用於治療之癌症之非限制性實例包括黑色素瘤(例如，轉移性惡性黑色素瘤)、腎癌(例如透明細胞癌)、前列腺癌(例如激素難治性前列腺腺癌)、乳癌、結腸癌及肺癌(例如非小細胞肺癌)、胃癌、卵巢癌、及膠質母細胞瘤。另外，本發明包括其生長可使用本發明之抗體抑制的難治性或復發性惡性腫瘤。可以使用本發明之抗體治療之其他癌症之實例包括骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區域癌、胃癌、睾丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病包括急性髓性白血病、慢性粒細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統腫瘤(CNS)、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T-細胞淋巴瘤、環境誘發之癌症包括由石棉誘導之癌症，以及該等癌症之組合。本發明亦可用於治療轉移性癌症，尤其是表現PD-1或PD-L1/PD-L2之轉移性癌症。在一些實施例中，PD-1或PD-L1/PD-L2表現、活性、及/或傳訊異常的癌症部分耐PD-1單阻斷(例如，部分耐抗PD-1抗體單一療法治療)或部分耐免疫檢查點抑制劑單一療法(例如，抗TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4抗體單一療法治療)。在此類情況下， 可使用本文所述之抗PD-1 MABP(例如，BABP)，諸如PD-1×TIGIT、PD-1×LAG-3、PD-1×TIM-3、PD-1×CTLA-4、或PD-1×PD-1 MABP(例如，BABP)。
本文描述之方法適用於治療多種癌症，包括實體癌症及液體癌症。該方法適用於所有階段之癌症，包括早期癌症、非轉移性癌症、原發性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、轉移性癌症、或緩解期癌症。本文描述之方法可以用作第一療法、第二療法、第三療法或與此項技術已知之其他類型之癌症療法之組合療法，例如化療、手術、激素療法、放射、基因療法、免疫療法(諸如T細胞療法或投與免疫調節劑)、骨髓移植、幹細胞移植、靶向療法、冷凍療法、超音波療法、光動力療法、射頻消融等，在輔助環境或新輔助環境中(即，該方法可以在初步/確定性治療之前進行)。在一些實施例中，該方法用於治療先前已經治療之個體。在一些實施例中，癌症對於先前療法係難以治癒的。在一些實施例中，該方法用於治療先前未接受過治療之個體。在一些實施例中，癌症部分耐免疫檢查點抑制劑單一療法(例如，部分耐抗TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1抗體單一療法治療)。
因此在一些實施例中，提供一種治療癌症(諸如癌或腺癌，諸如PD-1表現、活性、及/或傳訊異常的癌症，及/或TIGIT/LAG-3/TIM-3/CTLA-4表現、活性、及/或傳訊異常的癌症)之方法，其包含向個體投與有效量醫藥組成物，該醫藥組成物包含抗PD-1構築體(例如，PD-1×TIGIT、PD-1×LAG-3、PD-1×TIM-3、PD-1×CTLA-4、PD-1×PD-1 MABP、或BABP，其對應於TIGIT/LAG-3/TIM-3/CTLA-4/PD-1表現、活性、及/或傳訊異常)及視情況醫藥學上可接受之載劑，該抗PD-1構築體包含：(a)包含抗PD-1 sdAb部分之第一抗原結合部分，該抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2， 或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及(b)包含VH及VL之第二抗原結合部分，其中VH及VL在一起形成特異性結合第二免疫檢查點分子(例如，TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位))之抗原結合位點，其中第一抗原結合部分融合至第二抗原結合部分。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含有包含VH之重鏈及包含VL之輕鏈。在一些實施例中，第一抗原結合部分在重鏈之N末端、輕鏈之N末端、Fc區之N末端、重鏈之C末端、或輕鏈之C末端處融合至第二抗原結合部分。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含全長4鏈抗體或其抗原結合部分(例如，Fab或scFv)。在一些實施例中，第一抗原結合部分融合至包含Fab或scFv之第二抗原部分之C末端。在一些實施例中，第一及第二抗原結合部分經由連接子融合，諸如包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含Fc片段(例如，來源於IgG4、IgG2、或IgG1)。在一些實施例中，Fc片段包含SEQ ID NO：363-365中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，提供一種治療癌症(諸如癌或腺癌，諸如PD-1表現、活性、及/或傳訊異常的癌症，及/或TIGIT/LAG-3/TIM-3/CTLA-4表現、活性、及/或傳訊異常的癌症)之方法，其包含向個體投與有效量醫藥組成物，該醫藥組成物包含經單離抗PD-1構築體及視情況醫藥學上可接受之載劑，該抗PD-1構築體包含特異性識別PD-1、融合至全長抗體(例如，特異性識別TIGIT、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、或PD-1(諸如與本文所述之抗PD-1 sdAb部分所識別不同的第二PD-1表位)之抗體，其對應於TIGIT/LAG-3/TIM-3/CTLA-4/PD-1表現異常)之sdAb部分，其中該抗PD-1 sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3 個中任一者)胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個(諸如約1個、2個、或3個中任一者)胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，VH及VL域均源自替拉古單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：377之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，全長抗體為抗TIGIT抗體，其包含有包含SEQ ID NO：377之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，VH及VL域均源自瑞拉里單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，全長抗體為抗LAG-3抗體，其包含有包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，VH及VL域均源自MBG453。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，全長抗體為抗TIM-3抗體，其包含有包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，VH及VL域源自伊匹單抗(例如，Yervoy®)。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，全長抗體為抗CTLA-4抗體，其包含有包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗(例如，Keytruda®)或納武單抗(例如，Opdivo®)。 在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。在一些實施例中，全長抗體為抗PD-1抗體，其包含有包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M、或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化抗PD-1 sdAb部分。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分之N末端融合至全長抗體之重鏈之至少一者之C末端。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分之C末端融合至全長抗體之重鏈之至少一者之N末端。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分之N末端融合至全長抗體之輕鏈之至少一者之C末端。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分之C末端融合至全長抗體之輕鏈之至少一者之N末端。在一些實施例中，抗PD-1構築體包含四個抗PD-1 sdAb部分，其中各抗PD-1 sdAb部分之C末端融合至全長抗體各鏈之N末端。在一些實施例中，抗PD-1構築體包含四個抗PD-1 sdAb部分，其中兩個抗PD-1 sdAb部分融合在一起，其進一步融合至全長抗體之各重鏈之N末端。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PD-1 sdAb部分及全長抗體視情況藉由肽連接子(諸如包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列之肽連接子)連接。在一些實施例中，癌症為實體腫瘤(諸如結腸癌)。在一些實施例中，醫藥組成物係全身(諸如靜脈內或腹膜內)投與。在一些實施例中，醫藥組成物局部(例如腫瘤內)投與。在一些實施例中，該方法進一步包含向個體投與另外之癌症療法(例如手術、放射、化療、免疫療法、激素療法、或其組合)。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，癌症部 分耐免疫檢查點分子單阻斷(例如，部分耐抗PD-1抗體、抗TIGIT抗體、抗LAG-3抗體、抗TIM-3抗體、或抗CTLA-4抗體單一療法治療)。
本申請案之醫藥組成物之劑量及所需藥物濃度可根據設想的具體使用而變化。確定適當劑量或施用途徑完全在普通技術者之技術內。動物實驗為人類療法之有效劑量之確定提供可靠的指導。有效劑量之物種間類推可以遵循Mordenti,J.及Chappell,W.「The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics,」Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi等人編，Pergamon Press,New York 1989，第42-46頁來進行。
本申請案之醫藥組成物(包括但不限於經重構及液體調配物)係向需要以本文所述之抗PD-1構築體(諸如抗PD-1 sdAb、抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、抗PD-1/TIGIT雙特異性抗體(例如，PD-1×TIGIT BABP)、抗PD-1/LAG-3雙特異性抗體(例如，PD-1×LAG-3 BABP)、抗PD-1/TIM-3雙特異性抗體(例如，PD-1×TIM-3 BABP)、抗PD-1/CTLA-4雙特異性抗體(例如，PD-1×CTLA-4 BABP)、或抗PD-1/PD-1雙特異性抗體(例如，PD-1×PD-1 BABP))根據已知方法進行治療的個體(較佳人類)投與，該等方法諸如呈推注或藉由在一段時間內連續輸注來靜脈內投與，藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、靜脈內(iv)、關節內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑。重構調配物可藉由將經凍乾本文所述之抗PD-1構築體溶解於試劑中使得蛋白分散於各處來製備。適用於本申請案之示範性醫藥學上可接受之(對人投與安全且無毒)稀釋劑包括但不限於無菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液、或鹽及/或緩衝劑之水溶液。
在一些實施例中，醫藥組成物係藉由皮下(即在皮膚下)投與來向個體投與。出於此類目的，可使用注射器來注射醫藥組成物。然而，可使用其他用於投與醫藥組成物之裝置，諸如注射裝置、注射筆、自動注射器裝置、無針裝 置、及皮下貼片遞送系統。在一些實施例中，醫藥組成物係向個體靜脈內投與。在一些實施例中，醫藥組成物係藉由輸注(諸如靜脈內輸注)來向個體投與。免疫療法之輸注技術為此項技術已知的(參見例如Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319：1676(1988))。
V.製備方法
本文所述之抗PD-1構築體(諸如抗PD-1 sdAb、抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、抗PD-1/TIGIT雙特異性抗體(例如，PD-1×TIGIT BABP)、抗PD-1/LAG-3雙特異性抗體(例如，PD-1×LAG-3 BABP)、抗PD-1/TIM-3雙特異性抗體(例如，PD-1×TIM-3 BABP)、抗PD-1/CTLA-4雙特異性抗體(例如，PD-1×CTLA-4 BABP)、或抗PD-1/PD-1雙特異性抗體(例如，PD-1×PD-1 BABP)可使用此項技術中已知或如本文所述之任何方法製備。亦參見實例1-3。在一些實施例中，提供一種產生抗PD-1構築體之方法，其包含：(a)在有效表現經編碼抗PD-1構築體之條件下培養包含編碼本文所述之抗PD-1構築體之經單離核損或載體之宿主細胞；及(b)自該宿主細胞獲得經表現抗PD-1構築體。在一些實施例中，步驟(a)之方法進一步包含產生包含編碼本文所述之抗PD-1構築體之經單離核酸或載體之宿主細胞。
製備sdAb之方法已有所描述。參見例如Els Pardon等人，Nature Protocol,2014；9(3)：674。sdAb(諸如VHH)可使用此項技術中已知的方法獲得，諸如藉由將駱駝物種(諸如駱駝或美洲駝)免疫並自其獲得融合瘤，或藉由使用此項技術中已知的分子生物技術選殖單域抗體文庫並隨後藉由利用未選擇文庫之個別純系進行之ELISA或藉由使用噬菌體顯示進行選擇。
對於sdAb之重組產生，將編碼單域抗體之核酸單離並插入至可複製載體中以供進一步選殖(DNA之擴增)或以供表現。編碼單域抗體之DNA易於單離且使用習知程序(例如，藉由使用能夠特異性結合編碼抗體重鏈及輕鏈的基因 的寡核苷酸探針)來測序。許多載體可供使用。載體之選擇部分取決於欲使用之宿主細胞。通常，較佳之宿主細胞來源於原核或真核(通常係哺乳動物)。在一些實施例中，編碼本文所述之抗PD-1構築體之經單離核酸包含SEQ ID NO：253-288中任一者之核酸序列。
1.真核細胞中之重組產生
對於真核表現，載體組分通常包括但不限於訊號序列、複製起點、一或多個標記基因、及增強子元件中之一或多者、啟動子、及轉錄終止序列。
a)訊號序列組分
用於真核宿主之載體亦可為編碼訊號序列或在成熟蛋白或多肽之N末端處具有特異性裂解位點之其他多肽的插入物。較佳地選擇之異源訊號序列為由宿主細胞識別及加工(即，藉由訊號肽酶裂解)者。在哺乳動物細胞表現中，可獲得哺乳動物訊號序列以及病毒性分泌前導序列，例如單純皰疹gD訊號。
用於此類前驅物區之DNA在閱讀框中結合至編碼本申請案之抗體之DNA。
b)複製起點
通常，複製起點組分不為哺乳動物表現載體所需(通常可僅使用SV40起點，因為其含有早期啟動子)。
c)選擇基因組分
表現及選殖載體可含有選擇基因，該選擇基因亦稱作可選擇標記物。典型選擇基因編碼(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如安比西林、新黴素、胺甲喋呤、或四環素)之抗性，(b)補充營養缺陷型缺乏，或(c)供應無法自複合培養基(例如，就桿菌而言，編碼D-丙胺酸外消旋酶之基因)獲得之關鍵營養物的蛋白。
選擇方案之一個實例利用藥物來阻止宿主細胞之生長。用異源基因成功地轉型之彼等細胞產生賦予抗藥性之蛋白且因此經受得住該選擇方案。該顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸、及潮黴素。
用於哺乳動物細胞之合適可選擇標記物之另一實例為使得能夠鑒別有能力吸收編碼本申請案之抗體之核酸之細胞的彼等標記物，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及-II(較佳地靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷去胺酶、鳥胺酸去羧酶等。
例如，用DHFR選擇基因轉型之細胞首先藉由在含有DHFR之競爭性拮抗劑胺甲喋呤(Mtx)之培養基中培養所有轉型體來鑒別。當使用野生型DHFR時，適當宿主細胞為缺乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株(例如ATCC CRL-9096)。
或者，用編碼多肽之DNA序列、野生型DHFR蛋白及諸如胺基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH)之另一可選擇標記物轉型或共轉型之宿主細胞(尤其含有內源DHFR之野生型宿主)可藉由在含有用於可選擇標記物之選擇劑的培養基中進行細胞生長來選擇，該選擇劑諸如胺基糖苷抗生素，例如卡那黴素、新黴素或G418。參見美國專利第4,965,199號。
d)啟動子組分
表現及選殖載體通常含有由宿主有機體識別且可操作地連接至編碼所要多肽序列之核酸的啟動子。實際上所有真核基因均具有位於起始轉錄之位點上游大約25至30個鹼基處的富AT區。在多種基因之轉錄開始上游70至80個鹼基處發現的另一序列為CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。在大多數真核之3'末端處為AATAAA序列，其可為用於添加聚腺苷酸尾至編碼序列之3'末端中的信號。所有此等序列均可插入至真核表現載體中。
適合用於原核宿主之其他啟動子包括PhoA啟動子、-內醯胺酶、及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶啟動子、色胺酸(trp)啟動子系統、及雜合啟動子(諸如tac啟動子)。然而，其他已知的細菌啟動子為合適的。用於細菌系統之啟動子亦含有可操作地連接之編碼抗體之DNA的夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno；S.D.)序列。
