TW201522367A - 結合到ｒｓｖ ｇ蛋白之人類抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及結合到RSV的G蛋白並且能夠中和RSV A和B亞型的分離的抗體和抗原結合片段，和其在診斷、預防、和/或治療RSV感染中之用途。
Description
本發明涉及醫學。本發明尤其涉及特異性結合到呼吸道合胞體病毒(RSV)之附著糖蛋白(G蛋白)並且中和RSV之抗體和抗原結合片段。本發明還涉及使用抗RSV抗體之診斷、預防以及治療方法。
人類呼吸道合胞體病毒(RSV)係副粘病毒科(Paramyxoviridae)的一負義單股RNA病毒，該科還包括常見呼吸道病毒，如導致麻疹和腮腺炎之呼吸道病毒。存在兩種原始RSV亞型：亞型A和亞型B。RSV在上呼吸道中複製並且然後蔓延到下氣道，導致細支氣管炎或肺炎。該病毒引起炎症、氣道水腫、粘液產生增加以及呼吸上皮破裂。
估計全世界有6400萬例呼吸道疾病和160,000例死亡可歸因於RSV誘發的疾病。嚴重RSV感染最通常出現在兒童和嬰兒中、尤其早產兒中。潛在健康問題(如慢性肺病或先天性心臟病)可能會顯著增加重病的風險。RSV感染還可能會在年老者、患有慢性肺病的個體以及免疫功能不全的成人(如骨髓移植接受者)中引起重病。
已經研究若干用以預防和治療RSV感染之方法。從供體分離的靜脈注射免疫球蛋白(RSV-IGIV；RespiGam®)和單克隆抗體帕利珠單抗(SYNAGIS®)已經得到批准用於在高風險早產兒中進行RSV預防。然而，用於RSV的疫苗或可商購治療仍不可獲得。僅利巴韋林(一RNA抑制劑)得到批准用於治療RSV感染。為了有效用於治療RSV感染，高劑量、重複給藥和/或大量的抗體產品(如帕利珠單抗)因低有效性而是所需的。
RSV具有兩種主要表面糖蛋白，F和G。F蛋白介導融合，使得病毒進入到細胞的細胞質中並且促進體外合胞體之形成。F蛋白序列在RSV株之中是充分(約90%)保守的(詹森(Johnson)和柯林斯(Collins)，《普通病毒學雜誌》(J Gen Virol),(1988)69：2623-2628)。唯一市售的單克隆抗體帕利珠單抗針對RSV之F蛋白。
RSV的G蛋白係一嚴重糖基化並且充當附著蛋白之表面蛋白。與F蛋白對比，G蛋白在病毒株中除中央保守域(CCD)外相當可變，該中央保守域包含RSV A2株的G蛋白之胺基酸殘基153-184或其他病毒株中的相對應胺基酸殘基。中央保守域和相鄰區(殘基145-193)以剛性和重O-糖基化粘蛋白樣區為邊界。中央保守域的N末端那一半含有一在多於700種病毒株之中保守的社區。C末端那一半含有4個以1-4、2-3佈局連接的保守半胱胺酸並且折疊為一胱胺酸套索。
儘管使用針對G蛋白的抗體進行的被動免疫一般由於在病毒株中缺乏序列保守性而被視為不切實際的，但中和結合到RSV G蛋白的單克隆抗體係已
知的。安德森L.J.(Anderson,L.J.)等人(《病毒學雜誌》(J.Virol.)(1988)62：4232-4238)描述了F和G鼠類單克隆抗體混合物的中和能力，該等抗體之一結合到RSV G蛋白(即131-2G)。這種抗體的抗原位點後來由薩倫德(Sullender)定義(《病毒學》(Virol.)(1995)209：70-79)。發現這種抗體結合代表RSV的主要病毒株的RSV組A和B。另外，WO 2009/055711揭露了與RSV A2的G蛋白內的保守模體具有免疫反應性並且針對RSV A和B亞型具有中和活性之抗體，如3D3和3G12。該等抗體已經顯示識別中央保守域中的線性表位元，但尚未在較佳的動物模型(即棉花大鼠)中進行測試用於評估RSV抗體和疫苗。
鑒於特別是在幼兒和年老者中由RSV引起的呼吸道疾病的嚴重程度，持續需要用以預防和治療RSV感染的有效手段。
本發明提供了特異性結合到RSV G蛋白並且能夠中和RSV之分離的抗體和其抗原結合片段。該等抗體和抗原結合片段較佳的是能夠特異性結合到並且中和亞型A和B的RSV。較佳的是，該等抗體係人類抗體。該等抗體結合到該RSV G蛋白的中央保守未糖基化區(也稱為中央保守域，CCD)中的表位。
該等抗體和抗原結合片段對於該G蛋白具有高親和力並且具有有力的中和能力。該等本發明之抗體和抗原結合片段單獨和與其他診斷、預防和/或治
療劑組合可用作診斷、預防和/或治療劑。
本發明進一步提供了組合物，該等組合物包含一種或多種本發明的抗體和/或其抗原結合片段。本發明還提供了使用該等抗RSV抗體之診斷、預防以及治療方法。預防和治療方法包括將該等抗RSV抗體和/或其抗原結合片段給予人類受試者用於預防或治療一RSV感染和RSV介導的疾病或病狀和/或改善一RSV感染的一種或多種症狀。多種不同抗RSV抗體和/或其抗原結合片段和/或與其他抗RSV抗體之組合可以用於組合療法。還提供了包含該等抗RSV抗體和/或其抗原結合片段與其他預防或治療劑組合之組合物。本發明還提供了編碼該等抗體或其抗原結合片段之核酸分子。
該等本發明之抗體係獨特的，在於至少在一種體外中和分析中，針對RSV A和B型該等抗體比任何已知抗RSV G抗體、特別是比已知抗RSV G單克隆抗體3D3更有力。
該等本發明之抗體結合到該RSV G蛋白上的獨特表位。
在某些實施方式中，該等抗體包含一個在其胺基酸序列中包含一CXXXXC模體之重鏈CDR3。
在某些實施方式中，該等抗體和其抗原結合片段係獨特的，在於它們與抗RSV F抗體疊加和/或協同地起作用。
以下給出如本發明中所用的術語的定義。
如在此所用，術語“包括(included)”或“包括著(including)”被視為後面有措辭“無限制”。
如在此所用，術語“抗體”係指免疫球蛋白分子，包括單克隆抗體，如嵌合、人類化或人類單克隆抗體。術語“抗體”包括本領域中已知的所有免疫球蛋白類別和子類。取決於其重鏈恒定域之胺基酸序列，抗體可以被分成五種主要完整抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，並且該等類別中的數種可以進一步被分成子類(同種型)，例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4。
術語抗原結合片段係指一種免疫球蛋白的包含抗原結合和/或可變域的片段，該等片段與完整免疫球蛋白為特異性結合到免疫球蛋白(即RSV G蛋白)的結合伴侶而競爭。無關於結構，抗原結合片段與由完整免疫球蛋白識別的相同抗原結合。抗原結合片段尤其包括Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(CDR)片段、單股抗體(scFv)、二價單股抗體、(單)域抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、至少含有一免疫球蛋白的足以致使特異性抗原結合到(多)肽的一片段的(多)肽等。一抗原結合片段可以包含包括抗體的胺基酸序列的至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250個連續胺基酸殘基的一胺基酸序列的一種肽或多肽。抗原結合片段可以合成地或藉由使完整免疫球蛋白酶促或化學裂解而產生，或它們可以藉由重組DNA技術而基因工程化。產生方法在本領域中是熟知的並且在例如《抗體：實驗手冊》(Antibodies：A Laboratory Manual)，E.哈洛(E.Harlow)和D萊恩(D,Lane)編(1988)，冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港
(Cold Spring Harbor)，紐約(New York)中進行描述，該文獻藉由引用結合在此。一抗體或其抗原結合片段可以具有一個或多個結合位點。如果存在多於一個結合位點，那麼該等結合位點可以與彼此相同或它們可以是不同的。
如在此所用，術語“單克隆抗體”係指具有單一特異性的抗體分子。一單克隆抗體對於一具體表位呈現一單一結合特異性和親和力。因此，術語“人類單克隆抗體”係指一種呈現單一結合特異性之抗體，該抗體具有衍生自或基於人類生殖系免疫球蛋白序列或衍生自完全合成序列的可變和恒定區。製備單克隆抗體的方法與結合特異性不相關。
如在此所用，術語“功能變體”係指一抗體，該抗體包含與一參考抗體之核苷酸和/或胺基酸序列相比藉由一個或多個核苷酸和/或胺基酸而改變的一核苷酸和/或胺基酸序列並且能夠與參考抗體為特異性結合到結合伴侶(即RSV)而競爭。換句話說，參考抗體的胺基酸和/或核苷酸序列中的修飾不顯著影響或改變由該核苷酸序列編碼或含有該胺基酸序列的抗體的結合特徵，即該抗體仍能夠特異性識別並且結合其標靶。功能變體可以具有保守序列修飾，包括核苷酸和胺基酸取代、添加以及缺失。該等修飾可以藉由本領域中已知的標準技術(如定點誘變和隨機PCR介導的誘變)引入，並且可以包含天然以及非天然核苷酸和胺基酸。
如在此關於本發明的抗體所用，術語“中和”係指能夠藉由中和或抑制其生物效應和/或降低RSV的感染滴度而防止或抑制一細胞受病毒感染之抗體，
無關于實現中和的機制。中和可以例如藉由抑制病毒與細胞表面的附著或粘著或藉由抑制病毒與細胞膜在病毒與標靶細胞附著之後的融合等來實現。
如在此關於一抗體與其結合伴侶(例如一抗原)的相互作用所用，術語“特異性結合”意指相互作用取決於該結合伴侶上一具體結構(例如一抗原決定子或表位)的存在。換句話說，即使當該結合伴侶存在于其他分子或生物體的混合物中時，該抗體也優先結合或識別該結合伴侶。結合可以由共價或非共價相互作用或兩者的組合介導。又換句話說，術語“特異性結合”意指該抗體與一抗原決定子或表位具有特異性免疫反應性並且與其他抗原決定子或表位不具有免疫反應性。(免疫)特異性結合到抗原的一抗體可以按較低親和力結合到其他肽或多肽，如藉由例如放射免疫分析(RIA)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、BIACORE或本領域中已知的其他分析測定。特異性結合到一抗原的抗體或其片段可以與攜帶相同表位的相關抗原具有交叉反應性。較佳的是，特異性結合到一種抗原的抗體或其片段與其他抗原不交叉反應。
在一第一方面，本發明提供了能夠特異性結合到呼吸道合胞體病毒(RSV)的G蛋白並且能夠中和RSV之抗體和抗原結合片段。該等抗體較佳的是能夠特異性結合到並且中和亞型A和B的RSV。較佳的是，該等抗體係人類單克隆抗體。
根據本發明，該等抗體和抗原結合片段結合到RSV G蛋白的中央保守域(CCD)中的表位。該中央保守域跨越包含RSV A2株的G蛋白的胺基酸
153-184(或其他病毒株中相對應的胺基酸殘基)的胺基酸序列。在某些實施方式中，該等抗體和抗原結合片段結合到包括包含胺基酸殘基161-169的胺基酸序列內的一個或多個胺基酸殘基、特別是包含RSV A2株的G蛋白(根據RSV A2株編號)的胺基酸殘基162-168的胺基酸序列內的一個或多個胺基酸的一表位。
因此提供了結合到G蛋白中的位於是胱胺酸套索的N末端的一個位點處的一表位的抗體和抗原結合片段。根據本發明，已經顯示，儘管至少一些本發明之中和抗體如例如先前描述的單克隆抗體3D3(WO 2009/055711)般結合到一類似但不相同的線性表位元，但本發明的抗體具有一更高的中和效能，如一體外中和分析中所測量。根據本發明，已經顯示，本發明的抗體以一獨特方式結合這種線性表位元。因此，根據本發明，已經顯示，該等抗體對於RSV A和B型(根據RSV A2株編號)的161-169表位具有不同側鏈特異性。這例如藉由取代分析(參看實例11)反映，該分析顯示，本發明的抗體的表位與例如3D3相比具有不同必需殘基。
已經顯示，在一體外中和分析、特別是如實例7中所述的體外分析中，針對RSV A和B型本發明的抗體和抗原結合片段比已知抗RSV G抗體中任一者更有力，特別是比已知抗RSV G單克隆抗體3D3更有力。
在某些實施方式中，抗體和抗原結合片段針對RSV株A/A2(ATCC目錄號VR-1540)的IC50(用於50%中和空斑形成的有效稀釋度)低於40ng/ml和/或針對RSV株B/18537(ATCC目錄號VR-1589)的IC50低於30
ng/ml。
在一實施方式中，抗體不是一選自由以下各項組成之群組之抗體：1F12、3G12、1A5、3D3、1G1、2B11、5D8、2D10、3F9、1D4、1G8、6A12、10C6(如WO 2009/055711中所述)。
在某些實施方式中，本發明的抗體或抗體片段與一選自下組的抗體為結合到RSV G蛋白而競爭，該組由以下各項組成：1F12、3G12、1A5、3D3、1G1、2B11、5D8、2D10、3F9、1D4、1G8、6A12以及10C6(如WO 2009/055711中所述)。
在某些實施方式中，該等抗體包含一在其胺基酸序列中包含CXXXXC模體之重鏈CDR3。
