TW201625270A

TW201625270A - 用於治療贅瘤形成的治療組合及方法

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Publication number: TW201625270A
Application number: TW104137069A
Authority: TW
Inventors: 朵里亞強納森里歐思; 羅伯特Ｅ何林斯沃圖
Original assignee: 梅迪繆思有限公司
Priority date: 2014-11-11
Filing date: 2015-11-10
Publication date: 2016-07-16
Also published as: JP2018500384A; KR20170082579A; CN106999594A; US20190076452A1; CN106999594B; EP3218408A1; RU2017120063A3; WO2016075174A1; RU2017120063A

Abstract

本發明之特徵係阿黴素(doxorubicin)或Doxil與查核點抑制劑(例如抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、GITR配體或OX40融合蛋白(FP))組合及使用該組合以增強個體抗腫瘤活性之方法。

Description

用於治療贅瘤形成的治療組合及方法

癌症仍係主要之全球健康負擔。雖然癌症治療取得進展，但仍存在高效且低毒治療之未滿足之醫療需求，尤其對於彼等患有抗現存治療之晚期疾病或癌症之病患。

已熟知免疫系統(特定言之，T細胞介導之細胞毒性)於腫瘤控制中之角色。越來越多證據表明T細胞控制處於疾病早期及晚期階段之癌症病患之腫瘤生長及存活。然而，腫瘤特異性T細胞反應難以於癌症病患中增加並維持。

透過細胞毒性T淋巴球抗原-4(CTLA-4、CD152)及程式化死亡配體1(PD-L1，亦稱為B7H-1或CD274)接收重要注意信號的兩種T細胞路徑。

CTLA-4係表現於經活化之T細胞上並充當共抑制劑以在CD28介導之T細胞活化後之查核中保持T細胞反應。據信CTLA-4調節原始及記憶T細胞在TCR接合後之早期活化的幅度(amplitude)並成為影響抗腫瘤免疫及自體免疫兩者之中央抑制路徑之一部分。CTLA-4係僅表現於T細胞上且其配體CD80(B7.1)及CD86(B7.2)之表現主要限於抗原呈現細胞、T細胞及其他免疫介導細胞。已報告阻斷CTLA-4信號傳遞路徑之拮抗性抗CTLA-4抗體增強T細胞活化。一種此類抗體易普利姆瑪單抗(ipilimumab)在2011年被FDA批准用於治療轉移性黑色素瘤。另一抗CTLA-4抗體曲美木單抗(tremelimumab)在III階段試驗中經測試以用於治療晚期黑色素瘤，但相較於彼時之護理標準(替莫唑胺(temozolomide)或達卡巴嗪(dacarbazine))，未顯著增加病患之整體存活。

PD-L1亦係涉及控制T細胞活化之受體及配體之複雜系統的一部分。在正常組織中，PD-L1係表現於T細胞、B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、間質幹細胞、衍生自骨髓之肥胖細胞及各種非造血細胞上。其正常功能係透過與其兩種受體(程式化死亡1(亦稱為PD-1或CD279)及CD80(亦稱為B7-1或B7.1))之相互作用來調節T細胞活化與耐受之間之平衡。PD-L1亦由腫瘤表現且在多位點作用以幫助腫瘤逃避宿主免疫系統之偵測及消除。PD-L1以高頻率表現於廣泛範圍之癌症中。在一些癌症中，PD-L1之表現已與存活下降及預後不利相關。阻斷PD-L1與其受體之間之相互作用之抗體可減輕PD-L1依賴性免疫抑制效應並增強活體外抗腫瘤T細胞之細胞毒性活性。MEDI4736係可阻斷PD-L1結合至PD-1及CD80受體之針對人類PD-L1的人類單株抗體。

儘管過去十年間在開發對抗癌症及其他疾病之策略中取得顯著進展，但患有晚期、難治性及轉移性疾病之病患具有有限之臨床選擇。化學療法、輻射及高劑量化學療法已受劑量限制。仍存在對具有更佳治療療效、更長臨床利益及經改善之安全態勢之新穎低毒方法及治療之實質性未滿足之需求，特別係對於患有抗現存治療之晚期疾病或癌症之病患。

如下文描述，本發明之特徵係阿黴素(doxorubicin)或Doxil與免疫調節劑(例如，抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、GITR配體或OX40融合蛋白(FP))之組合及使用該組合以增強個體抗腫瘤活性之方法。

在一個態樣中，本發明提供一種增加個體抗腫瘤活性之方法，該方法涉及向個體投與阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式及為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、糖皮質素誘導之TNFR相關基因(GITR)配體及OX40融合蛋白中之一或多者之免疫調節劑。

在另一態樣中，本發明提供一種增加個體之抗腫瘤免疫反應之方法，該方法涉及向個體投與阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式及為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、糖皮質素誘導之TNFR相關基因(GITR)配體及OX40融合蛋白中之一或多者之免疫調節劑。

在另一態樣中，本發明提供一種治療個體之腫瘤之方法，該方法涉及向個體投與阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式及為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、糖皮質素誘導之TNFR相關基因(GITR)配體及OX40融合蛋白中之一或多者之免疫調節劑。

在一個態樣中，本發明提供一種用於增加抗腫瘤活性之套組，該套組含有阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式(例如，Doxil)及為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、GITR配體及OX40促效劑中之一或多者之免疫調節劑。在一些實施例中，該套組包括根據本發明之方法使用該套組之說明書。

在另一態樣中，本發明提供一種醫藥調配物，其含有有效量之阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式(例如，Doxil)及有效量之為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、GITR配體及OX40促效劑中之一或多者之免疫調節劑。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，該阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式係Doxil®。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，該抗PD-L1抗體係MEDI4736、BMS-936559或MPDL3280A。在特定實施例中，該抗PD-L1抗體係MEDI4736。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，該抗PD-1抗體係LOPD 18、納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、蘭勃利單抗(lambrolizumab)、MK-3475、AMP-224及皮立珠單抗(pidilizumab)。在特定實施例中，該抗PD-1抗體係LOPD 18。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，該抗CTLA-4抗體係曲美木單抗或易普利姆瑪單抗。在特定實施例中，該抗CTLA-4抗體係曲美木單抗。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，該免疫調節劑係GITR配體或GITR配體融合蛋白。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，該免疫調節劑係OX40融合蛋白。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，該腫瘤係結腸癌或肉瘤。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，相較於阿黴素、阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式(例如，Doxil)、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、GITR配體及OX40融合蛋白中任一者之單獨投與，該方法導致整體存活增加。在各種實施例中，該方法誘導腫瘤特異性免疫反應。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式(例如，Doxil)係與包括LOPD 18、納武單抗、派姆單抗、蘭勃利單抗、MK-3475、AMP-224及皮立珠單抗中任一者或多者之抗PD-1抗體組合投與。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式(例如，Doxil)係與包括MEDI4736、BMS-936559及MPDL3280A中任一者或多者之抗PD-L1抗體組合投與。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式(例如，Doxil)係與包括曲美木單抗及易普利姆瑪單抗中任一者或多者之抗CTLA-4抗體組合投與。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式(例如，Doxil)係與GITR配體或GITR配體融合蛋白組合投與。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式(例如，Doxil)係與OX40融合蛋白組合投與。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，阿黴素、阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式(例如，Doxil)或免疫調節劑(例如，抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、GITR配體或OX40融合蛋白)之投與係藉由靜脈內輸注。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式(例如，Doxil)及免疫調節劑係同時投與。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式(例如，Doxil)係在投與免疫調節劑之前投與。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，該免疫調節劑係在投與阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式(例如，Doxil)之前投與。

在本文描繪之任何態樣之各種實施例中，該個體係人類病患。

自實施方式及申請專利範圍將明白本發明之其他特徵及優點。

定義

除非另作規定，否則本文使用之所有技術及科學術語具有熟習本發明所屬技術領域者通常瞭解之含義。下列參考文獻向熟習此項技術者提供本發明中所用術語之許多術語之一般定義：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker編，1988)；The Glossary of Genetics，第5版，R.Rieger等人(編),Springer Verlag(1991)；及Hale & Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文使用，除非另作規定，否則下列術語具有下文歸於其等之含義。

「抗腫瘤活性」意謂減少或穩定腫瘤細胞之增殖或存活之任何生物活性。在一個實施例中，該抗腫瘤活性係抗腫瘤免疫反應。

「免疫調節劑」意謂增強免疫反應(例如，抗腫瘤免疫反應)之藥劑。本發明之例示性免疫調節劑包括抗體(諸如抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及其片段)及蛋白(諸如GITR配體或OX40融合蛋白或其片段)。在一個實施例中，該免疫調節劑係免疫查核點抑制劑。

「PD-1多肽」意謂具有與NCBI登錄號NP_005009至少約85%胺基酸一致性且具有PD-L1及/或PD-L2結合活性之多肽或其片段。下文提供NP_005009之序列。

(SEQ ID NO：1)

「PD-1核酸分子」意謂編碼PD-1多肽之多核苷酸。例示性PD-1核酸分子序列係提供於NCBI登錄號NM_005018中。

「抗PD-1抗體」意謂選擇性結合PD-1多肽之抗體。LOPD 180係例示性PD-1抗體。

LOPD180重鏈可變區多肽序列

LOPD180_VH_AA

(SEQ ID NO：2)

LOPD180重鏈可變區核酸序列

LOPD180_VH_DNA

(SEQ ID NO：3)

LOPD180輕鏈可變區多肽序列

LOPD180_VL_AA

(SEQ ID NO：4)

LOPD180輕鏈可變區核酸序列

LOPD180_VL_DNA

(SEQ ID NO：5)

其他例示性抗PD-1抗體包括納武單抗(ONO-4538/BMS-936558或MDX110，Opdivo；BMS；批准)、派姆單抗(Keytrudat®，蘭勃利單抗、MK-3475；Merck；批准)、AMP-224(Amplimmune/GSK)及皮立珠單抗(CT-011；Teva/Curetech)。