哺乳動物宿主細胞中載體之多肽轉錄例如藉由獲自病毒(諸如多瘤病毒、鳥痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、細胞巨化病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒及最佳猿病毒40(SV40))之基因組、獲自異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋啟動子或免疫球蛋白啟動子)、獲自熱休克啟動子之啟動子控制，限制條件在於該等啟動子可與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子便利地以亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制片段形式獲得。人類細胞巨化病毒之即刻早期啟動子便利地以HindIII E限制片段形式獲得。使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表現DNA之系統揭示於美國專利第4,419,446號中。此系統之修改描述於美國專利第4,601,978號中。關於在來自單純皰疹病毒之胸苷激酶啟動子控制下人類干擾素cDNA在小鼠細胞中之表現，亦參見Reyes等人，Nature 297：598-601(1982)。可替代地，勞斯肉瘤病毒長末端重複序列可用作啟動子。
e)增強子元件組分
由高等真核生物轉錄編碼本申請案之抗體之DNA常藉由將增強子序列插入至載體中來增加。現已知多種增強子序列來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)。通常，然而，吾人使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括在複製起點(100-270bp)之後側上的SV40增強子、細胞巨化病毒早期啟動子增強子、在複製起點之後側上的多瘤病毒增強子及腺病毒增強子。增強用於真核啟動子之活化之元件，亦參見Yaniv,Nature 297：17-18 (1982)。增強子可剪接至載體中編碼多肽之序列之5'或3'位置，但較佳位於啟動子之5'位點。
f)轉錄終止組分
用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類、或來自其他多細胞有機體之有核細胞)中之表現載體亦含有終止轉錄及穩定mRNA所必需的序列。此類序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA之5'及偶爾3'未轉譯區獲得。此等區含有轉錄為編碼多肽之mRNA之非轉譯部分中之腺苷酸化片段的核苷酸區段。一種可用的轉錄終止組分為牛生長激素聚腺苷酸化區。參見WO94/11026及其中所揭示之表現載體。
g)宿主細胞之選擇及轉型
用於在本文中之載體中選殖或表現DNA之合適宿主細胞包括本文所述之高等真核細胞，包括脊椎動物宿主細胞。培養物(組織培養物)中脊椎動物細胞之增殖已成為常規程序。適用之哺乳動物宿主細胞株之實例為藉由SV40轉型之猴腎CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚胎腎株(293或經次選殖用於懸浮培養物中之生長的293細胞，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠足細胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝細胞瘤株(Hep G2)。
宿主細胞經上述表現或選殖載體轉型以供抗體產生且在習知營養培養基中培養，該等營養培養基適當時經改良用於誘導啟動子、選擇轉型體、或擴增編碼所需序列之基因。
h)培養宿主細胞
用於產生本申請案之抗體之宿主細胞可在多種培養基中培養。諸如Ham氏F10(Sigma)、最低必需培養基((MEM),(Sigma),RPMI-1640(Sigma)及杜氏改良伊格爾氏培養基((DMEM),Sigma)之市售培養基適用於培養宿主細胞。另外，Ham等人，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等人，Anal.Biochem.102：255(1980)；美國專利第4,767,704號；第4,657,866號；第4,927,762號；第4,560,655號；或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利再審30,985中所述之任何培養基均可用作該等宿主細胞之培養基。任何此等培養基均可在必要時補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微莫耳濃度範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或相等能源。亦可包括在熟習此項技術者將已知之適當濃度下之任何其他必要補充物。諸如溫度、pH及其類似因素之培養條件為先前用於針對表現所選擇之宿主細胞的彼等條件，且將為一般技術者顯而易知的。
i)蛋白純化
當使用重組技術時，抗體可以在細胞內、周質空間中產生、或直接分泌至培養基中。若抗體在細胞內產生，則作為第一步，例如藉由離心或超濾移除宿主細胞或裂解片段之微粒碎片。Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述用於單離出分泌至大腸桿菌之周質空間的抗體之程序。簡言之，在約30min內在乙酸鈉(pH3.5)、EDTA、及苯甲基磺醯氟(PMSF)存在下解凍細胞糊 狀物。藉由離心移除細胞碎片。當抗體分泌至培養基中時，通常首先使用市售的蛋白質濃縮濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)來濃縮此類表現系統之上清液。蛋白酶抑制劑(諸如PMSF)可包括在任何前述步驟中以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。
由細胞製備之蛋白組成物可使用例如氫氧磷灰石層析、凝膠電泳、透析、及親和力層析來純化，其中親和力層析為較佳純化技術。蛋白A作為親和配體之適合性取決於抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc域之種類及同型。蛋白A可用於純化基於含有1、2、或4條重鏈之人類免疫球蛋白的抗體(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G經推薦用於所有小鼠同型及人類3(Guss等人，EMBO J.5：15671575(1986))。親和配體所連接之基質最常為瓊脂糖，但也可使用其他基質。機械穩定的基質(諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯)與瓊脂糖相比可達成較快流速及較短加工時間。當抗體包含CH3域時，Bakerbond ABXTMresin(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用於純化。亦可使用其他用於蛋白純化之技術，諸如離子交換管柱分餾、乙醇沉澱、逆相HPLC、矽膠層析、肝素SEPHAROSETM層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)層析、聚焦層析、SDS-PAGE、及硫酸銨沉澱，其取決於欲回收的抗體。
在任何初步純化步驟之後，可使用pH在約2.5-4.5之間的溶離緩衝液對包含所關注之抗體及污染物之混合物進行低pH疏水性作用層析，較佳在低鹽濃度(例如，約0-0.25M鹽)下進行。
2.多株抗體
多株抗體通常藉由多次皮下(s.c.)或腹膜內(i.p.)注射相關抗原及佐藥而在動物中產生。可為有用的是，使用雙功能或衍生劑(例如，順丁烯二醯亞胺苯甲醯基磺基琥珀醯亞胺酯(通過半胱胺酸殘基綴合)、N-羥基琥珀醯亞胺(通過離胺酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N=C=NR，其中R及R1獨立地 為低級烷基)，將相關抗原與在欲免疫之物種中具有免疫原性的蛋白綴合，例如鑰孔帽貝血藍素(keyhole limpet hemocyanin；KLH)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制劑。可採用之佐藥之實例包括弗氏完全佐藥及MPL-TDM佐藥(單磷醯基脂質A、合成海藻糖雙棒狀黴菌酸酯)。熟習此項技術者可選擇免疫規程而無需過多的實驗。
藉由將例如100μg或5μg或與3體積弗氏完全做好之蛋白或綴合物(分別為兔或小鼠)組合並將溶液在多個部位處進行皮內注射來使動物對抗原、免疫原性綴合物、或衍生物免疫。一個月後，藉由在多個部位進行皮下注射，將動物推注1/5至1/10原始量含肽或綴合物之弗氏完全佐藥。7至14天後，將動物放血並檢定血清之抗體效價。對動物進行加強直至效價平穩。綴合物亦可成蛋白融合物於重組細胞培養物中製成。同樣，諸如明礬之聚集劑適合於增強免疫反應。駱駝中的免疫亦參見實例1。
VI.製品及套組
進一步提供套組及製品，其包含本文所述之以下中任一者：經單離抗PD-1構築體(諸如抗PD-1 sdAb、抗PD-1 sdAb-Fc融合蛋白(例如，HCAb)、抗PD-1/TIGIT雙特異性抗體(例如，PD-1×TIGIT BABP)、抗PD-1/LAG-3雙特異性抗體(例如，PD-1×LAG-3 BABP)、抗PD-1/TIM-3雙特異性抗體(例如，PD-1×TIM-3 BABP)、抗PD-1/CTLA-4雙特異性抗體(例如，PD-1×CTLA-4 BABP)、或抗PD-1/PD-1雙特異性抗體(例如，PD-1×PD-1 BABP))、編碼其之經單離核酸或載體、或包含編碼抗PD-1構築體之經單離核酸或載體之經單離宿主細胞。在一些實施例中，提供一種套組，其包含本文所述之任一醫藥組成物且較佳提供其使用說明。
本申請案之套組以合適的包裝之形式。合適的包裝包括但不限於小瓶、瓶子、廣口瓶、撓性包裝(例如，密封Mylar或塑膠袋)、及其類似者。套組 可視情況提供額外組分，諸如緩衝液及解釋資訊。本申請案因此提供製品，其包括小瓶(諸如密封小瓶)、瓶子、廣口瓶、撓性包裝、及其類似者。
套組可包括多個單位劑量的醫藥組成物及使用說明書，其包裝量足以在藥房(例如，醫院藥房及複配藥房)中儲存及使用。
實例
以下實例意欲僅示範本發明，且因此不應視為以任何方式限制本發明。以下實例及詳述係藉由說明方式且不藉由限制方式來提供。
實例1：抗PD-1 sdAb及抗PD-1 HCAb之生成
免疫
根據所有當前動物福利法規，用重組PD-1細胞外域(ECD)蛋白(登錄號NP_005009.2，SEQ ID NO：362)免疫兩頭駱駝。對於免疫，將抗原與CFA(初級免疫)或IFA(加強免疫)一起調配成乳液。在頸部藉由肌肉內雙點注射來投與抗原。各動物在每週一次的間隔下接受兩次含有100μg PD-1 ECD之乳液注射及隨後4次含有50μg抗原的注射。在免疫期間的不同時間點，自動物收集10ml血液樣本且製備血清。在用固定化PD-1 ECD蛋白之基於ELISA之實驗中使用血清樣本驗證抗原特異性體液免疫反應之誘導(圖1A-1B及圖2A-2B)。最後一次免疫之後五天，收集200ml血液樣本。使用Ficoll-Paque梯度(Amersham Biosciences)自200ml血液樣本中單離出外周血淋巴球(PBL)，其作為駱駝重鏈免疫球蛋白(HCAb)之基因來源，得到5×108個PBL。預期抗體之最大多樣性等於經取樣B淋巴球數，其為PBL數之約20%(1×108)。駱駝之重鏈抗體分數為B淋巴球數之多達20%。因此，將200ml血液樣本中HCAb之最大多樣性計算為2×107種不同分子。
文庫構築及結合物選擇
將提取自PBL及淋巴結之RNA用作擴增sdAb編碼基因片段之RT-PCR之起始材料。將此等片段選殖至內部噬菌粒載體中。載體編碼與sdAb編碼序列同框的C末端His6標籤。文庫大小多於1×109。根據標準規程製備文庫噬菌體並在過濾滅菌之後在4℃下儲存以供進一步使用。
使用固相淘選(panning)以及基於細胞之淘選，用上文文庫進行選擇。挑選出純系並於96深孔板(1ml體積)中生長，且藉由添加IPTG及0.1% Triton誘導上清液中sdAb表現。分析上清液中其結合PD-1 ECD蛋白(藉由ELISA)及PD-1穩定細胞株(藉由FACS)之能力。對陽性結合物進行測序，且選擇獨特的純系以供進一步表徵(表3)。
sdAb產生
藉由ÄKTA自周質提取物中純化出所選之His6標記sdAb。根據製造商之說明書加工NTA樹脂。在RT下於旋轉器上將所製備之周質提取物與該樹脂一起孵育30min。用PBS洗滌樹脂並轉移至管柱。用15mM咪唑洗滌填充樹脂。使用150mM咪唑自管柱洗脫出sdAb。藉由在Hybond膜上點樣來分析洗脫流份並用麗春紅顯現。彙集含有蛋白之流份並用PBS透析。將透析蛋白收集，過濾滅菌，確定濃度並在-20℃下儲存。
為了確定純度，在12% SDS-PAGE凝膠上分析蛋白樣本。將10μl Laemmli樣本緩衝液添加至10μl(2μg)純化蛋白中，然後將樣本在95℃下加熱10分鐘，冷卻並加載至12% SDS-PAGE凝膠上。根據一般程序加工凝膠並用考馬斯亮藍(CBB)染色。純化資料概述於圖28中。
藉由表面電漿子共振(SPR)之sdAb之親和力量測
在BIAcore T200儀器(GE Healthcare)上藉由SPR確定sdAb之結合動力學。簡言之，在約50RU之密度下將PD-1 ECD胺偶聯至CM5感測器晶片。將5倍濃度以3倍連續稀釋(自2nM開始至162nM)的sdAb注射在經塗佈感測 器晶片上。全部實驗中流速為30μl/min。締合期為5min，且解離期為5、10、或15min。使用甘胺酸/HCl pH 1.5使晶片再生。將在不同濃度sdAb下的結合曲線擬合至1：1朗謬結合模型以計算動力學參數k on 、k off 、及KD(sdAb親和力資料參見圖3A-3F)。用Biacore T200評估軟體(GE Healthcare)執行感測圖加工及資料分析。親和力參數概述於圖3G中。
藉由FACS分析之與在細胞上表現之PD-1之結合
使用基於螢光活性細胞揀選(FACS)檢定確定sdAb與CHO細胞上表現之PD-1之結合。將表現人類PD-1之CHO細胞自貼壁式培養瓶解離並與不同濃度之抗體混合(均於96孔板中)。將混合物在室溫下平衡30分鐘，用FACS緩衝液(含有1% BSA之PBS)洗滌三次。然後添加二級抗體螢光異硫氰酸鹽(FITC)綴合之抗人類κ抗體(Jackson ImmunoResearch)並在室溫下孵育15分鐘。再次用FACS緩衝液洗滌細胞並藉由流動式細胞測量術分析。使用Prism(GraphPad軟體，San Diego，CA)使用非線性迴歸分析數據，並計算EC50值。從圖4A-4B可見，FACS結合檢定說明A31543、AS06962、及AS07424 sdAb可在低濃度(1-10μg/ml)下結合PD-1。
藉由FACS分析之配體結合之抑制
使用流動式細胞測量術研究配體結合之阻斷。對於抗PD-1 sdAb評估，將表現人類PD-1之CHO細胞自貼壁式培養瓶解離並與不同濃度的抗體及恆定濃度的生物素標記之人類PD-L1/Fc或人類PD-L2/Fc蛋白混合(均於96孔板中)。將Keytruda®用作抗PD-1抗體陽性對照。將混合物在室溫下平衡30分鐘，用FACS緩衝液(含有1% BSA之PBS)洗滌三次。然後添加PE/Cy5鏈親和素第二抗體並在室溫下孵育15分鐘。再次用FACS緩衝液洗滌細胞並藉由流動式細胞測量術分析(圖5A)。使用Prism(GraphPad軟體，San Diego，CA)使用非線性迴歸分析數據，並計算IC50值(圖5B)。
HCAb構築、產生、及表徵
自上文研究選擇具有功能活性及慢解離速率之sdAb用於HCAb構築及生產。將所選sdAb之DNA序列與人類IgG4 Fc(S228P)之DNA序列融合以製備HCAb構築體。將HCAb構築體轉染至CHO細胞中以供HCAb表現。藉由蛋白A管柱純化條件培養基中分泌之HCAb。純化資料概述於圖29中。
藉由表面電漿子共振(SPR)之HCAb之親和力量測
使用SPR生物感測器Biacore T200(GE Healthcare)確定抗PD-1駱駝科HCAb之結合動力學。通過Fc捕獲方法在約50RU之密度下將抗體固定在感測器晶片上。將5倍濃度以3倍連續稀釋(自3nM開始至243nM)的人類PD-1-His抗原注射在經塗佈感測器晶片上。全部實驗中流速為30μl/min。使用甘胺酸/HCl pH 1.5使晶片再生。將在不同濃度PD-1-His抗原下的結合曲線擬合至1：1朗謬結合模型以計算動力學參數k on 、k off 、及KD(HCAb親和力資料參見圖6B-6K)。將Keytruda®用作實驗對照(圖6L)。用Biacore T200評估軟體(GE Healthcare)執行感測圖加工及資料分析。親和力參數概述於圖6A中。
如圖6A-6L中可見，所選HCAb(AS15140_HCAb、AS15152_HCAb、AS15156_HCAb、AS15193_HCAb、AS06962_HCAb、AS15881_HCAb、AS15883_HCAb、AS15892_HCAb、AS15899_HCAb、及AS25170_HCAb)顯示與Keytruda®相當的結合親和力。
藉由FACS分析之HCAb與在細胞上表現之PD-1之結合
如上所述，測試22種經純化抗PD-1 HCAb對CHO細胞上表現之PD-1之結合能力(圖7A-7V)。將Keytruda®用作實驗對照(圖7W)。EC50概述於圖7X中。如圖7A-7X可見出，FACS結合檢定說明所有22種HCAb表現出良好的與細胞表面上PD-1之結合。
藉由FACS分析之配體結合之抑制
類似地如上所述，藉由FACS分析測試22種經純化抗PD-1 HCAb抑制PD-1及PD-L1結合之能力。將Keytruda®用作實驗對照(圖8W)。IC50概述於圖8X中。如圖8A-8X可見，競爭檢定說明抗PD-1 HCAb在低濃度(1-10μg/ml)下有效抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。且根據FACS數據之IC50，所有22種HCAb均顯示出良好的配體競爭活性。
基於PD-1之功能阻斷檢定
使用穩定表現PD-L1及Jurkat效應細胞之CHO-K1細胞評估抗PD-1 HCAb評估之PD-1阻斷。效應細胞含有螢光素酶構築體，其在破壞PD-1/PD-L1受體-配體相互作用時經誘導，諸如當PD-L1表現細胞與表現PD-1的效應細胞混合時。因此，可藉由量測螢光素酶報道子活性來評估抗PD-L1 HCAb抑制CHO-K1穩定細胞上PD-L1與效應細胞上PD-1之相互作用的功效。如下進行檢定。
第一天，將PD-L1表現CHO-K1細胞於37℃水浴中解凍，直至細胞剛好解凍(約3-4分鐘)，並將0.5mL解凍的細胞轉移至14.5mL細胞回收培養基(10% FBS/F-12)中。藉由輕輕顛倒管1-2次將細胞懸浮液充分混合。然後將細胞懸浮液轉移至無菌試劑儲存器，並以每孔25μL細胞懸浮液分配至測定板中。添加每孔100μL測定培養基作為空白對照。對作為空白對照之各孔添加每孔100μL細胞回收培養基。然後將板蓋上蓋子並在CO2孵育箱中在37℃下孵育隔夜。