在某些實施方式中，該抗體包含一個包含以下各項的重鏈：a)一SEQ ID NO：1之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：2之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：3之重鏈CDR3區，b)一SEQ ID NO：4之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：5之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：6之重鏈CDR3區，c)一SEQ ID NO：7之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：8之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：9之重鏈CDR3區，d)一SEQ ID NO：10之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：11之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：12之重鏈CDR3區，e)一SEQ ID NO：25之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：26之重鏈
CDR2區以及一SEQ ID NO：27之重鏈CDR3區，或f)一SEQ ID NO：31之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：32之重鏈CDR2區以及一個SEQ ID NO：33之重鏈CDR3區。
在某些實施方式中，該抗體包含一包含以下各項之輕鏈：a)一SEQ ID NO：13之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：14之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：15之輕鏈CDR3區，b)一SEQ ID NO：16之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：17之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：18之輕鏈CDR3區，c)一SEQ ID NO：19之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：20之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：21之輕鏈CDR3區，d)一SEQ ID NO：22之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：23之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：24之輕鏈CDR3區，e)一SEQ ID NO：28之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：29之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：30之輕鏈CDR3區，或f)一SEQ ID NO：34之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：35之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：36之輕鏈CDR3區。
在某些實施方式中，該抗體選自由以下各項組成之群組：a)一抗體，包含一SEQ ID NO：1之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：2之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：3之重鏈CDR3區，一SEQ ID NO：13之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：14之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：15之輕
鏈CDR3區；b)一抗體，包含一SEQ ID NO：4之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：5之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：6之重鏈CDR3區，和一SEQ ID NO：16之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：17之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：18之輕鏈CDR3區；c)一抗體，包含一SEQ ID NO：7之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：8之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：9之重鏈CDR3區，一SEQ ID NO：19之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：20之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：21之輕鏈CDR3區；d)一抗體，包含一SEQ ID NO：10之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：11之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：12之重鏈CDR3區，一SEQ ID NO：22之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：23之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：24之輕鏈CDR3區；e)一抗體，包含一SEQ ID NO：25之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：26之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：27之重鏈CDR3區，一SEQ ID NO：28之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：29之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：30之輕鏈CDR3區；以及f)一抗體，包含一SEQ ID NO：31之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：32之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：33之重鏈CDR3區，一SEQ ID NO：34之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：35之輕鏈CDR2區以及一SEO ID NO：36之
輕鏈CDR3區。
在某些實施方式中，該抗體包含一包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列之重鏈可變區、一包含SEQ ID NO：39的胺基酸序列之重鏈可變區、一包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列之重鏈可變區、一包含SEQ ID NO：43的胺基酸序列之重鏈可變區、一包含SEQ ID NO：45的胺基酸序列之重鏈可變區或一包含SEQ ID NO：47的胺基酸序列之重鏈可變區。
在某些實施方式中，該抗體包含一包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列之輕鏈可變區、一包含SEQ ID NO：40的胺基酸序列之輕鏈可變區、一包含SEQ ID NO：42的胺基酸序列之輕鏈可變區、一包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列之輕鏈可變區、一包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列之輕鏈可變區或一包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列之輕鏈可變區。
在某些實施方式中，該抗體選自由以下各項組成之群組：a)一抗體，包含一包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列之重鏈可變區和一包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列之輕鏈可變區；b)一抗體，包含一包含SEQ ID NO：39的胺基酸序列之重鏈可變區和一包含SEQ ID NO：40的胺基酸序列之輕鏈可變區；c)一抗體，包含一包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列之重鏈可變區和一包含SEQ ID NO：42的胺基酸序列之輕鏈可變區；d)一抗體，包含一包含SEQ ID NO：43的胺基酸序列之重鏈可變區和一包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列之輕鏈可變區；
e)一抗體，包含一包含SEQ ID NO：45的胺基酸序列之重鏈可變區和一包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列之輕鏈可變區；以及f)一抗體，包含一包含SEQ ID NO：47的胺基酸序列之重鏈可變區和一包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列之輕鏈可變區。
在某些實施方式中，提供了以上描述的抗體的抗原結合片段。該等抗原結合片段較佳的是結合到相同表位。
本發明之抗體和抗原結合片段結合到與已知抗RSV G蛋白(如例如抗RSV G抗體3D3，還已經展示它結合到RSV G蛋白的中央保守域中的一表位)的表位相比不同的表位。結合到一不同表位意指該抗體與已知抗體(如3D3)相比結合到不同的關鍵胺基酸殘基。此外已經顯示，當在一體外中和分析、特別是如實例7中所述的體外中和分析中測量時，本發明之抗體比已知RSV G蛋白結合抗體中任一者都更有力。
在某些實施方式中，該等抗體當與結合到RVS F蛋白的抗體組合使用時協同地起作用。如在此所用，術語“協同”意指該等抗體或抗原結合片段當組合使用時的組合效應大於其當單獨地使用時的疊加效應。一種計算協同作用的方式係借助於組合指數。組合指數(CI)的概念已經由周(Chou)和塔拉利(Talalay)(《酶調節進展》(Adv Enzyme Regul.),22：27-55,1984)進行了描述。
在某些實施方式中，該等抗體和抗原結合片段用作一藥劑，並且較佳的是用於診斷性、治療性和/或預防性治療由RSV A和/或B亞型引起的RSV感
染。如在此所用，術語“治療(treat)”或“治療(treatment)”係指降低一名已經感染了RSV的受試者之病毒負擔和/或改善這樣的受試者的疾病之症狀。這樣的症狀包括例如細支氣管炎、氣道炎症、肺充血以及呼吸困難。“預防(prevention)”或“預防(prophylaxis)”涵蓋了抑制或減少RSV的擴散或抑制或減少一種或多種與RSV感染相關的症狀的發作、發展或進展。
本發明還涉及包含至少一種本發明之抗體或抗原結合片段的組合物。在某些實施方式中，該等組合物係包含至少一種根據本發明的抗體或抗原結合片段以及至少一種藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。“藥學上可接受的賦形劑”意指與一活性分子(如一抗體)組合用於製備一適宜劑型的任何惰性物質。“藥學上可接受的賦形劑”係一在所用劑量和濃度下對接受者無毒並且與包含藥物、藥劑或抗體的配製物的其他成分相容的賦形劑。藥學上可接受的賦形劑廣泛適用並且在本領域中是已知的。