「PD-L1多肽」意謂具有與NCBI登錄號NP_001254635至少約85%胺基酸一致性且具有PD-1及CD80結合活性之多肽或其片段。

「PD-L1核酸分子」意謂編碼PD-L1多肽之多核苷酸。例示性PD-L1核酸分子序列係提供於NCBI登錄號NM_001267706中。

「抗PD-L1抗體」意謂選擇性結合PD-L1多肽之抗體。例示性抗PD-L1抗體係描述在(例如)以引用之方式併入本文中之US20130034559/US8779108及US20140356353中。MEDI4736係例示性抗PD-L1抗體。其他抗PD-L1抗體包括BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)及MPDL3280A(Roche)。

MEDI4736 VL

(SEQ ID NO：6)

MEDI4736 VH

(SEQ ID NO：7)

MEDI4736 VH CDR1

RYWMS(SEQ ID NO：8)

MEDI4736 VH CDR2

NIKQDGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO：9)

MEDI4736 VL CDR1

RASQRVSSSYLA(SEQ ID NO：10)

MEDI4736 VL CDR2

DASSRAT(SEQ ID NO：11)

MEDI4736 VL CDR3

QQYGSLPWT(SEQ ID NO：12)

「CTLA-4多肽」意謂具有與基因庫登錄號AAL07473.1至少85%胺基酸序列一致性之多肽或其具有T細胞抑制活性之片段。下文提供AAL07473.1之序列：

gi|15778586|gb|AAL07473.1|AF414120_1 CTLA-4[智人]

(SEQ ID NO：13)

「CTLA-4核酸分子」意謂編碼CTLA-4多肽之多核苷酸。例示性CTLA-4多核苷酸係提供在基因庫登錄號AAL07473中。

「抗CTLA-4抗體」意謂選擇性結合CTLA-4多肽之抗體。例示性抗CTLA-4抗體係描述在(例如)以引用之方式併入本文中之美國專利案第6,682,736；7,109,003；7,123,281；7,411,057；7,824,679； 8,143,379；7,807,797及8,491,895(其中曲美木單抗係11.2.1)號中。曲美木單抗係例示性抗CTLA-4抗體。下文提供曲美木單抗序列。

曲美木單抗美國專利案第6,682,736號

曲美木單抗VL

(SEQ ID NO：14)

曲美木單抗VH

(SEQ ID NO：15)

曲美木單抗VH CDR1

GFTFSSYGMH(SEQ ID NO：16)

曲美木單抗VH CDR2

VIWYDGSNKYYADSV(SEQ ID NO：17)

曲美木單抗VH CDR3

DPRGATLYYYYYGMDV(SEQ ID NO：18)

曲美木單抗VL CDR1

RASQSINSYLD(SEQ ID NO：19)

曲美木單抗VL CDR2

AASSLQS(SEQ ID NO：20)

曲美木單抗VL CDR3

QQYYSTPFT(SEQ ID NO：21)

如本發明中使用之術語「抗體」，係指免疫球蛋白或其片段或衍生物，且包括包含抗原結合位點之任何多肽(無論係活體外或活體內產生之多肽)。術語包括(但不限於)多株、單株、單特異性、多特異性、非特異性、人類化、單鏈、嵌合、合成、重組、融合、突變及接枝抗體。除非出於本發明之目的藉由術語「完整」修飾如在「完整抗體」中，否則術語「抗體」亦包括諸如Fab、F(ab')₂、Fv、scFv、Fd、dAb之抗體片段及保留抗原結合功能(即，特異性結合(例如)CTLA-4、PD-1或PD-L1之能力)之其他抗體片段。通常，此類片段將包含抗原結合域。

術語「抗原結合域」、「抗原結合片段」及「結合片段」係指抗體分子之包含負責抗體與抗原之間之特異性結合之胺基酸之部分。例如，在抗原較大之情況下，該抗原結合域可僅結合至該抗原之一部分。該抗原分子之負責與抗原結合域發生特異性相互作用之部分稱為「表位」或「抗原決定位」。抗原結合域通常包含抗體輕鏈可變區(V_L)及抗體重鏈可變區(V_H)，然而，不一定必須包含兩者。例如，所謂Fd抗體片段僅由V_H域組成，但仍保留完整抗體之一些抗原結合功能。

抗體之結合片段係藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶或化學裂解產生。結合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv及單鏈抗體。據瞭解「雙特異性」或「雙功能性」抗體外之抗體之各結合位點相同。以酶(木瓜酶)消化抗體產生兩個相同抗原結合片段(亦稱為「Fab」片段)，及「Fc」片段，其不具有抗原結合活性但具有結晶能力。以酶(胃蛋白酶)消化抗體產生F(ab')2片段，其中該抗體分子之兩臂保持連接且包含兩個抗原結合位點。該F(ab')2片段具有交聯抗原之能力。當本文使用「Fv」時，其係指抗體之保留抗原識別及抗原結合位點之最小片段。當本文使用「Fab」時，其係指抗體之包含輕鏈恆定域及重鏈CHI域之片段。

術語「mAb」係指單株抗體。本發明之抗體包含(但不限於)完整原始抗體、雙特異性抗體；嵌合抗體；Fab、Fab'、單鏈V區片段(scFv)、融合多肽及非習知抗體。

在本發明中，「包含(comprises、comprising)、含有(containing)及具有(having)」等可具有在美國專利法中所屬之含義且可意謂「包括(includes、including)」等；「基本上由其組成(consisting essentially of或consists essentially)」同樣具有在美國專利法中所屬之含義且該術語係開放性的，容許存在該敘述以外的含義，只要該敘述之基礎或新穎特徵未被該敘述以外所存在的含義改變，但排除先前技術實施例。

如本文使用，術語「測定」、「評定」、「分析」、「量測」及「偵測」係指定量及定性測定，且因此術語「測定」於本文中可與「分析」、「量測」等交換使用。若欲定量測定，使用片語「測定(分析物)之量」等。若欲定性及/或定量測定，使用片語「測定(分析物)水平」或「偵測」分析物。

「阿黴素」意謂具有下列結構式之小化合物：，CAS 23214-92-8，以商品名Adriamycin銷售。Doxil®係阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式之商品名，其可自Janssen Products LP購買獲得。

「糖皮質素誘導之TNFR相關基因(GITR)多肽」意謂具有與 NP_683699至少約85%胺基酸序列一致性且具有T細胞調節活性之蛋白質或其片段。在一個實施例中，GITR調節T細胞存活。

(SEQ ID NO：22)

GITR亦稱為腫瘤壞死因子受體超家族，成員18。

「糖皮質素誘導之TNFR相關基因(GITR)配體」意謂特異性結合GITR且具有與NP_005083至少約85%胺基酸序列一致性之蛋白質或其片段。下文提供NP_005083(例示性人類GITR配體)之序列： (SEQ ID NO：23)

在一實施例中，GITR配體係GITR促效劑或GITR配體融合蛋白。GITR促效劑結合GITR並誘導腫瘤消退。GITR配體係描述於例如Clothier等人之The Journal of Immunology October 3,2014 1401002中。

「OX40融合蛋白」意謂特異性結合OX40受體並增加免疫反應之蛋白質。在一實施例中，OX40融合蛋白結合至OX-40受體會藉由提高T細胞識別增強腫瘤抗原特異性免疫反應。例示性OX40融合蛋白係描述於標題為「Trimeric OX40 Immunoglobulin Fusion Protein and Methods of Use」之美國專利案第7,959,925號中。例如，參見美國專利案第7,959,925號，SEQ ID NO.8： (SEQ ID NO：24)

其他OX40融合蛋白係描述(例如)於美國專利案第6,312,700號中。在一個實施例中，OX40融合蛋白增強腫瘤特異性T細胞免疫。

「參考」意謂比較標準。

「個體」意謂哺乳動物，包括(但不限於)人類或非人類哺乳動物(諸如牛、馬、犬、羊或貓)。

當瞭解本文提供之範圍係針對該範圍內之所有值之速記。例如，當瞭解1至50之範圍包括來自由以下組成之群之任何數字、數字組合或子範圍：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

如本文使用，術語「治療(treat、treating、treatment)」等係指減少或緩解疾病及/或與其相關之症狀。應瞭解，儘管未排除，但治療失調症不要求完全消除該失調症、病症或與其相關之症狀。

除非明確規定或自內文顯而易見，否則當瞭解如本文使用，術語「或」係包括性的。除非明確規定或自內文顯而易見，否則當瞭解如本文使用，術語「一」、「一個」及「該」係單數或複數。

除非明確規定或自內文顯而易見，否則當瞭解如本文使用，術語「約」在此項技術中之標準公差之範圍內，例如在平均值之2個標準偏差內。可瞭解約在規定值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%內。除非內文明確規定，否則以術語約修飾本文提供之所有數值。

對本文變量之任何定義中之化學基團之清單的援引包括該變量作為任何單一基團或所列基團之組合之定義。對本文變量或態樣之實施例之援引包括該實施例作為任何單一實施例或與任何其他實施例或其部分之組合。

本文提供之任何組合物或方法可與本文提供之任何其他組合物及方法中之一或多者組合。

圖1A-1J係顯示在CT26腫瘤模型中阿黴素或Doxil與α-PD-1及α-CTLA-4抗體之組合之協同作用之圖。圖1A係繪示未經治療之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖1B係繪示投與同型對照組(大鼠IgG2a+小鼠IgG2b(5/0.5mg/kg))之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖1C係繪示投與阿黴素(4mg/kg)之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖1D係繪示投與Doxil(1mg/kg)之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖1E係繪示投與α-PD-1(5mg/kg)之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖1F係繪示投與α-CTLA-4(0.5mg/kg)之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖1G係繪示投與阿黴素+α-PD-1(4/5mg/kg)之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖1H係繪示投與Doxil+α-PD-1(1/5mg/kg)之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖1I係繪示投與阿黴素+α-CTLA-4(4/0.5mg/kg)之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖1J係繪示投與Doxil+α-CTLA-4(1/0.5mg/kg)之小鼠中之腫瘤體積之圖。*,p<0.005(Bliss獨立性測試)。將CT26細胞植入Balb/C小鼠內。細胞植入四天後，小鼠藉由體重隨機化並在第4、11及17天給藥Doxil；在第4、8及12天給藥阿黴素；且在第10、14、17及21天給藥抗PD-1或抗CTLA-4。