接著，將PD-1 Jurkat效應細胞於37℃水浴中解凍，直至細胞剛好解凍(約3-4分鐘)。藉由上下吸取將小瓶中之細胞懸浮液輕輕混合，且將0.5mL細胞添加至5.9mL測定緩衝液中。藉由輕輕顛倒管1-2次將細胞懸浮液充分混合。使細胞向下旋轉然後轉移至無菌試劑儲存器，於200μL檢定緩衝液中，且將40μL具有細胞之緩衝液分配至含有各種濃度的抗PD-1 HCAb或對照抗體的各孔中 (從1μM開始，以3倍稀釋，總計8個濃度)。然後向各孔中添加160μL PD-L1 CHO-K1細胞。將板蓋上蓋子並在CO2孵育箱中在37℃下孵育六小時。
藉由將一瓶緩衝液轉移至含有受質之瓶中來重構螢光素酶測定系統。將系統在室溫下儲存且避光保存以供某天使用。6小時孵育之後，將測定板自CO2孵育箱移除並在周圍溫度下平衡5-10min。向各孔中添加80μL試劑。將板在周圍溫度下孵育5-10min。於GloMax®發現系統(Promega,Madison,WI)或具有輝光型(glow-type)發光讀取能力之板讀取器中量測發光。
發光表示為相對光單位(RLU)。將具有稀釋HCAb或Keytruda®對照之孔之RLU值正規化至無抗體之RLU以得到螢光素酶誘導倍數。將數據繪製為RLU誘導倍數對HCAb抗體(或Keytruda®對照)之Log10濃度。將數據擬合至曲線並使用諸如GraphPad Prism之曲線擬合軟體確定各HCAb及對照抗PD-1抗體Keytruda®之EC50(圖9A-9G)。EC50資料概述於圖9H中。
亦可藉由確定包含表現PD-1之靶細胞及活化T細胞之混合淋巴球反應(MLR)中的IL-2分泌水準來研究抗體之PD-1抑制，其中抗PD-1 HCAb係以各種濃度提供。
使用單離套組(Miltenyl Biotec)自PBMC純化人類CD4+ T細胞及同種異體單核細胞。將單核細胞誘導至樹突細胞中。各孔含有105個CD4+ T細胞及104個同種異體樹突細胞，最終工作體積為200μl。在不同的濃度下將抗PD-1 HCAb添加至各孔中。沒有抗體可用作背景對照。將人類IgG4用作陰性對照(未示出)，且將Keytruda®用作陽性抗PD-1抗體對照。在37℃/5% CO2孵育箱中孵育72小時之後，自各測試孔取出100μl培養基以供IL-2分泌量測(Cisbio)。使用MLR中IL-2之抗體濃度依賴性分泌來得到抗PD-1抗體之抗PD-1活性之EC50(圖10A-10C)，並與全長PD-1抗體Keytruda®之EC50值相比較(圖10D)。MLR檢定之EC50概述於圖10E中。與基於FACS之配體競爭檢定結果一致(圖 8A-8X)，藉由MLR，三種所選HCAb在靶向PD-1中的功能活性與單株抗體Keytruda®相當。
實例2：抗PD-1 sdAb人源化及表徵
抗PD-1 sdAb之人源化
將AS15193 sdAb之蛋白序列與具有最高同源性的3個最接近的人類生殖系序列比對。選擇最佳人類生殖系序列作為人類接受者。建立同源性模型。根據模型分析數據，保留不觸及對抗原結合或抗體支架形成可能關鍵的殘基，而選擇其餘殘基以供轉化為人類對應物。基於結合、穩定性、及功能活性數據生成並選擇三組序列最佳化變異體。基於結合及解離速率排序資料選擇四種變異體(AS15193VH8、AS15193VH8M1、AS15193VH18、及AS15193VH18M1)。將駱駝親體sdAb、人源化變異體、及人類接受者序列在圖11中進行比對。人源化sdAb在其名稱中以「VH」指示。
實例3：人源化HCAb構築、產生、及表徵
自在實例2中使用BIAcore T200之上文解離排序研究(資料未示出)選擇具有功能活性及慢解離速率的4種sdAb(AS15193VH8、AS15193VH8M1、AS15193VH18、及AS15193VH18M1)以供HCAb構築及生產。將所選sdAb之DNA序列與人類IgG4 Fc(S228P)之DNA序列融合以製備人源化HCAb構築體。將HCAb構築體轉染至CHO細胞中以供HCAb表現。藉由蛋白A管柱純化條件培養基中分泌之HCAb。
藉由表面電漿子共振(SPR)之人源化HCAb之親和力量測
使用SPR生物感測器Biacore T200(GE Healthcare)確定抗PD-1人源化HCAb之結合動力學。通過Fc捕獲方法將抗體固定在感測器晶片上，如實例1中所提及。將抗原PD-1-His蛋白用作分析物(4倍濃度人類PD-1-His抗原，以3倍稀釋(自1nM開始至27nM))。使用Biacore T200評估軟體獲得解離(k d )及締 合(k a )速率常數(圖12A-12E)。自k d 與k a 之比計算表觀解離常數(KD)。資料概述於圖12F中。根據資料，人源化HCAb(AS15193VH8_HCAb、AS15193VH8M1_HCAb、AS15193VH18_HCAb、及AS15193VH18M1_HCAb)之結合親和力接近其親體HCAb(AS15193_HCAb)，表明在人源化後保持抗體親和力。
藉由FACS分析之人源化HCAb與在細胞上表現之PD-1之結合
測試經純化人源化抗PD-1 HCAb對CHO細胞上表現之PD-1之結合能力，如圖1中所述。如圖13A-13E可見，FACS結合檢定說明各種人源化HCAb表現出與親體AS15193_HCAb相當的結合能力。FACS結合EC50資料概述於圖13H中。與上文結合親和力結果一致，人源化HCAb(AS15193VH8_HCAb、AS15193VH8M1_HCAb、AS15193VH18_HCAb、及AS15193VH18M1_HCAb)亦顯示與其親體AS15193_HCAb相當結合能力。
藉由FACS分析之配體結合之抑制
藉由FACS分析測試經純化人源化抗PD-1 HCAb抑制PD-1及PD-L1結合之能力，如實例1中所述。如圖14A-14E可見，競爭檢定說明人源化抗PD-1 HCAb在低濃度(1-10μg/ml)下有效抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。且根據FACS資料之IC50(圖14F)，4種人源化HCAb顯示出與其親體AS15193_HCAb相當的配體阻斷活性。
基於PD-1之功能阻斷檢定
藉由基於IL-2之螢光素酶報導子檢定研究4種人源化HCAb之PD-1抑制，如實例1中所述。使用IL-2受體之抗體濃度依賴性活化來得到人源化抗PD-1抗體之抗PD-1活性之EC50值，且與親體AS15193_HCAb之EC50值相比較(圖15A-15E)。與基於FACS之配體競爭檢定結果一致，4種人源化HCAb之功能活性與其親體AS15193_HCAb相當。資料概述於圖15F中。
人源化HCAb之體內活性
在這裡呈現之研究中，研究PD-1人源化HCAb阻斷對鼠腫瘤模型的功效。提出抑制PD-1/PD-L1相互作用藉由恢復抗腫瘤CD8+ T細胞反應來發揮治療作用，因此在同源鼠腫瘤模型中進行臨床前功效研究，其中宿主之免疫系統是完全完整的。使用人類PD-1基因轉殖小鼠。
在此研究中，小鼠在右側皮下接種1×106個人類PD-L1過表現MC38結腸癌細胞。當腫瘤達到約100mm3之平均體積時，將小鼠分成治療組(n=5)(定義為研究第0天)。此研究中測試2種人源化抗PD-1 HCAb：AS15193VH8M1_HCAb及AS15193VH18M1_HCAb。各組每週兩次靜脈內投與基準抗體Keytruda(1mg/kg)或人源化HCAb(0.53mg/kg)達2週。2個對照組用1ml/kg PBS或1mg/kg人類IgG4同型對照處理。在研究期間每週兩次量測腫瘤。當與對照組相比較時，所有處理組均說明顯著的功效(P<0.050)(圖27)。此等觀測支持抗PD-1療法為驅動抗腫瘤CD8+ T細胞反應的有效策略。
序列表
SEQ ID NO：253(A31543 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：254(AS06962 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：255(AS15090 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：256(AS15140 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：257(AS15152 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：258(AS15156 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：259(AS15193 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：260(AS15872 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：261(AS15881 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：262(AS15883 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：263(AS15892 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：264(AS15899 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：265(AS17049 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：266(AS17118 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：267(AS24984 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：268(AS25037 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：269(AS25064 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：270(AS25067 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：271(AS25071 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：272(AS25115 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：273(AS25117 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：274(AS25119 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：275(AS25149 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：276(AS25164 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：277(AS25170 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：278(AS25222 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：279(AS25396 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：280(AS25457 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：281(AS25487 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：282(AS25095 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：283(AS25435 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：284(AS25156 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：285(AS15193VH8 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：286(AS15193VH8M1 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：287(AS15193VH18 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：288(AS15193VH18M1 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：289(A31543 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：290(AS06962 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：291(AS15090 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：292(AS15140 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：293(AS15152 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：294(AS15156 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：295(AS15193 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：296(AS15872 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：297(AS15881 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：298(AS15883 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：299(AS15892 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：300(AS15899 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：301(AS17049 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：302(AS17118 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：303(AS24984 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：304(AS25037 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：305(AS25064 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：306(AS25067 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：307(AS25071 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：308(AS25115 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：309(AS25117 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：310(AS25119 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：311(AS25149 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：312(AS25156 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：313(AS25164 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：314(AS25170 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：315(AS25222 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：316(AS25396 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：317(AS25457 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：318(AS25487 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：319(AS25095 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：320(AS25435 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：321(AS15193VH8 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：322(AS15193VH8M1 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：323(AS15193VH18 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：324(AS15193VH18M1 sdAb胺基酸序列；CDR經加下劃線)