在又另一個實施方式中，本發明涉及一種本發明抗體或抗原結合片段之用途，用於製備一種用於診斷、預防和/或治療RSV感染的藥劑。本發明還涉及藉由將治療有效量的一種根據本發明之抗體給予對其有需要的受試者來預防或治療RSV感染之方法。術語“治療有效量”係指如在此定義的抗體的有效預防、改善和/或治療一種由RSV感染引起的病狀之量。如在此所用，改善可以是指減少RSV感染的可見或可察覺的疾病症狀、病毒血症或任何其他可測量的表現形式。
為了用於治療，抗體或其片段使用適合賦形劑而調配成藥物組合物並且
根據標準方案而給予。藥物組合物可以包含一種或多種根據本發明之抗體或抗原結合片段。可以存在另外的治療劑，包括一種或多種與RSV的F蛋白具有免疫反應性的抗體或其他針對RSV或炎症有效的治療劑。因此，消炎劑(如類固醇和非類固醇消炎化合物)可以包括於組合物中。
在某些實施方式中，使用完全抗體，即含有含補體的Fc區。
在某些實施方式中，例如為了減少肺中的炎症應答，僅使用抗體的抗原結合片段。給予免疫特異性片段與完整抗體的混合物也包括在本發明範圍內。
治療可以靶向易受RSV感染之患者群組。這樣的患者群組包括(但不限於)例如年老者(例如50歲、60歲並且較佳的是65歲)、年幼者(例如5歲、1歲)、住院的患者、免疫功能不全的患者以及已經用一抗病毒化合物進行治療但已經顯示一不充分抗病毒應答的患者。
本發明之抗體組合物的給予典型地藉由注射、一般肌肉內或靜脈內注射進行。配製物以本領域中一般已知用於給予抗體組合物之方式製備。適合配製物可以見於標準配方，如《雷明頓藥物科學》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，最新版本，馬克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯頓(Easton)，賓夕法尼亞州(PA)，藉由引用結合在此。配製物典型地是適用於不經腸給予的配製物，包括包含緩衝劑、抗氧化劑等的等滲溶液；以及包含遞送媒劑(如脂質體、膠束以及奈米顆粒)之乳液。
所希望的方案和配製物取決於主治醫生的判斷以及受試者的具體病狀。
適當時，劑量水平將取決於受試者年齡、一般健康和感染嚴重程度。
本發明另一個方面包括了如在此定義的抗體之功能變體。如果變體能夠與“母體”或“參考”抗體為特異性結合到RSV或其一片段而競爭，那麼分子被視為一種根據本發明抗體之功能變體。換句話說，當功能變體仍能夠結合到RSV或其一片段的相同或重疊表位時，分子被視為一種根據本發明抗體之功能變體。功能變體包括(但不限於)一級構造序列實質上類似的衍生物，包括在Fc受體或效應功能涉及的其他區中具有修飾的衍生物，和/或含有例如未見於母體抗體中的體外或體內化學和/或生物化學修飾之衍生物。這樣的修飾尤其包括乙醯化、醯化、核苷酸或核苷酸衍生物的共價連接、脂質或脂質衍生物的共價連接、交聯、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解處理、磷酸化等。
可替代地，功能變體可以是如本發明中定義的包含一胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列與母體抗體的胺基酸序列相比含有一種或多種胺基酸的取代、插入、缺失或其組合。此外，功能變體可以包含胺基酸序列在胺基或羧基末端任一者或兩者處的截短。根據本發明之功能變體與母體抗體相比可以具有相同或不同、或者更高或者更低的結合親和力但仍能夠結合到RSV或其一片段。舉例來說，對於RSV或其一片段，根據本發明之功能變體與母體抗體相比可以具有增大或減小的結合親和力。旨在屬於本發明範圍內之功能變體與如在此定義的母體抗體具有至少約50%到約99%、較佳的是至少約60%到約99%、更佳的是至少約70%到約99%、甚至更佳的是至少約80%到約
99%、最佳的是至少約90%到約99%、特別是至少約95%到約99%並且特別是至少約97%到約99%胺基酸序列一致性和/或同源性。熟習該項技術者已知的電腦演算法(尤其如Gap或Bestfit)可以用以最佳地比對待比較的胺基酸序列並且定義類似或相同胺基酸殘基。功能變體可以藉由以本領域中已知的一般分子生物學方法(包括(但不限於)易錯PCR、寡核苷酸定向誘變、定點誘變以及重和/或輕鏈改組)改變母體抗體或其部分而獲得。
本發明還提供了免疫結合物，即包含至少一種抗體、抗原結合片段或功能變體並且進一步包含至少一種標籤(尤其如一可檢測部分/藥劑)之分子。本發明中還涵蓋根據本發明之免疫結合物之混合物或至少一種根據本發明之免疫結合物與另一種分子(如一種治療劑或另一種抗體或免疫結合物)之混合物。在另一個實施方式中，本發明的免疫結合物可以包含多於一種標籤。該等標籤可以與彼此相同或不同並且可以非共價連接/結合到抗體。該或該等標籤也可以藉由共價鍵結而直接連接/結合到人類抗體。可替代地，該或該等標籤可以借助於一種或多種鍵聯化合物而連接/結合到抗體。用於使標籤結合到抗體的技術為熟練的業內人士所熟知。本發明之免疫結合物的標籤可以是治療劑，但它們還可能是可檢測部分/藥劑。適合於治療和/或預防中的標籤可以是毒素或其功能部分、抗生素、酶、增強吞噬作用或免疫刺激的其他抗體。包含一可檢測藥劑的免疫結合物可以用以例如診斷上評估一名受試者是否已經感染RSV，或監測RSV感染的發展或進展作為一臨床測試程式的一部分以例如測定一既定治療方案的功效。然而，它們還可以用於其他檢測和/或
分析和/或診斷目的。可檢測部分/藥劑包括(但不限於)酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、放射性物質、發射正電子的金屬以及非放射性順磁性金屬離子。用以標記抗體用於檢測和/或分析和/或診斷目的的標籤取決於具體檢測/分析/診斷技術和/或所用方法，尤其如(組織)樣品之免疫組織化學染色、流式細胞術檢測、掃描鐳射細胞術檢測、螢光免疫分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、生物分析(例如吞噬作用分析)、蛋白質印跡應用等。用於本領域中已知的檢測/分析/診斷技術和/或方法的適合標記充分為熟練的業內人士力所能及。
此外，本發明之人類抗體或免疫結合物還可以連接到尤其可用於體外免疫分析或純化RSV或其片段的固體載體。本發明之抗體可以融合到標記序列(如一肽)以促進純化。實例包括(但不限於)六聚組胺酸標籤、血球凝集素(HA)標籤、myc標籤或flag標籤。可替代地，一抗體可以結合到一第二抗體以形成一抗體雜結合物。在另一個方面，本發明的抗體可以結合/連接到一種或多種抗原。較佳的是，該等抗原係由一名被給予抗體-抗原結合物的受試者的免疫系統識別的抗原。該等抗原可以是相同的，但也可以與彼此不同。用於連接抗原與抗體的結合方法在本領域中是熟知的並且包括(但不限於)使用交聯劑。
次於藉由直接或經由例如一連接子間接結合以化學方式產生免疫結合物，免疫結合物可以產生為包含本發明的抗體與一適合標籤的融合蛋白。融合蛋白可以藉由本領域中已知的方法而產生，該等方法如例如藉由構造在框
架中包含編碼該等抗體的核苷酸序列與編碼該或該等適合標籤的核苷酸序列的核酸分子並且然後表現該等核酸分子來重組地進行。
本發明此外提供了編碼一種根據本發明之抗體、抗原結合片段或功能變體之核酸分子。這樣的核酸分子可以用作中間物用於克隆目的，例如用於如上文所述的親和力成熟過程中。在一較佳的實施方式中，該等核酸分子經分離或純化。熟練的業內人士應理解，該等核酸分子的功能變體也旨在是本發明的一部分。功能變體係可以使用標準遺傳密碼來直接翻譯以提供一與翻譯自母體核酸分子的胺基酸序列相同的胺基酸序列之核酸序列。較佳的是，該等核酸分子編碼包含如上文所述的CDR區的抗體。在另一個實施方式中，該等核酸分子編碼包含本發明的抗體的兩個、三個、四個、五個或甚至全部六個CDR區的抗體。
本發明另一個方面係提供包含一種或多種根據本發明之核酸分子的載體(即核酸構建體)。載體可以衍生自質粒，尤其如F、R1、RP1、Col、pBR322、TOL、Ti等；粘粒；噬菌體，如λ、λ形、M13、Mu、P1、P22、Qβ、T偶、T奇、T2、T4、T7等；植物病毒。載體可以用於克隆和/或用於表現本發明的抗體並且甚至可以用於基因治療目的。可操作地連接到一種或多種表現調節核酸分子、包含一種或多種根據本發明的核酸分子的載體也由本發明涵蓋。載體選擇取決於所遵循的重組程式和所用的宿主。在宿主細胞中引入載體可以尤其藉由磷酸鈣轉染、病毒感染、DEAE-右旋糖酐介導的轉染、脂染胺轉染或電穿孔來實現。載體可以自主地複製或可以與它們已經被
整合進入的染色體一起複製。較佳的是，該等載體含有一種或多種選擇標記。該等標記之選擇可能取決於所選宿主細胞，但如熟習該項技術者所熟知，這對本發明不是關鍵的。它們包括(但不限於)卡那黴素、新黴素、嘌呤黴素、潮黴素、博萊黴素、來自單純皰疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、來自小鼠的二氫葉酸還原酶基因(dhfr)。可操作地連接到一種或多種編碼可用於分離人類抗體的蛋白或肽的核酸分子、包含一種或多種編碼如上文所述的人類抗體的核酸分子之載體也由本發明涵蓋。該等蛋白或肽包括(但不限於)榖胱甘肽-S-轉移酶、麥芽糖結合蛋白、金屬結合聚組胺酸、綠色螢光蛋白、螢光素酶以及β-半乳糖苷酶。
本發明還提供了含有上文所提及的載體的一個或多個複本的宿主細胞。宿主細胞包括(但不限於)哺乳動物、植物、昆蟲、真菌或細菌來源之細胞。細菌細胞包括(但不限於)來自革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌的細胞，該等細菌如埃希氏桿菌屬(Escherichia)(如大腸桿菌(E.coli))和假單胞菌屬(Pseudomonas)的若干物種。在真菌細胞的群組中，較佳的是使用酵母細胞。酵母中的表現可以藉由使用酵母菌株(尤其如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha))來實現。此外，昆蟲細胞(如來自果蠅的細胞和Sf9)可以用作宿主細胞。除此之外，宿主細胞可以是植物細胞，尤其如來自作物植物(如林業植物)的細胞，或來自供應食物和原料的植物(如榖類植物或藥用植物)的細胞，或來自觀賞植物的細胞，或來自花苞作物之細胞。
轉化的(轉基因)植物或植物細胞藉由已知方法來產生，該等方法例如土壤桿菌屬介導的基因轉移、葉碟片的轉化、藉由聚乙二醇誘發的DNA轉移進行的原生質體轉化、電穿孔、聲處理、顯微注射或彈道基因轉移。另外，一種適合表現系統可以是一杆狀病毒系統。使用哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞、BHK細胞、NSO細胞或Bowes黑色素瘤細胞)的表現系統在本發明中是較佳的。哺乳動物細胞為表現的蛋白提供了最類似于哺乳動物來源的天然分子的翻譯後修飾。因為本發明處理可能必須被給予人類的分子，所以一完全人類表現系統將尤其佳的。因此，甚至更佳的是，宿主細胞係人類細胞。人類細胞的實例尤其是海拉、911、AT1080、A549、293以及HEK293細胞。在較佳的實施方式中，人類生產細胞至少包含編碼一腺病毒E1區的一核酸序列(呈可表現形式)的一功能部分。在甚至更佳的實施方式中，所述宿主細胞衍生自一人類視網膜並且用包含腺病毒E1序列的核酸永生化，如911細胞或1996年2月29日以編號96022940寄存在歐洲細胞培養物保藏中心(European Collection of Cell Cultures,ECACC)，應用微生物研究中心(CAMR)，索爾茲伯里(Salisbury)，威爾特郡SP4 OJG(Wiltshire SP4 OJG)，大不列顛(Great Britain)並且以商標PER.C6®(PER.C6係荷蘭庫賽爾私人公司(Crucell Holland B.V.)的一個注冊商標)市售的細胞系。出於這一應用的目的，“PER.C6細胞”係指以編號96022940寄存的細胞或所寄存細胞的原種、上游或下游代以及來自原種的後代以及前述中任一者的衍生物。在宿主細胞中產生重組蛋白可以根據本領域中熟知的方
法來進行。使用以商標PER.C6®市售的細胞作為用於所關注的蛋白的生產平臺已經在WO 00/63403中進行描述，該文獻的揭露內容藉由引用以其全文結合在此。
本發明的抗體可以藉由不同的方法來製備。一種製造根據本發明抗體之方法係本發明的一個另外的部分。該方法包括以下步驟：a)在有助於該抗體的表現的條件下培養一根據本發明之宿主細胞，和b)可隨意地回收表現的抗體。表現的抗體可以從無細胞抽提液回收，但較佳的是它們從培養基回收。以上製造方法還可以用以製造本發明的抗體之功能變體和/或免疫結合物。用以從無細胞抽提液或培養基回收蛋白(如抗體)的方法為本領域中熟練的業內人士所熟知。