圖2A及2B顯示經Doxil或阿黴素單獨或與α-PD-1及α-CTLA-4組合治療之小鼠之存活。顯示圖1A-1J中之研究之小鼠之存活。圖2A係顯示投與α-PD-1與Doxil或阿黴素之組合之小鼠組及相關對照組之存活之圖。圖2B係顯示經單獨投與α-CTLA-4或與Doxil或阿黴素組合之小鼠組及相關對照組之存活之圖。經α-PD-1或α-CTLA-4抗體與Doxil(1mg/kg)或阿黴素(4mg/kg)之組合治療之小鼠比經α-PD-1或α-CTLA-4單獨治療之小鼠存活更久。α-PD-1+阿黴素(*)及α-CTLA-4+阿黴素(#)組相較於阿黴素組在統計上不同(藉由對數秩測試，分別係p=0.005及p=0.0012)。

圖3A-3D顯示對Doxil單獨投與或與抗CTLA-4或抗PD-1抗體之組合達成完全反應之小鼠抵抗腫瘤再激發。圖3A係繪示原始Balb/C小鼠(n=10)中之腫瘤體積之圖。圖3B係繪示由Doxil治療及以CT26細胞再激發達成完全反應之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖3C係繪示由α-CTLA-4+Doxil治療(n=10)及以CT26細胞再激發達成完全反應之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖3D係繪示由α-PD-1+Doxil治療(n=9)及以CT26細胞再激發達成完全反應之小鼠中之腫瘤體積之圖。數字指示該組中小鼠總數中排斥腫瘤之小鼠數量。

圖4A-4D顯示T細胞係活體內Doxil活性所需。圖4A係顯示如指示給藥Doxil(5mg/kg)或阿黴素(5mg/kg)之攜載CT26腫瘤之無胸腺裸小鼠中之腫瘤體積之圖。圖4B係顯示如指示給藥Doxil(5mg/kg)或阿黴素(5mg/kg)之攜載CT26腫瘤之Balb/C小鼠中之腫瘤體積之圖。圖4C係顯示如指示給藥吉西他濱(gemcitabine)(75mg/kg)之攜載CT26腫瘤之無胸腺裸小鼠中之腫瘤體積之圖。圖4D係顯示如指示給藥奧沙利鉑(oxiplatin)(8mg/kg)之攜載CT26腫瘤之無胸腺裸小鼠中之腫瘤體積之圖。圖4E係顯示如指示給藥奧沙利鉑(8mg/kg)之攜載CT26腫瘤之Balb/C小鼠中之腫瘤體積之圖。箭頭指示劑量投與。

圖5A-5L顯示既定CT26腫瘤模型中Doxil與多種免疫治療之組合之協同抗腫瘤反應。圖5A係繪示未經治療之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖5B係繪示投與Doxil之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖5C係繪示投與OX40L融合蛋白(FP)之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖5D係繪示投與α-PD-1之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖5E係繪示投與α-PD-L1之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖5F係繪示投與α-CTLA-4之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖5G係繪示投與GITR配體融合蛋白(GITRL FP)之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖5H係繪示投與Doxil+OX40L FP之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖51係繪示投與Doxil+α-PD-1之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖5J係繪示投與Doxil+α-PD-L1之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖5K係繪示投與Doxil+α-CTLA-4之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖5L係繪示投與Doxil+GITRL FP之小鼠中之腫瘤體積之圖。攜載既定(~200-300mm3)CT26腫瘤之Balb/C小鼠係藉由腫瘤體積隨機化並用最大有效劑量之Doxil(5mg/kg，第11及19天)；OX40L FP(2.5mg/kg，第14及19天)；α-PD-1(20mg/kg，第11、14、19及22天)；α-PD-L1(30mg/kg，第11、14、19及22天)；α-CTLA-4(20mg/kg，第14、19、22及26天)及GITRL FP(5mg/kg，第14、19、22、26、29及32天)治療。CR數指示12隻中達成完全反應之小鼠數。#,p=0.056；*,p<0.008，Bliss獨立性測試。

圖6A-6E顯示CT26既定腫瘤研究中之小鼠之存活。顯示來自圖5A-5L中之CT26既定腫瘤研究之小鼠之存活。圖6A係顯示單獨投與OX40 FP或與Doxil組合之小鼠組及相關對照組之存活之圖。圖6B係顯示單獨投與α-PD-1或與Doxil組合之小鼠組及相關對照組之存活之圖。圖6C係顯示單獨投與α-PD-L1或與Doxil組合之小鼠組及相關對照組之存活之圖。圖6D係顯示單獨投與α-CTLA-4或與Doxil組合之小鼠組及相關對照組之存活之圖。圖6E係顯示單獨投與GITRL FP或與Doxil組合之小鼠組及相關對照組之存活之圖。*p<0.00625且藉由對數秩測試相較於單一藥劑治療而統計上顯著。#,p<0.00625且藉由對數秩測試相較於Doxil治療而統計上顯著。

圖7A-7L顯示MCA205同基因模型中Doxil與α-PD-1、α-PD-L1及α-CTLA-4抗體之組合之協同抗腫瘤反應。圖7A係繪示未經治療之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖7B係繪示投與Doxil之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖7C係繪示投與OX40L融合蛋白(FP)之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖7D係繪示投與α-PD-1之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖7E係繪示投與α-PD-L1之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖7F係繪示投與α-CTLA-4之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖7G係繪示投與GITR配體融合蛋白(GITRL FP)之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖7H係繪示投與Doxil+OX40L FP之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖7I係繪示投與Doxil+α-PD-1之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖7J係繪示投與Doxil+α-PD-L1之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖7K係繪示投與Doxil+α-CTLA-4之小鼠中之腫瘤體積之圖。圖7L係繪示投與Doxil+GITRL FP之小鼠中之腫瘤體積之圖。攜載既定(~100-150mm³)MCA205腫瘤之C57/B16小鼠係藉由腫瘤體積隨機化並用最大有效劑量之Doxil(5mg/kg，第10、17及24天)；OX40L FP(20mg/kg，第10及14天)；α-PD-1(10mg/kg，第10、14、17及21天)；α-PD-L1(20mg/kg，第10、14、17及21天)；α-CTLA-4(10mg/kg，第10、14、17及21天)及GITRL FP(5mg/kg，第10、14、17、21、24及28天)治療。CR數指示達成12隻中完全反應之小鼠數。*p<0.008，Bliss獨立性測試。

圖8A-8E顯示MCA205既定腫瘤研究中之小鼠之存活。顯示圖7A-7L中之MCA205既定腫瘤研究之小鼠之存活。圖8A係顯示單獨投與OX40 FP或與Doxil組合之小鼠組及相關對照組之存活之圖。圖8B係顯示單獨投與α-PD-1或與Doxil組合之小鼠組及相關對照組之存活之圖。圖8C係顯示單獨投與α-PD-L1或與Doxil組合之小鼠組及相關對照組之存活之圖。圖8D係顯示單獨投與α-CTLA-4或與Doxil組合之小鼠組及相關對照組之存活之圖。圖8E係顯示單獨投與GITRL或與Doxil組合之小鼠組及相關對照組之存活之圖。

圖9A-9I顯示Doxil具有活體內免疫調節功能。對攜載MCA205腫瘤之C57/Bl6小鼠給藥α-PD-L1、Doxil或如本文之組合。圖9A係繪示血液中CD8⁺ T細胞之百分率之圖。圖9B係繪示腫瘤中CD8⁺ T細胞之百分率之圖。圖9C係繪示腫瘤中CD4⁺/FoxP3⁺細胞之百分率之圖。圖9D係繪示血液中CD80於CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi細胞中之表現之圖。圖9E係繪示腫瘤中CD80於CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi細胞中之表現之圖。圖9F係繪示經Doxil治療之動物之血液中CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi細胞之百分率增大，此藉由添加α-PD-L1進一步擴增之圖。圖9G係繪示CD80於腫瘤分離之CD45⁺CD11b⁺Ly6C⁺細胞中之表現之圖。圖9H係繪示CD80於腫瘤分離之CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺細胞中之表現之圖。圖9I係繪示經Doxil及Doxil+α-PD-L1治療之動物之腫瘤中CD45⁺CD11b⁺Ly6C⁺細胞之百分率增大之圖。*p<0.05，**p<0.01(非成對雙尾學生t測試)。

如下文描述，本發明之特徵係阿黴素或Doxil與免疫調節劑(例如，抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、GITRL或OX40融合蛋白(FP))之組合。

阿黴素係針對患有肉瘤、肺癌、乳癌及其他癌症之病患廣泛使用之化學治療藥物。先前，已作為拓樸異構酶之DNA嵌入劑及抑制劑充分地表徵阿黴素。阿黴素之報告之其他作用機制為DNA交聯、干擾DNA股分離、自由基形成、解旋酶活性及直接膜效應。因此已將阿黴素視作於腫瘤細胞上具有直接細胞-殺死作用之細胞毒性劑。最近，阿黴素已被確定為免疫性細胞死亡之誘導劑且已顯示增加IFN γ產生，並誘導小鼠模型中樹突狀及T細胞腫瘤浸潤。

如本文描述，兩種同基因小鼠模型中阿黴素及Doxil兩者皆可與數種T細胞目標化免疫治療協同作用。重要地，組合活性於小鼠模型中係長久性的，導致高治癒率並產生免疫記憶。此外，該等結果第一時間揭示全身投與後Doxil對腫瘤中之樹突狀及未成熟骨髓細胞之直接效應。