SEQ ID NO：325(A31543 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：326(AS06962 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：327(AS15090 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：328(AS15140 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：329(AS15152 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：330(AS15156 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：331(AS15193 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：332(AS15872 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：333(AS15881 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：334(AS15883 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：335(AS15892 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：336(AS15899 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：337(AS17049 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：338(AS17118 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：339(AS24984 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：340(AS25037 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：341(AS25064 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：342(AS25067 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：343(AS25071 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：344(AS25115 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：345(AS25117 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：346(AS25119 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：347(AS25149 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：348(AS25156 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：349(AS25164 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：350(AS25170 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：351(AS25222 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：352(AS25396 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：353(AS25457 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：354(AS25487 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：355(AS25095 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：356(AS25435 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：357(AS15193VH8 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：358(AS15193VH8M1 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：359(AS15193VH18 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：360(AS15193VH18M1 HCAb胺基酸序列；CDR經加下劃線，連接子以粗體表示)
SEQ ID NO：361(人類PD-1胺基酸序列，不包括前導肽)
SEQ ID NO：362(人類PD-1胺基酸序列之細胞外域)
SEQ ID NO：363(IgG4 Fc胺基酸序列)
SEQ ID NO：364(IgG1惰性Fc胺基酸序列)
SEQ ID NO：365(IgG1 Fc胺基酸序列)
SEQ ID NO：366(人類接受者胺基酸序列)QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
SEQ ID NO：367(人類IgG4(hIgG4)鉸鏈胺基酸序列)ESKYGPPCPPCP
SEQ ID NO：368(經突變人類IgG1(hIgG1)鉸鏈胺基酸序列)EPKSSDKTHTSPPSP
SEQ ID NO：369(人類IgG1(hIgG1)鉸鏈胺基酸序列)EPKSCDKTHTCPPCP
SEQ ID NO：370(連接肽(9GS)胺基酸序列)GGGGSGGGS
SEQ ID NO：371(連接肽胺基酸序列)GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO：372(連接肽胺基酸序列，n為至少1之整數)(G)n
SEQ ID NO：373(連接肽胺基酸序列，n為至少1之整數)(GS)n
SEQ ID NO：374(連接肽胺基酸序列，n為至少1之整數)(GSGGS)n
SEQ ID NO：375(連接肽胺基酸序列，n為至少1之整數)(GGGS)n
SEQ ID NO：376(連接肽胺基酸序列，n為至少1之整數)(GGGGS)n
SEQ ID NO：377(抗TIGIT mAb替拉古單抗重鏈胺基酸序列)
SEQ ID NO：378(抗TIGIT mAb替拉古單抗輕鏈胺基酸序列)
SEQ ID NO：379(抗LAG-3 mAb瑞拉里單抗重鏈胺基酸序列)
SEQ ID NO：380(抗LAG-3 mAb瑞拉里單抗輕鏈胺基酸序列)
SEQ ID NO：381(抗TIM-3 mAb MBG453重鏈胺基酸序列)
SEQ ID NO：382(抗TIM-3 mAb MBG453輕鏈胺基酸序列)
SEQ ID NO：383(抗CTLA-4 mAb伊匹單抗重鏈胺基酸序列)
SEQ ID NO：384(抗CTLA-4 mAb伊匹單抗輕鏈胺基酸序列)
SEQ ID NO：385(抗PD-1 mAb派姆單抗(IgG4 S228P)重鏈胺基酸序列)
SEQ ID NO：386(抗PD-1 mAb派姆單抗(IgG4 S228P)輕鏈胺基酸序列)
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<120> 針對PD-1之單域抗體及其變異體
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<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 315
<210> 316
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 316
<210> 317
<211> 126
<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
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<210> 319
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 319
<210> 320
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 321
<210> 322
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
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<210> 324
<211> 123
<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
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<223> 合成構建體
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<223> 合成構建體
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<220>
<223> 合成構建體
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<220>
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<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
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<220>
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<223> 合成構建體
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<220>
<223> 合成構建體
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<220>
<223> 合成構建體
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
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<210> 350
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<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
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<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
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<210> 353
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 353
<210> 354
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 354
<210> 355
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 355
<210> 356
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 356
<210> 357
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 357
<210> 358
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 358
<210> 359
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 359
<210> 360
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 360
<210> 361
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<210> 362
<211> 150
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 362
<210> 363
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 363
<210> 364
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 364
<210> 365
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 365
<210> 366
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 366
<210> 367
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 367
<210> 368
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
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<210> 369
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 369
<210> 370
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 370
<210> 371
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 371
<210> 372
<211> 1
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Can be present in repeats of at least one
<400> 372
<210> 373
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(2)
<223> Can be present in repeats of at least one
<400> 373
<210> 374
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(5)
<223> Can be present in repeats of at leaSt one
<400> 374
<210> 375
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(4)
<223> Can be present in repeats of at least one
<400> 375
<210> 376
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(5)
<223> Can be present in repeats of at least one
<400> 376
<210> 377
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 377
<210> 378
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 378
<210> 379
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 379
<210> 380
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 380
<210> 381
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 381
<210> 382
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 382
<210> 383
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 383
<210> 384
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 384
<210> 385
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 385
<210> 386
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 386

Claims (57)

  1. 一種經單離抗PD-1構築體，其包含特異性識別PD-1之單域抗體(sdAb)部分，其中該sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體。