可替代地，次於在宿主(如宿主細胞)中表現，本發明之抗體和免疫結合物可以藉由常規肽合成器或在無細胞翻譯系統中使用衍生自根據本發明之DNA分子的RNA核酸合成地製造。根據本發明之抗體還可以由表現人類免疫球蛋白基因的轉基因非人類哺乳動物(如例如轉基因小鼠或兔)產生。較佳的是，轉基因非人類哺乳動物具有一基因組，包含一人類重鏈轉基因和一人類輕鏈轉基因，編碼如上文所述的人類抗體的全部或一部分。轉基因非人類哺乳動物可以用RSV或其一片段的一純化或富集之製劑免疫。用於使非人類哺乳動物免疫的方案在本領域中是明確的。參看《使用抗體：實驗手冊》(Using Antibodies：A Laboratory Manual),E.哈洛，D萊恩編(1998)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約和《現行免疫學方案》(Current Protocols in
Immunology),J.E.科利根(J.E.Coligan),A.M.克魯斯貝克(A.M.Kruisbeek),D.H.馬古利斯(D.H.Margulies),E.M.席瓦赫(E.M.Shevach),W.斯特勞伯(W.Strober)編(2001)，約翰威利父子公司(John Wiley & Sons Inc.)，紐約，該等文獻的揭露內容藉由引用結合在此。免疫方案通常包括或者有或者無佐劑(如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑)情況下的多次免疫，但還可以包括裸DNA免疫。在其他實施方式中，人類抗體由衍生自轉基因動物的B細胞、漿細胞和/或記憶細胞產生。在又另一個實施方式中，人類抗體由融合瘤產生，該等融合瘤藉由將獲自上文所述的轉基因非人類哺乳動物的B細胞與永生化之細胞融合而製備。如可獲自上文所述的轉基因非人類哺乳動物的B細胞、漿細胞和融合瘤以及如可獲自上文所述的轉基因非人類哺乳動物的人類抗體、B細胞、漿細胞和/或記憶細胞和融合瘤也是本發明的一部分。
本發明進一步提供了試劑盒，包含至少一種根據本發明之抗體、一抗原結合片段、一免疫結合物、一功能變體和/或至少一種核酸。可隨意地，本發明之試劑盒的上文所述的組分被包裝在適合容器中並且被標記用於診斷、預防和/或治療指定的病狀。以上提及的組分可以按一水性、較佳的是無菌溶液形式或按一用於復原之凍幹、較佳的是無菌配製物形式儲存在單位或多劑量容器中。試劑盒可以進一步包含更多包含一種藥學上可接受的緩衝劑的容器。它可以進一步包括從一種商業和用戶立場出發令人希望的其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器、用於一種或多種適合宿主的
培養基以及可能地甚至至少一種其他治療劑、預防劑或診斷劑。與試劑盒相關的說明書習慣上可以包括在治療、預防或診斷產品的商業包裝中，該等商業包裝含有關於例如適應症、用法、劑量、製造、給藥、禁忌症的資訊和/或關於這樣的治療、預防或診斷產品的用途的警告。
根據本發明的抗體還可以有利地用作一種用於檢測RSV的體外方法中的一診斷劑。本發明因此進一步提供了一種檢測樣品中的RSV之方法，其中該方法包括以下步驟：(a)例如藉由使一樣品與診斷有效量的一根據本發明之抗體(或其片段)或免疫結合物接觸來分析樣品中RSV抗原之水平，和(b)將RSV抗原的分析水平與一對照水平比較，由此RSV抗原的該分析水平與該對照水平相比的增加指示RSV感染。該樣品可以是一生物樣品，包括(但不限於)來自(可能地)被感染的受試者的血液、血清、大便、痰、鼻咽吸出物、支氣管灌洗液、尿液、組織或其他生物物質；或一非生物樣品，如水、飲料等。該樣品可以首先被操縱以使得其更適用於檢測方法。操縱尤其意指以一種使得病毒將分解為抗原成分(如蛋白、(多)肽或其他抗原片段)之方式處理疑似含有和/或含有病毒的樣品。較佳的是，本發明之抗體或免疫結合物在使得可在抗體與可能存在於樣品中的病毒或其抗原成分之間形成一免疫複合物的條件下與樣品接觸。指示樣品中的病毒存在的一免疫複合物的形成(若有的話)然後藉由適合方法來檢測和測量。這樣的方法尤其包括均質和異質結合免疫分析，如放射免疫分析(RIA)、ELISA、免疫螢光、免疫組織化學、FACS、BIACORE以及蛋白質印跡分析。尤其用於大規模臨床篩檢患
者血清和血液和血液衍生的產物的較佳的分析技術係ELISA和蛋白質印跡技術。ELISA測試係尤其佳的。
圖1示出了針對RSV Ga和RSV Gb蛋白之結合特徵曲線。在ELISA分
析中測試IgG結合到重組RSV Ga和Gb蛋白的胞外域之能力。開口圈(虛線)表示結合到Ga(RSV A/長)並且閉口圈(實線)表示結合到Gb(RSV B/B1)。
圖2示出了針對RSV-A和RSV-B株之中和特徵曲線。在中和分析中測試IgG中和RSV-A和RSV-B株之能力。開口圈(虛線)表示中和RSV-A(RSV A/A2)並且閉口圈(實線)表示中和RSV-B(RSV B/18537)。
圖3示出了RSV G特異性單克隆抗體與RSV G肽之結合(ELISA)。跨越中央保守域的短和長RSV G肽(表15)在一ELISA中用於結合實驗，其中RSV G特異性mAb之濃度不同：CB003.1(閉口黑色圈，實線)、CB010.7(開口黑色圈，虛線)，或無單克隆抗體(閉口淺灰色圈)。
圖4：藉由PepScan進行的最小表位定位。RSV G蛋白特異性抗體與中央區(RSV-G A型和B型的殘基145-201)的所有完全重疊5聚體(mer)、8聚體、10聚體、14聚體、18聚體、25聚體以及32聚體肽的結合活性。與一肽的結合活性以與PepScan ELISA信號成比例的垂直線形式示出。
圖5：藉由PepScan進行的CB003.1和CB010.7表位之完全取代分析。單克隆抗體CB003.1和CB010.7對應地在100ng/mL和30ng/mL下與一肽的結合活性以與Pepscan ELISA信號成比例的垂直線形式示出。具有20條線的每一組對應於針對初始14聚體肽(FHFEVFNFVPCSIC)中的每個胺基酸位置設定的完全置換。在每一組的20條線內，取代係基於單字母胺基酸代碼按字母順序的(ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY)並且初始14聚體肽的反應性
以灰色條形式示出。
圖6：RSV G蛋白中央區的丙胺酸掃描(PepScan)。對應於A型(左圖)和B型(右圖)的RSV-G中央域的殘基161-192的肽的所有位置處的丙胺酸取代。A型的位置180處的丙胺酸被甘胺酸取代。初始肽的反應性以灰色條形式示出。
圖7示出了單克隆抗體與RSV G蛋白中央區的天然存在的變體之結合。mAb CB003.1和CB010.7與對應於可用的A型(上圖)和B型(下圖)變體的不同肽之結合。野生型肽的反應性以灰色條形式示出。
圖8示出了抗RSV G mAb在激發後第4天在棉花大鼠RSV-A/長模型中關於肺和鼻甲病毒負荷之預防功效。
圖9示出了抗RSV G mAb在激發後第4天在棉花大鼠RSV-A/長模型中關於肺和鼻甲病毒負荷之治療功效。
圖10示出了在激發後第6天抗RSV G mAb在棉花大鼠RSV-A/長模型中關於組織病理學分數之治療功效。
在以下不旨在限制本發明的實例中進一步展示本發明。
不同於病毒膜表面上表現的融合蛋白(RSV F)，附著蛋白(RSV G)高度可變，因此定義RSV的兩種廣泛亞型(即亞型A和B)。儘管具有序列可變性，但RSV G含有一中央的並且高度保守的區。為試圖獲得廣泛中和單克隆抗體，將對應於一代表性A子組(RSV A/長)和B子組株(RSV B/B1)的RSV G重組地表現于293自由式細胞中，純化，並且標記以用於單細胞分選實驗中。
使對應於在此稱為RSV Ga和Gb的RSV A/長(寄存編號P20895)和RSV B/B1(寄存編號NP_056862)的重組RSV附著蛋白(G蛋白)由具有一Myc(EQKLISEEDL)和6X組胺酸標籤的一基於CMV的啟動子哺乳動物表現載體(英傑公司(Invitrogen Corp.),pcDNA 3.1)表現(表1)。將對應於人類VκI信號肽的前導序列引入到胺基末端處以促進分泌。RSV Ga和Gb
都缺乏跨膜域地表現並且對應地包括RSV Ga和Gb的胺基酸65-288和65-299。
將RSV Ga和Gb根據製造商指南轉染。將重組地表現的RSV Ga和Gb蛋白使用鎳NTA層析法來純化。在轉染後七十二小時，將上清液收集並且針對20mM Tris-HCL pH 8和300mM NaCl透析過夜。第二天，將透析用新鮮緩衝液重複並且持續另外的6小時。然後將透析的上清液補充以5%甘油和10mM咪唑(VWR，目錄號EM-5720)，並且載入到e填充有2mL Ni-NTA瓊脂糖珠粒(凱傑(Qiagen)，目錄號30310)的柱上。接著將結合蛋白用2柱體積的由以下各項組成的洗滌緩衝液洗滌：20mM Tris-HCl,pH 8、300mM NaCl、5%甘油以及20mM咪唑。然後將蛋白用5mL含有以下各項的洗脫緩衝液洗脫：20mM Tris-HCl,pH 8、300mM NaCl、5%甘油以及50mM咪唑。最終，將洗脫液在4℃下針對四升磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)透析過夜。然後將透析的蛋白在一個30K MWCO濃縮器(密理博(Millipore),Amicon Ultracel濃縮器)中濃縮到0.5-1.0mL，並且藉由二辛可寧酸分析(BCA分析；賽默飛世爾(Thermo Fisher)，根據製造商說明書)來定量。另外，將純化的蛋白各自藉由SDS-PAGE/庫馬斯(Coomassie)來進行品質控制。
將RSV Ga根據製造商說明書使用Alexa Fluor 647微尺度蛋白標記試劑盒(英傑目錄號A30009)用Alexa Fluor 647(AF 647)螢光標記。在純化之後，使用一NanoDrop UV分光光度計(製造商)將標記程度測定為1.2莫耳
AF 647/莫耳蛋白。類似地，將RSV Gb蛋白根據製造商說明書使用一微尺度蛋白標記試劑盒(英傑目錄號A30006)用Alexa Fluor 488(AF 488)標記，並且在最終純化之後，使用一NanoDrop分光光度計將標記程度測定為約2莫耳AF 488/莫耳蛋白。
將針對RSV G蛋白的廣泛中和單克隆抗體從分離自藉由聖地牙哥血庫(San Diego Blood Bank)獲得的外周血液單核細胞(PBMC)的記憶B細胞(CD19+CD27+IgG+)回收。簡單地說，將CD22+富集的B細胞用螢光標記的抗體染色為記憶B細胞表面標記，並且與RSV Ga、Gb(如實例1中所
述，對應地用Alexa Fluor 647和488標記)或RSV G中央保守域(CCD)生物素結合的肽(SYM-1706)一起培養。CD19/CD27/IgG/RSVGa/RSVGb或CD19/CD27/IgG/SYM-1706(用於某些分選實驗中)。將陽性細胞分選，並且將單細胞使用一個FACSAria II(BD生物科學(BD Biosciences))或MoFlo XDP(貝克曼庫爾特(Beckman Coulter))放置到一個96孔板的單獨的孔中。將板儲存在-80℃下直到處理。平均每一供體研究約10-25×106個B細胞。
如實例2中所述，將針對RSV的廣泛中和單克隆抗體從與RSV Ga和Gb蛋白或RSV G中央保守域(CCD)生物素結合的肽(SYM-1706)具反應性的記憶B細胞(CD19+CD27+IgG+)分離。然後將重和輕鏈基因藉由一種兩步PCR方法從單獨的B細胞回收，克隆，並且以Fab抗體形式體外表現。
使用英傑的Superscript III第一鏈合成試劑盒(Superscript III試劑盒，目錄號18080-051)從單獨分選的細胞產生互補DNA(cDNA)。
使用一種兩步巢式PCR方法使IgG重和輕鏈可變區(κ和λ鏈)從新鮮製備的cDNA擴增。接著，將重和輕鏈PCR片段彙集到一個單盒中以促進使用一種重疊延伸PCR的下游克隆。
在步驟I中，將2.5μL如上所述產生的新鮮製備的cDNA用作模板以擴增重、κ以及λ輕鏈。使用針對抗體重鏈(CB-5'LVH引物)、κ輕鏈(CB-5'LVk引物)以及λ輕鏈(CB-5' LVlam引物)的前導區具體設計的引物池(表2-4)。將針對對應地重鏈、κ輕鏈以及λ輕鏈的CH1區、Ck以及CL區具體設計的單反向引物用於步驟I PCR反應中。
1)在步驟II中，將2.5μL由以上反應產生的步驟I PCR產物用作一種模板以擴增重、κ以及λ輕鏈。使用針對抗體重鏈、κ輕鏈以及λ輕鏈的構架1區具體設計的正向引物池(表5-7)。使用針對重鏈切接點(3'SalIJH引物)、κ輕鏈切接點(3'Jk引物)以及對應於λ輕鏈的5'區特異性引物(CB-
VL引物)具體設計的反向引物池。此外，將步驟II正向引物工程化以引入一SfiI限制位元點，而將步驟II重鏈反向引物設計以引入一SalI限制位點