CTLA-4、PD-1及PD-L1

越來越多證據表明T細胞控制處於疾病早期及晚期階段之癌症病患之腫瘤生長及存活。然而，腫瘤特異性T細胞反應難以在癌症病患中增加並維持。

透過細胞毒性T淋巴球抗原-4(CTLA-4、CD152)及程式化死亡配體1(PD-L1，亦稱為B7H-1或CD274)接收顯著之注意信號之兩種T細胞調節路徑。

CTLA-4係表現於經活化之T細胞上並充當共抑制劑以在CD28介導之T細胞活化後之查核中保持T細胞反應。據信CTLA-4調節原始及記憶T細胞在TCR接合後之早期活化的幅度並成為影響影響抗腫瘤免疫及自體免疫兩者之中央抑制路徑之一部分。CTLA-4係表現於T細胞上，且其配體CD80(B7.1)及CD86(B7.2)之表現主要限於抗原呈現之細胞、T細胞及其他免疫介導細胞。已報告阻斷CTLA-4信號路徑之拮抗性抗CTLA-4抗體增強T細胞活化。一種此類抗體(易普利姆瑪單抗)在2011年被FDA批准用於治療轉移性黑色素瘤。另一抗CTLA-4抗體(曲美木單抗)在III階段試驗中經測試以用於晚期黑色素瘤，但相較於彼時之護理標準(替莫唑胺或達卡巴嗪)，未顯著增加病患之整體存活。

PD-L1亦係涉及控制T細胞活化之受體及配體之複雜系統的一部分。在正常組織中，PD-L1係表現於T細胞、B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、間質幹細胞、衍生自骨髓之肥胖細胞及各種非造血細胞上。其正常功能係透過與其兩種受體(程式化死亡1(亦稱為PD-1或CD279)及CD80(亦稱為B7-1或B7.1))之相互作用來調節T細胞活化與耐受性之間之平衡。PD-L1亦由腫瘤表現且在多位點作用以幫助腫瘤逃避宿主免疫系統之偵測及消除。PD-L1以高頻率表現於廣泛範圍之癌症中。在一些癌症中，PD-L1之表現已與存活下降及預後不利相關。阻斷PD-L1與其受體之間相互作用之抗體可減輕PD-L1依賴性免疫抑制效應並增強活體外抗腫瘤T細胞之細胞毒性活性。

PD-1係50-55kDa I型跨膜受體，最初於經活化誘導細胞凋亡之T細胞系中識別。PD-1係表現於T細胞、B細胞及巨噬細胞上。PD-1之配體係B7家族成員PD-L1(B7-H1)及PD-L2(B7-DC)。

PD-1係免疫球蛋白(Ig)超家族中之一員，其細胞外區域中含有單一類IgV域。PD-1細胞質域含有兩個酪胺酸，最接近膜之酪胺酸(VAYEEL(SEQ ID NO：25)於小鼠PD-1中)位於ITIM(基於免疫受體酪胺酸之抑制模體(motif))內。PD-1上ITIM之存在指示此分子藉由募集細胞質磷酸酯酶作用以減弱抗原受體之信號傳遞。人類及鼠類PD-1蛋白共享約60%胺基酸一致性，具有保守的四個潛在N-醣化位點，及界定Ig-V域之殘基。細胞質區域中之ITIM及圍繞羧基端酪胺酸(人類及小鼠中之TEYATI(SEQ ID NO：26))之類ITIM模體亦保守於人類與鼠類異種同源物(orthologues)間。

PD-1係表現於經活化之T細胞、B細胞及單核球上。實驗資料暗示PD-1與其配體之相互作用下調中央及周邊免疫反應。特定言之，在PD-L1之存在下抑制野生型T細胞而非PD-1-缺失T細胞之增殖。此外，PD-1-缺失小鼠顯示自體免疫表現型。C57BL/6小鼠之PD-1缺失導致慢性進行性狼瘡樣腎絲球腎炎及關節炎。在Balb/c小鼠中，PD-1缺失導致因心臟組織特異性自反應抗體之存在所致之嚴重心肌症。

抗PD-1及抗PD-L1抗體

已描述抗PD-1抗體及其抗原結合片段(例如，參見以全文引用之方式併入本文中之美國專利案第7,488,802號)。LOPD180係例示性PD-1抗體。特異性結合並抑制PD-L1活性(例如，結合至PD-1及/或CD80)之抗體可用於增強抗腫瘤免疫反應。抗PD-L1抗體係此項技術中已知並描述於(例如)下列美國專利公開案中：對應於WO2007/005874之US20090055944(BMS/Medarex)；對應於WO01/14556之US2006/0153841(Dana Farber)；US2011/0271358(Dana Farber)；作為對應於WO2010/077634之美國專利案第8,217,149號發證之US2010/0203056(Genentech)；US2012/0039906(INSERM)；對應於WO2012/145493之US20140044738(Amplimmune)；US20100285039(John’s Hopkins University)；及美國專利案第8,779,108號(MEDI4736)，各以引用之方式併入本文中。

MEDI4736係對PD-L1具有選擇性並阻斷PD-L1結合至PD-1及CD80受體之例示性抗PD-L1抗體。MEDI4736可減輕活體外人類T細胞活化之PD-L1介導之抑制並經由T細胞依賴性機制抑制異種移植模型中之腫瘤生長。

用於本文提供之方法中之關於MEDI4736(或其片段)之資訊可參見美國專利案第8,779,108號，該案之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。MEDI4736之片段可結晶(Fc)域在IgG1重鏈之恆定域中含有減少結合至補體成分C1q及負責介導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)之Fcγ受體之三重突變。

用於本文提供之方法中之MEDI4736及其抗原結合片段包含重鏈及輕鏈或重鏈可變區及輕鏈可變區。在一特定態樣中，用於本文提供之方法中之MEDI4736或其抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區。在一特定態樣中，用於本文提供之方法中之MEDI4736或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含本文於上文中顯示之經Kabat界定之CDR1、CDR2及CDR3序列，及其中該輕鏈可變區包含本文於上文中顯示之經Kabat界定之CDR1、CDR2及CDR3序列。一般技術者將可易於識別經Chothia界定、Abm界定或一般技術者已知的其他CDR定義。在一特定態樣中，用於本文提供之方法中之MEDI4736或其抗原結合片段包含2.14H9OPT抗體之可變重鏈及可變輕鏈CDR序列，如揭示於US 8,779,108號中，該案以全文引用之方式併入本文中。

抗CTLA-4抗體

特異性結合CTLA-4並抑制CTLA-4活性之抗體可用於增強抗腫瘤免疫反應。用於本文提供之方法中之關於曲美木單抗(或其抗原結合片段)之資訊可參見美國專利案第6,682,736號(其中將其稱為11.2.1)，該案之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。曲美木單抗(亦稱為CP-675,206、CP-675、CP-675206及替西木單抗(ticilimumab))係對CTLA-4具有高度選擇性並阻斷CTLA-4結合至CD80(B7.1)及CD86(B7.2)之人類IgG₂單株抗體。已顯示其導致活體外免疫活化及一些經曲美木單抗治療之病患已顯示腫瘤消退。

用於本文提供之方法中之曲美木單抗包含重鏈及輕鏈或重鏈可變區及輕鏈可變區。在一特定態樣中，用於本文提供之方法中之曲美木單抗或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(包含本文於上文中顯示之胺基酸序列)及重鏈可變區(包含本文於上文中顯示之胺基酸序列)。在一特定態樣中，用於本文提供之方法中之曲美木單抗或其抗原結合片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含本文於上文中顯示之經Kabat界定之CDR1、CDR2及CDR3序列，及其中該輕鏈可變區包含本文於上文中顯示之經Kabat界定之CDR1、CDR2及CDR3序列。一般技術者將可易於識別經Chothia界定、Abm界定或一般技術者已知的其他CDR定義。在一特定態樣中，用於本文提供之方法中之曲美木單抗或其抗原結合片段包含如揭示於US 6,682,736中之11.2.1抗體之可變重鏈及可變輕鏈CDR序列，該案以全文引用之方式併入本文中。

其他抗CTLA-4抗體描述(例如)於US 20070243184中。在一個實施例中，該抗CTLA-4抗體係易普利姆瑪單抗，亦稱為MDX-010；BMS-734016。

抗體

選擇性結合CTLA-4、PD-1或PD-L1並抑制PD-1及/或PD-L1之結合或活化之抗體可用於本發明之方法中。

通常，抗體(例如)可使用傳統融合瘤技術(Kohler及Milstein(1975)Nature,256：495-499)、重組DNA方法(美國專利案第4,816,567號)或以抗體庫進行之噬菌體顯示(Clackson等人，(1991)Nature,352：624-628；Marks等人，(1991)J.Mol.Biol.,222：581-597)來製造。就其他抗體製造技術而言，亦參見Antibodies：A Laboratory Manual編，Harlow等人，Cold Spring Harbor Laboratory,1988。本發明不限於任何特定來源、起源種類、製造方法。

完整抗體(亦稱為免疫球蛋白)通常係四聚醣化蛋白質，其包括兩條各約25kDa之輕(L)鏈及兩條各約50kDa之重(H)鏈。抗體中發現兩種類型之輕鏈，指定為λ鏈及κ鏈。取決於重鏈之恆定域之胺基酸序列，免疫球蛋白可分為五個主要類別：A、D、E、G及M，且此等中之數種可進一步分為子類(同型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。

不同類別之免疫球蛋白之子單元結構及三維組態係此項技術中熟知。回顧抗體結構，參見Harlow等人，同上。簡而言之，各輕鏈包括N端可變域(VL)及恆定域(CL)。各重鏈包括N端可變域(VH)、三或四個恆定域(CH)及鉸鏈區。最接近VH之CH域指定為CH1。VH及VL域由四個稱為框架區(FR1、FR2、FR3及FR4)之相對保守序列區組成，其等為三個稱為互補決定區(CDR)之高度可變序列區形成支架。CDR含有大多數負責與抗原特異性相互作用之殘基。該等三個CDR稱為CDR1、CDR2及CDR3。重鏈上之CDR成分稱為H1、H2及H3，而因此將輕鏈上之CDR成分稱為L1、L2及L3。CDR3及(特定言之)H3係抗原結合域內之分子多樣性之最大來源。H3(例如)可短至兩個胺基酸殘基或大於26。