  2. 如申請專利範圍第1項之經單離抗PD-1構築體，其中該sdAb部分包含：包含SEQ ID NO：37-72中任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109-144中任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181-216中任一者之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之經單離抗PD-1構築體，其中該sdAb部分包含以下中任一者：(1)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：181之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(2)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：110之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：182之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(3)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：111之胺基酸序列之CDR2，或其包含 多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：183之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(4)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：112之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：184之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(5)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：113之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：185之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(6)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：114之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：186之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(7)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：115之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：187之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(8)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：116之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：188之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(9)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：117之胺基酸序列之CDR2，或其包含 多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：189之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(10)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：118之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：190之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(11)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：191之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(12)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：192之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(13)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：193之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(14)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：122之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：194之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(15)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：123之胺基酸序列之CDR2，或其包含 多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：195之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(16)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：124之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：196之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(17)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：125之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：197之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(18)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：126之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(19)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：127之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：199之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(20)包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(21)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之CDR2，或其包含 多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：201之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(22)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：130之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(23)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：131之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：203之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(24)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：132之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：204之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(25)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：133之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(26)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：134之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：206之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(27)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列之CDR2，或其包含 多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(28)包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：208之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(29)包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(30)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：138之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：210之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(31)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：211之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(32)包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：212之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(33)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：141之胺基酸序列之CDR2，或其包含 多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：213之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(34)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：142之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：214之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(35)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：143之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：215之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；或(36)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列之CDR1，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；包含SEQ ID NO：144之胺基酸序列之CDR2，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體；及包含SEQ ID NO：216之胺基酸序列之CDR3，或其包含多達約3個胺基酸取代之變異體。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中該sdAb部分包含以下中任一者：(1)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(2)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：110之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：182之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體； (3)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：111之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：183之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(4)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：112之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：184之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(5)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：113之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：185之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(6)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：114之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：186之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(7)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：115之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：187之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(8)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：116之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：188之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(9)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：117之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：189之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(10)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：118之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：190之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體； (11)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：191之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(12)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：192之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(13)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：193之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(14)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：122之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：194之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(15)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：123之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：195之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(16)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：124之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：196之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(17)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：125之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：197之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(18)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：126之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體； (19)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：127之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：199之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(20)包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(21)