在步驟III中，使重和輕鏈DNA片段(步驟II產物)經由重疊延伸PCR使用以下各項連接到一單盒中：1)如下文概述而擴增的Fab連接子(κ或λ；表8)，該連接子退火到輕鏈步驟II的3’端和重鏈步驟II片段的5’端並且含有或者κ或者λ恒定區，2)一種具有一SfiI限制位點的正向重疊引物，該引物退火到輕鏈的5’端，以及3)一種具有一SalI限制位點的反向引物，該引物退火到重鏈步驟II片段的3’端(表9)。這個反應產生一由輕鏈-連接子-重鏈組成的1200bp片段(即盒)。在擴增之後，將PCR連接子反應產物或重疊延伸PCR反應產物在一種1%瓊脂糖凝膠上分離並且根據製造商說明書凝膠提取(凱傑凝膠提取試劑盒；目錄號28706)。
在PCR純化(凱傑)重疊延伸PCR之後，將片段消化，並且然後將消化的重疊產物在一種1%瓊脂糖凝膠上分離。將對應於重疊盒的頻帶(約1.1kb)藉由凝膠提取來純化(凱傑)。最終，將消化的重疊延伸產物連接並且克隆到pCB-Fab細菌表現載體中。所有轉化都使用DH5a最大效率細胞(英傑公司，目錄號18258-012)進行。將約100μl回收的細胞塗布到一補充以20mM葡萄糖的100μg/ml卡比西林板上。將板在37℃下培養過夜以允許集落生長。
將實例3中克隆的Fab抗體表現於細菌中，並且再次測試其結合到RSV Ga、RSV Gb或RSV G中央保守域(CCD)肽(SYM-1706：胺基酸序列：生物素-KQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKR；SEQ ID NO：125)的能力。
將細菌上清液添加到RSV Ga、Gb、CCD肽、陰性對照肌動蛋白以及抗人類F(ab)2塗布的板中，並且在37℃下培養2小時(除CCD肽外，它在一抗生蛋白鏈菌素塗布的板上進行培養並且在室溫下培養2小時)。將CR9514(一抗體，基於3D3，即包含3D3的重和輕鏈可變區，如WO 2009/055711中揭露)以0.1μg/mL的稀釋度在0.4% NFDM/PBS/0.05% Tween 20中用作針對RSV Ga、Gb、CCD肽以及抗人類F(ab)2塗布的板的陽性對照。將小鼠抗肌
動蛋白(西格瑪(Sigma)，目錄號A3853)以1.25μg/mL用作牛肌動蛋白塗布的板的陽性對照。將抗HA HRP(羅氏(Roche)，目錄號12013819001)用作細菌上清液的二級抗體。將抗人類Fab(傑克遜實驗室(Jackson Labs)，目錄號109-036-097)用於CR9514(包含3D3的可變區)對照孔。最終，將山羊抗小鼠HRP(傑克遜實驗室，目錄號115-035-072)用於肌動蛋白陽性對照。在培養之後，將板在PBS/0.05% Tween 20中洗滌四次，並且用50μL 1：1 v/v TMB：過氧化物溶液(Pierce，目錄號34021)顯影約5分鐘。藉由添加50μL 2N H2SO4使反應立即停止，並且使用一ELISA板讀取器測量450nm下的吸光度。陽性結合由大於0.5的OD450(0.5-0.9係適度結合，>1係強結合)和高於背景3倍的應答指示。
基於ELISA結果，平均選擇約六種與標靶抗原具有反應性的無性系。因為最初使用構架1特異性和切接點特異性引物池克隆每種Fab抗體，所以尤其高度相關引物的交叉啟動的可能性較高。由於這個原因，選擇若干代表每種重疊的產物的細菌無性系以測序。根據製造商準則(凱傑小量製備試劑盒目錄號27106)製備質粒小量製備DNA。將對應於每種所選無性系的重和輕鏈用表10中突顯的引物進行測序。對序列進行分析，鑒別最接近生殖系，並且測定CDR和構架區。接著將這個資訊用以設計引物以將候選抗體克隆並且轉化為IgG。
將實例4中概述的細菌ELISA中鑒別的與RSV Ga、Gb以及CCD肽具有反應性的Fab抗體克隆並且在人類胚腎細胞(293-F細胞)中表現為IgG。接著將IgG藉由測定濃度、SDS-PAGE以及藉由尺寸排阻層析法來純化並且品質控制。
接著將細菌ELISA(實例4中概述)中鑒別的Fab抗體藉由以下方式轉化為IgG：藉由限制消化到pCP9-κ(SEQ ID NO：127)和pCP9-λ(SEQ ID NO：128)表現載體中來克隆可變重和輕域(κ和λ)。考慮到交叉啟動的可能性(實例4中前述)，經選擇用於轉化為IgG的每種細菌無性系的FR1的初始胺基酸與切接點區的最終胺基酸經常與其相對應的生殖系序列的胺基酸不同。由於這個原因，設計對每種抗體具有特異性的引物以針對每種所選細菌無性系的重和輕鏈基因恢復FR1和切接點區。將重和輕鏈使用相對應的細菌無性系(由實例4中的pCB-Fab載體表現)擴增並且以一連續方式克隆到pCP9表現載體中。
重鏈的擴增產生一平均大小係370bp的片段，將該片段在一種1%瓊脂糖凝膠上拆分並且根據製造商說明書(凱傑)凝膠提取。然後藉由重疊延伸PCR將重鏈片段用以連接HAVT20前導序列(5'-
ATGGCCTGCCCTGGCTTTCTCTGGGCACTTGTGATCTCCACCTGTCTTGAATTTTCCATGGCT-3'；MACPGFLWALVISTCLEFSMA)。接著將相對應的重疊HAVT20-重鏈產物根據製造商說明書(凱傑)進行PCR純化。連接係連續進行的；就是說，或者輕鏈首先被消化並且連接或者相對應的重鏈被消化並且插入。在或者輕或者重鏈插入被測序證實後，選擇一種代表性細菌無性系，製備小量製備物並且將其用以克隆第二鏈(即或者輕或者重鏈，取決於首先克隆的鏈)。為了克隆重鏈片段，將pCP9載體和PCR純化的重鏈重疊產物用限制酶BamHI HF(NEB，目錄號R3136L)和XhoI(NEB，目錄號R0146L)消化。然後將消化的pCP9載體和重鏈重疊產物在一種1%瓊脂糖凝膠上拆分並且凝膠提取(對於pCP9載體，較高的約9.5kB)。以1：3載體與插入物比進行連接，並且轉化為DH5a最大效率細胞(英傑公司，目錄號18258-012)。在測序證實後，克隆第二鏈(例如輕鏈)。為了克隆輕鏈片段，將含有相對應的重鏈的pCP9無性系和輕鏈PCR產物用NotI HF(NEB，目錄號R3189L)和XbaI(NEB，目錄號R0145L)消化。然後將輕鏈連接到含有相對應的重鏈基因的pCP9載體中並且轉化為DH5a最大效率細胞。選擇若干集落用於測序和分析。表11和12示出了抗體重和輕鏈CDR區的序列。
為了表現每種IgG，製備(凱傑)含有所關注的重和輕鏈基因的pCP9載體的中量製備物，並且根據製造商說明書使用293fectin(英傑，目錄號51-0031)將其用以轉染293-F細胞。在轉染之後，將細胞培養72小時以允許充足IgG產生。然後將細胞培養基收集並且離心以移出細胞。藉由使用一個蛋
白A柱(蛋白A瓊脂糖珠粒；安瑪西亞(Amersham)，目錄號17-0963-03)進行柱層析法來實現純化。然後將洗脫液針對4升20mM Tris-HCl pH 7.2、150mM NaCl透析兩次。最終，將透析的樣品用一10kDa Amicon Ultra柱(密理博)濃縮降到約1mL。
對每種IgG進行一系列品質控制步驟以測定濃度和純度並且評估大小。最初經由NanoDrop讀數使用210,000 M-1 cm-1的IgG莫耳消光係數測定IgG濃度。另外，藉由根據供應商說明書進行BCA分析(賽默飛世爾)和藉由使用蛋白A感測器端在Octet Red 384(福特生物(ForteBio))上測量來證實IgG濃度。作為一個另外的品質控制步驟，在非還原和還原條件(即±DTT)下進行SDS-PAGE，接著進行生物安全庫馬斯染色(伯樂(Biorad))，以使完整IgG或減小的重和輕多肽鏈可見。最終，藉由尺寸排阻層析法用一個Superdex 200 10/300 GL凝膠過濾柱(法瑪西亞(Pharmacia))對IgG進行品質控制。
在ELISA分析中測試如以上實例5中所述而產生並且進行品質控制的IgG和抗RSV G抗體CR9514(包含3D3的可變區)結合到重組RSV Ga和Gb蛋白的能力。簡單地說，將96半孔ELISA板(Costar)用1X PBS中的50μL抗原塗布過夜[RSV Ga：0.5μg/mL；RSV Gb：0.5μg/mL；牛肌動蛋白：1μg/mL(西格瑪)；親和純化山羊抗人類F(ab)2：2μg/mL(傑克遜免疫研究
(Jackson Immunoresearch))]。將板在4℃下培養過夜，並且在第二天用135μL於PBS中的4%脫脂奶粉(NFDM，伯樂)阻斷，並且在37℃下培養2小時。然後將mAb在0.4% NFDM/PBS/0.05% Tween 20中稀釋，起始於100ng/mL，並且以5倍稀釋度滴定下降，並且添加到板中後在37℃下持續2小時。將CR9514(3D3)mAb用作針對RSV Ga和Gb的陽性對照，並且以類似方式滴定。另外，將小鼠抗肌動蛋白(西格瑪，目錄號A3853)以1.25μg/mL用作牛肌動蛋白塗布的板的陽性對照。在培養之後，將板用PBS/0.05% Tween 20洗滌四次。將二級抗體各自以1：1000於0.4% NFDM/PBS/0.05% Tween 20中添加，並且在37℃下培養40分鐘。將抗Fc HRP(傑克遜實驗室，目錄號109-035-008)用作mAb的二級抗體。最終，將山羊抗小鼠HRP(傑克遜實驗室，目錄號115-035-072)用於肌動蛋白陽性對照。在培養之後，將板在PBS/0.05% Tween 20中洗滌四次，並且用50μL 1：1 v/v TMB：過氧化物溶液(Pierce，目錄號34021)顯影約5分鐘。藉由添加50μL 2N H2SO4使反應立即停止，並且使用一台ELISA板讀取器測量450nm下的吸光度。根據本發明的抗體的估計的結合EC50值(藉由滴定每種IgG而測定)對於RSV株A/長來說在1.0與2.0ng/ml之間的範圍內並且對於株B/B1來說在0.5與2.5ng/ml之間的範圍內。
如藉由一種空斑減少分析來評估，分析抗RSV抗體結合到並且中和溶液
中的RSV的能力。在這個實驗中，將病毒和抗體在不存在標靶細胞的情況下預培養。然後將混合物添加到細胞中，並且藉由一種在此描述的標準空斑減少分析來測量病毒感染。分析抗RSV抗體中和若干RSV株的能力，該等病毒株包括RSV A/A2(ATCC目錄號VR-1540)、RSV B/18537(ATCC目錄號VR-1580)以及RSV A/長(ATCC目錄號VR-26)。將抗體CR9514(3D3)和CR9505(一種抗體，基於131-2G，即包含131-2G的重和輕鏈可變區，如WO 2009/055711中揭露)用作參考。
將Vero細胞(ATCC，目錄號：CCL-81；馬納薩斯(Manassas))用於宿主細胞感染。使Vero細胞在具有10%胎牛血清(FBS)(海克隆(HyClone)，目錄號：SH30070.03)、補充以1% L-榖胺醯胺(海克隆，目錄號：SH30034.01)和1%青黴素-鏈黴素溶液(海克隆，目錄號：SV30010)的DMEM(海克隆，目錄號：SH 30285.01)中生長。將Vero細胞維持在一個具有5% CO2的37℃培養箱中，並且每週兩次進行傳代。
在實驗第1天，將Vero細胞在24孔細胞培養板中培養。將細胞以使得到第2天可形成細胞單層(>80%匯合)的密度(約9×104個細胞/孔)塗布。在第2天，將每種抗體在含有10%幼兔補體(AbD賽洛特克(AbD Serotec)，目錄號C12CAX)的普通伊格爾最低必需培養基(EMEM,ATCC，目錄號：30-2003)中連續稀釋。所測試的最終抗體濃度係：10μg/mL、1.3μg/mL、156ng/mL、19.5ng/mL、2.4ng/mL以及0.3ng/mL(例外是CB010.7，它使用抗體濃度：2.5μg/mL、312.5ng/mL、39.1ng/mL、4.9
ng/mL、0.61ng/mL以及0.08ng/mL)。還將病毒在普通EMEM中稀釋到2000-3000pfu/mL(100-150pfu/50μL)的濃度，並且添加85μL稀釋的RSV到85μL每種稀釋的抗體溶液中並且藉由吸取來混合。對於病毒對照樣品來說，添加85μL稀釋的病毒到85μL普通EMEM中。將抗體-病毒或病毒對照混合物在37℃下培養2小時。在培養之後，將培養基從含有Vero宿主細胞的24孔細胞培養板傾析，並且然後將150μL預培養的病毒-抗體或病毒-對照混合物轉移到每個孔中。一式三份地製備每種測試和對照樣品。然後將細胞在37℃下在每隔15分鐘混合下培養一小時。