Fab片段(抗原結合片段)由VH-CH1及VL-CL域經由恆定區之間之雙硫鍵共價連接來組成。為克服當共表現於宿主細胞中時Fv中非共價連接之VH及VL域之解離趨勢，可構築所謂之單鏈(sc)Fv片段(scFv)。在scFv中，可撓性及足夠長之多肽將VH之C端連接至VL之N端或將VL之C端連接至VH之N端。最常見地，使用15-殘基(Gly4Ser)3肽(SEQ ID NO：27)作為連接子，但此項技術中亦已知其他連接子。

抗體多樣性係多種編碼可變區之生殖基因之組合性組裝及各種體細胞事件之結果。該等體細胞事件包括可變基因片段與多樣性(D)及連接(J)基因片段重組以製造完整VH區及可變及連接基因片段之重組以製造完整VL區。重組過程本身係不精確的，導致V(D)J接合處之胺基酸之損失或增加。此等多樣性機制發生於在抗原曝露前之發育B細胞中。抗原刺激後，B細胞中經表現之抗體基因經歷體細胞突變。

基於生殖基因片段之估算數量、此等片段之隨機重組及隨機VH-VL配對，可產生多達1.6×10⁷種不同抗體(Fundamental Immunology，第3版，Paul編，Raven Press,New York,N.Y.,1993)。當計入有助於抗體多樣性之其他過程(諸如體細胞突變)時，認為可潛在產生1×10¹⁰種以上不同抗體(Immunoglobulin Genes，第2版，Jonio等人編，Academic Press,San Diego,Calif.,1995)。因為許多過程涉及抗體多樣性，因此獨立產生之抗體很可能將具有在CDR中相同或甚至大體上類似之胺基酸序列。

本文提供例示性抗CTLA-4、抗PD-L1及/或抗PD-1 CDR之序列。用於攜載CDR之結構將通常係其中該CDR位於對應於天然生成VH及VL之CDR位置處之抗體重鏈或輕鏈或其之一部分。免疫球蛋白可變域之結構及位置可(例如)如描述於Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,No.91-3242,National Institutes of Health Publications,Bethesda,Md.,1991中來測定。

本發明之抗體(例如，抗CTLA-4、抗PD-L1及/或抗PD-1)可視需要包含抗體恆定區或其部分。例如，VL域可已於其C端處附接至包括人類Cκ或Cλ鏈之抗體輕鏈恆定域。同樣地，基於VH域之特異性抗原結合域可已附接衍生自任何抗體同位素(例如，IgG、IgA、IgE及IgM)及該等同位素子類別(其等包括但不限於IgG1及IgG4)中任一者之免疫球蛋白重鏈之全部或部分。

一般技術者將知曉本發明之抗體可用以偵測、量測及抑制稍微不同於CTLA-4、PD-L1及PD-1之蛋白。預期該等抗體保留結合特異性，只要目標化蛋白包含與至少100、80、60、40或20個本文描述之連續胺基酸之任何序列至少約60%、70%、80%、90%、95%或更多一致性的序列。藉由標準比對演算法測定一致性百分率，諸如(例如)描述於Altshul等人，(1990)J.Mol.Biol.,215：403-410中之Basic Local Alignment Tool(BLAST)；Needleman等人，(1970)J.Mol.Biol.,48：444-453之演算法或Meyers等人，(1988)Comput.Appl.Biosci.,4：11-17之演算法。

除序列同源分析外，可實施表位繪圖(例如，參見Epitope Mapping Protocols，Morris編，Humana Press,1996)及二級及三級結構分析以識別由揭示之抗體及其等與抗原之錯合物假定之特定3D結構。此類方法包括(但不限於)X射線晶體法(Engstom(1974)Biochem. Exp.Biol.,11：7-13)及本發明揭示之抗體之虛擬再現之電腦建模 (Fletterick等人，(1986)Computer Graphics and Molecular Modeling,in Current Communications in Molecular Biology,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。

衍生物

本發明之抗體(例如，抗CTLA-4、抗PD-L1及/或抗PD-1)可包括此等保留特異性結合其目標之能力之序列的變體。此類變體可由熟習技工使用此項技術中熟知之技術衍生自此等抗體之序列。例如，可於FR及/或CDR中製造胺基酸置換、刪除或添加。雖然通常設計FR中之變化以改良該抗體之穩定性及免疫原性，但通常設計CDR中之變化以增加抗體對其目標之親和力。FR之變體亦包括天然生成免疫球蛋白異型。可藉由涉及改變CDR及測試對其目標之親和力抗體之例行技術經驗地測定此類親和力增加之變化。例如，可在揭示之CDR中任一者中製造保守胺基酸置換。可根據描述於Antibody Engineering，第2版，Oxford University Press，Borrebaeck編，1995中之方法製造各種改變。此等包括(但不限於)藉由編碼序列中功能等效之胺基酸殘基之不同密碼子之置換而改變(因此產生「無聲」變化)之核苷酸序列。例如，非極性胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸。極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺酸及麩醯胺酸。帶正電(鹼性)之胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸。帶負電(酸性)之胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。

可藉由此項技術中熟知之各種技術製造本發明之抗體之衍生物及類似物，該等技術包括重組及合成方法(Maniatis(1990)Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.及Bodansky等人，(1995)The Practice of Peptide Synthesis，第2版，Spring Verlag,Berlin, Germany)。

在一個實施例中，一種製造本發明之VH域之胺基酸序列變體之VH域的方法包括以下步驟：於本發明揭示之VH域之胺基酸序列中添加、刪除、置換或插入一或多個胺基酸，視需要組合VH域從而具有一或多種VL域，及測試VH域或VH/VL組合或用於特異性結合至抗原之組合。可採用其中組合本文揭示之VL域之一或多種序列變體與一或多種VH域之類似方法。

Stemmer(Nature(1994)370：389-391)亦揭示類似混組或組合性技術，Stemmer描述與β-內醯胺酶基因相關之技術，但觀察到該方法可用於產生抗體。

在其他實施例中，技術人員可使用一或多種選定VH及/或VL基因之隨機突變誘發產生攜載一或多種衍生自本文揭示之序列之序列的新穎VH或VL域。Gram等人，(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1992)89：3576-3580)描述一種此類技術(易誤PCR)。

可使用之另一方法係直接突變誘發VH或VL基因之CDR。藉由Barbas等人，(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1994)91：3809-3813)及Schier等人，(J.Mol.Biol.(1996)263：551-567)揭示此類技術。

同樣地，可將一或多個或全部三個CDR接枝於VH或VL域之全庫中，然後對其篩選對CTLA-4、PD-1或PD-L1具有特異性之抗原結合片段。

一部分免疫球蛋白可變域將包含大體上如本文所列之CDR中之至少一者及(視需要)來自如本文所列之scFv片段之介入框架區。該部分可包括FR1及FR4中之一者或兩者之至少約50%，該50%係FR1之C端50%及FR4之N端50%。可變域之實質部分之N端或C端末端之額外殘基可係彼等非通常與天然生成可變域相關者。例如，藉由重組DNA技術構築抗體可導致由經引入以促進選殖或其他操作步驟之連接子編碼之N端或C端殘基的引入。其他操作步驟包括引入連接子以將可變域連接至包括如下文將進一步詳細討論之免疫球蛋白重鏈恆定區、其他可變域(例如，在雙抗體之製造中)或蛋白標記之其他蛋白序列。

熟習技工將知曉本發明之抗體可包含含有僅來自VL或VH域之單一CDR之抗原結合片段。單鏈特異性結合域中任一者可用以篩選可形成可(例如)結合至CTLA-4、PD-L1及PD-1中之兩者之兩域特異性抗原結合片段之互補域。

本文描述之本發明之抗體(例如，抗PD-L1及/或抗PD1)可連接至另一功能分子，例如，另一肽或蛋白質(白蛋白、另一抗體等)。例如，該等抗體可藉由化學交聯或藉由重組方法連接。該等抗體亦可以美國專利案第4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337號中所述之方式連接至各種非蛋白聚合物(例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧伸烷基)中之一者。該等抗體可藉由共價結合至聚合物來化學修飾，(例如)以增加其循環半衰期。附接該等抗體之例示性聚合物及方法亦顯示於美國專利案第4,766,106；4,179,337；4,495,285及4,609,546號中。

該等揭示之抗體亦可經改變以具有不同於原始模式之醣化模式。例如，可刪除一或多個醣部分及/或向原始抗體添加一或多個醣化位點。向本發明揭示之抗體添加醣化位點可藉由改變胺基酸序列以含有此項技術中已知的醣化位點一致序列來完成。增加抗體上之醣部分之數量之其他方式係藉由醣苷與抗體之胺基酸殘基之化學或酶偶合。此類方法係描述於WO 87/05330及Aplin等人，(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.,22：259-306中。該等抗體之任何醣部分之移除可以化學或酶方式來完成，例如，如藉由Hakimuddin等人，(1987)Arch.Biochem.Biophys.,259：52；及Edge等人，(1981)Anal.Biochem.,118：131及藉由Thotakura等人，(1987)Meth.Enzymol.,138：350描述。該等抗體亦可用可偵測或功能標記來標誌。可偵測標記包括諸如131I或99Tc之放射性同位素標記，其亦可使用習知化學法附接至抗體。可偵測標記亦包括酶標記(諸如山葵過氧化酶或鹼性磷酸酯酶)。可偵測標記進一步包括化學部分(諸如生物素)，其可經由結合至特異性同源可偵測部分(例如，經標記之抗生物素蛋白)來偵測。