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：201之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(22)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：130之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(23)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：131之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：203之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(24)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：132之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：204之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(25)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：133之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(26)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：134之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：206之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體； (27)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(28)包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：208之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(29)包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(30)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：138之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：210之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(31)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：211之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(32)包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：212之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(33)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：141之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：213之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；(34)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：142之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：214之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體； (35)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：143之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：215之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體；或(36)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：144之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：216之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含多達約3個胺基酸取代之變異體。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中該sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含以下中任一者之胺基酸序列：a-1)在位置37處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：F、Y、L、I、及V；a-2)在位置44處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：A、G、E、D、G、Q、R、S、及L；a-3)在位置45處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：L、R、及C；a-4)在位置103處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：W、R、G、及S；且a-5)在位置108處之胺基酸殘基為Q；或b-1)在位置37處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：F、Y、L、I、及V；b-2)在位置44處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：E、Q、及G；b-3)在位置45處之胺基酸殘基為R；b-4)在位置103處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：W、R、及S；且b-5)在位置108處之胺基酸殘基選自由以下組成之群：Q及L；其中，胺基酸位置係根據Kabat編號，且其中當位置108為Q時，位置108可視情況經人源化為L。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中該sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一 者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：289-324中任一者具有至少約80%序列一致性的變異體。
  7. 如申請專利範圍第6項之經單離抗PD-1構築體，其中該sdAb部分包含VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO：289-324中任一者之胺基酸序列，或在其VHH域中包含多達約3個胺基酸取代之變異體。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中該sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-5M至約10-12M。
  9. 如申請專利範圍第8項之經單離抗PD-1構築體，其中該sdAb部分與PD-1之間的結合之Kd為約10-7M至約10-12M。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中特異性識別PD-1之該sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人源化、或完全人源化sdAb部分。
  11. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中該經單離抗PD-1構築體為僅重鏈抗體(HCAb)，其包含經由視情況選用之連接子融合至Fc片段的該特異性識別PD-1之sdAb部分。
  12. 如申請專利範圍第11項之經單離抗PD-1構築體，其中該HCAb為單體或二聚HCAb。
  13. 如申請專利範圍第11項或第12項之經單離抗PD-1構築體，其中該Fc片段為人類IgG1(hIgG1)Fc、無效應子(惰性)hIgG1 Fc、hIgG4 Fc、或hIgG4 Fc(S228P)。
  14. 如申請專利範圍第11項至第13項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中該視情況選用之連接子包含SEQ ID NO：367-376中任一者之胺基酸序列。
  15. 如申請專利範圍第11項至第14項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中該HCAb包含SEQ ID NO：325-360中任一者之胺基酸序列。
  16. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中該經單離抗PD-1構築體進一步包含特異性識別第二表位之第二抗體部分。
  17. 如申請專利範圍第16項之經單離抗PD-1構築體，其中該第二抗體部分為全長抗體、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、單鏈Fv(scFv)、scFv-scFv、微型抗體、雙功能抗體、或sdAb。
  18. 如申請專利範圍第16項或第17項之經單離抗PD-1構築體，其中該抗PD-1構築體具有多特異性。
  19. 如申請專利範圍第16項至第18項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中特異性識別PD-1之該sdAb部分及該第二抗體部分視情況藉由肽連接子連接。
  20. 如申請專利範圍第19項之經單離抗PD-1構築體，其中該肽連接子包含SEQ ID NO：367-376中任一項之胺基酸序列。
  21. 如申請專利範圍第16項至第20項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中該第二抗體部分為特異性識別PD-1或CTLA-4之第二sdAb。
  22. 如申請專利範圍第16項至第20項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中該第二抗體部分為由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體。
  23. 如申請專利範圍第22項之經單離抗PD-1構築體，其中該重鏈之該Fc片段為人類IgG1(hIgG1)Fc、無效應子(惰性)hIgG1 Fc、hIgG4 Fc、或hIgG4 Fc(S228P)。
  24. 如申請專利範圍第22項或第23項之經單離抗PD-1構築體，其中特異性識別PD-1之該sdAb部分之N末端融合至該全長抗體之該等重鏈之至少一者之C末端。
  25. 如申請專利範圍第22項或第23項之經單離抗PD-1構築體，其中特異性識別PD-1之該sdAb部分之C末端融合至該全長抗體之該等重鏈之至少一者之N末端。
  26. 如申請專利範圍第22項或第23項之經單離抗PD-1構築體，其中特異性識別PD-1之該sdAb部分之N末端融合至該全長抗體之該等輕鏈之至少一者之C末端。
  27. 如申請專利範圍第22項或第23項之經單離抗PD-1構築體，其中特異性識別PD-1之該sdAb部分之C末端融合至該全長抗體之該等輕鏈之至少一者之N末端。
  28. 如申請專利範圍第22項至第27項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中該全長抗體特異性識別TIGIT。
  29. 如申請專利範圍第28項之經單離抗PD-1構築體，其中該全長抗體包含：包含SEQ ID NO：377之胺基酸序列之重鏈之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3；以及包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之輕鏈之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。
  30. 如申請專利範圍第28項或第29項之經單離抗PD-1構築體，其中該全長抗體包含：包含SEQ ID NO：377之胺基酸序列之重鏈；以及包含SEQ ID NO：378之胺基酸序列之輕鏈。
  31. 如申請專利範圍第22項至第27項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中該全長抗體特異性識別LAG-3。
  32. 如申請專利範圍第31項之經單離抗PD-1構築體，其中該全長抗體包含：包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列之重鏈之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3；以及包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之輕鏈之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。
  33. 如申請專利範圍第31項或第32項之經單離抗PD-1構築體，其中該全長抗體包含：包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列之重鏈；以及包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之輕鏈。
  34. 如申請專利範圍第22項至第27項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中該全長抗體特異性識別TIM-3。
  35. 如申請專利範圍第34項之經單離抗PD-1構築體，其中該全長抗體包含：包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列之重鏈之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3；以及包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之輕鏈之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。
  36. 如申請專利範圍第34項或第35項之經單離抗PD-1構築體，其中該全長抗體包含：包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列之重鏈；以及包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之輕鏈。
  37. 如申請專利範圍第22項至第27項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中該全長抗體特異性識別CTLA-4。
  38. 如申請專利範圍第37項之經單離抗PD-1構築體，其中該全長抗體包含：包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列之重鏈之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3；以及包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之輕鏈之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。
  39. 如申請專利範圍第37項或第38項之經單離抗PD-1構築體，其中該全長抗體包含：包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列之重鏈；以及包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之輕鏈。
  40. 如申請專利範圍第22項至第27項中任一項之經單離抗PD-1構築體，其中該全長抗體特異性識別PD-1。
  41. 如申請專利範圍第40項之經單離抗PD-1構築體，其中該全長抗體包含：包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列之重鏈之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3；以及包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之輕鏈之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3。
  42. 如申請專利範圍第40項或第41項之經單離抗PD-1構築體，其中該全長抗體包含：包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列之重鏈；以及包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之輕鏈。
  43. 一種經單離抗PD-1構築體，其包含特異性識別PD-1之sdAb部分，其中該sdAb部分包含SEQ ID NO：289-324中任一者之CDR1、CDR2、及CDR3。
  44. 一種經單離抗PD-1構築體，其以與如申請專利範圍第1項至第43項中任一項之經單離抗PD-1構築體競爭之方式特異性結合PD-1。
  45. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項至第44項中任一項之經單離抗PD-1構築體及視情況醫藥學上可接受之載劑。
  46. 一種治療患有PD-1相關疾病之個體之方法，其包含向該個體投與有效量如申請專利範圍第45項之醫藥組成物。
  47. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該PD-1相關疾病為癌症。
  48. 如申請專利範圍第47項之方法，其中該癌症為實體腫瘤。
  49. 如申請專利範圍第48項之方法，其中該癌症為結腸癌。
  50. 如申請專利範圍第46項至第49項中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與額外療法。