在培養期之後，添加1mL覆蓋培養基到每個孔中(覆蓋培養基含有EMEM、2% FBS、1% L-榖胺醯胺、0.75%甲基纖維素)。然後將24孔細胞培養板在37℃下(在5% CO2下)培養約96-120小時。將細胞板在室溫下用10%福馬林固定1小時，用ddH2O洗滌10次，並且在37℃下用PBS中的5%脫脂乳粉(NFDM)阻斷一小時。在培養之後，傾析阻斷溶液，並且添加200μL HRP結合的小鼠抗RSV抗體(ab20686，艾碧康(Abcam)，在1% NFDM中1：750稀釋)到每個孔中。將板在37℃下培養2小時，並且用ddH2O洗滌10次。在洗滌之後，添加200μL TrueBlue®過氧化物酶底物(KPL目錄號50-78-02)到每個孔中。將板在室溫下顯影10分鐘。將板用ddH2O洗滌兩次，並且在一個紙巾上乾燥，並且對藍色空斑數目進行計數。
使用SPSS for Windows計算IC50(用於50%中和空斑形成的有效稀釋度)。根據下式計算空斑減少率：
空斑減少率(百分位數)=1-[(每種抗體稀釋度下的平均空斑數目)/(病毒對照孔中的平均空斑數目)]*100。
表13列出了一組抗體針對RSV株A/A2(ATCC目錄號VR-1540)和RSV B/18537(ATCC目錄號VR-1580)的IC50。
表13顯示，抗體和抗原結合片段針對RSV株A/A2(ATCC目錄號VR-1540)的IC50(用於50%中和空斑形成的有效稀釋度)低於40ng/ml和/或針對RSV株B/18537(ATCC目錄號VR-1589)的IC50低於30ng/ml。
另外，抗體CB003.1、CB010.7以及對照抗體CR9505(131-2G)和CR9514(3D3)針對RSV株A/長(ATCC目錄號VR-26)的IC50對應地是16、12、18以及17ng/mL。
檢查以上實例5中分離的每種抗體無性系的重和輕鏈可變區(VH和VL)中游離半胱胺酸和可能的翻譯後修飾位點(包括糖基化、脫醯胺以及氧化位點)的存在。為了移除該等位元點，使用由結構保守和/或基於生殖系的取代組成的胺基酸突變(表14)。可變區中的非保守半胱胺酸突變為絲胺酸。對於糖基化位點來說，可以使用若干突變，包括用天冬醯胺置換保守榖胺醯胺或生殖系突變。對脫醯胺位點的修飾包括用天冬胺酸置換天冬醯胺以及用絲胺酸或丙胺酸置換甘胺酸。不對可能的氧化位點進行修飾。然後將獲自抗體無性系的每個VH和VL的核苷酸和胺基酸序列在基因技術/英傑進行密碼子最佳化以便在人類細胞中表現。接著將該等功能變體的可變區藉由限制消化而直接克隆，以便在IgG表現載體pCP9-κ(參看SEQ ID：127)和pCP9-γ(參看SEQ ID：128)中表現。將BamHI、XhoI和/或SrfI用以克隆可變重鏈，並且將NotI和AscI用以克隆可變輕鏈。根據熟練的業內人士已知的標準技術來驗證用於所有構建體的核苷酸序列。
對所鑒別的RSV G蛋白特異性mAb(如CB010.7和CB030.1)進行詳細表位定位。將肽藉由Fmoc化學過程合成，並且藉由反相高效液相層析法(HPLC)純化。在肽-肽相互作用研究中，經由一胺基己酸(Ahx)間隔基將一些肽N末端生物素化。藉由電灑質譜法來分析肽的一致性。將樣品藉由超高效液體層析法(UPLC,Alliance，沃特斯(Waters)，米爾福德(Milford)，麻塞諸塞州(MA)，美國(USA))用一C18反相柱來分析，並且用一光二極體矩陣檢測器和一質量敏感檢測器來檢測。使用溶劑A(H2O+0.05%三氟乙酸[TFA])和溶劑B(ACN+0.05% TFA)情況下的25%-100%乙腈(ACN)，梯度係25%/分鐘。所有試劑都至少是HPLC級。
測試mAb與含有RSV-G A和B型的中央保守區的生物素化的肽之結合(表15)。將抗生物素蛋白塗布的96孔微量滴定板洗滌並且在室溫下與100μL生物素化的肽(2.37×10-7M)在ELISA緩衝液(PBS+1% FBS+0.05% Tween 20)中一起培養1小時。接著，在洗滌之後，將180μL阻斷緩衝液(PBS+10% FBS)/孔轉移到孔中，並且在室溫下培養1小時。接著，將板洗滌並且在室溫下與抗人類HRP(傑克遜免疫研究)一起培養1小時。在洗滌之後，添加100μL鄰苯二胺辣根過氧化物酶底物(賽默科學(Thermo
Scientific))到每個孔中。在10分鐘之後用100μL 1M H2SO4停止反應。在490nm下讀取吸光度。
所有上文所述的mAb結合到RSV Ga和Gb蛋白(實例6)並且結合到中央區A型和B型肽(數據未示出)。滴定抗體CB003.1和CB010.7顯示，該等mAb對於所有四種肽來說都具有約20ng/mL的IC50(圖3)。還使用抗生蛋白鏈菌素感測器端在Octet Red384(福特生物)上測定mAb與RSV G肽之結合。再次，該等mAb顯示了與A型和B型肽的交叉反應性(表16)。CB003.1顯示了與A型和B型肽的最高應答。CB010.7顯示了與A型肽相比與B型的稍微更高結合。
為了定位由mAb識別之最小表位，使用PepScan分析測試對於具有多倍對應於RSV-G A和B型的中央區(殘基145-201)的長度(5、8、10、14、18、25或32聚體)的肽之反應性。在一基於PepScan的ELISA中評估抗體與肽之結合。滴定每種mAb以確保實現最佳結合並且避免非特異性結合。每個信用卡形式的聚丙烯板含有共價鍵聯之肽，該等肽在4℃下與1與10ng/mL之間的mAb在含有5%馬血清(v/v)、5% OVA(w/v)以及1%(v/v)Tween 80的PBS中或在一含有4%馬血清(v/v)和1%(v/v)Tween 80的替代PBS阻斷緩衝液中一起培養過夜。在洗滌之後，將板在25℃下與一HRP連接的兔抗mAb(達科細胞資訊(DakoCytomation))一起培養1小時。在進一步洗滌之後，使用ABTS底物評估過氧化物酶活性，並且使用一電荷耦合裝置攝影機和一影像處理系統定量彩色顯影。
該分析展示了結合抗體、對應於表位的高能核心的最小肽，和具有最高結合、含有也促進結合的額外相鄰殘基並且含有完全表位的肽。抗體與肽的反應性概述於表17中(殘基描繪為大寫)。雖然所有抗體都結合中央保守
域，但對其結合關鍵的殘基是不同的。對於兩種抗體(CB003.1和CB010.7)來說，最小表位限於N末端CCD區(類似於3D3,WO 2009/055711中揭露)。
為了鑒別對結合關鍵之側鏈和研究已知RSV株的識別廣泛度，合成專用肽組。針對由抗體CB003.1和CB010.7識別的序列FHFEVFNFVPCSIC(SEQ ID NO：132)的每個位置對一專用肽矩陣的280種單取代變體肽進行一完全取代分析，並且展現了對結合到該等抗體重要的殘基(圖5)。該等抗體的表位可與3D3表位相當但以一完全不同方式識別。這由取代分析反映，該取代分析顯示，我們的抗體之表位具有與3D3相比完全不同的必需殘基。因此，識別和結合模式非常不同。如實例7中所示，本發明之抗體具有比3D3更高的中和能力。
3D3：159 FHFEVFNFVPCSIC172
CB010.7：159FHFEVFNFVPCSIC172
CB003.1：159FHFEVFNFVPCSIC172
对结合重要的保守残基也概述于表17中(关键残基以粗体描绘)。
測試一組肽，其中每個位置都被一丙胺酸殘基取代(圖6)。對結合抗
體關鍵之側鏈概述於表17中(以粗體黑色指示)。
接著，針對31種涵蓋RSV-G中央域的在2012年1月1日在GenBank出現的完全多樣性的肽的小組測試抗體。如圖7中所示，識別A和B型的幾乎所有天然存在的變體肽。CB003.1顯示比與B型肽更低的與A型之結合。CB010.7同樣好地結合A型和B型肽。抗體對A型變體肽中的位置180處之突變係關鍵的。Ser170Cys之突變對CB010.7並不關鍵。Ile171Thr突變對CB003.1結合是關健的，並且Gln175Arg突變對CB003.1是關健的。二重突變Ile181Phe；Ile184Ala對CB003.1也是關鍵的。對結合四種抗體關鍵之天然存在變體概述於表17中(由底線指示)。
為了確定抗G mAb是否顯示體內預防功效，在RSV-A/長棉花大鼠模型中測試mAb CB003.1和CB010.7。在激發之前24小時，向近親交配、副粘病毒血清陰性、6-8周大、第-1天體重範圍係60-80g的雄性棉花大鼠在後腿上部(股四頭肌)中肌肉內注射5mg/kg的CB003.1、CB010.7、Synagis®或媒劑(n=5/組)。在第0天，將棉花大鼠用105.4pfu RSV-A/長藉由鼻內滴注100μL(每個鼻孔50μL)而激發。在96小時之後，將動物殺死以收集肺和鼻甲：舌葉用於分離總RNA以便藉由qPCR進行總病毒RNA負荷測定，剩餘肺和鼻甲用於藉由pfu測試進行感染病毒負荷測定。在第0天在激發之前(在mAb給藥之後24小時)和在研究終止時(在激發之後96小時)收集血液樣品以證實充足投藥。G mAb與媒劑相比降低肺和鼻甲感染病毒滴度和肺
RNA病毒負荷(圖8)。肺感染病毒滴度(log10 PFU/g)對應地由抗體CB003.1和CB010.7降低2.456和1.559 log10，而用CR9514(3D3)預防性治療僅產生0.801 log10降低。
為了確定抗G mAb是否顯示體內治療功效，在RSV-A/長棉花大鼠模型中測試mAb CB003.1和CB010.7。在第0天，向近親交配、副粘病毒血清陰性、6-8周大、第-1天體重範圍係60-80g的雄性棉花大鼠用106.1pfu RSV-A/長藉由鼻內滴注100μL(每個鼻孔50μL)而激發。在激發後1天之後，藉由心臟內注射給予50mg/kg CB003.1、CB010.7、Synagis®(n=14/組)或媒劑(n=23/組)。在第4天，隨機挑選5只動物/組，將其殺死以收集肺和鼻甲：舌葉用於分離總RNA以便藉由qPCR進行總病毒RNA負荷測定，剩餘肺和鼻甲用於藉由pfu測試進行感染病毒負荷測定。在第6天，將所有剩餘動物(n=9或18/組)殺死以收集肺用於肺組織病理學。在激發後第2天(在mAb給藥之後24小時)和在研究終止時(在激發之後第4天或第6天)收集血液樣品以證實充足投藥。G mAb與媒劑相比降低肺和鼻甲感染病毒滴度，但不降低肺RNA病毒負荷(圖9)。肺感染病毒滴度(log10 PFU/g)對應地由抗體CB003.1和CB010.7降低2.348和1.736 log10，而用CR9514(3D3)治療性治療僅產生1.369 log10降低。此外，新G mAb降低細支氣管周圍炎、血管周圍炎、間質性肺炎以及肺泡炎的組織病理學分數(圖10)，而CR9514
(3D3)僅降低間質性肺炎。
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SEO ID：127(pCP9-κ序列)
SEQ ID：128(pCP9-λ序列)
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<400> 35
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CB028.2 LCDR3
<400> 36
<210> 37
<211> 126
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CB058.1 VH
<400> 37
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CB058.1 VK
<400> 38
<210> 39
<211> 125
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CB048.3 VH
<400> 39
<210> 40
<211> 108
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CB048.3 VK
<400> 40
<210> 41
<211> 133
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CB010.7 VH
<400> 41
<210> 42
<211> 113
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CB010.7 VK
<400> 42
<210> 43
<211> 120
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CB003.1 VH
<400> 43
<210> 44
<211> 109
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CB003.1 VK
<400> 44
<210> 45
<211> 132
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CB028.2 VH
<400> 45
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CB028.2 VK