其中CDR序列僅無實質性不同於彼等本文所列者之抗體包含於本發明之範圍內。通常，胺基酸經具有類似電荷、疏水性或立體化學特性之相關胺基酸置換。此類置換將在一般技工之技術範圍內。不同於在CDR中，可在FR中作出更多實質性變化而未不利地影響抗體之結合性質。對FR作出之變化包括(但不限於)人類化非人類衍生或改造之對抗原接觸或穩定化結合位點係重要的某些框架殘基，例如，變化恆定區之類別或子類別；變化可改變諸如Fc受體結合之效應子功能之特異性胺基酸殘基，例如，如描述於美國專利案第5,624,821及5,648,260號及Lund等人，(1991)J.Immun.147：2657-2662及Morgan等人，(1995)Immunology 86：319-324中；或變化衍生恆定區之種類。

熟習此項技術者將咸知上文描述之修飾係非完全詳細的，及熟習技工根據本發明之教義將明瞭許多其他修飾。

共治療

使用本發明之組合(諸如如本文提供之阿黴素或Doxil及GITR配體(GITRL)或OX40融合蛋白，或阿黴素或Doxil及抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段中任一者)治療患有實體腫瘤之病患可導致累加效應或協同效應。如本文使用，術語「協同」係指治療之組合(例如，阿黴素或Doxil及GITR配體(GITRL)或OX40融合蛋白，或阿黴素或Doxil及抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段中任一者之組合)，該組合相較於單一治療之累加效應更有效。

在某些實施例中，使用Bliss獨立性模型(Zhao等人，J Biomol Screen 2014；19(5)：817-21)藉由統計分析測定協同作用。該模型如下描述。若由單獨藥物A所致之總腫瘤消退速率係r _a及由單獨藥物B所致之總腫瘤消退速率係r _b，則因藥物A及藥物B之組合所致之預期總腫瘤消退速率係r _Bliss=r _a+r _b-r _a r _b，假定該等兩種該等藥物係bliss獨立性的。觀察到之總腫瘤消退速率r _ab與預望速率之間之差值係定義為協同作用指數：I=r _ab-r _Bliss

則可將協同作用指數之方差寫為：var(I)=var(r _ab)+var(r _Bliss)

此外，var(r _Bliss)=var(r _a)+var(r _b)+var(r _a r _b)-2cov(r _a+r _b ,r _a r _b)var(r _a r _b)=var(r _a)var(r _b)+r _a ² var(r _b)+r _b ² var(r _a)cov(r _a+r _b ,r _a r _b)=r _a var(r _b)+r _b var(r _a)

其中n _ab、n _a及n _b係組合實驗及兩種單一治療實驗之各自樣本尺寸。若>Z _0.95，則認為該等兩種藥物係協同作用的。

其中Z _0.95係標準常態分佈之95%百分率。

治療組合(例如，阿黴素或Doxil及GITR配體(GITRL)或OX40融合蛋白，或阿黴素或Doxil及抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段中任一者之組合)之協同效應允許使用較低劑量之一或多種治療劑及/或向患有實體腫瘤之病患頻率較低地投與該等治療劑。利用較低劑量之治療劑及/或向病患頻率較低地投與該等治療劑之能力會減弱與向個體投與該等治療劑相關之毒性而不減弱該等治療劑於治療實體腫瘤中之效力。此外，協同效應可導致治療劑於實體腫瘤之管理、治療或緩解中之效力。治療劑之組合之協同效應可避免或減少與任何一種單一治療之使用相關之不利或非所欲副作用。

在共治療中，阿黴素或Doxil及GITR配體(GITRL)或OX40融合蛋白，或阿黴素或Doxil及抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段中任一者之組合可視需要包括於同一醫藥組合物中，或可包括於不同醫藥組合物中。在此後一種情況下，包含阿黴素或Doxil之醫藥組合物適用於在投與包含GITR配體、OX40融合蛋白、抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物之前、同時或之後投與。在某些實例中，該阿黴素或Doxil係與在不同組合物中之GITR配體、OX40融合蛋白、抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段時間上重疊地投與。MEDI4736或其抗原結合片段及曲美木單抗或其抗原結合片段可僅一次或偶爾投與，但仍可向病患提供益處。在其他態樣中，向該病患投與額外之後續劑量。後續劑量可取決於病患之年齡、體重、臨床評定、腫瘤負荷及/或其他因素(包括主治醫師之診斷)而以各種時間間隔投與。

本文提供之方法可減少或減慢腫瘤生長。在一些態樣中，該減少或減慢可係統計學顯著。腫瘤生長之減少可藉由與處於基線之病患腫瘤之生長比較，相對於預期腫瘤生長；相對於基於大病患群體之預期腫瘤生長或相對於對照組群體之腫瘤生長，來量測。在其他實施例中，本發明之方法增加存活。

套組

本發明提供用於增強抗腫瘤活性之套組。在一個實施例中，該套組包括呈單位劑型之含有有效量之阿黴素或Doxil及抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、GITR配體、OX40融合蛋白中之一或多者之治療組合物。

在一些實施例中，該套組包含含有治療組合物之無菌容器；此類容器可係此項技術中已知的盒、安瓶、瓶、小瓶、管、袋、郵袋、泡鼓包裝或其他合適之容器形式。此類容器可由塑膠、玻璃、層壓紙、金屬箔或其他適用於裝納藥劑之材料製成。

若需要，則該套組進一步包含用於投與本發明之治療組合之說明書。在特定實施例中，該等說明書包括以下中之至少一者：治療劑之描述；用於增強抗腫瘤活性之劑量時間表及投與；注意事項；警告資訊；適用症；禁忌症(counter-indication)；過劑量資訊；不良反應；動物藥理學；臨床研究及/或參考文獻。該等說明書可直接印刷於容器(當存在時)上，或作為標籤施覆於容器上，或作為單獨紙張、小冊子、卡片或檔夾提供於容器內或與容器一起提供。

除非另有指示，否則本發明之實務採用熟習技工已知範圍內之分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術。此類技術已充分解釋於以下參考文獻中，諸如「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」，第二版(Sambrook,1989)；「Oligonucleotide Synthesis」(Gait,1984)；「Animal Cell Culture」(Freshney,1987)；「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」(Weir,1996)；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(Miller及Calos,1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubel,1987)；「PCR：The Polymerase Chain Reaction」,(Mullis,1994)；「Current Protocols in Immunology」(Coligan,1991)。此等技術可適用於製造本發明之多核苷酸及多肽，且因此可考慮創作或實施本發明。將於下文部分中詳細討論對特定實施例特別有用之技術。

提出下列實例以便於向一般技術者提供如何製造及使用本發明之分析、篩選及治療方法之完整揭示內容及描述，且非旨在限制本發明者視為其等發明之範圍。

實例

實例1：以Doxil或阿黴素與查核點抑制劑之組合之治療具有協同抗腫瘤活性。

為測試阿黴素或Doxil可加強IMT-C(用於癌症之免疫介導之治療)藥劑之抗腫瘤效應之假設，以變化劑量的此等藥物單獨及與抗小鼠PD-1及抗CTLA-4抗體組合治療攜載CT26腫瘤之Balb/C小鼠。此等小鼠以預防性方式治療並在任何可量測之腫瘤前接受治療。由於此係預防性研究，因此降低抗PD-1及抗CTLA-4抗體之劑量，因為已知此設定中的較高劑量產生強抗腫瘤反應。

在數種研究中使用CT26模型。CT26細胞係鼠類結腸癌細胞。CT26細胞係獲得自ATCC(Manassas,VA)，並以用10%胎牛血清補充之RPMI來生長。接收後，使用基於STR之DNA圖譜及多重PCR(IDEXX Bioresearch,Columbia,MO)重新認證細胞系。細胞生長於單層培養物中，藉由胰蛋白酶消化獲取，並皮下植入6-8週大之雌性Balb/C(CT26)、C57/Bl6(MCA205)或4-6週大之無胸腺雌性裸小鼠(Harlan,Indianapolis,IN)之右脅腹中。就CT26腫瘤模型而言，使用26號針將5 x 10⁵個細胞植入右脅腹中。抗體係獲得自抗PD-1(RMP1-14)、抗PD-L1(10F.9G2)、抗CTLA-4(9D9)及小鼠IgG2b對照組(MPC- 11)。小鼠OX40融合蛋白(OX40 FP)及Rat IgG2a同型對照組抗體係由MedImmune(Gaithersburg,MD)製造。所有抗體及OX40 FP係經由腹膜內注射給藥。Doxil(Bluedoor Pharma,Rockville,MD)及阿黴素(Henry Schein,Melville,NY)係經由靜脈內投與給藥。在一些研究中，同型對照組係以大鼠IgG2a及小鼠IgG2b之混合物(cocktail)形式投與給小鼠。在治療初期，藉由腫瘤體積(既定腫瘤研究)或藉由體重(預防性研究)隨機化小鼠。如基於使用nQuery軟體之樣本尺寸計算值測定，每組中之動物數量在每組10-12隻動物間之範圍內。每週兩次收集腫瘤及體重量測值兩者並使用方程式(L x W²)/2計算腫瘤體積，其中L及W分別係指長度及寬度大小。誤差桿計算為平均值之標準誤差。每日監測小鼠之一般健康情況並根據針對人類治療及實驗室動物護理之AAALAC及MedImmune IACUC指導方針實施所有實驗。使用對數秩測試使用GraphPad Prism進行Kaplan-Meier統計分析。使用對數秩(Mantel-Cox)測試以比較存活曲線(Prism 6.03)。使用Bonferroni方法以針對多種比較調整0.05α水平。記錄之p值係雙側p值。