  51. 如申請專利範圍第46項至第50項中任一項之方法，其中該個體為人類。
  52. 一種經單離核酸，其編碼如申請專利範圍第1項至第44項中任一項之經單離抗PD-1構築體。
  53. 一種載體，其包含如申請專利範圍第52項之經單離核酸。
  54. 一種經單離宿主細胞，其包含如申請專利範圍第52項之經單離核酸或如申請專利範圍第53項之載體。
  55. 一種套組，其包含如申請專利範圍第1項至第44項中任一項之經單離抗PD-1構築體、如申請專利範圍第52項之經單離核酸、如申請專利範圍第53項之載體、或如申請專利範圍第54項之經單離宿主細胞。
  56. 一種產生抗PD-1構築體之方法，其包含：(a)在有效表現經編碼抗PD-1構築體之條件下培養包含如申請專利範圍第52項之經單離核酸或如申請專利範圍第53項之載體之宿主細胞或如申請專利範圍第54項之經單離宿主細胞；及(b)自該宿主細胞獲得經表現抗PD-1構築體。
  57. 如申請專利範圍第56項之方法，其中步驟(a)進一步包含產生包含如申請專利範圍第52項之經單離核酸或如申請專利範圍第53項之載體之宿主細胞。
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7366908B2 (ja) 2018-01-15 2023-10-23 ナンジン レジェンド バイオテック カンパニー，リミテッド Ｐｄ－１に対する単一ドメイン抗体及びその変異体
CN114222759B (zh) * 2019-09-06 2023-06-06 北京拓界生物医药科技有限公司 抗pd-1单域抗体、其衍生蛋白及其医药用途
CN112341538A (zh) * 2020-10-27 2021-02-09 苏州复融生物技术有限公司 一种Fc单体多肽及其应用
CN118240082A (zh) * 2020-12-28 2024-06-25 浙江纳米抗体技术中心有限公司 Pd-1结合分子及其应用
CN114763384B (zh) * 2021-01-14 2023-03-17 立凌生物制药(苏州)有限公司 靶向pd-1的单域抗体及其衍生物和用途
CN114573704B (zh) * 2021-03-10 2022-11-01 北京拓界生物医药科技有限公司 Pd-1/ctla-4结合蛋白及其医药用途
AR125488A1 (es) * 2021-04-30 2023-07-19 Medimmune Llc Proteínas de unión biespecíficas de pd-1 y de tigit, y usos de las mismas
CN115340605A (zh) * 2021-05-14 2022-11-15 迈威(上海)生物科技股份有限公司 一种抗pd-l1单域抗体及其衍生蛋白
WO2023100944A1 (ja) * 2021-12-01 2023-06-08 株式会社Epsilon Molecular Engineering ランダム領域搭載用フレームワーク配列を有するペプチド及びそのペプチドで構成されるペプチドライブラリ
WO2024119193A2 (en) 2022-12-02 2024-06-06 AskGene Pharma, Inc. Mutant il-2 polypeptides and il-2 prodrugs
WO2024125417A1 (en) * 2022-12-12 2024-06-20 LaNova Medicines Limited Bispecific antibodies targeting pd1 and vegf

Family Cites Families (215)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
EP0308936B1 (en) 1987-09-23 1994-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibody heteroconjugates for the killing of HIV-infected cells
WO1990003430A1 (en) 1988-09-23 1990-04-05 Cetus Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ATE144793T1 (de) 1989-06-29 1996-11-15 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DK0463151T3 (da) 1990-01-12 1996-07-01 Cell Genesys Inc Frembringelse af xenogene antistoffer
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
EP0625200B1 (en) 1992-02-06 2005-05-11 Chiron Corporation Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
EP0656064B1 (en) 1992-08-17 1997-03-05 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
ATE452975T1 (de) 1992-08-21 2010-01-15 Univ Bruxelles Immunoglobuline ohne leichte ketten
RU2139731C1 (ru) 1992-11-13 1999-10-20 Айдек Фармасьютикалс Корпорейшн (US Способ лечения, антитела, гибридома
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
WO1996016673A1 (en) 1994-12-02 1996-06-06 Chiron Corporation Method of promoting an immune response with a bispecific antibody
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
CA2761116A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5837234A (en) 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
WO1997038123A1 (en) 1996-04-05 1997-10-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
DK0937140T3 (da) 1996-06-27 2008-01-28 Vlaams Interuniv Inst Biotech Antistofmolekyler, som interagerer specifikt med et målmolekyles aktive sted eller klöft
EP1027073A2 (en) 1996-11-19 2000-08-16 Sangstat Medical Corporation Enhanced effects for hapten conjugated therapeutics
DK0942968T3 (da) 1996-12-03 2008-06-23 Amgen Fremont Inc Fuldt humane antistoffer, der binder EGFR
CA2288600C (en) 1997-05-02 2010-06-01 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
WO1999037681A2 (en) 1998-01-26 1999-07-29 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
GB9824632D0 (en) 1998-11-10 1999-01-06 Celltech Therapeutics Ltd Biological compounds
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ATE276359T1 (de) 1999-01-19 2004-10-15 Unilever Nv Verfahren zur herstellung von antikörperfragmenten
JP4368530B2 (ja) 1999-04-09 2009-11-18 協和発酵キリン株式会社 免疫機能分子の活性を調節する方法
EP1212422B1 (en) 1999-08-24 2007-02-21 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
EP1240319A1 (en) 1999-12-15 2002-09-18 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
HUP0300369A2 (hu) 2000-04-11 2003-06-28 Genentech, Inc. Többértékű antitestek és alkalmazásuk
EP2295456A1 (en) 2000-04-12 2011-03-16 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2380443C (en) 2000-05-26 2013-03-12 Ginette Dubuc Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
WO2002031140A1 (fr) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules produisant des compositions d'anticorps
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
AU2002239422B2 (en) 2000-11-30 2006-12-07 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
CN1195779C (zh) 2001-05-24 2005-04-06 中国科学院遗传与发育生物学研究所 抗人卵巢癌抗人cd3双特异性抗体
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
CN1555411A (zh) 2001-08-03 2004-12-15 ���迨�����＼���ɷݹ�˾ 抗体-依赖性细胞毒性增大的抗体糖基化变体
CA2457636C (en) 2001-08-10 2012-01-03 Aberdeen University Antigen binding domains
EP1433793A4 (en) 2001-09-13 2006-01-25 Inst Antibodies Co Ltd METHOD FOR CREATING A CAMEL ANTIBODY LIBRARY
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
US20030157108A1 (en) 2001-10-25 2003-08-21 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
AU2003236015A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition
DE60336548D1 (de) 2002-04-09 2011-05-12 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
WO2003085119A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede d'amelioration de l'activite d'une composition d'anticorps de liaison avec le recepteur fc$g(g) iiia
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
WO2003102157A2 (en) 2002-06-03 2003-12-11 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1556684A4 (en) 2002-11-01 2008-01-23 Univ Colorado Regents QUANTITATIVE ANALYSIS OF PROTEIN ISOFORMS USING FLIGHT TIME MASS SPECTROMETRY BY MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION / IONIZATION
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
PT1572744E (pt) 2002-12-16 2010-09-07 Genentech Inc Variantes de imunoglobulina e utilizações destas
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
AU2004279742A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Fused protein composition
US20070134759A1 (en) 2003-10-09 2007-06-14 Harue Nishiya Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
KR101220691B1 (ko) 2003-11-05 2013-01-14 로슈 글리카트 아게 증가된 ｆｃ 수용체 결합 친화성 및 효과기 기능을 가진ｃｄ20 항체
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
ZA200608130B (en) 2004-03-31 2008-12-31 Genentech Inc Humanized anti-TGF-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
EP2357201B1 (en) 2004-04-13 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
KR101422286B1 (ko) 2004-07-22 2014-07-23 에라스무스 유니버시티 메디컬 센터 로테르담 결합 분자
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
EP3088004B1 (en) 2004-09-23 2018-03-28 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
FR2879605B1 (fr) 2004-12-16 2008-10-17 Centre Nat Rech Scient Cnrse Production de formats d'anticorps et applications immunologiques de ces formats
CA2612355A1 (en) 2005-06-16 2006-12-28 Virxsys Corporation Antibody complexes
KR20140053410A (ko) 2005-08-19 2014-05-07 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
CA2638117A1 (en) 2006-01-25 2007-08-30 Erasmus University Medical Center Rotterdam Generation of heavy-chain only antibodies in transgenic animals
WO2007112940A2 (en) 2006-03-31 2007-10-11 Ablynx N.V. Albumin-derived amino acid sequence, use thereof for increasing the half-life of therapeutic proteins and of other therapeutic compounds and entities, and constructs comprising the same
US20070292936A1 (en) 2006-05-09 2007-12-20 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN101210048A (zh) 2006-12-29 2008-07-02 中国医学科学院血液学研究所 用于靶向结合髓系白血病细胞的抗cd33的工程抗体及其表达载体和用途
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
ES2616355T3 (es) 2007-06-18 2017-06-12 Merck Sharp & Dohme B.V. Anticuerpos para el receptor humano de muerte programada PD-1
JP2011504740A (ja) 2007-11-27 2011-02-17 アブリンクス エン．ヴェー． ヘテロ二量体サイトカイン及び／又はこれらの受容体に指向性を有するアミノ酸配列、並びにこれを含むポリペプチド
AU2008328726B2 (en) 2007-11-30 2014-06-12 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
MX350962B (es) 2008-01-07 2017-09-27 Amgen Inc Metodo para fabricar moleculas heterodimericas de fragmentos cristalizables de anticuerpo, utilizando efectos electrostaticos de direccion.