<400> 46
<210> 47
<211> 126
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CB002.1 VH
<400> 47
<210> 48
<211> 108
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CB002.1 VK
<400> 48
<210> 49
<211> 259
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> RSV G A/长(P20895)
<400> 49
<210> 50
<211> 260
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> RSV G B/B1(NP_056862)
<400> 50
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVH1a
<400> 51
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVH1b
<400> 52
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVH1c
<400> 53
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVH1d
<400> 54
<210> 55
<211> 26
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVH2
<400> 55
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVH3a
<400> 56
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVH3b
<400> 57
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVH3c
<400> 58
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVH4
<400> 59
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVH5
<400> 60
<210> 61
<211> 26
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVH6
<400> 61
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 3？CgCH1
<400> 62
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVk1a
<400> 63
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVk1b
<400> 64
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVk1c
<400> 65
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVk2
<400> 66
<210> 67
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVk3
<400> 67
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVk4
<400> 68
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVk5
<400> 69
<210> 70
<211> 26
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？LVk6
<400> 70
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 3'Ck-Rev494
<400> 71
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？ LVlam1
<400> 72
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？ LVlam2
<400> 73
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？ LVlam3
<400> 74
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？ LVlam4
<400> 75
<210> 76
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-5？ LVlam5
<400> 76
<210> 77
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 3？Clam-Rev
<400> 77
<210> 78
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VH1a
<400> 78
<210> 79
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VH1b
<400> 79
<210> 80
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VH1c
<400> 80
<210> 81
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VH1d
<400> 81
<210> 82
<211> 48
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VH2a
<400> 82
<210> 83
<211> 48
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VH2b
<400> 83
<210> 84
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VH3a
<400> 84
<210> 85
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VH3b
<400> 85
<210> 86
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VH3c
<400> 86
<210> 87
<211> 47
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VH3d
<400> 87
<210> 88
<211> 43
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VH4a
<400> 88
<210> 89
<211> 46
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VH4b
<400> 89
<210> 90
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VH5
<400> 90
<210> 91
<211> 47
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VH6
<400> 91
<210> 92
<211> 47
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VH7
<400> 92
<210> 93
<211> 32
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 3？SalIJH 1/2/4/5
<400> 93
<210> 94
<211> 34
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 3？SalIJH3
<400> 94
<210> 95
<211> 33
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 3？SalIJH6
<400> 95
<210> 96
<211> 43
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VK1a
<400> 96
<210> 97
<211> 43
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VK1b
<400> 97
<210> 98
<211> 43
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VK1c
<400> 98
<210> 99
<211> 47
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VK2a
<400> 99
<210> 100
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VK3a
<400> 100
<210> 101
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VK3b
<400> 101
<210> 102
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VK3c
<400> 102
<210> 103
<211> 43
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-Vk4
<400> 103
<210> 104
<211> 43
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-Vk5
<400> 104
<210> 105
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-Vk6
<400> 105
<210> 106
<211> 46
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 3'Jk1/4 Rev IIa-L
<400> 106
<210> 107
<211> 46
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 3'Jk2 Rev IIb-L
<400> 107
<210> 108
<211> 46
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 3'Jk3 Rev IIc-L
<400> 108
<210> 109
<211> 46
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 3'Jk5 Rev IId-L
<400> 109
<210> 110
<211> 46
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VL1
<400> 110
<210> 111
<211> 40
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VL2
<400> 111
<210> 112
<211> 40
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VL3
<400> 112
<210> 113
<211> 40
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VL4
<400> 113
<210> 114
<211> 40
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VL5
<400> 114