相較於阿黴素，Doxil在4mg/kg劑量(表1)下具有更有效之抗腫瘤活性。當然，所有經Doxil以其MTD(5mg/kg)治療之小鼠均具有完全反應(CR)。1mg/kg下之小劑量Doxil與4mg/kg下之阿黴素具有接近等效抗腫瘤活性(圖1C及1D)。雖然抗PD-1及抗CTLA-4治療作為單一藥劑具有中度至較低之抗腫瘤活性(圖1E及1F)，但兩者抗體在與阿黴素或Doxil組合時均顯示協同抗腫瘤效應(圖1G-1J)。當抗PD-1與阿黴素(4mg/kg)組合時，完全反應者之數量自2隻增加至8隻動物(圖1G)。同樣地，與抗CTLA-4之組合使完全反應者之數量自2隻增加至9隻動物(圖1I)。當抗PD-1及抗CTLA-4與1mg/kg的Doxil組合時，獲得類似結果(圖1H及1J)。整個研究中每組完全反應者之數量顯示於表1中。

表1：阿黴素或Doxil與PD-1或CTLA-4mAb組合產生較高數量之

此等資料證實阿黴素及Doxil兩者與抗PD-1及抗CTLA-4抗體均具有協同性，並指示此特徵係阿黴素本身固有之特徵，因為脂質體阿黴素之利用與遊離藥物IMT-C具有類似協同作用活性。

研究結束時，相較於經單一藥劑治療之小鼠，證實經抗PD-1抗體及阿黴素(4mg/kg)之組合治療之小鼠之存活增加(圖2A,p=0.005)。同樣地，相較於單獨投與任何單一藥劑，阿黴素(4mg/kg)或Doxil(1mg/kg)與抗CTLA-4之組合顯示經改善之存活(圖2B,p=0.012)。儘管非統計學顯著，但在此研究中，經Doxil(1mg/kg)+抗CTLA-4或抗PD-1抗體治療之小鼠亦趨於比經單一藥劑治療之小鼠具有更長之存活。

實例2：以Doxil單獨或與查核點抑制劑組合之治療導致腫瘤特異性免疫記憶。

為測定經Doxil單獨治療或與抗PD-1或抗CTLA-4組合治療而獲得完全反應之小鼠是否顯示免疫記憶，此等動物在初始治療後70天以活CT26細胞再挑戰。雖然十隻原始未經治療之小鼠中之十隻全部生長CT26細胞(圖3A)，但以Doxil達成完全反應之小鼠顯示10隻排斥腫瘤之小鼠中有9隻廣泛性腫瘤排斥性(圖3B)。10隻經Doxil+抗CTLA-4治療之小鼠中有8隻及9隻經Doxil+抗PD-1治療之小鼠中有9隻排斥腫瘤(圖3C及3D)。此等結果證實以Doxil作為單一藥劑之治療及以Doxil與查核點抑制劑之組合之治療導致腫瘤特異性免疫記憶。

實例3：在免疫活性個體中觀察到Doxil抗腫瘤活性及涉及T細胞。

雖然Doxil及阿黴素兩者於預防性CT26腫瘤模型中皆具有活性，但亦關注此等藥物在控制既定CT26腫瘤中是否有效及此等藥物之活性在功能免疫系統之存在下是否不同。將CT26細胞植入T細胞-缺失無胸腺裸小鼠及免疫活性Balb/C小鼠兩者中及當腫瘤達到約200mm³時，用此等藥物在其等最大可耐受之劑量下進行治療。

在此實驗中，阿黴素不在免疫功能低下或免疫活性之小鼠中誘導抗腫瘤活性(圖4A及4B)。相比之下，Doxil治療在攜載既定CT26腫瘤之免疫活性之小鼠中顯示強健之抗腫瘤活性(圖4B)，但在免疫功能低下之小鼠中顯示較小活性(圖4A)，此證實在功能免疫系統之存在下，Doxil活性增加，及可能取決於T細胞之存在。

為評定其他化學治療劑是否可達成類似結果，向免疫功能低下及免疫活性之攜載CT26腫瘤之小鼠投與奧沙利鉑或吉西他濱。奧沙利鉑顯示相較於免疫功能低下之小鼠(圖4D)，免疫活性之小鼠中之抗腫瘤活性增加(圖4E)，該結果與先前報告之結果一致(Zhao等人，J Biomol Screen 2014；19(5)：817-2)。相比之下，吉西他濱在免疫功能低下中具有顯著抗腫瘤活性(圖4C)。此等結果與先前研究一致，表明某些化學治療係免疫細胞死亡之有效誘導物(Obeid等人，Nat Med 2007；13(1)：54-61)及亦首次揭示此特徵非由活體內吉西他濱所保留。

實例4：當與各種免疫調節劑組合時，Doxil係抗腫瘤活性之推進者。

儘管Doxil與抗PD-1及抗CTLA-4抗體之組合在CT26模型中顯示強抗腫瘤效應(圖1A-1J)，但該實驗之侷限性在於其係預防性研究及使用較低劑量之抗PD-1及抗CTLA-4抗體。為測定在既定腫瘤狀況中Doxil是否保留與IMT-C之協同性，在腫瘤係約200-300mm³時，使用Doxil單獨或與靶向以下之IMT-C藥劑之組合均以最大有效劑量來治療攜載CT26腫瘤之小鼠：CTLA-4(抗CTLA-4(9D9),West Lebanon,NH)、抗PD-1(PD-1(RMP1-14),West Lebanon,NH)、PD-L1(抗PD-L1(10F.9G2),West Lebanon,NH)、OX40(小鼠OX40融合蛋白，MedImmune,Gaithersburg,MD)及GITR(小鼠GITRL配體融合蛋白，MedImmune,Gaithersburg,MD)(圖5A-5L)。先前研究證實較高劑量之此等抗小鼠IMTC藥劑在此等既定腫瘤體積下不導致更大之抗腫瘤效力。

Doxil治療導致對腫瘤生長之暫時控制，接著腫瘤再次快速生長，及僅一種完全反應(圖5B)。使用OX40 FP、抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4抗體之治療證實低至中度之活性(圖5C-5F)，及每組中具有數個完全反應者。Doxil與OX40 FP之組合相較於單一藥劑治療而言增加腫瘤進展之時間，且趨於統計學顯著之協同作用(圖5G)。單獨GITR配體產生更強健之反應且具有6/12完全反應者(圖5G)。相較於任一單一藥劑，Doxil與OX40 FP之組合在活性中產生中度增加(圖5H)。

顯著地，Doxil與抗PD-1、抗PD-L1及抗CTLA-4抗體之組合在完全反應者之數量中產生協同增加，分別具有11/12、9/12及8/12之治癒率(圖5H-5J)。顯著地，Doxil及GITRL FP之組合治癒所有小鼠，具有12/12完全反應(圖5L)。此等實驗證實Doxil與查核點阻斷劑之組合在抗腫瘤反應中產生顯著增加，甚至在既定腫瘤設定中。此亦可體現於Kaplan-Meier存活圖中，該等圖證實相較於任一單一藥劑單獨治療，所有經Doxil加PD-1、PD-L1及CTLA-4抗體之組合治療之小鼠存活更久(圖6A-6E)。

實例5：當與多種免疫調節劑組合時，Doxil係抗腫瘤活性之推進者。

由於CT26對免疫治療高度敏感，因此在敏感性較小之模型(MCA205)中測定Doxil是否可增強免疫治療之活性。在起始於100-150mm³間之腫瘤體積之既定MCA205腫瘤中，Doxil、抗CTLA-4(9D9,West Lebanon,NH)；抗PD-1(RMP1-14,West Lebanon,NH)；抗PD-L1(10F.9G2,West Lebanon,NH)；OX40 FP(小鼠OX40融合蛋白(MedImmune,Gaithersburg,MD)及GITRL FP(小鼠GITR配體融合蛋白，MedImmune,Gaithersburg,MD)係以其等最大有效劑量給藥(圖 7A-7L)。

MCA205細胞係獲得自Agonox(Portland,OR)並生長於以10%胎牛血清補充之RPMI中。接收後，使用基於STR之DNA圖譜及多重PCR(IDEXX Bioresearch,Columbia,MO)重新認證細胞系。MCA205係纖維肉瘤腫瘤細胞。就MCA205腫瘤模型而言，植入2.5 x 10⁵個細胞。所有抗體及OX40 FP係經由腹膜內注射給藥。Doxil(Bluedoor Pharma,Rockville,MD)及阿黴素(Henry Schein,Melville,NY)係經由靜脈內投與給藥。在一些研究中，同型對照組係以大鼠IgG2a及小鼠IgG2b之混合物形式投與給小鼠。在治療初期，藉由腫瘤體積(既定腫瘤研究)或藉由體重(預防性研究)隨機化小鼠。如基於使用nQuery軟體之樣本尺寸計算值測定，每組中之動物數量在每組10-12隻動物間之範圍內。每週兩次收集腫瘤及體重量測值兩者並使用方程式(L x W²)/2計算腫瘤體積，其中L及W分別係指長度及寬度大小。誤差桿計算為平均值之標準誤差。每日監測小鼠之一般健康情況並根據針對人類治療及實驗室動物護理之AAALAC及MedImmune IACUC指導方針實施所有實驗。使用對數秩測試使用GraphPad Prism進行Kaplan-Meier統計分析。使用對數秩(Mantel-Cox)測試以比較存活曲線(Prism 6.03)。使用Bonferroni方法以針對多種比較調整0.05α水平。記錄之p值係雙側p值。

在此模型中，Doxil暫時控制腫瘤生長，但大多數腫瘤再次生長(圖7B)。Doxil組中確有一隻小鼠達成完全反應。在此模型中，OX40 FP、PD-1、GITRL FP及PD-L1抗體係活性最小，其中一些延遲腫瘤進展，但OX40 FP組中僅一個完全反應(圖7C-7G)。使用抗CTLA-4抗體之治療產生8/12隻小鼠達成完全反應之中度反應。就組合治療而言，組合Doxil與OX40 FP促效劑不比Doxil單獨治療延遲更多腫瘤生長，及亦不提供完全反應之顯著增加(圖7H)。