US20100122358A1 (en) 2008-06-06 2010-05-13 Crescendo Biologics Limited H-Chain-only antibodies
IT1394281B1 (it) 2009-01-19 2012-06-06 Zardi Processo per la produzione di proteine di fusione polivalenti e polispecifiche utilizzando come struttura portante l'uteroglobina e prodotti cosi' ottenuti.
GB0903325D0 (en) 2009-02-26 2009-04-08 Univ Aberdeen Antibody molecules
MX2011010159A (es) 2009-04-02 2011-10-17 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla.
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
EP2954779B1 (en) 2009-12-10 2019-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make heavy chain antibodies
TW201134488A (en) 2010-03-11 2011-10-16 Ucb Pharma Sa PD-1 antibodies
US8993731B2 (en) 2010-03-11 2015-03-31 Ucb Biopharma Sprl PD-1 antibody
CA2796633C (en) 2010-04-23 2020-10-27 Genentech, Inc. Production of heteromultimeric proteins
UA112062C2 (uk) 2010-10-04 2016-07-25 Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх Cd33-зв'язувальний агент
JP6014116B2 (ja) 2011-03-31 2016-10-25 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． ヒト・プログラム死受容体ｐｄ−１に対する抗体の安定製剤および関連治療
CN103608684B (zh) 2011-05-12 2016-05-04 基因泰克公司 利用框架签名肽检测动物样品中的治疗性抗体的多重反应监测lc-ms/ms方法
CN107936121B (zh) 2011-05-16 2022-01-14 埃泰美德(香港)有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
WO2013019906A1 (en) 2011-08-01 2013-02-07 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using pd-1 axis binding antagonists and mek inhibitors
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
JP2015506372A (ja) 2012-01-27 2015-03-02 グリックニック インコーポレイテッド ＩｇＧ２ヒンジドメインを含む融合タンパク質
KR101911438B1 (ko) 2012-10-31 2018-10-24 삼성전자주식회사 이중 특이 항원 결합 단백질 복합체 및 이중 특이 항체의 제조 방법
CN105407902A (zh) 2013-03-05 2016-03-16 贝勒医学院 溶瘤病毒
WO2014209804A1 (en) 2013-06-24 2014-12-31 Biomed Valley Discoveries, Inc. Bispecific antibodies
CN104250302B (zh) * 2013-06-26 2017-11-14 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd‑1抗体及其应用
PT3702373T (pt) * 2013-09-13 2022-09-27 Beigene Switzerland Gmbh Anticorpos anti-pd1 e a sua utilização como agentes terapêuticos e de diagnóstico
US10350275B2 (en) 2013-09-21 2019-07-16 Advantagene, Inc. Methods of cytotoxic gene therapy to treat tumors
BR112016010224A2 (pt) 2013-11-05 2018-05-02 Cognate Bioservices, Inc. combinações de inibidores do ponto de verificação e produtos terapêuticos para tratar o câncer.
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
MX2016010080A (es) 2014-02-04 2016-10-07 Incyte Corp Combinacion de un antagonista de muerte programada-1 y un inhibidor de indolamina 2,3-dioxigenasa 1 para el tratamiento del cancer.
AU2015230938C1 (en) 2014-03-21 2021-10-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
HRP20220738T1 (hr) 2014-08-11 2022-08-19 Acerta Pharma B.V. Terapijske kombinacije inhibitora btk, inhibitora pd-1 i/ili inhibitora pd-l1
KR102485788B1 (ko) 2014-08-27 2023-01-09 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 항체, 조성물 및 용도
MA40579A (fr) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech Inc Anticorps anti-cll-1 et immunoconjugués
TWI716362B (zh) 2014-10-14 2021-01-21 瑞士商諾華公司 針對ｐｄ－ｌ１之抗體分子及其用途
CA2964317C (en) 2014-10-14 2021-10-05 Halozyme, Inc. Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same
US10822414B2 (en) * 2014-11-11 2020-11-03 Sutro Biopharma, Inc. Anti-PD-1 antibodies, compositions comprising anti-PD-1 antibodies and methods of using anti-PD-1 antibodies
JP2017537090A (ja) 2014-11-17 2017-12-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｏｘ４０結合アゴニスト及びｐｄ−１軸結合アンタゴニストを含む併用療法
WO2016154473A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Oncosec Medical Incorporated Method for the treatment of malignancies
US20180100026A1 (en) 2015-04-15 2018-04-12 California Institute For Biomedical Research Optimized chimeric receptor t cell switches and uses thereof
IL293719B2 (en) 2015-05-21 2023-07-01 Harpoon Therapeutics Inc Trispecific binding proteins and methods of use
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
EP3307779A2 (en) 2015-06-12 2018-04-18 Alector LLC Anti-cd33 antibodies and methods of use thereof
EP3310378B1 (en) 2015-06-16 2024-01-24 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-cll-1 antibodies and methods of use
PE20181018A1 (es) * 2015-08-11 2018-06-26 Wuxi Biologics Cayman Inc Anticuerpos anti-pd-1 novedosos
WO2017024515A1 (en) * 2015-08-11 2017-02-16 Wuxi Biologics (Cayman) Inc. Novel anti-pd-1 antibodies
US10946095B2 (en) 2015-09-02 2021-03-16 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Antibodies specific to human T-cell immunoglobulin and ITIM domain (TIGIT)
EP3353210B1 (en) 2015-09-25 2024-11-06 Genentech, Inc. Anti-tigit antibodies and methods of use
CN108463472A (zh) 2015-09-30 2018-08-28 Igm生物科学有限公司 具有修饰的j-链的结合分子
JP7023233B2 (ja) 2015-10-01 2022-02-21 ポテンザ セラピューティックス インコーポレイテッド 抗ｔｉｇｉｔ抗原結合タンパク質と、その使用方法
SG10201911035QA (en) 2015-11-18 2020-01-30 Merck Sharp & Dohme Pd1 and/or lag3 binders
US10544222B2 (en) 2015-11-18 2020-01-28 Merck Sharp & Dohme Corp. PD1/CTLA4 binders
WO2017087901A2 (en) 2015-11-19 2017-05-26 Sutro Biopharma, Inc. Anti-lag3 antibodies, compositions comprising anti-lag3 antibodies and methods of making and using anti-lag3 antibodies
EP3405492B1 (en) 2016-01-21 2020-10-21 Novartis AG Multispecific molecules targeting cll-1
WO2017132279A1 (en) 2016-01-25 2017-08-03 Genentech, Inc. Methods for assaying t-cell dependent bispecific antibodies
CN105754990A (zh) 2016-01-29 2016-07-13 深圳精准医疗科技有限公司 一种pd-1/ctla-4双特异性抗体的制备方法及其应用
JP7536424B2 (ja) 2016-02-26 2024-08-20 イミュネクサス・セラピューティクス・リミテッド 多重特異性分子
CN109069638B (zh) 2016-03-24 2022-03-29 璟尚生物制药公司 用于癌症治疗的三特异性抑制剂
WO2017196847A1 (en) 2016-05-10 2017-11-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Variable new antigen receptor (vnar) antibodies and antibody conjugates targeting tumor and viral antigens
EP3243836A1 (en) 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
SI3458478T1 (sl) * 2016-05-18 2021-04-30 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-PD1 in anti-LAG3 protitelesa za zdravljenje raka
CN107400166A (zh) 2016-05-19 2017-11-28 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 针对ctla4的单域抗体及其衍生蛋白
WO2018014260A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
CA2937157A1 (en) 2016-07-25 2018-01-25 Ucl Business Plc Protein-based t-cell receptor knockdown
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
CN106939050B (zh) 2017-03-27 2019-05-10 顺昊细胞生物技术（天津）股份有限公司 抗pd1和cd19双特异性抗体及其应用
EA039662B1 (ru) 2017-10-03 2022-02-24 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Антитела, специфичные к cd47 и pd-l1
CN109897111B (zh) 2017-12-08 2021-02-23 杭州翰思生物医药有限公司 抗pd-1/cd47的双特异性抗体及其应用
EP3733716A4 (en) 2017-12-26 2021-11-24 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. DIMERAL FUSION PROTEIN USING ANTIBODY FC REGION AS A SKELETON AND ASSOCIATED USE
CN117050184A (zh) 2017-12-28 2023-11-14 南京传奇生物科技有限公司 针对tigit的单域抗体和其变体
SG11202006362RA (en) 2018-01-08 2020-07-29 Nanjing Legend Biotech Co Ltd Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
JP7366908B2 (ja) 2018-01-15 2023-10-23 ナンジン レジェンド バイオテック カンパニー，リミテッド Ｐｄ－１に対する単一ドメイン抗体及びその変異体
CN108047333B (zh) 2018-01-15 2021-05-25 浙江阿思科力生物科技有限公司 以cd33为靶点的特异性抗体、car-nk细胞及其制备和应用
WO2019179434A1 (en) 2018-03-20 2019-09-26 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel bispecific pd-1/cd47 antibody molecules
TW202003567A (zh) 2018-03-30 2020-01-16 大陸商南京傳奇生物科技有限公司 針對lag-3之單一結構域抗體及其用途
AU2019337759A1 (en) 2018-09-10 2021-03-11 Legend Biotech Ireland Limited Single-domain antibodies against CD33 and constructs thereof
EP3998287A4 (en) 2019-07-08 2023-08-09 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. ANTI-CD47/ANTI-PD-1 BISPECIFIC ANTIBODY, METHOD FOR ITS PRODUCTION AND ITS USE

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KR20200120641A (ko) 2020-10-21
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TWI802633B (zh) 2023-05-21

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