<210> 115
<211> 42
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VL6
<400> 115
<210> 116
<211> 43
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> CB-VL7
<400> 116
<210> 117
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 3'Clam-步驟II
<400> 117
<210> 118
<211> 414
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> IGKC
<400> 118
<210> 119
<211> 387
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> IGLC2
<400> 119
<210> 120
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab連接子-F
<400> 120
<210> 121
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab連接子-R
<400> 121
<210> 122
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> λ-Fab連接子F
<400> 122
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 重疊-F
<400> 123
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 重疊-R
<400> 124
<210> 125
<211> 40
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> SYM-1706
<400> 125
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> SeqpCBFab-HCF
<400> 126
<210> 127
<211> 8970
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> pCP9-κ序列
<400> 127
<210> 128
<211> 8969
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> pCP9-λ序列
<400> 128
<210> 129
<211> 57
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Sym-1705
<400> 129
<210> 130
<211> 57
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Sym-1788
<400> 130
<210> 131
<211> 40
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Sym-1789
<400> 131
<210> 132
<211> 14
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 132
Claims (16)
- 能夠特異性結合到呼吸道合胞體病毒(RSV)的G蛋白並且能夠中和RSV A和B株之抗體，其中該抗體結合到該RSV G蛋白的中央保守域內的一表位，並且其中所述表位包含RSV G蛋白RSV A2株之胺基酸161-169、特別是胺基酸162-168中的一個或多個胺基酸或其他病毒株中相對應的胺基酸。
- 如申請專利範圍第1項所述之能夠特異性結合到呼吸道合胞體病毒(RSV)的G蛋白並且能夠中和RSV A和B株之抗體，其中該抗體選自由以下各項組成之群組：a)一抗體，包含一SEQ ID NO：1之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：2之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：3之重鏈CDR3區，b)一抗體，包含一SEQ ID NO：4之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：5之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：6之重鏈CDR3區，c)一抗體，包含一SEQ ID NO：7之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：8之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：9之重鏈CDR3區，d)一抗體，包含一SEQ ID NO：10之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：11之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：12之重鏈CDR3區，e)一抗體，包含一SEQ ID NO：25之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：26之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：27之重鏈CDR3區，以及 f)一抗體，包含一SEQ ID NO：31之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：32之重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：33之重鏈CDR3區。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之抗體，其中該抗體選自由以下各項組成之群組：a)一抗體，包含一SEQ ID NO：1之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：2的重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：3之重鏈CDR3區，一SEQ ID NO：13之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：14之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：15之輕鏈CDR3區；b)一抗體，包含一SEQ ID NO：4之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：5的重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：6之重鏈CDR3區，一SEQ ID NO：16之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：17之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：18之輕鏈CDR3區，c)一抗體，包含一SEQ ID NO：7之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：8的重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：9之重鏈CDR3區，一SEQ ID NO：19之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：20之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：21之輕鏈CDR3區；d)一抗體，包含一SEQ ID NO：10之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：11的重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：12之重鏈CDR3區，一SEQ ID NO：22之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：23之輕鏈CDR2區以及一SEO ID NO：24之輕鏈 CDR3區；e)一抗體，包含一SEQ ID NO：25之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：26的重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：27之重鏈CDR3區，一SEQ ID NO：28之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：29之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：30之輕鏈CDR3區；以及f)一抗體，包含一SEQ ID NO：31之重鏈CDR1區、一SEQ ID NO：32的重鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：33之重鏈CDR3區，一SEQ ID NO：34之輕鏈CDR1區、一SEQ ID NO：35之輕鏈CDR2區以及一SEQ ID NO：36之輕鏈CDR3區。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之抗體，其中該抗體係一人類抗體。
- 如以上申請專利範圍第1到4項中任一項所述之抗體之抗原結合片段。
- 如以上申請專利範圍第1到4中任一項所述之抗體之功能變體。
- 免疫結合物，包含如申請專利範圍第1到4項中任一項所述之抗體，和/或如申請專利範圍第5項所述之抗原結合片段，和/或如申請專利範圍第6項所述之功能變體，該免疫結合物進一步包含至少一種治療劑和/或可檢測藥劑。
- 核酸分子，編碼如申請專利範圍第1到4項中任一項所述之抗體、如申請專利範圍第5項所述之抗原結合片段、和/或如申請專利範圍第6項所述之功能變體。
- 載體，包含至少一種如申請專利範圍第8項所述之核酸分子。
- 一種宿主細胞，包含至少一種如申請專利範圍第9項所述之載體。
- 一種製造如申請專利範圍第1到4項中任一項所述之抗體、如申請專利範圍第5項所述之抗原結合片段、和/或如申請專利範圍第6項所述之功能變體的方法，其中該方法包括以下步驟：a)在有助於該抗體的表現的條件下培養如申請專利範圍第10項所述之宿主細胞，和可隨意地，b)回收該表現的抗體、抗原結合片段和/或功能變體。
- 一種藥物組合物，包含如申請專利範圍第1到4項中任一項所述之抗體、如申請專利範圍第5項所述之抗原結合片段、和/或如申請專利範圍第6項所述之功能變體，該藥物組合物進一步包含至少一種藥學上可接受的賦形劑。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之抗體、如申請專利範圍第5項所述之抗原結合片段、如申請專利範圍第6項所述之功能變體或如申請專利範圍第12項所述之藥物組合物用作一藥劑。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之抗體、如申請專利範圍第5項所述之抗原結合片段、如申請專利範圍第6項所述之功能變體或如申請專利範圍第12項所述之藥物組合物用於對RSV感染進行預防或治療或其組合。
- 一種試劑盒，包含以下中的至少一者：如申請專利範圍第1到4項項中任一項所述之抗體、如申請專利範圍第5項所述之抗原結合片段、如申請專利範圍第6項所述之功能變體、或如申請專利範圍第12項所述之藥物組合物、或其組合。
- 一種檢測RSV感染之方法，包括(a)使用如申請專利範圍第1到4項中任一項所述之抗體、如申請專利範圍第5項所述之抗原結合片段、如申請專利範圍第6項所述之功能變體、和/或如申請專利範圍第7項所述之免疫結合物分析一種樣品中RSV抗原的水平；和(b)將RSV抗原的分析水平與一對照水平比較，由此RSV抗原的該分析水平與該對照水平相比之增加指示RSV感染。
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