相比之下，Doxil與對查核點抑制劑PD-1、PD-L1及CTLA-4之抗體之組合分別產生9/12、12/12及12/12隻小鼠達成完全反應之顯著反應(圖7I-7K)。此等結果指示在不如單一藥劑對免疫治療敏感之模型中，Doxil增強免疫治療之抗腫瘤效應。在此研究中，相較於Doxil治療，觀察到經Doxil+抗PD-1、抗PD-L1及抗CTLA-4抗體治療之小鼠之存活增加(圖8A-8E)。

實例6：Doxil減少腫瘤Treg，誘導細胞毒性T細胞擴增，並活化腫瘤中之成熟DC。

進行機械研究以闡明Doxil對活體內免疫細胞群體之任何影響。以Doxil、α-PD-L1抗體或組合治療攜載MCA205腫瘤之小鼠並獲得腫瘤及血液。將MCA205細胞(2.5 x 10⁵)植入6-8週大之C57/Bl6雌性小鼠之右脅腹中。當腫瘤達到~250mm³之平均值時，小鼠被隨機分成6組並給藥Doxil(5mg/kg)；OX40 FP(20mg/kg)；α-PD-L1(20mg/kg)或Doxil與OX40 FP或α-PD-L1之組合(第0天)。在第3天給予第二劑量之OX40 FP及α-PD-L1，且在第7天再次給予Doxil。在第8天，對所有小鼠實施安樂死並自小鼠收集組織。以ACK溶液(Life Tech,Carlsbad,CA)溶解紅血球。將腫瘤分割成2mm³片並在37℃下以200units/mL膠原蛋白酶型3(Worthington,Lakewood,NJ)及0.25mg/mL DNase(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)消化20min。在96孔板中每孔裝載一至兩百萬個細胞並在FACS緩衝液(PBS+0.5%FBS及2mm EDTA)中用Live Dead Blue(Life Tech,Carlsbad,CA)染色及以針對以下的抗體染色：CD11b(BD Clone M1/70)、CD11c(Biolegend Clone n418)、CD80(Biolegend Clone 16-10A1)、Ly6G(Biolegend Clone 1A8)、Ly6C(Biolegend HK1.4)、CD45(Ebioscience Clone 30-F11)、MHC-II(Biolegend Clone M5/114.15.2)、CD4(Biolegend Clone RM4-5)、CD8(BD Clone RPA-T8)及FOXP3(Ebioscience Clone FJK-16S)。就FOXP3 偵測而言，使用FOXP3轉錄套組(Ebioscience,San Diego,CA)。在4℃下染色細胞20分鐘，清洗，並以4%多聚甲醛固定。在BD Fortessa(BD,San Jose,CA)上獲取樣本資料。使用Flowjo(Treestar,Ashland,OR)分析資料。

在經Doxil、α-PD-L1抗體或組合治療之攜載MCA205腫瘤之小鼠中，Doxil增加血液中CD8+ T細胞之百分率，及Doxil與P α-D-L1之組合在腫瘤中產生CD8⁺ T細胞之百分率顯著增加(圖9A及9B)。除細胞毒性T細胞外，亦觀察到腫瘤浸潤性Treg之數量因Doxil治療而顯著減少，此似乎藉由Doxil及抗PD-L1之組合進一步加強(圖9C)。

為檢查T細胞變化之原因，研究血液及腫瘤中之骨髓隔室之表現型。在血液及腫瘤中，Doxil及Doxil+抗PD-L1(但非單獨抗PD-L1)誘導共刺激分子CD80於CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi細胞上之表現，CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi表示成熟樹突狀細胞(圖9D及9E)。相較於單獨投與Doxil，CD80表現之水平在組合組中趨於更高。同時，Doxil治療亦增加血液中之CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi細胞之百分率，當與抗PD-L1組合時，其進一步顯著增加(圖9F)。此證實Doxil不僅增加CD80於成熟樹突狀細胞上之水平，亦誘導此等細胞之擴增。有趣地，亦可於腫瘤中之CD45⁺CD11b⁺Ly6c⁺單核細胞MDSC及CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺顆粒細胞MDSC上觀察到CD80之Doxil誘導之上調效應(圖9G及9H)。Doxil及Doxil+抗PD-L1亦增加腫瘤中之CD45⁺CD11b⁺Ly6c⁺細胞之百分率(圖9I)。總而言之，此等結果證實在活體內，Doxil減少腫瘤Treg，誘導細胞毒性T細胞擴增，並活化腫瘤中之成熟DC。此等發現與Doxil已與抗PD-L1組合之強烈抗腫瘤效應一致並可為其提供解釋，及查核點阻斷之其他潛在介體亦如此研究中所觀察。

其他實施例

自前文描述，將明瞭可對本文描述之本發明作出各種改變及修飾以使其適用於各種用途及條件。此類實施例亦係在隨附申請專利範圍之範圍內。

本文之變量之任何定義中之元素清單之列舉包括該變量作為任何單一元素或所列元素之組合(或子組合)之定義。本文之實施例之列舉包括該實施例作為任何單一實施例或與任何其他實施例或其部分之組合。

此說明書中提及之所有專利案及公開案均以引用之方式併入本文中，該引用之程度就如同已特定地及個別地將各個獨立之專利案及公開案以引用之方式併入一般。

<110> 英商梅迪繆思有限公司

<120> 用於治療贅瘤形成的治療組合及方法

<130> IMTC-200TW1

<140>

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<150> 62/154,287

<151> 2015-04-29

<150> 62/078,238

<151> 2014-11-11

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<213> 智人

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<223> 人造序列之描述：合成多核苷酸

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<213> 人造序列

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<223> 人造序列之描述：合成肽

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Claims

一種阿黴素(doxorubicin)或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式及免疫調節劑在製造用於增加個體抗腫瘤活性之藥劑之用途，其中該免疫調節劑係選自由以下組成之群：抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、糖皮質素誘導之TNFR相關基因(GITR)配體及OX40融合蛋白。
一種阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式及免疫調節劑在製造用於增加個體抗腫瘤免疫反應之藥劑之用途，其中該免疫調節劑係選自由以下組成之群：抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、GITR配體及OX40融合。
一種阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式及免疫調節劑在製造用於治療個體腫瘤之藥劑之用途，其中該免疫調節劑係選自由以下組成之群：抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、GITR配體及OX40融合蛋白。
如請求項1至3中任一項之用途，其中該阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式係Doxil®。
如請求項1至3中任一項之用途，其中該抗PD-L1抗體係MEDI4736、BMS-936559或MPDL3280A。
如請求項5之用途，其中該抗PD-L1抗體係MEDI4736。
如請求項1至3中任一項之用途，其中該抗PD-1抗體係LOPD 18、納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、蘭勃利單抗(lambrolizumab)、MK-3475、AMP-224及皮立珠單抗(pidilizumab)。
如請求項7之用途，其中該抗PD-1抗體係LOPD 18。
如請求項1至3中任一項之用途，其中該抗CTLA-4抗體係曲美木單抗(tremelimumab)或易普利姆瑪單抗(ipilimumab)。
如請求項9之用途，其中該抗CTLA-4抗體係曲美木單抗。
如請求項1至3中任一項之用途，其中該免疫調節劑係GITR配體或GITR配體融合蛋白。
如請求項1至3中任一項之用途，其中該免疫調節劑係OX40融合蛋白。
如請求項1至3中任一項之用途，其中該腫瘤係結腸癌或肉瘤。
如請求項1至3中任一項之用途，其中相較於阿黴素、阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、GITR配體及OX40融合蛋白中任一者之單獨投與，該藥劑導致整體存活增加。
如請求項1至3中任一項之用途，其中該藥劑誘導腫瘤特異性免疫反應。
如請求項1至3中任一項之用途，其中阿黴素或Doxil係與抗PD-1抗體組合投與。
如請求項16之用途，其中該抗PD-1抗體係LOPD 18、納武單抗、派姆單抗、蘭勃利單抗、MK-3475、AMP-224或皮立珠單抗。
如請求項1至3中任一項之用途，其中阿黴素或Doxil係與抗PD-L1抗體組合投與。
如請求項18之用途，其中該抗PD-L1抗體係MEDI4736、BMS-936559或MPDL3280A。
如請求項1至3中任一項之用途，其中阿黴素或Doxil係與抗CTLA-4抗體組合投與。
如請求項20之用途，其中該抗CTLA-4抗體係曲美木單抗或易普利姆瑪單抗。
如請求項1至3中任一項之用途，其中阿黴素或Doxil係與GITR配體或GITR配體融合蛋白組合投與。
如請求項1至3中任一項之用途，其中阿黴素或Doxil係與OX40融合蛋白組合投與。
如請求項1至3中任一項之用途，其中阿黴素、阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、GITR配體或OX40融合蛋白之投與係藉由靜脈內輸注。
如請求項1至3中任一項之用途，其中該阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式及該免疫調節劑係同時投與。
如請求項1至3中任一項之用途，其中該阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式係在該免疫調節劑之前投與。
如請求項1至3中任一項之用途，其中該免疫調節劑係在該阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式之前投與。
如請求項1至3中任一項之用途，其中該個體係人類病患。
一種用於增加抗腫瘤活性之套組，該套組包含阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式及選自由以下組成之群之免疫調節劑：抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、GITR配體及OX40促效劑。
如請求項29之套組，其中該套組進一步包含在如請求項1之用途中使用該套組之說明書。
一種醫藥調配物，其包含有效量之阿黴素或阿黴素之經聚乙二醇塗覆之脂質體囊封形式及有效量之選自由以下組成之群之免疫調節劑：抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、GITR配體及OX40促效劑。
如請求項31之醫藥調配物，其中該抗CTLA-4抗體係曲美木單抗或易普利姆瑪單抗。
如請求項31之醫藥調配物，其中該抗PD-1抗體係LOPD 18、納武單抗、派姆單抗、蘭勃利單抗、MK-3475、AMP-224或皮立珠單抗。
如請求項31之醫藥調配物，其中該抗PD-L1抗體係MEDI4736、BMS-936559或MPDL3280A。